CN114404611B - 一种酶动力蛋白马达的制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种酶动力蛋白马达的制备方法及应用，所述酶动力蛋白马达包括人血清白蛋白、与所述人血清白蛋白连接的蛋白酶和负载于人血清白蛋白与蛋白酶连接网络内的药物。该酶动力蛋白马达具有出色的自主运动能力，可以大大增强细胞摄取和组织渗透能力，提高其载药疗效。而且其不含任何无机成分，有效规避生物安全性等问题。构建方法简单，便于操作，能实现大规模生产，可灵活交联不同的蛋白酶(如葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶、DNA酶、脂肪酶等)，以构建不同动力来源驱动的生物马达，并应用于不同疾病的诊断和治疗，所搭载的治疗平台具有极大的灵活性、通用性和创新性。

Description

一种酶动力蛋白马达的制备方法及应用
技术领域
本发明属于纳米复合材料领域，具体涉及一种酶动力蛋白马达的制备方法及应用。
背景技术
全世界恶性肿瘤的发展态势异常严峻，据世界卫生组织统计，恶性肿瘤已经是全球第三大死因。相关技术中，传统的肿瘤治疗方法有手术、放射、化学药物治疗三大模式。其中，肿瘤化学药物治疗普遍存在靶向性差，毒副作用大，治疗效果不理想等缺陷，严重制约着临床应用。纳米技术的快速发展为肿瘤的诊断和治疗带来了新的机遇，通过将药物装载至纳米颗粒中，可以提高药物稳定性，并改善药物在体内的生物分布和药代动力学。基于肿瘤疏松的血管结构，纳米药物能够通过血管空隙进入肿瘤组织，在肿瘤内部实现增强渗透和滞留(EPR效应)，因此纳米药物在肿瘤诊断和治疗中显示出巨大的优势。但目前的纳米药物局限于只能在热力学平衡态进行布朗运动的简单运动，无法实现真正意义上的自身运动。
因此，开发一种能够基于不同动力来源驱动的，具有自身运动能力的生物马达，对于药物的递送以及不同疾病的诊断和治疗具有极为重要的意义。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种酶动力蛋白马达的制备方法及应用，该酶动力蛋白马达基于人血清白蛋白作为载体，通过连接的蛋白酶作为驱动力，负载药物实现肿瘤细胞穿透能力，将药物递送至肿瘤细胞内部，从而有效杀伤肿瘤细胞。
本发明的第一个方面，提供一种酶动力蛋白马达。
在微纳米尺度上持续的驱动力推进可以有效地将药物传递到病变部位，促进药物通过生物屏障的渗透，自驱动微纳米马达具有极好的应用前景，但由于传统微纳米马达驱动能力弱，因此，能够利用周围环境中的化学能实现自驱动的酶动力蛋白马达将更具有实用性。
本发明中的酶动力马达是指利用酶对生物介质中的过氧化氢、尿素、DNA、脂肪、水等底物燃料的催化反应，在马达周围产生催化产物的不对称堆积，从而为整个马达系统提供驱动力。由于酶具有良好的生物安全性、高周转率，并在在生理环境下具有优异的选择性，是驱动马达自主运动良好的催化剂，因此，本发明中的酶动力马达在实际生物医学应用中有很好的潜力。而选择理想的燃料对于促进酶动力马达的应用非常重要。
根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，所述酶动力蛋白马达包括人血清白蛋白、与所述人血清白蛋白连接的蛋白酶和负载于人血清白蛋白与蛋白酶连接网络内的药物。
传统的微纳米马达多以无机材料为载体，存在生物相容性差、在体内难以降解等生物安全性问题，而在本发明中，以血清白蛋白(HSA)为载体，其具有来源丰富、无毒、低免疫原性、生物相容性好、生物可降解等优点，可有效规避生物安全性等问题，可开发成新材料并向市场推广。
相关技术中，虽然也会引入蛋白酶，但在合成马达的过程中往往会引入不可降解的无机材料或溶剂，这极大地限制了其生物医学应用。但在本发明中，发明人构建得到了一个完全由有机物组成的马达，具有相对更加好的安全性和可降解性
根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，所述酶动力蛋白马达呈球形结构，粒径为100～400nm。
在本发明的一些优选实施方式中，所述酶动力蛋白马达呈球形结构，粒径约为250nm。
根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，所述蛋白酶包括脲酶、葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶、DNA酶和脂肪酶中的任意一种。
在本发明中，脲酶被设计为氨发生器，通过催化尿素生成氨和二氧化碳，产生的浓度梯度赋予了马达自我推进的动力，而增强的自扩散运动提高了马达的肿瘤穿透能力；同时，其催化产物氨对细胞有毒性作用，具有抗肿瘤效应，这提供了在没有其他外源性危险成分的情况下进行原位氨治疗(即仅在含有尿素的病灶区域内原位生成氨)的可能。而谷氨酰胺合成酶抑制剂可有效抑制细胞将有毒氨转化为无毒谷氨酰胺，从而放大氨对肿瘤细胞的毒性作用。
根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，所述药物包括谷氨酰胺合成酶抑制剂和化疗药物。在本发明的一些优选实施方式中，所述谷氨酰胺合成酶抑制剂包括蛋氨酸亚砜亚胺(MSO)、草铵膦及类似物中的一种或多种；所述化疗药物包括阿霉素、紫杉醇、吉西他滨和奥沙利铂中的一种或多种。
在本发明的一些实施例中，所述酶动力蛋白马达由人血清白蛋白(HSA)、脲酶(Urease)和蛋氨酸亚砜亚胺(MSO)组成。
在本发明的一些实施例中，所述酶动力蛋白马达有下述(1)～(5)任一种组合组成：
(1)酶动力蛋白马达MUHNPs：人血清白蛋白(HSA)、脲酶(Urease)和蛋氨酸亚砜亚胺(MSO)；
(2)酶动力蛋白马达DGHNPs：人血清白蛋白(HSA)、葡萄糖氧化酶(GlucoseOxidase，GOD)和化疗药物阿霉素(DOX)；
其中，GOD在肿瘤微环境中可通过催化反应为DGHNPs提供驱动力，增强自扩散运动，从而提高马达对肿瘤的穿透能力，而且其还可以催化肿瘤细胞内葡萄糖的氧化分解，从而降低ATP的合成，抑制P-gp的表达，抑制癌细胞对化疗药物阿霉素的外排，从而促进化疗药物阿霉素在细胞内蓄积和抗癌作用，提高对肿瘤的杀伤能力。
(3)酶动力蛋白马达CHNPs：人血清白蛋白(HSA)、过氧化氢酶(catalase，CAT)；
其中，CAT在肿瘤微环境中可通过催化反应为CHNPs提供驱动力，增强自扩散运动，从而提高马达对肿瘤的穿透能力。
(4)酶动力蛋白马达DHNPs：人血清白蛋白(HSA)、DNA酶；
其中，DNA酶以从凋亡或者垂死的肿瘤细胞中释放的游离肿瘤DNA为底物通过催化反应为纳米马达提供驱动力，增强自主运动，从而提高马达对肿瘤的穿透能力；同时沿着DNA浓度梯度的方向自主趋化到达肿瘤部位。
(5)酶动力蛋白马达LHNPs：人血清白蛋白(HSA)、脂肪酶(Lipase)。
其中，脂肪酶可通过催化反应为纳米马达提供驱动力，增强自主运动，从而提高马达对肿瘤的穿透能力，而且其还可以降解体内的甘油三酯，从而应用于医学疾病治疗。
本发明的第二个方面，提供一种酶动力蛋白马达的制备方法，包括如下步骤：
(1)将人血清白蛋白、蛋白酶和药物混合，加入交联剂。
(2)离心除去沉淀，透析，再次离心除去沉淀，即得酶动力蛋白马达。
在本发明的一些优选实施方式中，所述蛋白酶包括脲酶、葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶、DNA酶和脂肪酶中的任意一种。
在本发明的一些优选实施方式中，所述药物包括谷氨酰胺合成酶抑制剂和化疗药物。
在本发明的一些更优选实施方式中，所述谷氨酰胺合成酶抑制剂包括蛋氨酸亚砜亚胺(MSO)、草铵膦及类似物的一种或多种；所述化疗药物包括阿霉素、紫杉醇、吉西他滨和奥沙利铂中的一种或多种。
生物机体出于对自身的保护，会对体内外的有毒物质进行代谢转化，使毒性减弱，从而维持机体的动态平衡。例如，机体通过谷氨酰胺合成酶(GS)催化毒性物质氨的代谢，从而减弱氨的毒性。GS是一种依赖于ATP的金属酶，催化氨和谷氨酸(Glu)的缩合形成谷氨酰胺(Gln)，这会降低马达的催化产物氨的浓度，从而降低氨对肿瘤组织的毒性作用，使疗效降低。因此，发明人通过加入谷氨酰胺合成酶抑制剂—L-蛋氨酸亚砜亚胺(L-Methioninesulfoximine，MSO)，可以抑制GS活性，从而放大氨毒性。肿瘤组织由肿瘤细胞和基质细胞(如成纤维细胞、血管内皮细胞、免疫细胞等)组成，对于高表达GS的肿瘤细胞，通过抑制GS活性从而放大氨对肿瘤细胞的毒性直接杀伤肿瘤细胞；而对于低表达GS的肿瘤细胞，可以通过抑制高表达GS的成纤维细胞的GS活性，从而放大氨对成纤维细胞的毒性，进一步诱导肿瘤细胞的凋亡。因此，通过加入MSO抑制GS的活性，有望扩大氨的毒性效应，用于脲酶驱动马达的抗肿瘤治疗。
在本发明的一些优选实施方式中，所述交联剂包括戊二醛、1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)/N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)组合中的一种或多种。
EDC/NHS组合常规使用的交联剂组合试剂。
在本发明的一些优选实施方式中，人血清白蛋白、蛋白酶的质量比为1～2:1～2；在本发明的一些更优选实施方式中，人血清白蛋白、蛋白酶的质量比为1:1。
根据本发明的第二个方面，在本发明的一些实施方式中，所述酶动力蛋白马达的制备方法具体为：
(1)MUHNPs的制备方法具体为：取8mg人血清白蛋白(HSA)、8mg脲酶(Urease)、3.2mg蛋氨酸亚砜亚胺(MSO，是一种谷氨酰胺合成酶抑制剂)溶于2mL水中，搅拌15min，加入10％的戊二醛溶液，1000rpm避光搅拌9h。然后6000rpm离心6min，除去沉淀，将上清液置于透析袋(分子量：1000kDa)中透析过夜，以除去游离HSA、Urease和MSO。取得到的透析液在6000rpm离心6min，除去沉淀，上清液即为酶动力蛋白马达(MUHNPs)。
(2)DGHNPs的制备方法同MUHNPs，区别在于，将脲酶换为等量GOD，MSO换为等量阿霉素。
(3)CHNPs的制备方法同MUHNPs，区别在于，将脲酶换为等量CAT，不加入药物。
(4)DHNPs的制备方法同CHNPs，区别在于，将CAT换为等量DNA酶，不加入药物。
(5)LHNPs的制备方法同CHNPs，区别在于，将CAT换为等量脂肪酶，不加入药物。
本发明的第三个方面，提供本发明第一个方面所述的酶动力蛋白马达在下述(1)～(3)任一项中的应用；
(1)药物递送；
(2)制备药物递送工具；
(3)制备肿瘤治疗药物。
根据本发明的第三个方面，在本发明的一些实施方式中，所述肿瘤为谷氨酰胺合成酶高表达，或谷氨酰胺合成酶低表达但通过肿瘤内的基质细胞实现补偿的肿瘤。
在本发明的一些优选实施方式中，所述肿瘤为肝癌和膀胱癌。
本发明的第四个方面，提供一种酶动力驱动递送系统。
根据本发明的第四个方面，在本发明的一些实施方式中，所述酶动力驱动递送系统包括本发明第一个方面所述的酶动力蛋白马达，和对应于所述酶动力蛋白马达中的蛋白酶的底物。
在本发明的一些优选实施方式中，当酶动力蛋白马达为MUHNPs时，蛋白酶为脲酶，底物为尿素。当酶动力蛋白马达为DGHNPs时，蛋白酶为GOD，底物为葡萄糖。当酶动力蛋白马达为CHNPs，蛋白酶为CAT，底物为肿瘤微环境中的过氧化氢。当酶动力蛋白马达为DHNPs，蛋白酶为DNA酶，底物为凋亡或者垂死的肿瘤细胞中释放的游离肿瘤DNA。当酶动力蛋白马达为LHNPs，蛋白酶为脂肪酶，底物为甘油三酯。
在本发明的一些更优选实施方式中，所述酶动力蛋白马达中的蛋白酶为脲酶；所述底物为尿素。
理想的燃料(底物)应在生物系统中大量存在并具有良好的生物相容性，如水、尿素、葡萄糖等；此外，这些酶催化燃料产生的产物应无毒并具有治疗效果，如抗肿瘤、抗血管内皮等作用。尿素(CO(NH2)2)是生物体蛋白质代谢转化后的产物，主要在肝脏通过尿素循环合成，最终通过肾脏由尿液排出。因此尿素在肝脏中浓度较高，而在尿液中的浓度甚至高达300mM。脲酶修饰的MUHNPs将尿素分解为氨和二氧化碳，产生的浓度梯度可以产生自推进的驱动力，实现纳米马达的自主运动。而且其中的催化产物氨对细胞具有毒性作用，可以实现高效的抗肿瘤治疗。
本发明的第五个方面，提供本发明第四个方面所述的酶动力驱动递送系统在在下述(1)～(3)任一项中的应用；
(1)药物递送；
(2)制备药物递送产品；
(3)制备肿瘤诊断和治疗产品。
本发明提出了一种由生物相容性良好的人血清白蛋白作为载体，利用戊二醛将人血清白蛋白的氨基(-NH2)与脲酶的氨基(-NH2)连接起来，并在形成过程中负载谷氨酰胺合成酶抑制剂，从而构建出自驱动酶动力蛋白马达MUHNPs。MUHNPs中的脲酶在尿素溶液中可通过催化反应为马达提供驱动力，增强自扩散运动，从而增强马达在肿瘤中的渗透能力。同时，脲酶催化产物氨对肿瘤细胞或成纤维细胞具有毒性作用，而谷氨酰胺合成酶抑制剂可有效阻止细胞将氨转化为谷氨酰胺，从而抑制氨的转化，放大氨对细胞的毒性作用，实现对肿瘤的高效治疗，尤其是膀胱癌和肝癌。
在本发明中，其不仅突出了白蛋白和脲酶的一步合成法以及其对于负载的谷氨酰胺合成酶抑制剂的保护，还强调马达在膀胱癌和肝癌中的应用。而且该马达实质上可以以人血清白蛋白为载体直接灵活交联不同的蛋白酶(如葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶、DNA酶、脂肪酶等)，以构建不同动力来源驱动的生物马达，应用于不同疾病的诊断和治疗，适用性更广。
本发明的有益效果是：
1.本发明中的酶动力蛋白马达具有出色的自主运动能力，可以大大增强细胞摄取和组织渗透能力，提高其载药疗效。而且其以生物来源的人血清白蛋白作为载体，具有来源丰富、无毒、低免疫原性、生物相容性好、生物可降解等优点，交联脲酶构建纯蛋白纳米马达，可有效规避生物安全性等问题，有望进一步深化微纳米马达在肿瘤治疗领域中的应用。
2.本发明中的酶动力蛋白马达通过催化底物尿素产生氨和二氧化碳，而且基于其负载的谷氨酰胺合成酶抑制剂，可抑制细胞对氨的解毒作用进而放大氨毒性，充分发挥酶催化产物的活性作用(对肿瘤细胞的毒性作用)，实现高效的抗肿瘤治疗。
3.本发明中的酶动力蛋白马达构建方法简单，便于操作，能实现大规模生产，可灵活交联不同的蛋白酶(如葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶、DNA酶、脂肪酶等)，以构建不同动力来源驱动的生物马达，并应用于不同疾病的诊断和治疗，所搭载的治疗平台具有极大的灵活性、通用性和创新性。
附图说明
图1为本发明实施例中的MUHNPs的透射电镜(TEM)图。
图2为本发明实施例中的MUHNPs的粒径图。
图3为本发明实施例中的MUHNPs的7天稳定性结果。
图4为本发明实施例中的MUHNPs的HSA和脲酶荧光共定位图。
图5为对本发明实施例中的MUHNPs中MSO衍生化处理后的GC-MS色谱图。
图6为本发明实施例中的MUHNPs与游离脲酶的脲酶活性对比。
图7为本发明实施例中的MUHNPs在不同浓度尿素中产生氨的含量测定。
图8为本发明实施例中的MUHNPs在不同浓度尿素中的运动轨迹。
图9为本发明实施例中的MUHNPs在不同浓度尿素中的运动速度。
图10为本发明实施例中的不同浓度尿素中肿瘤细胞对MUHNPs的摄取能力。
图11为本发明实施例中的不同纳米粒子对MUHNPs对肿瘤细胞的杀伤作用。
图12为本发明实施例中的不同浓度尿素中MUHNPs对肿瘤细胞球的穿透效果。
图13为本发明实施例中的不同纳米粒子对肿瘤细胞球的杀伤作用。
图14为膀胱注射给药后，不同纳米粒子在膀胱中的滞留效应图像。
图15为膀胱注射给药后，不同纳米粒子的膀胱H&E染色分析结果。
图16为DGHNPs(人血清白蛋白和葡萄糖氧化酶交联并负载阿霉素)的粒径图。
图17为CHNPs(人血清白蛋白和过氧化氢酶交联)的粒径图。
图18为DHNPs(人血清白蛋白和DNA酶交联)的粒径图。
图19为LHNPs(人血清白蛋白和脂肪酶交联)的粒径图。
具体实施方式
为了使本发明的发明目的、技术方案及其技术效果更加清晰，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明。
所使用的实验材料和试剂，若无特别说明，均为常规可从商业途径所获得的耗材和试剂。
酶动力蛋白马达(MUHNPs)的合成和表征
(1)MUHNPs的合成：
取8mg人血清白蛋白(HSA)、8mg脲酶(Urease)、3.2mg蛋氨酸亚砜亚胺(MSO，是一种谷氨酰胺合成酶抑制剂)溶于2mL水中，搅拌15min，加入10％的戊二醛溶液，1000rpm避光搅拌9h。然后6000rpm离心6min，除去沉淀，将上清液置于透析袋(分子量：1000kDa)中透析过夜，以除去游离HSA、Urease和MSO。取得到的透析液在6000rpm离心6min，除去沉淀，上清液即为酶动力蛋白马达(MUHNPs)。
(2)MUHNPs的表征：
MUHNPs的形态和结构则通过高分辨率透射电镜(TEM)测定。其中TEM测定的步骤为：滴加一滴上述步骤(1)制得的MUHNPs至300目的铜网上，随后滴加2％的磷钨酸水溶液进行负染，过夜烘干即得电镜样品，将其放入TEM中观测即可。
结果如图1所示。
通过高分辨率透射电镜(TEM)观测显示，上述实施例制得的MUHNPs表征良好，具有典型的球形结构。
MUHNPs的粒径分布和粒径稳定性由马尔文粒度仪测得。
结果如图2～3所示。
利用动态光散射(DLS)分析发现上述实施例制得的MUHNPs的粒径约为250nm左右，与TEM结果一致(图2)。且经过长期持续观测(室温环境下保存)，该MUHNPs的粒径在7天内大小无明显变化，说明制得的MUHNPs稳定性良好，不会发生分解等情况(图3)。
进一步分别用异硫氰酸荧光染料(FITC)和菁染料(Cy5)标记HSA和脲酶，在荧光显微镜下观察。
FITC标记HSA后会显示出绿色荧光，而Cy5标记脲酶后会显示出红色荧光，根据图4可以看出，上述实施例制得的MUHNPs同时表现出绿色和红色荧光，表明马达的成功构建。
进一步对MUHNPs的另一关键性成分MSO进行检测，具体检测方法为：将MUHNPs用盐酸异丙醇溶液在100℃条件下加热30min，冷却后干燥，加入三氟乙酸酐，100℃加热30min进行衍生化处理，然后使用甲醇对MUHNPs中的衍生化MSO进行提取，将提取物进行气相色谱-质谱(GC-MS)分析。
MUHNPs中的衍生化MSO甲醇提取物GC-MS色谱图如图5所示，可以发现其在保留时间为18.7min时出现一个峰，为衍生化MSO的特征峰(以MSO对照，PBS作为空白)，从而可以说明MUHNPs中成功负载MSO。
酶动力蛋白马达(MUHNPs)的效果验证
(1)MUHNPs中的脲酶的活性和催化效率：
MUHNPs中的脲酶的活性和催化效率由脲酶活性检测试剂盒(购自北京索莱宝科技有限公司)，具体检测操作按照说明书进行。以游离脲酶对对照。
结果如图6所示。
通过脲酶活性检测试剂盒检测，可以发现，上述实施例制得的MUHNPs中脲酶的活性(74.57％)与游离脲酶相当。
(2)MUHNPs的产氨效果：
使用氨含量测定试剂盒检测(购自武汉力博瑞生物科技有限公司)上述实施例制得的MUHNPs在不同浓度(0、50、100mM)尿素溶液中4小时内产生的氨的量，可以发现，随着底物尿素浓度的增加，MUHNPs产生的氨浓度也越来越高，在50mM尿素浓度下，产生的氨浓度高达113.23mM(图7)，远远高于对肿瘤细胞球产生毒性的最低氨浓度。上述结果表明，通过上述实施例制得的MUHNPs可以高效催化产生氨，说明MUHNPs在肿瘤治疗中具有巨大的应用潜力。
(3)MUHNPs自扩散运动行为评估：
将上述实施例中制备得到的MUHNPs分别加入到0、1、5、25、50、100mM的尿素溶液中，采用倒置荧光显微镜观察马达的运动情况，通过image J和Chemotaxis软件分析记录的视频，追踪马达运动轨迹，计算出马达的运动速度。
结果如图8和9所示。
根据MUHNPs在不同浓度尿素条件下的运动轨迹，可以发现在在不含尿素的溶液中，MUHNPs表现为布朗运动，同时由于缺乏分解底物时所产生的驱动力，马达的运动位移较小；而随着尿素浓度的增加，马达的运动表现出增强扩散的作用，且运动位移变大，表明MUHNPs扩散能力对底物浓度存在依赖关系。如图9所示，随着尿素浓度的进一步增加，MUHNPs自扩散运动速度也显著增强，当尿素浓度增加到50mM时，马达的平均速度达到4.97m/s，约为无尿素时的平均速度的1.27倍。
(4)2D细胞水平验证MUHNPs的癌细胞杀伤效果：
谷氨酰胺合成酶(GS)在多种癌细胞中的表达水平各异，对于高表达GS的肿瘤细胞，上述实施例中的MUHNPs可通过抑制GS活性从而放大氨对肿瘤细胞的毒性直接杀伤肿瘤细胞。在本实施例中，使用GS高表达的5637细胞(人膀胱癌细胞)作为2D细胞模型作为样品，评价MUHNPs的癌细胞摄取和杀伤效果。
为了验证MUHNPs对肿瘤细胞摄取能力的促进作用，在使用上述实施例中的方法合成MUHNPs时，加入少量尼罗红染料，得到荧光标记的MUHNPs。
具体试验步骤为：
取生长状态良好的5637细胞铺于6孔板中，使用RPMI-1640培养基孵育过夜。弃去培养基，向各孔分别加入含MUHNPs(MUHNPs中含终浓度为10μg mL-1的MSO和200μg mL-1的urease)的0、50、100mM的尿素溶液。孵育4h。弃去溶液，加入Hoechst 33342染色剂(用PBS稀释比例1:1000)染核10min，随后用PBS洗三遍，于荧光显微镜下观察，评价肿瘤细胞对马达的细胞摄取能力。
如图10所示，随着尿素浓度的增加，肿瘤细胞对MUHNPs的细胞摄取能力越来越强。通过对红色荧光(尼罗红标记的MUHNPs)定量分析，可以发现当尿素浓度为100mM时，MUHNPs的摄取效率比无尿素时提高1.65倍，该结果说明细胞摄取的增强与MUHNPs随着尿素浓度的增加自扩散运动增强的结果是相一致。
(5)2D细胞水平验证MUHNPs对肿瘤细胞的杀伤作用：
取生长状态良好的5637细胞铺于96孔板中(设置为4个实验组，分别为空白组(Blank)、MSO组(游离MSO)、MHNPs(由等量人血清白蛋白替代脲酶，采用上述实施例中的方法构建得到的产物)和MUHNPs)，使用RPMI-1640培养基孵育过夜。弃去培养液，分别加入含MSO、MHNPs和MUHNPs的50mM尿素培养基(其中，MUHNPs中含终浓度为10μg mL-1的MSO和200μgmL-1的urease)孵育4h。弃去溶液后继续孵育24h，随后加入含有CCK8的RPMI-1640培养基，CCK8与培养基的体积比为1：10，孵育1h。使用酶标仪在450nm波长处检测各孔吸光值，计算各孔的相对细胞存活率。
计算公式为：
如图11所示，通过对比不同组的细胞存活率，游离MSO和MHNPs组对细胞有极其微弱的毒性影响，而MUHNPs组的细胞存活率显著下降至0.53％。结果表明，MUHNPs不仅通过催化分解尿素产生氨，而且通过抑制GS酶活性阻止氨的代谢，从而产生较高的氨积累和强大的肿瘤杀伤能力，说明MUHNPs具有较好的抗肿瘤作用。
(6)3D细胞球水平评估MUHNPs对肿瘤细胞的渗透作用
肿瘤内的基质细胞，如成纤维细胞，均呈GS高表达状态，主要用于补偿肿瘤细胞本身GS表达不足的缺陷。因此，对于低表达GS的肿瘤细胞，MUHNPs可以通过抑制成纤维细胞的GS活性，从而放大氨对成纤维细胞和肿瘤细胞的毒性，进一步诱导肿瘤细胞的凋亡。在本实施例中，选择GS低表达的MB49细胞(小鼠膀胱癌细胞)和GS高表达的3T3细胞(小鼠成纤维细胞)的混合细胞(细胞数比例为1:5)构建3D肿瘤细胞球模型，检测MUHNPs对癌细胞的杀伤效果。
为了验证MUHNPs对肿瘤细胞的渗透作用，在使用上述实施例中的方法合成MUHNPs时，加入少量尼罗红染料，得到荧光标记的MUHNPs。
具体检测步骤为：
将MB49细胞和3T3细胞按细胞数比例为1:5的比例混合，然后以每孔1000个的细胞密度铺于低吸附U型96孔板中，加入DMEM培养基，3500rpm离心5min。孵育2～5天。在孵育第二天至第五天分别置于显微镜下观察其形貌和大小，待细胞形成肿瘤球且肿瘤球直径约为250mm时即可作为3D肿瘤细胞球模型使用。
弃去3D肿瘤细胞球模型的培养基，向各孔分别加入含MUHNPs(MUHNPs中含终浓度为10μg mL-1的MSO和200μg mL-1的urease)的0、50、100mM的尿素溶液，孵育4h。弃去溶液，加入4％多聚甲醛溶液对细胞进行固定，荧光显微镜下观察，并从不同层面对细胞球进行荧光扫描，评价MUHNPs在肿瘤球中的渗透作用。
如图12所示，可以发现随着尿素浓度的增加，MUHNPs表现出增强的自扩散运动，肿瘤细胞球中出现红色荧光，说明MUHNPs可以深入肿瘤细胞球中，从而实现更高的药物积累。进一步定量肿瘤细胞球中部截面的荧光信号，结果显示在100mM尿素浓度下的细胞球对蛋白马达的摄取效率比50mM尿素浓度时高1.33倍，比无尿素情况下的摄取效率高2.02倍。
(7)3D细胞球水平评估MUHNPs对肿瘤细胞的杀伤效果：
具体检测步骤为：
参考上述实施例制备3D肿瘤细胞球模型。
3D肿瘤细胞球模型设置为4个实验组，分别为空白组(Blank)、MSO组(游离MSO)、MHNPs(由等量人血清白蛋白替代脲酶，采用上述实施例中的方法构建得到的产物)和MUHNPs，弃去原培养液，分别加入含MSO、MHNPs和MUHNPs的50mM尿素培养基(其中，MUHNPs中含终浓度为10μg mL-1的MSO和200μg mL-1的urease)孵育4h。弃去溶液，使用Calcein-AM/PI活细胞/死细胞双染试剂盒进行染色，操作参考使用说明书。继续孵育30min，用PBS洗涤后，置于荧光显微镜下观察。
如图13所示，游离MSO和MHNPs两组均未见明显的毒性。由于氨的生成和氨代谢的抑制，MUHNPs使肿瘤球呈淡绿色和红色荧光，表明肿瘤球处于严重的凋亡和坏死状态。上述结果表明，脲酶的催化作用和GS的抑制不仅增强了MUHNPs的肿瘤深度穿透能力，而且放大了原位氨毒性，实现高效的抗肿瘤治疗效果。
(8)MUHNPs在动物模型中的实际应用效果：
为了进一步验证MUHNPs的使用效果，发明人使用小鼠模型作为检测对象进行实际测试验证。
在本实施例中，所用小鼠模型为balb/c雌性小鼠，购自南方医科大学实验动物中心，饲养条件为SPF环境。
随机选取9只雌性小鼠，平均分成3组，包括空白组(PBS)、MHNPs组(由等量人血清白蛋白替代脲酶，采用上述实施例中的方法构建得到的产物)、MUHNPs组。用5％水合氯醛(约150mL)麻醉各组小鼠，排空膀胱后，经膀胱注射给药，给药剂量100mL/只(因留置针会滞留100mL的药物在针内，因此，每针的药物实际吸取量为200mL)。给药12小时后，处死小鼠，收集小鼠的完整膀胱用于活体成像。
从每组小鼠中取膀胱做冰冻切片，使用DAPI染色细胞核，用于观察MUHNPs在组织中的滞留和渗透效应。
从每组小鼠中取膀胱做石蜡切片，采用苏木精-伊红(H&E)染色法观察细胞形态学，判断药物是否会对小鼠膀胱造成组织学损伤。
在膀胱注射给药12小时后，对收集的小鼠完整膀胱进行荧光成像，结果如图14所示，可以发现，PBS和MHNPs组中几乎检测不到荧光，而MUHNPs处理组的荧光较强。根据荧光定量结果，可以发现MUHNPs组的平均荧光强度大约是MHNPs组的1.4倍，提示MUHNPs由于其自扩散运动，可以有效粘附在上皮屏障，在膀胱组织中实现滞留。
通过进一步利用苏木精-伊红(H&E)染色法观察MUHNPs对膀胱组织的毒性，结果如图15所示，可以发现使用上述不同纳米颗粒均不会对小鼠膀胱造成组织学损伤，表明了MUHNPs的安全性。
综上所述，MUHNPs可以实现高效的组织滞留效应，同时对实验动物模型的毒性可以忽略不计，具有极好的应用潜力和实用价值。
其他酶动力蛋白马达的制备与表征
(1)一种酶动力蛋白马达DGHNPs，该DGHNPs的制备材料为人血清白蛋白(HSA)、葡萄糖氧化酶(Glucose Oxidase，GOD)和化疗药物阿霉素(DOX)。HSA具有来源丰富、无毒、低免疫原性、生物相容性好、生物可降解等优点。GOD在肿瘤微环境中可通过催化反应为DGHNPs提供驱动力，增强自扩散运动，从而提高马达对肿瘤的穿透能力，而且其还可以催化肿瘤细胞内葡萄糖的氧化分解，从而降低ATP的合成，抑制P-gp的表达，抑制癌细胞对化疗药物阿霉素的外排，从而促进化疗药物阿霉素在细胞内蓄积和抗癌作用，提高对肿瘤的杀伤能力。
DGHNPs合成方法为：参考MUHNPs的合成，利用戊二醛将HSA的氨基(-NH2)与GOD的氨基(-NH2)连接起来，同时，利用两种蛋白的相互交联将阿霉素包裹起来，构建自驱动酶动力蛋白马达DGHNPs。
具体步骤为：取8mg HSA、8mg GOD、3.2mg阿霉素溶于2mL水中，搅拌15min，加入10％的戊二醛溶液，1000rpm避光搅拌9h。然后6000rpm离心6min，除去沉淀，将上清液置于透析袋(分子量：1000kDa)中透析过夜，以除去游离HSA、GOD和DOX。取得到的透析液在6000rpm离心6min，除去沉淀，上清液即为DGHNPs。
DGHNPs的粒径表征如图16所示。
(2)一种酶动力蛋白马达CHNPs，该CHNPs的制备材料为人血清白蛋白(HSA)、过氧化氢酶(catalase，CAT)。CAT在肿瘤微环境中可通过催化反应为CHNPs提供驱动力，增强自扩散运动，从而提高马达对肿瘤的穿透能力。
CHNPs合成方法为：参考MUHNPs的合成，利用戊二醛将HSA的氨基(-NH2)与CAT的氨基(-NH2)连接起来，构建自驱动酶动力蛋白马达CHNPs。
具体步骤为：取8mg HSA、8mg CAT溶于2mL水中，搅拌15min，加入10％的戊二醛溶液，1000rpm避光搅拌9h。然后6000rpm离心6min，除去沉淀，将上清液置于透析袋(分子量：1000kDa)中透析过夜，以除去游离HSA和CAT。取得到的透析液在6000rpm离心6min，除去沉淀，上清液即为CHNPs。
CHNPs的粒径表征如图17所示。
(3)一种酶动力蛋白马达DHNPs，该DHNPs的制备材料为人血清白蛋白(HSA)、DNA酶。DNA酶以从凋亡或者垂死的肿瘤细胞中释放的游离肿瘤DNA为底物通过催化反应为纳米马达提供驱动力，增强自主运动，从而提高马达对肿瘤的穿透能力；同时沿着DNA浓度梯度的方向自主趋化到达肿瘤部位。
DHNPs合成方法为：参考MUHNPs的合成，利用戊二醛将HSA的氨基(-NH2)与DNA酶的氨基(-NH2)连接起来，构建自驱动酶动力蛋白马达DHNPs。
具体步骤为：取8mg HSA、8mg DNA酶溶于2mL水中，搅拌15min，加入10％的戊二醛溶液，1000rpm避光搅拌9h。然后6000rpm离心6min，除去沉淀，将上清液置于透析袋(分子量：1000kDa)中透析过夜，以除去游离HSA和CAT。取得到的透析液在6000rpm离心6min，除去沉淀，上清液即为DHNPs。
DHNPs的粒径表征如图18所示。
(4)一种酶动力蛋白马达LHNPs，该LHNPs的制备材料为人血清白蛋白(HSA)、脂肪酶(Lipase)。脂肪酶可通过催化反应为纳米马达提供驱动力，增强自主运动，从而提高马达对肿瘤的穿透能力，而且其还可以降解体内的甘油三酯，从而应用于医学疾病治疗。
LHNPs合成方法为：参考MUHNPs的合成，利用戊二醛将HSA的氨基(-NH2)与DNA酶的氨基(-NH2)连接起来，构建自驱动酶动力蛋白马达LHNPs。
具体步骤为：取8mg HSA、8mg脂肪酶溶于2mL水中，搅拌15min，加入10％的戊二醛溶液，1000rpm避光搅拌9h。然后6000rpm离心6min，除去沉淀，将上清液置于透析袋(分子量：1000kDa)中透析过夜，以除去游离HSA和CAT。取得到的透析液在6000rpm离心6min，除去沉淀，上清液即为LHNPs。
LHNPs的粒径表征如图19所示。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种酶动力蛋白马达，其特征在于，所述酶动力蛋白马达包括人血清白蛋白、与所述人血清白蛋白连接的蛋白酶和负载于人血清白蛋白与蛋白酶连接网络内的药物；所述蛋白酶为脲酶；所述药物包括谷氨酰胺合成酶抑制剂；所述谷氨酰胺合成酶抑制剂包括蛋氨酸亚砜亚胺、草铵膦中的一种或多种；
所述酶动力蛋白马达由包括以下制备方法制备得到：
1）将人血清白蛋白、蛋白酶和药物混合，加入交联剂；
2）离心除去沉淀，透析，再次离心除去沉淀，即得酶动力蛋白马达；
所述交联剂为戊二醛；
所述酶动力蛋白马达呈球形结构，粒径为100~400 nm。
2.根据权利要求1所述的酶动力蛋白马达，其特征在于，所述药物还包括化疗药物；所述化疗药物包括阿霉素、紫杉醇、吉西他滨和奥沙利铂中的一种或多种。
3.权利要求1或2所述的酶动力蛋白马达的制备方法，包括如下步骤：
（1）将人血清白蛋白、蛋白酶和药物混合，加入交联剂；
（2）离心除去沉淀，透析，再次离心除去沉淀，即得酶动力蛋白马达。
4.权利要求1或2所述的酶动力蛋白马达在下述（1）或（2）中的应用；
（1）制备药物递送工具；
（2）制备肿瘤诊断和治疗药物。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为谷氨酰胺合成酶高表达，或谷氨酰胺合成酶低表达但通过肿瘤内的基质细胞实现补偿的肿瘤。
6.一种酶动力驱动递送系统，其特征在于，所述酶动力驱动递送系统包括权利要求1所述的酶动力蛋白马达，和对应于所述酶动力蛋白马达中的蛋白酶的底物；
所述酶动力蛋白马达中的蛋白酶为脲酶；
所述底物为尿素。
7.权利要求6所述的酶动力驱动递送系统在下述（3）或（4）中的应用；
（3）制备药物递送产品；
（4）制备肿瘤诊断和治疗产品。
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