JP2022507253A - チェックポイント分子に対する多重特異性結合性構築物およびその使用 - Google Patents

チェックポイント分子に対する多重特異性結合性構築物およびその使用 Download PDF

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Abstract

本開示は、免疫チェックポイント抑制を低減することにより腫瘍逃避を阻害するための組成物および方法に関する。一部の実施形態では、ＰＤ－１ならびにそのリガンド（例えば、ＰＤ－１および／またはＰＤ－Ｌ２）が発現された細胞の相互作用を促進しながらＰＤ－１およびそのリガンドの間の相互作用を遮断する組成物が本明細書において提供される。そのような組成物を使用する方法もまた提供される。

Description

本開示は、チェックポイント分子に対する多重特異性結合性構築物およびその使用に関する。
がんは、米国および世界中の両方において死の主因の１つである。手術、放射線、化学療法、ホルモン療法、標的化療法、および免疫療法などの一般的な治療は、２０世紀中にがん関連死の率を減少させたが、２０１２年現在に世界中で１４１０万人の新たに診断されたがん症例および８２０万人のがんでの死亡があった。２０世紀中に全体的ながん生存率の向上があったが、がんは依然として世界中で７人中１人の死亡の原因となっている。非特許文献１を参照。
近年、増加しつつある証拠は、免疫系は腫瘍の形成および進行に対する重大なバリアとして作動することを示唆する。抗腫瘍潜在能力または活性を有する天然に存在するＴ細胞ががんを有する患者において存在するという原理は、腫瘍学における免疫療法アプローチの開発を合理化した。Ｔ細胞、マクロファージ、およびナチュラルキラー細胞などの免疫細胞は、抗腫瘍活性を呈し、悪性腫瘍の出現および成長を有効に制御することができる。腫瘍特異的または関連抗原は、悪性腫瘍を認識および排除するように免疫細胞を誘導することができる（非特許文献２）。腫瘍特異的な免疫応答の存在にもかかわらず、悪性腫瘍は多くの場合に様々な免疫調節機構を通じて免疫攻撃から逃避しまたはそれを回避して、腫瘍の出現および進行を制御することの失敗を結果としてもたらす（非特許文献３）。実際に、がんの新興の特徴は、これらの免疫調節機構の活用および抗腫瘍免疫応答の不能であり、免疫学的殺傷からの腫瘍逃避およびエスケープを結果としてもたらす（非特許文献４）。
Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｏｃｉｅｔｙ， Ｇｌｏｂａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｆａｃｔｓ ＆ Ｆｉｇｕｒｅｓ ３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， アメリカがん協会（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｏｃｉｅｔｙ）［米国アトランタ（Ａｔｌａｎｔａ）所在］， ２０１５ チェン（Ｃｈｅｎ）およびメルマン（Ｍｅｌｌｍａｎ）， （２０１３） Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ３９（１）：１－１０ モッツ（Ｍｏｔｚ）およびコウコス（Ｃｏｕｋｏｓ）， （２０１３） Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ３９（１）：６１－７３０ ハナハン（Ｈａｎａｈａｎ）およびワインバーグ（Ｗｅｉｎｂｅｒｇ）（２０１１） Ｃｅｌｌ １４４（５）：６４６－６７４
がんの免疫療法における新規のアプローチは、これらの免疫逃避およびエスケープ機構に対抗し、腫瘍を拒絶するように内因性の免疫系を誘導することを伴う。しかしながら、特にがん治療法における、免疫逃避に有効に対抗する新規の治療法に対する必要性が依然として存在する。
本開示は、ＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１の両方を標的化する新規の多重特異性および多価構築物、例えば、二重特異性および四価構築物に部分的に基づく。本明細書において実証されるように、これらの多重特異性構築物は、個々の抗体の組合せとの比較の他に、臨床的なチェックポイント遮断剤と比較して、向上したｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ効力を有する。そのような多重特異性および多価構築物において使用するための、新規のモノクローナル抗ＰＤ－１抗体およびその抗原結合性断片、ならびに新規のモノクローナル抗ＰＤ－Ｌ１抗体およびその抗原結合性断片もまた本明細書において提供される。これらの新規のモノクローナル抗ＰＤ－１抗体および新規のモノクローナル抗ＰＤ－Ｌ１抗体の一部は共通の軽鎖を共有し、それにより、驚くべき優れた薬物様特性（ＤＬＰ）および容易な生産可能性の他にそれらの親抗体に類似した親和性を有する多重特異性および多価構築物の生成を可能とする。本開示はまた、免疫細胞により発現されたＰＤ－１および第２の細胞上に発現されたそのリガンド（例えば、ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２）の間の相互作用を遮断すると共に、該免疫細胞および該第２の細胞（例えば、別の免疫細胞、またはＰＤ－１リガンドを発現する腫瘍細胞）をブリッジ形成させることは、例えば、Ｔ細胞の増殖、ＩＦＮγの産生および分泌、ならびにＴ細胞の細胞溶解活性を強く増進するという発見に部分的に基づく。そのため、ＰＤ－１およびそのリガンド（ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２）が発現された細胞の相互作用（ブリッジ形成）を促進しながらＰＤ－１およびそのリガンドの間の相互作用を遮断する組成物が本明細書において提供される。本明細書において例示されるように、「遮断およびブリッジ形成」の能力を有する本開示のそのような組成物は、例えば、受容体およびリガンドに別々に結合する化学量論量の剤を有するカクテル、または受容体もしくはリガンドのいずれかに結合する単一の剤と比較して、（例えば、ＩＦＮγの産生および分泌ならびにｉｎ ｖｉｖｏ活性により測定されるような）優位な抗腫瘍有効性を提供する。本明細書に記載のＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１の両方を標的化する多重特異性および多価構築物は、価数依存性の様式で、細胞表面上のＰＤ－１の発現の喪失を引き起こすこともまた見出された。ＰＤ－１発現のこの喪失は、親抗体の組合せを化学量論的に同等の量で使用した場合には観察されなかった。よって、本明細書に記載のＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１の両方を標的化する多重特異性および多価構築物は、がんの治療において使用するための増加した効力および有効性を有する新規の免疫療法剤を提供する。
一部の実施形態では、本明細書に開示される任意の多重特異性抗原結合性構築物は少なくとも２つの異なる受容体またはエピトープ（例えば、ＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１）に結合し、多重特異性抗原結合性構築物により結合される２つの異なる受容体またはエピトープは同じ細胞の表面上に発現されている。例えば、一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物はＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１に同時に結合し、ＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１は同じ細胞の表面上に発現されている。一部の実施形態では、本明細書に開示される任意の多重特異性抗原結合性構築物は少なくとも２つの異なる受容体またはエピトープ（例えば、ＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１）に結合し、多重特異性抗原結合性構築物により結合される２つの異なる受容体またはエピトープは２つの異なる細胞の表面上に発現されている。例えば、一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物は、第１の細胞の表面上に発現されたＰＤ－１および第２の細胞の表面上に発現されたＰＤ－１リガンド、例えば、ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２に同時に結合する。
一部の実施形態では、本開示は、少なくとも２つの抗原結合性アームを含む多重特異性抗原結合性構築物であって、第１のアームが、免疫細胞により発現されたＰＤ－１に結合し、第２のアームが、第２の細胞により発現されたＰＤ－１リガンドに結合し、多重特異性抗原結合性構築物がＰＤ－１およびＰＤ－１リガンドの相互作用を遮断する、多重特異性抗原結合性構築物を提供する。一部の実施形態では、ＰＤ－１リガンドはＰＤ－Ｌ２である。一部の実施形態では、ＰＤ－１リガンドはＰＤ－Ｌ１である。一部の実施形態では、免疫細胞はＴ細胞である。一部の実施形態では、Ｔ細胞はＣＤ８＋ Ｔ細胞である。一部の実施形態では、免疫細胞はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。一部の実施形態では、免疫細胞はマクロファージである。一部の実施形態では、第２の細胞は第２の免疫細胞である。一部の実施形態では、第２の免疫細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、骨髄由来抑制細胞、樹状細胞、または間葉間質細胞のいずれか１つまたは複数である。一部の実施形態では、第２の免疫細胞は制御性Ｔ細胞である。一部の実施形態では、第２の細胞は腫瘍細胞である。一部の実施形態では、腫瘍細胞は、血液がん、リンパ腫、骨髄腫、白血病、神経学的がん、黒色腫、乳がん、前立腺がん、結腸直腸がん、肺がん、頭頸部がん、胃腸がん、肝臓がん、膵臓がん、泌尿生殖器がん、骨がん、腎臓がん、および血管がんからなる群から選択される。一部の実施形態では、両方のアームは、少なくとも１×１０－７Ｍ、少なくとも１×１０－８Ｍ、少なくとも１×１０－９Ｍ、または少なくとも１×１０－１０ＭのＫＤを有する。一部の実施形態では、１つのアームのその標的への結合は、他のアームのその標的への結合を遮断しない。一部の実施形態では、第１のアームおよび第２のアームはそれらの各々の標的に結合し、両方のアームは同時に結合したままとなる。一部の実施形態では、第１のアームおよび第２のアームのそれらの各々の標的への結合は、免疫細胞および第２の細胞を一緒になるようにブリッジ形成させることができる。一部の実施形態では、免疫細胞および第２の細胞のブリッジ形成は、フローサイトメトリーにより決定される。一部の実施形態では、第１のアームはＰＤ－１のアンタゴニストである。
多重特異性抗原結合性構築物の一部の実施形態では、第１のアームはＰＤ－１に結合し、（ａ）（ｉ）配列番号７０（ＦＴＦＸ１Ｘ２ＹＡＸ３Ｘ４であり、Ｘ１＝Ｓ、Ｒ、Ｇ、またはＮであり、Ｘ２＝Ｄ、Ｓ、Ｎ、Ａ、Ｒ、またはＧであり、Ｘ３＝ＭまたはＬであり、Ｘ４＝Ｓ、Ｌ、またはＮである）を含むＣＤＲＨ１、（ｉｉ）配列番号７１（ＳＡＩＳＮＳＧＴＹＴＹＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、および（ｉｉｉ）配列番号７２（ＡＲＧＬＤＦＩＶＧＸ５ＴＧＮＤＹであり、Ｘ５＝Ａ、Ｙ、またはＲである）を含むＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域、ならびに（ｂ）（ｉ）配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含むＣＤＲＬ１、（ｉｉ）配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含むＣＤＲＬ２、および（ｉｉｉ）配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含むＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含む。
一部の実施形態では、第１のアームのＣＤＲＨ１は配列番号７３（ＦＴＦＳＤＹＡＭＳ）を含み、第１のアームのＣＤＲＨ２は配列番号７１（ＳＡＩＳＮＳＧＴＹＴＹＹＡ）を含み、第１のアームのＣＤＲＨ３は配列番号７４（ＡＲＧＬＤＦＩＶＧＡＴＧＮＤＹ）を含む。一部の実施形態では、第１のアームのＣＤＲＨ１は配列番号７３（ＦＴＦＳＤＹＡＭＳ）を含み、第１のアームのＣＤＲＨ２は配列番号７１（ＳＡＩＳＮＳＧＴＹＴＹＹＡ）を含み、第１のアームのＣＤＲＨ３は配列番号７５（ＡＲＧＬＤＦＩＶＧＹＴＧＮＤＹ）を含む。一部の実施形態では、第１のアームのＣＤＲＨ１は配列番号７６（ＦＴＦＳＳＹＡＭＳ）を含み、第１のアームのＣＤＲＨ２は配列番号７１（ＳＡＩＳＮＳＧＴＹＴＹＹＡ）を含み、第１のアームのＣＤＲＨ３は配列番号７５（ＡＲＧＬＤＦＩＶＧＹＴＧＮＤＹ）を含む。一部の実施形態では、第１のアームのＣＤＲＨ１は配列番号７７（ＦＴＦＳＳＹＡＭＬ）を含み、第１のアームのＣＤＲＨ２は配列番号７１（ＳＡＩＳＮＳＧＴＹＴＹＹＡ）を含み、第１のアームのＣＤＲＨ３は配列番号７５（ＡＲＧＬＤＦＩＶＧＹＴＧＮＤＹ）を含む。一部の実施形態では、第１のアームのＣＤＲＨ１は配列番号７８（ＦＴＦＳＮＹＡＬＳ）を含み、第１のアームのＣＤＲＨ２は配列番号７１（ＳＡＩＳＮＳＧＴＹＴＹＹＡ）を含み、第１のアームのＣＤＲＨ３は配列番号７５（ＡＲＧＬＤＦＩＶＧＹＴＧＮＤＹ）を含む。一部の実施形態では、第１のアームのＣＤＲＨ１は配列番号７９（ＦＴＦＳＡＹＡＭＮ）を含み、第１のアームのＣＤＲＨ２は配列番号７１（ＳＡＩＳＮＳＧＴＹＴＹＹＡ）を含み、第１のアームのＣＤＲＨ３は配列番号７５（ＡＲＧＬＤＦＩＶＧＹＴＧＮＤＹ）を含む。一部の実施形態では、第１のアームのＣＤＲＨ１は配列番号８０（ＦＴＦＲＳＹＡＭＳ）を含み、第１のアームのＣＤＲＨ２は配列番号７１（ＳＡＩＳＮＳＧＴＹＴＹＹＡ）を含み、第１のアームのＣＤＲＨ３は配列番号７５（ＡＲＧＬＤＦＩＶＧＹＴＧＮＤＹ）を含む。一部の実施形態では、第１のアームのＣＤＲＨ１は配列番号８１（ＦＴＦＧＲＹＡＭＳ）を含み、第１のアームのＣＤＲＨ２は配列番号７１（ＳＡＩＳＮＳＧＴＹＴＹＹＡ）を含み、第１のアームのＣＤＲＨ３は配列番号７５（ＡＲＧＬＤＦＩＶＧＹＴＧＮＤＹ）を含む。一部の実施形態では、第１のアームのＣＤＲＨ１は配列番号８２（ＦＴＦＮＳＹＡＭＳ）を含み、第１のアームのＣＤＲＨ２は配列番号７１（ＳＡＩＳＮＳＧＴＹＴＹＹＡ）を含み、第１のアームのＣＤＲＨ３は配列番号７５（ＡＲＧＬＤＦＩＶＧＹＴＧＮＤＹ）を含む。一部の実施形態では、第１のアームのＣＤＲＨ１は配列番号８３（ＦＴＦＳＮＹＡＭＳ）を含み、第１のアームのＣＤＲＨ２は配列番号７１（ＳＡＩＳＮＳＧＴＹＴＹＹＡ）を含み、第１のアームのＣＤＲＨ３は配列番号７４（ＡＲＧＬＤＦＩＶＧＡＴＧＮＤＹ）を含む。一部の実施形態では、第１のアームのＣＤＲＨ１は配列番号８４（ＦＴＦＳＧＹＡＭＳ）を含み、第１のアームのＣＤＲＨ２は配列番号７１（ＳＡＩＳＮＳＧＴＹＴＹＹＡ）を含み、第１のアームのＣＤＲＨ３は配列番号８５（ＡＲＧＬＤＦＩＶＧＲＴＧＮＤＹ）を含む。一部の実施形態では、第１のアームのＣＤＲＨ１は配列番号８６（ＦＴＦＳＳＹＡＭＮ）を含み、第１のアームのＣＤＲＨ２は配列番号７１（ＳＡＩＳＮＳＧＴＹＴＹＹＡ）を含み、第１のアームのＣＤＲＨ３は配列番号８５（ＡＲＧＬＤＦＩＶＧＲＴＧＮＤＹ）を含む。一部の実施形態では、第１のアームのＣＤＲＨ１は配列番号８０（ＦＴＦＲＳＹＡＭＳ）を含み、第１のアームのＣＤＲＨ２は配列番号７１（ＳＡＩＳＮＳＧＴＹＴＹＹＡ）を含み、第１のアームのＣＤＲＨ３は配列番号８５（ＡＲＧＬＤＦＩＶＧＲＴＧＮＤＹ）を含む。
一部の実施形態では、第１のアームのＣＤＲＬ１は配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含み、第１のアームのＣＤＲＬ２は配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含み、第１のアームのＣＤＲＬ３は配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含む。
一部の実施形態では、第１のアームの重鎖可変領域は、配列番号８７に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１のアームの重鎖可変領域は、配列番号８８に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１のアームの重鎖可変領域は、配列番号８９に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１のアームの重鎖可変領域は、配列番号９０に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１のアームの重鎖可変領域は、配列番号９１に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１のアームの重鎖可変領域は、配列番号９２に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１のアームの重鎖可変領域は、配列番号９３に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１のアームの重鎖可変領域は、配列番号９４に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１のアームの重鎖可変領域は、配列番号９５に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１のアームの重鎖可変領域は、配列番号９６に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１のアームの重鎖可変領域は、配列番号９７に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１のアームの重鎖可変領域は、配列番号９８に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１のアームの重鎖可変領域は、配列番号９９に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１のアームの軽鎖可変領域は、配列番号５９に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、第２のアームはＰＤ－１リガンドのアンタゴニストである。一部の実施形態では、第２のアームはＰＤ－Ｌ２のアンタゴニストである。一部の実施形態では、第２のアームはＰＤ－Ｌ１のアンタゴニストである。一部の実施形態では、第２のアームはＰＤ－Ｌ１に結合し、ａ．（ｉ）配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含むＣＤＲＨ１、（ｉｉ）配列番号２（ＧＧＩＩＰＸ１Ｘ２ＧＸ３ＡＴＹＡであり、Ｘ１はＶまたはＩであり、Ｘ２はＦ、Ｌ、またはＶであり、Ｘ３はＴまたはＡである）を含むＣＤＲＨ２、および（ｉｉｉ）配列番号３（ＡＲＬＫＸ１ＥＬＫＤＡＦＤＩであり、Ｘ１はＧ、Ｆ、またはＮである）を含むＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域、ならびにｂ．（ｉ）配列番号４（ＲＡＳＱＸ１ＩＳＳＹＬＮであり、Ｘ１はＳ、Ｗ、またはＱである）を含むＣＤＲＬ１、（ｉｉ）配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含むＣＤＲＬ２、および（ｉｉｉ）配列番号６（Ｘ１ＱＳＹＳＴＰＬＴであり、Ｘ１はＱまたはＦである）を含むＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含む。
一部の実施形態では、第２のアームのＣＤＲＨ１は配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、第２のアームのＣＤＲＨ２は配列番号７（ＧＧＩＩＰＩＬＧＡＡＴＹＡ）を含み、第２のアームのＣＤＲＨ３は配列番号８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含む。一部の実施形態では、第２のアームのＣＤＲＨ１は配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、第２のアームのＣＤＲＨ２は配列番号７（ＧＧＩＩＰＩＬＧＡＡＴＹＡ）を含み、第２のアームのＣＤＲＨ３は配列番号８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含み、第２のアームのＣＤＲＬ１は配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含み、第２のアームのＣＤＲＬ２は配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含み、第２のアームのＣＤＲＬ３は配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含む。
一部の実施形態では、第２のアームのＣＤＲＨ１は配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、第２のアームのＣＤＲＨ２は配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含み、第２のアームのＣＤＲＨ３は配列番号８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含み、第２のアームのＣＤＲＬ１は配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含み、第２のアームのＣＤＲＬ２は配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含み、第２のアームのＣＤＲＬ３は配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含む。一部の実施形態では、第２のアームのＣＤＲＨ１は配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、第２のアームのＣＤＲＨ２は配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含み、第２のアームのＣＤＲＨ３は配列番号８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含む。一部の実施形態では、第２のアームのＣＤＲＨ１は配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、第２のアームのＣＤＲＨ２は配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含み、第２のアームのＣＤＲＨ３は配列番号８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含み、第２のアームのＣＤＲＬ１は配列番号１２（ＲＡＳＱＷＩＳＳＹＬＮ）を含み、第２のアームのＣＤＲＬ２は配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含み、第２のアームのＣＤＲＬ３は配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含む。一部の実施形態では、第２のアームのＣＤＲＨ１は配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、第２のアームのＣＤＲＨ２は配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含み、第２のアームのＣＤＲＨ３は配列番号８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含み、第２のアームのＣＤＲＬ１は配列番号１３（ＲＡＳＱＱＩＳＳＹＬＮ）を含み、第２のアームのＣＤＲＬ２は配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含み、第２のアームのＣＤＲＬ３は配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含む。一部の実施形態では、第２のアームのＣＤＲＨ１は配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、第２のアームのＣＤＲＨ２は配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含み、第２のアームのＣＤＲＨ３は配列番号８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含み、第２のアームのＣＤＲＬ１は配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含み、第２のアームのＣＤＲＬ２は配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含み、第２のアームのＣＤＲＬ３は配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含む。
一部の実施形態では、第２のアームのＣＤＲＨ１は配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、第２のアームのＣＤＲＨ２は配列番号１５（ＧＧＩＩＰＩＦＧＩＡＮＹＡ）を含み、第２のアームのＣＤＲＨ３は配列番号８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含む。一部の実施形態では、第２のアームのＣＤＲＨ１は配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、第２のアームのＣＤＲＨ２は配列番号１５（ＧＧＩＩＰＩＦＧＩＡＮＹＡ）を含み、第２のアームのＣＤＲＨ３は配列番号８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含み、第２のアームのＣＤＲＬ１は配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含み、第２のアームのＣＤＲＬ２は配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含み、第２のアームのＣＤＲＬ３は配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含む。
一部の実施形態では、第２のアームのＣＤＲＨ１は配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、第２のアームのＣＤＲＨ２は配列番号１６（ＧＧＩＩＰＮＦＧＴＡＴＹＡ）を含み、第２のアームのＣＤＲＨ３は配列番号１７（ＡＲＬＫＧＥＬＫＧＡＧＤＩ）を含む。一部の実施形態では、第２のアームのＣＤＲＨ１は配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、第２のアームのＣＤＲＨ２は配列番号１６（ＧＧＩＩＰＮＦＧＴＡＴＹＡ）を含み、第２のアームのＣＤＲＨ３は配列番号１７（ＡＲＬＫＧＥＬＫＧＡＧＤＩ）を含み、第２のアームのＣＤＲＬ１は配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含み、第２のアームのＣＤＲＬ２は配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含み、第２のアームのＣＤＲＬ３は配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含む。
一部の実施形態では、第２のアームのＣＤＲＨ１は配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、第２のアームのＣＤＲＨ２は配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含み、第２のアームのＣＤＲＨ３は配列番号１８（ＡＲＬＫＦＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含む。一部の実施形態では、第２のアームのＣＤＲＨ１は配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、第２のアームのＣＤＲＨ２は配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含み、第２のアームのＣＤＲＨ３は配列番号１８（ＡＲＬＫＦＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含み、第２のアームのＣＤＲＬ１は配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含み、第２のアームのＣＤＲＬ２は配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含み、第２のアームのＣＤＲＬ３は配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含む。
一部の実施形態では、第２のアームのＣＤＲＨ１は配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、第２のアームのＣＤＲＨ２は配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含み、第２のアームのＣＤＲＨ３は配列番号１９（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＥ）を含む。一部の実施形態では、第２のアームのＣＤＲＨ１は配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、第２のアームのＣＤＲＨ２は配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含み、第２のアームのＣＤＲＨ３は配列番号１９（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＥ）を含み、第２のアームのＣＤＲＬ１は配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含み、第２のアームのＣＤＲＬ２は配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含み、第２のアームのＣＤＲＬ３は配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含む。
一部の実施形態では、第２のアームのＣＤＲＨ１は配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、第２のアームのＣＤＲＨ２は配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含み、第２のアームのＣＤＲＨ３は配列番号２０（ＡＲＬＫＮＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含む。一部の実施形態では、第２のアームのＣＤＲＨ１は配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、第２のアームのＣＤＲＨ２は配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含み、第２のアームのＣＤＲＨ３は配列番号２０（ＡＲＬＫＮＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含み、第２のアームのＣＤＲＬ１は配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含み、第２のアームのＣＤＲＬ２は配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含み、第２のアームのＣＤＲＬ３は配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含む。
一部の実施形態では、第２のアームのＣＤＲＨ１は配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、第２のアームのＣＤＲＨ２は配列番号２１（ＧＧＶＩＰＦＬＧＴＡＮＹＡ）を含み、第２のアームのＣＤＲＨ３は配列番号２２（ＡＲＬＫＧＩＬＫＤＡＬＤＩ）を含む。一部の実施形態では、第２のアームのＣＤＲＨ１は配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、第２のアームのＣＤＲＨ２は配列番号２１（ＧＧＶＩＰＦＬＧＴＡＮＹＡ）を含み、第２のアームのＣＤＲＨ３は配列番号２２（ＡＲＬＫＧＩＬＫＤＡＬＤＩ）を含み、第２のアームのＣＤＲＬ１は配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含み、第２のアームのＣＤＲＬ２は配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含み、第２のアームのＣＤＲＬ３は配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含む。
一部の実施形態では、第２のアームのＣＤＲＨ１は配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、第２のアームのＣＤＲＨ２は配列番号２９（ＧＲＩＩＰＩＦＧＴＡＤＹＡ）を含み、第２のアームのＣＤＲＨ３は配列番号８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含む。一部の実施形態では、第２のアームのＣＤＲＨ１は配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、第２のアームのＣＤＲＨ２は配列番号２９（ＧＲＩＩＰＩＦＧＴＡＤＹＡ）を含み、第２のアームのＣＤＲＨ３は配列番号８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含み、第２のアームのＣＤＲＬ１は配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含み、第２のアームのＣＤＲＬ２は配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含み、第２のアームのＣＤＲＬ３は配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含む。
一部の実施形態では、第２のアームのＣＤＲＨ１は配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、第２のアームのＣＤＲＨ２は配列番号３１（ＧＧＩＩＰＩＬＧＴＡＴＹＡ）を含み、第２のアームのＣＤＲＨ３は配列番号３２（ＡＲＲＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含む。一部の実施形態では、第２のアームのＣＤＲＨ１は配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、第２のアームのＣＤＲＨ２は配列番号３１（ＧＧＩＩＰＩＬＧＴＡＴＹＡ）を含み、第２のアームのＣＤＲＨ３は配列番号３２（ＡＲＲＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含み、第２のアームのＣＤＲＬ１は配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含み、第２のアームのＣＤＲＬ２は配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含み、第２のアームのＣＤＲＬ３は配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含む。
一部の実施形態では、第２のアームのＣＤＲＨ１は配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、第２のアームのＣＤＲＨ２は配列番号３３（ＧＧＩＩＰＩＶＡＴＡＮＹＡ）を含み、第２のアームのＣＤＲＨ３は配列番号３２（ＡＲＲＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含む。一部の実施形態では、第２のアームのＣＤＲＨ１は配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、第２のアームのＣＤＲＨ２は配列番号３３（ＧＧＩＩＰＩＶＡＴＡＮＹＡ）を含み、第２のアームのＣＤＲＨ３は配列番号３２（ＡＲＲＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含み、第２のアームのＣＤＲＬ１は配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含み、第２のアームのＣＤＲＬ２は配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含み、第２のアームのＣＤＲＬ３は配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含む。
一部の実施形態では、第２のアームのＣＤＲＨ１は配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、第２のアームのＣＤＲＨ２は配列番号３４（ＧＧＩＩＰＩＦＧＫＡＴＹＡ）を含み、第２のアームのＣＤＲＨ３は配列番号３２（ＡＲＲＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含む。一部の実施形態では、第２のアームのＣＤＲＨ１は配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、第２のアームのＣＤＲＨ２は配列番号３４（ＧＧＩＩＰＩＦＧＫＡＴＹＡ）を含み、第２のアームのＣＤＲＨ３は配列番号３２（ＡＲＲＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含み、第２のアームのＣＤＲＬ１は配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含み、第２のアームのＣＤＲＬ２は配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含み、第２のアームのＣＤＲＬ３は配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含む。
一部の実施形態では、第２のアームのＣＤＲＨ１は配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、第２のアームのＣＤＲＨ２は配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含み、第２のアームのＣＤＲＨ３は配列番号８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含み、第２のアームのＣＤＲＬ１は配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含み、第２のアームのＣＤＲＬ２は配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含み、第２のアームのＣＤＲＬ３は配列番号３８（ＦＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含む。
一部の実施形態では、第２のアームのＣＤＲＨ１は配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、第２のアームのＣＤＲＨ２は配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含み、第２のアームのＣＤＲＨ３は配列番号８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含み、第２のアームのＣＤＲＬ１は配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含み、第２のアームのＣＤＲＬ２は配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含み、第２のアームのＣＤＲＬ３は配列番号３９（ＱＱＳＹＳＴＩＬＴ）を含む。
一部の実施形態では、第２のアームは、ａ．（ｉ）配列番号１４（ＧＴＦＳＳＹＡＦＳ）を含むＣＤＲＨ１、（ｉｉ）配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含むＣＤＲＨ２および（ｉｉｉ）配列番号８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含むＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域、ならびにｂ．（ｉ）配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含むＣＤＲＬ１、（ｉｉ）配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含むＣＤＲＬ２、および（ｉｉｉ）配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含むＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含む。
一部の実施形態では、第２のアームは、（ｉ）配列番号２３（ＧＴＦＳＳＹＡＩＳ）を含むＣＤＲＨ１、（ｉｉ）配列番号２４（ＧＧＩＩＰＩＶＧＩＡＮＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、および（ｉｉｉ）配列番号８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含むＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域を含む。一部の実施形態では、第２のアームは、（ｉ）配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含むＣＤＲＬ１、（ｉｉ）配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含むＣＤＲＬ２、および（ｉｉｉ）配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含むＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含む。
一部の実施形態では、第２のアームは、（ｉ）配列番号２３（ＧＴＦＳＳＹＡＩＳ）を含むＣＤＲＨ１、（ｉｉ）配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、および（ｉｉｉ）配列番号２５（ＡＲＬＫＧＥＦＫＤＡＦＤＩ）を含むＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域を含む。一部の実施形態では、第２のアームは、（ｉ）配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含むＣＤＲＬ１、（ｉｉ）配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含むＣＤＲＬ２、および（ｉｉｉ）配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含むＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含む。
一部の実施形態では、第２のアームは、（ｉ）配列番号２３（ＧＴＦＳＳＹＡＩＳ）を含むＣＤＲＨ１、（ｉｉ）配列番号２６（ＧＲＩＩＰＬＦＧＴＡＨＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、および（ｉｉｉ）配列番号８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含むＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域を含む。一部の実施形態では、第２のアームは、（ｉ）配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含むＣＤＲＬ１、（ｉｉ）配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含むＣＤＲＬ２、および（ｉｉｉ）配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含むＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含む。
一部の実施形態では、第２のアームは、（ｉ）配列番号２３（ＧＴＦＳＳＹＡＩＳ）を含むＣＤＲＨ１、（ｉｉ）配列番号２７（ＧＲＩＮＰＩＬＧＴＡＮＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、および（ｉｉｉ）配列番号２８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＳＩ）を含むＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域を含む。一部の実施形態では、第２のアームは、（ｉ）配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含むＣＤＲＬ１、（ｉｉ）配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含むＣＤＲＬ２、および（ｉｉｉ）配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含むＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含む。
一部の実施形態では、第２のアームは、（ｉ）配列番号２３（ＧＴＦＳＳＹＡＩＳ）を含むＣＤＲＨ１、（ｉｉ）配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、および（ｉｉｉ）配列番号３０（ＡＲＬＫＧＥＬＫＣＡＦＤＩ）を含むＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域を含む。一部の実施形態では、第２のアームは、（ｉ）配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含むＣＤＲＬ１、（ｉｉ）配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含むＣＤＲＬ２、および（ｉｉｉ）配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含むＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含む。
一部の実施形態では、第２のアームは、（ｉ）配列番号１２２（ＧＴＫＳＳＹＡＩＳ）を含むＣＤＲＨ１、（ｉｉ）配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、および（ｉｉｉ）配列番号３０（ＡＲＬＫＧＥＬＫＣＡＦＤＩ）を含むＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域を含む。一部の実施形態では、第２のアームは、（ｉ）配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含むＣＤＲＬ１、（ｉｉ）配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含むＣＤＲＬ２、および（ｉｉｉ）配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含むＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域をさらに含む。
一部の実施形態では、第２のアームは、（ｉ）配列番号３６（ＧＰＦＲＳＨＡＶＳ）を含むＣＤＲＨ１、（ｉｉ）配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、および（ｉｉｉ）配列番号３７（ＡＲＬＫＳＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含むＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域を含む。一部の実施形態では、第２のアームは、（ｉ）配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含むＣＤＲＬ１、（ｉｉ）配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含むＣＤＲＬ２、および（ｉｉｉ）配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含むＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含む。
一部の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１に結合する第２のアームは、配列番号３５、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、または５８のいずれか１つに対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号５９、６０、６１、６２、または６３のいずれか１つに対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
一部の実施形態では、第２のアームの重鎖可変領域は、配列番号３５（ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＳＹＡＩＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ）に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第２のアームの重鎖可変領域は、配列番号４０（ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＳＹＡＦＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ）に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第２のアームの重鎖可変領域は、配列番号４１（ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＳＹＡＩＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧＩＩＰＩＦＧＩＡＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ）に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第２のアームの重鎖可変領域は、配列番号４２（ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＳＹＡＩＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧＩＩＰＮＦＧＴＡＴＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＬＫＧＥＬＫＧＡＧＤＩＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ）に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第２のアームの重鎖可変領域は、配列番号４３（ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＳＹＡＩＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＬＫＦＥＬＫＤＡＦＤＩＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ）に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第２のアームの重鎖可変領域は、配列番号４４（ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＳＹＡＩＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＥＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ）に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第２のアームの重鎖可変領域は、配列番号４５（ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＳＹＡＩＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩＷＧＱＧＴＬＶＴＡＳＴ）に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第２のアームの重鎖可変領域は、配列番号４６（ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＳＹＡＩＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＬＫＮＥＬＫＤＡＦＤＩＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ）に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第２のアームの重鎖可変領域は、配列番号４７（ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＳＹＡＩＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧＶＩＰＦＬＧＴＡＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＬＫＧＩＬＫＤＡＬＤＩＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ）に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第２のアームの重鎖可変領域は、配列番号４８（ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＳＹＡＩＳＷＶＲＱＡＰＧＱＤＬＥＷＭＧＧＩＩＰＩＶＧＩＡＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ）に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第２のアームの重鎖可変領域は、配列番号４９（ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＳＹＡＩＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＬＫＧＥＦＫＤＡＦＤＩＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ）に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第２のアームの重鎖可変領域は、配列番号５０（ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＳＹＡＩＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＲＩＩＰＬＦＧＴＡＨＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ）に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第２のアームの重鎖可変領域は、配列番号５１（ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＳＹＡＩＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＲＩＮＰＩＬＧＴＡＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＳＩＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ）に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第２のアームの重鎖可変領域は、配列番号５２（ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＳＹＡＩＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＲＩＩＰＩＦＧＴＡＤＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ）に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第２のアームの重鎖可変領域は、配列番号５３（ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＫＦＳＳＹＡＩＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＬＫＧＥＬＫＣＡＦＤＩＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ）に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第２のアームの重鎖可変領域は、配列番号５４（ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＳＹＡＩＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧＩＩＰＩＬＧＴＡＴＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ）に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第２のアームの重鎖可変領域は、配列番号５５（ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＳＹＡＩＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧＩＩＰＩＬＧＡＡＴＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ）に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第２のアームの重鎖可変領域は、配列番号５６（ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＳＹＡＩＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧＩＩＰＩＶＡＴＡＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ）に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第２のアームの重鎖可変領域は、配列番号５７（ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＳＹＡＩＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧＩＩＰＩＦＧＫＡＴＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ）に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第２のアームの重鎖可変領域は、配列番号５８（ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＰＦＲＳＨＡＶＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＬＫＳＥＬＫＤＡＦＤＩＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ）に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第２のアームの軽鎖可変領域は、配列番号５９（ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＳＹＳＴＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ）に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第２のアームの軽鎖可変領域は、配列番号６０（ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＷＩＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＳＹＳＴＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ）に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第２のアームの軽鎖可変領域は、配列番号６１（ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＱＩＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＳＹＳＴＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ）に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第２のアームの軽鎖可変領域は、配列番号６２（ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＦＱＳＹＳＴＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ）に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第２のアームの軽鎖可変領域は、配列番号６３（ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＳＹＳＴＩＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ）に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。
本明細書に記載の任意の態様の一部の実施形態では、構築物は二重特異性抗体である。一部の実施形態では、二重特異性抗体はＰＤ－１およびＰＤ－１リガンドの両方のアンタゴニストである。一部の実施形態では、構築物は共通の軽鎖を含む。一部の実施形態では、アームの一方または両方はアプタマーである。一部の実施形態では、アームの一方または両方は抗体以外のタンパク質である。一部の実施形態では、構築物は少なくとも２つの二重特異性抗体を含む。一部の実施形態では、少なくとも２つの二重特異性抗体の１つはＰＤ－１について一価である。一部の実施形態では、少なくとも２つの二重特異性抗体の１つはＰＤ－１リガンドについて一価である。一部の実施形態では、アームの少なくとも１つはＰＤ－１に対して特異的な二価抗体である。一部の実施形態では、アームの少なくとも１つはＰＤ－Ｌ１に対して特異的な二価抗体である。一部の実施形態では、アームの少なくとも１つはＰＤ－１に対して特異的な二価抗体であり、アームの少なくとも１つはＰＤ－Ｌ１に対して特異的な二価抗体である。一部の実施形態では、アームの少なくとも１つはＰＤ－１について二価である。一部の実施形態では、アームの少なくとも１つはＰＤ－Ｌ１について二価である。一部の実施形態では、アームの少なくとも１つはＰＤ－１について二価であり、アームの少なくとも１つはＰＤ－Ｌ１について二価である。一部の実施形態では、二重特異性抗体はＰＤ－１上の２つの異なるエピトープに結合する。一部の実施形態では、二重特異性抗体はＰＤ－１リガンド上の２つの異なるエピトープに結合する。
一部の実施形態では、本明細書に開示される任意の多重特異性抗原結合性構築物は少なくとも２つの単一特異性抗体を含む。一部の実施形態では、単一特異性抗体の少なくとも１つは抗ＰＤ－１抗体である。一部の実施形態では、抗ＰＤ－１抗体は二価の抗ＰＤ－１抗体である。一部の実施形態では、単一特異性抗体の少なくとも１つは抗ＰＤ－Ｌ１抗体である。一部の実施形態では、抗ＰＤ－１抗体は二価の抗ＰＤ－Ｌ１抗体である。一部の実施形態では、構築物は二価の抗ＰＤ－１抗体および二価の抗ＰＤ－Ｌ１抗体を含む。一部の実施形態では、構築物は、抗ＰＤ－１抗体の可変重鎖を含むポリペプチドが抗ＰＤ－Ｌ１抗体の可変重鎖を含むポリペプチドに融合した融合構築物である。一部の実施形態では、抗ＰＤ－１抗体の可変重鎖を含むポリペプチドは、抗ＰＤ－Ｌ１抗体の可変重鎖を含むポリペプチドにリンカーによって融合している。一部の実施形態では、融合構築物は共通の軽鎖を含む。一部の実施形態では、融合構築物のＮ末端可変重鎖は共通の軽鎖の存在下でＰＤ－１に結合し、融合構築物のＣ末端可変重鎖は共通の軽鎖の存在下でＰＤ－Ｌ１に結合する。一部の実施形態では、融合構築物のＮ末端可変重鎖は共通の軽鎖の存在下でＰＤ－Ｌ１に結合し、融合構築物のＣ末端可変重鎖は共通の軽鎖の存在下でＰＤ－１に結合する。
一部の態様および実施形態では、本開示は、抗原結合の少なくとも２つの単位を含む多重特異性抗原結合性構築物であって、抗原結合の第１の単位がＰＤ－１に結合し、抗原結合の第２の単位がＰＤ－１リガンドに結合する、多重特異性抗原結合性構築物を提供する。一部の実施形態では、抗原結合の第１の単位は、免疫細胞により発現されたＰＤ－１に結合する。一部の実施形態では、抗原結合の第２の単位は、第２の細胞により発現されたＰＤ－１に結合する。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物はＰＤ－１およびＰＤ－１リガンド、例えば、ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２の相互作用を遮断する。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物はＰＤ－１およびＰＤ－１リガンド、例えば、ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２の相互作用を遮断する。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物は、ＰＤ－１に結合する抗原結合の少なくとも２つの単位を含む。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物は、ＰＤ－１に結合する抗原結合の２つの単位を含む。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物は、ＰＤ－１リガンド、例えば、ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２に結合する抗原結合の少なくとも２つの単位を含む。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物は、ＰＤ－１リガンド、例えば、ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２に結合する抗原結合の２つの単位を含む。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物は抗原結合の少なくとも４つの単位を含み、抗原結合の２つの単位はＰＤ－１に結合し、抗原結合の２つの単位はＰＤ－１リガンド、例えば、ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２に結合する。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物は抗原結合の４つの単位を含み、抗原結合の２つの単位はＰＤ－１に結合し、抗原結合の２つの単位はＰＤ－１リガンド、例えば、ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２に結合する。一部の実施形態では、抗原結合の各単位は、そのコグネイト抗原、すなわち、ＰＤ－１またはＰＤ－１リガンド、例えば、ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２に独立して結合することができる。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物は、細胞からのＰＤ－１発現の喪失を促進する。一部の実施形態では、ＰＤ－１発現の喪失はＰＤ－１シェディングに起因する。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物はＰＤ－１およびＰＤ－１リガンド、例えば、ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２の相互作用を遮断する。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物は共通の軽鎖を含む。例えば、抗原結合の少なくとも２つの単位は共通の軽鎖を含む。
一部の実施形態では、抗原結合の第１の単位はＰＤ－１に結合し、
（ａ）（ｉ）配列番号７０（ＦＴＦＸ１Ｘ２ＹＡＸ３Ｘ４であり、Ｘ１＝Ｓ、Ｒ、Ｇ、またはＮであり、Ｘ２＝Ｄ、Ｓ、Ｎ、Ａ、Ｒ、またはＧであり、Ｘ３＝ＭまたはＬであり、Ｘ４＝Ｓ、Ｌ、またはＮである）を含むＣＤＲＨ１、（ｉｉ）配列番号７１（ＳＡＩＳＮＳＧＴＹＴＹＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、および（ｉｉｉ）配列番号７２（ＡＲＧＬＤＦＩＶＧＸ５ＴＧＮＤＹであり、Ｘ５＝Ａ、Ｙ、またはＲである）を含むＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域、ならびに
（ｂ）（ｉ）配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含むＣＤＲＬ１、（ｉｉ）配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含むＣＤＲＬ２、および（ｉｉｉ）配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含むＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域
を含む。
一部のそのような実施形態では、抗原結合の第１の単位はＰＤ－１に結合し、
（ａ）配列番号７３（ＦＴＦＳＤＹＡＭＳ）を含むＣＤＲＨ１、配列番号７１（ＳＡＩＳＮＳＧＴＹＴＹＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、および配列番号７４（ＡＲＧＬＤＦＩＶＧＡＴＧＮＤＹ）を含むＣＤＲＨ３、
（ｂ）配列番号７３（ＦＴＦＳＤＹＡＭＳ）を含むＣＤＲＨ１、配列番号７１（ＳＡＩＳＮＳＧＴＹＴＹＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、および配列番号７５（ＡＲＧＬＤＦＩＶＧＹＴＧＮＤＹ）を含むＣＤＲＨ３、
（ｃ）配列番号７６（ＦＴＦＳＳＹＡＭＳ）を含むＣＤＲＨ１、配列番号７１（ＳＡＩＳＮＳＧＴＹＴＹＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、および配列番号７５（ＡＲＧＬＤＦＩＶＧＹＴＧＮＤＹ）を含むＣＤＲＨ３、
（ｄ）配列番号７７（ＦＴＦＳＳＹＡＭＬ）を含むＣＤＲＨ１、配列番号７１（ＳＡＩＳＮＳＧＴＹＴＹＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、および配列番号７５（ＡＲＧＬＤＦＩＶＧＹＴＧＮＤＹ）を含むＣＤＲＨ３、
（ｅ）配列番号７８（ＦＴＦＳＮＹＡＬＳ）を含むＣＤＲＨ１、配列番号７１（ＳＡＩＳＮＳＧＴＹＴＹＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、および配列番号７５（ＡＲＧＬＤＦＩＶＧＹＴＧＮＤＹ）を含むＣＤＲＨ３、
（ｆ）配列番号７９（ＦＴＦＳＡＹＡＭＮ）を含むＣＤＲＨ１、配列番号７１（ＳＡＩＳＮＳＧＴＹＴＹＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、および配列番号７５（ＡＲＧＬＤＦＩＶＧＹＴＧＮＤＹ）を含むＣＤＲＨ３、
（ｇ）配列番号８０（ＦＴＦＲＳＹＡＭＳ）を含むＣＤＲＨ１、配列番号７１（ＳＡＩＳＮＳＧＴＹＴＹＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、および配列番号７５（ＡＲＧＬＤＦＩＶＧＹＴＧＮＤＹ）を含むＣＤＲＨ３、
（ｈ）配列番号８１（ＦＴＦＧＲＹＡＭＳ）を含むＣＤＲＨ１、配列番号７１（ＳＡＩＳＮＳＧＴＹＴＹＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、および配列番号７５（ＡＲＧＬＤＦＩＶＧＹＴＧＮＤＹ）を含むＣＤＲＨ３、
（ｉ）配列番号８２（ＦＴＦＮＳＹＡＭＳ）を含むＣＤＲＨ１、配列番号７１（ＳＡＩＳＮＳＧＴＹＴＹＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、および配列番号７５（ＡＲＧＬＤＦＩＶＧＹＴＧＮＤＹ）を含むＣＤＲＨ３、
（ｊ）配列番号８３（ＦＴＦＳＮＹＡＭＳ）を含むＣＤＲＨ１、配列番号７１（ＳＡＩＳＮＳＧＴＹＴＹＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、および配列番号７４（ＡＲＧＬＤＦＩＶＧＡＴＧＮＤＹ）を含むＣＤＲＨ３、
（ｋ）配列番号８４（ＦＴＦＳＧＹＡＭＳ）を含むＣＤＲＨ１、配列番号７１（ＳＡＩＳＮＳＧＴＹＴＹＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、および配列番号８５（ＡＲＧＬＤＦＩＶＧＲＴＧＮＤＹ）を含むＣＤＲＨ３、
（ｌ）配列番号８６（ＦＴＦＳＳＹＡＭＮ）を含むＣＤＲＨ１、配列番号７１（ＳＡＩＳＮＳＧＴＹＴＹＹＡ）を含むＣＤＲＨ２および配列番号８５（ＡＲＧＬＤＦＩＶＧＲＴＧＮＤＹ）を含むＣＤＲＨ３、または
（ｍ）配列番号８０（ＦＴＦＲＳＹＡＭＳ）を含むＣＤＲＨ１、配列番号７１（ＳＡＩＳＮＳＧＴＹＴＹＹＡ）を含む、および配列番号８５（ＡＲＧＬＤＦＩＶＧＲＴＧＮＤＹ）を含むＣＤＲＨ３
を含む。
一部の実施形態では、抗原結合の第１の単位はＰＤ－１に結合し、
（ａ）配列番号８７に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
（ｂ）配列番号８８に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
（ｃ）配列番号８９に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
（ｄ）配列番号９０に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
（ｅ）配列番号９１に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
（ｆ）配列番号９２に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
（ｇ）配列番号９３に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
（ｈ）配列番号９４に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
（ｉ）配列番号９５に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
（ｊ）配列番号９６に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
（ｋ）配列番号９７に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
（ｌ）配列番号９８に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、または
（ｍ）配列番号９９に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域
を含む。
一部の実施形態では、抗原結合の第１の単位はＰＤ－１に結合し、配列番号５９に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
一部の実施形態では、抗原結合の第２の単位はＰＤ－Ｌ２に結合する。一部の実施形態では、抗原結合の第２の単位はＰＤ－Ｌ１に結合する。一部の実施形態では、抗原結合の第２の単位はＰＤ－Ｌ１に結合し、
ａ．（ｉ）配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含むＣＤＲＨ１、（ｉｉ）配列番号２（ＧＧＩＩＰＸ１Ｘ２ＧＸ３ＡＴＹＡであり、Ｘ１はＶまたはＩであり、Ｘ２はＦ、Ｌ、またはＶであり、Ｘ３はＴまたはＡである）を含むＣＤＲＨ２、および（ｉｉｉ）配列番号３（ＡＲＬＫＸ１ＥＬＫＤＡＦＤＩであり、Ｘ１はＧ、Ｆ、またはＮである）を含むＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域、ならびに
ｂ．（ｉ）配列番号４（ＲＡＳＱＸ１ＩＳＳＹＬＮであり、Ｘ１はＳ、Ｗ、またはＱである）を含むＣＤＲＬ１、（ｉｉ）配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含むＣＤＲＬ２、および（ｉｉｉ）配列番号６（Ｘ１ＱＳＹＳＴＰＬＴであり、Ｘ１はＱまたはＦである）を含むＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域
を含む。
一部のそのような実施形態では、抗原結合の第２の単位はＰＤ－Ｌ１に結合し、
（ａ）配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含むＣＤＲＨ１、配列番号７（ＧＧＩＩＰＩＬＧＡＡＴＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、および配列番号８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含むＣＤＲＨ３、
（ｂ）配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含むＣＤＲＨ１、配列番号７（ＧＧＩＩＰＩＬＧＡＡＴＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、配列番号８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含むＣＤＲＨ３、配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含むＣＤＲＬ１、配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含むＣＤＲＬ２、および配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含むＣＤＲＬ３、
（ｃ）配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含むＣＤＲＨ１、配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、配列番号８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含むＣＤＲＨ３、配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含むＣＤＲＬ１、配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含むＣＤＲＬ２、および配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含むＣＤＲＬ３、
（ｄ）配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含むＣＤＲＨ１、配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含むＣＤＲＨ２および配列番号８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含むＣＤＲＨ３、
（ｅ）配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含むＣＤＲＨ１、配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、配列番号８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含むＣＤＲＨ３、配列番号１２（ＲＡＳＱＷＩＳＳＹＬＮ）を含むＣＤＲＬ１、配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含むＣＤＲＬ２、および配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含むＣＤＲＬ３、
（ｆ）配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含むＣＤＲＨ１、配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、配列番号８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含むＣＤＲＨ３、配列番号１３（ＲＡＳＱＱＩＳＳＹＬＮ）を含むＣＤＲＬ１、配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含むＣＤＲＬ２、および配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含むＣＤＲＬ３、
（ｇ）配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含むＣＤＲＨ１、配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、配列番号８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含むＣＤＲＨ３、配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含むＣＤＲＬ１、配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含むＣＤＲＬ２、および配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含むＣＤＲＬ３、
（ｈ）配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含むＣＤＲＨ１、配列番号１５（ＧＧＩＩＰＩＦＧＩＡＮＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、および配列番号８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含むＣＤＲＨ３、
（ｉ）配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含むＣＤＲＨ１、配列番号１５（ＧＧＩＩＰＩＦＧＩＡＮＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、配列番号８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含むＣＤＲＨ３、配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含むＣＤＲＬ１、配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含むＣＤＲＬ２、および配列番号１０（ＣＱＱＳＹＳＴＰＬＴＦ）を含むＣＤＲＬ３、
（ｊ）配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含むＣＤＲＨ１、配列番号１６（ＧＧＩＩＰＮＦＧＴＡＴＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、および配列番号１７（ＡＲＬＫＧＥＬＫＧＡＧＤＩ）を含むＣＤＲＨ３、
（ｋ）配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含むＣＤＲＨ１、配列番号１６（ＧＧＩＩＰＮＦＧＴＡＴＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、配列番号１７（ＡＲＬＫＧＥＬＫＧＡＧＤＩ）を含むＣＤＲＨ３、配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含むＣＤＲＬ１、配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含むＣＤＲＬ２、および配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含むＣＤＲＬ３、
（ｌ）配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含むＣＤＲＨ１、配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、および配列番号１８（ＡＲＬＫＦＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含むＣＤＲＨ３、
（ｍ）配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含むＣＤＲＨ１、配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、配列番号１８（ＡＲＬＫＦＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含むＣＤＲＨ３、配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含むＣＤＲＬ１、配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含むＣＤＲＬ２、および配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含むＣＤＲＬ３、
（ｎ）配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含むＣＤＲＨ１、配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、および配列番号１９（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＥ）を含むＣＤＲＨ３、
（ｏ）配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含むＣＤＲＨ１、配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、配列番号１９（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＥ）を含むＣＤＲＨ３、配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含むＣＤＲＬ１、配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含むＣＤＲＬ２、および配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含むＣＤＲＬ３、
（ｐ）配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含むＣＤＲＨ１、配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、および配列番号２０（ＡＲＬＫＮＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含むＣＤＲＨ３、
（ｑ）配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含むＣＤＲＨ１、配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、配列番号２０（ＡＲＬＫＮＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含むＣＤＲＨ３、配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含むＣＤＲＬ１、配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含むＣＤＲＬ２、および配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含むＣＤＲＬ３、
（ｒ）配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含むＣＤＲＨ１、配列番号２１（ＧＧＶＩＰＦＬＧＴＡＮＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、および配列番号２２（ＡＲＬＫＧＩＬＫＤＡＬＤＩ）を含むＣＤＲＨ３、
（ｓ）配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含むＣＤＲＨ１、配列番号２１（ＧＧＶＩＰＦＬＧＴＡＮＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、配列番号２２（ＡＲＬＫＧＩＬＫＤＡＬＤＩ）を含むＣＤＲＨ３、配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含むＣＤＲＬ１、配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含むＣＤＲＬ２、および配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含むＣＤＲＬ３、
（ｔ）配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含むＣＤＲＨ１、配列番号２９（ＧＲＩＩＰＩＦＧＴＡＤＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、および配列番号８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含むＣＤＲＨ３、
（ｕ）配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含むＣＤＲＨ１、配列番号２９（ＧＲＩＩＰＩＦＧＴＡＤＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、配列番号８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含むＣＤＲＨ３、配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含むＣＤＲＬ１、配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含むＣＤＲＬ２、および配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含むＣＤＲＬ３、
（ｖ）配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含むＣＤＲＨ１、配列番号３１（ＧＧＩＩＰＩＬＧＴＡＴＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、および配列番号３２（ＡＲＲＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含むＣＤＲＨ３、
（ｗ）配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含むＣＤＲＨ１、配列番号３１（ＧＧＩＩＰＩＬＧＴＡＴＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、配列番号３２（ＡＲＲＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含むＣＤＲＨ３、配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含むＣＤＲＬ１、配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含むＣＤＲＬ２、および配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含むＣＤＲＬ３、
（ｘ）配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含むＣＤＲＨ１、配列番号３３（ＧＧＩＩＰＩＶＡＴＡＮＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、および配列番号３２（ＡＲＲＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含むＣＤＲＨ３、
（ｙ）配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含むＣＤＲＨ１、配列番号３３（ＧＧＩＩＰＩＶＡＴＡＮＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、配列番号３２（ＡＲＲＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含むＣＤＲＨ３、配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含むＣＤＲＬ１、配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含むＣＤＲＬ２、および配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含むＣＤＲＬ３、
（ｚ）配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含むＣＤＲＨ１、配列番号３４（ＧＧＩＩＰＩＦＧＫＡＴＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、および配列番号３２（ＡＲＲＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含むＣＤＲＨ３、
（ａａ）配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含むＣＤＲＨ１、配列番号３４（ＧＧＩＩＰＩＦＧＫＡＴＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、配列番号３２（ＡＲＲＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含むＣＤＲＨ３、配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含むＣＤＲＬ１、配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含むＣＤＲＬ２、および配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含むＣＤＲＬ３、
（ｂｂ）配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含むＣＤＲＨ１、配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、配列番号８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含むＣＤＲＨ３、配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含むＣＤＲＬ１、配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含むＣＤＲＬ２、および配列番号３８（ＦＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含むＣＤＲＬ３、
（ｃｃ）配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含むＣＤＲＨ１、配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、配列番号８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含むＣＤＲＨ３、配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含むＣＤＲＬ１、配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含むＣＤＲＬ２、および配列番号３９（ＱＱＳＹＳＴＩＬＴ）を含むＣＤＲＬ３、
（ｄｄ）配列番号１４（ＧＴＦＳＳＹＡＦＳ）を含むＣＤＲＨ１、配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含むＣＤＲＨ２および配列番号８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含むＣＤＲＨ３、配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含むＣＤＲＬ１、配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含むＣＤＲＬ２、および配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含むＣＤＲＬ３、
（ｅｅ）配列番号２３（ＧＴＦＳＳＹＡＩＳ）を含むＣＤＲＨ１、配列番号２４（ＧＧＩＩＰＩＶＧＩＡＮＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、および配列番号８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含むＣＤＲＨ３、
（ｆｆ）配列番号２３（ＧＴＦＳＳＹＡＩＳ）を含むＣＤＲＨ１、配列番号２４（ＧＧＩＩＰＩＶＧＩＡＮＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、および配列番号８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含むＣＤＲＨ３、配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含むＣＤＲＬ１、配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含むＣＤＲＬ２、および配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含むＣＤＲＬ３、
（ｇｇ）配列番号２３（ＧＴＦＳＳＹＡＩＳ）を含むＣＤＲＨ１、配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、および配列番号２５（ＡＲＬＫＧＥＦＫＤＡＦＤＩ）を含むＣＤＲＨ３、
（ｈｈ）配列番号２３（ＧＴＦＳＳＹＡＩＳ）を含むＣＤＲＨ１、配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、および配列番号２５（ＡＲＬＫＧＥＦＫＤＡＦＤＩ）を含むＣＤＲＨ３、配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含むＣＤＲＬ１、配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含むＣＤＲＬ２、および配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含むＣＤＲＬ３、
（ｉｉ）配列番号２３（ＧＴＦＳＳＹＡＩＳ）を含むＣＤＲＨ１、配列番号２６（ＧＲＩＩＰＬＦＧＴＡＨＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、および配列番号８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含むＣＤＲＨ３、
（ｊｊ）配列番号２３（ＧＴＦＳＳＹＡＩＳ）を含むＣＤＲＨ１、配列番号２６（ＧＲＩＩＰＬＦＧＴＡＨＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、および配列番号８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含むＣＤＲＨ３、配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含むＣＤＲＬ１、配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含むＣＤＲＬ２、および配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含むＣＤＲＬ３、
（ｋｋ）配列番号２３（ＧＴＦＳＳＹＡＩＳ）を含むＣＤＲＨ１、配列番号２７（ＧＲＩＮＰＩＬＧＴＡＮＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、および配列番号２８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＳＩ）を含むＣＤＲＨ３、
（ｌｌ）配列番号２３（ＧＴＦＳＳＹＡＩＳ）を含むＣＤＲＨ１、配列番号２７（ＧＲＩＮＰＩＬＧＴＡＮＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、および配列番号２８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＳＩ）を含むＣＤＲＨ３、配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含むＣＤＲＬ１、配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含むＣＤＲＬ２、および配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含むＣＤＲＬ３、
（ｍｍ）配列番号２３（ＧＴＦＳＳＹＡＩＳ）を含むＣＤＲＨ１、配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、および配列番号３０（ＡＲＬＫＧＥＬＫＣＡＦＤＩ）を含むＣＤＲＨ３、
（ｎｎ）配列番号２３（ＧＴＦＳＳＹＡＩＳ）を含むＣＤＲＨ１、配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、および配列番号３０（ＡＲＬＫＧＥＬＫＣＡＦＤＩ）を含む、配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含むＣＤＲＬ１、配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含むＣＤＲＬ２、および配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含むＣＤＲＬ３、
（ｏｏ）配列番号３６（ＧＰＦＲＳＨＡＶＳ）を含むＣＤＲＨ１、配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、および配列番号３７（ＡＲＬＫＳＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含むＣＤＲＨ３、または
（ｐｐ）配列番号３６（ＧＰＦＲＳＨＡＶＳ）を含むＣＤＲＨ１、配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、および配列番号３７（ＡＲＬＫＳＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含むＣＤＲＨ３、配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含むＣＤＲＬ１、配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含むＣＤＲＬ２、および配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含むＣＤＲＬ３
を含む。
一部のそのような実施形態では、抗原結合の第２の単位はＰＤ－Ｌ１に結合し、配列番号３５、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、または５８のいずれか１つに対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号５９、６０、６１、６２、または６３のいずれか１つに対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むおよび含む。
一部の実施形態では、抗原結合の第２の単位はＰＤ－Ｌ１に結合し、
（ａ）配列番号３５に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号４０に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号４１に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列、
（ｄ）配列番号４２に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列、
（ｅ）配列番号４３に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列、
（ｆ）配列番号４４に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列、
（ｇ）配列番号４５に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列、
（ｈ）配列番号４６に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列、
（ｉ）配列番号４７に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列、
（ｊ）配列番号４８に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列、
（ｋ）配列番号４９に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列、
（ｌ）配列番号５０に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列、
（ｍ）配列番号５１に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列、
（ｎ）配列番号５２に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列、
（ｏ）配列番号５３に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列、
（ｐ）配列番号５４に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列、
（ｑ）配列番号５５に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列、
（ｒ）配列番号５６に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列、
（ｓ）配列番号５７に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列、または
（ｔ）配列番号５８に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列
を含む重鎖可変領域を含む。
一部の実施形態では、抗原結合の第２の単位はＰＤ－Ｌ１に結合し、
（ａ）配列番号５９に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号６０に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号６１に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列、
（ｄ）配列番号６２に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列、または
（ｅ）配列番号６３に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列
を含む軽鎖可変領域を含む。
一部の態様および実施形態では、抗原結合の４つの単位を含む多重特異性抗原結合性構築物であって、抗原結合の２つの単位がＰＤ－１に結合し、抗原結合の２つの単位がＰＤ－Ｌ１に結合し、構築物が、配列番号１００または１０２のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％同一の重鎖アミノ酸配列、および配列番号１０１または１０３のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％同一の軽鎖アミノ酸配列を含む、多重特異性抗原結合性構築物もまた本明細書において提供される。
一部の態様および実施形態では、抗原結合の４つの単位を含む多重特異性抗原結合性構築物であって、抗原結合の２つの単位がＰＤ－１に結合し、抗原結合の２つの単位がＰＤ－Ｌ１に結合し、構築物が、配列番号１００のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％同一の重鎖アミノ酸配列および配列番号１０１のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％同一の軽鎖アミノ酸配列を含む、多重特異性抗原結合性構築物もまた本明細書において提供される。
一部の態様および実施形態では、抗原結合の４つの単位を含む多重特異性抗原結合性構築物であって、抗原結合の２つの単位がＰＤ－１に結合し、抗原結合の２つの単位がＰＤ－Ｌ１に結合し、構築物が、配列番号１０２のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％同一の重鎖アミノ酸配列および配列番号１０３のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％同一の軽鎖アミノ酸配列を含む、多重特異性抗原結合性構築物もまた本明細書において提供される。
一部の実施形態では、構築物はＦｃドメインを含まない。一部の実施形態では、第１のアームもしくは第２のアーム、または両方は、１つまたは複数の免疫グロブリンＦｃ改変を含む重鎖を含む。一部の実施形態では、重鎖の免疫グロブリンＦｃドメインは、第１および第２のアームのヘテロ二量体化を促進する１つまたは複数のアミノ酸突然変異を含む。一部の実施形態では、突然変異は重鎖のＣＨ３ドメイン中に存在する。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物はクアドローマ細胞中で製造される。一部の実施形態では、構築物は１つまたは複数の免疫グロブリン定常領域改変を含む。一部の実施形態では、免疫グロブリン定常領域は、抗体のヘテロ二量体化を促進する１つまたは複数のアミノ酸突然変異を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の突然変異は１つのアームの軽鎖定常領域中に存在し、１つまたは複数の突然変異は別のアームの重鎖定常領域中に存在する。一部の実施形態では、二重特異性抗体は、二重特異性ＩｇＧ、二重特異性抗体断片、二重特異性融合タンパク質、付加型ＩｇＧ（ａｐｐｅｎｄｅｄ ＩｇＧ）、および二重特異性抗体コンジュゲートからなる群から選択されるフォーマットのものである。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は低減したエフェクター機能を有する。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は構築物の半減期を増進する。
一部の実施形態では、構築物は、配列番号１００または１０２のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％同一の重鎖アミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、構築物は、配列番号１０１または１０３のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％同一の軽鎖アミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、構築物は、配列番号１００のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％同一の重鎖アミノ酸配列を含み、構築物は、配列番号１０１のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％同一の軽鎖アミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、構築物は、配列番号１０２のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％同一の重鎖アミノ酸配列を含み、構築物は、配列番号１０３のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％同一の軽鎖アミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、本明細書に開示される任意の多重特異性抗原結合性構築物は非グリコシル化されている。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物はヒトＰＤ－１に結合することができる。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物はマウスＰＤ－１に結合することができる。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物はカニクイザルＰＤ－１に結合することができる。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物は、ヒト、マウスおよびカニクイザルＰＤ－１に類似した親和性で結合することができる。
一部の実施形態では、本明細書に開示される任意の多重特異性抗原結合性構築物は細胞上のＰＤ－１レベルを低減することができる。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物はＰＤ－１分解を誘導することができる。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物はＰＤ－１発現を低減することができる。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物はＰＤ－１細胞表面発現を低減することができる。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物は、細胞表面からのＰＤ－１のシェディングを誘導することによりＰＤ－１細胞表面発現を低減することができる。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物はＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１の両方に結合し、細胞上のＰＤ－１レベルを低減することができる。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物はＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１の両方に結合し、ＰＤ－１分解を誘導することができる。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物はＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１の両方に結合し、ＰＤ－１発現を低減することができる。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物は免疫細胞からのＰＤ－１のシェディングを誘導することができる。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物はＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１の両方に結合し、免疫細胞からのＰＤ－１シェディングを誘導することができる。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物は、ＰＤ－Ｌ１がＣＤ８０に結合できないように、ＰＤ－Ｌ１を隔離することができる。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物は、ＰＤ－Ｌ１がＣＤ８０に結合できないように、ＰＤ－Ｌ１を隔離することができ、ＣＤ８０はＣＤ２８に自由に結合する。一部の実施形態では、細胞は免疫細胞、例えば、Ｔ細胞である。一部の実施形態では、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）は腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）である。一部の実施形態では、腫瘍微環境中の免疫細胞により発現されたＰＤ－１への本明細書に記載の多重特異性抗原結合性分子のエンゲージメントは、免疫細胞によるＰＤ－１の下方調節を結果としてもたらす。一部の実施形態では、免疫細胞はＴ細胞である。一部の実施形態では、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）は腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）である。
一部の実施形態では、本明細書に開示される任意の多重特異性抗原結合性構築物は、参照抗原結合性構築物（例えば、ペムブロリズマブもしくはアテゾリズマブ）または抗原結合性構築物の参照組合せ（例えば、多重特異性抗原結合性構築物のＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１アームを含む組成物であって、組成物中のＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１アームが互いに対してコンジュゲート化していない、組成物）と比較して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％高いインターフェロン－ガンマレベル（例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓエンテロトキシンＡ（「ＳＥＡ」）アッセイにおいて測定されるようなインターフェロン－ガンマレベル）を誘導することができる。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物は、参照抗原結合性構築物（例えば、ペムブロリズマブもしくはアテゾリズマブ）または抗原結合性構築物の参照組合せ（例えば、多重特異性抗原結合性構築物のＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１アームを含む組成物であって、組成物中のＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１アームが互いに対してコンジュゲート化していない、組成物）と比較して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％高いインターロイキン－２レベル（例えば、ＳＥＡアッセイにおいて測定されるようなインターロイキン－２レベル）を誘導することができる。
一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物は、参照抗原結合性構築物（例えば、ペムブロリズマブもしくはアテゾリズマブ）または抗原結合性構築物の参照組合せ（例えば、多重特異性抗原結合性構築物のＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１アームを含む組成物であって、組成物中のＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１アームが互いに対してコンジュゲート化していない、組成物）と比較して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、２００％、３００％、４００％、または５００％高い腫瘍細胞（例えば、白血病細胞、リンパ腫細胞、黒色腫、または乳がん細胞）の殺傷を誘導する。
一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物は、参照抗原結合性構築物（例えば、ペムブロリズマブもしくはアテゾリズマブ）または抗原結合性構築物の参照組合せ（例えば、多重特異性抗原結合性構築物のＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１アームを含む組成物であって、組成物中のＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１アームが互いに対してコンジュゲート化していない、組成物）を投与された対象よりも少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、１００％、２００％、３００％、４００％、または５００％長く、がん（例えば、白血病、リンパ腫、黒色腫、および／または乳がん）を患う対象の生存を延長させることができる。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物は、非処理の免疫細胞と比較してまたは参照抗原結合性構築物（例えば、ペムブロリズマブもしくはアテゾリズマブ）もしくは抗原結合性構築物の参照組合せ（例えば、多重特異性抗原結合性構築物のＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１アームを含む組成物であって、組成物中のＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１アームが互いに対してコンジュゲート化していない、組成物）を用いて処理された免疫細胞と比較して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、１００％、２００％、３００％、４００％、または５００％高い免疫細胞からのＰＤ－１のシェディングを誘導することができる。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物は、非処理の免疫細胞または参照抗原結合性構築物（例えば、ペムブロリズマブもしくはアテゾリズマブ）もしくは抗原結合性構築物の参照組合せ（例えば、多重特異性抗原結合性構築物のＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１アームを含む組成物であって、組成物中のＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１アームが互いに対してコンジュゲート化していない、組成物）を用いて処理された免疫細胞と比較して、（例えば、細胞表面からのＰＤ－１シェディングを引き起こすことおよび／またはＰＤ－１分解を誘導することおよび／またはＰＤ－１発現を低減することにより）少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、１００％、２００％、３００％、４００％、または５００％、ＰＤ－１レベルを低減することができる。
一部の実施形態では、細胞により発現されたＰＤ－１への本明細書に記載の多重特異性抗原結合性分子のエンゲージメントは、細胞によるＰＤ－１の細胞表面発現の下方調節および／または喪失を結果としてもたらす。細胞表面発現のそのような下方調節または喪失は、例えば、免疫細胞の表面からの細胞外ＰＤ－１のシェディングに部分的に起因することができる。一部の実施形態では、細胞は免疫細胞、例えば、Ｔ細胞である。一部の実施形態では、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）は腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）である。一部の実施形態では、腫瘍微環境中の免疫細胞により発現されたＰＤ－１への本明細書に記載の多重特異性抗原結合性分子のエンゲージメントは、免疫細胞によるＰＤ－１の下方調節を結果としてもたらす。一部の実施形態では、免疫細胞はＴ細胞である。一部の実施形態では、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）は腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）である。
一部の態様では、本開示は、それを必要とする対象において増殖性障害を治療する方法であって、対象に治療有効量の本明細書に開示される任意の多重特異性抗原結合性構築物を投与し、それにより、対象において増殖性障害を治療する工程を含む、方法を提供する。一部の実施形態では、増殖性障害はがんである。一部の実施形態では、がんは、血液がん、神経学的がん、黒色腫、乳がん、肺がん、頭頸部がん、胃腸がん、肝臓がん、膵臓がん、泌尿生殖器がん、骨がん、および血管がんからなる群から選択される。一部の実施形態では、本開示は、それを必要とする対象において免疫応答を増進する方法であって、対象に治療有効量の本明細書に開示される任意の多重特異性抗原結合性構築物を投与し、それにより、対象において免疫応答を増進する工程を含む、方法を提供する。一部の実施形態では、増進した免疫応答は、増進したＴ細胞機能、増進したＮＫ細胞機能、または増進したマクロファージ機能のいずれか１つまたは複数を含む。一部の実施形態では、Ｔ細胞機能の増進は、ＰＤ－１もしくはＰＤ－１リガンドのいずれかに結合する剤、またはＰＤ－１に結合する剤およびＰＤ－１リガンドに結合する剤を含むカクテルと比較して、多重特異性抗原結合性構築物の投与でより大きい。一部の実施形態では、Ｔ細胞機能は、Ｔ細胞からの増加したＩＦＮγ産生、増進したＴ細胞生存、増加したＴ細胞増殖、または疲弊Ｔ細胞表現型からのレスキューのいずれか１つまたは複数である。一部の実施形態では、増進したＴ細胞機能は、ＰＤ－１もしくはＰＤ－１リガンドのいずれかに結合する剤、またはＰＤ－１に結合する剤およびＰＤ－１リガンドに結合する剤を含むカクテルと比較して、多重特異性抗原結合性構築物の投与でより大きい。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物は、皮下、静脈内、皮内、腹腔内、経口的、筋肉内または頭蓋内に投与される。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物は、対象中の同じ細胞の表面上に発現されたＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１に結合する。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物は、対象中の第１の細胞の表面上に発現されたＰＤ－１に結合し、多重特異性抗原結合性構築物は、対象中の第２の細胞の表面上に発現されたＰＤ－Ｌ１に結合する。
一部の実施形態では、本開示は、抗ＰＤ１抗体またはその抗原結合性断片であって、（ａ）（ｉ）配列番号７０（ＦＴＦＸ１Ｘ２ＹＡＸ３Ｘ４であり、Ｘ１＝Ｓ、Ｒ、Ｇ、またはＮであり、Ｘ２＝Ｄ、Ｓ、Ｎ、Ａ、Ｒ、またはＧであり、Ｘ３＝ＭまたはＬであり、Ｘ４＝Ｓ、Ｌ、またはＮである）を含むＣＤＲＨ１、（ｉｉ）配列番号７１（ＳＡＩＳＮＳＧＴＹＴＹＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、および（ｉｉｉ）配列番号７２（ＡＲＧＬＤＦＩＶＧＸ５ＴＧＮＤＹであり、Ｘ５＝Ａ、Ｙ、またはＲである）を含むＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域、ならびに（ｂ）（ｉ）配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含むＣＤＲＬ１、（ｉｉ）配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含むＣＤＲＬ２、および（ｉｉｉ）配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含むＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含む、抗ＰＤ１抗体またはその抗原結合性断片を提供する。一部の実施形態では、抗ＰＤ－１抗体または抗原結合性断片は、（ａ）（ｉ）配列番号７３、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、または８６のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、（ｉｉ）配列番号７１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、および（ｉｉｉ）配列番号７４、７５、または８５のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域、ならびに（ｂ）（ｉ）配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含むＣＤＲＬ１、（ｉｉ）配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含むＣＤＲＬ２、および（ｉｉｉ）配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含むＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含む。一部の実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９のいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号５９のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、本開示は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合性断片であって、ａ．（ｉ）配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含むＣＤＲＨ１、（ｉｉ）配列番号２（ＧＧＩＩＰＸ１Ｘ２ＧＸ３ＡＴＹＡであり、Ｘ１はＶまたはＩであり、Ｘ２はＦ、Ｌ、またはＶであり、Ｘ３はＴまたはＡである）を含むＣＤＲＨ２、および（ｉｉｉ）配列番号３（ＡＲＬＫＸ１ＥＬＫＤＡＦＤＩであり、Ｘ１はＧ、Ｆ、またはＮである）を含むＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域、ならびにｂ．（ｉ）配列番号４（ＲＡＳＱＸ１ＩＳＳＹＬＮであり、Ｘ１はＳ、Ｗ、またはＱである）を含むＣＤＲＬ１、（ｉｉ）配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含むＣＤＲＬ２、および（ｉｉｉ）配列番号６（Ｘ１ＱＳＹＳＴＰＬＴであり、Ｘ１はＱまたはＦである）を含むＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含む、抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合性断片を提供する。一部の実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体または抗原結合性断片は、（ａ）（ｉ）配列番号１、１４、２３、３６、または１２２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、（ｉｉ）配列番号１１、１５、１６、２１、２４、２６、２７、２９、３１、３３、または３４のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、および（ｉｉｉ）配列番号８、１７、１８、１９、２０、２２、２５、２８、３０、３２、または３７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域、ならびに（ｂ）（ｉ）配列番号９、１２、または１３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、および（ｉｉｉ）配列番号１０、３８または３９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含む。一部の実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、または３５のいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号５９、６０、６１、６２、または６３のいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、本開示は、それを必要とする対象において増殖性障害を治療する方法であって、対象に治療有効量の本明細書に開示される任意の抗体または抗原結合性構築物を投与し、それにより、対象において増殖性障害を治療する工程を含む、方法を提供する。一部の実施形態では、増殖性障害はがんである。一部の実施形態では、がんは、血液がん、神経学的がん、黒色腫、乳がん、肺がん、頭頸部がん、胃腸がん、肝臓がん、膵臓がん、泌尿生殖器がん、骨がん、および血管がんからなる群から選択される。
一部の実施形態では、本開示は、それを必要とする対象において免疫応答を増進する方法であって、対象に治療有効量の本明細書に開示される任意の抗体または抗原結合性構築物を投与し、それにより、対象において免疫応答を増進する工程を含む、方法を提供する。
一部の実施形態では、本明細書に記載の任意の方法は、本明細書に記載の多重特異性抗原結合性分子との接触の前および／または後に１つもしくは複数の細胞（またはＴＩＬなどの細胞の集団）によるＰＤ－１発現の存在または非存在を検出する工程を伴うことができる。例えば、本明細書に記載の任意の方法は、対象（例えば、がん患者）への本明細書に記載の多重特異性抗原結合性分子の投与の前および／または後に１つもしくは複数の細胞（またはＴＩＬなどの細胞の集団）によるＰＤ－１発現の存在または非存在を検出する工程を伴うことができる。そのような方法は、例えば、所与の患者または患者集団の治療において使用するための分子の治療有効量の決定で、有用である。発現の存在、低減、および／またはＰＤ－１発現の非存在を検出する方法は当業者に公知であり、例えば、フローサイトメトリー、ウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡなどが使用される。
別の態様では、本開示は、本明細書に記載の多重特異性抗原結合性分子との接触の前および／または後に１つもしくは複数の細胞（またはＴＩＬなどの細胞の集団）によるＰＤ－１発現のレベルを測定する工程を含む方法を特徴とする。一部の実施形態では、方法は、対象（例えば、がん患者）への本明細書に記載の多重特異性抗原結合性分子の投与の前および／または後に１つもしくは複数の細胞（またはＴＩＬなどの細胞の集団）によるＰＤ－１発現のレベルを測定する工程を含む。
さらに別の態様では、本開示は、本明細書に記載の多重特異性抗原結合性分子との接触の前および／または後に１つもしくは複数の細胞（またはＴＩＬなどの細胞の集団）によるＰＤ－１発現のレベルを測定する工程を含む方法を特徴とする。例えば、本明細書に記載の任意の方法は、対象（例えば、がん患者）への本明細書に記載の多重特異性抗原結合性分子の投与の前および／または後に１つもしくは複数の細胞（またはＴＩＬなどの細胞の集団）によるＰＤ－１発現のレベルを測定する工程を伴うことができる。そのような方法は、他のものの中でも、対象に対する本明細書に記載の分子の生物学的効果を検出または測定するために有用である。一部の実施形態では、本明細書に記載の多重特異性抗原結合性分子を用いた治療後の免疫細胞（例えば、患者から単離されたＴＩＬ）によるＰＤ－１発現のレベルの低減は、分子が対象において生物学的効果を有したことを指し示す。一部の実施形態では、本明細書に記載の多重特異性抗原結合性分子を用いた治療後の免疫細胞（例えば、患者から単離されたＴＩＬ）によるＰＤ－１発現のレベルの低減は、患者は分子の１つまたは複数の用量を与えられるか、またはさもなければ分子を含む療法を継続すべきであることを指し示す。
さらに別の態様では、本開示は、生物学的効果が本明細書に記載の多重特異性抗原結合性分子を用いて治療された患者または患者の集団において起こったかどうかを決定する方法を特徴とする。方法は、本明細書に記載の多重特異性抗原結合性分子を投与された１または複数の患者から得られた１つまたは複数の試験免疫細胞（例えば、エフェクター免疫細胞、例えば、腫瘍微環境中のエフェクター免疫細胞）によるＰＤ－１発現の存在または量を検出する工程を含み、対照発現レベル（例えば、分子の投与前の試験免疫細胞と同じ組織学的種類の免疫細胞によるＰＤ－１の発現レベル）と比べた１つまたは複数の免疫細胞によるＰＤ－１のＰＤ－１発現（例えば、細胞表面発現）の低減したレベルは、生物学的効果が患者または患者の集団において起こったことを指し示す。一部の実施形態では、方法は、検出の前に多重特異性抗原結合性分子を投与する工程を含む。一部の実施形態では、方法は、生物学的効果の出現が決定された患者または患者の集団に対して多重特異性抗原結合性分子を投与する工程を含む。一部の実施形態では、対照ＰＤ－１発現レベルはおおよそ、がんを有すると診断されていない対象の集団における同じ組織学的種類の免疫細胞によるＰＤ－１のメジアンまたは平均発現レベルである。一部の実施形態では、対照ＰＤ－１発現レベルはおおよそ、本明細書に記載の多重特異性抗原結合性分子および／またはＰＤ－１に結合しかつ／もしくはそれを阻害する剤を投与されていない対象の集団における同じ組織学的種類の免疫細胞によるＰＤ－１のメジアンまたは平均発現レベルである。
さらに別の態様では、本開示は、対象（例えば、がん患者）において１つまたは複数の免疫細胞によるＰＤ－１の発現を低減する方法であって、本明細書に記載の多重特異性抗原結合性分子を対象に投与し、それにより、対象における１つまたは複数の免疫細胞によるＰＤ－１の発現を低減する工程を含む、方法を特徴とする。一部の実施形態では、方法は、患者において１つまたは複数の免疫細胞によるＰＤ－１発現の低減が起こったかどうかを決定する工程を含む。一部の実施形態では、方法は、（例えば、対象への分子の投与後に）１つまたは複数の免疫細胞を含む生物学的試料（例えば、腫瘍生検）を対象から得る工程を含む。一部の実施形態では、方法は、生物学的試料中の１つまたは複数の免疫細胞によるＰＤ－１発現のレベルを測定する工程を含む。
さらに別の態様では、本開示は、対象（例えば、がん患者）においてＰＤ－Ｌ１およびＣＤ８０の間の結合を阻害する方法であって、本明細書に記載の多重特異性抗原結合性分子を対象に投与し、それにより、対象においてＰＤ－Ｌ１およびＣＤ８０の間の結合を阻害する工程を含む、方法を特徴とする。
特許または出願書類は、少なくとも１つのカラー図面を含有する。カラー図面を有するこの特許または特許出願公開公報のコピーは、必要な料金の納付と共に請求により庁により提供される。
キイトルーダ（ＫＥＹＴＲＵＤＡ）単独と比較した場合の、ペムブロリズマブ×アテゾリズマブ二重特異物、ニボルマブ×アテゾリズマブ二重特異物、キイトルーダおよびアテゾリズマブのカクテル、ならびにニボルマブおよびアテゾリズマブのカクテルを含む様々な抗体カクテルまたは二重特異性抗体を用いて処理された混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイにおけるインターフェロン－ガンマ（ＩＦＮγ）の誘導を示す。結果は、指し示されるような試験された抗体の最終濃度でのｐｇ／ｍＬとしてのＩＦＮγの濃度を示す。 キイトルーダ単独と比較した場合の、ペムブロリズマブ×ニボルマブ二重特異物、アテゾリズマブ×アテゾリズマブ四価融合物、ニボルマブ、およびアテゾリズマブを含む様々なモノクローナルおよび二重特異性抗体を用いて処理された混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイにおけるインターフェロン－ガンマ（ＩＦＮγ）の誘導を示す。結果は、指し示されるような試験された抗体の最終濃度でのｐｇ／ｍＬとしてのＩＦＮγの濃度を示す。 ペムブロリズマブ×アテゾリズマブ二重特異物についての図式およびアミノ酸配列を示す。ペムブロリズマブ＿アグリコ（ａｇｌｙｃｏ）－ＩｇＧ１－（Ｇ４Ｓ）４重鎖（Ｈ鎖；配列番号１０４）および軽鎖（Ｌ鎖；配列番号１０５）ならびにアテゾリズマブ＿ＦａｂＨ－（Ｇ４Ｓ）４重鎖（Ｈ鎖；配列番号１０６）および軽鎖（Ｌ鎖；配列番号１０７）について別々の配列を与えている。 ニボルマブ×アテゾリズマブ二重特異物についての図式およびアミノ酸配列を示す。ニボルマブアグリコ－ＩｇＧ１－（Ｇ４Ｓ）４重鎖（Ｈ鎖；配列番号１０８）および軽鎖（Ｌ鎖；配列番号１０９）ならびにアテゾリズマブＦａｂＨ－（Ｇ４Ｓ）４重鎖（Ｈ鎖；配列番号１０６）および軽鎖（Ｌ鎖；配列番号１０７）について別々の配列を与えている。 ９４９アグリコ－ＩｇＧ１×アテゾリズマブ二重特異物についての図式およびアミノ酸配列を示す。９４９＿アグリコ－ＩｇＧ１－（Ｇ４Ｓ）４重鎖（Ｈ鎖；配列番号１１０）および軽鎖（Ｌ鎖；配列番号１１１）ならびにアテゾリズマブ＿ＦａｂＨ－（Ｇ４Ｓ）４重鎖（Ｈ鎖；配列番号１０６）および軽鎖（Ｌ鎖；配列番号１０７）について別々の配列を与えている。 アテゾリズマブ×ニボルマブ二重特異物についての図式およびアミノ酸配列を示す。アテゾリズマブ＿アグリコ－ＩｇＧ１－（Ｇ４Ｓ）４重鎖（Ｈ鎖；配列番号１１２）および軽鎖（Ｌ鎖；配列番号１０７）ならびにニボルマブ＿ＨＣ Ｆａｂ－（Ｇ４Ｓ）４重鎖（Ｈ鎖；配列番号１１３）および軽鎖（Ｌ鎖；配列番号１０９）について別々の配列を与えている。 様々な濃度において試験された抗体の関数としての混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイにおけるｐｇ／ｍＬでのＩＦＮ－γ放出を示す（右パネル）。これらの結果は、多重特異性フォーマットの二重特異性抗体ＰＤ－１×ＰＤ－Ｌ１（ペムブロリズマブ×アテゾリズマブ）または（ニボルマブ×アテゾリズマブ）は、ペムブロリズマブおよびアテゾリズマブまたはニボルマブおよびアテゾリズマブのカクテルと比較して、フェムトモル濃度においてより大きいＩＦＮ－γ応答を誘導することを指し示す。ｍＡｂ前駆体に対する二重特異性フォーマットのサイズ排除クロマトグラフィーを示す（左パネル）。 相乗作用を実証する多重特異性（例えば、二重特異性）抗体を同定するためのワークフローの例を示す。プロセスは、様々な濃度におけるｐｇ／ｍＬでのＩＦＮ－γ放出を測定する混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイにおけるチェックポイント遮断剤の組合せのバイアスなしのスクリーニングを含む。図示したワークフローの第２の工程において、共通軽鎖二重特異物を生成してそれらの有効性をさらに試験し、ここで、様々な二重特異性フォーマットを描写している。同定された二重特異性フォーマットは、Ｔ細胞活性化アッセイにおいて公知のＰＤ－１遮断剤を凌いだ。 二重特異物３は、アイソタイプ対照抗体およびキイトルーダの両方と比較して、抗原非特異的Ｔ細胞アッセイにおいてＣＤ３／ＣＤ２８拡大増殖Ｔ細胞によるＫ５６２－ＣＤ３２－ＰＤＬ１標的細胞のより高い殺傷（図９Ａ）および増加したＩＦＮγ産生（図９Ｂ）を誘導したことを示す。二重特異物３によるこの増加した殺傷は、０．０１ｎＭの低濃度においてさえ見られた。 二重特異物３は、アイソタイプ対照抗体およびキイトルーダの両方と比較して、抗原非特異的Ｔ細胞アッセイにおいてＣＤ３／ＣＤ２８拡大増殖Ｔ細胞によるＫ５６２－ＣＤ３２－ＰＤＬ１標的細胞のより高い殺傷（図９Ａ）および増加したＩＦＮγ産生（図９Ｂ）を誘導したことを示す。二重特異物３によるこの増加した殺傷は、０．０１ｎＭの低濃度においてさえ見られた。 腫瘍細胞殺傷に対する二重特異物３の効果を示す。図１０Ａは、キイトルーダおよびｍＡｂ１とｍＡｂ２８との組合せの両方と比較して、二重特異物３は、０．００１～０．０１ｎＭの低濃度においてＣＭＶ特異的Ｔ細胞によるＫ５６２－Ａ２－ＣＭＶ－ＰＤＬ１腫瘍抗原標的細胞の特異的殺傷を増加させたことを示し、二重特異物３を使用してより低い用量において標的細胞の抗原特異的殺傷を媒介できることを指し示した。 腫瘍細胞殺傷に対する二重特異物３の効果を示す。図１０Ｂは、二重特異物３は、０．００１ｎＭの低濃度においてＣＭＶ特異的Ｔ細胞によるＲａｊｉ－Ａ２－ＣＭＶ－ＰＤＬ１細胞腫瘍抗原標的細胞の特異的殺傷においてキイトルーダまたはｍＡｂ１とｍＡｂ２８との組合せのいずれかよりも有効であったことを示し、再び、二重特異物３を使用してより低い用量において標的細胞の抗原特異的殺傷を媒介できることを指し示した。 二重特異物３は、ＳＥＡ刺激アッセイにおいて全ての試験した用量においてキイトルーダよりも多くのＩＬ－２を誘導したことを示す。重要なことに、二重特異物３は、キイトルーダならびにｍＡｂ１およびｍＡｂ２８の両方と比較して、抗体のより低い濃度で開始してＩＬ－２産生の増加を誘導した。 二重特異物３は、ＰＤ－１の内部移行およびその後の分解または発現の喪失を引き起こす特有の能力を有すること、ならびにこの特性は分子のアームを標的化するＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１の両方のエンゲージメントに依存することを実証する。図１２Ａ～１２Ｂは、アイソタイプ対照、キイトルーダ、ｍＡｂ１およびｍＡｂ２８、アテゾリズマブ、またはアテゾリズマブおよびキイトルーダと比較した場合に、二重特異物３のみがＰＤ－１の内部移行およびその後の分解または発現の喪失を結果としてもたらすことを実証する。 二重特異物３は、ＰＤ－１の内部移行およびその後の分解または発現の喪失を引き起こす特有の能力を有すること、ならびにこの特性は分子のアームを標的化するＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１の両方のエンゲージメントに依存することを実証する。図１２Ａ～１２Ｂは、アイソタイプ対照、キイトルーダ、ｍＡｂ１およびｍＡｂ２８、アテゾリズマブ、またはアテゾリズマブおよびキイトルーダと比較した場合に、二重特異物３のみがＰＤ－１の内部移行およびその後の分解または発現の喪失を結果としてもたらすことを実証する。 二重特異物３は、ＰＤ－１の内部移行およびその後の分解または発現の喪失を引き起こす特有の能力を有すること、ならびにこの特性は分子のアームを標的化するＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１の両方のエンゲージメントに依存することを実証する。追加的に、図１２Ｃに示されるように、二重特異物３を加える５分前に抗ＰＤ－Ｌ１抗体、ｍＡｂ１を５０ｎＭでウェルに加えた場合、ＰＤ－１内部移行を推進する二重特異物３の能力は喪失した。これは、二重特異物３の両方のアームはＰＤ－１の発現の喪失および／または内部移行および／または分解を推進するためにエンゲージメントされるべきであることを示唆する。 二重特異物３は、ＰＤ－１の内部移行およびその後の分解または発現の喪失を引き起こす特有の能力を有すること、ならびにこの特性は分子のアームを標的化するＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１の両方のエンゲージメントに依存することを実証する。図１２Ｄは、二重特異物の両方の結合性アームを同時にエンゲージメントさせた場合に、二重特異物３を用いた処理は上清中のＰＤ－１の量を増加させることを示す。ＰＤ－Ｌ１標的化アームをｍＡｂ１により遮断した場合に、この効果は喪失される。これは、二重特異物３は上清へのＰＤ－１のシェディングを増加させることを示唆する。 二重特異物３は、ＰＤ－１の内部移行およびその後の分解または発現の喪失を引き起こす特有の能力を有すること、ならびにこの特性は分子のアームを標的化するＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１の両方のエンゲージメントに依存することを実証する。図１２Ｅは、結合性アームの価数はＰＤ－１発現の喪失の程度に影響を及ぼすことを実証する。ｍＡｂ１のＶＨおよびＶＬ配列に基づくＰＤ－Ｌ１に結合する第１のＮ末端Ｆａｂを有し、ｍＡｂ２８のＶＨおよびＶＬ配列に基づくＰＤ－１に結合する第２のＮ末端Ｆａｂを有する二重特異物５を作製した。換言すれば、ＰＤ－Ｌ１に結合する二価アームおよびＰＤ－１に結合する二価アームを有する二重特異物３と比較して、二重特異物５は、ＰＤ－Ｌ１に結合する１つの一価アームおよびＰＤ－１に結合する１つの一価アームを有する。示されるように、ＰＤ－１発現の喪失は、二重特異物３（四価）に比して二重特異物５（二価）のより高い用量において起こり始め、二重特異物３の増加した価数がこの差異の原因となることを示唆する。 二重特異物３は、ＰＤ－１の内部移行およびその後の分解または発現の喪失を引き起こす特有の能力を有すること、ならびにこの特性は分子のアームを標的化するＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１の両方のエンゲージメントに依存することを実証する。図１２Ｆは、細胞の形質膜からタンパク質を切断する原因となるシェダーゼまたはプロテアーゼである、複数のＭＭＰおよびＡＤＡＭの広域阻害剤、バチマスタットを用いた前処理は、細胞関連ＰＤ－１喪失の量を大きく低減することを実証し、ＰＤ－１の喪失またはシェディングはＭＭＰまたはＡＤＡＭプロテアーゼによる切断に起因することを示唆する。 二重特異物３は、ＰＤ－１の内部移行およびその後の分解または発現の喪失を引き起こす特有の能力を有すること、ならびにこの特性は分子のアームを標的化するＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１の両方のエンゲージメントに依存することを実証する。図１２Ｇは、二重特異物３は、主に、トランス配置にある、すなわち、異なる細胞により発現されているＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１にそれが結合する場合に、細胞表面ＰＤ－１発現の喪失を推進することを示唆する。 二重特異物３を使用したｉｎ ｖｉｖｏの結果を示す。図１３Ａは実験プロトコールの図式を描写する。 二重特異物３を使用したｉｎ ｖｉｖｏの結果を示す。図１３Ｂは、二重特異物３群ならびに組合せｍＡｂ１およびｍＡｂ２８群の両方は、アイソタイプ群およびキイトルーダ群の両方と比較して腫瘍成長における有意な遅延を有したことを実証する。追加的に、２４日目において、二重特異物３群およびｍＡｂ１とｍＡｂ２８との組合せを用いて処置された群の間に有意な相違があり、二重特異物３は、組合せと比較して腫瘍成長におけるより大きい遅延を引き起こした。無Ｔ細胞移入群は、Ｔ細胞を含有する任意の群よりも激しく成長する腫瘍を有した。このモデルにおいて、キイトルーダは、アイソタイプ対照と比較してＫＡＣＰ腫瘍成長の遅延において利益を与えなかった。 Ｋ５６２－Ａ２－ＣＭＶ－ＰＤ－Ｌ１腫瘍マウスモデルにおける二重特異物３を使用したｉｎ ｖｉｖｏの結果を示す。図１４Ａおよび図１４Ｂは、異なる処置群のそれぞれは非処置マウスと比較して平均腫瘍成長における遅延を結果としてもたらしたが、Ｔ細胞および二重特異物３を用いた処置は、経時的な平均腫瘍成長における最も大きい遅延を結果としてもたらしたことを図示するグラフである。無Ｔ細胞移入群は、Ｔ細胞を含有する任意の群よりも激しく成長する腫瘍を有した。このモデルにおいて、キイトルーダは、アイソタイプ対照と比較してＫ５６２－Ａ２－ＣＭＶ－ＰＤ－Ｌ１腫瘍成長の遅延において利益を与えなかった。 Ｋ５６２－Ａ２－ＣＭＶ－ＰＤ－Ｌ１腫瘍マウスモデルにおける二重特異物３を使用したｉｎ ｖｉｖｏの結果を示す。図１４Ａおよび図１４Ｂは、異なる処置群のそれぞれは非処置マウスと比較して平均腫瘍成長における遅延を結果としてもたらしたが、Ｔ細胞および二重特異物３を用いた処置は、経時的な平均腫瘍成長における最も大きい遅延を結果としてもたらしたことを図示するグラフである。無Ｔ細胞移入群は、Ｔ細胞を含有する任意の群よりも激しく成長する腫瘍を有した。このモデルにおいて、キイトルーダは、アイソタイプ対照と比較してＫ５６２－Ａ２－ＣＭＶ－ＰＤ－Ｌ１腫瘍成長の遅延において利益を与えなかった。 いくつかの同系腫瘍モデルにおける二重特異物３を使用したｉｎ ｖｉｖｏの結果を図示する。図１５Ａは、二重特異物３を用いたＥＭＴ－６同系腫瘍モデルの処置は、対照処置と比較して腫瘍成長におけるより大きい遅延を結果としてもたらしたことを示すグラフである。 いくつかの同系腫瘍モデルにおける二重特異物３を使用したｉｎ ｖｉｖｏの結果を図示する。図１５Ｂは、二重特異物３を用いたＭＢ４９同系腫瘍モデルの処置は、対照処置と比較して腫瘍成長におけるより大きい遅延を結果としてもたらしたことを示すグラフである。 ヒト化ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１トランスジェニックマウスにおけるＭＣ３８－ｈＰＤ－Ｌ１モデルにおいて二重特異物１を使用したｉｎ ｖｉｖｏの結果を示す。図１６Ａは、キイトルーダおよび二重特異物１の処置の両方は、対照処置マウスと比較してＭＣ３８－ｈＰＤ－Ｌ１腫瘍マウスにおける腫瘍成長を有効に制御したことを示す。 ヒト化ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１トランスジェニックマウスにおけるＭＣ３８－ｈＰＤ－Ｌ１モデルにおいて二重特異物１を使用したｉｎ ｖｉｖｏの結果を示す。図１６Ｂは生存グラフであり、二重特異物１は、対照処置マウスと比較してＭＣ３８－ＰＤ－Ｌ１腫瘍マウスの生存を増加させたことを図示する。 Ｂ１６Ｆ１０－ｈＰＤ－Ｌ１モデルにおける二重特異物３を使用したｉｎ ｖｉｖｏの結果を図示する。図１７Ａは、Ｂ１６Ｆ１０－ＨｕＰＤ－Ｌ１マウスにおいて１５日のカットオフにおいて測定された腫瘍成長に対する異なる処置の効果をそれぞれ示す一連のグラフである。マウスの異なる群（ｎ＝８）を二重特異物３、キイトルーダ、アベルマブ、キイトルーダ＋アベルマブの組合せ、またはアイソタイプ対照抗体を用いて処置した。図１７Ａは、各群についての個々の腫瘍体積トレースを示す。腫瘍サイジングカットオフの前に死亡した複数のマウスにおいて転移が同定された。 Ｂ１６Ｆ１０－ｈＰＤ－Ｌ１モデルにおける二重特異物３を使用したｉｎ ｖｉｖｏの結果を図示する。図１７Ｂは、処置群間の平均腫瘍体積の差異を示し、腫瘍細胞接種後１５日までに、二重特異物３処置は、Ｂ１６Ｆ１０－ＨｕＰＤ－Ｌ１マウスにおいて試験されたいずれの他の処置よりも有意に長く平均腫瘍成長を遅延させたことを実証する。＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１；＊＊、Ｐ＜０．０１、＊、Ｐ＜０．０５、二元配置ＡＮＯＶＡおよびチューキーの多重比較検定。図１７Ｂは、Ｂ１６Ｆ１０－ＨｕＰＤ－Ｌ１マウスにおいて１５日のカットオフにおいて測定された腫瘍体積に対する異なる処置の効果を比較したグラフである。腫瘍サイジングカットオフの前に死亡した複数のマウスにおいて転移が同定された。図１７Ｂに示されるように、二重特異物３処置は、Ｂ１６Ｆ１０－ｈＰＤ－Ｌ１マウスにおいて試験されたいずれの他の処置よりも有意に長く平均腫瘍成長を遅延させた。 Ｂ１６Ｆ１０－ｈＰＤ－Ｌ１モデルにおける二重特異物３を使用したｉｎ ｖｉｖｏの結果を図示する。図１７Ｃは生存グラフであり、二重特異物３を用いた処置は、試験された他の処置のいずれかを用いた生存と比較してＢ１６Ｆ１０－ｈＰＤ－Ｌ１腫瘍マウスの生存を増加させたことを図示する。 Ｂ１６Ｆ１０－ｈＰＤ－Ｌ１モデルにおける二重特異物３を使用したｉｎ ｖｉｖｏの結果を図示する。図１７Ｄは、腫瘍細胞接種後２１日目までに、二重特異物３処置は、Ｂ１６Ｆ１０－ｈＰＤ－Ｌ１マウスにおいてキイトルーダを用いた処置より有意に良好に平均腫瘍成長を遅延させ続けたことを示す。 Ｂ１６Ｆ１０－ｈＰＤ－Ｌ１モデルにおける二重特異物３を使用したｉｎ ｖｉｖｏの結果を図示する。図１７Ｅは生存グラフであり、二重特異物３を用いた処置は、試験された他の処置のいずれかを用いた生存と比較してＢ１６Ｆ１０－ＨｕＰＤ－Ｌ１腫瘍マウスの生存を増加させたことを図示する。 Ｂ１６Ｆ１０－ｈＰＤ－Ｌ１モデルにおける二重特異物３を使用したｉｎ ｖｉｖｏの結果を図示する。図１７Ｆは、異なる処置群のそれぞれについての無腫瘍マウスの数を示す表を提供する。二重特異物３を用いて処置された群は、無腫瘍である３匹のマウスを有したが、キイトルーダとアベルマブとの組合せは、無腫瘍である１匹のマウスを有した。 二重特異物３は、良好に挙動するモノクローナル抗体に類似した薬物様特性（ＤＬＰ）を有し、親ＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１結合を維持することを実証する。図１８Ａは、二重特異物３は、ヒトＰＤ－１を発現するＣＨＯ細胞に対して親クローンｍＡｂ２８と類似した結合（上）、およびヒトＰＤ－Ｌ１を発現するＣＨＯ細胞に対して親クローンｍＡｂ１と類似した結合（下）を示すことを示す。 二重特異物３は、良好に挙動するモノクローナル抗体に類似した薬物様特性（ＤＬＰ）を有し、親ＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１結合を維持することを実証する。図１８Ｂは、二重特異物３は、カニクイザルＰＤ－１を発現するＣＨＯ細胞に対して親クローンｍＡｂ２８と類似した結合（上）、およびカニクイザルＰＤ－Ｌ１を発現するＣＨＯ細胞に対して親クローンｍＡｂ１と類似した結合（下）を示すことを示す。 二重特異物３は、良好に挙動するモノクローナル抗体に類似した薬物様特性（ＤＬＰ）を有し、親ＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１結合を維持することを実証する。図１８Ｃは、二重特異物３は、マウスＰＤ－１を発現するＣＨＯ細胞に対して親クローンｍＡｂ２８と類似した結合（上）、およびマウスＰＤ－Ｌ１を発現するＣＨＯ細胞に対して親クローンｍＡｂ１と類似した結合（下）を示すことを示す。 二重特異物３は、良好に挙動するモノクローナル抗体に類似した薬物様特性（ＤＬＰ）を有し、親ＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１結合を維持することを実証する。図１８Ｄは、９８％より高い純度を有する単一のピークを実証するプロテインＡクロマトグラフィー後の二重特異物３のサイズ排除クロマトグラフィートレース（上）、および分子が高い熱安定性を有することを実証する二重特異物３の示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ）トレース（下）を示す。
他に定義されなければ、本明細書において使用される全ての技術用語、表記および他の科学用語は、本開示が関わる技術分野の当業者により一般的に理解される意味を有することが意図される。一部の場合には、一般的に理解される意味を有する用語が、明確性のためおよび／または即時の参照のために本明細書において定義され、本明細書においてそのような定義を含めたことは、当該技術分野において一般に理解されるものに対する差異を表すと必ずしも解釈されるべきではない。本明細書において記載または参照される技術および手順は一般によく理解されており、当業者により従来の方法論、例えば、サムブルックら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．）， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄ． （１９８９） コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）［米国ニューヨーク州所在］に記載の広く利用される分子クローニング方法論などを使用して一般的に用いられる。適切な場合、商業的に入手可能なキットおよび試薬の使用を伴う手順は、他に記されなければ、生産者により定義されたプロトコールおよび／またはパラメーターに従って一般に実行される。
本明細書において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明確に他に指し示さなければ、複数の指示対象を含む。
明細書および特許請求の範囲において、「約」という用語は、例えば、本開示の実施形態の記載において用いられる、組成物中の原料成分の量、濃度、体積、プロセス温度、プロセス時間、収率、流速、圧力、および同様の値、ならびにこれらの範囲を修飾するために使用される。「約」という用語は、例えば、化合物、組成物、濃縮物または使用製剤の作製のために使用される典型的な測定および取扱い手順を通じて；これらの手順における意図しない誤差を通じて；方法を実行するために使用される出発材料または原料成分の生産、供給源、または純度における差異、および同様の近似の考慮を通じて起こり得る数量における変動を指す。「約」という用語はまた、具体的な初期濃度または混合物を有する製剤のエイジングに起因して異なる量、および具体的な初期濃度または混合物を有する製剤の混合またはプロセシングに起因して異なる量を包含する。「約」という用語により修飾された場合、本明細書に添付される特許請求の範囲は、これらの量の均等を含む。使用される文脈を考慮して当業者にとって明確でない該用語の使用がある場合、「約」は、具体的な値のプラスまたはマイナス１０％までを意味する。
抗原結合性タンパク質／領域／アームの標的分子への結合に関して、「特異的結合」、「特異的に結合する」、「特異的」、「選択的に結合する」、および「選択的」などの用語は、具体的な抗原（例えば、ポリペプチド標的）または具体的な抗原上のエピトープに関する場合、非特異的または非選択的な相互作用とは測定できる程度に異なる結合を意味する。特異的結合は、例えば、対照分子の結合と比較して分子の結合を決定することにより測定することができる。特異的結合はまた、過剰な非標識化標的などの、標的に類似した対照分子との競合により決定することができる。その場合、特異的結合は、標識化標的のプローブへの結合が過剰な非標識化標的により競合的に阻害される場合に指し示される。
「エピトープ」という用語は、抗原結合性タンパク質への特異的結合が可能な抗原の成分を意味する。エピトープは、頻繁に、表面に接近可能なアミノ酸残基および／または糖側鎖からなり、特定の三次元構造的特徴の他に、特定の電荷的特徴を有することができる。コンホメーショナルおよび非コンホメーショナルエピトープは、後者への結合はそうではないが、前者への結合は変性溶剤の存在下で失われるという点で区別される。エピトープは、結合に直接的に関与するアミノ酸残基、および結合に直接的に関与しない他のアミノ酸残基を含むことができる。抗原結合性タンパク質が結合するエピトープは、例えば、異なる点突然変異を有する抗原変種への抗原結合性タンパク質の結合についての試験などのエピトープ決定のための公知の技術を使用して決定することができる。
ポリペプチド配列および参照配列の間の「同一性」パーセントは、配列をアライメントし、必要な場合にはギャップを導入して最大の配列同一性パーセントを達成した後の、参照配列中のアミノ酸残基と同一のポリペプチド配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的のためのアライメントは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、ＭＥＧＡＬＩＧＮ（ＤＮＡＳＴＡＲ）、ＣＬＵＳＴＡＬＷ、またはＣＬＵＳＴＡＬ ＯＭＥＧＡソフトウェアなどの公開されているコンピュータソフトウェアを使用して、当業者の技術的範囲内にある様々なやり方で達成することができる。一部の実施形態では、アライメントは、ＣＬＵＳＴＡＬ ＯＭＥＧＡソフトウェアを使用して行われる。当業者は、比較されている配列の全長にわたり最大のアライメントを達成するために必要とされる任意のアルゴリズムを含む、配列をアライメントするための適切なパラメーターを決定することができる。
「することができる」という用語は、本明細書において使用される場合、剤または方法（例えば、本明細書に開示される任意の多重特異性抗原結合性構築物または方法）が、（当業者により理解されるような）適切な文脈において指定された特性を達成する能力を有することを意味するが、任意の具体的な時点においてその特性と関連付けられることは必要とされない。例えば、本明細書に開示される任意の多重特異性抗原結合性構築物は、ＰＤ－１および／またはＰＤ－Ｌ１を発現する細胞に投与された場合にＰＤ－１および／またはＰＤ－Ｌ１に結合することができてもよいが、構築物は、ＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１タンパク質を欠いている組成物中にある場合にＰＤ－１および／またはＰＤ－Ｌ１に結合することは期待されない。
「保存的置換」または「保存的アミノ酸置換」は、１つまたは複数の化学的または機能的に類似したアミノ酸を用いた１つまたは複数のアミノ酸の置換を指す。類似したアミノ酸を提供する保存的置換の表は当該技術分野において周知である。そのような置換を有するポリペプチド配列は、「保存的に改変されたバリアント」、または「バリアント」として公知である。そのような保存的に改変されたバリアントは、追加的に、除外することなく、多型バリアント、種間ホモログ、およびアレルである。保存的置換の一部の例は、例えば、クライトン（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ）， Ｐｒｏｔｅｉｎｓ： Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ２ｎｄ ｅｄ． （１９９３） ダブル、エイチ、フリーマン、アンドシーオー（Ｗ． Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．）［米国ニューヨーク州ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）所在］に見出すことができる。
本明細書に開示されるポリペプチドは、天然に存在しないアミノ酸配列を含むことができる。そのようなバリアントは、出発分子と１００％未満の配列同一性または類似性を必然的に有する。ある特定の実施形態では、バリアントは、例えば、バリアント分子の長さにわたり、出発（例えば、天然に存在するまたは野生型）ポリペプチドのアミノ酸配列と約７５％から１００％未満まで、より好ましくは約８０％から１００％未満まで、より好ましくは約８５％から１００％未満まで、より好ましくは約９０％から１００％未満まで（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）、最も好ましくは約９５％から１００％未満までのアミノ酸配列同一性または類似性のアミノ酸配列を有する。
「抗体」は、本明細書において使用される場合、インタクトな抗体（例えば、インタクトな免疫グロブリン）および抗体部分、例えば、抗原結合性部分を指すことができる。抗原結合性部分は少なくとも１つの抗原結合性ドメインを含む。抗原結合性ドメインの１つの例は、ＶＨ－ＶＬ二量体により形成される抗原結合性ドメインである。抗体および抗原結合性部分は、それらが特異的に結合する抗原により記載することができる。例えば、ＰＤ－Ｌ１抗体、または抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する抗体である。
ＶＨおよびＶＬ領域は、より保存された領域が散在した超可変性の領域（相補性決定領域（ＣＤＲ）とも呼ばれる超可変領域（ＨＶＲ））にさらに分割することができる。より保存された領域はフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。各ＶＨおよびＶＬは、一般に、以下の順序（Ｎ末端からＣ末端へ）：ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４で並べられた３つのＣＤＲおよび４つのＦＲを含む。ＣＤＲは、抗原結合に関与し、抗体に対して抗原特異性および結合親和性を付与する。（カバットら（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．）（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ ５ｔｈ ｅｄ．，米国国立衛生研究所公衆衛生局（Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）［米国メリーランド州ベセスダ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ）所在］を参照。）
ＣＤＲは、抗原結合に関与し、抗体に対して抗原特異性および結合親和性を付与する。重鎖および軽鎖の可変ドメインのそれぞれにおいて３つのＣＤＲがあり、これらは可変ドメインのそれぞれについてＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と呼称される。「ＣＤＲセット」という用語は、本明細書において使用される場合、標的抗原に結合することができる単一の重鎖または軽鎖可変ドメイン中に起こる３つのＣＤＲの群を指す。これらのＣＤＲの正確な境界は、異なるシステムに従って異なって定義されている。３つの重鎖ＣＤＲは、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３と称することができ、３つの軽鎖ＣＤＲは、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３と称することができる。
「カバットに従って番号付けされた」、「カバット番号付け」、「カバットの定義」、および「カバットの標識化」とも称されるカバットにより記載されたシステムは、抗体の任意の可変ドメインに対して応用可能な明瞭な残基番号付けシステムを提供し、各鎖の３つのＣＤＲを定義する精密な残基境界を提供する。（カバットら（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．），Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，米国国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）［米国メリーランド州ベセスダ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ）所在］（１９８７）および（１９９１）；その内容の全体を参照により援用する）。これらのＣＤＲはカバットＣＤＲと称され、おおよそ軽鎖可変ドメイン中の残基２４～３４（ＣＤＲ１）、５０～５６（ＣＤＲ２）および８９～９７（ＣＤＲ３）、ならびに重鎖可変ドメイン中の３１～３５（ＣＤＲ１）、５０～６５（ＣＤＲ２）および９５～１０２（ＣＤＲ３）を含む。ＣＤＲがカバットに従って定義される場合、軽鎖ＦＲ残基はおおよそ残基１～２３（ＬＣＦＲ１）、３５～４９（ＬＣＦＲ２）、５７～８８（ＬＣＦＲ３）、および９８～１０７（ＬＣＦＲ４）に位置し、重鎖ＦＲ残基は、重鎖残基中のおおよそ残基１～３０（ＨＣＦＲ１）、３６～４９（ＨＣＦＲ２）、６６～９４（ＨＣＦＲ３）、および１０３～１１３（ＨＣＦＲ４）に位置する。「カバットにおけるようなＥＵインデックス」はヒトＩｇＧ１ ＥＵ抗体の残基番号付けを指す。
他のＣＤＲ番号付けシステムもまた当該技術分野において使用される（例えば、表Ａを参照）。コチア（Ｃｈｏｔｈｉａ）および共同研究者らは、カバットＣＤＲ内のある特定の下位部分は、アミノ酸配列のレベルにおいて大きな多様性を有するにもかかわらず、ほぼ同一のペプチド骨格コンホメーションをとることを見出した。（コチアら（Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．）（１９８７） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９６：９０１－９１７；およびコチアら（Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．）（１９８９） Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７７－８８３）。これらの下位部分は、Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３またはＨ１、Ｈ２、およびＨ３として指定され、「Ｌ」および「Ｈ」はそれぞれ軽鎖および重鎖領域を指定する。これらのＣＤＲは、「コチアＣＤＲ」、「コチア番号付け」、または「コチアに従って番号付けされた」と称されることがあり、おおよそ軽鎖可変ドメイン中の残基２４～３４（ＣＤＲ１）、５０～５６（ＣＤＲ２）および８９～９７（ＣＤＲ３）、ならびに重鎖可変ドメイン中の２６～３２（ＣＤＲ１）、５０～５６または５２～５６（ＣＤＲ２）、および９５～１０２（ＣＤＲ３）を含む。Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９６：９０１－９１７（１９８７）。
「マッカラムに従って番号付けされた」、または「マッカラム番号付け」とも称される、マッカラム（ＭａｃＣａｌｌｕｍ）により記載されたシステムは、おおよそ軽鎖可変ドメイン中の残基３０～３６（ＣＤＲ１）、４６～５５（ＣＤＲ２）および８９～９６（ＣＤＲ３）、ならびに重鎖可変ドメイン中の３０～３５（ＣＤＲ１）、４７～５８（ＣＤＲ２）および９３～１０１（ＣＤＲ３）を含む。マッカラムら（ＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．）（（１９９６）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２６２（５）：７３２－７４５）。
「ＡｂＭに従った番号付け」、または「ＡｂＭ番号付け」とも称される、ＡｂＭにより記載されたシステムは、おおよそ軽鎖可変ドメイン中の残基２４～３４（ＣＤＲ１）、５０～５６（ＣＤＲ２）および８９～９７（ＣＤＲ３）、ならびに重鎖可変ドメイン中の２６～３５（ＣＤＲ１）、５０～５８（ＣＤＲ２）および９５～１０２（ＣＤＲ３）を含む。
可変領域のＩＭＧＴ（インターナショナル・イミュノジェネティクス・インフォメーション・システム（ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ ＩＭＭＵＮＯＧＥＮＥＴＩＣＳ ＩＮＦＯＲＭＡＴＩＯＮ ＳＹＳＴＥＭ））番号付けもまた使用することができ、これは、ルフラン、エム、ピー（Ｌｅｆｒａｎｃ， Ｍ．－Ｐ．）「免疫グロブリン、Ｔ細胞受容体およびＩｇ様ドメインに対するＩＭＧＴ特有の番号付け（Ｔｈｅ ＩＭＧＴ ｕｎｉｑｕｅ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ， Ｔ ｃｅｌｌ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ａｎｄ Ｉｇ－ｌｉｋｅ ｄｏｍａｉｎｓ）」，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｓｔ，７，１３２－１３６（１９９９）（全体を参照により本願明細書に明示的に援用する）に記載されるようなＩＭＧＴの方法に従った免疫グロブリン可変重鎖または軽鎖中の残基の番号付けである。本明細書において使用される場合、「ＩＭＧＴ配列番号付け」または「ＩＭＴＧに従って番号付けされた」は、ＩＭＧＴに従った可変領域をコードする配列の番号付けを指す。重鎖可変ドメインについて、ＩＭＧＴに従って番号付けされた場合、超可変領域は、ＣＤＲ１についてアミノ酸位置２７～３８、ＣＤＲ２についてアミノ酸位置５６～６５、およびＣＤＲ３についてアミノ酸位置１０５～１１７に及ぶ。軽鎖可変ドメインについて、ＩＭＧＴに従って番号付けされた場合、超可変領域は、ＣＤＲ１についてアミノ酸位置２７～３８、ＣＤＲ２についてアミノ酸位置５６～６５、およびＣＤＲ３についてアミノ酸位置１０５～１１７に及ぶ。
本明細書に記載の構築物および抗原結合アームの一部の実施形態では、本明細書に記載のＣＤＲは、コチア番号付けに従って番号付けされた場合、おおよそ軽鎖可変ドメイン中の残基２４～３４（ＣＤＲ１）、４９～５６（ＣＤＲ２）および８９～９７（ＣＤＲ３）、ならびに重鎖可変ドメイン中の２７～３５（ＣＤＲ１）、４９～６０（ＣＤＲ２）および９３～１０２（ＣＤＲ３）を含む。一部の実施形態では、軽鎖可変ドメイン中のＣＤＲ２は、コチア番号付けに従って番号付けされた場合、アミノ酸４９～５６を含むことができる。
Figure 2022507253000001
好ましい方法および材料が本明細書に記載されるが、本明細書に記載のものと類似または同等の方法および材料もまた、本開示の方法および組成物の実施または試験において使用することができる。本明細書において述べられる全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献を本願明細書に援用する。
本発明の様々な態様が以下においてさらに詳細に記載される。追加の定義は本明細書の全体を通じて述べられる。
免疫系は、腫瘍細胞を認識および排除する能力を有するが、腫瘍は、免疫から逃避する複数の戦略を使用することができる。阻害免疫チェックポイント分子は様々な抗腫瘍阻害機構を通じてがんの進行を促進することを最近の研究は示している。免疫チェックポイントの遮断は、治療的な抗腫瘍免疫を活性化または再活性化させるアプローチの１つである。様々なリガンドが多数のコグネイト阻害免疫チェックポイント受容体のために記載されてきた。例えば、ナイア（Ｎａｉｒ）＆エルコード（Ｅｌｋｏｒｄ）， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ＆ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ （２０１８）， ９６：２１－３３；およびジェンキンスら（Ｊｅｎｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．）， Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊ． ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ （２０１７）， １１８：９－１６に総説されている。
プログラム死１（ＰＤ－１）タンパク質は、Ｔ細胞調節因子の拡張ＣＤ２８／ＣＴＬＡ－４ファミリーの阻害メンバーである（オカザキら（Ｏｋａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．）（２００２） Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４： ３９１７７９－８２；ベネットら（Ｂｅｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．）（２００３） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １７０：７１１－８）。ＣＤ２８ファミリーの他のメンバーとしては、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ－４、ＩＣＯＳおよびＢＴＬＡが挙げられる。ＰＤ－１は単量体として存在し、他のＣＤ２８ファミリーメンバーに特徴的な対合していないシステイン残基を欠いていることが示唆されている。ＰＤ－１は、活性化Ｂ細胞、Ｔ細胞、および単球上に発現される。
ＰＤ－１遺伝子は５５ｋＤａのＩ型膜貫通タンパク質をコードする（アガタら（Ａｇａｔａ ｅｔ ａｌ．）（１９９６） Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ８：７６５－７２）。ＣＴＬＡ－４に構造的に類似しているが、ＰＤ－１は、Ｂ７－１およびＢ７－２結合のために重要なＭＹＰＰＹモチーフを欠いている。ＰＤ－１の２つのリガンド、ＰＤ－Ｌ１（Ｂ７－Ｈ１）およびＰＤ－Ｌ２（Ｂ７－ＤＣ）が同定されており、これらは、ＰＤ－１に結合するとＴ細胞活性化を下方調節することが示されている（フリーマンら（Ｆｒｅｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．）（２０００） Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １９２：１０２７－３４；カーターら（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．）（２００２） Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３２：６３４－４３）。ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２の両方は、ＰＤ－１に結合するが他のＣＤ２８ファミリーメンバーに結合しないＢ７ホモログである。ＰＤ－Ｌ１は、様々なヒトがん中に豊富に存在する（ドングら（Ｄｏｎｇ ｅｔ ａｌ．）（２００２） Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ８：７８７－９）。
ＰＤ－１は、ＴＣＲシグナルを負に調節する免疫阻害タンパク質として公知である（イシダ、ワイら（Ｉｓｈｉｄａ， Ｙ． ｅｔ ａｌ．）（１９９２） ＥＭＢＯ Ｊ． １１：３８８７－３８９５；ブランク、シーら（Ｂｌａｎｋ， Ｃ． ｅｔ ａｌ．）（Ｅｐｕｂ ２００６ Ｄｅｃ． ２９） Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ． ５６（５）：７３９－７４５）。ＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１の間の相互作用は免疫チェックポイントとして作用することができ、これは、例えば、腫瘍浸潤性リンパ球の減少、Ｔ細胞受容体媒介性の増殖の減少、および／またはがん性細胞による免疫逃避に繋がることができる（ドングら（Ｄｏｎｇ ｅｔ ａｌ．）（２００３） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｍｅｄ． ８１：２８１－７；ブランクら（Ｂｌａｎｋ ｅｔ ａｌ．）（２００５） Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ． ５４：３０７－３１４；コニシら（Ｋｏｎｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．）（２００４） Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １０：５０９４－１００）。免疫抑制は、ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２とのＰＤ－１の局所的な相互作用を阻害することにより逆転させることができ、ＰＤ－Ｌ２とのＰＤ－１の相互作用も遮断した場合に効果は相加的である（イワイら（Ｉｗａｉ ｅｔ ａｌ．）（２００２） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９９：１２２９３－７；ブラウンら（Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．）（２００３） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １７０：１２５７－６６）。
分化クラスター２７４（ＣＤ２７４）またはＢ７ホモログ１（Ｂ７－Ｈ１）としても公知のＰＤ－Ｌ１は、妊娠、組織同種グラフト、自己免疫疾患、および肝炎などの他の疾患状態などの具体的な事象の間の免疫系の抑制において役割を果たす４０ｋＤａの１型膜貫通タンパク質である。例として、ヒトＰＤ－Ｌ１は配列番号１１５のアミノ酸配列（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｑ９ＮＺＱ７）を含む。通常、免疫系は、抗原特異的なＣＤ８＋ Ｔ細胞および／またはＣＤ４＋ヘルパー細胞の増殖のトリガーとなる外因性または内因性の危険シグナルと関連付けられる外来抗原に反応する。がんにおいて、がん細胞上に発現されたＰＤ－Ｌ１は、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞上のそのリガンドＰＤ－１に結合する。ＰＤ－１へのＰＤ－Ｌ１の結合は、リンパ節において抗原特異的Ｔ細胞の増殖を低減する阻害シグナルを伝達すると同時に、制御性Ｔ細胞（抗炎症性、抑制性Ｔ細胞）においてアポトーシスを低減する。ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用はまた、腫瘍特異的Ｔ細胞のアポトーシスを誘導し、Ｆｏｘｐ３＋制御性Ｔ細胞へのＣＤ４＋ Ｔ細胞の分化を促進し、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）攻撃に対する腫瘍細胞の抵抗性を促進し、そのため腫瘍が宿主免疫系から逃避することを可能とする。
本開示は、ＰＤ－１ならびにそのリガンド（例えば、ＰＤ－Ｌ１および／またはＰＤ－Ｌ２）の間の相互作用の結果としてもたらされる免疫チェックポイント抑制を低減することにより腫瘍逃避を阻害するための組成物および方法に関する。特に、ＰＤ－１ならびにそのリガンド（例えば、ＰＤ－１および／またはＰＤ－Ｌ２）が発現された細胞の相互作用（ブリッジ形成）を促進しながらＰＤ－１およびそのリガンドの間の相互作用を遮断する、二重特異性および四価構築物などの新規の多重特異性および多価構築物を含む組成物が本明細書において提供される。「遮断およびブリッジ形成」の能力を有する本開示のそのような組成物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでの増加した効力を有し、例えば、Ｔ細胞増殖、ＩＦＮγの産生および／もしくは分泌、Ｔ細胞の細胞溶解活性、ならびに／または機能的な疲弊からのＴ細胞のレスキューを強く増進して、個々の抗体の組合せと比較した場合の他に、臨床的なチェックポイント遮断剤と比較して、優位な抗腫瘍有効性（例えば、腫瘍体積の減少、腫瘍細胞の数の減少、腫瘍細胞増殖の減少、および／または腫瘍細胞生存の減少が挙げられるがそれに限定されない様々な手段により顕在化し得る生物学的効果）を提供する。そのような多重特異性および多価構築物において使用するための、新規のモノクローナル抗ＰＤ－１抗体およびその抗原結合性断片、ならびに新規のモノクローナル抗ＰＤ－Ｌ１抗体およびその抗原結合性断片もまた本明細書において提供される。これらの新規のモノクローナル抗ＰＤ－１抗体および新規のモノクローナル抗ＰＤ－Ｌ１抗体の一部は共通の軽鎖を共有し、それにより、優れた薬物様特性および生産可能性の他に、それらの親抗体に類似した親和性を有する多重特異性および多価構築物の生成を可能とする。
よって、本開示は、抗原結合の少なくとも２つの抗原結合性アームまたは単位を含む多重特異性抗原結合性構築物であって、抗原結合の第１のアームまたは単位が、免疫細胞により発現されたＰＤ－１に結合し、抗原結合の第２のアームまたは単位が、第２の細胞により発現された１つまたは複数のＰＤ－１リガンド（例えば、ＰＤ－Ｌ１および／またはＰＤ－Ｌ２）に結合する、多重特異性抗原結合性構築物を提供する。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物は、ＰＤ－１およびそのリガンドの相互作用を遮断する。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物は、ＰＤ－１およびそのリガンドが発現された細胞をブリッジさせて、ＰＤ－１を発現する免疫細胞の相互作用および／または有効性を促進する。一部の実施形態では、抗原結合性アームの少なくとも１つはＰＤ－１について二価である。一部の実施形態では、抗原結合性アームの少なくとも１つはＰＤ－Ｌ１について二価である。一部の実施形態では、抗原結合性アームの少なくとも１つはＰＤ－１について二価であり、抗原結合性アームの少なくとも１つはＰＤ－Ｌ１について二価である。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物は、ＰＤ－１に結合する抗原結合の少なくとも２つの単位を含む。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物は、ＰＤ－１に結合する抗原結合の２つの単位を含む。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物は、ＰＤ－１リガンド、例えば、ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２に結合する抗原結合の少なくとも２つの単位を含む。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物は、ＰＤ－１リガンド、例えば、ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２に結合する抗原結合の２つの単位を含む。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物は抗原結合の少なくとも４つの単位を含み、抗原結合の２つの単位はＰＤ－１に結合し、抗原結合の２つの単位はＰＤ－１リガンド、例えば、ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２に結合する。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物は抗原結合の４つの単位を含み、抗原結合の２つの単位はＰＤ－１に結合し、抗原結合の２つの単位はＰＤ－１リガンド、例えば、ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２に結合する。本明細書に記載の任意の態様の一部の実施形態では、構築物は二重特異性抗体である。一部の実施形態では、二重特異性抗体はＰＤ－１およびＰＤ－１リガンドの両方のアンタゴニストである。一部の実施形態では、構築物は共通の軽鎖を含む。一部の実施形態では、抗原結合性アームの一方または両方はアプタマーである。一部の実施形態では、抗原結合性アームの一方または両方は抗体以外のタンパク質である。一部の実施形態では、構築物は少なくとも２つの抗体を含む。一部の実施形態では、抗原結合性アームの少なくとも１つはＰＤ－１に対して特異的な二価抗体である。一部の実施形態では、抗原結合性アームの少なくとも１つはＰＤ－Ｌ１に対して特異的な二価抗体である。一部の実施形態では、抗原結合性アームの少なくとも１つはＰＤ－１に対して特異的な二価抗体であり、抗原結合性アームの少なくとも１つはＰＤ－Ｌ１に対して特異的な二価抗体であり、それにより構築物は四価である。一部の実施形態では、二重特異性抗体はＰＤ－１上の２つの異なるエピトープに結合する。一部の実施形態では、二重特異性抗体はＰＤ－１リガンド上の２つの異なるエピトープに結合する。一部の態様では、ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－１に特異的に結合する新規の単離された抗体およびその抗原結合性部分もまた本明細書において提供される。一部の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－１に特異的に結合するこれらの新規の単離された抗体ならびにその抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲ、可変重鎖、および／または可変軽鎖は、本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物の抗原結合の１つまたは複数のアームまたは単位において使用され得る。
よって、本明細書に記載されるように、開示される多重特異性抗原結合性構築物は、二重特異性、三重特異性、四重特異性、または多重特異性抗体またはその抗原結合性部分を含む。記載される多重特異性構築物は、少なくとも１つの、好ましくは両方の、抗原結合性アームについて好ましくは二価であり、すなわち、二重特異性および三価、または二重特異性および四価分子である。本明細書に記載の多重特異性構築物は、様々な態様および実施形態では、１つまたは複数の抗体および／またはその抗原結合性部分を含むことができる。例えば、抗原結合性アームは、ＰＤ－１に対する所与の抗体および／またはＰＤ－Ｌ１に対する所与の抗体の、可変重鎖および／または可変軽鎖、またはその相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むことができる。よって、本明細書に記載の任意の態様の一部の実施形態では、第１の抗原結合性アーム、第２の抗原結合性アーム、抗原結合の第１の単位、結合の第２の単位、またはその任意の組合せは、抗体またはその抗原結合性部分を含むことができる。本明細書に記載の任意の態様の一部の実施形態では、第１の抗原結合性アーム、第２の抗原結合性アーム、抗原結合の第１の単位、結合の第２の単位、またはその任意の組合せは、抗体またはその抗原結合性部分である。
Ａ．ＰＤ－Ｌ１アンタゴニスト
一部の態様および実施形態では、本開示は抗ＰＤ－Ｌ１アンタゴニストを提供する。一部の実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１アンタゴニストは、本明細書に開示される任意の抗ＰＤ－Ｌ１抗体または抗原結合性分子である。一部の実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体または抗原結合性分子は、多重特異性抗原結合性構築物の一部分ではなく、すなわち、抗ＰＤ－Ｌ１抗体または抗原結合性分子は、複数のエピトープに結合するタンパク質構築物の一部分ではない。一部の実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体または抗原結合性部分を異なる抗体または抗原結合性部分と組み合わせて、多重特異性抗原結合性構築物を形成させることができる。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物は、ＰＤ－Ｌ１上のエピトープおよび別のタンパク質上のエピトープに結合することができる。一部の実施形態では、他のタンパク質上のエピトープはＰＤ－１上にある。
よって、一部の態様では、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分が本明細書において提供される。一部の態様では、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分は、（ａ）（ｉ）配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含むＣＤＲＨ１、（ｉｉ）配列番号２（ＧＧＩＩＰＸ１Ｘ２ＧＸ３ＡＴＹＡであり、Ｘ１はＶまたはＩであり、Ｘ２はＦ、Ｌ、またはＶであり、Ｘ３はＴまたはＡである）を含むＣＤＲＨ２、および（ｉｉｉ）配列番号３（ＡＲＬＫＸ１ＥＬＫＤＡＦＤＩであり、Ｘ１はＧ、Ｆ、またはＮである）を含むＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域、ならびに（ｂ）（ｉ）配列番号４（ＲＡＳＱＸ１ＩＳＳＹＬＮであり、Ｘ１はＳ、Ｗ、またはＱである）を含むＣＤＲＬ１、（ｉｉ）配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含むＣＤＲＬ２、および（ｉｉｉ）配列番号６（Ｘ１ＱＳＹＳＴＰＬＴであり、Ｘ１はＱまたはＦである）を含むＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含む。
これらの態様および本明細書に記載の全てのそのような態様の一部の実施形態では、ＣＤＲＨ１は配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、ＣＤＲＨ２は配列番号７（ＧＧＩＩＰＩＬＧＡＡＴＹＡ）を含み、ＣＤＲＨ３は配列番号８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含む。これらの態様および本明細書に記載の全てのそのような態様の一部の実施形態では、ＣＤＲＨ１は配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、ＣＤＲＨ２は配列番号７（ＧＧＩＩＰＩＬＧＡＡＴＹＡ）を含み、ＣＤＲＨ３は配列番号８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含み、ＣＤＲＬ１は配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含み、ＣＤＲＬ２は配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含み、ＣＤＲＬ３は配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含む。そのような重鎖および軽鎖可変ＣＤＲ領域を有する代表的な抗体はｍＡｂ１である。
これらの態様および本明細書に記載の全てのそのような態様の一部の実施形態では、ＣＤＲＨ１は配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、ＣＤＲＨ２は配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含み、ＣＤＲＨ３は配列番号８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含む。これらの態様および本明細書に記載の全てのそのような態様の一部の実施形態では、ＣＤＲＨ１は配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、ＣＤＲＨ２は配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含み、ＣＤＲＨ３は配列番号８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含み、ＣＤＲＬ１は配列番号１２（ＲＡＳＱＷＩＳＳＹＬＮ）を含み、ＣＤＲＬ２は配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含み、ＣＤＲＬ３は配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含む。そのような重鎖および軽鎖可変ＣＤＲ領域を有する代表的な抗体はｍＡｂ２である。これらの態様および本明細書に記載の全てのそのような態様の一部の実施形態では、ＣＤＲＨ１は配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、ＣＤＲＨ２は配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含み、ＣＤＲＨ３は配列番号８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含み、ＣＤＲＬ１は配列番号１３（ＲＡＳＱＱＩＳＳＹＬＮ）を含み、ＣＤＲＬ２は配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含み、ＣＤＲＬ３は配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含む。そのような重鎖および軽鎖可変ＣＤＲ領域を有する代表的な抗体はｍＡｂ３である。
これらの態様および本明細書に記載の全てのそのような態様の一部の実施形態では、ＣＤＲＨ１は配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、ＣＤＲＨ２は配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含み、ＣＤＲＨ３は配列番号８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含み、ＣＤＲＬ１は配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含み、ＣＤＲＬ２は配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含み、ＣＤＲＬ３は配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含む。そのような重鎖および軽鎖可変ＣＤＲ領域を有する代表的な抗体はｍＡｂ４である。別のそのような重鎖および軽鎖可変ＣＤＲ領域を有する代表的な抗体はｍＡｂ２４である。
これらの態様および本明細書に記載の全てのそのような態様の一部の実施形態では、ＣＤＲＨ１は配列番号１４（ＧＴＦＳＳＹＡＦＳ）を含み、ＣＤＲＨ２は配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含み、ＣＤＲＨ３は配列番号８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含む。これらの態様および本明細書に記載の全てのそのような態様の一部の実施形態では、ＣＤＲＨ１は配列番号１４（ＧＴＦＳＳＹＡＦＳ）を含み、ＣＤＲＨ２は配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含み、ＣＤＲＨ３は配列番号８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含み、ＣＤＲＬ１は配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含み、ＣＤＲＬ２は配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含み、ＣＤＲＬ３は配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含む。そのような重鎖および軽鎖可変ＣＤＲ領域を有する代表的な抗体はｍＡｂ５である。
これらの態様および本明細書に記載の全てのそのような態様の一部の実施形態では、ＣＤＲＨ１は配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、ＣＤＲＨ２は配列番号１５（ＧＧＩＩＰＩＦＧＩＡＮＹＡ）を含み、ＣＤＲＨ３は配列番号８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含む。これらの態様および本明細書に記載の全てのそのような態様の一部の実施形態では、ＣＤＲＨ１は配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、ＣＤＲＨ２は配列番号１５（ＧＧＩＩＰＩＦＧＩＡＮＹＡ）を含み、ＣＤＲＨ３は配列番号８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含み、ＣＤＲＬ１は配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含み、ＣＤＲＬ２は配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含み、ＣＤＲＬ３は配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含む。そのような重鎖および軽鎖可変ＣＤＲ領域を有する代表的な抗体はｍＡｂ６である。
これらの態様および本明細書に記載の全てのそのような態様の一部の実施形態では、ＣＤＲＨ１は配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、ＣＤＲＨ２は配列番号１６（ＧＧＩＩＰＮＦＧＴＡＴＹＡ）を含み、ＣＤＲＨ３は配列番号１７（ＡＲＬＫＧＥＬＫＧＡＧＤＩ）を含む。これらの態様および本明細書に記載の全てのそのような態様の一部の実施形態では、配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）、ＣＤＲＨ２は配列番号１６（ＧＧＩＩＰＮＦＧＴＡＴＹＡ）を含み、ＣＤＲＨ３は配列番号１７（ＡＲＬＫＧＥＬＫＧＡＧＤＩ）を含み、ＣＤＲＬ１は配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含み、ＣＤＲＬ２は配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含み、ＣＤＲＬ３は配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含む。そのような重鎖および軽鎖可変ＣＤＲ領域を有する代表的な抗体はｍＡｂ７である。
これらの態様および本明細書に記載の全てのそのような態様の一部の実施形態では、ＣＤＲＨ１は配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、ＣＤＲＨ２は配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含み、ＣＤＲＨ３は配列番号１８（ＡＲＬＫＦＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含む。これらの態様および本明細書に記載の全てのそのような態様の一部の実施形態では、ＣＤＲＨ１は配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、ＣＤＲＨ２は配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含み、ＣＤＲＨ３は配列番号１８（ＡＲＬＫＦＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含み、ＣＤＲＬ１は配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含み、ＣＤＲＬ２は配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含み、ＣＤＲＬ３は配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含む。そのような重鎖および軽鎖可変ＣＤＲ領域を有する代表的な抗体はｍＡｂ８である。
これらの態様および本明細書に記載の全てのそのような態様の一部の実施形態では、ＣＤＲＨ１は配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、ＣＤＲＨ２は配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含み、ＣＤＲＨ３は配列番号１９（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＥ）を含む。これらの態様および本明細書に記載の全てのそのような態様の一部の実施形態では、ＣＤＲＨ１は配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、ＣＤＲＨ２は配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含み、ＣＤＲＨ３は配列番号１９（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＥ）を含み、ＣＤＲＬ１は配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含み、ＣＤＲＬ２は配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含み、ＣＤＲＬ３は配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含む。そのような重鎖および軽鎖可変ＣＤＲ領域を有する代表的な抗体はｍＡｂ９である。
これらの態様および本明細書に記載の全てのそのような態様の一部の実施形態では、ＣＤＲＨ１は配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、ＣＤＲＨ２は配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含み、ＣＤＲＨ３は配列番号２０（ＡＲＬＫＮＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含む。これらの態様および本明細書に記載の全てのそのような態様の一部の実施形態では、ＣＤＲＨ１は配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、ＣＤＲＨ２は配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含み、ＣＤＲＨ３は配列番号２０（ＡＲＬＫＮＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含み、ＣＤＲＬ１は配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含み、ＣＤＲＬ２は配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含み、ＣＤＲＬ３は配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含む。そのような重鎖および軽鎖可変ＣＤＲ領域を有する代表的な抗体はｍＡｂ１０である。
これらの態様および本明細書に記載の全てのそのような態様の一部の実施形態では、ＣＤＲＨ１は配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、ＣＤＲＨ２は配列番号２１（ＧＧＶＩＰＦＬＧＴＡＮＹＡ）を含み、ＣＤＲＨ３は配列番号２２（ＡＲＬＫＧＩＬＫＤＡＬＤＩ）を含む。これらの態様および本明細書に記載の全てのそのような態様の一部の実施形態では、ＣＤＲＨ１は配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、ＣＤＲＨ２は配列番号２１（ＧＧＶＩＰＦＬＧＴＡＮＹＡ）を含み、ＣＤＲＨ３は配列番号２２（ＡＲＬＫＧＩＬＫＤＡＬＤＩ）を含み、ＣＤＲＬ１は配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含み、ＣＤＲＬ２は配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含み、ＣＤＲＬ３は配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含む。そのような重鎖および軽鎖可変ＣＤＲ領域を有する代表的な抗体はｍＡｂ１１である。
これらの態様および本明細書に記載の全てのそのような態様の一部の実施形態では、ＣＤＲＨ１は配列番号２３（ＧＴＦＳＳＹＡＩＳ）を含み、ＣＤＲＨ２は配列番号２４（ＧＧＩＩＰＩＶＧＩＡＮＹＡ）を含み、ＣＤＲＨ３は配列番号８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含む。これらの態様および本明細書に記載の全てのそのような態様の一部の実施形態では、ＣＤＲＨ１は配列番号２３（ＧＴＦＳＳＹＡＩＳ）を含み、ＣＤＲＨ２は配列番号２４（ＧＧＩＩＰＩＶＧＩＡＮＹＡ）を含み、ＣＤＲＨ３は配列番号８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含み、ＣＤＲＬ１は配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含み、ＣＤＲＬ２は配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含み、ＣＤＲＬ３は配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含む。そのような重鎖および軽鎖可変ＣＤＲ領域を有する代表的な抗体はｍＡｂ１２である。
これらの態様および本明細書に記載の全てのそのような態様の一部の実施形態では、ＣＤＲＨ１は配列番号２３（ＧＴＦＳＳＹＡＩＳ）を含み、ＣＤＲＨ２は配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含み、ＣＤＲＨ３は配列番号２５（ＡＲＬＫＧＥＦＫＤＡＦＤＩ）を含む。これらの態様および本明細書に記載の全てのそのような態様の一部の実施形態では、ＣＤＲＨ１は配列番号２３（ＧＴＦＳＳＹＡＩＳ）を含み、ＣＤＲＨ２は配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含み、ＣＤＲＨ３は配列番号２５（ＡＲＬＫＧＥＦＫＤＡＦＤＩ）を含み、ＣＤＲＬ１は配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含み、ＣＤＲＬ２は配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含み、ＣＤＲＬ３は配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含む。そのような重鎖および軽鎖可変ＣＤＲ領域を有する代表的な抗体はｍＡｂ１３である。
これらの態様および本明細書に記載の全てのそのような態様の一部の実施形態では、ＣＤＲＨ１は配列番号２３（ＧＴＦＳＳＹＡＩＳ）を含み、ＣＤＲＨ２は配列番号２６（ＧＲＩＩＰＬＦＧＴＡＨＹＡ）を含み、ＣＤＲＨ３は配列番号８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含む。これらの態様および本明細書に記載の全てのそのような態様の一部の実施形態では、ＣＤＲＨ１は配列番号２３（ＧＴＦＳＳＹＡＩＳ）を含み、ＣＤＲＨ２は配列番号２６（ＧＲＩＩＰＬＦＧＴＡＨＹＡ）を含み、ＣＤＲＨ３は配列番号８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含み、ＣＤＲＬ１は配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含み、ＣＤＲＬ２は配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含み、ＣＤＲＬ３は配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含む。そのような重鎖および軽鎖可変ＣＤＲ領域を有する代表的な抗体はｍＡｂ１４である。
これらの態様および本明細書に記載の全てのそのような態様の一部の実施形態では、ＣＤＲＨ１は配列番号２３（ＧＴＦＳＳＹＡＩＳ）を含み、ＣＤＲＨ２は配列番号２７（ＧＲＩＮＰＩＬＧＴＡＮＹＡ）を含み、ＣＤＲＨ３は配列番号２８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＳＩ）を含む。これらの態様および本明細書に記載の全てのそのような態様の一部の実施形態では、ＣＤＲＨ１は配列番号２３（ＧＴＦＳＳＹＡＩＳ）を含み、ＣＤＲＨ２は配列番号２７（ＧＲＩＮＰＩＬＧＴＡＮＹＡ）を含み、ＣＤＲＨ３は配列番号２８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＳＩ）を含み、ＣＤＲＬ１は配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含み、ＣＤＲＬ２は配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含み、ＣＤＲＬ３は配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含む。そのような重鎖および軽鎖可変ＣＤＲ領域を有する代表的な抗体はｍＡｂ１５である。
これらの態様および本明細書に記載の全てのそのような態様の一部の実施形態では、ＣＤＲＨ１は配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、ＣＤＲＨ２は配列番号２９（ＧＲＩＩＰＩＦＧＴＡＤＹＡ）を含み、ＣＤＲＨ３は配列番号８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含む。これらの態様および本明細書に記載の全てのそのような態様の一部の実施形態では、ＣＤＲＨ１は配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、ＣＤＲＨ２は配列番号２９（ＧＲＩＩＰＩＦＧＴＡＤＹＡ）を含み、ＣＤＲＨ３は配列番号８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含み、ＣＤＲＬ１は配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含み、ＣＤＲＬ２は配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含み、ＣＤＲＬ３は配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含む。そのような重鎖および軽鎖可変ＣＤＲ領域を有する代表的な抗体はｍＡｂ１６である。
これらの態様および本明細書に記載の全てのそのような態様の一部の実施形態では、ＣＤＲＨ１は配列番号２３（ＧＴＦＳＳＹＡＩＳ）を含み、ＣＤＲＨ２は配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含み、ＣＤＲＨ３は配列番号３０（ＡＲＬＫＧＥＬＫＣＡＦＤＩ）を含む。これらの態様および本明細書に記載の全てのそのような態様の一部の実施形態では、ＣＤＲＨ１は配列番号２３（ＧＴＦＳＳＹＡＩＳ）を含み、ＣＤＲＨ２は配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含み、ＣＤＲＨ３は配列番号３０（ＡＲＬＫＧＥＬＫＣＡＦＤＩ）を含み、ＣＤＲＬ１は配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含み、ＣＤＲＬ２は配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含み、ＣＤＲＬ３は配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含む。
これらの態様および本明細書に記載の全てのそのような態様の一部の実施形態では、ＣＤＲＨ１は配列番号１２２（ＧＴＫＳＳＹＡＩＳ）を含み、ＣＤＲＨ２は配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含み、ＣＤＲＨ３は配列番号３０（ＡＲＬＫＧＥＬＫＣＡＦＤＩ）を含む。これらの態様および本明細書に記載の全てのそのような態様の一部の実施形態では、ＣＤＲＨ１は配列番号１２２（ＧＴＫＳＳＹＡＩＳ）を含み、ＣＤＲＨ２は配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含み、ＣＤＲＨ３は配列番号３０（ＡＲＬＫＧＥＬＫＣＡＦＤＩ）を含み、ＣＤＲＬ１は配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含み、ＣＤＲＬ２は配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含み、ＣＤＲＬ３は配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含む。そのような重鎖および軽鎖可変ＣＤＲ領域を有する代表的な抗体はｍＡｂ１７である。
これらの態様および本明細書に記載の全てのそのような態様の一部の実施形態では、ＣＤＲＨ１は配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、ＣＤＲＨ２は配列番号３１（ＧＧＩＩＰＩＬＧＴＡＴＹＡ）を含み、ＣＤＲＨ３は配列番号３２（ＡＲＲＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含む。これらの態様および本明細書に記載の全てのそのような態様の一部の実施形態では、ＣＤＲＨ１は配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、ＣＤＲＨ２は配列番号３１（ＧＧＩＩＰＩＬＧＴＡＴＹＡ）を含み、ＣＤＲＨ３は配列番号３２（ＡＲＲＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含み、ＣＤＲＬ１は配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含み、ＣＤＲＬ２は配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含み、ＣＤＲＬ３は配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含む。そのような重鎖および軽鎖可変ＣＤＲ領域を有する代表的な抗体はｍＡｂ１８である。
これらの態様および本明細書に記載の全てのそのような態様の一部の実施形態では、ＣＤＲＨ１は配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、ＣＤＲＨ２は配列番号３３（ＧＧＩＩＰＩＶＡＴＡＮＹＡ）を含み、ＣＤＲＨ３は配列番号３２（ＡＲＲＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含む。これらの態様および本明細書に記載の全てのそのような態様の一部の実施形態では、ＣＤＲＨ１は配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、ＣＤＲＨ２は配列番号３３（ＧＧＩＩＰＩＶＡＴＡＮＹＡ）を含み、ＣＤＲＨ３は配列番号３２（ＡＲＲＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含み、ＣＤＲＬ１は配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含み、ＣＤＲＬ２は配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含み、ＣＤＲＬ３は配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含む。そのような重鎖および軽鎖可変ＣＤＲ領域を有する代表的な抗体はｍＡｂ１９である。
これらの態様および本明細書に記載の全てのそのような態様の一部の実施形態では、ＣＤＲＨ１は配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、ＣＤＲＨ２は配列番号３４（ＧＧＩＩＰＩＦＧＫＡＴＹＡ）を含み、ＣＤＲＨ３は配列番号３２（ＡＲＲＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含む。これらの態様および本明細書に記載の全てのそのような態様の一部の実施形態では、ＣＤＲＨ１は配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、ＣＤＲＨ２は配列番号３４（ＧＧＩＩＰＩＦＧＫＡＴＹＡ）を含み、ＣＤＲＨ３は配列番号３２（ＡＲＲＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含み、ＣＤＲＬ１は配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含み、ＣＤＲＬ２は配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含み、ＣＤＲＬ３は配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含む。そのような重鎖および軽鎖可変ＣＤＲ領域を有する代表的な抗体はｍＡｂ２０である。
これらの態様および本明細書に記載の全てのそのような態様の一部の実施形態では、ＣＤＲＨ１は配列番号３６（ＧＰＦＲＳＨＡＶＳ）を含み、ＣＤＲＨ２は配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含み、ＣＤＲＨ３は配列番号３７（ＡＲＬＫＳＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含む。これらの態様および本明細書に記載の全てのそのような態様の一部の実施形態では、ＣＤＲＨ１は配列番号３６（ＧＰＦＲＳＨＡＶＳ）を含み、ＣＤＲＨ２は配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含み、ＣＤＲＨ３は配列番号３７（ＡＲＬＫＳＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含み、ＣＤＲＬ１は配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含み、ＣＤＲＬ２は配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含み、ＣＤＲＬ３は配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含む。そのような重鎖および軽鎖可変ＣＤＲ領域を有する代表的な抗体はｍＡｂ２１である。
これらの態様および本明細書に記載の全てのそのような態様の一部の実施形態では、ＣＤＲＨ１は配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、ＣＤＲＨ２は配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含み、ＣＤＲＨ３は配列番号８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含み、ＣＤＲＬ１は配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含み、ＣＤＲＬ２は配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含み、ＣＤＲＬ３は配列番号３８（ＦＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含む。そのような重鎖および軽鎖可変ＣＤＲ領域を有する代表的な抗体はｍＡｂ２２である。
これらの態様および本明細書に記載の全てのそのような態様の一部の実施形態では、ＣＤＲＨ１は配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、ＣＤＲＨ２は配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含み、ＣＤＲＨ３は配列番号８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含み、ＣＤＲＬ１は配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含み、ＣＤＲＬ２は配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含み、ＣＤＲＬ３は配列番号３９（ＱＱＳＹＳＴＩＬＴ）を含む。そのような重鎖および軽鎖可変ＣＤＲ領域を有する代表的な抗体はｍＡｂ２３である。
これらの態様および本明細書に記載の全てのそのような態様の一部の実施形態では、ＣＤＲＨ１は配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、ＣＤＲＨ２は配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含み、ＣＤＲＨ３は配列番号８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含み、ＣＤＲＬ１は配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含み、ＣＤＲＬ２は配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含み、ＣＤＲＬ３は配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含む。そのような重鎖および軽鎖可変ＣＤＲ領域を有する代表的な抗体はｍＡｂ２４である。
各場合において、特定の配列が言及される場合、言及される配列（例えば、配列番号１～３４および３６～３９）に対して少なくとも９０％の同一性（例えば、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一）を有する配列を含む実施形態もまた提供される。
本開示はまた、一部の態様では、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分であって、配列番号３５、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、または５８に対して少なくとも９０％同一（例えば、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号５９、６０、６１、６２、または６３に対して少なくとも９０％同一（例えば、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、抗体またはその抗原結合性部分を提供する。
本開示はまた、一部の態様では、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分であって、配列番号４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、または５８に対して少なくとも９０％同一（例えば、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号５９に対して少なくとも９０％同一（例えば、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、抗体またはその抗原結合性部分を提供する。
本開示はまた、一部の態様では、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分であって、配列番号３５に対して少なくとも９０％同一（例えば、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号５９、６０、６１、６２、または６３に対して少なくとも９０％同一（例えば、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、抗体またはその抗原結合性部分を提供する。
抗体ｍＡｂ１～ｍＡｂ２３は、実施例に記載されるように、親抗体ｍＡｂ２４に由来する親和性成熟抗体である。親和性成熟抗体またはその抗原結合性部分は、（例えば、１つまたは複数のＣＤＲまたはＦＲ中の）１つまたは複数の変更を欠いた親抗体と比較して、その抗原に対する抗体の親和性における向上を結果としてもたらす該変更を有する抗体または抗原結合性断片である。一部の実施形態では、親和性成熟抗体は、ＰＤ－Ｌ１に対してナノモル濃度またはピコモル濃度の親和性を有する。一部の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合性部分は、少なくとも１×１０－７Ｍ、少なくとも１×１０－８Ｍ、少なくとも１×１０－９Ｍ、少なくとも１×１０－１０Ｍ、少なくとも１×１０－１１Ｍ、少なくとも１×１０－１２Ｍ、または少なくとも１×１０－１３ＭのＫＤを有する。
表１は、ヒトＰＤ－Ｌ１に対するｍＡｂ１、ｍＡｂ２、ｍＡｂ３、ｍＡｂ４、ｍＡｂ５、ｍＡｂ６、ｍＡｂ７、ｍＡｂ８、ｍＡｂ９、ｍＡｂ１０、ｍＡｂ１１、ｍＡｂ１２、ｍＡｂ１３、ｍＡｂ１４、ｍＡｂ１５、ｍＡｂ１６、ｍＡｂ１７、ｍＡｂ１８、ｍＡｂ１９、ｍＡｂ２０、ｍＡｂ２１、ｍＡｂ２２、およびｍＡｂ２３（すなわち、ｍＡｂ２４の親和性成熟バリアント）の結合親和性（ＫＤ）を示す。用語ＫＤは、本明細書において使用される場合、具体的な抗体－抗原相互作用の解離平衡定数を指す。ＫＤ＝ｋｄ／ｋａ。用語ｋｄ（秒－１）は、本明細書において使用される場合、具体的な抗体－抗原相互作用の解離速度定数を指す。値はｋｏｆｆ値とも称される。用語ｋａ（Ｍ－１×秒－１）は、本明細書において使用される場合、具体的な抗体－抗原相互作用の会合速度定数を指す。値はｋｏｎ値とも称される。
Figure 2022507253000002
表２は、ヒトＰＤ－Ｌ１（「ｈｕＰＤＬ１」）、カニクイザルＰＤ－Ｌ１、またはマウスＰＤ－Ｌ１（「ｍｕＰＤＬ１」）に対するｍＡｂ１、ｍＡｂ２、ｍＡｂ３、ｍＡｂ４、ｍＡｂ５、ｍＡｂ６、ｍＡｂ７、ｍＡｂ８、ｍＡｂ９、ｍＡｂ１０、ｍＡｂ１１、ｍＡｂ１２、ｍＡｂ１３、ｍＡｂ１４、ｍＡｂ１５、ｍＡｂ１６、ｍＡｂ１７、ｍＡｂ１８、ｍＡｂ１９、ｍＡｂ２０、ｍＡｂ２１、ｍＡｂ２２、およびｍＡｂ２３（すなわち、ｍＡｂ２４の親和性成熟バリアント）についての細胞結合データを提供する。ヒトまたはカニクイザルＰＤ－Ｌ１をＨＥＫ細胞上に発現させ、マウスＰＤ－Ｌ１をＡ２０細胞上に発現させた。結合はＥＣ５０値として表現され、これは、目的の抗原を外因的に発現する細胞上の異なる濃度のｍＡｂを滴定することから推定することができる。蛍光タグ付加二次物（ｓｅｃｏｎｄａｒｉｅｓ）を使用してｍＡｂ結合を検出および定量化することができる。表２に示されるデータをＧＲＡＰＨＰＡＤ中のビルトイン機能を使用して１：１結合モデルにフィッティングしてＥＣ５０値を得た。
Figure 2022507253000003
本開示はまた、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分であって、配列番号３５、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、または５８のいずれか１つに対して少なくとも９０％同一（例えば、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号５９、６０、６１、６２、または６３のいずれか１つに対して少なくとも９０％同一（例えば、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、抗体またはその抗原結合性部分を提供する。一部の実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号３５、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、または５８のいずれか１つから１５アミノ酸もしくはそれ未満、１４アミノ酸もしくはそれ未満、１３アミノ酸もしくはそれ未満、１２アミノ酸もしくはそれ未満、１１アミノ酸もしくはそれ未満、１０アミノ酸もしくはそれ未満、９アミノ酸もしくはそれ未満、８アミノ酸もしくはそれ未満、７アミノ酸もしくはそれ未満、６アミノ酸もしくはそれ未満、５アミノ酸もしくはそれ未満、４アミノ酸もしくはそれ未満、３アミノ酸もしくはそれ未満、２アミノ酸もしくはそれ未満、または１アミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号５９、６０、６１、６２、または６３のいずれか１つから１５アミノ酸もしくはそれ未満、１４アミノ酸もしくはそれ未満、１３アミノ酸もしくはそれ未満、１２アミノ酸もしくはそれ未満、１１アミノ酸もしくはそれ未満、１０アミノ酸もしくはそれ未満、９アミノ酸もしくはそれ未満、８アミノ酸もしくはそれ未満、７アミノ酸もしくはそれ未満、６アミノ酸もしくはそれ未満、５アミノ酸もしくはそれ未満、４アミノ酸もしくはそれ未満、３アミノ酸もしくはそれ未満、２アミノ酸もしくはそれ未満、または１アミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を含む。表３および表４は、配列番号３５および４０～５８の重鎖可変配列、および配列番号５９～６３の軽鎖可変配列の配列をそれぞれ提供する。
Figure 2022507253000004
Figure 2022507253000005
本開示はまた、一部の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分であって、配列番号３５、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、または５８の重鎖可変領域のいずれかの重鎖ＣＤＲ、および配列番号５９、６０、６１、６２、または６３の軽鎖可変領域のいずれかの軽鎖ＣＤＲを含む、抗体またはその抗原結合性部分を提供する。
本開示はまた、一部の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分であって、配列番号３５、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、または５８の重鎖可変領域のいずれかの重鎖ＣＤＲ、および配列番号５９、６０、６１、６２、または６３の軽鎖可変領域のいずれかの軽鎖ＣＤＲを含み、重鎖および軽鎖ＣＤＲ残基がカバット（Ｋａｂａｔ）に従って番号付けされたものである、抗体またはその抗原結合性部分を提供する。
本開示はまた、一部の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分であって、配列番号３５、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、または５８の重鎖可変領域のいずれかの重鎖ＣＤＲ、および配列番号５９、６０、６１、６２、または６３の軽鎖可変領域のいずれかの軽鎖ＣＤＲを含み、重鎖および軽鎖ＣＤＲ残基がコチア（Ｃｈｏｔｈｉａ）に従って番号付けされたものである、抗体またはその抗原結合性部分を提供する。
本開示はまた、一部の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分であって、配列番号３５、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、または５８の重鎖可変領域のいずれかの重鎖ＣＤＲ、および配列番号５９、６０、６１、６２、または６３の軽鎖可変領域のいずれかの軽鎖ＣＤＲを含み、重鎖および軽鎖ＣＤＲ残基がマッカラム（ＭａｃＣａｌｌｕｍ）に従って番号付けされたものである、抗体またはその抗原結合性部分を提供する。
本開示はまた、一部の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分であって、配列番号３５、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、または５８の重鎖可変領域のいずれかの重鎖ＣＤＲ、および配列番号５９、６０、６１、６２、または６３の軽鎖可変領域のいずれかの軽鎖ＣＤＲを含み、重鎖および軽鎖ＣＤＲ残基がＡｂＭに従って番号付けされたものである、抗体またはその抗原結合性部分を提供する。
本開示はまた、一部の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分であって、配列番号３５、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、または５８の重鎖可変領域のいずれかの重鎖ＣＤＲ、および配列番号５９、６０、６１、６２、または６３の軽鎖可変領域のいずれかの軽鎖ＣＤＲを含み、重鎖および軽鎖ＣＤＲ残基がＩＭＧＴに従って番号付けされたものである、抗体またはその抗原結合性部分を提供する。
Ｂ．ＰＤ－１アンタゴニスト
一部の態様および実施形態では、本開示は抗ＰＤ－１アンタゴニストを提供する。一部の実施形態では、抗ＰＤ－１アンタゴニストは、本明細書に開示される任意の抗ＰＤ－１抗体または抗原結合性分子である。一部の実施形態では、抗ＰＤ－１抗体または抗原結合性分子は多重特異性抗原結合性構築物の一部分ではなく、すなわち、抗ＰＤ－１抗体または抗原結合性分子は、複数のエピトープに結合するタンパク質構築物の一部分ではない。一部の実施形態では、抗ＰＤ－１抗体または抗原結合性部分を異なる抗体または抗原結合性部分と組み合わせて、多重特異性抗原結合性構築物を形成させることができる。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物はＰＤ－１上のエピトープおよび別のタンパク質上のエピトープに結合することができる。一部の実施形態では、他のタンパク質上のエピトープはＰＤ－Ｌ１上にある。
一部の実施形態では、本明細書に開示される任意の多重特異性抗原結合性構築物はＰＤ－１アンタゴニストを含む。一部の実施形態では、ＰＤ－１アンタゴニストは「阻害受容体」である。本明細書において使用される場合、「阻害受容体」は、コグネイトリガンドにより結合された場合に免疫応答の抑制または阻害を引き起こす免疫チェックポイント分子を一般に差し、例えば、腫瘍逃避を増進することが公知のものである。しかしながら、一部の事例では、本明細書において使用される場合、「阻害受容体」はＰＤ－１を特に指す。
ＰＤ－１は、アミノ酸（Ｓ／Ｉ／Ｖ／Ｌ）ｘＹｘｘ（Ｉ／Ｖ／Ｌ）（ｘは任意のアミノ酸である）の保存された配列を含む「免疫受容体チロシン阻害モチーフ」または「ＩＴＩＭ」を含有する免疫チェックポイント阻害受容体である。ＰＤ－１活性が阻害されたかどうかをアッセイする方法は当該技術分野において公知であり、当業者により容易に設計され得る。そのようなアッセイは、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでＰＤ－１の任意の下流のシグナル伝達経路の効果を試験する工程を含む。ＰＤ－１がそのリガンドと相互作用した後に、ＩＴＩＭモチーフは酵素、例えばＳｒｃキナーゼファミリーの酵素によりリン酸化されて、他の酵素、例えば、ホスホチロシンホスファターゼＳＨＰ－１およびＳＨＰ－２、またはＳＨＩＰと呼ばれるイノシトール－ホスファターゼをリクルートすることが可能となる。これらのホスファターゼは、細胞シグナル伝達に関与する分子の活性化を減少させることが示されている。例えば、バロウ（Ｂａｒｒｏｗ）およびトロウスデール（Ｔｒｏｗｓｄａｌｅ）（２００６） Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３６（７）： １６４６－５３を参照。そのため、当該技術分野において公知の方法を使用してＰＤ－１内のＩＴＩＭモチーフのリン酸化状態をアセスメントすることができる。また、ホスホチロシンホスファターゼなどの下流の因子の存在もまた調べることができる。さらに、ＰＤ－１活性状態の代理として下流の因子（例えば、ＰＤ－１阻害の度合としての活性化Ｔ細胞核因子－ＮＦＡＴ）の存在を検出する様々な細胞ベースのアッセイおよびキットが当該技術分野において公知である。他の例では、単純な結合アッセイを使用して、上記に議論されるように、本開示の構築物が結合性ＰＤ－１およびそのリガンドを遮断できるかどうかを決定することができる。
よって、一部の態様では、ＰＤ－１に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分が本明細書において提供される。一部の態様では、ＰＤ－１に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分は、（ａ）（ｉ）配列番号７０（ＦＴＦＸ１Ｘ２ＹＡＸ３Ｘ４であり、Ｘ１＝Ｓ、Ｒ、Ｇ、またはＮであり、Ｘ２＝Ｄ、Ｓ、Ｎ、Ａ、Ｒ、またはＧであり、Ｘ３＝ＭまたはＬであり、Ｘ４＝Ｓ、Ｌ、またはＮである）を含むＣＤＲＨ１、（ｉｉ）配列番号７１（ＳＡＩＳＮＳＧＴＹＴＹＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、および（ｉｉｉ）配列番号７２（ＡＲＧＬＤＦＩＶＧＸ５ＴＧＮＤＹであり、Ｘ５＝Ａ、Ｙ、またはＲである）を含むＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域、ならびに（ｂ）（ｉ）配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含むＣＤＲＬ１、（ｉｉ）配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含むＣＤＲＬ２、および（ｉｉｉ）配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含むＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含む。
これらの態様および本明細書に記載の全てのそのような態様の一部の実施形態では、ＣＤＲＨ１は配列番号７３（ＦＴＦＳＤＹＡＭＳ）を含み、ＣＤＲＨ２は配列番号７１（ＳＡＩＳＮＳＧＴＹＴＹＹＡ）を含み、ＣＤＲＨ３は配列番号７４（ＡＲＧＬＤＦＩＶＧＡＴＧＮＤＹ）を含む。これらの態様および本明細書に記載の全てのそのような態様の一部の実施形態では、ＣＤＲＨ１は配列番号７３（ＦＴＦＳＤＹＡＭＳ）を含み、ＣＤＲＨ２は配列番号７１（ＳＡＩＳＮＳＧＴＹＴＹＹＡ）を含み、ＣＤＲＨ３は配列番号７４（ＡＲＧＬＤＦＩＶＧＡＴＧＮＤＹ）を含み、ＣＤＲＬ１は配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含み、ＣＤＲＬ２は配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含み、ＣＤＲＬ３は配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含む。そのような重鎖および軽鎖可変ＣＤＲ領域を有する代表的な抗体はｍＡｂ２５である。
これらの態様および本明細書に記載の全てのそのような態様の一部の実施形態では、ＣＤＲＨ１は配列番号７３（ＦＴＦＳＤＹＡＭＳ）を含み、ＣＤＲＨ２は配列番号７１（ＳＡＩＳＮＳＧＴＹＴＹＹＡ）を含み、ＣＤＲＨ３は配列番号７５（ＡＲＧＬＤＦＩＶＧＹＴＧＮＤＹ）を含む。これらの態様および本明細書に記載の全てのそのような態様の一部の実施形態では、ＣＤＲＨ１は配列番号７３（ＦＴＦＳＤＹＡＭＳ）を含み、ＣＤＲＨ２は配列番号７１（ＳＡＩＳＮＳＧＴＹＴＹＹＡ）を含み、ＣＤＲＨ３は配列番号７５（ＡＲＧＬＤＦＩＶＧＹＴＧＮＤＹ）を含み、ＣＤＲＬ１は配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含み、ＣＤＲＬ２は配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含み、ＣＤＲＬ３は配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含む。そのような重鎖および軽鎖可変ＣＤＲ領域を有する代表的な抗体はｍＡｂ２６である。
これらの態様および本明細書に記載の全てのそのような態様の一部の実施形態では、ＣＤＲＨ１は配列番号７６（ＦＴＦＳＳＹＡＭＳ）を含み、ＣＤＲＨ２は配列番号７１（ＳＡＩＳＮＳＧＴＹＴＹＹＡ）を含み、ＣＤＲＨ３は配列番号７５（ＡＲＧＬＤＦＩＶＧＹＴＧＮＤＹ）を含む。これらの態様および本明細書に記載の全てのそのような態様の一部の実施形態では、ＣＤＲＨ１は配列番号７６（ＦＴＦＳＳＹＡＭＳ）を含み、ＣＤＲＨ２は配列番号７１（ＳＡＩＳＮＳＧＴＹＴＹＹＡ）を含み、ＣＤＲＨ３は配列番号７５（ＡＲＧＬＤＦＩＶＧＹＴＧＮＤＹ）を含み、ＣＤＲＬ１は配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含み、ＣＤＲＬ２は配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含み、ＣＤＲＬ３は配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含む。そのような重鎖および軽鎖可変ＣＤＲ領域を有する代表的な抗体はｍＡｂ２７である。
これらの態様および本明細書に記載の全てのそのような態様の一部の実施形態では、ＣＤＲＨ１は配列番号７７（ＦＴＦＳＳＹＡＭＬ）を含み、ＣＤＲＨ２は配列番号７１（ＳＡＩＳＮＳＧＴＹＴＹＹＡ）を含み、ＣＤＲＨ３は配列番号７５（ＡＲＧＬＤＦＩＶＧＹＴＧＮＤＹ）を含む。これらの態様および本明細書に記載の全てのそのような態様の一部の実施形態では、ＣＤＲＨ１は配列番号７７（ＦＴＦＳＳＹＡＭＬ）を含み、ＣＤＲＨ２は配列番号７１（ＳＡＩＳＮＳＧＴＹＴＹＹＡ）を含み、ＣＤＲＨ３は配列番号７５（ＡＲＧＬＤＦＩＶＧＹＴＧＮＤＹ）を含み、ＣＤＲＬ１は配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含み、ＣＤＲＬ２は配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含み、ＣＤＲＬ３は配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含む。そのような重鎖および軽鎖可変ＣＤＲ領域を有する代表的な抗体はｍＡｂ２８である。
これらの態様および本明細書に記載の全てのそのような態様の一部の実施形態では、ＣＤＲＨ１は配列番号７８（ＦＴＦＳＮＹＡＬＳ）を含み、ＣＤＲＨ２は配列番号７１（ＳＡＩＳＮＳＧＴＹＴＹＹＡ）を含み、ＣＤＲＨ３は配列番号７５（ＡＲＧＬＤＦＩＶＧＹＴＧＮＤＹ）を含む。これらの態様および本明細書に記載の全てのそのような態様の一部の実施形態では、ＣＤＲＨ１は配列番号７８（ＦＴＦＳＮＹＡＬＳ）を含み、ＣＤＲＨ２は配列番号７１（ＳＡＩＳＮＳＧＴＹＴＹＹＡ）を含み、ＣＤＲＨ３は配列番号７５（ＡＲＧＬＤＦＩＶＧＹＴＧＮＤＹ）を含み、ＣＤＲＬ１は配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含み、ＣＤＲＬ２は配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含み、ＣＤＲＬ３は配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含む。そのような重鎖および軽鎖可変ＣＤＲ領域を有する代表的な抗体はｍＡｂ２９である。
これらの態様および本明細書に記載の全てのそのような態様の一部の実施形態では、ＣＤＲＨ１は配列番号７９（ＦＴＦＳＡＹＡＭＮ）を含み、ＣＤＲＨ２は配列番号７１（ＳＡＩＳＮＳＧＴＹＴＹＹＡ）を含み、ＣＤＲＨ３は配列番号７５（ＡＲＧＬＤＦＩＶＧＹＴＧＮＤＹ）を含む。これらの態様および本明細書に記載の全てのそのような態様の一部の実施形態では、ＣＤＲＨ１は配列番号７９（ＦＴＦＳＡＹＡＭＮ）を含み、ＣＤＲＨ２は配列番号７１（ＳＡＩＳＮＳＧＴＹＴＹＹＡ）を含み、ＣＤＲＨ３は配列番号７５（ＡＲＧＬＤＦＩＶＧＹＴＧＮＤＹ）を含み、ＣＤＲＬ１は配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含み、ＣＤＲＬ２は配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含み、ＣＤＲＬ３は配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含む。そのような重鎖および軽鎖可変ＣＤＲ領域を有する代表的な抗体はｍＡｂ３０である。
これらの態様および本明細書に記載の全てのそのような態様の一部の実施形態では、ＣＤＲＨ１は配列番号８０（ＦＴＦＲＳＹＡＭＳ）を含み、ＣＤＲＨ２は配列番号７１（ＳＡＩＳＮＳＧＴＹＴＹＹＡ）を含み、ＣＤＲＨ３は配列番号７５（ＡＲＧＬＤＦＩＶＧＹＴＧＮＤＹ）を含む。これらの態様および本明細書に記載の全てのそのような態様の一部の実施形態では、ＣＤＲＨ１は配列番号８０（ＦＴＦＲＳＹＡＭＳ）を含み、ＣＤＲＨ２は配列番号７１（ＳＡＩＳＮＳＧＴＹＴＹＹＡ）を含み、ＣＤＲＨ３は配列番号７５（ＡＲＧＬＤＦＩＶＧＹＴＧＮＤＹ）を含み、ＣＤＲＬ１は配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含み、ＣＤＲＬ２は配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含み、ＣＤＲＬ３は配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含む。そのような重鎖および軽鎖可変ＣＤＲ領域を有する代表的な抗体はｍＡｂ３１である。
これらの態様および本明細書に記載の全てのそのような態様の一部の実施形態では、ＣＤＲＨ１は配列番号８１（ＦＴＦＧＲＹＡＭＳ）を含み、ＣＤＲＨ２は配列番号７１（ＳＡＩＳＮＳＧＴＹＴＹＹＡ）を含み、ＣＤＲＨ３は配列番号７５（ＡＲＧＬＤＦＩＶＧＹＴＧＮＤＹ）を含む。これらの態様および本明細書に記載の全てのそのような態様の一部の実施形態では、ＣＤＲＨ１は配列番号８１（ＦＴＦＧＲＹＡＭＳ）を含み、ＣＤＲＨ２は配列番号７１（ＳＡＩＳＮＳＧＴＹＴＹＹＡ）を含み、ＣＤＲＨ３は配列番号７５（ＡＲＧＬＤＦＩＶＧＹＴＧＮＤＹ）を含み、ＣＤＲＬ１は配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含み、ＣＤＲＬ２は配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含み、ＣＤＲＬ３は配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含む。そのような重鎖および軽鎖可変ＣＤＲ領域を有する代表的な抗体はｍＡｂ３２である。
これらの態様および本明細書に記載の全てのそのような態様の一部の実施形態では、ＣＤＲＨ１は配列番号８２（ＦＴＦＮＳＹＡＭＳ）を含み、ＣＤＲＨ２は配列番号７１（ＳＡＩＳＮＳＧＴＹＴＹＹＡ）を含み、ＣＤＲＨ３は配列番号７５（ＡＲＧＬＤＦＩＶＧＹＴＧＮＤＹ）を含む。これらの態様および本明細書に記載の全てのそのような態様の一部の実施形態では、ＣＤＲＨ１は配列番号８２（ＦＴＦＮＳＹＡＭＳ）を含み、ＣＤＲＨ２は配列番号７１（ＳＡＩＳＮＳＧＴＹＴＹＹＡ）を含み、ＣＤＲＨ３は配列番号７５（ＡＲＧＬＤＦＩＶＧＹＴＧＮＤＹ）を含み、ＣＤＲＬ１は配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含み、ＣＤＲＬ２は配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含み、ＣＤＲＬ３は配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含む。そのような重鎖および軽鎖可変ＣＤＲ領域を有する代表的な抗体はｍＡｂ３３である。
これらの態様および本明細書に記載の全てのそのような態様の一部の実施形態では、ＣＤＲＨ１は配列番号８３（ＦＴＦＳＮＹＡＭＳ）を含み、ＣＤＲＨ２は配列番号７１（ＳＡＩＳＮＳＧＴＹＴＹＹＡ）を含み、ＣＤＲＨ３は配列番号７４（ＡＲＧＬＤＦＩＶＧＡＴＧＮＤＹ）を含む。これらの態様および本明細書に記載の全てのそのような態様の一部の実施形態では、ＣＤＲＨ１は配列番号８３（ＦＴＦＳＮＹＡＭＳ）を含み、ＣＤＲＨ２は配列番号７１（ＳＡＩＳＮＳＧＴＹＴＹＹＡ）を含み、ＣＤＲＨ３は配列番号７４（ＡＲＧＬＤＦＩＶＧＡＴＧＮＤＹ）を含み、ＣＤＲＬ１は配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含み、ＣＤＲＬ２は配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含み、ＣＤＲＬ３は配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含む。そのような重鎖および軽鎖可変ＣＤＲ領域を有する代表的な抗体はｍＡｂ３４である。
これらの態様および本明細書に記載の全てのそのような態様の一部の実施形態では、ＣＤＲＨ１は配列番号８４（ＦＴＦＳＧＹＡＭＳ）を含み、ＣＤＲＨ２は配列番号７１（ＳＡＩＳＮＳＧＴＹＴＹＹＡ）を含み、ＣＤＲＨ３は配列番号８５（ＡＲＧＬＤＦＩＶＧＲＴＧＮＤＹ）を含む。これらの態様および本明細書に記載の全てのそのような態様の一部の実施形態では、ＣＤＲＨ１は配列番号８４（ＦＴＦＳＧＹＡＭＳ）を含み、ＣＤＲＨ２は配列番号７１（ＳＡＩＳＮＳＧＴＹＴＹＹＡ）を含み、ＣＤＲＨ３は配列番号８５（ＡＲＧＬＤＦＩＶＧＲＴＧＮＤＹ）を含み、ＣＤＲＬ１は配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含み、ＣＤＲＬ２は配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含み、ＣＤＲＬ３は配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含む。そのような重鎖および軽鎖可変ＣＤＲ領域を有する代表的な抗体はｍＡｂ３５である。
これらの態様および本明細書に記載の全てのそのような態様の一部の実施形態では、ＣＤＲＨ１は配列番号８６（ＦＴＦＳＳＹＡＭＮ）を含み、ＣＤＲＨ２は配列番号７１（ＳＡＩＳＮＳＧＴＹＴＹＹＡ）を含み、ＣＤＲＨ３は配列番号８５（ＡＲＧＬＤＦＩＶＧＲＴＧＮＤＹ）を含む。これらの態様および本明細書に記載の全てのそのような態様の一部の実施形態では、ＣＤＲＨ１は配列番号８６（ＦＴＦＳＳＹＡＭＮ）を含み、ＣＤＲＨ２は配列番号７１（ＳＡＩＳＮＳＧＴＹＴＹＹＡ）を含み、ＣＤＲＨ３は配列番号８５（ＡＲＧＬＤＦＩＶＧＲＴＧＮＤＹ）を含み、ＣＤＲＬ１は配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含み、ＣＤＲＬ２は配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含み、ＣＤＲＬ３は配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含む。そのような重鎖および軽鎖可変ＣＤＲ領域を有する代表的な抗体はｍＡｂ３６である。
これらの態様および本明細書に記載の全てのそのような態様の一部の実施形態では、ＣＤＲＨ１は配列番号８０（ＦＴＦＲＳＹＡＭＳ）を含み、ＣＤＲＨ２は配列番号７１（ＳＡＩＳＮＳＧＴＹＴＹＹＡ）を含み、ＣＤＲＨ３は配列番号８５（ＡＲＧＬＤＦＩＶＧＲＴＧＮＤＹ）を含む。これらの態様および本明細書に記載の全てのそのような態様の一部の実施形態では、ＣＤＲＨ１は配列番号８０（ＦＴＦＲＳＹＡＭＳ）を含み、ＣＤＲＨ２は配列番号７１（ＳＡＩＳＮＳＧＴＹＴＹＹＡ）を含み、ＣＤＲＨ３は配列番号８５（ＡＲＧＬＤＦＩＶＧＲＴＧＮＤＹ）を含み、ＣＤＲＬ１は配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含み、ＣＤＲＬ２は配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含み、ＣＤＲＬ３は配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含む。そのような重鎖および軽鎖可変ＣＤＲ領域を有する代表的な抗体はｍＡｂ３７である。
各場合において、特定の配列が言及される場合、言及される配列（例えば、配列番号５、９、１０、または７１～８６）に対して少なくとも８５％の同一性（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一）を有する配列を含む実施形態もまた提供される。
本開示はまた、一部の態様では、ＰＤ－１に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分であって、配列番号８７～９９のいずれか１つに対して少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号５９に対して少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、抗体またはその抗原結合性部分を提供する。一部の実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号９０に対して少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一）のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域は、配列番号５９に対して少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一）のアミノ酸配列を含む。表７は配列番号８７～９９の重鎖可変配列、表４は配列番号５９の軽鎖可変配列の配列をそれぞれ提供する。一部の実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号８７～９９のいずれか１つから１５アミノ酸もしくはそれ未満、１４アミノ酸もしくはそれ未満、１３アミノ酸もしくはそれ未満、１２アミノ酸もしくはそれ未満、１１アミノ酸もしくはそれ未満、１０アミノ酸もしくはそれ未満、９アミノ酸もしくはそれ未満、８アミノ酸もしくはそれ未満、７アミノ酸もしくはそれ未満、６アミノ酸もしくはそれ未満、５アミノ酸もしくはそれ未満、４アミノ酸もしくはそれ未満、３アミノ酸もしくはそれ未満、２アミノ酸もしくはそれ未満、または１アミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号５９から１５アミノ酸もしくはそれ未満、１４アミノ酸もしくはそれ未満、１３アミノ酸もしくはそれ未満、１２アミノ酸もしくはそれ未満、１１アミノ酸もしくはそれ未満、１０アミノ酸もしくはそれ未満、９アミノ酸もしくはそれ未満、８アミノ酸もしくはそれ未満、７アミノ酸もしくはそれ未満、６アミノ酸もしくはそれ未満、５アミノ酸もしくはそれ未満、４アミノ酸もしくはそれ未満、３アミノ酸もしくはそれ未満、２アミノ酸もしくはそれ未満、または１アミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を含む。
抗体ｍＡｂ２６～ｍＡｂ３７は、実施例に記載されるように、親抗体ｍＡｂ２５に由来する親和性成熟抗体である。親和性成熟抗体またはその抗原結合性部分は、（例えば、１つまたは複数のＣＤＲまたはＦＲ中の）１つまたは複数の変更を欠いた親抗体と比較して、その抗原に対する抗体の親和性における向上を結果としてもたらす該変更を有する抗体または抗原結合性断片である。一部の実施形態では、親和性成熟抗体は、ＰＤ－１に対してナノモル濃度またはピコモル濃度の親和性を有する。一部の実施形態では、ＰＤ－１抗体またはその抗原結合性部分は、少なくとも１×１０－７Ｍ、少なくとも１×１０－８Ｍ、少なくとも１×１０－９Ｍ、少なくとも１×１０－１０Ｍ、少なくとも１×１０－１１Ｍ、少なくとも１×１０－１２Ｍ、または少なくとも１×１０－１３ＭのＫＤを有する。
表５および表６は、ヒトＰＤ－１（「ｈｕＰＤ－１」）、カニクイザルＰＤ－１（「ｃｙＰＤ－１」）、またはマウスＰＤ－１（「ｍｕＰＤ－１」）に対するｍＡｂ２５、ｍＡｂ２６、ｍＡｂ２７、ｍＡｂ２８、ｍＡｂ２９、ｍＡｂ３０、ｍＡｂ３１、ｍＡｂ３２、ｍＡｂ３３、ｍＡｂ３４、ｍＡｂ３５、ｍＡｂ３６、およびｍＡｂ３７（すなわち、ｍＡｂ２５の親和性成熟バリアント）についての細胞結合データを提供する。ヒト、カニクイザル、またはマウスＰＤ－１をＣＨＯ細胞上に発現させた。結合はＥＣ５０値として表現され、これは、目的の抗原を外因的に発現する細胞上の異なる濃度のｍＡｂを滴定することから推定することができる。蛍光タグ付加二次物を使用してｍＡｂ結合を検出および定量化することができる。表５に示されるデータをＧＲＡＰＨＰＡＤ中のビルトイン機能を使用して１：１結合モデルにフィッティングしてＥＣ５０値を得た。
Figure 2022507253000006
Figure 2022507253000007
Figure 2022507253000008
本開示はまた、一部の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分であって、配列番号８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９の重鎖可変領域のいずれかの重鎖ＣＤＲ、および配列番号５９の軽鎖可変領域の軽鎖ＣＤＲを含む、抗体またはその抗原結合性部分を提供する。
本開示はまた、一部の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分であって、配列番号８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９の重鎖可変領域のいずれかの重鎖ＣＤＲ、および配列番号５９の軽鎖可変領域の軽鎖ＣＤＲを含み、重鎖および軽鎖ＣＤＲ残基がカバットに従って番号付けされたものである、抗体またはその抗原結合性部分を提供する。
本開示はまた、一部の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分であって、配列番号８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９の重鎖可変領域のいずれかの重鎖ＣＤＲ、および配列番号５９の軽鎖可変領域の軽鎖ＣＤＲを含み、重鎖および軽鎖ＣＤＲ残基がコチアに従って番号付けされたものである、抗体またはその抗原結合性部分を提供する。
本開示はまた、一部の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分であって、配列番号８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９の重鎖可変領域のいずれかの重鎖ＣＤＲ、および配列番号５９の軽鎖可変領域の軽鎖ＣＤＲを含み、重鎖および軽鎖ＣＤＲ残基がマッカラムに従って番号付けされたものである、抗体またはその抗原結合性部分を提供する。
本開示はまた、一部の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分であって、配列番号８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９の重鎖可変領域のいずれかの重鎖ＣＤＲ、および配列番号５９の軽鎖可変領域の軽鎖ＣＤＲを含み、重鎖および軽鎖ＣＤＲ残基がＡｂＭに従って番号付けされたものである、抗体またはその抗原結合性部分を提供する。
本開示はまた、一部の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分であって、配列番号８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９の重鎖可変領域のいずれかの重鎖ＣＤＲ、および配列番号５９の軽鎖可変領域の軽鎖ＣＤＲを含み、重鎖および軽鎖ＣＤＲ残基がＩＭＧＴに従って番号付けされたものである、抗体またはその抗原結合性部分を提供する。
Ｃ．多重特異性抗原結合性構築物
本開示は、一部の態様では、ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－１の間の相互作用、例えば、腫瘍細胞上に発現されたＰＤ－Ｌ１およびＴ細胞上に発現されたＰＤ－１の相互作用を阻害することにより腫瘍細胞に対する免疫応答を増進するための組成物および方法を提供する。ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－１に特異的または選択的に結合する抗体またはその抗原結合性部分が提供される。本明細書において使用される場合、ＰＤ－Ｌ１もしくはＰＤ－１、またはＰＤ－Ｌ１もしくはＰＤ－１上のエピトープに対して「特異的に結合する」、「特異的」、「選択的に結合する」および「選択的」という用語は、非特異的または非選択的な相互作用とは測定できる程度に異なる結合を意味する。一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合性部分は、ヒトＰＤ－Ｌ１もしくはＰＤ－１および／またはマウスＰＤ－Ｌ１もしくはＰＤ－１に特異的に結合する。特異的結合は、例えば、対照分子の結合と比較して分子の結合を決定することにより測定することができる。特異的結合はまた、過剰な非標識化標的などの、標的に類似した対照分子との競合により決定することができる。その場合、特異的結合は、標識化標的のプローブへの結合が過剰な非標識化標的により競合的に阻害される場合に指し示される。
一部の実施形態では、本明細書に開示される任意の多重特異性抗原結合性構築物は少なくとも２つの異なる受容体またはエピトープ（例えば、ＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１）に結合し、多重特異性抗原結合性構築物により結合される２つの異なる受容体またはエピトープは同じ細胞の表面上に発現されている。例えば、一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物はＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１に同時に結合し、ＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１は同じ細胞の表面上に発現されている。一部の実施形態では、本明細書に開示される任意の多重特異性抗原結合性構築物は少なくとも２つの異なる受容体またはエピトープ（例えば、ＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１）に結合し、多重特異性抗原結合性構築物により結合される２つの異なる受容体またはエピトープは２つの異なる細胞の表面上に発現されている。例えば、一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物は、第１の細胞の表面上に発現されたＰＤ－１および第２の細胞の表面上に発現されたＰＤ－Ｌ１に同時に結合する。
一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物はヒトＰＤ－１に結合することができる。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物はマウスＰＤ－１に結合することができる。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物はカニクイザルＰＤ－１に結合することができる。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物は、ヒト、マウス、およびカニクイザルＰＤ－１に類似した親和性で結合することができる。
一部の態様および実施形態では、本開示は、抗原結合の少なくとも２つの単位を含む多重特異性抗原結合性構築物であって、抗原結合の第１の単位がＰＤ－１に結合し、抗原結合の第２の単位がＰＤ－１リガンドに結合する、多重特異性抗原結合性構築物を提供する。一部の実施形態では、抗原結合の第１の単位は、免疫細胞により発現されたＰＤ－１に結合する。一部の実施形態では、抗原結合の第２の単位は、第２の細胞により発現されたＰＤ－１に結合する。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物はＰＤ－１およびＰＤ－１リガンド、例えば、ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２の相互作用を遮断する。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物はＰＤ－１およびＰＤ－１リガンド、例えば、ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２の相互作用を遮断する。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物は、ＰＤ－１に結合する抗原結合の少なくとも２つの単位を含む。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物は、ＰＤ－１に結合する抗原結合の２つの単位を含む。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物は、ＰＤ－１リガンド、例えば、ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２に結合する抗原結合の少なくとも２つの単位を含む。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物は、ＰＤ－１リガンド、例えば、ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２に結合する抗原結合の２つの単位を含む。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物は抗原結合の少なくとも４つの単位を含み、抗原結合の２つの単位はＰＤ－１に結合し、抗原結合の２つの単位はＰＤ－１リガンド、例えば、ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２に結合する。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物は抗原結合の４つの単位を含み、抗原結合の２つの単位はＰＤ－１に結合し、抗原結合の２つの単位はＰＤ－１リガンド、例えば、ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２に結合する。一部の実施形態では、抗原結合の各単位は、そのコグネイト抗原、すなわち、ＰＤ－１またはＰＤ－１リガンド、例えば、ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２に独立して結合することができる。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物は、細胞からのＰＤ－１発現の喪失を促進する。一部の実施形態では、ＰＤ－１発現の喪失はＰＤ－１シェディングに起因する。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物はＰＤ－１およびＰＤ－１リガンド、例えば、ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２の相互作用を遮断する。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物は共通の軽鎖を含む。例えば、抗原結合の少なくとも２つの単位は共通の軽鎖を含む。
一部の実施形態では、抗原結合の第１の単位はＰＤ－１に結合し、
（ａ）（ｉ）配列番号７０（ＦＴＦＸ１Ｘ２ＹＡＸ３Ｘ４であり、Ｘ１＝Ｓ、Ｒ、Ｇ、またはＮであり、Ｘ２＝Ｄ、Ｓ、Ｎ、Ａ、Ｒ、またはＧであり、Ｘ３＝ＭまたはＬであり、Ｘ４＝Ｓ、Ｌ、またはＮである）を含むＣＤＲＨ１、（ｉｉ）配列番号７１（ＳＡＩＳＮＳＧＴＹＴＹＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、および（ｉｉｉ）配列番号７２（ＡＲＧＬＤＦＩＶＧＸ５ＴＧＮＤＹであり、Ｘ５＝Ａ、Ｙ、またはＲである）を含むＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域、ならびに
（ｂ）（ｉ）配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含むＣＤＲＬ１、（ｉｉ）配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含むＣＤＲＬ２、および（ｉｉｉ）配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含むＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域
を含む。
一部のそのような実施形態では、抗原結合の第１の単位はＰＤ－１に結合し、
（ａ）配列番号７３（ＦＴＦＳＤＹＡＭＳ）を含むＣＤＲＨ１、配列番号７１（ＳＡＩＳＮＳＧＴＹＴＹＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、および配列番号７４（ＡＲＧＬＤＦＩＶＧＡＴＧＮＤＹ）を含むＣＤＲＨ３、
（ｂ）配列番号７３（ＦＴＦＳＤＹＡＭＳ）を含むＣＤＲＨ１、配列番号７１（ＳＡＩＳＮＳＧＴＹＴＹＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、および配列番号７５（ＡＲＧＬＤＦＩＶＧＹＴＧＮＤＹ）を含むＣＤＲＨ３、
（ｃ）配列番号７６（ＦＴＦＳＳＹＡＭＳ）を含むＣＤＲＨ１、配列番号７１（ＳＡＩＳＮＳＧＴＹＴＹＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、および配列番号７５（ＡＲＧＬＤＦＩＶＧＹＴＧＮＤＹ）を含むＣＤＲＨ３、
（ｄ）配列番号７７（ＦＴＦＳＳＹＡＭＬ）を含むＣＤＲＨ１、配列番号７１（ＳＡＩＳＮＳＧＴＹＴＹＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、および配列番号７５（ＡＲＧＬＤＦＩＶＧＹＴＧＮＤＹ）を含むＣＤＲＨ３、
（ｅ）配列番号７８（ＦＴＦＳＮＹＡＬＳ）を含むＣＤＲＨ１、配列番号７１（ＳＡＩＳＮＳＧＴＹＴＹＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、および配列番号７５（ＡＲＧＬＤＦＩＶＧＹＴＧＮＤＹ）を含むＣＤＲＨ３、
（ｆ）配列番号７９（ＦＴＦＳＡＹＡＭＮ）を含むＣＤＲＨ１、配列番号７１（ＳＡＩＳＮＳＧＴＹＴＹＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、および配列番号７５（ＡＲＧＬＤＦＩＶＧＹＴＧＮＤＹ）を含むＣＤＲＨ３、
（ｇ）配列番号８０（ＦＴＦＲＳＹＡＭＳ）を含むＣＤＲＨ１、配列番号７１（ＳＡＩＳＮＳＧＴＹＴＹＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、および配列番号７５（ＡＲＧＬＤＦＩＶＧＹＴＧＮＤＹ）を含むＣＤＲＨ３、
（ｈ）配列番号８１（ＦＴＦＧＲＹＡＭＳ）を含むＣＤＲＨ１、配列番号７１（ＳＡＩＳＮＳＧＴＹＴＹＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、および配列番号７５（ＡＲＧＬＤＦＩＶＧＹＴＧＮＤＹ）を含むＣＤＲＨ３、
（ｉ）配列番号８２（ＦＴＦＮＳＹＡＭＳ）を含むＣＤＲＨ１、配列番号７１（ＳＡＩＳＮＳＧＴＹＴＹＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、および配列番号７５（ＡＲＧＬＤＦＩＶＧＹＴＧＮＤＹ）を含むＣＤＲＨ３、
（ｊ）配列番号８３（ＦＴＦＳＮＹＡＭＳ）を含むＣＤＲＨ１、配列番号７１（ＳＡＩＳＮＳＧＴＹＴＹＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、および配列番号７４（ＡＲＧＬＤＦＩＶＧＡＴＧＮＤＹ）を含むＣＤＲＨ３、
（ｋ）配列番号８４（ＦＴＦＳＧＹＡＭＳ）を含むＣＤＲＨ１、配列番号７１（ＳＡＩＳＮＳＧＴＹＴＹＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、および配列番号８５（ＡＲＧＬＤＦＩＶＧＲＴＧＮＤＹ）を含むＣＤＲＨ３、
（ｌ）配列番号８６（ＦＴＦＳＳＹＡＭＮ）を含むＣＤＲＨ１、配列番号７１（ＳＡＩＳＮＳＧＴＹＴＹＹＡ）を含むＣＤＲＨ２および配列番号８５（ＡＲＧＬＤＦＩＶＧＲＴＧＮＤＹ）を含むＣＤＲＨ３、または
（ｍ）配列番号８０（ＦＴＦＲＳＹＡＭＳ）を含むＣＤＲＨ１、配列番号７１（ＳＡＩＳＮＳＧＴＹＴＹＹＡ）を含む、および配列番号８５（ＡＲＧＬＤＦＩＶＧＲＴＧＮＤＹ）を含むＣＤＲＨ３
を含む。
一部の実施形態では、抗原結合の第１の単位はＰＤ－１に結合し、
（ａ）配列番号８７に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
（ｂ）配列番号８８に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
（ｃ）配列番号８９に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
（ｄ）配列番号９０に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
（ｅ）配列番号９１に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
（ｆ）配列番号９２に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
（ｇ）配列番号９３に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
（ｈ）配列番号９４に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
（ｉ）配列番号９５に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
（ｊ）配列番号９６に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
（ｋ）配列番号９７に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
（ｌ）配列番号９８に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、または
（ｍ）配列番号９９に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域
を含む。
一部の実施形態では、抗原結合の第１の単位はＰＤ－１に結合し、配列番号５９に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
一部の実施形態では、抗原結合の第２の単位はＰＤ－Ｌ２に結合する。一部の実施形態では、抗原結合の第２の単位はＰＤ－Ｌ１に結合する。一部の実施形態では、抗原結合の第２の単位はＰＤ－Ｌ１に結合し、
ａ．（ｉ）配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含むＣＤＲＨ１、（ｉｉ）配列番号２（ＧＧＩＩＰＸ１Ｘ２ＧＸ３ＡＴＹＡであり、Ｘ１はＶまたはＩであり、Ｘ２はＦ、Ｌ、またはＶであり、Ｘ３はＴまたはＡである）を含むＣＤＲＨ２、および（ｉｉｉ）配列番号３（ＡＲＬＫＸ１ＥＬＫＤＡＦＤＩであり、Ｘ１はＧ、Ｆ、またはＮである）を含むＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域、ならびに
ｂ．（ｉ）配列番号４（ＲＡＳＱＸ１ＩＳＳＹＬＮであり、Ｘ１はＳ、Ｗ、またはＱである）を含むＣＤＲＬ１、（ｉｉ）配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含むＣＤＲＬ２、および（ｉｉｉ）配列番号６（Ｘ１ＱＳＹＳＴＰＬＴであり、Ｘ１はＱまたはＦである）を含むＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域
を含む。
一部のそのような実施形態では、抗原結合の第２の単位はＰＤ－Ｌ１に結合し、
（ａ）配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含むＣＤＲＨ１、配列番号７（ＧＧＩＩＰＩＬＧＡＡＴＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、および配列番号８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含むＣＤＲＨ３、
（ｂ）配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含むＣＤＲＨ１、配列番号７（ＧＧＩＩＰＩＬＧＡＡＴＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、配列番号８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含むＣＤＲＨ３、配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含むＣＤＲＬ１、配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含むＣＤＲＬ２、および配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含むＣＤＲＬ３、
（ｃ）配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含むＣＤＲＨ１、配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、配列番号８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含むＣＤＲＨ３、配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含むＣＤＲＬ１、配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含むＣＤＲＬ２、および配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含むＣＤＲＬ３、
（ｄ）配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含むＣＤＲＨ１、配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含むＣＤＲＨ２および配列番号８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含むＣＤＲＨ３、
（ｅ）配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含むＣＤＲＨ１、配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、配列番号８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含むＣＤＲＨ３、配列番号１２（ＲＡＳＱＷＩＳＳＹＬＮ）を含むＣＤＲＬ１、配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含むＣＤＲＬ２、および配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含むＣＤＲＬ３、
（ｆ）配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含むＣＤＲＨ１、配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、配列番号８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含むＣＤＲＨ３、配列番号１３（ＲＡＳＱＱＩＳＳＹＬＮ）を含むＣＤＲＬ１、配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含むＣＤＲＬ２、および配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含むＣＤＲＬ３、
（ｇ）配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含むＣＤＲＨ１、配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、配列番号８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含むＣＤＲＨ３、配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含むＣＤＲＬ１、配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含むＣＤＲＬ２、および配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含むＣＤＲＬ３、
（ｈ）配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含むＣＤＲＨ１、配列番号１５（ＧＧＩＩＰＩＦＧＩＡＮＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、および配列番号８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含むＣＤＲＨ３、
（ｉ）配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含むＣＤＲＨ１、配列番号１５（ＧＧＩＩＰＩＦＧＩＡＮＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、配列番号８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含むＣＤＲＨ３、配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含むＣＤＲＬ１、配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含むＣＤＲＬ２、および配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含むＣＤＲＬ３、
（ｊ）配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含むＣＤＲＨ１、配列番号１６（ＧＧＩＩＰＮＦＧＴＡＴＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、および配列番号１７（ＡＲＬＫＧＥＬＫＧＡＧＤＩ）を含むＣＤＲＨ３、
（ｋ）配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含むＣＤＲＨ１、配列番号１６（ＧＧＩＩＰＮＦＧＴＡＴＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、配列番号１７（ＡＲＬＫＧＥＬＫＧＡＧＤＩ）を含むＣＤＲＨ３、配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含むＣＤＲＬ１、配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含むＣＤＲＬ２、および配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含むＣＤＲＬ３、
（ｌ）配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含むＣＤＲＨ１、配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、および配列番号１８（ＡＲＬＫＦＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含むＣＤＲＨ３、
（ｍ）配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含むＣＤＲＨ１、配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、配列番号１８（ＡＲＬＫＦＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含むＣＤＲＨ３、配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含むＣＤＲＬ１、配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含むＣＤＲＬ２、および配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含むＣＤＲＬ３、
（ｎ）配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含むＣＤＲＨ１、配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、および配列番号１９（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＥ）を含むＣＤＲＨ３、
（ｏ）配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含むＣＤＲＨ１、配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、配列番号１９（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＥ）を含むＣＤＲＨ３、配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含むＣＤＲＬ１、配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含むＣＤＲＬ２、および配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含むＣＤＲＬ３、
（ｐ）配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含むＣＤＲＨ１、配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、および配列番号２０（ＡＲＬＫＮＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含むＣＤＲＨ３、
（ｑ）配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含むＣＤＲＨ１、配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、配列番号２０（ＡＲＬＫＮＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含むＣＤＲＨ３、配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含むＣＤＲＬ１、配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含むＣＤＲＬ２、および配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含むＣＤＲＬ３、
（ｒ）配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含むＣＤＲＨ１、配列番号２１（ＧＧＶＩＰＦＬＧＴＡＮＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、および配列番号２２（ＡＲＬＫＧＩＬＫＤＡＬＤＩ）を含むＣＤＲＨ３、
（ｓ）配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含むＣＤＲＨ１、配列番号２１（ＧＧＶＩＰＦＬＧＴＡＮＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、配列番号２２（ＡＲＬＫＧＩＬＫＤＡＬＤＩ）を含むＣＤＲＨ３、配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含むＣＤＲＬ１、配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含むＣＤＲＬ２、および配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含むＣＤＲＬ３、
（ｔ）配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含むＣＤＲＨ１、配列番号２９（ＧＲＩＩＰＩＦＧＴＡＤＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、および配列番号８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含むＣＤＲＨ３、
（ｕ）配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含むＣＤＲＨ１、配列番号２９（ＧＲＩＩＰＩＦＧＴＡＤＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、配列番号８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含むＣＤＲＨ３、配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含むＣＤＲＬ１、配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含むＣＤＲＬ２、および配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含むＣＤＲＬ３、
（ｖ）配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含むＣＤＲＨ１、配列番号３１（ＧＧＩＩＰＩＬＧＴＡＴＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、および配列番号３２（ＡＲＲＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含むＣＤＲＨ３、
（ｗ）配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含むＣＤＲＨ１、配列番号３１（ＧＧＩＩＰＩＬＧＴＡＴＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、配列番号３２（ＡＲＲＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含むＣＤＲＨ３、配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含むＣＤＲＬ１、配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含むＣＤＲＬ２、および配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含むＣＤＲＬ３、
（ｘ）配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含むＣＤＲＨ１、配列番号３３（ＧＧＩＩＰＩＶＡＴＡＮＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、および配列番号３２（ＡＲＲＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含むＣＤＲＨ３、
（ｙ）配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含むＣＤＲＨ１、配列番号３３（ＧＧＩＩＰＩＶＡＴＡＮＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、配列番号３２（ＡＲＲＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含むＣＤＲＨ３、配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含むＣＤＲＬ１、配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含むＣＤＲＬ２、および配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含むＣＤＲＬ３、
（ｚ）配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含むＣＤＲＨ１、配列番号３４（ＧＧＩＩＰＩＦＧＫＡＴＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、および配列番号３２（ＡＲＲＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含むＣＤＲＨ３、
（ａａ）配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含むＣＤＲＨ１、配列番号３４（ＧＧＩＩＰＩＦＧＫＡＴＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、配列番号３２（ＡＲＲＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含むＣＤＲＨ３、配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含むＣＤＲＬ１、配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含むＣＤＲＬ２、および配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含むＣＤＲＬ３、
（ｂｂ）配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含むＣＤＲＨ１、配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、配列番号８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含むＣＤＲＨ３、配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含むＣＤＲＬ１、配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含むＣＤＲＬ２、および配列番号３８（ＦＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含むＣＤＲＬ３、
（ｃｃ）配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含むＣＤＲＨ１、配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、配列番号８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含むＣＤＲＨ３、配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含むＣＤＲＬ１、配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含むＣＤＲＬ２、および配列番号３９（ＱＱＳＹＳＴＩＬＴ）を含むＣＤＲＬ３、
（ｄｄ）配列番号１４（ＧＴＦＳＳＹＡＦＳ）を含むＣＤＲＨ１、配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含むＣＤＲＨ２および配列番号８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含むＣＤＲＨ３、配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含むＣＤＲＬ１、配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含むＣＤＲＬ２、および配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含むＣＤＲＬ３、
（ｅｅ）配列番号２３（ＧＴＦＳＳＹＡＩＳ）を含むＣＤＲＨ１、配列番号２４（ＧＧＩＩＰＩＶＧＩＡＮＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、および配列番号８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含むＣＤＲＨ３、
（ｆｆ）配列番号２３（ＧＴＦＳＳＹＡＩＳ）を含むＣＤＲＨ１、配列番号２４（ＧＧＩＩＰＩＶＧＩＡＮＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、および配列番号８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含むＣＤＲＨ３、配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含むＣＤＲＬ１、配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含むＣＤＲＬ２、および配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含むＣＤＲＬ３、
（ｇｇ）配列番号２３（ＧＴＦＳＳＹＡＩＳ）を含むＣＤＲＨ１、配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、および配列番号２５（ＡＲＬＫＧＥＦＫＤＡＦＤＩ）を含むＣＤＲＨ３、
（ｈｈ）配列番号２３（ＧＴＦＳＳＹＡＩＳ）を含むＣＤＲＨ１、配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、および配列番号２５（ＡＲＬＫＧＥＦＫＤＡＦＤＩ）を含むＣＤＲＨ３、配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含むＣＤＲＬ１、配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含むＣＤＲＬ２、および配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含むＣＤＲＬ３、
（ｉｉ）配列番号２３（ＧＴＦＳＳＹＡＩＳ）を含むＣＤＲＨ１、配列番号２６（ＧＲＩＩＰＬＦＧＴＡＨＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、および配列番号８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含むＣＤＲＨ３、
（ｊｊ）配列番号２３（ＧＴＦＳＳＹＡＩＳ）を含むＣＤＲＨ１、配列番号２６（ＧＲＩＩＰＬＦＧＴＡＨＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、および配列番号８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含むＣＤＲＨ３、配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含むＣＤＲＬ１、配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含むＣＤＲＬ２、および配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含むＣＤＲＬ３、
（ｋｋ）配列番号２３（ＧＴＦＳＳＹＡＩＳ）を含むＣＤＲＨ１、配列番号２７（ＧＲＩＮＰＩＬＧＴＡＮＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、および配列番号２８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＳＩ）を含むＣＤＲＨ３、
（ｌｌ）配列番号２３（ＧＴＦＳＳＹＡＩＳ）を含むＣＤＲＨ１、配列番号２７（ＧＲＩＮＰＩＬＧＴＡＮＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、および配列番号２８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＳＩ）を含むＣＤＲＨ３、配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含むＣＤＲＬ１、配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含むＣＤＲＬ２、および配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含むＣＤＲＬ３、
（ｍｍ）配列番号２３（ＧＴＦＳＳＹＡＩＳ）を含むＣＤＲＨ１、配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、および配列番号３０（ＡＲＬＫＧＥＬＫＣＡＦＤＩ）を含むＣＤＲＨ３、
（ｎｎ）配列番号２３（ＧＴＦＳＳＹＡＩＳ）を含むＣＤＲＨ１、配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、および配列番号３０（ＡＲＬＫＧＥＬＫＣＡＦＤＩ）を含む、配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含むＣＤＲＬ１、配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含むＣＤＲＬ２、および配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含むＣＤＲＬ３、
（ｏｏ）配列番号３６（ＧＰＦＲＳＨＡＶＳ）を含むＣＤＲＨ１、配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、および配列番号３７（ＡＲＬＫＳＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含むＣＤＲＨ３、または
（ｐｐ）配列番号３６（ＧＰＦＲＳＨＡＶＳ）を含むＣＤＲＨ１、配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、および配列番号３７（ＡＲＬＫＳＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含むＣＤＲＨ３、配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含むＣＤＲＬ１、配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含むＣＤＲＬ２、および配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含むＣＤＲＬ３
を含む。
一部のそのような実施形態では、抗原結合の第２の単位はＰＤ－Ｌ１に結合し、配列番号３５、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、または５８のいずれか１つに対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号５９、６０、６１、６２、または６３のいずれか１つに対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
一部の実施形態では、抗原結合の第２の単位はＰＤ－Ｌ１に結合し、
（ａ）配列番号３５に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号４０に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号４１に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列、
（ｄ）配列番号４２に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列、
（ｅ）配列番号４３に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列、
（ｆ）配列番号４４に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列、
（ｇ）配列番号４５に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列、
（ｈ）配列番号４６に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列、
（ｉ）配列番号４７に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列、
（ｊ）配列番号４８に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列、
（ｋ）配列番号４９に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列、
（ｌ）配列番号５０に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列、
（ｍ）配列番号５１に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列、
（ｎ）配列番号５２に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列、
（ｏ）配列番号５３に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列、
（ｐ）配列番号５４に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列、
（ｑ）配列番号５５に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列、
（ｒ）配列番号５６に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列、
（ｓ）配列番号５７に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列、または
（ｔ）配列番号５８に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列
を含む重鎖可変領域を含む。
一部の実施形態では、抗原結合の第２の単位はＰＤ－Ｌ１に結合し、
（ａ）配列番号５９に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号６０に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号６１に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列、
（ｄ）配列番号６２に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列、または
（ｅ）配列番号６３に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列
を含む軽鎖可変領域を含む。
一部の実施形態では、本開示は、本明細書に開示される任意のＰＤ－１アンタゴニストおよび本明細書に開示されるＰＤ－Ｌ１などのＰＤ－１リガンドの任意のアンタゴニストを含む多重特異性抗原結合性構築物を提供する。例えば、二重特異物３は、ヒトＰＤ－１およびヒトＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する多重特異性の、四価の抗原結合性構築物である。構築物は、抗体の重鎖が、ポリ－ＧＧＧＳ（配列番号１２０）リンカーによって抗ＢＣＭＡ抗体のＦｃ領域に接続された抗ＰＤ－Ｌ１抗体（ｍＡｂ１）の重鎖可変領域をそのＣ末端にさらに含む融合タンパク質である抗ＰＤ－１ ＩｇＧ１抗体（ｍＡｂ２８）を含む。構築物の抗ＰＤ－１部分および抗ＰＤ－Ｌ１部分の軽鎖は同一である（配列番号１０１）。図１３Ａにおいて図示により表される構造物である二重特異物３は、配列番号１００において言及される重鎖配列および配列番号１０１において言及される軽鎖配列を含む。
一部の実施形態では、本開示は、ＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する多重特異性抗体またはその抗原結合性部分であって、配列番号１００または１０２に対して少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一）のアミノ酸配列を含む重鎖領域および配列番号１０１または１０３に対して少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一）のアミノ酸配列を含む軽鎖領域を含む、多重特異性抗体またはその抗原結合性部分を提供する。
一部の実施形態では、本開示は、ＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する多重特異性抗体またはその抗原結合性部分であって、配列番号１００に対して少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一）のアミノ酸配列を含む重鎖領域、および配列番号１０１に対して少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一）のアミノ酸配列を含む軽鎖領域を含む、多重特異性抗体またはその抗原結合性部分を提供する。一部の実施形態では、重鎖領域は、配列番号１００から１５アミノ酸もしくはそれ未満、１４アミノ酸もしくはそれ未満、１３アミノ酸もしくはそれ未満、１２アミノ酸もしくはそれ未満、１１アミノ酸もしくはそれ未満、１０アミノ酸もしくはそれ未満、９アミノ酸もしくはそれ未満、８アミノ酸もしくはそれ未満、７アミノ酸もしくはそれ未満、６アミノ酸もしくはそれ未満、５アミノ酸もしくはそれ未満、４アミノ酸もしくはそれ未満、３アミノ酸もしくはそれ未満、２アミノ酸もしくはそれ未満、または１アミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、軽鎖領域は、配列番号１０１から１５アミノ酸もしくはそれ未満、１４アミノ酸もしくはそれ未満、１３アミノ酸もしくはそれ未満、１２アミノ酸もしくはそれ未満、１１アミノ酸もしくはそれ未満、１０アミノ酸もしくはそれ未満、９アミノ酸もしくはそれ未満、８アミノ酸もしくはそれ未満、７アミノ酸もしくはそれ未満、６アミノ酸もしくはそれ未満、５アミノ酸もしくはそれ未満、４アミノ酸もしくはそれ未満、３アミノ酸もしくはそれ未満、２アミノ酸もしくはそれ未満、または１アミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、本開示は、ＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する多重特異性抗体またはその抗原結合性部分であって、配列番号１０２に対して少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一）のアミノ酸配列を含む重鎖領域、および配列番号１０３に対して少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一）のアミノ酸配列を含む軽鎖領域を含む、多重特異性抗体またはその抗原結合性部分を提供する。一部の実施形態では、重鎖領域は、配列番号１０２から１５アミノ酸もしくはそれ未満、１４アミノ酸もしくはそれ未満、１３アミノ酸もしくはそれ未満、１２アミノ酸もしくはそれ未満、１１アミノ酸もしくはそれ未満、１０アミノ酸もしくはそれ未満、９アミノ酸もしくはそれ未満、８アミノ酸もしくはそれ未満、７アミノ酸もしくはそれ未満、６アミノ酸もしくはそれ未満、５アミノ酸もしくはそれ未満、４アミノ酸もしくはそれ未満、３アミノ酸もしくはそれ未満、２アミノ酸もしくはそれ未満、または１アミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、軽鎖領域は、配列番号１０３から１５アミノ酸もしくはそれ未満、１４アミノ酸もしくはそれ未満、１３アミノ酸もしくはそれ未満、１２アミノ酸もしくはそれ未満、１１アミノ酸もしくはそれ未満、１０アミノ酸もしくはそれ未満、９アミノ酸もしくはそれ未満、８アミノ酸もしくはそれ未満、７アミノ酸もしくはそれ未満、６アミノ酸もしくはそれ未満、５アミノ酸もしくはそれ未満、４アミノ酸もしくはそれ未満、３アミノ酸もしくはそれ未満、２アミノ酸もしくはそれ未満、または１アミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を含む。
一部の態様および実施形態では、抗原結合の４つの単位を含む多重特異性抗原結合性構築物であって、抗原結合の２つの単位がＰＤ－１に結合し、抗原結合の２つの単位がＰＤ－Ｌ１に結合し、構築物が、配列番号１００または１０２のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％同一の重鎖アミノ酸配列、および配列番号１０１または１０３のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％同一の軽鎖アミノ酸配列を含む、多重特異性抗原結合性構築物もまた本明細書において提供される。
一部の態様および実施形態では、抗原結合の４つの単位を含む多重特異性抗原結合性構築物であって、抗原結合の２つの単位がＰＤ－１に結合し、抗原結合の２つの単位がＰＤ－Ｌ１に結合し、構築物が、配列番号１００のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％同一の重鎖アミノ酸配列および配列番号１０１のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％同一の軽鎖アミノ酸配列を含む、多重特異性抗原結合性構築物もまた本明細書において提供される。
一部の態様および実施形態では、抗原結合の４つの単位を含む多重特異性抗原結合性構築物であって、抗原結合の２つの単位がＰＤ－１に結合し、抗原結合の２つの単位がＰＤ－Ｌ１に結合し、構築物が、配列番号１０２のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％同一の重鎖アミノ酸配列および配列番号１０３のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％同一の軽鎖アミノ酸配列を含む、多重特異性抗原結合性構築物もまた本明細書において提供される。
Figure 2022507253000009
Figure 2022507253000010
「多重特異性抗原結合性構築物」という用語は、本明細書において使用される場合、二重特異性、三重特異性、または多重特異性抗原結合性構築物、およびその抗原結合性部分または断片を指す。多重特異性抗原結合性構築物は、単一の多機能性ポリペプチドであることができ、または共有結合的もしくは非共有結合的に互いと会合した２つもしくはそれより多くの分子（例えば、ポリペプチドおよび／もしくはアプタマー）のマルチマー複合体であることができる。「多重特異性抗原結合性構築物」という用語は、別の機能分子、例えば、別のペプチド、タンパク質、および／またはアプタマーに連結されることまたはそれと共発現されることができる抗体（またはその抗原結合性断片）を含む。例えば、抗体またはその断片は、第２の結合特異性を有する二重特異性または多重特異性抗原結合性分子を製造するために、タンパク質またはその断片などの１つまたは複数の他の分子実体に（例えば、化学カップリング、遺伝子融合、非共有結合性会合またはその他により）機能的に連結させることができる。本明細書において使用される場合、「多重特異性抗原結合性構築物」という用語はまた、二重特異性、三重特異性もしくは多重特異性抗体またはその抗原結合性断片を含む。ある特定の実施形態では、抗体は、第２の結合特異性を有する二重特異性抗体を製造するために、別の抗体またはその抗原結合性断片に機能的に連結させられる。本発明の二重特異性および多重特異性抗体は、本明細書の他の箇所に記載される。
本明細書において使用される場合、抗原結合性「アーム」は、抗原に結合する構築物の区画を形成する多重特異性抗原結合性構築物の単位、ドメイン、または領域などを指す。そのため、「第１のアーム」は、構築物の「第２のアーム」とは別々の多重特異性抗原結合性構築物の結合性区画を形成し、各アームは抗原結合の単位を形成する。一般に、１つの「アーム」（第１のアーム）は、その抗原結合性または抗原特異性において他の「アーム」（第２のアーム）とは別個である。そのため、二重特異性の二価抗体の例において、抗体の１つのアームは抗原Ａに結合し、抗体の他のアームは抗原Ｂに結合する。一部の実施形態では、二重特異性の二価抗体の例において、抗体の１つのアームは抗原Ａに結合し、抗体の他のアームは抗原ＢまたはＣに結合する（例えば、構造における類似性に起因して、ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２などの２つの抗原と交差反応する）。例えば、米国特許第９，８４５，３５６号明細書を参照。同様に、四価の二重特異性抗体（例えば、２つの異なる抗体を接合することにより形成される）の例において、１つの「アーム」は、（二価抗体の２つの結合部位が抗原Ａに結合する場合であっても）抗原Ａに結合する抗体の区画を指し、「他のアーム」は、（二価抗体の２つの結合部位が抗原Ｂに結合する場合であっても）抗原Ｂに結合する抗体の区画を指す。一部の実施形態では、四価の二重特異性抗体（例えば、２つの異なる抗体を接合することにより形成される）の例において、１つの「アーム」は、（二価抗体の２つの結合部位が抗原Ａに結合する場合であっても）抗原Ａに結合する抗体の区画を指し、「他のアーム」は、（二価抗体の２つの結合部位が抗原ＢまたはＣに結合できる場合であっても）抗原ＢまたはＣに結合する抗体の区画を指す。例えば、米国特許第９８４５３５６号明細書を参照。当業者に明らかなように、「第１」または「第２」は交換可能に使用され得る。
「価数」という用語は、抗原結合性構築物もしくはタンパク質または抗原結合性アームを記載するために使用される場合、異なる認識または結合部位が同じエピトープに結合するかどうかにかかわらず、抗原結合性構築物またはタンパク質中の認識（結合）部位の数を指す。各認識部位は、抗原上の１つのエピトープ（結合部位）を特異的に認識し、したがってそれに結合することができる。抗原結合性タンパク質が１つより多くの認識部位を含む場合（例えば、抗原結合性タンパク質が、その可変領域中に２つの認識部位を有するＩｇＧである場合）、各認識部位は、同じ抗原上の同じエピトープ、または同じ抗原上もしくは異なる抗原上のいずれにあるにせよ異なるエピトープを特異的に認識することができる。多価性は、抗原結合性アームまたは構築物と、関係する抗原または標的受容体との間のアビディティ、すなわち、結合の強度を増加させることができる。アビディティは、エピトープまたは抗原決定基と抗原結合単位上のその結合部位との間の親和性、および抗原結合単位上に存在する関係する結合部位の実際の数の両方に関する。
一部の実施形態では、本明細書に開示される任意の多重特異性抗原結合性構築物は、価数の少なくとも２つがＰＤ－１に特異的に結合する、多価（例えば、二価）抗体または抗原結合性断片を含む。一部の実施形態では、本明細書に開示される任意の多重特異性抗原結合性構築物は、価数の少なくとも２つがＰＤ－１リガンド（例えば、ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２）に特異的に結合する、多価（例えば、二価）抗体または抗原結合性断片を含む。一部の実施形態では、本明細書に開示される任意の多重特異性抗原結合性構築物は、価数の少なくとも２つがＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する、多価（例えば、二価）抗体または抗原結合性断片を含む。一部の実施形態では、本明細書に開示される任意の多重特異性抗原結合性構築物は、第１の多価（例えば、二価）抗体または抗原結合性断片および第２の多価（例えば、二価）抗体または抗原結合性断片を含み、第１の多価抗体または抗原結合性断片の価数の少なくとも２つがＰＤ－１に特異的に結合し、第２の多価抗体または抗原結合性断片の価数の少なくとも２つがＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する。一部の実施形態では、本明細書に開示される任意の多重特異性抗原結合性構築物は四価構築物であり、四価構築物は第１の二価抗体または抗原結合性断片および第２の二価抗体または抗原結合性断片を含み、第１の二価抗体または抗原結合性断片の両方の価数は、ＰＤ－１上の同じエピトープに対して特異的であり、第２の二価抗体または抗原結合性断片の両方の価数は、ＰＤ－Ｌ１上の同じエピトープに対して特異的である。そのような四価構築物の一部の実施形態では、第１および第２の二価抗体またはその抗原結合性断片もしくは部分は、同じアミノ酸配列を有する軽鎖を使用する。換言すれば、四価構築物は共通の軽鎖を含む。例えば、配列番号１０１または配列番号１０３の配列を有する軽鎖。
一部の実施形態では、第１のアームはＰＤ－１のアンタゴニストである。一部の実施形態では、第２のアームは、ＰＤ－１リガンド、例えば、ＰＤ－Ｌ１および／またはＰＤ－Ｌ２のアンタゴニストである。一部の実施形態では、第１のアームはＰＤ－１のアンタゴニストであり、第２のアームは、コグネイトＰＤ－１リガンド、例えば、ＰＤ－Ｌ１および／またはＰＤ－Ｌ２のアンタゴニストである。
「アンタゴニスト」、「アンタゴナイズする」、および「阻害する」という用語は、抗原結合性アームの生物学的活性を指すために使用される場合、抗原結合性アームが各々の細胞上のその標的（例えば、ＰＤ－１）に結合して、ＰＤ－１を通じた生物学的応答を部分的または全体的に遮断、阻害、および／または低減することを指し示す。一部の実施形態では、アンタゴニストの存在下での阻害は、用量依存的な方式で観察される。一部の実施形態では、測定されるシグナル（例えば、生物学的活性）は、同等の条件下で陰性対照を用いて測定されるシグナルよりも少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約１００％低い。本開示の方法において使用するために好適なアンタゴニストを同定する方法もまた本明細書に開示される。例えば、これらの方法としては、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ＦＯＲＴＥ ＢＩＯ（著作権）システム、およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）などの結合アッセイが挙げられるがそれに限定されない。これらのアッセイは、目的のポリペプチド（例えば、ＰＤ－１またはそのリガンド）に結合するアンタゴニストの能力を決定し、したがって目的のポリペプチドの活性を阻害、中和または遮断するアンタゴニストの能力を指し示す。ポリペプチドの機能を阻害するアンタゴニストの能力などのアンタゴニストの有効性はまた、機能アッセイを使用して決定することができる。例えば、機能アッセイは、ポリペプチドを候補アンタゴニスト分子と接触させる工程およびポリペプチドと通常関連付けられる１つまたは複数の生物学的活性における検出可能な変化を測定する工程を含んでもよい。アンタゴニストの効力は、通常、そのＩＣ５０値（アゴニスト応答の５０％を阻害するために必要とされる濃度）により定義される。ＩＣ５０値が低くなる程、アンタゴニストの効力はより大きくなり、最大生物学的応答を阻害するために必要とされる濃度はより低くなる。
一部の実施形態では、少なくとも１つの抗原結合性アームは、少なくとも１×１０－７Ｍ、少なくとも１×１０－８Ｍ、少なくとも１×１０－９Ｍ、少なくとも１×１０－１０Ｍ、少なくとも１×１０－１１Ｍ、少なくとも１×１０－１２Ｍ、または少なくとも１×１０－１３ＭのＫＤを有する。一部の実施形態では、両方の抗原結合性アームは同じまたは類似したＫＤを有する。「ＫＤ」（Ｍ）という用語は、本明細書において使用される場合、具体的な抗原結合性アーム／抗原相互作用の解離平衡定数を指す。ＫＤ＝ｋｄ／ｋａ。「ｋｄ」（秒－１）という用語は、本明細書において使用される場合、具体的な抗原結合性アーム／抗原相互作用の解離速度定数を指す。この値はｋｏｆｆ値とも称される。「ｋａ」（Ｍ－１×秒－１）という用語は、本明細書において使用される場合、具体的な抗原結合性アーム／抗原相互作用の会合速度定数を指す。この値はｋｏｎ値とも称される。
一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物の１つのアーム（例えば、第１のアーム）のその標的への結合は、他のアーム（例えば、第２のアーム）のその標的への結合を遮断しない。一部の実施形態では、１つのアームの結合は、第２のアームのその標的への結合を立体的に邪魔しない。例えば、第１のアームのＰＤ－１への結合時に、第２のアームはＰＤ－１のリガンド（例えば、ＰＤ－Ｌ１および／またはＰＤ－Ｌ２）に自由に結合する。そのため、一部の実施形態では、第１のアームおよび第２のアームはそれらの各々の標的に結合し、両方のアームは同時に結合したままとなる。
一部の実施形態では、第１のアームおよび第２のアームのそれらの各々の標的への結合は免疫細胞および第２の細胞を一緒になるようにブリッジ形成させ、２つの細胞を近接させる。本明細書において使用される場合、「ブリッジ形成」は、２つの細胞種（例えば、ＰＤ－１を発現する１つの免疫細胞、およびそのリガンドＰＤ－Ｌ１を発現する第２の細胞）を接合すること、または２つの細胞を近接させることを指し、２つの細胞は物理的に接触している必要はない。そのため、多重特異性抗原結合性構築物は、それぞれがＰＤ－１またはそのリガンドのいずれかを発現する２つの細胞へのコネクター（例えば、ブリッジ）として作用する。
２つの細胞が一緒になるように本発明の構築物によりブリッジ形成または接続されているかどうかを決定する方法は、当該技術分野において公知である。例えば、一部の実施形態では、免疫細胞および第２の細胞のブリッジ形成は、例えば、フローサイトメトリー、ＦＲＥＴ、免疫沈降、顕微鏡法、または蛍光プレートリーダーにより決定される。
一部の実施形態では、多重特異性構築物の第１のアームおよび第２のアームのそれらの各々の標的への結合は、標的、例えば、ＰＤ－１の下方調節および／またはエクトドメインのシェディングおよび／または分解を結果としてもたらす。本明細書において使用される場合、「下方調節」は、細胞がＲＮＡまたはタンパク質などの細胞成分の量を減少させるプロセスを指す。細胞表面タンパク質受容体の場合、下方調節は、リガンドまたは本明細書に記載の任意の構築物への結合の帰結として受容体の内部移行を通じて起こり得る。シェディングまたはエクトドメインのシェディングは、細胞表面タンパク質がタンパク質分解により切断されてそれらのエクトドメインの細胞外環境への放出を結果としてもたらすプロセスを指す。エクトドメインのシェディングを調節するシェダーゼの非限定的な例としては、ディスインテグリン（ｄｉｓｉｎｔｉｇｒｉｎ）およびメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭ）ファミリーのメンバー、例えば、ＡＤＡＭ８、ＡＤＡＭ９、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１２、ＡＤＡＭ１５、ＡＤＡＭ１７、およびＡＤＡＭ２８、ならびにマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）、例えば、ＭＭＰ２、ＭＭＰ３、ＭＭＰ７、ＭＭＰ９、およびＭＭＰ１４が挙げられる。切断部位領域の形質膜からの距離および構造は、エクトドメインのシェディングにおいて特定の配列よりも重要であると考えられている。タンパク質分解またはタンパク質加水分解は、プロテアーゼと呼ばれるタンパク質分解酵素による触媒作用を通じて、または、例えば非常に低いもしくは非常に高いｐＨにおいて、非酵素的に、タンパク質中のペプチド結合の１つまたは複数の加水分解を結果としてもたらすプロセスのセットを指す。真核細胞において、２つの主要な経路、ユビキチン－プロテアソーム経路およびリソソームタンパク質加水分解がタンパク質分解を媒介する。標的受容体が、本明細書に開示される多重特異性構築物により下方調節および／またはシェディングおよび／または分解されるかどうかを決定する方法は当該技術分野において公知であり、実施例に記載されており（例えば、図１２Ａ～１２Ｃを参照）、例えば、フローサイトメトリー、ウエスタンブロッティング、免疫沈降、顕微鏡法、または蛍光プレートリーダーがある。
本明細書に記載されるように、本発明の構築物は、ＰＤ－１を発現する免疫細胞、ならびにそのリガンドを発現する第２の細胞、例えば、第２の免疫細胞、および／またはがんもしくは腫瘍細胞をブリッジ形成させることができる。当業者が認識するように、免疫細胞の種類は、治療される疾患の文脈に依存し、免疫細胞の具体的な種類は、考慮されている障害に依存して容易に決定され得る。一部の実施形態では、免疫細胞はＴ細胞、例えば、制御性Ｔ細胞（別名サプレッサーＴ細胞）であり、これには、ＣＤ８＋ Ｔ細胞およびＣＤ４＋ Ｔ細胞、ならびにサブタイプ、例えば、ＣＤ４＋ ＦＯＸＰ３＋ Ｔｒｅｇ細胞、ＣＤ４＋ＦＯＸＰ３－ Ｔｒｅｇ細胞、Ｔｒ１細胞、Ｔｈ３細胞、およびＴｒｅｇ１７細胞が含まれる。一部の実施形態では、免疫細胞はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。一部の実施形態では、免疫細胞はＢ細胞である。一部の実施形態では、免疫細胞はマクロファージである。
同様に、第２の細胞の種類は、考慮されている障害に依存する。一部の実施形態では、第２の細胞（ＰＤ－１リガンドを発現する細胞）は第２の免疫細胞、例えば、制御性免疫細胞である。一部の実施形態では、制御性免疫細胞は、制御性Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、骨髄由来抑制細胞、樹状細胞、または間葉間質細胞のいずれか１つまたは複数である。一部の実施形態では、制御性免疫細胞は制御性Ｔ細胞、例えば、ＣＤ８＋ Ｔ細胞またはＣＤ４＋ Ｔ細胞である。
一部の実施形態では、第２の細胞は腫瘍細胞である。本明細書において使用される場合、「腫瘍細胞」は「がん細胞」と交換可能に使用されることがあるが、正常細胞と比較して増加した増殖を呈する非悪性（非がん性）細胞も包含する。一部の実施形態では、腫瘍細胞は、免疫細胞により発現されたＰＤ－１および第２の細胞上に発現されたそのリガンド（例えば、ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２）の間の相互作用を遮断すると共に、免疫細胞および腫瘍細胞をブリッジ形成させることにより治療され得るがんである。一部の実施形態では、腫瘍細胞は、血液がん、リンパ腫、骨髄腫、白血病、神経学的がん、黒色腫、乳がん、前立腺がん、結腸直腸がん、肺がん、頭頸部がん、胃腸がん、肝臓がん、膵臓がん、泌尿生殖器がん、骨がん、腎臓がん、および血管がんからなる群から選択される。一部の実施形態では、腫瘍細胞は、カポジ肉腫、白血病、急性リンパ球性白血病、急性骨髄球性白血病、骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性赤白血病、慢性白血病、慢性骨髄球性（顆粒球性）白血病、慢性リンパ球性白血病、マントル細胞リンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫、バーキットリンパ腫および辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、真性多血症リンパ（Ｐｏｌｙｃｙｔｈｅｍｉａ ｖｅｒａ Ｌｙｍｐｈｏｍａ）、ホジキン病、非ホジキン病、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、重鎖病、固形腫瘍、肉腫、癌腫、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫（ｃｈｒｏｎｄｒｏｓａｒｃｏｍａ）、骨原性肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸肉腫、結腸直腸癌、膵臓がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、扁平細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、ヘパトーマ、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、子宮がん、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫（ｍｅｎａｎｇｉｏｍａ）、黒色腫、神経芽腫、網膜芽腫、鼻咽頭癌、食道癌、基底細胞癌、胆道がん、膀胱がん、骨がん、脳および中枢神経系（ＣＮＳ）がん、子宮頸がん、絨毛癌、結腸直腸がん、結合組織がん、消化器系のがん、子宮内膜がん、食道がん、眼がん、頭頸部がん、胃がん、上皮内新生物、腎臓がん、喉頭がん、肝臓がん、肺がん（小細胞、大細胞）、黒色腫、神経芽腫；口腔がん（例えば、唇、舌、口および咽頭）、卵巣がん、膵臓がん、網膜芽腫、横紋筋肉腫、直腸がん；呼吸器系のがん、肉腫、皮膚がん、胃がん、精巣がん、甲状腺がん、子宮がん、ならびに泌尿器系のがんからなる群から選択される。
本明細書に記載されるように、本発明の多重特異性抗原結合性構築物は、二重特異性、三重特異性、四重特異性、もしくは多重特異性抗体（免疫グロブリン）またはその抗原結合性部分もしくは断片を含む。
「免疫グロブリン」という用語は、ポリペプチド鎖の２つのペア：軽（Ｌ）鎖の１つのペアおよび重（Ｈ）鎖の１つのペアを一般に含む、構造的に関するタンパク質のクラスを指す。「インタクトな免疫グロブリン」において、これらの鎖の４つ全てはジスルフィド結合により相互接続されている。免疫グロブリンの構造はよく特徴付けられている。例えば、ポール（Ｐａｕｌ） Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ７ｔｈ ｅｄ．， Ｃｈ． ５（２０１３）， リッピンコット・ウィリアムズ・アンド・ウィルキンス（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ）［米国ペンシルベニア州フィラデルフィア（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ）所在］を参照。簡潔に述べれば、各重鎖は、典型的には、重鎖可変領域（ＶＨ）および重鎖定常領域（ＣＨ）を含む。重鎖定常領域は、典型的には、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３を含む。各軽鎖は、典型的には、軽鎖可変領域（ＶＬ）および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、典型的には、ＣＬと略記される１つのドメインを含む。「免疫グロブリン」（Ｉｇ）という用語は、本明細書において「抗体」という用語と交換可能に使用されることがある。
「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子の種類を記載し、その最も広い意味において本明細書において使用される。抗体としては、インタクトな抗体（例えば、インタクトな免疫グロブリン）、および抗体断片、例えば、本明細書に記載されるような抗体の抗原結合性断片が特に挙げられる。そのため、「抗体」は、インタクトな抗体の他に、その抗原結合性断片を指すことができる。抗体は少なくとも１つの抗原結合性ドメインを含む。抗原結合性ドメインの１つの例は、ＶＨ－ＶＬ二量体により形成される抗原結合性ドメインである。抗体は、それらが特異的に結合する抗原により記載され得る。例えば、代替的に抗ＰＤ－１抗体と称されるＰＤ－１抗体は、阻害受容体ＰＤ－１に特異的に結合する抗体である。
ＶＨおよびＶＬ領域は、より保存された領域が散在した超可変性の領域（相補性決定領域（ＣＤＲ）とも呼ばれる「超可変領域」（ＨＶＲ））にさらに分割することができる。より保存された領域はフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。各ＶＨおよびＶＬは、一般に、以下の順序（Ｎ末端からＣ末端へ）：ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４で並べられた３つのＣＤＲおよび４つのＦＲを含む。ＣＤＲは、抗原結合に関与し、抗体に対して抗原特異性および結合親和性を付与する。カバットら（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．）， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ ５ｔｈ ｅｄ． （１９９１），米国国立衛生研究所公衆衛生局（Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）［米国メリーランド州ベセスダ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ）所在］（本願明細書に援用する）を参照。
脊椎動物種からの軽鎖は、定常ドメインの配列に基づいて、カッパおよびラムダと呼ばれる２つの種類のうちの１つに割り当てられ得る。
脊椎動物種からの重鎖は、５つの異なるクラス（またはアイソタイプ）：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭのうちの１つに割り当てられ得る。これらのクラスはまた、α、δ、ε、γ、およびμとそれぞれ呼称される。ＩｇＧおよびＩｇＡクラスは、配列および機能における差異に基づいてサブクラスにさらに分割される。ヒトは、以下のサブクラス：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２を発現する。
所望の標的に対する抗体を生成し、スクリーニングする方法は当該技術分野において周知である。増進した特性（例えば、増進した親和性、キメラ化、ヒト化）のために抗体をさらに改変する他に、本明細書に記載されるような抗原結合性断片を生成する方法もまた当該技術分野において周知である。
「キメラ抗体」という用語は、重鎖および／または軽鎖の成分が具体的な供給源または種に由来し、重鎖および／または軽鎖の残りの部分が異なる供給源または種に由来する抗体を指す。
非ヒト抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト抗体に由来する最小の配列を含有するキメラ抗体である。ヒト化抗体は、一般にヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であって、１つまたは複数のＣＤＲからの残基が非ヒト抗体（ドナー抗体）の１つまたは複数のＣＤＲからの残基により置き換えられたものである。ドナー抗体は、所望の特異性、親和性、または生物学的効果を有するマウス、ラット、ウサギ、ニワトリ、または非ヒト霊長動物抗体などの任意の好適な非ヒト抗体であることができる。一部の事例では、レシピエント抗体の選択されたフレームワーク領域残基は、ドナー抗体からの対応するフレームワーク領域残基により置き換えられる。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体中にもドナー抗体中にも見出されない残基を含むことができる。そのような改変は、抗体機能をさらに精密化するために行うことができる。さらなる詳細について、ジョーンズら（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．）， （１９８６） Ｎａｔｕｒｅ， ３２１：５２２－５２５；ライヒマンら（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．）， （１９８８） Ｎａｔｕｒｅ， ３３２：３２３－３２９；およびプレスタ（Ｐｒｅｓｔａ）， （１９９２） Ｃｕｒｒ． Ｏｐ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ．， ２：５９３－５９６（これらのそれぞれを本願明細書に援用する）を参照。
「ヒト抗体」は、ヒトもしくはヒト細胞により産生される抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する、またはヒト抗体レパートリーもしくはヒト抗体コーディング配列（例えば、ヒト供給源から得られるもしくはｄｅ ｎｏｖｏで設計される）を利用する非ヒト供給源に由来するものである。ヒト抗体はヒト化抗体を特に除外する。
一部の実施形態では、抗体分子は、ダイアボディおよび一本鎖分子の他に、抗体の抗原結合性断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ）を含む。例えば、抗体分子は、重（Ｈ）鎖可変ドメイン配列（本明細書においてＶＨと略記される）、および軽（Ｌ）鎖可変ドメイン配列（本明細書においてＶＬと略記される）を含むことができる。一部の実施形態では、抗体分子は１つの重鎖および１つの軽鎖を含むまたはからなる（半抗体と称される）。別の例では、抗体分子は２つの重（Ｈ）鎖可変ドメイン配列および２つの軽（Ｌ）鎖可変ドメイン配列を含み、それにより、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｃ、Ｆｄ、Ｆｄ’、Ｆｖ、単鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）、単一可変ドメイン抗体、ダイアボディ（Ｄａｂ）（二価および二重特異性）、ならびにキメラ（例えば、ヒト化）抗体などの２つの抗原結合部位を形成し、これは全体抗体の改変により製造することができ、または組換えＤＮＡ技術を使用してｄｅ ｎｏｖｏで合成されたものであり得る。これらの機能性抗体断片は、それらの各々の抗原と選択的に結合する能力を保持する。抗体および抗体断片は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、およびＩｇＥが挙げられるがそれに限定されない抗体の任意のクラスから、ならびに抗体の任意のサブクラス（例えば、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４）からのものであることができる。抗体分子の調製物はモノクローナルまたはポリクローナルであることができる。抗体分子はまた、ヒト、ヒト化、ＣＤＲグラフト、またはｉｎ ｖｉｔｒｏ生成抗体であることができる。抗体は、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４から選ばれる重鎖定常領域を有することができる。抗体はまた、例えば、カッパまたはラムダから選ばれる軽鎖を有することができる。一部の実施形態では、抗体は、配列番号６４（ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ）に対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を有するＩｇＧ１重鎖定常領域を含む。一部の実施形態では、抗体は、配列番号６８（ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＳＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ）に対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を有するＩｇＧ４重鎖定常領域を含む。一部の実施形態では、抗体は、配列番号６９（ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧ）に対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を有するＩｇＧ４重鎖定常領域を含む。
抗体分子の抗原結合性部分または断片は当該技術分野において周知であり、例えば、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価断片であるＦａｂ断片；（ｉｉ）ヒンジ領域においてジスルフィドブリッジにより連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ’）２断片；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一のアームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインからなるダイアボディ（ｄＡｂ）断片；（ｖｉ）ラクダ科動物もしくはラクダ化可変ドメイン；（ｖｉｉ）単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）（例えば、バードら（Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．）（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６；ヒューストンら（Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．）（１９８８）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：５８７９－５８８３を参照）；（ｖｉｉｉ）単一ドメイン抗体を含む。これらの抗体断片は、当業者に公知の従来技術を使用して得られ、断片は、インタクトな抗体と同じ方式で有用性についてスクリーニングされる。
抗体分子はまた、単一ドメイン抗体であることができる。単一ドメイン抗体は、その相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ）が単一ドメインポリペプチドの部分である抗体を含むことができる。例としては、重鎖抗体、軽鎖を天然に欠いた抗体、従来の４鎖抗体に由来する単一ドメイン抗体、操作された抗体および抗体に由来するもの以外の単一ドメインスキャフォールドが挙げられるがそれに限定されない。単一ドメイン抗体は、当該技術分野における任意のものまたは任意の将来的な単一ドメイン抗体であることができる。単一ドメイン抗体は、マウス、ヒト、ラクダ、ラマ、魚、サメ、ヤギ、ウサギ、およびウシが挙げられるがそれに限定されない任意の種に由来することができる。本発明の別の態様によれば、単一ドメイン抗体は、軽鎖を欠いた重鎖抗体として公知の天然に存在する単一ドメイン抗体である。そのような単一ドメイン抗体は、例えば、国際公開第９４０４６７８号に開示されている。明瞭性の理由から、天然に軽鎖を欠いた重鎖抗体に由来するこの可変ドメインは、４鎖免疫グロブリンの従来のＶＨからそれを区別するために本明細書においてＶＨＨまたはナノボディとして知られる。そのようなＶＨＨ分子は、ラクダ科の種、例えば、ラクダ、ラマ、ヒトコブラクダ、アルパカおよびグアナコにおいて生じた抗体に由来することができる。ラクダ科以外に他の種が、天然に軽鎖を欠いた重鎖抗体を産生することがあり、そのようなＶＨＨは本発明の範囲内である。
一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物は二重特異性抗体を含む。二重特異性抗体は、２つ以下の抗原に対して特異性を有するが、本明細書に記載されるように、２つより多くの結合部位を有することができる。二重特異性抗体分子は、第１の抗原（例えば、ＰＤ－１）に対する結合特異性を有する第１の免疫グロブリン可変ドメイン配列および第２の抗原（例えば、ＰＤ－Ｌ１リガンドなどのＰＤ－１リガンド）に対する結合特異性を有する第２の免疫グロブリン可変ドメイン配列により特徴付けられる。一部の実施形態では、二重特異性抗体分子は、第１の抗原に対する結合特異性を有するｓｃＦｖまたはその断片および第２の抗原に対する結合特異性を有するｓｃＦｖまたはその断片を含む。例えば、コンターマン（Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ）およびブリンクマン（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ）， （２０１５）， Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ， ２０（７）：８３８－４７（本願明細書に援用する）を参照。
非対称および対称の両方のアーキテクチャの多価および／または多重特異性抗体フォーマットなどの本明細書に記載の多価および／または多重特異性構築物を生成するために使用することができる様々なフォーマットおよび方法が当該技術分野において公知である。そのようなフォーマットの非限定的な例としては、以下が挙げられる：（ｉ）Ｆｃレス二重特異性抗体フォーマット、例えば、タンデム単鎖可変断片（ｓｃＦｖ２、ｔａＦｖ）およびトリプルボディ、例えば、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）および二重特異性キラー細胞エンゲージャー（ＢｉＫＥ）分子；単一ドメイン抗体を含む二重特異性単一ドメイン抗体融合タンパク質、例えば、ＶＨまたはＶＬドメイン、ＶＨＨ、ＶＮＡＲおよびナノボディ；ダイアボディおよびダイアボディ誘導体、例えば、タンデムダイアボディおよび二重親和性再標的化（ｄｕａｌ－ａｆｆｉｎｉｔｙ ｒｅｔａｒｇｅｔｉｎｇ）（ＤＡＲＴ）タンパク質；Ｆａｂ融合タンパク質；および様々なタンパク質からのヘテロ二量体化ペプチドまたはミニ抗体、例えば、コイルドコイル構造を有するロイシンジッパーの使用を通じた他のＦｃレス融合タンパク質；（ｉｉ）非対称アーキテクチャを有する二重特異性ＩｇＧ、例えば、２つの異なる抗体からの重鎖および軽鎖を有する非対称ＩｇＧ；ノブ－イントゥー－ホールアプローチ、ＣＨ３ドメインのホモ二量体化を回避するための静電相互作用（ステアリング）、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２のヒンジ領域に電荷対を導入することによる優先的な重鎖ヘテロ二量体化、鎖交換操作ドメイン（ｓｔｒａｎｄ－ｅｘｃｈａｎｇｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｄｏｍａｉｎ）（ＳＥＥＤ）ヘテロ二量体、およびＴ細胞受容体に基づく抗体による二重特異性エンゲージメント（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ ｂｙ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）（ＢＥＡＴ）技術を使用した、非対称Ｆｃ領域を有する二重特異性ＩｇＧ；非対称ＦｃおよびＣＨ３融合タンパク質；（ｉｉｉ）対称アーキテクチャを有する二重特異性抗体、例えば、ｓｃＦｖの融合による付加型ＩｇＧ、ドメイン抗体およびスキャフォールドタンパク質の融合物、Ｆａｂアームの融合物、および追加の可変重鎖および軽鎖ドメインの融合物；改変されたＩｇＧ分子；対称ＦｃおよびＣＨ３ベース二重特異性抗体；および免疫グロブリン由来ホモ二量体化ドメインを使用した二重特異性抗体。例えば、「二重特異性抗体の製造（Ｔｈｅ ｍａｋｉｎｇ ｏｆ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」、ブリンクマン（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ）およびコンターマン（Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ）、ＭＡＢＳ ２０１７， Ｖｏｌ． ９：２， ｐｐ． １８２－２１２（その内容の全体を参照により本願明細書に援用する）を参照。例えば、米国特許第５，７３１，１６８号明細書に記載の「ノブ・イン・ア・ホール」（ｋｎｏｂ ｉｎ ａ ｈｏｌｅ）アプローチ；例えば、国際公開第０９／０８９００４号、国際公開第０６／１０６９０５号および国際公開第２０１０／１２９３０４号に記載されるような静電ステアリングＦｃペアリング；例えば、国際公開第０７／１１０２０５号に記載されるような鎖交換操作ドメイン（ＳＥＥＤ）ヘテロ二量体形成；例えば、国際公開第０８／１１９３５３号、国際公開第２０１１／１３１７４６号、および国際公開第２０１３／０６０８６７号に記載されるようなＦａｂアーム交換；例えば、米国特許第４，４３３，０５９号明細書に記載されるような、例えば、アミン反応性基およびスルフヒドリル反応性基を有するヘテロ二官能性試薬を使用して二重特異性構造を生成するための抗体架橋による、二重抗体コンジュゲート；例えば、米国特許第４，４４４，８７８号明細書に記載されるような、２つの重鎖の間のジスルフィド結合の還元および酸化のサイクルを通じた異なる抗体からの半抗体（重鎖－軽鎖ペアまたはＦａｂ）の再結合により生成される二重特異性抗体決定因子；例えば、米国特許第５，２７３，７４３号明細書に記載されるような、三機能性抗体、例えば、スルフヒドリル（ｓｕｌｆｈｄｒｙｌ）反応性基を通じて架橋された３つのＦａｂ’断片；例えば、米国特許第５，５３４，２５４号明細書に記載されるような、生合成結合性タンパク質、例えば、好ましくはジスルフィドまたはアミン反応性化学架橋を通じてＣ末端テイルを通じて架橋されたｓｃＦｖのペア；例えば、米国特許第５，５８２，９９６号明細書に記載されるような、二機能性抗体、例えば、定常ドメインを置き換えたロイシンジッパー（例えば、ｃ－ｆｏｓおよびｃ－ｊｕｎ）を通じて二量体化した異なる結合特異性を有するＦａｂ断片；例えば、米国特許第５，５９１，８２８号明細書に記載されるような、二重特異性およびオリゴ特異性の一価およびオリゴ価受容体、例えば、１つの抗体のＣＨ１領域と、典型的には会合した軽鎖を有する他の抗体のＶＨ領域との間でポリペプチドスペーサーを通じて連結された２つの抗体（２つのＦａｂ断片）のＶＨ－ＣＨ１領域；例えば、米国特許第５，６３５，６０２号明細書に記載されるような、二重特異性ＤＮＡ－抗体コンジュゲート、例えば、ＤＮＡの二本鎖小片を通じた抗体またはＦａｂ断片の架橋；例えば、米国特許第５，６３７，４８１号明細書に記載されるような、二重特異性融合タンパク質、例えば、それらと全長定常領域との間に親水性ヘリカルペプチドリンカーを有する２つのｓｃＦｖを含有する発現構築物；例えば、米国特許第５，８３７，２４２号明細書に記載されるような、多価および多重特異性結合性タンパク質、例えば、一般にダイアボディと称される、Ｉｇ重鎖可変領域の結合性領域を有する第１のドメイン、およびＩｇ軽鎖可変領域の結合性領域を有する第２のドメインを有するポリペプチドの二量体（二重特異性、三重特異性、または四重特異性分子を作製するより高次構造もまた包含される）；例えば、米国特許第５，８３７，８２１号明細書に記載されるような、二量体化して二重特異性／多価分子を形成することができる、ペプチドスペーサーを用いて抗体ヒンジ領域およびＣＨ３領域にさらに接続された連結されたＶＬおよびＶＨ鎖を有するミニボディ構築物；二量体を形成して二重特異性ダイアボディを形成することができる、短いペプチドリンカー（例えば、５もしくは１０アミノ酸）を用いてまたはリンカーを全く用いずにいずれかの方向において連結されたＶＨおよびＶＬドメイン；例えば、米国特許第５，８４４，０９４号明細書に記載されるような、三量体および四量体；例えば、米国特許第５，８６４，０１９号明細書に記載されるような、一連のＦＶ（またはｓｃＦｖ）を形成するためにＶＬドメインとさらに会合したＣ末端において架橋可能な基を用いたペプチド連結により接続されたＶＨドメイン（またはファミリーメンバー中のＶＬドメイン）の連なり；ならびに、例えば、米国特許第５，８６９，６２０号明細書に記載されるような、ペプチドリンカーを通じて連結されたＶＨドメインおよびＶＬドメインの両方を有する単鎖結合性ポリペプチドが非共有結合性または化学架橋を通じて多価構造に組み合わせられて、例えば、ｓｃＦＶ型またはダイアボディ型の両方のフォーマットを使用してホモ二価、ヘテロ二価、三価、および四価構造を形成したものも参照。追加の例示的な多重特異性および二重特異性分子ならびにそれを作る方法は、例えば、米国特許第５，９１０，５７３号明細書、米国特許第５，９３２，４４８号明細書、米国特許第５，９５９，０８３号明細書、米国特許第５，９８９，８３０号明細書、米国特許第６，００５，０７９号明細書、米国特許第６，２３９，２５９号明細書、米国特許第６，２９４，３５３号明細書、米国特許第６，３３３，３９６号明細書、米国特許第６，４７６，１９８号明細書、米国特許第６，５１１，６６３号明細書、米国特許第６，６７０，４５３号明細書、米国特許第６，７４３，８９６号明細書、米国特許第６，８０９，１８５号明細書、米国特許第６，８３３，４４１号明細書、米国特許第７，１２９，３３０号明細書、米国特許第７，１８３，０７６号明細書、米国特許第７，５２１，０５６号明細書、米国特許第７，５２７，７８７号明細書、米国特許第７，５３４，８６６号明細書、米国特許第７，６１２，１８１号明細書、米国特許出願公開第ＵＳ２００２００４５８７号明細書、米国特許出願公開第２００２０７６４０６号明細書、米国特許出願公開第２００２１０３３４５号明細書、米国特許出願公開第２００３２０７３４６号明細書、米国特許出願公開第２００３２１１０７８号明細書、米国特許出願公開第２００４２１９６４３号明細書、米国特許出願公開第２００４２２０３８８号明細書、米国特許出願公開第２００４２４２８４７号明細書、米国特許出願公開第２００５００３４０３号明細書、米国特許出願公開第２００５００４３５２号明細書、米国特許出願公開第２００５０６９５５２号明細書、米国特許出願公開第２００５０７９１７０号明細書、米国特許出願公開第２００５１００５４３号明細書、米国特許出願公開第２００５１３６０４９号明細書、米国特許出願公開第２００５１３６０５１号明細書、米国特許出願公開第２００５１６３７８２号明細書、米国特許出願公開第２００５２６６４２５号明細書、米国特許出願公開第２００６０８３７４７号明細書、米国特許出願公開第２００６１２０９６０号明細書、米国特許出願公開第２００６２０４４９３号明細書、米国特許出願公開第２００６２６３３６７号明細書、米国特許出願公開第２００７００４９０９号明細書、米国特許出願公開第２００７０８７３８１号明細書、米国特許出願公開第２００７１２８１５０号明細書、米国特許出願公開第２００７１４１０４９号明細書、米国特許出願公開第２００７１５４９０１号明細書、米国特許出願公開第２００７２７４９８５号明細書、米国特許出願公開第２００８０５０３７０号明細書、米国特許出願公開第２００８０６９８２０号明細書、米国特許出願公開第２００８１５２６４５号明細書、米国特許出願公開第２００８１７１８５５号明細書、米国特許出願公開第２００８２４１８８４号明細書、米国特許出願公開第２００８２５４５１２号明細書、米国特許出願公開第２００８２６０７３８号明細書、米国特許出願公開第２００９１３０１０６号明細書、米国特許出願公開第２００９１４８９０５号明細書、米国特許出願公開第２００９１５５２７５号明細書、米国特許出願公開第２００９１６２３５９号明細書、米国特許出願公開第２００９１６２３６０号明細書、米国特許出願公開第２００９１７５８５１号明細書、米国特許出願公開第２００９１７５８６７号明細書、米国特許出願公開第２００９２３２８１１号明細書、米国特許出願公開第２００９２３４１０５号明細書、米国特許出願公開第２００９２６３３９２号明細書、米国特許出願公開第２００９２７４６４９号明細書、欧州特許出願公開第３４６０８７号明細書、および国際公開第０００６６０５号、国際公開第０２０７２６３５号、国際公開第０４０８１０５１号、国際公開第０６０２０２５８号、国際公開第２００７０４４８８７号、国際公開第２００７０９５３３８号、国際公開第２００７１３７７６０号、国際公開第２００８１１９３５３号、国際公開第２００９０２１７５４号、国際公開第２００９０６８６３０号、国際公開第９１０３４９３号、国際公開第９３２３５３７号、国際公開第９４０９１３１号、国際公開第９４１２６２５号、国際公開第９５０９９１７号、国際公開第９６３７６２１号、国際公開第９９６４４６０号に見出される。上記で参照される出願の内容を本願明細書に援用する。
一部の実施形態では、本発明の多重特異性抗原結合性構築物は二重特異性抗体である。本開示による二重特異性抗体は、ＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１に対して、またはＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ２に対して生成され得る。二重特異性抗体の抗体アームは、本明細書に開示されるように、標準的な技術により生成され得る。一部の実施形態では、ＰＤ－１およびそのリガンドに対する任意の公知の抗体を使用して本開示による二重特異性抗体を生成することができる。例えば、そのような二重特異性構築物は本明細書において例示されている（例えば、図３におけるアテゾリズマブ（ＰＤ－Ｌ１抗体）と接合されたペムブロリズマブ（ＰＤ－１抗体）；図４におけるアテゾリズマブ（ＰＤ－Ｌ１抗体）と接合されたニボルマブ（ＰＤ－１抗体）を参照）。本明細書において例示されるように、本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物（例えば、二重特異性抗体）は、当該技術分野において公知および／または利用可能な抗体を使用して生成され得る。
一部の実施形態では、二重特異性抗体は二価であり、例えば、１つのアームはＰＤ－１について一価であり、他のアームはＰＤ－Ｌ１もしくはＰＤ－Ｌ２のいずれか、または両方について一価である（例えば、両方のリガンドと交差反応する）。一部の実施形態では、二重特異性抗体は四価であり、本明細書に記載の新規の二重特異物３および二重特異物４抗体などである。例えば、図３に図示されるように、ペムブロリズマブ結合性アームはＰＤ－１について二価であり、それぞれはＰＤ－１上の同じエピトープに結合し、アテゾリズマブ結合性アームはＰＤ－Ｌ１について二価であり、それぞれはＰＤ－Ｌ１上の同じエピトープに結合する。これはまた、例えば、図８における二重特異性フォーマット（図８に提示されるワークフローの工程２の左パネルにおいて図示される例示的な共通軽鎖二重特異物）において見ることができる。図８における例示的な共通軽鎖二重特異性フォーマット（ワークフローの工程２の右パネルにおいて図示されるフォーマット）は、四価の二重特異性フォーマットの別の例を表す。第１の抗原結合性アームがＦｃ領域の反対末端上の第２の抗原結合性アームに接合された四価の二重特異性フォーマットとは対照的に、ここでの第１の抗原結合性アームの各Ｆａｂは第２の抗原結合性アームの各Ｆａｂに接合されている。例えば、第１の抗原結合性アームの１つのＦａｂは、リンカーを使用して第２の抗原結合性アームのＦａｂに連結されており、各抗原結合性アームは共通の軽鎖を共有する。図８、ワークフローの工程２の右パネルにおいて図示されるフォーマットを参照。
一部の実施形態では、二重特異性抗体は四価であり、１つのアームはＰＤ－１について二価であり、それぞれはＰＤ－１上の２つの異なるエピトープに結合する。一部の実施形態では、二重特異性抗体は四価であり、１つのアームはＰＤ－１のリガンド（ＰＤ－Ｌ１および／またはＰＤ－Ｌ２）について二価であり、それぞれはＰＤ－１のリガンド上の２つの異なるエピトープに結合する。一部の実施形態では、二重特異性抗体は四価であり、１つのアームはＰＤ－１について二価であり、それぞれはＰＤ－１上の２つの異なるがオーバーラップするエピトープに結合する。一部の実施形態では、二重特異性抗体は四価であり、１つのアームはＰＤ－１リガンド（ＰＤ－Ｌ１および／またはＰＤ－Ｌ２）について二価であり、それぞれはＰＤ－１リガンド（ＰＤ－Ｌ１および／またはＰＤ－Ｌ２）上の２つの異なるがオーバーラップするエピトープに結合する。一部の実施形態では、二重特異性抗体は四価であり、１つのアームはＰＤ－１について二価であり、それぞれはＰＤ－１上の同じエピトープに結合する。一部の実施形態では、二重特異性抗体は四価であり、１つのアームはＰＤ－１リガンド（ＰＤ－Ｌ１および／またはＰＤ－Ｌ２）について二価であり、それぞれはＰＤ－１リガンド（ＰＤ－Ｌ１および／またはＰＤ－Ｌ２）上の同じエピトープに結合する。一部の実施形態では、二重特異性抗体は四価であり、１つのアームはＰＤ－１上の同じエピトープについて二価であり、他のアームはＰＤ－１リガンド（ＰＤ－Ｌ１および／またはＰＤ－Ｌ２）上の同じエピトープについて二価である。
一部の実施形態では、二重特異性抗体はＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１の両方のアンタゴニストである。一部の実施形態では、二重特異性抗体はＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ２の両方のアンタゴニストである。一部の実施形態では、二重特異性抗体はＰＤ－１ならびに両方のリガンドＰＤ／Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２のアンタゴニストである（例えば、両方のリガンドと交差反応する）。
ある特定の実施形態では、第１の抗原結合アームおよび第２の抗原結合アームは少なくとも１つのアミノリンカーアミノ酸配列により連結されている。任意選択で、リンカーアミノ酸配列はＧＧＧＧＳｘ（配列番号１２１）（ｘは、１および６を含む１～６の整数である）を含む。
一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物は免疫グロブリンＦｃドメインを含まない。
一部の実施形態では、構築物は免疫グロブリンＦｃドメインを含む。一部の実施形態では、構築物の第１のアームもしくは第２のアーム、または両方は、１つまたは複数の免疫グロブリンＦｃ改変を含む重鎖を含む。一部の実施形態では、重鎖の免疫グロブリンＦｃドメインは、例えば、第１および第２のアームのヘテロ二量体化を促進し、血清半減期を促進し、および／またはエフェクター機能を改変する、１つまたは複数のアミノ酸突然変異を含む。一部の実施形態では、突然変異は重鎖のＣＨ３ドメイン中に存在する（例えば、シューら（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．）ｍＡｂｓ ７（１）：２３１－４２、２０１５を参照）。
伝統的なＦｃ融合タンパク質および抗体はガイドされない相互作用ペアの例であるが、例えば、第１の抗原結合アームおよび第２の抗原結合アームのヘテロ二量体化を促進するために、様々な操作されたＦｃドメインが非対称相互作用ペアとして設計されている（シュピースら（Ｓｐｉｅｓｓ ｅｔ ａｌ．）（２０１５）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６７（２Ａ）：９５－１０６）。許容される収率において好ましい非対称融合タンパク質を製造するために単一細胞株中でのＦｃ含有ポリペプチド鎖の所望のペア形成を増加させる様々な方法が当該技術分野において公知である［例えば、クラインら（Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．）（２０１２）ｍＡｂｓ ４：６５３－６６３；およびシュピースら（Ｓｐｉｅｓｓ ｅｔ ａｌ．）（２０１５）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６７（２ＰａｒｔＡ）：９５－１０６を参照］。Ｆｃ含有ポリペプチドの所望のペア形成を得る方法としては、電荷ベースのペア形成（静電ステアリング）、「ノブ－イントゥー－ホール」立体ペア形成、ＳＥＥＤボディペア形成、およびロイシンジッパーベースのペア形成が挙げられるがそれに限定されない。例えば、リッジウェイら（Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ．）（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． ９：６１７－６２１；マーチャントら（Ｍｅｒｃｈａｎｔ ｅｔ ａｌ．）（１９９８）Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． １６：６７７－６８１；デイビスら（Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．）（２０１０）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． Ｄｅｓ． Ｓｅｌ．２３：１９５－２０２；グナセカランら（Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎ ｅｔ ａｌ．）（２０１０） ２８５：１９６３７－１９６４６；ラニクら（Ｗｒａｎｉｋ ｅｔ ａｌ．）（２０１２）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２８７：４３３３１－４３３３９；米国特許第５，９３２，４４８号明細書；ならびに国際公開第１９９３／０１１１６２号、国際公開第２００９／０８９００４号、および国際公開第２０１１／０３４６０５号を参照。
例えば、特定のポリペプチドの間の相互作用を促進することができる１つの手段は、アラトゥーンら（Ａｒａｔｈｏｏｎ ｅｔ ａｌ．）、米国特許第７，１８３，０７６号明細書；カーターら（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．）、米国特許第５，７３１，１６８号明細書；およびクマールら（Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．）、国際公開第２０１６／１６４０８９号（本願明細書に援用する）に記載されるようにプロチュベランス－イントゥー－キャビティ（ｐｒｏｔｕｂｅｒａｎｃｅ－ｉｎｔｏ－ｃａｖｉｔｙ）（ノブ－イントゥー－ホール）相補領域を操作することによる。「プロチュベランス」（隆起）は、第１のポリペプチドの境界面（例えば、第１の相互作用ペア）からの小さいアミノ酸側鎖をより大きい側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）で置き換えることにより構築される。プロチュベランスと同一または類似のサイズの相補的な「キャビティ」は、大きいアミノ酸側鎖をより小さいもの（例えば、アラニンまたはスレオニン）で置き換えることにより第２のポリペプチドの境界面（例えば、第２の相互作用ペア）上に任意選択で作製される。好適な位置および寸法のプロチュベランスまたはキャビティが第１または第２のいずれかのポリペプチドの境界面において存在する場合、隣接する境界面において対応するそれぞれキャビティまたはプロチュベランスを操作することのみが必要である。
中性ｐＨ（７．０）において、アスパラギン酸およびグルタミン酸は負に荷電し、リシン、アルギニン、およびヒスチジンは正に荷電する。これらの荷電性残基を使用して、ヘテロ二量体形成を促進し、それと同時にホモ二量体形成を邪魔することができる。反対の電荷の間で誘引性相互作用が起こり、同様の電荷の間で反発性相互作用が起こる。部分的に、本明細書に開示されるタンパク質複合体は、荷電性境界面残基の部位特異的突然変異誘発を実行することによりヘテロマルチマー形成（例えば、ヘテロ二量体形成）を促進するために誘引性相互作用を使用し、任意選択でホモ二量体形成（例えば、ホモ二量体形成）を邪魔するために反発性相互作用を使用する。
例えば、ＩｇＧ１ ＣＨ３ドメイン境界面は、ドメイン－ドメイン相互作用に関与する４つの特有の電荷残基ペア：Ａｓｐ３５６－Ｌｙｓ４３９’、Ｇｌｕ３５７－Ｌｙｓ３７０’、Ｌｙｓ３９２－Ａｓｐ３９９’、およびＡｓｐ３９９－Ｌｙｓ４０９’［第２の鎖中の残基番号付けは（’）により指し示される］を含む。ＩｇＧ１ ＣＨ３ドメイン中の残基を指定するためにここで使用される番号付けスキームは、カバットのＥＵ番号付けスキームに従うことに留意すべきである。ＣＨ３－ＣＨ３ドメイン相互作用において存在する２回対称性に起因して、各特有の相互作用は構造中に２回現れる（例えば、Ａｓｐ－３９９－Ｌｙｓ４０９’およびＬｙｓ４０９－Ａｓｐ３９９’）。野生型配列において、Ｋ４０９－Ｄ３９９’は、ヘテロ二量体およびホモ二量体の両方の形成を好む。第１の鎖において電荷極性を切り替える単一の突然変異（例えば、Ｋ４０９Ｅ；正電荷から負電荷へ）は、第１の鎖のホモ二量体の形成にとって不都合な相互作用に繋がる。不都合な相互作用は、同じ電荷（負－負；Ｋ４０９Ｅ－Ｄ３９９’およびＤ３９９－Ｋ４０９Ｅ’）の間で起こる反発性相互作用に起因して生じる。第２の鎖において電荷極性を切り替える類似した突然変異（Ｄ３９９Ｋ’；負から正へ）は、第２の鎖のホモ二量体形成にとって不都合な相互作用（Ｋ４０９’－Ｄ３９９Ｋ’およびＤ３９９Ｋ－Ｋ４０９’）に繋がる。しかし、同時に、これらの２つの突然変異（Ｋ４０９ＥおよびＤ３９９Ｋ’）はヘテロ二量体形成にとって好都合な相互作用（Ｋ４０９Ｅ－Ｄ３９９Ｋ’およびＤ３９９－Ｋ４０９’）に繋がる。ヘテロ二量体の形成およびホモ二量体の支障に対する静電ステアリング効果は、例えば、Ａｒｇ３５５およびＬｙｓ３６０を含む、第２の鎖中の反対に荷電した残基とペア形成していてもよいしそうでなくてもよい追加の電荷残基の突然変異によりさらに増進することができる（例えば、国際公開第２０１６／１６４０８９号を参照）。
そのため、一部の実施形態では、本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物（例えば、二重特異性構築物）は、例えば、免疫グロブリンのＦｃ部分を含む、免疫グロブリンの定常ドメインを含むことができる。例えば、第１のアームは、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４）、ＩｇＡ（ＩｇＡｌもしくはＩｇＡ２）、ＩｇＥ、またはＩｇＭ免疫グロブリンのＦｃドメインに由来するアミノ酸配列を含むことができる。任意選択で、第２のアームは、ＩｇＧ（ＩｇＧｌ、ｌｇＧ２、ｌｇＧ３、もしくはＩｇＧ４）、ＩｇＡ（ＩｇＡｌもしくはＩｇＡ２）、ＩｇＥ、またはＩｇＭのＦｃドメインに由来するアミノ酸配列を含むことができる。そのような免疫グロブリンドメインは、ヘテロ二量体形成を促進する１つまたは複数のアミノ酸改変（例えば、欠失、付加、および／または置換）を含むことができる。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物はＩｇＧ１アイソタイプである。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物はＩｇＧ１アイソタイプであり、置換を含む。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物はＩｇＧ２アイソタイプである。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物はＩｇＧ３アイソタイプである。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物はＩｇＧ４アイソタイプである。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物はＩｇＧ４アイソタイプであり、置換を含む。一部の実施形態では、置換は、ＥＵ番号付けに従って番号付けされた場合にＳｅｒ２２８におけるものである。一部の実施形態では、Ｓｅｒ２２８における置換はＳ２２８Ｐである。一部の実施形態では、第１のアームおよび第２のアームは、同じ免疫グロブリンクラスおよびサブタイプに由来するＦｃドメインを含む。一部の実施形態では、第１のアームおよび第２のアームは、異なる免疫グロブリンクラスまたはサブタイプに由来するＦｃドメインを含む。同様に、第１のアームおよび／または第２のアーム（例えば、非対称ペアまたは非ガイド相互作用ペア）は、例えば、ヘテロ二量体形成を促進する１つまたは複数のアミノ酸改変（例えば、欠失、付加、および／または置換）を含む、改変された免疫グロブリンの定常ドメインを含む。所望のヘテロ二量体形成を有するＦｃ改変を生成する方法は当該技術分野において公知である。
一部の実施形態では、Ｆｃドメインは、本明細書に開示される多重特異性抗原結合性構築物の血清半減期を増進するように改変することができる。例えば、中性ｐＨと比較して酸性ｐＨにおいて、Ｆｃ受容体への抗体の結合を増進または減少させる１つまたは複数の突然変異を含むＦｃドメインは当該技術分野において公知である。例えば、本明細書に開示される構築物は、ＦｃドメインのＣＨ２またはＣＨ３領域中に突然変異を含むことができ、突然変異は、酸性環境中（例えば、ｐＨが約５．５～約６．０に及ぶエンドソーム中）でＦｃＲｎに対するＦｃドメインの親和性を増加させる。そのような突然変異は、動物に投与された場合に構築物の血清半減期の増加を結果としてもたらすことができる。増進した血清半減期などの所望の特徴のためにＦｃドメインを改変する方法は当該技術分野において公知である。
一部の実施形態では、本明細書に記載の構築物は、その対応する変更されていない定常領域と比べて低減されたエフェクター機能を有する（またはエフェクター機能を有しない）変更された重鎖定常領域を含む。本明細書に記載の構築物の定常領域を伴うエフェクター機能は、定常またはＦｃ領域の特性を変更することによりモジュレートすることができる。変更されたエフェクター機能としては、例えば、以下の活性：抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）、アポトーシス、１つまたは複数のＦｃ受容体への結合、および炎症促進性応答の１つまたは複数におけるモジュレーションが挙げられる。モジュレーションは、変更されていない形態の定常領域の活性と比較して変更された定常領域を含有する対象抗体により呈されるエフェクター機能活性の増加、減少、または排除を指す。具体的な実施形態では、モジュレーションは、活性が消失しまたは完全に存在しない状況を含む。
変更されたＦｃＲ結合親和性および／またはＡＤＣＣ活性および／または変更されたＣＤＣ活性を有する変更された定常領域は、変更されていない形態の定常領域と比較して増進または減少したＦｃＲ結合活性および／またはＡＤＣＣ活性および／またはＣＤＣ活性のいずれかを有するポリペプチドである。ＦｃＲへの増加した結合を示す変更された定常領域は、変更されていないポリペプチドより高い親和性で少なくとも１つのＦｃＲに結合する。ＦｃＲへの減少した結合を示す変更された定常領域は、変更されていない形態の定常領域より低い親和性で少なくとも１つのＦｃＲに結合する。ＦｃＲへの減少した結合を示すそのような変種は、ＦｃＲへの認識できる結合をほとんどまたは全く有することができず、例えば、天然配列免疫グロブリン定常またはＦｃ領域のＦｃＲへの結合のレベルと比較して０～５０％（例えば、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１％未満）のＦｃＲへの結合である。同様に、モジュレートされたＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ活性を示す変更された定常領域は、変更されていない定常領域と比較して増加または低減されたＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ活性のいずれかを呈することができる。例えば、一部の実施形態では、変更された定常領域を含む本明細書に記載の抗体のいずれか１つまたは複数は、変更されていない形態の定常領域のＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ活性の約０～５０％（例えば、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１％未満）を呈することができる。低減されたＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣを示す変化した定常領域を含む本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物は、低減されたＡＤＣＣおよび／もしくはＣＤＣ活性を呈し、またはＡＤＣＣおよび／もしくはＣＤＣ活性を全く呈しないものであることができる。
一部の実施形態では、本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物は、低減されたエフェクター機能を呈し、またはエフェクター機能を呈しない。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物は、Ｇ２／Ｇ４ハイブリッド定常領域などのハイブリッド定常領域、またはその部分を含む（例えば、バートンら（Ｂｕｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．）（１９９２）Ａｄｖ． Ｉｍｍｕｎ．５１：１－１８；キャンフィールドら（Ｃａｎｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．）（１９９１）Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７３：１４８３－１４９１；およびミュラーら（Ｍｕｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．）（１９９７）Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３４（６）：４４１－４５２を参照）。
一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物は、増進または低減された補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）を呈する変更された定常領域を含有し得る。モジュレートされたＣＤＣ活性は、抗体のＦｃ領域中に１つまたは複数のアミノ酸置換、挿入、または欠失を導入することにより達成することができる。例えば、米国特許第６，１９４，５５１号明細書を参照。
本明細書に記載の構築物および抗原結合アームは、部分的に、スキャフォールドドメイン、タンパク質、または部分、例えば、標的受容体結合活性を提供しないが、空間的組織化、構造的サポート、複数の受容体結合単位の連結の手段、または他の所望の特徴、例えば、向上した半減期を提供する構築物の部分またはドメインを提供することができる分子を含むことができる。様々なスキャフォールド技術および組成物は当該技術分野において公知であり、本明細書に記載の抗原結合単位に容易に連結またはコンジュゲート化させることができる。スキャフォールドドメイン、タンパク質、または部分は、抗体に由来し、または抗体に由来しないものであり得る。そのようなスキャフォールドタンパク質、およびそのドメインは、一般に、既存の抗原結合性タンパク質のコンビナトリアル化学ベースの適合を通じて得られる。
非抗体タンパク質スキャフォールドは、２つの構造的カテゴリー、ドメインサイズの構築物（６～２０ｋＤａの範囲内）、および制約されたペプチド（２～４ｋＤａの範囲内）に入ると考えることができる。ドメインサイズの非抗体スキャフォールドとしては、アフィボディ、アフィリン、アンチカリン、アトリマー、ＤＡＲＰｉｎ、ＦＮ３スキャフォールド（例えば、アドネクチンおよびセンチリン）、フィノマー、クニッツドメイン、プロネクチンならびにＯＢｏｄｙが挙げられるがそれに限定されない。ペプチドサイズの非抗体スキャフォールドとしては、例えば、アビマー、二環ペプチドおよびシステインノットが挙げられる。これらの非抗体スキャフォールドおよびそのベースまたは由来となる基礎タンパク質またはペプチドは、例えば、シメオン（Ｓｉｍｅｏｎ）およびチェン（Ｃｈｅｎ）， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｅｌｌ ９（１）：３－１４（２０１８）；バスケス－ロンバルディら（Ｖａｚｑｕｅｚ－Ｌｏｍｂａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．）， Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ ２０：１２７１－１２８３（２０１５）、およびビンツら（Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ．）， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２３：１２５７－１２６８（２００５）（それぞれの内容の全体を参照により本願明細書に援用する）により総説されている。非抗体スキャフォールドを使用する利点としては、増加した親和性、標的中和、および安定性が挙げられる。様々な非抗体スキャフォールドはまた、例えば、組織透過、より小さいサイズ、および熱安定性の点で、抗体スキャフォールドの制限の一部を克服することができる。一部の非抗体スキャフォールドはまた、例えば、二重特異性構築物が所望される場合の軽鎖会合の問題により邪魔されることなく、より容易な構築を許容することができる。非抗体スキャフォールド上に構築物を構築する方法は当業者に公知である。正式には抗体スキャフォールド上ではないが、そのような構築物は、多くの場合に、特異的な標的結合能力を提供する単一ドメイン抗体、ｓｃＦｖまたは他の抗体結合性ドメイン変種のいずれの形態にあるにせよ、抗体結合性ドメインを含む。
よって、本明細書に記載の任意の態様の一部の実施形態では、構築物は非抗体スキャフォールドタンパク質を含むことができる。本明細書に記載の任意の態様の一部の実施形態では、受容体結合単位の少なくとも１つは非抗体スキャフォールドタンパク質を含むことができる。非抗体スキャフォールドタンパク質のスキャフォールド部分は、一部の実施形態では、例えば、ヒト第１０フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（１０Ｆｎ３）に由来するアドネクチンスキャフォールドもしくは部分；ヒトリポカリンに由来するアンチカリンスキャフォールド（例えば、例えば国際公開第２０１５／１０４４０６号に記載されるものなど）；低比重関連タンパク質（ＬＲＰ）のＡドメインおよび／もしくは超低比重リポタンパク質受容体（ＶＬＤＬＲ）に由来するアビマースキャフォールドもしくはタンパク質断片；ＦＹＮチロシンキナーゼのＳＨ３ドメインのフィノマースキャフォールドもしくは部分；ヒトトリプシン阻害剤、アプロチニン（ウシ膵臓トリプシン阻害剤）、アルツハイマーのアミロイド前駆体タンパク質、および組織因子経路阻害剤などのクニッツ型プロテアーゼ阻害剤のクニッツドメインスキャフォールドもしくは部分；Ｅ．エラテリウム（Ｅ． ｅｌａｔｅｒｉｕｍ）からのトリプシン阻害剤に基づくものなどのノッチン（ｋｎｏｔｔｉｎ）スキャフォールド（システインノットミニプロテイン）；アフィボディスキャフォールドもしくはＳ．アウレウス（Ｓ． ａｕｒｅｕｓ）プロテインＡのＺドメインの全体もしくは部分；β－ヘアピン模倣体スキャフォールド；設計アンキリンリピートタンパク質（Ｄｅｓｉｇｎｅｄ ａｎｋｙｒｉｎ ｒｅｐｅａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＤＡＲＰｉｎ）スキャフォールドもしくはアンキリンリピート（ＡＲ）タンパク質に基づく人工的なタンパク質スキャフォールド；またはヒトトランスフェリン、ヒトＣＴＬＡ－４、ヒトクリスタリン、およびヒトユビキチンに由来しもしくはそれに基づく任意のスキャフォールドを含むことができることを当業者は理解する。例えば、ヒトトランスフェリン受容体用のヒトトランスフェリンの結合部位は、その一部が異なる抗原に対する親和性を獲得しているトランスフェリン変種の多様なライブラリーを作製するために多様化させることができる。例えば、アリら（Ａｌｉ ｅｔ ａｌ．）（１９９９）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４：２４０６６－２４０７３を参照。受容体との結合に関与しないヒトトランスフェリンの部分は、変化させないままであり、変種結合部位を提示するための、抗体のフレームワーク領域のようなスキャフォールドとして働く。ライブラリーは次に、抗体ライブラリーとして、および本明細書に記載の方法に従って、標的抗原について最適な選択性および親和性を有する変種を同定するために、目的の標的抗原に対してスクリーニングされる。例えば、ヘイら（Ｈｅｙ ｅｔ ａｌ．）（２００５）ＴＲＥＮＤＳ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２３（１０）：５１４－５２２を参照。
Ｄ．多重特異性抗原結合性構築物を製造する方法
本開示はまた、本明細書に記載の任意の多重特異性抗原結合性構築物を製造する方法を特徴とする。一部の実施形態では、本発明の構築物を製造する方法は、本明細書に記載されるような抗体、および／またはその断片を調製する方法を含む。そのような方法は当該技術分野において周知であり、例えば、適切な免疫原を用いて対象（例えば、非ヒト哺乳動物）を免疫化する工程を含むことができる。例えば、ＰＤ－１に結合する抗体を生成するために、当業者は、配列番号１１４に描写されるアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００５００９．２；ＵｎｉＰｒｏｔ Ｑ１５１１６）を含む全長ヒトＰＤ－１ポリペプチドなどの全長ＰＤ－１ポリペプチド、その抗原性断片、および／またはそのバリアントを用いて好適な対象（例えば、ラット、マウス、アレチネズミ、ハムスター、イヌ、ネコ、ブタ、ヤギ、ウマ、または非ヒト霊長動物などの非ヒト哺乳動物）を免疫化することができる。同様に、ＰＤ－１のリガンド（例えば、ＰＤ－Ｌ１）に結合する抗体を生成するために、当業者は、配列番号１１５に描写されるアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ ０５４８６２．１、ＵｎｉＰｒｏｔ Ｑ９ＮＺＱ７）を含む全長ヒトＰＤ－Ｌ１ポリペプチドなどの全長ＰＤ－Ｌ１ポリペプチド、その抗原性断片、および／またはそのバリアントを用いて好適な対象を免疫化することができる。同様に、ＰＤ－Ｌ２に結合する抗体を生成するために、当業者は、配列番号１１６に描写されるアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０７９５１５．２、ＵｎｉＰｒｏｔ Ｑ９ＢＱ５１）を含む全長ヒトＰＤ－Ｌ２ポリペプチドなどの全長ＰＤ－Ｌ２ポリペプチド、その抗原性断片、および／またはそのバリアントを用いて好適な対象を免疫化することができる。
当業者が認識するように、全長ポリペプチド（ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、またはＰＤ－Ｌ２）を抗原として使用することができ、抗体を所望の結合特性（例えば、ＰＤ－１／リガンド相互作用の遮断；ＰＤ－１およびそのリガンドが発現された細胞をブリッジ形成させる能力）についてスクリーニングすることができる。当業者がこれもまた認識するように、ポリペプチド（ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、またはＰＤ－Ｌ２）の抗原性断片は、ポリペプチドの既知の構造的特徴に基づいて選択することができる。例えば、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ２相互作用は構造的によく特徴付けられている（例えば、ザク、ケーら（Ｚａｋ， Ｋ．， ｅｔ ａｌ．）（２０１５） Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２３（１２）：２３４１－４８；ギオット、エムら（Ｇｈｉｏｔｔｏ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ．）（２０１０） Ｉｎｔ’ｌ Ｉｍｍｕｎｏ． ２２（８）：６５１－６０；フリーマン、ジー（Ｆｒｅｅｍａｎ， Ｇ．）（２００８） ＰＮＡＳ １０５（３０）：１０２７５－７６；ラザー－モルナー、イーら（Ｌａｚａｒ－Ｍｏｌｎａｒ， Ｅ． ｅｔ ａｌ．）（２００８） ＰＮＡＳ １０５：１０４８３－８８を参照；本願明細書に援用する）。そのため、当該技術分野において利用可能な受容体／リガンド境界面の情報に基づく、例えば、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、および／またはＰＤ－Ｌ２内の、領域を使用して、所望の結合特性を有する好適な抗原性断片を設計することができる。例えば、ＰＤ－１エクトドメインは、ＣＤ２８ファミリーに典型的な単一のＩｇＶドメインを含有し、ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２は、Ｂ７ファミリーに典型的なＩｇＶおよびＩｇＣドメインから構成される。ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１および／またはＰＤ－Ｌ２の構造は１：１の化学量論を示し、主にＩｇＶドメインの面間の相互作用を有する。ＩｇＶドメインは、ストランドを接続するループと共に９つの平行なベータストランド（ＡＢＣＣ’Ｃ’’ＤＥＦＧ）にオーガナイズされる約１２０個のアミノ酸を含む。ＰＤ－１は、フロントベータ面（ＧＦＣＣ’ストランドならびにＣＣ’、ＣＣ’’、およびＦＧループ）を使用してＰＤ－Ｌ１（ＧＦＣＣ’）またはＰＤ－Ｌ２（ＡＧＦＣストランドおよびＦＧループ）のベータ面に結合することが示されている。さらに、ＰＤ－１のＣ、Ｆ、およびＧストランドの６個のアミノ酸は、ＰＤ－Ｌ２のＦおよびＧストランドの他にＦＧループと相互作用するくぼんだ疎水性コアを形成する。ＰＤ－１への結合に関与する１４のうちの８個の残基は、ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２の間で同一であるか、または高度に保存されている。そのような情報を使用して、当業者は、望ましい特性を有する抗体を生成するために好適な抗原性領域を決定することができる。例えば、当業者は、両方のリガンドＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２と交差反応する抗体を生成することができる（例えば、米国特許第９８４５３５６号明細書を参照）。
好適な対象（例えば、非ヒト哺乳動物）は、哺乳動物による抗体の産生を誘発するために十分な回数のその後のブースター免疫化と共に適切な抗原を用いて免疫化することができる。免疫原は、アジュバントと共に対象（例えば、非ヒト哺乳動物）に投与することができる。対象における抗体の産生において有用なアジュバントとしては、タンパク質アジュバント；細菌アジュバント、例えば、細菌全体（ＢＣＧ、コリネバクテリウム・パルバム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）またはサルモネラ・ミネソタ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｍｉｎｎｅｓｏｔａ））、および、細胞壁骨格、トレハロースジミコール酸、モノホスホリルリピドＡ、結核菌（ｔｕｂｅｒｃｌｅ ｂａｃｉｌｌｕｓ）のメタノール抽出可能残留物（ＭＥＲ）、完全または不完全フロイントアジュバントを含む細菌成分；ウイルスアジュバント；化学的アジュバント、例えば、水酸化アルミニウム、およびヨード酢酸塩およびコレステリルヘミスクシネートが挙げられるがそれに限定されない。免疫応答を誘導する方法において使用することができる他のアジュバントとしては、例えば、コレラ毒素およびパラポックスウイルスタンパク質が挙げられる。ビーグら（Ｂｉｅｇ ｅｔ ａｌ．）（１９９９）Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ ３１（１）：１５－２４も参照。例えば、ロドメルら（Ｌｏｄｍｅｌｌ ｅｔ ａｌ．）（２０００）Ｖａｃｃｉｎｅ １８：１０５９－１０６６；ジョンソンら（Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．）（１９９９）Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ４２：４６４０－４６４９；バルドリッジら（Ｂａｌｄｒｉｄｇｅ ｅｔ ａｌ．）（１９９９）Ｍｅｔｈｏｄｓ １９：１０３－１０７；およびグプタら（Ｇｕｐｔａ ｅｔ ａｌ．）（１９９５）Ｖａｃｃｉｎｅ １３（１４）：１２６３－１２７６も参照。
一部の実施形態では、方法は、免疫原に結合するモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞株を調製することを含む。例えば、実験室マウスなどの好適な哺乳動物は、上記のようなポリペプチド（例えば、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２）または抗原性断片を用いて免疫化される。免疫化された哺乳動物の抗体産生細胞（例えば、脾臓のＢ細胞）は、免疫原の少なくとも１回のブースター免疫化の２～４日後に単離することができ、次に好適な骨髄腫細胞株の細胞との融合前に培養で短期間生育することができる。細胞は、例えば、ワクシニアウイルスまたはポリエチレングリコールなどの融合促進剤の存在下で融合させることができる。融合において得られたハイブリッド細胞はクローニングされ、所望の抗体を分泌する細胞クローンが選択される。例えば、好適な免疫原を用いて免疫化されたＢａｌｂ／ｃマウスの脾臓細胞は、骨髄腫細胞株ＰＡＩまたは骨髄腫細胞株Ｓｐ２／０－Ａｇ１４の細胞と融合させることができる。融合後、正常な骨髄腫細胞が所望のハイブリドーマ細胞より過成長することを防止するために定期的な間隔において選択培地、例えばＨＡＴ培地を添加した好適な培養培地中で細胞は拡大増殖される。得られたハイブリドーマ細胞は次に、所望の抗体、例えば、ＰＤ－１に結合する抗体の分泌についてスクリーニングされる。
一部の実施形態では、当業者は、例えば、米国特許第６，３００，０６４号明細書（ナピックら（Ｋｎａｐｐｉｋ ｅｔ ａｌ．）へ；Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ ＡＧ）およびショーンブロートら（Ｓｃｈｏｏｎｂｒｏｏｄｔ ｅｔ ａｌ．）（２００５） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３３（９）：ｅ８１に記載されるような非免疫バイアスライブラリーから抗ＰＤ－１抗体を同定することができる。
一部の実施形態では、本明細書に記載の方法は、例えば、ファージディスプレイ技術、細菌ディスプレイ、酵母表面ディスプレイ、真核ウイルスディスプレイ、哺乳動物細胞ディスプレイ、および無細胞（例えば、リボソームディスプレイ）抗体スクリーニング技術を伴い、またはそれと組み合わせて使用することができる（例えば、エッツら（Ｅｔｚ ｅｔ ａｌ．）（２００１）Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １８３：６９２４－６９３５；コーネリス（Ｃｏｒｎｅｌｉｓ）（２０００）Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １１：４５０－４５４；クレムら（Ｋｌｅｍｍ ｅｔ ａｌ．）（２０００）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １４６：３０２５－３０３２；キーケら（Ｋｉｅｋｅ ｅｔ ａｌ．）（１９９７）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． １０：１３０３－１３１０；イェンら（Ｙｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ．）（２００２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｐｒｏｇ． １８：２１２－２２０；ボーデルら（Ｂｏｄｅｒ ｅｔ ａｌ．）（２０００）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ３２８：４３０－４４４；グラベールら（Ｇｒａｂｈｅｒｒ ｅｔ ａｌ．）（２００１）Ｃｏｍｂ． Ｃｈｅｍ． Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎ ４：１８５－１９２；ミカエルら（Ｍｉｃｈａｅｌ ｅｔ ａｌ．）（１９９５）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ２：６６０－６６８；ペレボエフら（Ｐｅｒｅｂｏｅｖ ｅｔ ａｌ．）（２００１）Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７５：７１０７－７１１３；シャフィッツェルら（Ｓｃｈａｆｆｉｔｚｅｌ ｅｔ ａｌ．）（１９９９）Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３１：１１９－１３５；およびヘインズら（Ｈａｎｅｓ ｅｔ ａｌ．）（２０００）Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １８：１２８７－１２９２を参照）。
様々なファージディスプレイ法を使用して抗体を同定する方法は当該技術分野において公知である。ファージディスプレイ法において、機能的抗体ドメインは、それをコードするポリヌクレオチド配列を有するファージ粒子の表面上に提示される。そのようなファージは、レパートリーまたはコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えば、ヒトまたはマウス）から発現される、Ｆａｂ、Ｆｖ、またはジスルフィド結合安定化Ｆｖ抗体断片などの抗体の抗原結合性ドメインを提示するために利用することができる。これらの方法において使用されるファージは、典型的には、ｆｄおよびＭ１３などの糸状ファージである。抗原結合性ドメインは、ファージコートタンパク質ｐＩＩＩ、ｐＶＩＩＩ、またはｐＩＸのいずれかに対する組換え融合タンパク質として発現される。例えば、シら（Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．）（２０１０）ＪＭＢ ３９７：３８５－３９６を参照。本明細書に記載の免疫グロブリン、またはその断片を作るために使用することができるファージディスプレイ法の例としては、ブリンクマンら（Ｂｒｉｎｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．）（１９９５）Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ １８２：４１－５０；エイムスら（Ａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．）（１９９５）Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ １８４：１７７－１８６；ケトルボローら（Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ ｅｔ ａｌ．）（１９９４）Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２４：９５２－９５８；ペルシッチら（Ｐｅｒｓｉｃ ｅｔ ａｌ．）（１９９７）Ｇｅｎｅ １８７：９－１８；バートンら（Ｂｕｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．）（１９９４）Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５７：１９１－２８０；ならびにＰＣＴ国際公開第９０／０２８０９号、国際公開第９１／１０７３７号、国際公開第９２／０１０４７号、国際公開第９２／１８６１９号、国際公開第９３／１１２３６号、国際公開第９５／１５９８２号、および国際公開第９５／２０４０１号に開示されるものが挙げられる。好適な方法はまた、例えば、米国特許第５，６９８，４２６号明細書、同第５，２２３，４０９号明細書、同第５，４０３，４８４号明細書、同第５，５８０，７１７号明細書、同第５，４２７，９０８号明細書、同第５，７５０，７５３号明細書、同第５，８２１，０４７号明細書、同第５，５７１，６９８号明細書、同第５，４２７，９０８号明細書、同第５，５１６，６３７号明細書、同第５，７８０，２２５号明細書、同第５，６５８，７２７号明細書、同第５，７３３，７４３号明細書、および同第５，９６９，１０８号明細書に記載されている。
一部の実施形態では、ファージディスプレイ抗体ライブラリーは、免疫化された哺乳動物からのＢ細胞から収集されたｍＲＮＡを使用して生成することができる。例えば、Ｂ細胞を含む脾臓細胞試料を、上記のようにＰＤ－１ポリペプチドを用いて免疫化されたマウスから単離することができる。ｍＲＮＡを細胞から単離し、標準的な分子生物学技術を使用してｃＤＮＡに変換することができる。例えば、サムブルックら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．）（１９８９） “Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，” コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）［ニューヨーク所在］；ハーロウ（Ｈａｒｌｏｗ）およびレーン（Ｌａｎｅ）（１９８８）、上掲；ベニー、ケー、シー、ロ（Ｂｅｎｎｙ Ｋ． Ｃ． Ｌｏ）（２００４）、上掲；およびボレバエク（Ｂｏｒｒｅｂａｅｋ）（１９９５）、上掲を参照。免疫グロブリンの重鎖および軽鎖ポリペプチドの可変領域をコードするｃＤＮＡを使用して、ファージディスプレイライブラリーが構築される。そのようなライブラリーを生成する方法は、例えば、メルツら（Ｍｅｒｚ ｅｔ ａｌ．）（１９９５） Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｍｅｔｈｏｄｓ ６２（１－２）：２１３－９； ジ、ニロら（Ｄｉ Ｎｉｒｏ ｅｔ ａｌ．）（２００５） Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ３８８（Ｐｔ ３）：８８９－８９４；およびエンドベルグら（Ｅｎｇｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．）（１９９５） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ５１：３５５－３７６に記載されている。
一部の実施形態では、選択およびスクリーニングの組合せを用いて、例えば、ハイブリドーマ由来の抗体の集団またはファージディスプレイ抗体ライブラリーから、目的の抗体を同定することができる。好適な方法は当該技術分野において公知であり、例えば、フーゲンブーム（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ）（１９９７） Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １５：６２－７０；ブリンクマンら（Ｂｒｉｎｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．）（１９９５）、上掲；エイムスら（Ａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．）（１９９５）、上掲；ケトルボローら（Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ ｅｔ ａｌ．）（１９９４）、上掲；ペルシッチら（Ｐｅｒｓｉｃ ｅｔ ａｌ．）（１９９７）、上掲；およびバートンら（Ｂｕｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．）（１９９４）、上掲に記載されている。例えば、バクテリオファージコートタンパク質（例えば、Ｍ１３ファージのｐＩＩＩ、ｐＶＩＩＩ、またはｐＩＸ）および異なる抗原組合せ領域の融合タンパク質をそれぞれコードする複数のファージミドベクターが標準的な分子生物学技術を使用して製造され、次に細菌（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））の集団に導入される。細菌中でのバクテリオファージの発現は、一部の実施形態では、ヘルパーファージの使用を必要とし得る。一部の実施形態では、ヘルパーファージは必要とされない（例えば、チャスティーンら（Ｃｈａｓｔｅｅｎ ｅｔ ａｌ．）（２００６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３４（２１）：ｅ１４５を参照）。細菌から産生されるファージを回収し、次にそれを、例えば、（固定化された）固体支持体に結合した標的抗原に接触させる。ファージはまた、溶液中の抗原に接触させることができ、複合体をその後に固体支持体に結合させる。
上記の方法を使用してスクリーニングされた抗体の亜集団は、当該技術分野において公知の任意の免疫学的または生化学ベースの方法を使用して具体的な抗原（例えば、ヒトＰＤ－１）に対する特異性および結合親和性について特徴付けることができる。例えば、抗体のＰＤ－１への特異的結合は、例えば、上記のようにＥＬＩＳＡアッセイ、ＳＰＲアッセイ、免疫沈降アッセイ、アフィニティークロマトグラフィー、および平衡透析などであるがそれに限定されない免疫学的または生化学ベースの方法を使用して決定することができる。抗体の免疫特異的結合および交差反応性を解析するために使用することができるイムノアッセイとしては、ウエスタンブロット、ＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ（酵素連結免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体固定化アッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ、蛍光イムノアッセイ、およびプロテインＡイムノアッセイなどの技術を使用する競合および非競合アッセイ系が挙げられるがそれに限定されない。そのようなアッセイは慣例的であり、当該技術分野において周知である。
上記の方法を使用して、例えば、抗ＰＤ－１抗体が全長の、ヒトＰＤ－１および／またはＰＤ－１タンパク質に結合しないかどうかを決定することもできることが理解される。
選択されたＣＤＲアミノ酸配列が短鎖配列（例えば、１０～１５未満のアミノ酸の長さ）である実施形態では、ＣＤＲをコードする核酸は、例えば、シライシら（Ｓｈｉｒａｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．）（２００７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ ５１（１）：１２９－１３０および米国特許第６，９９５，２５９号明細書に記載されるように化学的に合成することができる。アクセプター抗体をコードする所与の核酸配列について、ＣＤＲをコードする核酸配列の領域は、標準的な分子生物学技術を使用して化学的に合成された核酸で置き換えることができる。化学的に合成された核酸の５’および３’末端は、ドナー抗体の可変領域をコードする核酸への核酸のクローニングにおいて使用するために付着末端制限酵素部位を含むように合成することができる。代替的に、一緒になって抗体をコードすることができる化学的に合成された核酸の断片は、当該技術分野において公知のＤＮＡアセンブリー技術（例えば、ギブソンアセンブリー）を使用して接合させることができる。
選ばれた任意の抗体は、本明細書に記載されるような抗原結合性断片を生成するためにさらに改変し、および／または本明細書に記載されるような多重特異性抗原結合性構築物を生成するために当該技術分野において公知の技術を使用してマニピュレートすることができる。例えば、例えば米国特許第４，４３３，０５９号明細書に記載されるように、アミン反応性基およびスルフヒドリル反応性基を有するヘテロ二官能性試薬を使用して二重特異性構造を生成するために架橋方法を使用することができ；例えば、米国特許第４，４４４，８７８号明細書に記載されるように、２つの重鎖の間のジスルフィド結合の還元および酸化のサイクルを通じて異なる抗体から半抗体（重鎖－軽鎖ペアまたはＦａｂ）を再結合することにより二重特異性抗体決定因子を生成することができ；例えば、米国特許第５，２７３，７４３号明細書に記載されるように、スルフヒドリル（ｓｕｌｆｈｄｒｙｌ）反応性基を通じて三機能性抗体、例えば、３つのＦａｂ’断片を架橋することができる。二重特異性構築物を生成する他の方法、例えば、共通の軽鎖を有する二重特異性構築物を生成する方法は本明細書に記載されている。本明細書に記載の構築物において使用される共通の軽鎖のアミノ酸配列の非限定的な例としては、配列番号５９～６３が挙げられる。
Ｅ．多重特異性抗原結合性構築物の発現および精製
本明細書に記載のその多重特異性抗原結合性構築物は、分子生物学およびタンパク質化学の技術分野において公知の様々な技術を使用して製造することができる。例えば、多重特異性抗原結合性構築物をコードする核酸（単一の多機能性ポリペプチドとして、またはマルチマー複合体の別々の分子として、例えば、他の抗原結合アームから別々に１つの抗原結合アームとして）は、転写および翻訳調節配列を含有する発現ベクターに挿入することができ、該配列としては、例えば、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始および終止配列、翻訳開始および終止配列、転写ターミネーターシグナル、ポリアデニル化シグナル、ならびにエンハンサーまたは活性化因子配列が挙げられる。調節配列としては、プロモーターならびに転写開始および終止配列が挙げられる。追加的に、発現ベクターは、２つの異なる生物中、例えば、発現のために哺乳動物または昆虫細胞中ならびにクローニングおよび増幅のために原核性宿主中で維持することができるように、１つより多くの複製システムを含むことができる。
哺乳動物細胞中での核酸からのクローニングされた重鎖および軽鎖ポリペプチドの発現のためにいくつかの可能なベクターシステムが利用可能である。ベクターの１つのクラスは、所望の遺伝子配列の宿主細胞ゲノムへの組込みに依拠する。安定的に組み込まれたＤＮＡを有する細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｇｐｔ（ムリガン（Ｍｕｌｌｉｇａｎ）およびバーグ（Ｂｅｒｇ）（１９８１）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７８：２０７２）またはＴｎ５ ｎｅｏ（サザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）およびバーグ（Ｂｅｒｇ）（１９８２）Ｍｏｌ． Ａｐｐｌ． Ｇｅｎｅｔ． １：３２７）などの薬物抵抗性遺伝子を同時に導入することにより選択することができる。選択マーカー遺伝子は、発現されるべきＤＮＡ遺伝子配列に連結させるか、または共トランスフェクションにより同じ細胞に導入するかのいずれかとすることができる（ウィグラーら（Ｗｉｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．）（１９７９）Ｃｅｌｌ １６：７７）。ベクターの第２のクラスは、染色体外プラスミドに自律複製能力を付与するＤＮＡエレメントを利用する。これらのベクターは、ウシパピローマウイルス（サーバーら（Ｓａｒｖｅｒ ｅｔ ａｌ．）（１９８２）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７９：７１４７）、サイトメガロウイルス、ポリオーマウイルス（ディーンズら（Ｄｅａｎｓ ｅｔ ａｌ．）（１９８４）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１：１２９２）、またはＳＶ４０ウイルス（ルスキー（Ｌｕｓｋｙ）およびボッチャン（Ｂｏｔｃｈａｎ）（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ２９３：７９）などの動物ウイルスに由来することができる。
発現ベクターは、核酸のその後の発現のために好適な方式で細胞に導入することができる。導入の方法は、概ね、以下に議論される標的化される細胞種により定められる。例示的な方法としては、ＣａＰＯ４沈殿、リポソーム融合、陽イオン性リポソーム、エレクトロポレーション、ウイルス感染、デキストラン媒介性トランスフェクション、ポリブレン媒介性トランスフェクション、プロトプラスト融合、および直接微量注射が挙げられる。
抗体またはその抗原結合性断片の発現用の適切な宿主細胞としては、酵母、細菌、昆虫、植物、および哺乳動物細胞が挙げられる。具体的に関心が持たれるものとしては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）およびピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）などの真菌、ＳＦ９などの昆虫細胞、哺乳動物細胞株（例えば、ヒト細胞株）の他に、初代細胞株である。
一部の実施形態では、抗体またはその断片は、トランスジェニック動物（例えば、トランスジェニック哺乳動物）中で発現させ、そこから精製することができる。例えば、抗体は、例えば、ホーデビン（Ｈｏｕｄｅｂｉｎｅ）（２００２）Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １３（６）：６２５－６２９；ファン・クイク－ロメイジュンら（ｖａｎ Ｋｕｉｋ－Ｒｏｍｅｉｊｎ ｅｔ ａｌ．）（２０００）Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ． ９（２）：１５５－１５９；およびポロックら（Ｐｏｌｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ．）（１９９９）Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３１（１－２）：１４７－１５７に記載されるように、トランスジェニック非ヒト哺乳動物（例えば、齧歯動物）中で産生され、ミルクから単離することができる。
抗体およびその断片は、タンパク質の発現を可能とするために十分な条件下、および期間、抗体または断片をコードする核酸を含有する発現ベクターを用いて形質転換された宿主細胞を培養することにより細胞から産生させることができる。タンパク質発現のためのそのような条件は、発現ベクターおよび宿主細胞の選択と共に変動し、慣例的な実験を通じて当業者により容易に確認される。例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で発現された抗体は、封入体から再フォールディングさせることができる（例えば、ホウら（Ｈｏｕ ｅｔ ａｌ．）（１９９８）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ １０：３１９－３０を参照）。細菌発現システムおよびその使用方法は当該技術分野において公知である（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、ウィリー・アンド・サンズ（Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）；ならびにＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ－－Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ３ｒｄ Ｅｄ．， コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）［ニューヨーク所在］（２００１）を参照）。コドン、好適な発現ベクターおよび好適な宿主細胞の選択は多数の要因に依存して変動し、必要に応じて容易に最適化することができる。本明細書に記載の抗体（またはその断片）は、哺乳動物細胞中または酵母、バキュロウイルス、およびｉｎ ｖｉｔｒｏ発現システムが挙げられるがそれに限定されない他の発現システム中で発現させることができる（例えば、カスズブスカら（Ｋａｓｚｕｂｓｋａ ｅｔ ａｌ．）（２０００） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ １８：２１３－２２０を参照）。
発現後に、抗体およびその断片を単離することができる。抗体またはその断片は、どんな他の成分が試料中に存在するのかに依存して当該技術分野において公知の様々なやり方において単離または精製することができる。標準的な精製方法としては、電気泳動、分子、免疫学的、およびクロマトグラフィー技術が挙げられ、クロマトグラフィー技術としては、イオン交換、疎水性、アフィニティー、および逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィーが挙げられる。例えば、抗体は、標準的な抗抗体カラム（例えば、プロテインＡまたはプロテインＧカラム）を使用して精製することができる。タンパク質濃縮と組み合わせて限外濾過およびダイアフィルトレーション技術もまた有用である。例えば、スコープス（Ｓｃｏｐｅｓ）（１９９４）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ， ３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， シュプリンガー・フェアラーク（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ）［米国ニューヨーク州ニューヨーク市（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｃｉｔｙ）所在］を参照。必要な精製の程度は所望の使用に依存して変動する。一部の事例では、発現された抗体またはその断片の精製は必要でない。
精製された抗体またはその断片の収率または純度を決定する方法は当該技術分野において公知であり、例えば、ブラッドフォードアッセイ、ＵＶ分光法、ビウレットタンパク質アッセイ、ローリータンパク質アッセイ、アミドブラックタンパク質アッセイ、高圧力液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、質量分析（ＭＳ）、およびゲル電気泳動方法（例えば、クマシーブルーまたはコロイド銀染色剤などのタンパク質染色剤を使用する）が挙げられる。
Ｆ．多重特異性抗原結合性構築物の修飾
多重特異性抗原結合性構築物は、単一の多機能性ポリペプチドとしてまたはマルチマー複合体の別々の分子として、例えば、他の抗原結合性アームから別々に１つの抗原結合性アームとして、それらの発現および精製後に修飾することができる。修飾は、共有結合または非共有結合修飾であることができる。そのような修飾は、例えば、ポリペプチドの標的化されたアミノ酸残基を、選択された側鎖または末端残基と反応することができる有機誘導体化剤と反応させることにより抗体または抗原結合性断片に導入することができる。修飾のために好適な部位は、例えば、抗体または断片の構造解析またはアミノ酸配列解析を含む様々な基準のいずれかを使用して選ぶことができる。
本明細書において提供されるアミノ酸配列は、３文字アミノ酸コードと交換可能に使用され得る１文字アミノ酸コードにおいて示される。アミノ酸は、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に組み込まれ得る任意の単量体単位を指す。２０個の天然のまたは遺伝学的にコードされるアルファ－アミノ酸は以下の通りである：アラニン（ＡｌａまたはＡ）、アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）、アスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）、アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）、システイン（ＣｙｓまたはＣ）、グルタミン（ＧｌｎまたはＱ）、グルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）、グリシン（ＧｌｙまたはＧ）、ヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）、イソロイシン（ＩｌｅまたはＩ）、ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）、リジン（ＬｙｓまたはＫ）、メチオニン（ＭｅｔまたはＭ）、フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）、プロリン（ＰｒｏまたはＰ）、セリン（ＳｅｒまたはＳ）、スレオニン（ＴｈｒまたはＴ）、トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）、チロシン（ＴｙｒまたはＹ）、およびバリン（ＶａｌまたはＶ）。これらの２０個の天然アミノ酸の構造は、例えば、ストライアーら（Ｓｔｒｙｅｒ ｅｔ ａｌ．）， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ５ｔｈ ｅｄ．， フリーマン・アンド・カンパニー（Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ）（２００２）に示されている。アミノ酸という用語はまた、非天然アミノ酸、修飾アミノ酸（例えば、修飾された側鎖および／または骨格を有する）、ならびにアミノ酸アナログを含む。
２つまたはそれより多くの核酸またはポリペプチド配列の文脈における同一のまたは同一性パーセントという用語は、以下の配列比較アルゴリズムの１つを使用してまたは手動のアライメントおよび目視検査により測定されるような比較ウインドウ、または指定された領域にわたり最大一致のために比較およびアライメントされた場合に、同じであるか、または同じであるヌクレオチドもしくはアミノ酸残基の指定されたパーセンテージ（例えば、指定された領域にわたり９０％、もしくは９５％もしくはより高い同一性）を有する２つまたはそれより多くの配列または部分配列を指す。
配列に関する同一性または類似性は、配列をアライメントし、必要な場合にはギャップを導入して最大の配列同一性パーセントを達成した後の、出発アミノ酸残基と同一（すなわち、同じ残基）の候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。比較用の配列のアライメントの方法は当該技術分野において周知である。比較用の配列の最適なアライメントは、例えば、スミス（Ｓｍｉｔｈ）およびウォーターマン（Ｗａｔｅｒｍａｎ）（Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ． ２：４８２， １９７０）の局所相同性アルゴリズムにより、ニードルマン（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ）およびブンシュ（Ｗｕｎｓｃｈ）（Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８：４４３， １９７０）の相同性アライメントアルゴリズムにより、ピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）およびリップマン（Ｌｉｐｍａｎ）（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：２４４４， １９８８）の類似性検索法により、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実施態様（例えば、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， ［米国ウィスコンシン州５７５サイエンス、ドクターマジソン（５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．， Ｍａｄｉｓｏｎ）所在］）により、または手動のアライメントおよび目視検査により実行することができる（例えば、オーズベルら（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．）， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （１９９５ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）を参照）。
断片を含む、全てのペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質と同様に、抗体またはその抗原結合性断片の性質も機能も変更しない、例えば、重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域中の、本明細書に記載の構築物、抗体またはその抗原結合性部分のアミノ酸配列中の追加の改変が起こり得ることが理解される。そのような改変としては、各言及される配列が１つまたは複数の保存的アミノ酸置換を任意選択で含有するような保存的アミノ酸置換が挙げられる。以下の群は、互いに保存的置換であるアミノ酸をそれぞれ含有する。これらの群は例示的であり、他の保存的置換が当業者に公知である。
１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；
７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、および
８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）
例として、特定の残基におけるアスパラギン酸が述べられる場合、該残基における保存的置換、例えば、グルタミン酸もまた想定される。非保存的置換、例えば、グリシンでのプロリンの置換もまた想定される。
一部の実施形態では、構築物、抗体またはその抗原結合性部分は、異種部分に対してコンジュゲート化され得る。異種部分は、例えば、異種ポリペプチド、治療剤（例えば、毒素もしくは薬物）、または検出可能な標識であることができ、検出可能な標識は、放射性標識、酵素標識、蛍光標識、重金属標識、発光標識、またはビオチンもしくはストレプトアビジンなどのアフィニティータグなどであるがそれに限定されない。好適な異種ポリペプチドとしては、例えば、抗体または断片の精製において使用するための抗原性タグ（例えば、ＦＬＡＧ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）（配列番号１１７）、ポリヒスチジン（６－Ｈｉｓ；ＨＨＨＨＨＨ）（配列番号１１８）、ヘマグルチニン（ＨＡ；ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ）（配列番号１１９）、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、またはマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ））が挙げられる。異種ポリペプチドとしてはまた、診断用のまたは検出可能なマーカーとして有用なポリペプチド（例えば、酵素）、例えば、ルシフェラーゼ、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ））、またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）が挙げられる。好適な放射性標識としては、例えば、３２Ｐ、３３Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、および３Ｈが挙げられる。好適な蛍光標識としては、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標） ４８８、フィコエリトリン（ＰＥ）、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、ＰｅｒＣＰ、ＰＥ－ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（登録商標） ７００、Ｃｙ５、アロフィコシアニン、およびＣｙ７が挙げられるがそれに限定されない。発光標識としては、例えば、様々な発光性ランタニド（例えば、ユウロピウムまたはテルビウム）キレートのいずれかが挙げられる。例えば、好適なユウロピウムキレートとしては、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）またはテトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０－四酢酸（ＤＯＴＡ）のユウロピウムキレートが挙げられる。酵素標識としては、例えば、アルカリホスファターゼ、ＣＡＴ、ルシフェラーゼ、および西洋ワサビペルオキシダーゼが挙げられる。
２つのタンパク質（例えば、抗体および異種部分）は、多数の公知の化学架橋剤のいずれかを使用して架橋することができる。そのような架橋剤の例は、「ヒンダード」（ｈｉｎｄｅｒｅｄ）ジスルフィド結合を含む連結を介して２つのアミノ酸残基を連結するものである。これらの連結において、架橋単位内のジスルフィド結合は、例えば、還元されたグルタチオンまたは酵素ジスルフィドレダクターゼの作用により、還元から保護される（ジスルフィド結合のいずれかの側の基を邪魔することによる）。１つの好適な試薬、４－スクシンイミジルオキシカルボニル－α－メチル－α（２－ピリジルジチオ）トルエン（ＳＭＰＴ）は、タンパク質の１つにおける末端リシンおよび他方における末端システインを利用して２つのタンパク質間にそのような連結を形成する。各タンパク質上の異なるカップリング部分により架橋するヘテロ二官能性試薬もまた使用することができる。他の有用なクロスリンカーとしては、２つのアミノ基（例えば、Ｎ－５－アジド－２－ニトロベンゾイルオキシスクシンイミド）、２つのスルフヒドリル基（例えば、１，４－ビス－マレイミドブタン）、アミノ基およびスルフヒドリル基（例えば、ｍ－マレイミドベンゾイル－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル）、アミノ基およびカルボキシル基（例えば、４－［ｐ－アジドサリチルアミド］ブチルアミン）、ならびにアミノ基およびアルギニンの側鎖中に存在するグアニジニウム基（例えば、ｐ－アジドフェニルグリオキサール一水和物）を連結する試薬が挙げられるがそれに限定されない。
一部の実施形態では、放射性標識は、抗体のアミノ酸骨格に直接的にコンジュゲート化させることができる。代替的に、放射性標識は、タンパク質骨格に結合しているより大きい分子（例えば、関係のあるタンパク質のメタ－ヨードフェニル（ｍＩＰ）誘導体を形成するために遊離アミノ基に結合するメタ－［１２５Ｉ］ヨードフェニル－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（［１２５Ｉ］ｍＩＰＮＨＳ中の１２５Ｉ（例えば、ロジャーズら（Ｒｏｇｅｒｓ ｅｔ ａｌ．）（１９９７）Ｊ． Ｎｕｃｌ． Ｍｅｄ． ３８：１２２１－１２２９を参照）またはキレート（例えば、ＤＯＴＡもしくはＤＴＰＡ）の部分として含めることができる。放射性標識またはそれを含有するより大きい分子／キレートを本明細書に記載の抗体または抗原結合性断片にコンジュゲート化する方法は当該技術分野において公知である。そのような方法は、放射性標識またはキレートのタンパク質への結合を促す条件（例えば、ｐＨ、塩濃度、および／または温度）下でタンパク質を放射性標識とインキュベートすることを伴う（例えば、米国特許第６，００１，３２９号明細書を参照）。
蛍光標識（「フルオロフォア」と称されることがある）をタンパク質（例えば、抗体）にコンジュゲート化する方法はタンパク質化学の技術分野において公知である。例えば、フルオロフォアは、フルオロフォアに取り付けられたスクシンイミジル（ＮＨＳ）エステルまたはテトラフルオロフェニル（ＴＦＰ）エステル部分を使用してタンパク質の（例えば、リシンの）遊離アミノ基または（例えば、システインの）スルフヒドリル基にコンジュゲート化することができる。一部の実施形態では、フルオロフォアは、スルホ－ＳＭＣＣなどのヘテロ二官能性クロスリンカー部分にコンジュゲート化することができる。好適なコンジュゲーション方法は、フルオロフォアのタンパク質への結合を促す条件下で抗体タンパク質またはその断片をフルオロフォアとインキュベートすることを伴う。例えば、ウェルチ（Ｗｅｌｃｈ）およびレドバンリー（Ｒｅｄｖａｎｌｙ）（２００３）”Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ：Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”， ジョン・ウィリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ）（ＩＳＢＮ ０４７１４９５６０３）を参照。
一部の実施形態では、抗体または断片は、例えば、循環中、例えば、血液、血清、または他の組織中の抗体の安定化および／または保持を向上させる部分を用いて修飾することができる。例えば、抗体または断片は、例えば、リーら（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．）（１９９９）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ． Ｃｈｅｍ． １０（６）：９７３－８；キンストラーら（Ｋｉｎｓｔｌｅｒ ｅｔ ａｌ．）（２００２）Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｉｅｓ Ｒｅｖｉｅｗｓ ５４：４７７－４８５；およびロバーツら（Ｒｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．）（２００２）Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｉｅｓ Ｒｅｖｉｅｗｓ ５４：４５９－４７６に記載されるようにＰＥＧ化、またはＨＥＳ化（フレゼニウス・カビ（Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ Ｋａｂｉ）、ドイツ）（例えば、パヴィシッチら（Ｐａｖｉｓｉｃ ｅｔ ａｌ．）（２０１０）Ｉｎｔ． Ｊ． Ｐｈａｒｍ． ３８７（１－２）：１１０－１１９を参照）することができる。安定化部分は、少なくとも、例えば、１．５（例えば、少なくとも２、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、または５０またはより大きい）倍数だけ抗体（または断片）の安定性、または保持を向上させることができる。
一部の実施形態では、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合性断片は、グリコシル化されることができる。一部の実施形態では、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合性断片は、抗体または断片が低減されたグリコシル化を有するまたはグリコシル化を有しないように、酵素もしくは化学処理に供し、または細胞から製造することができる。低減されたグリコシル化を有する抗体を製造する方法は当該技術分野において公知であり、例えば、米国特許第６，９３３，３６８号明細書；ライトら（Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．）（１９９１）ＥＭＢＯ Ｊ． １０（１０）：２７１７－２７２３；およびコら（Ｃｏ ｅｔ ａｌ．）（１９９３）Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３０：１３６１に記載されている。一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は非グリコシル化されている。
Ｇ．医薬組成物および製剤
本開示はまた、本明細書に開示される方法と共に使用される薬学的に許容される希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、防腐剤および／またはアジュバントと共に本開示の多重特異性抗原結合性構築物を含む医薬組成物を提供する。そのような医薬組成物は、本明細書に開示されるように、例えば、がんを有する対象において使用され得る。
ある特定の実施形態では、許容される製剤材料は、好ましくは、用いられる投与量および濃度においてレシピエントに対して非毒性である。ある特定の実施形態では、製剤材料はｓ．ｃ．および／またはＩ．Ｖ．投与用である。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、組成物の例えば、ｐＨ、重量オスモル濃度、粘度、透明性、色、等張性、匂い、無菌状態、安定性、溶解もしくは放出の速度、吸着または透過を改変、維持または保存するための製剤材料を含有することができる。ある特定の実施形態では、好適な製剤材料としては、アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンもしくはリシン）；抗菌物質；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウムもしくは亜硫酸水素ナトリウム）；緩衝剤（例えば、ボレート、ビカルボネート、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、シトレート、ホスフェートもしくは他の有機酸）；充填剤（例えば、マンニトールもしくはグリシン）；キレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））；錯化剤（例えば、カフェイン、ポリビニルピロリドン、ベータ－シクロデキストリンもしくはヒドロキシプロピル－ベータ－シクロデキストリン）；充填剤；単糖、二糖、および他の炭水化物（例えば、グルコース、マンノースもしくはデキストリン）；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンもしくは免疫グロブリン）；着色、香味および希釈剤；乳化剤；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；低分子量ポリペプチド；塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）；防腐剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸もしくは過酸化水素）；溶剤（例えば、グリセリン、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコール）；糖アルコール（例えば、マンニトールもしくはソルビトール）；懸濁化剤；界面活性剤もしくは湿潤剤（例えば、プルロニック、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０などのポリソルベート、ｔｒｉｔｏｎ、トロメタミン、レシチン、コレステロール、ｔｙｌｏｘａｐａｌ）；安定性増進剤（例えば、スクロースもしくはソルビトール）；張度増進剤（例えば、ハロゲン化アルカリ金属、好ましくは、塩化ナトリウムもしくはカリウム、マンニトール、ソルビトール）；送達溶媒；希釈剤；賦形剤ならびに／または薬学的アジュバントが挙げられるがそれに限定されない。（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， エー、アール、ゲンナロ（Ａ． Ｒ． Ｇｅｎｎａｒｏ）編， マックパブリッシングカンパニー（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ）（１９９５）。ある特定の実施形態では、製剤は、ＰＢＳ；２０ｍＭのＮａＯＡＣ、ｐＨ５．２、５０ｍＭのＮａＣｌ；および／または１０ｍＭのＮＡＯＡＣ、ｐＨ５．２、９％のスクロースを含む。ある特定の実施形態では、最適な医薬組成物は、例えば、投与の意図される経路、送達フォーマットおよび所望の投与量に依存して、当業者により決定される。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、上掲を参照。ある特定の実施形態では、そのような組成物は、多重特異性抗原結合性構築物の物理的状態、安定性、ｉｎ ｖｉｖｏ放出の速度および／またはｉｎ ｖｉｖｏクリアランスの速度に影響を及ぼし得る。
ある特定の実施形態では、医薬組成物中の主要な溶媒または担体は、水性または非水性のいずれかの性質であることができる。例えば、ある特定の実施形態では、好適な溶媒または担体は、場合により非経口投与用の組成物において一般的な他の材料を添加した、注射用の水、生理食塩水溶液または人工脳脊髄液であることができる。ある特定の実施形態では、生理食塩水は等張リン酸緩衝生理食塩水を含む。ある特定の実施形態では、血清アルブミンと混合された中性の緩衝生理食塩水または生理食塩水はさらなる例示的な溶媒である。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、約ｐＨ７．０～８．５のＴｒｉｓ緩衝液、または約ｐＨ４．０～５．５の酢酸緩衝液を含み、これらはソルビトールまたはしたがって（ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ）好適な代替物をさらに含むことができる。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される多重特異性抗原結合性構築物を含む組成物は、凍結乾燥ケーキまたは水性溶液の形態において所望の純度を有する選択された組成物を任意選択の製剤物質と混合することにより貯蔵用に調製することができる（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、上掲）。さらに、ある特定の実施形態では、本明細書に開示される多重特異性抗原結合性構築物を含む組成物は、スクロースなどの適切な賦形剤を使用して凍結乾燥物として製剤化することができる。
ある特定の実施形態では、医薬組成物は、非経口送達用に選択することができる。ある特定の実施形態では、組成物は、吸入用または経口的などの消化管を通じた送達用に選択することができる。そのような薬学的に許容される組成物の調製は当業者の能力の範囲内である。
ある特定の実施形態では、製剤成分は、投与の部位にとって許容される濃度において存在する。ある特定の実施形態では、生理的ｐＨまたはわずかにより低いｐＨ、典型的には、約５～約８のｐＨ範囲内に組成物を維持するために緩衝剤が使用される。
非経口投与が想定される場合のある特定の実施形態では、治療用組成物は、薬学的に許容される溶媒中に多重特異性抗原結合性構築物を含む、発熱物質非含有の非経口的に許容される水性溶液の形態であることができる。ある特定の実施形態では、非経口注射用の溶媒は、多重特異性抗原結合性構築物がその中に無菌の等張溶液として製剤化され、適切に保存される無菌の蒸留水である。ある特定の実施形態では、調製物は、次にデポー注射を介して送達することができる製造物の制御または持続放出を提供することができる、注射可能なマイクロスフェア、生体内分解性粒子、ポリマー化合物（例えば、ポリ乳酸もしくはポリグリコール酸）、ビーズまたはリポソームなどの剤を含む所望の分子の製剤を伴うことができる。ある特定の実施形態では、ヒアルロン酸もまた使用することができ、これは、循環中の持続期間を促進する効果を有することができる。ある特定の実施形態では、所望の分子を導入するために、埋込み可能な薬物送達デバイスを使用することができる。
ある特定の実施形態では、医薬組成物は吸入用に製剤化することができる。ある特定の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物は、吸入用の乾燥粉末として製剤化することができる。ある特定の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物を含む吸入溶液は、エアロゾル送達用の噴射剤を用いて製剤化することができる。ある特定の実施形態では、溶液を噴霧することができる。肺投与は、化学的に修飾されたタンパク質の肺送達を記載するＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ９４／００１８７５号にさらに記載されている。
ある特定の実施形態では、製剤は経口的に投与できることが想定される。ある特定の実施形態では、この様式において投与される多重特異性抗原結合性構築物は、錠剤およびカプセルなどの固体投与形態の配合において慣習的に使用される担体を用いてまたは用いずに製剤化することができる。ある特定の実施形態では、バイオアベイラビリティが最大化され、前全身性分解が最小化される胃腸管中の点において製剤の活性部分を放出するようにカプセルを設計することができる。ある特定の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物の吸収を促すために少なくとも１つの追加の剤を含めることができる。ある特定の実施形態では、希釈剤、香味剤、低融点ワックス、植物油、潤滑剤、懸濁化剤、錠剤崩壊剤、および結合剤もまた用いることができる。
ある特定の実施形態では、医薬組成物は、錠剤の生産のために好適な非毒性の賦形剤との混合状態の有効量の多重特異性抗原結合性構築物を伴うことができる。ある特定の実施形態では、無菌水または別の適切な溶媒中に錠剤を溶解することにより、溶液を単位用量形態において調製することができる。ある特定の実施形態では、好適な賦形剤としては、炭酸カルシウム、炭酸もしくは重炭酸ナトリウム、ラクトース、もしくはリン酸カルシウムなどの不活性希釈剤；またはデンプン、ゼラチン、もしくはアカシアなどの結合剤；またはステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、もしくはタルクなどの潤滑剤が挙げられるがそれに限定されない。
追加の医薬組成物が当業者に明らかであり、これには、持続または制御送達製剤中の多重特異性抗原結合性構築物を伴う製剤が含まれる。ある特定の実施形態では、リポソーム担体、生体内分解性マイクロ粒子または多孔性ビーズおよびデポー注射などの、様々な他の持続または制御送達手段を製剤化するための技術もまた当業者に公知である。例えば、医薬組成物の送達用の多孔性ポリマーマイクロ粒子の制御放出を記載するＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ９３／００８２９号を参照。ある特定の実施形態では、持続放出調製物は、成形物品、例えば、フィルム、またはマイクロカプセルの形態の半透性ポリマーマトリックスを含むことができる。持続放出マトリックスは、ポリエステル、ハイドロゲル、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号明細書および欧州特許第０５８，４８１号明細書）、Ｌ－グルタミン酸およびガンマエチル－Ｌ－グルタメートのコポリマー（シドマンら（Ｓｉｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．）Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２２：５４７－５５６（１９８３））、ポリ（２－ヒドロキシエチル－メタクリレート）（ランガーら（Ｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｍａｔｅｒ． Ｒｅｓ． １５：１６７－２７７（１９８１）；およびランガー（Ｌａｎｇｅｒ）Ｃｈｅｍ． Ｔｅｃｈ． １２：９８－１０５（１９８２））、エチレン酢酸ビニル（ランガーら（Ｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．）、上掲）またはポリ－Ｄ（－）－３－ヒドロキシ酪酸（欧州特許第１３３，９８８号明細書）を含むことができる。ある特定の実施形態では、持続放出組成物はまた、当該技術分野において公知のいくつかの方法のいずれかにより調製できるリポソームを含むことができる（例えば、エプスタインら（Ｅｐｐｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８２：３６８８－３６９２（１９８５）；欧州特許第０３６，６７６号明細書；欧州特許第０８８，０４６号明細書；および欧州特許第１４３，９４９号明細書を参照）。
ｉｎ ｖｉｖｏ投与のために使用される医薬組成物は典型的には無菌である。ある特定の実施形態では、これは、無菌濾過膜を通じた濾過により達成される。ある特定の実施形態では、組成物が凍結乾燥される場合、この方法を使用する滅菌は、凍結乾燥および再構成の前または後のいずれかにおいて実行することができる。ある特定の実施形態では、非経口投与用の組成物は、凍結乾燥形態でまたは溶液中に貯蔵することができる。ある特定の実施形態では、非経口組成物は、一般に、無菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下注射針により貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアルに入れられる。
ある特定の実施形態では、医薬組成物が製剤化されたら、それを溶液、懸濁液、ゲル、エマルション、固体としてまたは脱水もしくは凍結乾燥粉末として無菌バイアル中に貯蔵することができる。ある特定の実施形態では、そのような製剤は、使用準備済みの形態または投与前に再構成される（例えば、凍結乾燥された）形態のいずれかにおいて貯蔵することができる。
ある特定の実施形態では、単回用量投与単位を製造するためのキットが提供される。ある特定の実施形態では、キットは、乾燥タンパク質を有する第１の容器および水性製剤を有する第２の容器の両方を含有することができる。ある特定の実施形態では、シングルおよびマルチチャンバー事前充填シリンジ（例えば、液体シリンジおよびリオシリンジ）を含有するキットが含まれる。
ある特定の実施形態では、治療的に用いられる多重特異性抗原結合性構築物を含む医薬組成物の有効量は、例えば、治療的な文脈および目的に依存する。ある特定の実施形態による治療用の適切な投与量レベルは、部分的には、送達される分子、多重特異性抗原結合性構築物が使用されている適応症、投与の経路、ならびに患者のサイズ（体重、身体表面もしくは臓器サイズ）および／または状態（年齢および全般的健康）に依存して変動することを当業者は理解する。ある特定の実施形態では、臨床医は、最適な治療効果を得るために投与量を滴定し、投与の経路を改変することができる。
ある特定の実施形態では、投与の頻度は、使用される製剤中の多重特異性抗原結合性構築物の薬物動態パラメーターを考慮に入れる。ある特定の実施形態では、臨床医は、所望の効果を達成する投与量に達するまで組成物を投与する。ある特定の実施形態では、組成物は、したがって、単回用量としてもしくは経時的な２つもしくはより多くの用量（同じ量の所望の分子を含有してもよく、もしくはそうでなくてもよい）として、または、埋込みデバイスもしくはカテーテルを介して、連続注入として、投与することができる。適切な投与量のさらなる精密化は当業者により慣例的に為され、当業者により慣例的に行われるタスクの範囲内である。ある特定の実施形態では、適切な投与量は、適切な用量応答データの使用を通じて確認することができる。
ある特定の実施形態では、医薬組成物の投与の経路は、公知の方法、例えば、経口的なもの、静脈内、腹腔内、脳内（実質内）、脳室内、筋肉内、皮下、眼内、動脈内、門脈内、もしくは病巣内経路による注射を通じたもの、持続放出システムによるものまたは埋込みデバイスによるものに従って為される。ある特定の実施形態では、組成物は、ボーラス注射によりまたは注入により連続的に、または埋込みデバイスにより投与することができる。ある特定の実施形態では、併用療法の個々の要素は、異なる経路により投与することができる。
ある特定の実施形態では、組成物は、所望の分子が吸収または被包された膜、スポンジ、または別の適切な材料の埋込みを介して局所的に投与することができる。ある特定の実施形態では、埋込みデバイスが使用される場合、デバイスは、任意の好適な組織または臓器に埋め込むことができ、所望の分子の送達は、拡散、徐放性ボーラス、または連続的な投与を介して為され得る。ある特定の実施形態では、ｅｘ ｖｉｖｏの方式において多重特異性抗原結合性構築物を含む医薬組成物を使用することが望ましいことがある。そのような事例では、患者から除去された細胞、組織および／または臓器は、多重特異性抗原結合性構築物を含む医薬組成物に曝露され、その後に細胞、組織および／または臓器は再び患者に埋め込まれる。
ある特定の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物は、ポリペプチドを発現および分泌するように本明細書に記載の方法などの方法を使用して遺伝子操作されたある特定の細胞を埋め込むことにより送達することができる。ある特定の実施形態では、そのような細胞は動物またはヒト細胞であることができ、自己、異種由来の、または異種間のものであることができる。ある特定の実施形態では、細胞を不死化させることができる。ある特定の実施形態では、免疫学的応答の可能性を減少させるために、細胞を被包して周囲組織の浸潤を回避することができる。ある特定の実施形態では、被包材料は、典型的には、タンパク質生成物の放出を可能とするが、患者の免疫系によるまたは周囲組織からの他の有害な因子による細胞の破壊を防止する生体適合性の半透性ポリマーエンクロージャまたは膜である。
Ｈ．使用の方法
本明細書に記載されるように、本開示は、それを必要とする対象において増殖性障害を治療する方法であって、対象に治療有効量の本開示の多重特異性抗原結合性構築物を投与することを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、本開示は、それを必要とする対象において免疫応答を増進する（例えば、増進したＴ細胞機能、例えば、Ｔ細胞の機能的な疲弊からのレスキュー；増進したＴ細胞媒介性応答；増加した炎症性サイトカインの分泌および／または産生、例えば、Ｔ細胞からのＩＦＮγの分泌および／または産生；増進したＮＫ細胞機能；増進したマクロファージ機能）方法であって、対象に治療有効量の本開示の多重特異性抗原結合性構築物を投与することを含む、方法を提供する。本明細書において例示されるように、免疫応答の増進は、ＰＤ－１もしくはそのリガンド（例えば、ＰＤ－Ｌ１もしくはＰＤ－Ｌ２）のいずれかに結合する剤（例えば、抗体）、またはＰＤ－１に結合する剤（例えば、抗体）およびそのリガンドに結合する剤（例えば、抗体）を含むカクテルと比較して、本明細書に開示される多重特異性抗原結合性構築物の投与でより大きい。一部の実施形態では、免疫応答の増進（例えば、増進したＴ細胞機能、例えば、Ｔ細胞の機能的な疲弊からのレスキュー；増進したＴ細胞媒介性応答；増加した炎症性サイトカイン、Ｔ細胞からのＩＦＮγの分泌および／または産生；増進したＮＫ細胞機能；増進したマクロファージ機能）は、ＰＤ－１もしくはそのリガンドのいずれかに結合する剤（例えば、抗体）、またはＰＤ－１に結合する剤（例えば、抗体）およびそのリガンドに結合する剤（例えば、抗体）を含むカクテルと比較して少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、またはより高いパーセンテージでより大きい。対象に有効量の本明細書に記載されるような多重特異性抗原結合性構築物、抗体もしくはその抗原結合性断片、医薬組成物、またはタンパク質コンジュゲートを投与することによる、対象においてがんを治療しもしくはその進行を遅延させまたは腫瘍成長を低減もしくは阻害する方法もまた本明細書において提供される。
本明細書に記載の組成物は、とりわけ、対象において様々ながんを治療または予防する方法において有用である。
組成物は、部分的には投与の経路に依存する様々な方法を使用して対象、例えば、ヒト対象に投与することができる。経路は、例えば、静脈注射もしくは注入（ＩＶ）、皮下注射（ＳＣ）、腹腔内（ＩＰ）注射、筋肉内注射（ＩＭ）、または髄腔内注射（ＩＴ）であることができる。注射は、ボーラスまたは連続注入において行うことができる。
本明細書において使用される場合、「対象」という用語は哺乳動物対象を意味する。例示的な対象としては、ヒト、サル、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ラクダ、ヤギおよびヒツジが挙げられるがそれに限定されない。一部の実施形態では、対象はヒトである。一部の実施形態では、対象は、本明細書において提供される多重特異性抗原結合性構築物を用いて治療することができる疾患または状態を有するまたは有することが疑われる。一部の実施形態では、疾患または状態はがんである。一部の実施形態では、対象は、本明細書において提供される多重特異性抗原結合性構築物を用いて治療することができるがんを有するヒトである。一部の実施形態では、対象は、本明細書において提供される多重特異性抗原結合性構築物を用いて治療することができるがんを有することが疑われるヒトである。
任意の疾患または障害を「治療すること」またはその「治療」は、一部の実施形態では、対象において存在する疾患または障害を寛解させることを指す。別の実施形態では、「治療すること」または「治療」は、対象により認識可能でないものであり得る少なくとも１つの身体的パラメーターを寛解させることを含む。さらに別の実施形態では、「治療すること」または「治療」は、身体的（例えば、認識可能な症状の安定化）もしくは生理学的（例えば、身体的パラメーターの安定化）のいずれかまたは両方で、疾患または障害をモジュレートすることを含む。さらに別の実施形態では、「治療すること」または「治療」は、疾患または障害の開始を遅延させまたは予防することを含む。
本明細書において使用される場合、「治療有効量」または「有効量」という用語は、対象に投与された場合に、疾患または障害を治療するために有効である多重特異性抗原結合性構築物の量を指す。
本明細書において使用される場合、「投与する」または「投与」は、粘膜、皮内、静脈内、筋肉内送達および／または本明細書に記載のもしくは当該技術分野において公知の任意の他の物理的送達方法などにより、身体の外側に存在する物質（例えば、本明細書において提供される多重特異性抗原結合性構築物）を患者の中に注射しまたは他に物理的に送達する行為を指す。疾患、またはその症状が治療されている場合、物質の投与は、典型的には、疾患またはその症状の開始後に行われる。疾患、またはその症状が予防されている場合、物質の投与は、典型的には、疾患またはその症状の開始前に行われる。
投与は、例えば、局所注入、注射、またはインプラントの手段により達成することができる。インプラントは、シラスティック（ｓｉａｌａｓｔｉｃ）膜などの膜、または繊維を含む、多孔性、非多孔性、またはゼラチン状材料のものであることができる。インプラントは、対象への組成物の持続的または定期的な放出のために構成することができる。例えば、米国特許出願公開第２００８０２４１２２３号明細書；米国特許第５，５０１，８５６号明細書；同第４，８６３，４５７号明細書；および同第３，７１０，７９５号明細書；欧州特許第４８８４０１号明細書；および欧州特許第４３０５３９号明細書（これらのそれぞれの開示を本願明細書に援用する）を参照。組成物は、例えば、拡散性、浸食性、または対流性システムに基づく埋込み可能なデバイス、例えば、浸透ポンプ、生分解性インプラント、電気拡散システム、電気浸透システム、蒸気圧ポンプ、電気分解ポンプ、起泡性ポンプ、圧電ポンプ、浸食ベースのシステム、または電気機械システムによって対象に送達することができる。
一部の実施形態では、本開示の多重特異性抗原結合性構築物は、局所投与によって対象に治療的に送達される。
本明細書において使用される場合、「増進したＴ細胞機能」または「Ｔ細胞の活性化」という用語は、表面上に抗原特異的Ｔ細胞受容体を発現する成熟Ｔ細胞がそのコグネイト抗原を認識して、細胞周期に入ること、サイトカインまたは溶菌酵素を分泌すること、および細胞ベースのエフェクター機能を行うことを開始させるまたはそのためにコンピテントとなることにより応答する細胞プロセスを指す。Ｔ細胞活性化は、完全に活性化されるために少なくとも２つのシグナルを必要とする。１つ目は抗原－主要組織適合複合体（ＭＨＣ）によるＴ細胞抗原特異的受容体（ＴＣＲ）のエンゲージメント後に起こり、２つ目は共刺激分子（例えば、ＣＤ２８）のその後のエンゲージメントにより起こる。これらのシグナルは核に伝達され、Ｔ細胞のクローン性拡大増殖、細胞表面上の活性化マーカーの上方調節、エフェクター細胞への分化、細胞傷害性もしくはサイトカイン分泌の誘導、アポトーシスの誘導、またはその組合せを結果としてもたらす。一部の実施形態では、「増進したＴ細胞機能」はまた、Ｔ細胞の増進した生存および／または増進した増殖を包含する。そのような活性を測定する方法は当該技術分野において慣例的で公知である。一部の実施形態では、「増進したＴ細胞機能」はまた、１つまたは複数のＴ細胞機能における回復または増加が達成されるような、疲弊した表現型からのＴ細胞のレスキューを包含する。当該技術分野において公知のように、Ｔ細胞疲弊の状態は、広範な共阻害受容体の持続的な上方調節、ならびに特有の転写およびエピジェネティックシグネチャーに加えて、Ｔ細胞エフェクター機能、例えば、炎症性サイトカイン産生、増殖能力、代謝適応度の逐次的な喪失により特徴付けられる。Ｔ細胞の疲弊およびその変更は、当該技術分野において公知の、および本明細書に記載の技術、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ非特異的Ｔ細胞＋Ｋ５６２－ＰＤ－Ｌ１腫瘍標的細胞アッセイを使用して測定することができる。
本明細書において使用される場合、Ｔ細胞媒介性応答という用語は、Ｔ細胞により媒介される任意の応答を指し、Ｔ細胞としては、エフェクターＴ細胞（例えば、ＣＤ８＋細胞、エフェクターγδ Ｔ細胞）ならびにヘルパーＴ細胞（例えば、ＴＨ１、ＴＨ２、ＴＨ３、ＴＨ１７、ＴＨ９、およびＴＦＨ細胞などのそのサブセットを含む、ＣＤ４＋細胞）が挙げられるがそれに限定されない。Ｔ細胞媒介性応答としては、例えば、Ｔ細胞の細胞傷害性、Ｔ細胞のサイトカイン分泌、および増殖が挙げられる。対象におけるがんを治療または予防することができる、本明細書に記載の抗体またはその断片の好適な用量は様々な要因に依存することができ、該要因としては、例えば、治療される対象の年齢、性別、および体重ならびに使用される具体的な阻害剤化合物が挙げられる。例えば、同じ対象を治療するために必要とされる多重特異性抗原結合性構築物の断片（例えば、Ｆａｂ’抗体断片）の用量と比較して異なる用量の多重特異性抗原結合性構築物全体ががんを有する対象を治療するために必要とされることがある。対象に投与される用量に影響する他の要因としては、例えば、がんの種類または重篤度が挙げられる。例えば、転移性黒色腫を有する対象は、膠芽腫を有する対象とは異なる多重特異性抗原結合性構築物の投与量の投与を必要とすることがある。他の要因としては、例えば、対象に同時にまたは以前に影響した他の医学的障害、対象の全般的健康、対象の遺伝学的傾向、食事、投与の時間、排出の速度、薬物の組合せ、および対象に投与される任意の他の追加の治療法を挙げることができる。任意の具体的な対象のための特定の投与量および治療レジメンは、治療施術者（例えば、医師または看護師）の判断にも依存することも理解されるべきである。好適な投与量は本明細書に記載されている。一部の実施形態では、本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物は、高用量および低用量の両方において有効である。
医薬組成物は、治療有効量の本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物を含むことができる。そのような有効量は、当業者により容易に決定され得、これは部分的には、投与される抗体の効果、または、１つより多くの剤が使用される場合には、抗体および１つもしくは複数の追加の活性剤の組合せの効果に基づく。本明細書に記載の抗体またはその断片の治療有効量はまた、個体の疾患状態、年齢、性別、および体重、ならびに個体において所望の応答、例えば、腫瘍成長における低減を誘発する抗体（および１つまたは複数の追加の活性剤）の能力などの要因に従って変動し得る。例えば、治療有効量の多重特異性抗原結合性構築物は、具体的な障害、および／または当該技術分野において公知のもしくは本明細書に記載の具体的な障害の症状のいずれか１つを阻害（その重篤度の減少もしくはその出現の排除）および／または予防することができる。治療有効量はまた、組成物の任意の毒性または有害効果を治療的に有益な効果が凌ぐものである。
本明細書に記載の任意の多重特異性抗原結合性構築物の好適なヒト用量は、例えば、第Ｉ相用量漸増研究においてさらに評価することができる。例えば、ファン・グルプら（ｖａｎ Ｇｕｒｐ ｅｔ ａｌ．）（２００８）Ａｍ． Ｊ． Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ８（８）：１７１１－１７１８；ハノウスカら（Ｈａｎｏｕｓｋａ ｅｔ ａｌ．）（２００７）Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １３（２， ｐａｒｔ １）：５２３－５３１；およびヘザリントンら（Ｈｅｔｈｅｒｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ．）（２００６）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ５０（１０）：３４９９－３５００を参照。
そのような組成物の毒性および治療効果は、細胞培養物または実験動物（例えば、本明細書に記載の任意のがんの動物モデル）において公知の薬学的手順により決定することができる。これらの手順は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に対して致死的な用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療的に効果的な用量）を決定するために使用することができる。毒性効果と治療効果との用量比は治療指数であり、それは比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表すことができる。高い治療指数を呈する抗体またはその抗原結合性断片が好ましい。毒性の副作用を呈する組成物が使用されてもよいが、影響された組織の部位にそのような化合物を標的化する送達システムを設計すること、および、正常細胞への潜在的な損傷を最小化し、それにより副作用を低減することに注意するべきである。
細胞培養アッセイおよび動物研究から得られるデータは、ヒトにおいて使用するための投与量の範囲の定式化において使用することができる。そのような抗体またはその抗原結合性断片の投与量は、一般に、ほとんどまたは全く毒性を有しないＥＤ５０を含む抗体または断片の循環濃度の範囲内にある。投与量は、用いられる投与形態および利用される投与の経路に依存してこの範囲内で変動してもよい。本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物について、治療的に効果的な用量は、最初に細胞培養アッセイから推定することができる。用量は、細胞培養において決定されるようなＥＣ５０（すなわち、症状の半数最大阻害を達成する構築物、例えば、抗体の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するために動物モデルにおいて定式化することができる。そのような情報は、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定するために使用することができる。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーにより測定することができる。一部の実施形態では、例えば、（例えば、目または関節への）局所投与が所望される場合、局所的な部位内で治療的に効果的な濃度を達成するために必要とされる用量を決定するために細胞培養または動物モデリングを使用することができる。
一部の実施形態では、方法は、がんに対する他の療法と組み合わせて行うことができる。例えば、組成物は、放射線、手術、標的化もしくは細胞傷害性化学療法、化学放射線療法、ホルモン療法、免疫療法、遺伝子療法、細胞移植療法、プレシジョンメディシン、ゲノム編集療法、または他の薬物療法と同時、その前、または後に対象に投与することができる。
上記のように、本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物は、血液がん、リンパ腫、骨髄腫、白血病、神経学的がん、皮膚がん、乳がん、前立腺がん、結腸直腸がん、肺がん、頭頸部がん、胃腸がん、肝臓がん、膵臓がん、泌尿生殖器がん、骨がん、腎臓がん、および血管がんからなる群から選択される様々ながんを治療するために使用される。任意選択で、がんは、カポジ肉腫、白血病、急性リンパ性白血病（ｅｔｖ６、ａｍｌ１、シクロフィリンｂ）、急性骨髄球性白血病、骨髄芽球性前骨髄球性骨髄単球性単球性赤白血病、慢性白血病、慢性骨髄球性（顆粒球性）白血病、慢性リンパ性白血病（シクロフィリンｂ）、マントル細胞リンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫、バーキットリンパ腫、辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫（Ｉｇ－イディオタイプ）、真性多血症リンパ、ホジキン病（Ｉｍｐ－１、ＥＢＮＡ－１）、非ホジキン病、骨髄腫（ＭＵＣファミリー、ｐ２１ｒａｓ）、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、重鎖病、固形腫瘍、肉腫、癌腫、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸肉腫、結腸癌（ｐ２１ｒａｓ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｃ－ｅｒｂＢ－２、ＭＵＣファミリー）、膵臓がん、乳がん（ＭＵＣファミリー、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｃ－ｅｒｂＢ－２）、卵巣がん、前立腺がん（前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）およびその抗原エピトープＰＳＡ－１、ＰＳＡ－２、およびＰＳＡ－３、ＰＳＭＡ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｃ－ｅｒｂＢ－２、ｇａ７３３糖タンパク質）、扁平細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌（ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｃ－ｅｒｂＢ－２）、ヘパトーマ、肝細胞がん（α－フェトプロテイン）、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、子宮がん、精巣腫瘍（ＮＹ－ＥＳＯ－１）、肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌（ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｃ－ｅｒｂＢ－２）、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫（Ｅ－カドヘリン、α－カテニン、β－カテニン、γ－カテニン、ｐ１２０ｃｔｎ）、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫（ｐ５タンパク質、ｇｐ７５、がん胎児性抗原、ＧＭ２およびＧＤ２ガングリオシド、Ｍｅｌａｎ－Ａ／ＭＡＲＴ－１、ｃｄｃ２７、ＭＡＧＥ－３、ｐ２１ｒａｓ、ｇｐ１００）、神経芽腫、網膜芽腫、鼻咽頭癌（Ｉｍｐ－１、ＥＢＮＡ－１）、食道癌、基底細胞癌、胆道がん（ｐ２１ｒａｓ）、膀胱がん（ｐ２１ｒａｓ）、骨がん、脳および中枢神経系（ＣＮＳ）がん、子宮頸癌（ｐ５３、ｐ２１ｒａｓ）、絨毛癌（ＣＥＡ）、結腸直腸がん（結腸直腸関連抗原（ＣＲＣ）－ＣＯ１７－１Ａ／ＧＡ７３３、ＡＰＣ）、結合組織がん、消化器系のがん、子宮内膜がん、食道がん、眼がん、頭頸部がん、胃がん（ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｃ－ｅｒｂＢ－２、ｇａ７３３糖タンパク質）、上皮細胞がん（シクロフィリンｂ）、上皮内新生物、腎臓がん、喉頭がん、肝臓がん、肺がん（小細胞、大細胞）（ＣＥＡ、ＭＡＧＥ－３、ＮＹ－ＥＳＯ－１）、口腔がん（例えば、口唇、舌、口、および咽頭がん）、卵巣がん（ＭＵＣファミリー、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｃ－ｅｒｂＢ－２）、膵臓がん、直腸がん、呼吸器系のがん、皮膚がん、甲状腺がん、および泌尿器系のがんからなる群から選択される。
一部の実施形態では、本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物は、単剤療法として対象に投与することができる。代替的に、上記のように、抗体またはその断片は、別の治療、例えば、がんに対する別の治療との併用療法として対象に投与することができる。例えば、併用療法は、がんを有する、またはそれを発症するリスクがある対象に対して治療的な利益を提供する１つまたは複数の追加の剤を対象（例えば、ヒト患者）に投与する工程を含むことができる。本発明の組成物との併用投与のために好適な化学療法剤としては、例えば、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、ミトマイシン、エトポシド、テニポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン（ｃｏｌｃｈｉｃｉｎ）、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラセンジオン（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙａｎｔｈｒａｎｃｉｎｄｉｏｎｅ）、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１－デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシンならびにこれらのアナログまたはホモログが挙げられる。さらなる剤としては、例えば、代謝拮抗物質（例えば、メトトレキサート、６－メルカプトプリン、６－チオグアニン、シタラビン、５－フルオロウラシル ダカルバジン（ｄｅｃａｒｂａｚｉｎｅ）））、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオテパ、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、ミトマイシンＣ、シス－ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ｃｉｓ－ｄｉｃｈｌｏｒｄｉａｍｉｎｅ ｐｌａｔｉｎｕｍ（ＩＩ）；ＤＤＰ）、プロカルバジン、アルトレタミン、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、ネダプラチン、サトラプラチン、または四硝酸トリプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（旧名ダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（ｄａｃｔｉｎｏｍｃｉｎ）（旧名アクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン（ＡＭＣ））、ならびに抗有糸分裂剤（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）およびテモゾロミドが挙げられる。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物および１つまたは複数の追加の活性剤は同時に投与される。他の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物は時間的に一番目に投与され、１つまたは複数の追加の活性剤は時間的に二番目に投与される。一部の実施形態では、１つまたは複数の追加の活性剤は時間的に一番目に投与され、多重特異性抗原結合性構築物は時間的に二番目に投与される。
本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物は、以前にまたは現在投与されている療法を置き換えまたは増強することができる。例えば、多重特異性抗原結合性構築物を用いて治療する場合、１つまたは複数の追加の活性剤の投与は、中止または縮小することができ、例えば、より低いレベルまたは投与量において投与することができる。一部の実施形態では、以前の療法の投与を維持することができる。一部の実施形態では、以前の療法は、多重特異性抗原結合性構築物のレベルが治療効果を提供するために十分なレベルに達するまで維持される。２つの療法を組合せで投与することができる。
本明細書において定義されるようながんの改善について対象（例えば、ヒト患者）をモニターすることは、疾患パラメーターにおける変化、例えば、腫瘍成長の低減について対象を評価することを意味する。一部の実施形態では、評価は、投与の少なくとも１時間後、例えば、少なくとも２、４、６、８、１２、２４、もしくは４８時間、または少なくとも１日、２日、４日、１０日、１３日、２０日もしくはより多くの日数、または少なくとも１週、２週、４週、１０週、１３週、２０週、もしくはより多くの週の後に行われる。対象は、以下の期間：治療の開始前、治療中、または治療の１つもしくは複数の要素が投与された後の１つまたは複数において評価することができる。評価は、さらなる治療の必要性を評価すること、例えば、投与量、投与の頻度、または治療の継続期間を変更するべきかどうかを評価することを含むことができる。それはまた、選択された治療モダリティーを追加または削減する必要性、例えば、本明細書に記載のがんに対する任意の治療を追加または削減することを評価することを含むことができる。
一部の実施形態では、本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物は、例えば、Ｔ細胞の活性化および／または増殖を増加させることにより、患者においてＴ細胞応答をモジュレートするために投与される。免疫細胞により発現されたＰＤ－１およびそのリガンドの間の相互作用を遮断することは、Ｔ細胞の増殖、ＩＦＮγの産生および分泌、ならびにＴ細胞の細胞溶解活性を強く増進する。ＰＤ－１を発現する免疫細胞を、ＰＤ－１リガンド（例えば、ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２）を発現する第２の細胞（例えば、別の免疫細胞、または腫瘍細胞）とブリッジ形成させることは、Ｔ細胞の増殖、ＩＦＮγの産生および分泌、ならびにＴ細胞の細胞溶解活性を強く増進することができる。よって、一部の実施形態では、本開示の多重特異性抗原結合性構築物は、Ｔ細胞活性化を誘導しもしくは増加させ、Ｔ細胞増殖を増進し、ＩＦＮγの産生および／もしくは分泌を誘導し、かつ／または細胞溶解性Ｔ細胞応答を誘導するためにそれを必要とする患者に投与される。
本開示をその特定の実施形態を参照して記載してきたが、本開示の真の精神および範囲から離れることなく様々な変化が為されてもよく、均等物が置換されてもよいことが当業者により理解されるべきである。追加的に、本開示の客観的な精神および範囲に対して具体的な状況、材料、組成物、プロセス、プロセスの１つまたは複数の工程を適応させるための多くの改変が為されてもよい。全てのそのような改変は本開示の範囲内であることが意図される。
実施例１：Ｔ細胞におけるインターフェロン－ガンマ（ＩＦＮγ）の誘導
Ｔ細胞活性化に対するＰＤ１／ＰＤＬ１二重特異性抗体の効果をアセスメントするために、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）においてＩＦＮγ産生を分析した。ニボルマブ×アテゾリズマブ、９４９×アテゾリズマブ、Ｊ４３×アテゾリズマブ、ピディリズマブ×アテゾリズマブ、アテゾリズマブ×ニボルマブ、またはデュルバルマブ×ニボルマブの結合性ドメインを組み合わせた非グリコシル化二重特異性抗体を試験した。抗体９４９は、米国特許第９１０２７２８号明細書に開示されるようなＰＤ－１抗体を指す。抗体Ｊ４３は抗マウスＰＤ－１抗体を指す。ＰＤ－１を遮断し、ＩＦＮγ産生を誘導することが公知であるヒト化抗体、キイトルーダ（メルク（Ｍｅｒｃｋ）社）を比較物として使用した。ニボルマブ×アテゾリズマブ、９４９×アテゾリズマブ、およびアテゾリズマブ×ニボルマブの図式およびアミノ酸配列をそれぞれ図４～６に示す。本明細書において例示および試験された二重特異性フォーマットのそれぞれは、当該技術分野において公知の方法を使用して生成した。例えば、図４に示されるように、当該技術分野において公知の方法を使用してアテゾリズマブＦａｂの重鎖部分をニボルマブの重鎖Ｆｃ部分に架橋した。リンカー配列を用いてまたは用いずに、Ｆａｂの重鎖およびＩｇＧ分子の重鎖などの２つのタンパク質を架橋する好適な方法は本明細書に記載されている。この研究は、様々な濃度の上記の二重特異性抗体はＴ細胞においてＩＦＮγ応答を誘導できることを実証した。
３人の独立したヒトドナー（Ｄ９８５、Ｄ７６０３、およびＤ５００４）に由来するｌｅｕｋｏｐａｋｓ（ヘマケア（ＨｅｍａＣａｒｅ）社、［米国カリフォルニア州ヴァン・ナイズ（Ｖａｎ Ｎｕｙｓ）所在］）から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。免疫磁気細胞分離（ＥＡＳＹＳＥＰ（商標）；ステムセルテクノロジーズ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）社、［カナダブリティッシュコロンビア州バンクーバー（Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ）所在］）を使用して陰性選択により全Ｔ細胞をＰＢＭＣから濃縮した。免疫磁気細胞分離（ＥＡＳＹＳＥＰ（商標）；ステムセルテクノロジーズ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）社、［カナダブリティッシュコロンビア州バンクーバー（Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ）所在］）を使用して単球をＰＢＭＣから単離した。Ｔ細胞を１×１０６細胞／ｍｌの濃度で完全ＲＰＭＩに再懸濁し、単球を５×１０５細胞／ｍｌにそれぞれ調整した。９６ウェルプレート中、Ｔ細胞を含有する１００μｌの培地を１×１０５細胞／ウェルの密度でプレーティングし、続いて１００μｌの単球細胞懸濁液（Ｅ：Ｔ比２：１）を加えた。次に、抗体の様々な希釈液を含有する５０μｌの培地を０ｎＭ、０．５ｎＭ、５ｎＭ、または５０ｎＭの最終濃度に達するように加えた。プレートをＣＯ２インキュベーター中３７℃で５日間インキュベートした。インキュベーション期間の終わりに、培養上清を収集し、ＩＦＮγレベルをＭＳＤアッセイ（メソスケールダイアグノスティックス（Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）社、［米国メリーランド州ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）所在］）により分析した。
実施例２：ペムブロリズマブ／アテゾリズマブ二重特異性抗体を用いて処理されたＴ細胞におけるインターフェロン－ガンマ（ＩＦＮγ）の誘導
Ｔ細胞活性化に対するＰＤ１／ＰＤＬ１二重特異性抗体の効果をアセスメントするために、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）においてＩＦＮγ産生を分析した。ペムブロリズマブ×アテゾリズマブ二重特異物、ペムブロリズマブｍＡｂ、アテゾリズマブＦａｂ、キイトルーダおよびアテゾリズマブＦａｂの混合物、ならびにＰＤ－１を遮断し、ＩＦＮ－γ産生を誘導することが公知であるヒト化抗体、キイトルーダ（メルク（Ｍｅｒｃｋ）社）を比較物として使用した。ペムブロリズマブ×アテゾリズマブ二重特異性抗体の図式およびアミノ酸配列を図３に示す。本明細書において例示および試験された他の二重特異性フォーマットについて同様に記載されるように、図３に示される二重特異性フォーマットは、当該技術分野において公知の方法を使用して生成した。図３に示されるように、当該技術分野において公知の方法を使用してアテゾリズマブＦａｂの重鎖部分をペムブロリズマブの重鎖Ｆｃ部分のｃ末端に対して架橋した。リンカー配列を用いてまたは用いずに、Ｆａｂの重鎖およびＩｇＧ分子の重鎖などの２つのタンパク質を架橋する好適な方法は本明細書に記載されている。これらの結果は、ＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１を標的化する二重特異性抗体、ペムブロリズマブ×アテゾリズマブは、単独でのペムブロリズマブ、アテゾリズマブＦａｂ、またはキイトルーダ処理と同等にＴ細胞においてＩＦＮγ応答を誘導することを指し示す。
Ｔ細胞を上記のように調製した。抗体の様々な希釈液を含有する５０μｌの体積の培地を０ｎＭ、０．５ｎＭ、５ｎＭ、または５０ｎＭの最終濃度に達するように加えた。プレートをＣＯ２インキュベーター中３７℃で５日間インキュベートした。インキュベーション期間の終わりに、培養上清を収集し、ＩＦＮ－γレベルをＭＳＤアッセイ（メソスケールダイアグノスティックス（Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）社、［米国メリーランド州ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）所在］）により分析した。
実施例３：ＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１を標的化する二重特異性抗体またはＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１を標的化するモノクローナル抗体のカクテルを用いて処理されたＴ細胞におけるインターフェロン－ガンマ（ＩＦＮγ）誘導の比較
Ｔ細胞活性化に対するＰＤ－１×ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ１×ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体の効果をアセスメントするために、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）においてＩＦＮ－γ産生を分析した。ペムブロリズマブ×アテゾリズマブ二重特異性抗体、ニボルマブ×アテゾリズマブ二重特異性抗体、キイトルーダおよびアテゾリズマブのカクテル、ニボルマブおよびアテゾリズマブのカクテルを試験し、ＰＤ－１を遮断し、ＩＦＮ－γ産生を誘導することが公知であるヒト化抗体、キイトルーダ（メルク（Ｍｅｒｃｋ）社）を単独で比較物として使用した。
Ｔ細胞を上記のように調製した。抗体の様々な希釈液を含有する５０μｌの体積の培地を０ｎＭ、０．０１ｎＭ、０．００１ｎＭ、または０．０００１ｎＭの最終濃度に達するように加えた。プレートをＣＯ２インキュベーター中３７℃で５日間インキュベートした。インキュベーション期間の終わりに、培養上清を収集し、ＩＦＮγレベルをＭＳＤアッセイ（メソスケールダイアグノスティックス（Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）社、［米国メリーランド州ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）所在］）により分析した。
図１は、指し示されるような、試験された抗体の最終濃度でのｐｇ／ｍＬとしてのＩＦＮ－γの濃度を示す。これらの結果は、ペムブロリズマブ×アテゾリズマブなどの二重特異性ＰＤ－１×ＰＤ－Ｌ１抗体またはＰＤＬ１／ＰＤＬ１二重特異性抗体ニボルマブ／アテゾリズマブは、ＰＤ１およびＰＤＬ１特異的抗体のカクテル、またはＰＤ－１抗体（キイトルーダ）単独よりもＴ細胞においてより高いＩＦＮγ応答を誘導することを指し示す。
実施例４：ＰＤ－１／ＰＤＬ－１を標的化する二重特異性抗体またはＰＤ－１もしくはＰＤ－Ｌ１を標的化するモノクローナル抗体を用いて処理されたＴ細胞におけるインターフェロン－ガンマ（ＩＦＮγ）誘導の比較
Ｔ細胞活性化に対するＰＤ－１×ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ１×ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体の効果をアセスメントするために、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）においてＩＦＮγ産生を分析した。ペムブロリズマブ×ニボルマブ二重特異性抗体、アテゾリズマブ×アテゾリズマブ四価単一特異性抗体を試験し、ニボルマブ単独、アテゾリズマブ単独、およびＰＤ－１を遮断し、ＩＦＮ－γ産生を誘導することが公知であるヒト化抗体、キイトルーダ（ペムブロリズマブ）（メルク（Ｍｅｒｃｋ）社）を比較物として使用した。
Ｔ細胞を上記のように調製した。抗体の様々な希釈液を含有する５０μｌの体積の培地を０ｎＭ、０．０１ｎＭ、０．００１ｎＭ、または０．０００１ｎＭの最終濃度に達するように加えた。プレートをＣＯ２インキュベーター中３７℃で５日間インキュベートした。インキュベーション期間の終わりに、培養上清を収集し、ＩＦＮ－γレベルをＭＳＤアッセイ（メソスケールダイアグノスティックス（Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）社、［米国メリーランド州ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）所在］）により分析した。
図２は、指し示されるような、ＰＢＳ中の、試験された抗体の最終濃度でのｐｇ／ｍＬとしてのＩＦＮ－γの濃度を示す。これらの結果は、二重特異性ＰＤ１×ＰＤＬ１（ペムブロリズマブ×ニボルマブ）またはＰＤ－Ｌ１×ＰＤ－Ｌ１抗体（アテゾリズマブ×アテゾリズマブ）は、単独でのＰＤ－１（アテゾリズマブもしくはキイトルーダ）またはＰＤ－Ｌ１（ニボルマブ）特異的抗体と類似したＴ細胞におけるＩＦＮ－γ応答を誘導することを指し示す。
図７は、指し示されるような、ＰＢＳ中での、試験された抗体の最終濃度でのｐｇ／ｍＬとしてのＩＦＮ－γの濃度を示す。これらの結果は、二重特異性抗体ＰＤ－１×ＰＤ－Ｌ１（ペムブロリズマブ×アテゾリズマブ）または多重特異性フォーマットにおける（ニボルマブ×アテゾリズマブ）は、ペムブロリズマブおよびアテゾリズマブまたはニボルマブおよびアテゾリズマブのカクテルと比較して混合リンパ球反応（ＭＬＲ）においてフェムトモル濃度でより大きいＩＦＮ－γ応答を誘導することを指し示す。これらの結果は、多重特異性フォーマットの結果としてもたらされる相乗効果を示唆する。
図８は、相乗作用を実証する多重特異性（例えば、二重特異性）抗体を同定するための例示的なワークフローを示す。プロセスは、本明細書の他の箇所において記載されるように（例えば、非特異的Ｔ細胞＋Ｋ５６２－ＰＤ－Ｌ１腫瘍標的細胞アッセイというタイトルの以下のセクションを参照）、様々な濃度におけるｐｇ／ｍＬでのＩＦＮγ放出を測定する混合リンパ球反応（ＭＬＲ）におけるチェックポイント遮断剤の組合せのバイアスなしのスクリーニングを含む。図示したワークフローの第２の工程において、共通軽鎖二重特異物を生成してそれらの有効性をさらに試験し、様々な例示的な共通軽鎖二重特異性フォーマットを描写している。同定された共通軽鎖二重特異性フォーマットは、Ｔ細胞活性化アッセイにおいて公知のＰＤ－１遮断剤を凌いだ。
実施例５：抗ＰＤ－１および抗ＰＤ－Ｌ１抗体構築物ならびに多重特異性抗原結合性分子の生成および特徴付け
抗ＰＤ－Ｌ１抗体の親和性成熟
突然変異体ライブラリーの構築、哺乳動物ディスプレイ選別、およびモノクローナルＩｇＧのスクリーニングを介してＰＤ－Ｌ１抗体ｍＡｂ２４に由来する親和性成熟抗ＰＤ－Ｌ１抗体を生成した。ライブラリーは、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３において合成の多様性を導入された重鎖中の突然変異を含有し、軽鎖配列は、一部の場合を除いて、一定に保持して単一の軽鎖構築物との適合性を維持した。ヒトＰＤ－Ｌ１に対する親和性を増加させ、マウス交差反応性を維持することを目的としてライブラリーに３ラウンドの哺乳動物ディスプレイ選別を行った。各ラウンドにおいて、ビオチン化抗原への初期結合（すなわち、過剰な非標識抗原または親ＩｇＧとの１時間のインキュベーション）後にオフレート競合工程を用いた。選別の最終ラウンド後に、クローンを選び取り、それらの配列を分析し、Ｗａｓａｔｃｈ ＳＰＲ結合速度論および細胞結合平衡アッセイを介して特有のクローンをアッセイしてリード候補を同定した。
異なる選択ラウンドからの結果としてもたらされた抗ＰＤ－Ｌ１抗体をｋｄ／ｋａ二重ｌｏｇプロットにプロットした。見かけの会合および解離速度論的速度定数（ｋａおよびｋｄ値）をＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ ０．０１％のランニングバッファー中ＳＰＲｉリーダー（ＭＸ９６、カルテッラ（Ｃａｒｔｅｒｒａ）社、［米国ユタ州ソルトレークシティー（Ｓａｌｔ Ｌａｋｅ Ｃｉｔｙ）所在］））で決定した。抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体をＣＦＭ（カルテッラ（Ｃａｒｔｅｒｒａ）社）上のカルボキシメチルデキストランハイドロゲル５０Ｌチップ（キサンテックバイオアナリティクス（ＸａｎＴｅｃ ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃｓ）有限会社、［ドイツデュッセルドルフ（Ｄｕｓｓｅｌｄｏｒｆ）所在］）上に共有結合的にコンジュゲート化させた。新たに混合した活性化試薬（５ｍｌのＨ２Ｏ中の１５０ｕｌの０．４Ｍ ＥＤＣおよび１５０ｕｌの０．１Ｍスルホ－ＮＨＳ）を使用してＳＰＲ基質の表面を７分間活性化させた。ｐＨ４．５の酢酸緩衝液中の１０ｍｇ／ｍｌの抗体をプリンティングのために１５分間使用した。プリンティングしたチップを次にＳＰＲｉリーダー（ＭＸ９６、カルテッラ（Ｃａｒｔｅｒｒａ）社）上で１Ｍのエタノールアミンを用いて１５分間クエンチした。速度論分析のために、精製した組換えＨｉｓタグ付加ヒトＰＤ－Ｌ１（０、２．０５、５．１２、１２．８、３２、８０、２００、５００ｎＭ）を逐次的に注入した。各濃度について、５分の会合、続いて１０分の解離を行った。ＳＰＲ Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ ＴｏｏｌおよびＳｃｒｕｂｂｅｒソフトウェア（バイオセンサーツールズエルエルシー（Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ Ｔｏｏｌｓ ＬＬＣ）、［米国ユタ州ソルトレークシティー（Ｓａｌｔ Ｌａｋｅ Ｃｉｔｙ）所在］）においてデータを処理し、分析した。速度論データを間質参照スポットと参照し、緩衝液サイクルに対して二重参照し、次に１：１結合モデルに対して大域的にフィッティングしてそれらの親会合および解離速度論的速度定数（ｋａおよびｋｄ値）を決定した。比ｋｄ／ｋａを使用して各抗原／ｍＡｂ相互作用のＫＤ値、すなわち、ＫＤ＝ｋｄ／ｋａを導出した。
抗ＰＤ－１抗体の親和性成熟
突然変異体ライブラリーの構築、ファージディスプレイパニング、およびモノクローナル抗体のスクリーニングを介してＰＤ－１抗体ｍＡｂ２５に由来する親和性成熟抗ＰＤ－１抗体を生成した。ライブラリーは、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３において合成の多様性を導入された重鎖中の突然変異を含有し、軽鎖配列を一定に保持して単一の軽鎖構築物との適合性を維持した。ヒトＰＤ－１に対する親和性を増加させ、マウス交差反応性を獲得することを目的としてライブラリーに４ラウンドのファージディスプレイパニングラウンドを行った。各ラウンドにおいて、ビオチン化抗原への初期結合（すなわち、過剰な非標識抗原または親ＩｇＧとの１時間のインキュベーション）後にオフレート競合工程を用いた。パニングの最終ラウンド後に、クローンを選び取り、それらの配列を分析し、Ｏｃｔｅｔ ＳＰＲ結合速度論および細胞結合平衡アッセイを介して特有のＦａｂクローンをアッセイしてリード候補を同定した。リード候補をＦａｂからヒトＩｇＧに変換し、さらに特徴付けた。
異なる選択ラウンドからの結果としてもたらされた抗ＰＤ－１抗体をｋｄ／ｋａ二重ｌｏｇプロットにプロットした。見かけの会合および解離速度論的速度定数（ｋａおよびｋｄ値）をＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ ０．０１％のランニングバッファー中ＳＰＲｉリーダー（ＭＸ９６、カルテッラ（Ｃａｒｔｅｒｒａ）社、［米国ユタ州ソルトレークシティー（Ｓａｌｔ Ｌａｋｅ Ｃｉｔｙ）所在］））で決定した。抗ヒトＰＤ－１抗体をＣＦＭ（カルテッラ（Ｃａｒｔｅｒｒａ）社）上のカルボキシメチルデキストランハイドロゲル５０Ｌチップ（キサンテックバイオアナリティクス（ＸａｎＴｅｃ ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃｓ）有限会社、［ドイツデュッセルドルフ（Ｄｕｓｓｅｌｄｏｒｆ）所在］）上に共有結合的にコンジュゲート化させた。新たに混合した活性化試薬（５ｍｌのＨ２Ｏ中の１５０ｕｌの０．４Ｍ ＥＤＣおよび１５０ｕｌの０．１Ｍスルホ－ＮＨＳ）を使用してＳＰＲ基質の表面を７分間活性化させた。ｐＨ４．５の酢酸緩衝液中の１０ｍｇ／ｍｌの抗体をプリンティングのために１５分間使用した。プリンティングしたチップを次にＳＰＲｉリーダー（ＭＸ９６、カルテッラ（Ｃａｒｔｅｒｒａ）社）上で１Ｍのエタノールアミンを用いて１５分間クエンチした。速度論分析のために、精製した組換えＨｉｓタグ付加ヒトＰＤ－１（０、２．０５、５．１２、１２．８、３２、８０、２００、５００ｎＭ）を逐次的に注入した。各濃度について、５分の会合、続いて１０分の解離を行った。ＳＰＲ Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ ＴｏｏｌおよびＳｃｒｕｂｂｅｒソフトウェア（バイオセンサーツールズエルエルシー（Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ Ｔｏｏｌｓ ＬＬＣ）、［米国ユタ州ソルトレークシティー（Ｓａｌｔ Ｌａｋｅ Ｃｉｔｙ）所在］）においてデータを処理し、分析した。速度論データを間質参照スポットと参照し、緩衝液サイクルに対して二重参照し、次に１：１結合モデルに対して大域的にフィッティングしてそれらの見かけの会合および解離速度論的速度定数（ｋａおよびｋｄ値）を決定した。比ｋｄ／ｋａを使用して各抗原／ｍＡｂ相互作用のＫＤ値、すなわち、ＫＤ＝ｋｄ／ｋａを導出した。
非特異的Ｔ細胞＋Ｋ５６２－ＰＤ－Ｌ１腫瘍標的細胞アッセイ
陰性選択キットを使用して以前に凍結したＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）からＴ細胞を単離し、１０％のＦＢＳを添加したＸ－ＶＩＶＯ １５培地（「Ｘ－１０」）中でＩＭＭＵＮＯＣＵＬＴ（商標） 抗ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｔ細胞活性化因子を使用して活性化させた。３日後に、５ｎｇ／ｍｌのＩＬ－２および２．５ｎｇ／ｍｌのＩＬ－７を含有するＸ－１０培地（「ｈＸ－１０」）に細胞を切り替えた。２～３日毎に細胞に新鮮なｈＸ－１０を与えた。１０日の活性化後に、ＩＭＭＵＮＯＣＵＬＴ（商標）拡大増殖Ｔ細胞をＣＥＬＬＴＲＡＣＥ（商標） Ｖｉｏｌｅｔ標識し、５００００個のＴ細胞および２５０００個のＫ３２Ｐ細胞／ウェルを含む９６ウェル丸底プレート中でヒトＣＤ３２ＢおよびＰＤ－Ｌ１を発現するように安定的に形質導入されたＫ５６２細胞（「Ｋ３２Ｐ」）と共培養した。０．２５μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３（クローンＯＫＴ３）と共に１０倍希釈で１０～０．００１ｎＭの最終濃度で抗体（二重特異物３、キイトルーダ、およびアイソタイプ対照）を加えた。３日後に、ＭＳＤプレートを介してＩＦＮγサイトカイン産生を測定するために上清を収集し、細胞をフローサイトメトリーのために染色し、次にＢＤ ＬＳＲＦＯＲＴＥＳＳＡ（商標）サイトメーターに流してＴ細胞活性化および標的細胞殺傷を調べた。標的細胞殺傷は、無ＣＤ３対照ウェルのセット中のＫ３２Ｐ標的の数と比較して実験ウェル中の生Ｋ３２Ｐ標的の数をカウントすることにより測定される。全てのデータを次にＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍにおいて分析した。図９Ａ～９Ｂに示されるように、二重特異物３は、アイソタイプ対照抗体およびキイトルーダの両方と比較してより多くの量のＩＦＮγおよびＫ３２Ｐ標的細胞の殺傷を誘導した。
ＣＭＶ抗原リコールアッセイ
ＨＬＡ Ａ０２：０１ドナーからの１２日目の拡大増殖したＣＭＶ抗原特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞を解凍し、２ｕｇ／ｍｌのＤＮａｓｅ Ｉを含有するｈＸ－１０培地中で終夜静置した。翌日、細胞を収集し、Ｆｉｃｏｌｌ分離を使用して死細胞を除去した。残存した細胞を次に、２５０００個のＣＭＶ Ｔ細胞、５００００個のＫＡＣＰ細胞、および５００００個のＫＡ細胞／ウェルを含む９６ウェル丸底プレート中でＨＬＡ－Ａ０２：０１、ＣＭＶタンパク質ｐｐ６５－ＩＲＥＳ－ＧＦＰ、およびＰＤ－Ｌ１を発現するＫ５６２細胞（「ＫＡＣＰ」、ＧＦＰ＋）およびＨＬＡ－Ａ０２：０１を発現するＫ５６２細胞（「ＫＡ」、ＧＦＰ－）と共培養した。抗体（二重特異物３、キイトルーダ、ｍＡｂ１とｍＡｂ２８との組合せ、およびアイソタイプ対照）を１０～０．０００１ｎＭの最終濃度で加えた。この用量は、１０倍希釈の１０～０．１ｎＭ、次に０．０００１ｎＭまでの２倍希釈を含んでいた。２日の共培養後に、フローサイトメトリーを介してＫＡＣＰ腫瘍標的の特異的殺傷を分析した。特異的殺傷は、ＧＦＰ－ＫＡ細胞に対する生ＧＦＰ＋ ＫＡＣＰ細胞の比を、Ｔ細胞が存在しない場合のこれらの細胞の比に対して正規化したものとして比算出的に定義される。図１０Ａに示されるように、二重特異物３は腫瘍抗原標的細胞の特異的殺傷を増加させた。二重特異物３により媒介された増加は、キイトルーダについて見られたものよりも常に高く、高用量においてｍＡｂ１とｍＡｂ２８との組合せは等しい数のＫＡＣＰ細胞を殺傷した。クリティカルなことに、低用量の抗体（０．００１～０．０１ｎＭ）において二重特異物３は、キイトルーダおよびｍＡｂ１とｍＡｂ２８との組合せの両方と比較して、ＫＡＣＰ細胞の殺傷における増加を示し、二重特異物３を使用してより低い用量において標的細胞の抗原特異的殺傷を媒介できることを指し示した。
別々の実験において、Ｒａｊｉ細胞特異的殺傷に対する二重特異物３の効果を、Ｋ５６２細胞特異的殺傷アッセイについて上記に概説した方式に類似した方式で調べた。簡潔に述べれば、ＣＭＶ抗原特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞を、ＨＬＡ－Ａ０２：０１、ＣＭＶタンパク質ｐｐ６５－ＩＲＥＳ－ＧＦＰ、およびＰＤ－Ｌ１を発現するＲａｊｉ細胞（「ＲＡＣＰ」、ＧＦＰ＋）ならびにＨＬＡ－Ａ０２：０１を発現するＲａｊｉ細胞（「ＲＡ」、ＧＦＰ－）と２５０００個のＣＭＶ Ｔ細胞、５００００個のＲＡＣＰ細胞、および５００００個のＲＡ細胞／ウェルを含む９６ウェル丸底プレート中で共培養した。抗体（二重特異物３、キイトルーダ、ｍＡｂ１とｍＡｂ２８との組合せ、およびアイソタイプ対照）を１０～０．０００１ｎＭの最終濃度で加えた。この用量は、１０倍希釈の１０～０．１ｎＭ、次に０．０００１ｎＭまでの２倍希釈を含んでいた。２日の共培養後に、フローサイトメトリーを介してＲＡＣＰ腫瘍標的の特異的殺傷を分析した。特異的殺傷は、ＧＦＰ－ＲＡ細胞に対する生ＧＦＰ＋ ＲＡＣＰ細胞の比を、Ｔ細胞が存在しない場合のこれらの細胞の比に対して正規化したものとして比算出的に定義される。図１０Ｂに示されるように、二重特異物３は腫瘍抗原標的細胞の特異的殺傷を増加させた。二重特異物３により媒介された増加は、キイトルーダまたはｍＡｂ１とｍＡｂ２８との組合せのいずれかについて見られたものよりも０．００１ｎＭにおいて著しく高かったが、高用量において二重特異物３およびｍＡｂ１とｍＡｂ２８との組合せは標的細胞の同等の殺傷を引き起こした。これらのデータは、二重特異物３を使用してより低い用量において標的細胞の抗原特異的殺傷を媒介できることを指し示す。
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓエンテロトキシンＡ（「ＳＥＡ」）アッセイ
以前に凍結したＰＢＭＣを解凍し、ＰＢＳ中の０．１ｍｇ／ｍｌのＤＮａｓｅ Ｉと１５分間インキュベートし、４０μｍナイロンメッシュフィルターに通過させ、次に９６ウェル丸底プレートのウェル当たり１０００００細胞でＸ－１０培地にプレーティングした。１０ｎｇ／ｍｌのＳＥＡと共に、抗体（二重特異物３、キイトルーダ、ｍＡｂ１とｍＡｂ２８との組合せ、およびアイソタイプ対照）を１０～０．０００１ｎＭの最終濃度で加えた。３日の共培養後に、ＩＬ－２サイトカイン産生を分析した。図１１に示されるように、二重特異物３は、全ての試験した用量においてキイトルーダよりも多くのＩＬ－２を誘導した。重要なことに、二重特異物３は、キイトルーダおよびｍＡｂ１とｍＡｂ２８との組合せの両方と比較して、抗体のより低い濃度で開始してＩＬ－２産生の増加を誘導した。
ＰＤ－１発現決定アッセイ
以前に凍結したＰＢＭＣを解凍し、ＰＢＳ中の０．１ｍｇ／ｍｌのＤＮａｓｅ Ｉと１５分間インキュベートし、フィルターに通過させ、次に０．２５μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３（クローンＯＫＴ３）および０．２５μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８（クローンＣＤ２８．２）と共にｈＸ－１０中１×１０６細胞／ｍｌで３日間プレーティングした。３日後に、細胞をスピンダウンし、過剰な培地を除去することにより細胞をｈＸ－１０中で２×１０６細胞／ｍｌに調整した。細胞を次に再懸濁し、４８ウェルプレート中に１×１０６細胞／ウェル（０．５ｍｌ）でプレーティングした。抗体（二重特異物３、キイトルーダ、ｍＡｂ１とｍＡｂ２８との組合せ、アテゾリズマブ、またはアイソタイプ対照）を次に各ウェルに加えて、０．０１ｎＭまたは１ｎＭの抗体の最終濃度と共に、１ｍｌ／ウェルのｈＸ－１０の最終体積を得た。終夜の培養後に、細胞を１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに収集し、プロテアーゼ阻害剤カクテルを含有する１００ｕｌの溶解緩衝液に溶解した。スピニングして粒子状物質の上清を清澄化させた後に、清澄化した上清をウエスタンブロットのための使用まで－８０℃で貯蔵した。ウエスタンブロットのために、１ＸのＬＤＳ試料緩衝液および１Ｘの還元剤を含むように試料を調整し、７０℃で１０分間加熱し、次に２０ｕｌ／ウェルを４～１２％のＢｉｓ－Ｔｒｉｓゲルにロードした。ゲルに流した後に、それをニトロセルロース膜に移し、５％の乾燥乳を含有するＴＢＳ－０．１％ Ｔｗｅｅｎ－２０（ＴＢＳＴ）を用いて室温で１時間遮断し、ＴＢＳＴ中で洗浄し、次に５％のウシ血清アルブミンを含有するＴＢＳＴ中で抗ＰＤ－１（クローンＤ４Ｗ２Ｊ、セルシグナリングテクノロジーズ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）社）または抗β－アクチン（クローン１３Ｅ５、セルシグナリングテクノロジーズ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）社）抗体と４℃で終夜インキュベートした。翌日、膜をＴＢＳＴ中で洗浄し、ＨＲＰコンジュゲート化抗ウサギＩｇＧ抗体とインキュベートし、ＴＢＳＴ中で洗浄し、次にＳＵＰＥＲＳＩＧＮＡＬ（商標） Ｐｉｃｏ基質を用いて顕色させた。化学発光および白色光画像をＡｍｅｒｓｈａｍ Ｉｍａｇｅｒ ６００上で収集し、重ね合わせて示される画像を生成した。図１２Ａに示されるように、二重特異物３は、ＰＤ－１の内部移行および／もしくはその後の分解ならびに／またはシェディングにより細胞ＰＤ－１発現の喪失を引き起こすその能力において特有である。
その後のアッセイにおいて、以前に凍結したＰＢＭＣを解凍し、ＰＢＳ中の０．１ｍｇ／ｍｌのＤＮａｓｅ Ｉと１５分間インキュベートし、フィルターに通過させ、次に０．２５μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３（クローンＯＫＴ３）および０．２５μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８（クローンＣＤ２８．２）と共にｈＸ－１０中１×１０６細胞／ｍｌで３日間プレーティングした。３日後に、細胞をスピンダウンし、過剰な培地を除去することにより細胞をｈＸ－１０中で２×１０６細胞／ｍｌに調整した。細胞を次に再懸濁し、４８ウェルプレート中に１×１０６細胞／ウェル（０．５ｍｌ）でプレーティングした。抗体（二重特異物３、キイトルーダ、ｍＡｂ１とｍＡｂ２８との組合せ、アテゾリズマブ、アテゾリズマブおよびキイトルーダ、５０ｎＭのｍＡｂ１との二重特異物３、またはアイソタイプ対照）を次に各ウェルに加えて０．１ｎＭ、１ｎＭ、または１０ｎＭの抗体の最終濃度と共に１ｍｌ／ウェルのｈＸ－１０の最終体積を得た。終夜の培養後に、細胞を１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに収集し、プロテアーゼ阻害剤カクテルを含有する１００ｕｌの溶解緩衝液に溶解した。スピニングして粒子状物質の上清を清澄化させた後に、清澄化した上清をウエスタンブロットのための使用まで－８０℃で貯蔵した。ウエスタンブロットのために、１ＸのＬＤＳ試料緩衝液および１Ｘの還元剤を含むように試料を調整し、７０℃で１０分間加熱し、次に１０ｕｌ／ウェルを４～１２％のＢｉｓ－Ｔｒｉｓゲルにロードした。ゲルに流した後に、それをニトロセルロース膜に移し、５％の乾燥乳を含有するＴＢＳ－０．１％ Ｔｗｅｅｎ－２０（ＴＢＳＴ）を用いて室温で１時間遮断し、ＴＢＳＴ中で洗浄し、次に５％のウシ血清アルブミンを含有するＴＢＳＴ中で抗ＰＤ－１（クローンＤ４Ｗ２Ｊ、セルシグナリングテクノロジーズ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）社）または抗β－アクチン（クローン１３Ｅ５、セルシグナリングテクノロジーズ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）社）抗体と４Ｃで終夜インキュベートした。翌日、膜をＴＢＳＴ中で洗浄し、ＨＲＰコンジュゲート化抗ウサギＩｇＧ抗体とインキュベートし、ＴＢＳＴ中で洗浄し、次にＳＵＰＥＲＳＩＧＮＡＬ（商標） Ｐｉｃｏ基質を用いて顕色させた。化学発光および白色光画像をＡｍｅｒｓｈａｍ Ｉｍａｇｅｒ ６００上で収集し、重ね合わせて示される画像を生成した。図１２Ｂ～１２Ｃに示されるように、二重特異物３は、ＰＤ－１の内部移行および／もしくはその後の分解ならびに／またはＰＤ－１のシェディングを通じて細胞表面ＰＤ－１発現の喪失を引き起こすその能力において特有である。追加的に、二重特異物３を含有するウェルに抗ＰＤ－Ｌ１抗体、ｍＡｂ１を５０ｎＭで加えた場合、ＰＤ－１内部移行および／またはＰＤ－１のその後の分解および／またはシェディングにより細胞表面ＰＤ－１発現の喪失を推進する二重特異物３の能力は喪失した。これは、二重特異物３の両方のアームは、ＰＤ－１の内部移行および／もしくは分解ならびに／またはシェディングにより細胞表面ＰＤ－１発現の喪失を推進するためにエンゲージメントされるべきであることを示唆する。
図１２Ｄは、二重特異物の両方の結合性アームを同時にエンゲージメントさせた場合に、二重特異物３を用いた処理は上清中のＰＤ－１の量を増加させることを示す。ＰＤ－Ｌ１標的化アームをｍＡｂ１、親ＰＤ－Ｌ１アーム抗体により遮断した場合に、この効果は喪失される。これは、二重特異物３は上清へのＰＤ－１のシェディングを増加させることを示唆する。
結合性アームの配列と比べたその価数の効果を次に調査した。ｍＡｂ１のＶＨおよびＶＬ配列に由来するＰＤ－Ｌ１に結合する第１のＮ末端Ｆａｂ、ならびにｍＡｂ２８のＶＨおよびＶＬ配列に由来するＰＤ－１に結合する第２のＮ末端Ｆａｂを有する新たな二重特異物（二重特異物５）を生成した。換言すれば、それらはＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１への結合のために同じＶＨおよびＶＬ配列を共有するが、ＰＤ－Ｌ１に結合する二価アームおよびＰＤ－１に結合する二価アームを有する二重特異物３と比較して、二重特異物５は、ＰＤ－Ｌ１に結合する１つの一価アームおよびＰＤ－１に結合する１つの一価アームを有する。
Ｔ７５フラスコ中のＩＬ－２およびＩＬ－７を含有するｈＸ－１０培地中で４０×１０６個のＰＢＭＣを０．２５μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３および０．２５μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８を用いて３日間処理した。細胞をマニピュレーションなしでフラスコ中で３日間インキュベートした。３日目に、古い培地を何ら洗浄除去することなく細胞を収集した。１×１０６細胞／ウェルならびに０．０１ｎＭ、０．１ｎＭ、１ｎＭ、および１０ｎＭの抗体で、１ｍｌの最終体積で、細胞を４８ウェルプレートのウェルにプレーティングした。終夜のインキュベーション後に、ウェルから全ての細胞を収集するための洗浄と共に、細胞を１．５ｍｌのチューブに収集し、次に溶解し、ウエスタンブロッティングのために使用した。ウエスタンブロットをＰＤ－１およびアクチンについて実行した。図１２Ｅは、結合性アームの価数はＰＤ－１発現の喪失の程度に影響を及ぼすことを実証する。示されるように、ＰＤ－１発現の喪失は、二重特異物３（二価結合性アーム、総価数＝４または四価）と比べてより高い用量の二重特異物５（一価結合性アーム、総価数＝２または二価）において起こり始め、二重特異物３の価数の増加がこの差異の原因となることを示唆した。
次に、細胞の形質膜からタンパク質を切断する原因となるシェダーゼまたはプロテアーゼである複数のＭＭＰおよびＡＤＡＭの広域阻害剤、バチマスタットを使用してＡＤＡＭ／ＭＭＰ阻害の効果を調べた。簡潔に述べれば、Ｔ７５フラスコ中のＩＬ－２およびＩＬ－７を含有するｈＸ－１０培地中で４０×１０６個のＰＢＭＣを０．２５μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３および０．２５μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８を用いて３日間処理した。細胞をマニピュレーションなしでフラスコ中で３日間インキュベートした。３日目に、古い培地を何ら洗浄除去することなく細胞を収集した。１×１０６細胞／ウェルで、１ｍｌの最終体積で、細胞を４８ウェルプレートのウェルにプレーティングした。抗体を加える少なくとも１／２時間前に、バチマスタットまたはＤＭＳＯ溶媒を０μＭ、１．２５μＭ、２．５μＭ、５μＭ、および１０μＭの増加性濃度で加え、３７ＣでプレインキュベートしてＡＤＡＭ／ＭＭＰ阻害の帰結を調べた。アイソタイプ対照および二重特異物３を次に１ｎＭで加えた。終夜のインキュベーション後に、ウェルから全ての細胞を収集するための洗浄と共に、細胞を１．５ｍｌのチューブに収集し、次に溶解し、ウエスタンブロッティングのために使用した。ウエスタンブロットをＰＤ－１およびアクチンについて実行した。図１２Ｆは、複数のＭＭＰおよびＡＤＡＭの広域阻害剤、バチマスタットを用いた前処理は、細胞関連ＰＤ－１喪失の量を大きく低減することを実証し、ＰＤ－１の喪失またはシェディングはＭＭＰまたはＡＤＡＭプロテアーゼによる切断に起因することを示唆する。図１２Ｇは、二重特異物３は、主に、トランス配置にある、すなわち、異なる細胞により発現されているＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１にそれが結合する場合に、細胞表面ＰＤ－１発現の喪失を推進することを示唆する。ＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１は同じ細胞上に発現され得ることを考慮して、シスでＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１に結合する二重特異物３はＰＤ－１発現もしくはＰＤ－１シェディングの喪失を結果としてもたらすかどうか、または二重特異物３による結合はトランスである必要があり、二重特異物３はＰＤ－Ｌ１を発現する腫瘍細胞などの第１の細胞、およびＰＤ－１を発現するＴエフェクター細胞などの第２の細胞をブリッジ形成させるかどうかを調査した。ＰＤ－１のみ、ＰＤ－Ｌ１のみ、またはＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１の両方を発現するＪｕｒｋａｔ細胞を実験において使用した。簡潔に述べれば、計０．５×１０６個のＰＤ－１を発現するＪｕｒｋａｔ細胞、ＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１を発現するＪｕｒｋａｔ細胞、またはＰＤ－１のみもしくはＰＤ－Ｌ１のみを発現するＪｕｒｋａｔ細胞の１：１の混合物を０．０１、０．１および１ｎＭのアイソタイプ対照または二重特異物３を用いて処理した。終夜のインキュベーション後に、ウェルから全ての細胞を収集するための洗浄と共に、細胞を１．５ｍｌのチューブに収集し、次に溶解し、ウエスタンブロッティングのために使用した。ウエスタンブロットを実行してＰＤ－１およびアクチンレベルを決定した。
二重特異物３のｉｎ ｖｉｖｏ機能
ＨＬＡ Ａ０２：０１ドナーからの１３日目の拡大増殖したＣＭＶ抗原特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞を収集し、次にＨＬＡ－Ａ０２：０１、ＣＭＶタンパク質ｐｐ６５－ＩＲＥＳ－ＧＦＰ、およびＰＤ－Ｌ１を発現するＫ５６２細胞（「ＫＡＣＰ」）とに２：１のＫＡＣＰ：ＣＭＶ Ｔ細胞の比で、およびマトリゲルと混合して、１００μｌが１Ｘのマトリゲル、５×１０６個のＫＡＣＰ細胞、および２．５×１０６個のＣＭＶ Ｔ細胞を含むようにした。ＮＳＧマウスの脇腹の皮下にマウス当たり１００ｕｌの調製したマトリゲル－ＫＡＣＰ－ＣＭＶ Ｔ細胞混合物を移植した。抗体投与を移植の日に開始し、等モル量（各モノクローナルについて２００μｇ、二重特異物３について３３３μｇ）で与え、マウスに抗体を３日毎に再投与した。処置群は、マトリゲル中のＫＡＣＰ腫瘍細胞を単独で与えた対照群（「無Ｔ細胞移入」）、ならびにアイソタイプ、キイトルーダ、ｍＡｂ１およびｍＡｂ２８（ｍＡｂ１＋ｍＡｂ２８）、または二重特異物３を与えた群を含んだ。群当たり５匹のマウスとし、マウスを１日毎にモニターし、腫瘍を週に２回測定した。プロトコールを図１３Ａに図式的に描写する。図１３Ｂに示されるように、無Ｔ細胞移入群は、Ｔ細胞を含有する任意の群よりも激しく成長する腫瘍を有した。このモデルにおいて、キイトルーダは、アイソタイプ対照と比較してＫＡＣＰ腫瘍成長の遅延において利益を与えなかった。二重特異物３群ならびに組合せｍＡｂ１およびｍＡｂ２８群の両方は、アイソタイプ群およびキイトルーダ群の両方と比較して腫瘍成長における有意な遅延を有した。２４日目に、二重特異物３群およびｍＡｂ１とｍＡｂ２８との組合せを用いて処置された群の間に有意な相違があり、二重特異物３は組合せと比較して腫瘍成長における遅延を引き起こした。
実施例６：二重特異物３の薬理学的調査のためのｉｎ ｖｉｖｏ研究
ＮＳＧマウスにおけるＫ５６２－Ａ２－ＣＭＶ－ＰＤ－Ｌ１標的細胞およびＣＭＶ Ｔ細胞の併用接種モデル
図１３Ａに図式的に描写されるプロトコールを用いた２つの別々の研究において、ＮＳＧ雌マウスの皮下（ｓ．ｃ．）に５×１０６個のＫ５６２－Ａ２－ＣＭＶ－ＰＤ－Ｌ１（「ＫＡＣＰ」）細胞ならびに同じドナーからｉｎ ｖｉｔｒｏで拡大増殖した２．５×１０６（図１３Ｂおよび図１４Ａ；エフェクター：標的比＝０．５：１）または５×１０６（図１４Ｂ；エフェクター：標的比＝１：１）個のＣＭＶ特異的Ｔ細胞を含有する１００μＬのマトリゲルを併用注射した。マウスを接種の日にそれぞれ群当たり５匹のマウス、または群当たり１０匹のマウスの５群に盲検で群化した。ヒトＴ細胞の抗腫瘍活性を決定するために、両方の研究においてマウスの第１の群に腫瘍細胞のみを注射した。第２の群にヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体（０．２ｍｇ Ｑ３Ｄ×５）を与えた。第３の群にキイトルーダ（０．２ｍｇ Ｑ３Ｄ×５）を与え、第４の群を二重特異物３（０．３３３ｍｇ Ｑ３Ｄ×５）を用いて処置し、第５の群に抗ＰＤ－１（ｍＡｂ２８）抗体と抗ＰＤ－Ｌ１（ｍＡｂ１）抗体との組合せ（各０．２ｍｇ Ｑ３Ｄ×５）を与えた。全ての抗体はｉ．ｐ．で注射し、投与は移植日に開始した。腫瘍体積測定、体重喪失、および全生存によりモニターされる腫瘍成長により抗腫瘍活性を決定した。腫瘍サイズおよび体重を週当たり２～３回測定し、腫瘍が２０００ｍｍ３に接近したか、またはマウスが体重の２０％を喪失した時にマウスを安楽死させた。Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用してデータを分析およびグラフ化した。図１４Ａおよび図１４Ｂに図示されるように、二重特異物３は、試験した異なるモノクローナル抗体と比較して増加した抗腫瘍有効性を表し示した。
移植可能な同系マウスモデル
乳がんＥＭＴ－６細胞（５×１０４／マウス）をＢＡＬＢ／ｃ雌マウスの乳房脂肪パッドに移植した。腫瘍が確立された時に（腫瘍体積約５０ｍｍ３）、マウスを群化し（ｎ＝８）、ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照（０．２ｍｇ Ｑ３Ｄ×３）または二重特異物３（０．３３３ｍｇ Ｑ３Ｄ×３）を用いて処置した。抗体はｉ．ｐ．注射により送達した。
類似した研究設計を使用して、膀胱がんＭＢ－４９細胞（５×１０５／マウス）を雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスにｓ．ｃ．で注射した。腫瘍が確立された時に（腫瘍体積約７５ｍｍ３）マウスを群化し（ｎ＝８）、ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照（０．２ｍｇ Ｑ３Ｄ×３）または二重特異物３（０．３３３ｍｇ Ｑ３Ｄ×３）を用いて処置した。抗体はｉ．ｐ．注射により送達した。
両方の研究について、腫瘍サイズおよび体重を週当たり２～３回測定し、腫瘍が２０００ｍｍ３に接近したか、またはマウスが体重の２０％を喪失した時にマウスを安楽死させた。Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアにより結果をプロットし、グラフ化し、分析した。二重特異物３は、アイソタイプ対照処置と比較してＥＭＴ－６乳がん細胞モデル（図１５Ａ）およびＭＢ－４９細胞モデル（図１５Ｂ）においてより大きい抗腫瘍有効性を示した。
トランスジェニックマウスにおける操作された移植可能な同系モデル
ヒトＰＤ－Ｌ１を発現するように操作されたマウス結腸がんＭＣ－３８細胞（ＭＣ－３８－ｈＰＤ－Ｌ１）を、受容体－リガンドペアの膜貫通およびシグナル伝達ドメインを改変せずにＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１の細胞外ドメインをヒトＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１で置き換えたＣ５７ＢＬ／６雌マウスにｓ．ｃ．で注射した。ヒトＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１の遺伝子ノックインは、マウスＰＤ－１と相互作用せず、そのため同系マウスモデルにおいて評価できないキイトルーダと突き合わせて我々の二重特異性ＰＤ－１×ＰＤ－Ｌ１抗体を試験することを可能とした。確立されたＭＣ－３８－ｈＰＤ－Ｌ１腫瘍を有するマウスを群化し（ｎ＝８）、アイソタイプ対照（０．２ｍｇ Ｑ３Ｄ×３）、キイトルーダ（０．２ｍｇ Ｑ３Ｄ×３）、または二重特異物３（０．３３３ｍｇ Ｑ３Ｄ×３）を用いてｉ．ｐ．で処置した。二重特異物３を用いた処置は、アイソタイプ対照またはキイトルーダ処置よりも有意に良好にＭＣ－３８－ｈＰＤ－Ｌ１腫瘍成長を制御した（図１６Ａ）。追加的に、二重特異物３処置は、アイソタイプ対照またはキイトルーダ処置マウスと比較してＭＣ－３８－ｈＰＤ－Ｌ１腫瘍マウスにおける生存の増加を結果としてもたらした（図１６Ｂ）。
別々の研究において、Ｃ５７ＢＬ／６ヒトＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１トランスジェニック雌マウスに極めて高悪性度のマウス黒色腫細胞系である１×１０５個のＢ１６Ｆ１０－ｈＰＤ－Ｌ１細胞をｓ．ｃ．で注射した。以下の処置を与えた５つの群において黒色腫が可視的になったら直ちに（腫瘍細胞接種後４日目）マウスを群化した（ｎ＝８）。群１にはアイソタイプ対照ヒトＩｇＧ１（０．２ｍｇ Ｑ３Ｄ×３）を、群２にはアベルマブ（０．２ｍｇ Ｑ３Ｄ×３）を、群３にはキイトルーダ（０．２ｍｇ Ｑ３Ｄ×３）を、群４には二重特異物３（０．３３３ Ｑ３Ｄ×３）を、群５にはキイトルーダとアベルマブとの組合せ（各０．２ｍｇ Ｑ３Ｄ×３）を与えた。両方の研究について腫瘍サイズおよび体重を週当たり２～３回測定し、腫瘍が２０００ｍｍ３に接近したか、またはマウスが体重の２０％を喪失した時にマウスを安楽死させた。生存を記録し、分析した。Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアによりデータをプロットし、グラフ化し、分析した。図１７Ａおよび図１７Ｂに図示されるように、二重特異物３は、試験した他の処置群と比較してＢ１６Ｆ１０－ｈＰＤ－Ｌ１マウスにおける腫瘍成長の遅延において有意により有効であった。追加的に、二重特異物３を用いて処置されたＢ１６Ｆ１０－ｈＰＤ－Ｌ１マウスは、他の試験した処置を与えられたマウスよりも平均でより長く生存した（図１７Ｃおよび図１７Ｅ）。
実施例７：二重特異物３はモノクローナル様ＤＬＰおよび親様結合を有する
図１８Ａ～１８Ｄは、二重特異物３は、良好に挙動するモノクローナル抗体に類似した薬物様特性（ＤＬＰ）を有し、親ＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１結合を維持することを実証する。図１８Ａは、二重特異物３は、ヒトＰＤ－１を発現するＣＨＯ細胞に対して親クローンｍＡｂ２８と類似した結合（上）、およびヒトＰＤ－Ｌ１を発現するＣＨＯ細胞に対して親クローンｍＡｂ１と類似した結合（下）を示すことを示す。図１８Ｂは、二重特異物３は、カニクイザルＰＤ－１を発現するＣＨＯ細胞に対して親クローンｍＡｂ２８と類似した結合（上）、およびカニクイザルＰＤ－Ｌ１を発現するＣＨＯ細胞に対して親クローンｍＡｂ１と類似した結合（下）を示すことを示す。図１８Ｃは、二重特異物３は、マウスＰＤ－１を発現するＣＨＯ細胞に対して親クローンｍＡｂ２８と類似した結合（上）、およびマウスＰＤ－Ｌ１を発現するＣＨＯ細胞に対して親クローンｍＡｂ１と類似した結合（下）を示すことを示す。図１８Ｄは、９８％より高い純度を有する単一のピークを実証するプロテインＡクロマトグラフィー後の二重特異物３のサイズ排除クロマトグラフィートレース（上）、および分子が高い熱安定性を有することを実証する二重特異物３の示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ）トレース（下）を示す。
配列
Figure 2022507253000011

Claims (274)

  1. 少なくとも２つの抗原結合性アームを含む多重特異性抗原結合性構築物であって、第１のアームが、免疫細胞により発現されたＰＤ－１に結合し、第２のアームが、第２の細胞により発現されたＰＤ－１リガンドに結合し、前記多重特異性抗原結合性構築物がＰＤ－１およびＰＤ－１リガンドの相互作用を遮断する、多重特異性抗原結合性構築物。
  2. 前記ＰＤ－１リガンドがＰＤ－Ｌ２である、請求項１に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  3. 前記ＰＤ－１リガンドがＰＤ－Ｌ１である、請求項１に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  4. 前記免疫細胞がＴ細胞である、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  5. 前記Ｔ細胞がＣＤ８＋ Ｔ細胞である、請求項４に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  6. 前記免疫細胞がナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  7. 前記免疫細胞がマクロファージである、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  8. 前記第２の細胞が第２の免疫細胞である、請求項１乃至６のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  9. 前記第２の免疫細胞が、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、骨髄由来抑制細胞、樹状細胞、または間葉間質細胞のいずれか１つまたは複数である、請求項８に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  10. 前記第２の免疫細胞が制御性Ｔ細胞である、請求項９に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  11. 前記第２の細胞が腫瘍細胞である、請求項１乃至７のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  12. 前記腫瘍細胞が、血液がん、リンパ腫、骨髄腫、白血病、神経学的がん、黒色腫、乳がん、前立腺がん、結腸直腸がん、肺がん、頭頸部がん、胃腸がん、肝臓がん、膵臓がん、泌尿生殖器がん、骨がん、腎臓がん、および血管がんからなる群から選択される、請求項１１に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  13. 両方のアームが、少なくとも１×１０－７Ｍ、少なくとも１×１０－８Ｍ、少なくとも１×１０－９Ｍ、または少なくとも１×１０－１０ＭのＫＤを有する、請求項１乃至１２のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  14. １つのアームのその標的への結合が、他のアームのその標的への結合を遮断しない、請求項１乃至１３のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  15. 前記第１のアームおよび第２のアームがそれらの各々の標的に結合し、両方のアームが同時に結合したままとなる、請求項１乃至１４のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  16. 前記第１のアームおよび前記第２のアームのそれらの各々の標的への結合が、前記免疫細胞および前記第２の細胞を一緒になるようにブリッジ形成させることができる、請求項１乃至１５のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  17. 前記免疫細胞および前記第２の細胞の前記ブリッジ形成が、フローサイトメトリーにより決定される、請求項１６に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  18. 前記第１のアームがＰＤ－１のアンタゴニストである、請求項１乃至１７のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  19. 前記第１のアームが、
    （ａ）（ｉ）配列番号７０（ＦＴＦＸ１Ｘ２ＹＡＸ３Ｘ４であり、Ｘ１＝Ｓ、Ｒ、Ｇ、またはＮであり、Ｘ２＝Ｄ、Ｓ、Ｎ、Ａ、Ｒ、またはＧであり、Ｘ３＝ＭまたはＬであり、Ｘ４＝Ｓ、Ｌ、またはＮである）を含むＣＤＲＨ１、（ｉｉ）配列番号７１（ＳＡＩＳＮＳＧＴＹＴＹＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、および（ｉｉｉ）配列番号７２（ＡＲＧＬＤＦＩＶＧＸ５ＴＧＮＤＹであり、Ｘ５＝Ａ、Ｙ、またはＲである）を含むＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域、ならびに
    （ｂ）（ｉ）配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含むＣＤＲＬ１、（ｉｉ）配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含むＣＤＲＬ２、および（ｉｉｉ）配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含むＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域
    を含む、請求項１８に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  20. 前記第１のアームのＣＤＲＨ１が配列番号７３（ＦＴＦＳＤＹＡＭＳ）を含み、前記第１のアームのＣＤＲＨ２が配列番号７１（ＳＡＩＳＮＳＧＴＹＴＹＹＡ）を含み、前記第１のアームのＣＤＲＨ３が配列番号７４（ＡＲＧＬＤＦＩＶＧＡＴＧＮＤＹ）を含む、請求項１９に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  21. 前記第１のアームのＣＤＲＨ１が配列番号７３（ＦＴＦＳＤＹＡＭＳ）を含み、前記第１のアームのＣＤＲＨ２が配列番号７１（ＳＡＩＳＮＳＧＴＹＴＹＹＡ）を含み、前記第１のアームのＣＤＲＨ３が配列番号７５（ＡＲＧＬＤＦＩＶＧＹＴＧＮＤＹ）を含む、請求項１９に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  22. 前記第１のアームのＣＤＲＨ１が配列番号７６（ＦＴＦＳＳＹＡＭＳ）を含み、前記第１のアームのＣＤＲＨ２が配列番号７１（ＳＡＩＳＮＳＧＴＹＴＹＹＡ）を含み、前記第１のアームのＣＤＲＨ３が配列番号７５（ＡＲＧＬＤＦＩＶＧＹＴＧＮＤＹ）を含む、請求項１９に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  23. 前記第１のアームのＣＤＲＨ１が配列番号７７（ＦＴＦＳＳＹＡＭＬ）を含み、前記第１のアームのＣＤＲＨ２が配列番号７１（ＳＡＩＳＮＳＧＴＹＴＹＹＡ）を含み、前記第１のアームのＣＤＲＨ３が配列番号７５（ＡＲＧＬＤＦＩＶＧＹＴＧＮＤＹ）を含む、請求項１９に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  24. 前記第１のアームのＣＤＲＨ１が配列番号７８（ＦＴＦＳＮＹＡＬＳ）を含み、前記第１のアームのＣＤＲＨ２が配列番号７１（ＳＡＩＳＮＳＧＴＹＴＹＹＡ）を含み、前記第１のアームのＣＤＲＨ３が配列番号７５（ＡＲＧＬＤＦＩＶＧＹＴＧＮＤＹ）を含む、請求項１９に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  25. 前記第１のアームのＣＤＲＨ１が配列番号７９（ＦＴＦＳＡＹＡＭＮ）を含み、前記第１のアームのＣＤＲＨ２が配列番号７１（ＳＡＩＳＮＳＧＴＹＴＹＹＡ）を含み、前記第１のアームのＣＤＲＨ３が配列番号７５（ＡＲＧＬＤＦＩＶＧＹＴＧＮＤＹ）を含む、請求項１９に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  26. 前記第１のアームのＣＤＲＨ１が配列番号８０（ＦＴＦＲＳＹＡＭＳ）を含み、前記第１のアームのＣＤＲＨ２が配列番号７１（ＳＡＩＳＮＳＧＴＹＴＹＹＡ）を含み、前記第１のアームのＣＤＲＨ３が配列番号７５（ＡＲＧＬＤＦＩＶＧＹＴＧＮＤＹ）を含む、請求項１９に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  27. 前記第１のアームのＣＤＲＨ１が配列番号８１（ＦＴＦＧＲＹＡＭＳ）を含み、前記第１のアームのＣＤＲＨ２が配列番号７１（ＳＡＩＳＮＳＧＴＹＴＹＹＡ）を含み、前記第１のアームのＣＤＲＨ３が配列番号７５（ＡＲＧＬＤＦＩＶＧＹＴＧＮＤＹ）を含む、請求項１９に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  28. 前記第１のアームのＣＤＲＨ１が配列番号８２（ＦＴＦＮＳＹＡＭＳ）を含み、前記第１のアームのＣＤＲＨ２が配列番号７１（ＳＡＩＳＮＳＧＴＹＴＹＹＡ）を含み、前記第１のアームのＣＤＲＨ３が配列番号７５（ＡＲＧＬＤＦＩＶＧＹＴＧＮＤＹ）を含む、請求項１９に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  29. 前記第１のアームのＣＤＲＨ１が配列番号８３（ＦＴＦＳＮＹＡＭＳ）を含み、前記第１のアームのＣＤＲＨ２が配列番号７１（ＳＡＩＳＮＳＧＴＹＴＹＹＡ）を含み、前記第１のアームのＣＤＲＨ３が配列番号７４（ＡＲＧＬＤＦＩＶＧＡＴＧＮＤＹ）を含む、請求項１９に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  30. 前記第１のアームのＣＤＲＨ１が配列番号８４（ＦＴＦＳＧＹＡＭＳ）を含み、前記第１のアームのＣＤＲＨ２が配列番号７１（ＳＡＩＳＮＳＧＴＹＴＹＹＡ）を含み、前記第１のアームのＣＤＲＨ３が配列番号８５（ＡＲＧＬＤＦＩＶＧＲＴＧＮＤＹ）を含む、請求項１９に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  31. 前記第１のアームのＣＤＲＨ１が配列番号８６（ＦＴＦＳＳＹＡＭＮ）を含み、前記第１のアームのＣＤＲＨ２が配列番号７１（ＳＡＩＳＮＳＧＴＹＴＹＹＡ）を含み、前記第１のアームのＣＤＲＨ３が配列番号８５（ＡＲＧＬＤＦＩＶＧＲＴＧＮＤＹ）を含む、請求項１９に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  32. 前記第１のアームのＣＤＲＨ１が配列番号８０（ＦＴＦＲＳＹＡＭＳ）を含み、前記第１のアームのＣＤＲＨ２が配列番号７１（ＳＡＩＳＮＳＧＴＹＴＹＹＡ）を含み、前記第１のアームのＣＤＲＨ３が配列番号８５（ＡＲＧＬＤＦＩＶＧＲＴＧＮＤＹ）を含む、請求項１９に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  33. 前記第１のアームの前記重鎖可変領域が、配列番号８７に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１９に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  34. 前記第１のアームの前記重鎖可変領域が、配列番号８８に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１９に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  35. 前記第１のアームの前記重鎖可変領域が、配列番号８９に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１９に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  36. 前記第１のアームの前記重鎖可変領域が、配列番号９０に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１９に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  37. 前記第１のアームの前記重鎖可変領域が、配列番号９１に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１９に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  38. 前記第１のアームの前記重鎖可変領域が、配列番号９２に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１９に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  39. 前記第１のアームの前記重鎖可変領域が、配列番号９３に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１９に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  40. 前記第１のアームの前記重鎖可変領域が、配列番号９４に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１９に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  41. 前記第１のアームの前記重鎖可変領域が、配列番号９５に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１９に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  42. 前記第１のアームの前記重鎖可変領域が、配列番号９６に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１９に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  43. 前記第１のアームの前記重鎖可変領域が、配列番号９７に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１９に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  44. 前記第１のアームの前記重鎖可変領域が、配列番号９８に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１９に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  45. 前記第１のアームの前記重鎖可変領域が、配列番号９９に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１９に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  46. 前記第１のアームの前記軽鎖可変領域が、配列番号５９に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１９乃至４５のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  47. 前記第２のアームが前記ＰＤ－１リガンドのアンタゴニストである、請求項１乃至４６のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  48. 前記第２のアームがＰＤ－Ｌ２のアンタゴニストである、請求項１乃至４７のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  49. 前記第２のアームがＰＤ－Ｌ１のアンタゴニストである、請求項１乃至４７のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  50. 前記第２のアームが、
    ａ．（ｉ）配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含むＣＤＲＨ１、（ｉｉ）配列番号２（ＧＧＩＩＰＸ１Ｘ２ＧＸ３ＡＴＹＡであり、Ｘ１はＶまたはＩであり、Ｘ２はＦ、Ｌ、またはＶであり、Ｘ３はＴまたはＡである）を含むＣＤＲＨ２、および（ｉｉｉ）配列番号３（ＡＲＬＫＸ１ＥＬＫＤＡＦＤＩであり、Ｘ１はＧ、Ｆ、またはＮである）を含むＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域、ならびに
    ｂ．（ｉ）配列番号４（ＲＡＳＱＸ１ＩＳＳＹＬＮであり、Ｘ１はＳ、Ｗ、またはＱである）を含むＣＤＲＬ１、（ｉｉ）配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含むＣＤＲＬ２、および（ｉｉｉ）配列番号６（Ｘ１ＱＳＹＳＴＰＬＴであり、Ｘ１はＱまたはＦである）を含むＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域
    を含む、請求項４９に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  51. 前記第２のアームのＣＤＲＨ１が配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、前記第２のアームのＣＤＲＨ２が配列番号７（ＧＧＩＩＰＩＬＧＡＡＴＹＡ）を含み、前記第２のアームのＣＤＲＨ３が配列番号８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含む、請求項５０に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  52. 前記第２のアームのＣＤＲＨ１が配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、前記第２のアームのＣＤＲＨ２が配列番号７（ＧＧＩＩＰＩＬＧＡＡＴＹＡ）を含み、前記第２のアームのＣＤＲＨ３が配列番号８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含み、前記第２のアームのＣＤＲＬ１が配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含み、前記第２のアームのＣＤＲＬ２が配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含み、前記第２のアームのＣＤＲＬ３が配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含む、請求項５１に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  53. 前記第２のアームのＣＤＲＨ１が配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、前記第２のアームのＣＤＲＨ２が配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含み、前記第２のアームのＣＤＲＨ３が配列番号８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含み、前記第２のアームのＣＤＲＬ１が配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含み、前記第２のアームのＣＤＲＬ２が配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含み、前記第２のアームのＣＤＲＬ３が配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含む、請求項５０に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  54. 前記第２のアームのＣＤＲＨ１が配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、前記第２のアームのＣＤＲＨ２が配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含み、前記第２のアームのＣＤＲＨ３が配列番号８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含む、請求項５０に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  55. 前記第２のアームのＣＤＲＨ１が配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、前記第２のアームのＣＤＲＨ２が配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含み、前記第２のアームのＣＤＲＨ３が配列番号８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含み、前記第２のアームのＣＤＲＬ１が配列番号１２（ＲＡＳＱＷＩＳＳＹＬＮ）を含み、前記第２のアームのＣＤＲＬ２が配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含み、前記第２のアームのＣＤＲＬ３が配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含む、請求項５４に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  56. 前記第２のアームのＣＤＲＨ１が配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、前記第２のアームのＣＤＲＨ２が配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含み、前記第２のアームのＣＤＲＨ３が配列番号８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含み、前記第２のアームのＣＤＲＬ１が配列番号１３（ＲＡＳＱＱＩＳＳＹＬＮ）を含み、前記第２のアームのＣＤＲＬ２が配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含み、前記第２のアームのＣＤＲＬ３が配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含む、請求項５４に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  57. 前記第２のアームのＣＤＲＨ１が配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、前記第２のアームのＣＤＲＨ２が配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含み、前記第２のアームのＣＤＲＨ３が配列番号８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含み、前記第２のアームのＣＤＲＬ１が配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含み、前記第２のアームのＣＤＲＬ２が配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含み、前記第２のアームのＣＤＲＬ３が配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含む、請求項５０に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  58. 前記第２のアームのＣＤＲＨ１が配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、前記第２のアームのＣＤＲＨ２が配列番号１５（ＧＧＩＩＰＩＦＧＩＡＮＹＡ）を含み、前記第２のアームのＣＤＲＨ３が配列番号８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含む、請求項５０に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  59. 前記第２のアームのＣＤＲＨ１が配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、前記第２のアームのＣＤＲＨ２が配列番号１５（ＧＧＩＩＰＩＦＧＩＡＮＹＡ）を含み、前記第２のアームのＣＤＲＨ３が配列番号８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含み、前記第２のアームのＣＤＲＬ１が配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含み、前記第２のアームのＣＤＲＬ２が配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含み、前記第２のアームのＣＤＲＬ３が配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含む、請求項５８に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  60. 前記第２のアームのＣＤＲＨ１が配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、前記第２のアームのＣＤＲＨ２が配列番号１６（ＧＧＩＩＰＮＦＧＴＡＴＹＡ）を含み、前記第２のアームのＣＤＲＨ３が配列番号１７（ＡＲＬＫＧＥＬＫＧＡＧＤＩ）を含む、請求項５０に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  61. 前記第２のアームのＣＤＲＨ１が配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、前記第２のアームのＣＤＲＨ２が配列番号１６（ＧＧＩＩＰＮＦＧＴＡＴＹＡ）を含み、前記第２のアームのＣＤＲＨ３が配列番号１７（ＡＲＬＫＧＥＬＫＧＡＧＤＩ）を含み、前記第２のアームのＣＤＲＬ１が配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含み、前記第２のアームのＣＤＲＬ２が配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含み、前記第２のアームのＣＤＲＬ３が配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含む、請求項６０に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  62. 前記第２のアームのＣＤＲＨ１が配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、前記第２のアームのＣＤＲＨ２が配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含み、前記第２のアームのＣＤＲＨ３が配列番号１８（ＡＲＬＫＦＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含む、請求項５０に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  63. 前記第２のアームのＣＤＲＨ１が配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、前記第２のアームのＣＤＲＨ２が配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含み、前記第２のアームのＣＤＲＨ３が配列番号１８（ＡＲＬＫＦＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含み、前記第２のアームのＣＤＲＬ１が配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含み、前記第２のアームのＣＤＲＬ２が配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含み、前記第２のアームのＣＤＲＬ３が配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含む、請求項６２に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  64. 前記第２のアームのＣＤＲＨ１が配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、前記第２のアームのＣＤＲＨ２が配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含み、前記第２のアームのＣＤＲＨ３が配列番号１９（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＥ）を含む、請求項５０に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  65. 前記第２のアームのＣＤＲＨ１が配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、前記第２のアームのＣＤＲＨ２が配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含み、前記第２のアームのＣＤＲＨ３が配列番号１９（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＥ）を含み、前記第２のアームのＣＤＲＬ１が配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含み、前記第２のアームのＣＤＲＬ２が配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含み、前記第２のアームのＣＤＲＬ３が配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含む、請求項６４に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  66. 前記第２のアームのＣＤＲＨ１が配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、前記第２のアームのＣＤＲＨ２が配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含み、前記第２のアームのＣＤＲＨ３が配列番号２０（ＡＲＬＫＮＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含む、請求項５０に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  67. 前記第２のアームのＣＤＲＨ１が配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、前記第２のアームのＣＤＲＨ２が配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含み、前記第２のアームのＣＤＲＨ３が配列番号２０（ＡＲＬＫＮＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含み、前記第２のアームのＣＤＲＬ１が配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含み、前記第２のアームのＣＤＲＬ２が配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含み、前記第２のアームのＣＤＲＬ３が配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含む、請求項６６に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  68. 前記第２のアームのＣＤＲＨ１が配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、前記第２のアームのＣＤＲＨ２が配列番号２１（ＧＧＶＩＰＦＬＧＴＡＮＹＡ）を含み、前記第２のアームのＣＤＲＨ３が配列番号２２（ＡＲＬＫＧＩＬＫＤＡＬＤＩ）を含む、請求項５０に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  69. 前記第２のアームのＣＤＲＨ１が配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、前記第２のアームのＣＤＲＨ２が配列番号２１（ＧＧＶＩＰＦＬＧＴＡＮＹＡ）を含み、前記第２のアームのＣＤＲＨ３が配列番号２２（ＡＲＬＫＧＩＬＫＤＡＬＤＩ）を含み、前記第２のアームのＣＤＲＬ１が配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含み、前記第２のアームのＣＤＲＬ２が配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含み、前記第２のアームのＣＤＲＬ３が配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含む、請求項６８に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  70. 前記第２のアームのＣＤＲＨ１が配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、前記第２のアームのＣＤＲＨ２が配列番号２９（ＧＲＩＩＰＩＦＧＴＡＤＹＡ）を含み、前記第２のアームのＣＤＲＨ３が配列番号８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含む、請求項５０に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  71. 前記第２のアームのＣＤＲＨ１が配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、前記第２のアームのＣＤＲＨ２が配列番号２９（ＧＲＩＩＰＩＦＧＴＡＤＹＡ）を含み、前記第２のアームのＣＤＲＨ３が配列番号８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含み、前記第２のアームのＣＤＲＬ１が配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含み、前記第２のアームのＣＤＲＬ２が配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含み、前記第２のアームのＣＤＲＬ３が配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含む、請求項７０に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  72. 前記第２のアームのＣＤＲＨ１が配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、前記第２のアームのＣＤＲＨ２が配列番号３１（ＧＧＩＩＰＩＬＧＴＡＴＹＡ）を含み、前記第２のアームのＣＤＲＨ３が配列番号３２（ＡＲＲＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含む、請求項５０に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  73. 前記第２のアームのＣＤＲＨ１が配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、前記第２のアームのＣＤＲＨ２が配列番号３１（ＧＧＩＩＰＩＬＧＴＡＴＹＡ）を含み、前記第２のアームのＣＤＲＨ３が配列番号３２（ＡＲＲＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含み、前記第２のアームのＣＤＲＬ１が配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含み、前記第２のアームのＣＤＲＬ２が配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含み、前記第２のアームのＣＤＲＬ３が配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含む、請求項７２に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  74. 前記第２のアームのＣＤＲＨ１が配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、前記第２のアームのＣＤＲＨ２が配列番号３３（ＧＧＩＩＰＩＶＡＴＡＮＹＡ）を含み、前記第２のアームのＣＤＲＨ３が配列番号３２（ＡＲＲＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含む、請求項５０に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  75. 前記第２のアームのＣＤＲＨ１が配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、前記第２のアームのＣＤＲＨ２が配列番号３３（ＧＧＩＩＰＩＶＡＴＡＮＹＡ）を含み、前記第２のアームのＣＤＲＨ３が配列番号３２（ＡＲＲＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含み、前記第２のアームのＣＤＲＬ１が配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含み、前記第２のアームのＣＤＲＬ２が配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含み、前記第２のアームのＣＤＲＬ３が配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含む、請求項７４に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  76. 前記第２のアームのＣＤＲＨ１が配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、前記第２のアームのＣＤＲＨ２が配列番号３４（ＧＧＩＩＰＩＦＧＫＡＴＹＡ）を含み、前記第２のアームのＣＤＲＨ３が配列番号３２（ＡＲＲＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含む、請求項５０に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  77. 前記第２のアームのＣＤＲＨ１が配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、前記第２のアームのＣＤＲＨ２が配列番号３４（ＧＧＩＩＰＩＦＧＫＡＴＹＡ）を含み、前記第２のアームのＣＤＲＨ３が配列番号３２（ＡＲＲＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含み、前記第２のアームのＣＤＲＬ１が配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含み、前記第２のアームのＣＤＲＬ２が配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含み、前記第２のアームのＣＤＲＬ３が配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含む、請求項７６に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  78. 前記第２のアームのＣＤＲＨ１が配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、前記第２のアームのＣＤＲＨ２が配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含み、前記第２のアームのＣＤＲＨ３が配列番号８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含み、前記第２のアームのＣＤＲＬ１が配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含み、前記第２のアームのＣＤＲＬ２が配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含み、前記第２のアームのＣＤＲＬ３が配列番号３８（ＦＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含む、請求項５０に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  79. 前記第２のアームのＣＤＲＨ１が配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、前記第２のアームのＣＤＲＨ２が配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含み、前記第２のアームのＣＤＲＨ３が配列番号８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含み、前記第２のアームのＣＤＲＬ１が配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含み、前記第２のアームのＣＤＲＬ２が配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含み、前記第２のアームのＣＤＲＬ３が配列番号３９（ＱＱＳＹＳＴＩＬＴ）を含む、請求項５０に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  80. 前記第２のアームが、
    ａ．（ｉ）配列番号１４（ＧＴＦＳＳＹＡＦＳ）を含むＣＤＲＨ１、（ｉｉ）配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含むＣＤＲＨ２および（ｉｉｉ）配列番号８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含むＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域、ならびに
    ｂ．（ｉ）配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含むＣＤＲＬ１、（ｉｉ）配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含むＣＤＲＬ２、および（ｉｉｉ）配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含むＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域
    を含む、請求項５０に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  81. 前記第２のアームが、（ｉ）配列番号２３（ＧＴＦＳＳＹＡＩＳ）を含むＣＤＲＨ１、（ｉｉ）配列番号２４（ＧＧＩＩＰＩＶＧＩＡＮＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、および（ｉｉｉ）配列番号８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含むＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域を含む、請求項５０に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  82. 前記第２のアームが、（ｉ）配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含むＣＤＲＬ１、（ｉｉ）配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含むＣＤＲＬ２、および（ｉｉｉ）配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含むＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含む、請求項８１に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  83. 前記第２のアームが、（ｉ）配列番号２３（ＧＴＦＳＳＹＡＩＳ）を含むＣＤＲＨ１、（ｉｉ）配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、および（ｉｉｉ）配列番号２５（ＡＲＬＫＧＥＦＫＤＡＦＤＩ）を含むＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域を含む、請求項５０に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  84. 前記第２のアームが、（ｉ）配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含むＣＤＲＬ１、（ｉｉ）配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含むＣＤＲＬ２、および（ｉｉｉ）配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含むＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含む、請求項８３に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  85. 前記第２のアームが、（ｉ）配列番号２３（ＧＴＦＳＳＹＡＩＳ）を含むＣＤＲＨ１、（ｉｉ）配列番号２６（ＧＲＩＩＰＬＦＧＴＡＨＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、および（ｉｉｉ）配列番号８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含むＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域を含む、請求項５０に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  86. 前記第２のアームが、（ｉ）配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含むＣＤＲＬ１、（ｉｉ）配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含むＣＤＲＬ２、および（ｉｉｉ）配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含むＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含む、請求項８５に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  87. 前記第２のアームが、（ｉ）配列番号２３（ＧＴＦＳＳＹＡＩＳ）を含むＣＤＲＨ１、（ｉｉ）配列番号２７（ＧＲＩＮＰＩＬＧＴＡＮＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、および（ｉｉｉ）配列番号２８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＳＩ）を含むＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域を含む、請求項５０に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  88. 前記第２のアームが、（ｉ）配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含むＣＤＲＬ１、（ｉｉ）配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含むＣＤＲＬ２、および（ｉｉｉ）配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含むＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含む、請求項８７に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  89. 前記第２のアームが、（ｉ）配列番号２３（ＧＴＦＳＳＹＡＩＳ）を含むＣＤＲＨ１、（ｉｉ）配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、および（ｉｉｉ）配列番号３０（ＡＲＬＫＧＥＬＫＣＡＦＤＩ）を含むＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域を含む、請求項５０に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  90. 前記第２のアームが、（ｉ）配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含むＣＤＲＬ１、（ｉｉ）配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含むＣＤＲＬ２、および（ｉｉｉ）配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含むＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含む、請求項８９に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  91. 前記第２のアームが、（ｉ）配列番号３６（ＧＰＦＲＳＨＡＶＳ）を含むＣＤＲＨ１、（ｉｉ）配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、および（ｉｉｉ）配列番号３７（ＡＲＬＫＳＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含むＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域を含む、請求項５０に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  92. 前記第２のアームが、（ｉ）配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含むＣＤＲＬ１、（ｉｉ）配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含むＣＤＲＬ２、および（ｉｉｉ）配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含むＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含む、請求項９１に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  93. 前記第２のアームが、配列番号３５、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、または５８のいずれか１つに対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号５９、６０、６１、６２、または６３のいずれか１つに対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項５０に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  94. 前記第２のアームの前記重鎖可変領域が、配列番号３５（ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＳＹＡＩＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ）に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項９３に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  95. 前記第２のアームの前記重鎖可変領域が、配列番号４０（ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＳＹＡＦＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ）に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項９３に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  96. 前記第２のアームの前記重鎖可変領域が、配列番号４１（ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＳＹＡＩＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧＩＩＰＩＦＧＩＡＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ）に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項９３に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  97. 前記第２のアームの前記重鎖可変領域が、配列番号４２（ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＳＹＡＩＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧＩＩＰＮＦＧＴＡＴＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＬＫＧＥＬＫＧＡＧＤＩＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ）に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項９３に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  98. 前記第２のアームの前記重鎖可変領域が、配列番号４３（ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＳＹＡＩＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＬＫＦＥＬＫＤＡＦＤＩＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ）に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項９３に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  99. 前記第２のアームの前記重鎖可変領域が、配列番号４４（ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＳＹＡＩＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＥＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ）に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項９３に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  100. 前記第２のアームの前記重鎖可変領域が、配列番号４５（ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＳＹＡＩＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩＷＧＱＧＴＬＶＴＡＳＴ）に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項９３に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  101. 前記第２のアームの前記重鎖可変領域が、配列番号４６（ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＳＹＡＩＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＬＫＮＥＬＫＤＡＦＤＩＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ）に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項９３に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  102. 前記第２のアームの前記重鎖可変領域が、配列番号４７（ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＳＹＡＩＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧＶＩＰＦＬＧＴＡＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＬＫＧＩＬＫＤＡＬＤＩＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ）に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項９３に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  103. 前記第２のアームの前記重鎖可変領域が、配列番号４８（ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＳＹＡＩＳＷＶＲＱＡＰＧＱＤＬＥＷＭＧＧＩＩＰＩＶＧＩＡＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ）に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項９３に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  104. 前記第２のアームの前記重鎖可変領域が、配列番号４９（ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＳＹＡＩＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＬＫＧＥＦＫＤＡＦＤＩＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ）に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項９３に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  105. 前記第２のアームの前記重鎖可変領域が、配列番号５０（ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＳＹＡＩＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＲＩＩＰＬＦＧＴＡＨＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ）に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項９３に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  106. 前記第２のアームの前記重鎖可変領域が、配列番号５１（ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＳＹＡＩＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＲＩＮＰＩＬＧＴＡＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＳＩＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ）に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項９３に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  107. 前記第２のアームの前記重鎖可変領域が、配列番号５２（ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＳＹＡＩＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＲＩＩＰＩＦＧＴＡＤＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ）に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項９３に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  108. 前記第２のアームの前記重鎖可変領域が、配列番号５３（ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＫＦＳＳＹＡＩＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＬＫＧＥＬＫＣＡＦＤＩＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ）に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項９３に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  109. 前記第２のアームの前記重鎖可変領域が、配列番号５４（ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＳＹＡＩＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧＩＩＰＩＬＧＴＡＴＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ）に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項９３に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  110. 前記第２のアームの前記重鎖可変領域が、配列番号５５（ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＳＹＡＩＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧＩＩＰＩＬＧＡＡＴＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ）に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項９３に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  111. 前記第２のアームの前記重鎖可変領域が、配列番号５６（ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＳＹＡＩＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧＩＩＰＩＶＡＴＡＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ）に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項９３に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  112. 前記第２のアームの前記重鎖可変領域が、配列番号５７（ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＳＹＡＩＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧＩＩＰＩＦＧＫＡＴＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ）に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項９３に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  113. 前記第２のアームの前記重鎖可変領域が、配列番号５８（ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＰＦＲＳＨＡＶＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＬＫＳＥＬＫＤＡＦＤＩＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ）に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項９３に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  114. 前記第２のアームの前記軽鎖可変領域が、配列番号５９（ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＳＹＳＴＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ）に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項９３に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  115. 前記第２のアームの前記軽鎖可変領域が、配列番号６０（ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＷＩＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＳＹＳＴＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ）に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項９３に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  116. 前記第２のアームの前記軽鎖可変領域が、配列番号６１（ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＱＩＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＳＹＳＴＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ）に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項９３に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  117. 前記第２のアームの前記軽鎖可変領域が、配列番号６２（ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＦＱＳＹＳＴＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ）に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項９３に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  118. 前記第２のアームの前記軽鎖可変領域が、配列番号６３（ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＳＹＳＴＩＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ）に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項９３に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  119. 二重特異性抗体である、請求項１乃至１１８のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  120. 前記二重特異性抗体がＰＤ－１およびＰＤ－１リガンドの両方のアンタゴニストである、請求項１１９に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  121. 共通の軽鎖を含む、請求項１乃至１２０のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  122. 前記アームの一方または両方がアプタマーである、請求項１乃至１１８のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  123. 前記アームの一方または両方が抗体以外のタンパク質である、請求項１乃至１１８のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  124. 少なくとも２つの二重特異性抗体を含む、請求項１乃至１２１のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  125. 前記少なくとも２つの二重特異性抗体の１つがＰＤ－１について一価である、請求項１２４に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  126. 前記少なくとも２つの二重特異性抗体の１つがＰＤ－１リガンドについて一価である、請求項１２４に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  127. 前記アームの少なくとも１つがＰＤ－１に対して特異的な二価抗体である、請求項１乃至１１８のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  128. 前記アームの少なくとも１つがＰＤ－Ｌ１に対して特異的な二価抗体である、請求項１乃至１１８のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  129. 前記アームの少なくとも１つがＰＤ－１に対して特異的な二価抗体であり、前記アームの少なくとも１つがＰＤ－Ｌ１に対して特異的な二価抗体である、請求項１乃至１１８のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  130. 前記二重特異性抗体がＰＤ－１上の２つの異なるエピトープに結合する、請求項１２５に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  131. 前記二重特異性抗体がＰＤ－１リガンド上の２つの異なるエピトープに結合する、請求項１２６に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  132. Ｆｃドメインを含まない、請求項１乃至１３１のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  133. 前記第１のアームもしくは第２のアーム、または両方が、１つまたは複数の免疫グロブリンＦｃ改変を含む重鎖を含む、請求項１乃至１３１のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  134. 前記重鎖の免疫グロブリンＦｃドメインが、前記第１および第２のアームのヘテロ二量体化を促進する１つまたは複数のアミノ酸突然変異を含む、請求項１３３に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  135. 前記突然変異が前記重鎖のＣＨ３ドメイン中に存在する、請求項１３４に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  136. クアドローマ細胞中で製造される、請求項１乃至１３５のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  137. １つまたは複数の免疫グロブリン定常領域改変を含む、請求項１乃至１３６のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  138. 免疫グロブリン定常領域が、抗体のヘテロ二量体化を促進する１つまたは複数のアミノ酸突然変異を含む、請求項１乃至１３７のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  139. １つまたは複数の突然変異が１つのアームの軽鎖定常領域中に存在し、１つまたは複数の突然変異が別のアームの重鎖定常領域中に存在する、請求項１３８に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  140. 二重特異性抗体が、二重特異性ＩｇＧ、二重特異性抗体断片、二重特異性融合タンパク質、付加型ＩｇＧ、および二重特異性抗体コンジュゲートからなる群から選択されるフォーマットのものである、請求項１１９または１２４乃至１３９のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  141. Ｆｃ領域が低減したエフェクター機能を有する、請求項１３３乃至１４０のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  142. Ｆｃ領域が前記構築物の半減期を増進する、請求項１３３乃至１４１のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  143. 前記アームの少なくとも１つがＰＤ－１について二価である、請求項１乃至１４２のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  144. 前記アームの少なくとも１つがＰＤ－Ｌ１について二価である、請求項１乃至１４２のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  145. 前記アームの少なくとも１つがＰＤ－１について二価であり、前記アームの少なくとも１つがＰＤ－Ｌ１について二価である、請求項１乃至１４２のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  146. 配列番号１００または１０２のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％同一の重鎖アミノ酸配列を含む、請求項１乃至１８のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  147. 配列番号１０１または１０３のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％同一の軽鎖アミノ酸配列を含む、請求項１乃至１８のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  148. 前記構築物が、配列番号１００のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％同一の重鎖アミノ酸配列を含み、前記構築物が、配列番号１０１のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％同一の軽鎖アミノ酸配列を含む、請求項１乃至１８のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  149. 前記構築物が、配列番号１０２のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％同一の重鎖アミノ酸配列を含み、前記構築物が、配列番号１０３のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％同一の軽鎖アミノ酸配列を含む、請求項１乃至１８のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  150. 前記多重特異性抗原結合性構築物の結合が、前記免疫細胞によるＰＤ－１発現の低減を引き起こす、請求項１乃至１４９のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  151. 前記多重特異性抗原結合性構築物の結合が、前記免疫細胞からのＰＤ－１のシェディングを誘導することによりＰＤ－１細胞発現を低減する、請求項１乃至１５０のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  152. 抗原結合の少なくとも２つの単位を含む多重特異性抗原結合性構築物であって、抗原結合の第１の単位がＰＤ－１に結合し、抗原結合の第２の単位がＰＤ－１リガンドに結合する、多重特異性抗原結合性構築物。
  153. 抗原結合の前記第１の単位が、免疫細胞により発現されたＰＤ－１に結合する、請求項１５２に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  154. 抗原結合の前記第２の単位が、第２の細胞により発現されたＰＤ－１リガンドに結合する、請求項１５２または１５３に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  155. ＰＤ－１および前記ＰＤ－１リガンドの相互作用を遮断する、請求項１５２乃至１５４のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  156. ＰＤ－１に結合する抗原結合の少なくとも２つの単位を含む、請求項１５２乃至１５５のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  157. ＰＤ－１リガンドに結合する抗原結合の少なくとも２つの単位を含む、請求項１５２乃至１５６のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  158. ＰＤ－１に結合する抗原結合の２つの単位を含む、請求項１５２乃至１５７のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  159. ＰＤ－１リガンドに結合する抗原結合の２つの単位を含む、請求項１５２乃至１５８のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  160. 抗原結合の少なくとも４つの単位を含み、抗原結合の２つの単位がＰＤ－１に結合し、抗原結合の２つの単位がＰＤ－１リガンドに結合する、請求項１５２乃至１５９のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  161. 抗原結合の４つの単位を含み、抗原結合の２つの単位がＰＤ－１に結合し、抗原結合の２つの単位がＰＤ－１リガンドに結合する、請求項１５２乃至１６０のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  162. 前記多重特異性抗原結合性構築物の結合が免疫細胞によるＰＤ－１発現の低減を引き起こす、請求項１５２乃至１６１のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  163. 前記多重特異性抗原結合性構築物の結合が、免疫細胞からのＰＤ－１のシェディングを誘導することによりＰＤ－１細胞発現を低減する、請求項１５２乃至１６２のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  164. 前記ＰＤ－１リガンドがＰＤ－Ｌ２である、請求項１５２乃至１６３のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  165. 前記ＰＤ－１リガンドがＰＤ－Ｌ１である、請求項１５２乃至１６３のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  166. 前記免疫細胞がＴ細胞である、請求項１５３に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  167. 前記Ｔ細胞がＣＤ８＋ Ｔ細胞である、請求項１６６に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  168. 前記免疫細胞がナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である、請求項１５３に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  169. 前記免疫細胞がマクロファージである、請求項１５３に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  170. 前記第２の細胞が第２の免疫細胞である、請求項１５４に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  171. 前記第２の免疫細胞が、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、骨髄由来抑制細胞、樹状細胞、または間葉間質細胞のいずれか１つまたは複数である、請求項１７０に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  172. 前記第２の免疫細胞が制御性Ｔ細胞である、請求項１７０に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  173. 前記第２の細胞が腫瘍細胞である、請求項１５４に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  174. 前記腫瘍細胞が、血液がん、リンパ腫、骨髄腫、白血病、神経学的がん、黒色腫、乳がん、前立腺がん、結腸直腸がん、肺がん、頭頸部がん、胃腸がん、肝臓がん、膵臓がん、泌尿生殖器がん、骨がん、腎臓がん、および血管がんからなる群から選択される、請求項１７３に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  175. 抗原結合の両方の単位が、少なくとも１×１０－７Ｍ、少なくとも１×１０－８Ｍ、少なくとも１×１０－９Ｍ、または少なくとも１×１０－１０ＭのＫＤを有する、請求項１５２乃至１７４のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  176. 抗原結合の１つの単位のその標的への結合が、抗原結合の他の単位のその標的への結合を遮断しない、請求項１５２乃至１７５のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  177. 抗原結合の前記第１の単位および抗原結合の前記第２の単位がそれらの各々の標的に結合し、抗原結合の両方の単位が同時に結合したままとなる、請求項１５２乃至１７６のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  178. 抗原結合の前記第１の単位および抗原結合の前記第２の単位のそれらの各々の標的への結合が、免疫細胞および第２の細胞を一緒になるようにブリッジ形成させることができる、請求項１５２乃至１７７のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  179. 前記免疫細胞および前記第２の細胞の前記ブリッジ形成が、フローサイトメトリーにより決定される、請求項１７８に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  180. 抗原結合の前記第１の単位がＰＤ－１のアンタゴニストである、請求項１５２乃至１７９のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  181. 抗原結合の前記第１の単位が、
    （ａ）（ｉ）配列番号７０（ＦＴＦＸ１Ｘ２ＹＡＸ３Ｘ４であり、Ｘ１＝Ｓ、Ｒ、Ｇ、またはＮであり、Ｘ２＝Ｄ、Ｓ、Ｎ、Ａ、Ｒ、またはＧであり、Ｘ３＝ＭまたはＬであり、Ｘ４＝Ｓ、Ｌ、またはＮである）を含むＣＤＲＨ１、（ｉｉ）配列番号７１（ＳＡＩＳＮＳＧＴＹＴＹＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、および（ｉｉｉ）配列番号７２（ＡＲＧＬＤＦＩＶＧＸ５ＴＧＮＤＹであり、Ｘ５＝Ａ、Ｙ、またはＲである）を含むＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域、ならびに
    （ｂ）（ｉ）配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含むＣＤＲＬ１、（ｉｉ）配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含むＣＤＲＬ２、および（ｉｉｉ）配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含むＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域
    を含む、請求項１８０に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  182. （ａ）抗原結合の前記第１の単位のＣＤＲＨ１が配列番号７３（ＦＴＦＳＤＹＡＭＳ）を含み、抗原結合の前記第１の単位のＣＤＲＨ２が配列番号７１（ＳＡＩＳＮＳＧＴＹＴＹＹＡ）を含み、抗原結合の前記第１の単位のＣＤＲＨ３が配列番号７４（ＡＲＧＬＤＦＩＶＧＡＴＧＮＤＹ）を含み、
    （ｂ）抗原結合の前記第１の単位のＣＤＲＨ１が配列番号７３（ＦＴＦＳＤＹＡＭＳ）を含み、抗原結合の前記第１の単位のＣＤＲＨ２が配列番号７１（ＳＡＩＳＮＳＧＴＹＴＹＹＡ）を含み、抗原結合の前記第１の単位のＣＤＲＨ３が配列番号７５（ＡＲＧＬＤＦＩＶＧＹＴＧＮＤＹ）を含み、
    （ｃ）抗原結合の前記第１の単位のＣＤＲＨ１が配列番号７６（ＦＴＦＳＳＹＡＭＳ）を含み、抗原結合の前記第１の単位のＣＤＲＨ２が配列番号７１（ＳＡＩＳＮＳＧＴＹＴＹＹＡ）を含み、抗原結合の前記第１の単位のＣＤＲＨ３が配列番号７５（ＡＲＧＬＤＦＩＶＧＹＴＧＮＤＹ）を含み、
    （ｄ）抗原結合の前記第１の単位のＣＤＲＨ１が配列番号７７（ＦＴＦＳＳＹＡＭＬ）を含み、抗原結合の前記第１の単位のＣＤＲＨ２が配列番号７１（ＳＡＩＳＮＳＧＴＹＴＹＹＡ）を含み、抗原結合の前記第１の単位のＣＤＲＨ３が配列番号７５（ＡＲＧＬＤＦＩＶＧＹＴＧＮＤＹ）を含み、
    （ｅ）抗原結合の前記第１の単位のＣＤＲＨ１が配列番号７８（ＦＴＦＳＮＹＡＬＳ）を含み、抗原結合の前記第１の単位のＣＤＲＨ２が配列番号７１（ＳＡＩＳＮＳＧＴＹＴＹＹＡ）を含み、抗原結合の前記第１の単位のＣＤＲＨ３が配列番号７５（ＡＲＧＬＤＦＩＶＧＹＴＧＮＤＹ）を含み、
    （ｆ）抗原結合の前記第１の単位のＣＤＲＨ１が配列番号７９（ＦＴＦＳＡＹＡＭＮ）を含み、抗原結合の前記第１の単位のＣＤＲＨ２が配列番号７１（ＳＡＩＳＮＳＧＴＹＴＹＹＡ）を含み、抗原結合の前記第１の単位のＣＤＲＨ３が配列番号７５（ＡＲＧＬＤＦＩＶＧＹＴＧＮＤＹ）を含み、
    （ｇ）抗原結合の前記第１の単位のＣＤＲＨ１が配列番号８０（ＦＴＦＲＳＹＡＭＳ）を含み、抗原結合の前記第１の単位のＣＤＲＨ２が配列番号７１（ＳＡＩＳＮＳＧＴＹＴＹＹＡ）を含み、抗原結合の前記第１の単位のＣＤＲＨ３が配列番号７５（ＡＲＧＬＤＦＩＶＧＹＴＧＮＤＹ）を含み、
    （ｈ）抗原結合の前記第１の単位のＣＤＲＨ１が配列番号８１（ＦＴＦＧＲＹＡＭＳ）を含み、抗原結合の前記第１の単位のＣＤＲＨ２が配列番号７１（ＳＡＩＳＮＳＧＴＹＴＹＹＡ）を含み、抗原結合の前記第１の単位のＣＤＲＨ３が配列番号７５（ＡＲＧＬＤＦＩＶＧＹＴＧＮＤＹ）を含み、
    （ｉ）抗原結合の前記第１の単位のＣＤＲＨ１が配列番号８２（ＦＴＦＮＳＹＡＭＳ）を含み、抗原結合の前記第１の単位のＣＤＲＨ２が配列番号７１（ＳＡＩＳＮＳＧＴＹＴＹＹＡ）を含み、抗原結合の前記第１の単位のＣＤＲＨ３が配列番号７５（ＡＲＧＬＤＦＩＶＧＹＴＧＮＤＹ）を含み、
    （ｊ）抗原結合の前記第１の単位のＣＤＲＨ１が配列番号８３（ＦＴＦＳＮＹＡＭＳ）を含み、抗原結合の前記第１の単位のＣＤＲＨ２が配列番号７１（ＳＡＩＳＮＳＧＴＹＴＹＹＡ）を含み、抗原結合の前記第１の単位のＣＤＲＨ３が配列番号７４（ＡＲＧＬＤＦＩＶＧＡＴＧＮＤＹ）を含み、
    （ｋ）抗原結合の前記第１の単位のＣＤＲＨ１が配列番号８４（ＦＴＦＳＧＹＡＭＳ）を含み、抗原結合の前記第１の単位のＣＤＲＨ２が配列番号７１（ＳＡＩＳＮＳＧＴＹＴＹＹＡ）を含み、抗原結合の前記第１の単位のＣＤＲＨ３が配列番号８５（ＡＲＧＬＤＦＩＶＧＲＴＧＮＤＹ）を含み、
    （ｌ）抗原結合の前記第１の単位のＣＤＲＨ１が配列番号８６（ＦＴＦＳＳＹＡＭＮ）を含み、抗原結合の前記第１の単位のＣＤＲＨ２が配列番号７１（ＳＡＩＳＮＳＧＴＹＴＹＹＡ）を含み、抗原結合の前記第１の単位のＣＤＲＨ３が配列番号８５（ＡＲＧＬＤＦＩＶＧＲＴＧＮＤＹ）を含み、または
    （ｍ）抗原結合の前記第１の単位のＣＤＲＨ１が配列番号８０（ＦＴＦＲＳＹＡＭＳ）を含み、抗原結合の前記第１の単位のＣＤＲＨ２が配列番号７１（ＳＡＩＳＮＳＧＴＹＴＹＹＡ）を含み、抗原結合の前記第１の単位のＣＤＲＨ３が配列番号８５（ＡＲＧＬＤＦＩＶＧＲＴＧＮＤＹ）を含む、請求項１８１に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  183. （ａ）抗原結合の前記第１の単位の前記重鎖可変領域が、配列番号８７に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、
    （ｂ）抗原結合の前記第１の単位の前記重鎖可変領域が、配列番号８８に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、
    （ｃ）抗原結合の前記第１の単位の前記重鎖可変領域が、配列番号８９に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、
    （ｄ）抗原結合の前記第１の単位の前記重鎖可変領域が、配列番号９０に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、
    （ｅ）抗原結合の前記第１の単位の前記重鎖可変領域が、配列番号９１に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、
    （ｆ）抗原結合の前記第１の単位の前記重鎖可変領域が、配列番号９２に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、
    （ｇ）抗原結合の前記第１の単位の前記重鎖可変領域が、配列番号９３に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、
    （ｈ）抗原結合の前記第１の単位の前記重鎖可変領域が、配列番号９４に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、
    （ｉ）抗原結合の前記第１の単位の前記重鎖可変領域が、配列番号９５に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、
    （ｊ）抗原結合の前記第１の単位の前記重鎖可変領域が、配列番号９６に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、
    （ｋ）抗原結合の前記第１の単位の前記重鎖可変領域が、配列番号９７に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、
    （ｌ）抗原結合の前記第１の単位の前記重鎖可変領域が、配列番号９８に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、または
    （ｍ）抗原結合の前記第１の単位の前記重鎖可変領域が、配列番号９９に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１８１に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  184. 抗原結合の前記第１の単位の前記軽鎖可変領域が、配列番号５９に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１８１乃至１８３のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  185. 抗原結合の前記第２の単位が前記ＰＤ－１リガンドのアンタゴニストである、請求項１５２乃至１８４のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  186. 抗原結合の前記第２の単位がＰＤ－Ｌ２のアンタゴニストである、請求項１５２乃至１８５のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  187. 抗原結合の前記第２の単位がＰＤ－Ｌ１のアンタゴニストである、請求項１５２乃至１８５のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  188. 抗原結合の前記第２の単位が、
    ａ．（ｉ）配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含むＣＤＲＨ１、（ｉｉ）配列番号２（ＧＧＩＩＰＸ１Ｘ２ＧＸ３ＡＴＹＡであり、Ｘ１はＶまたはＩであり、Ｘ２はＦ、Ｌ、またはＶであり、Ｘ３はＴまたはＡである）を含むＣＤＲＨ２、および（ｉｉｉ）配列番号３（ＡＲＬＫＸ１ＥＬＫＤＡＦＤＩであり、Ｘ１はＧ、Ｆ、またはＮである）を含むＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域、ならびに
    ｂ．（ｉ）配列番号４（ＲＡＳＱＸ１ＩＳＳＹＬＮであり、Ｘ１はＳ、Ｗ、またはＱである）を含むＣＤＲＬ１、（ｉｉ）配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含むＣＤＲＬ２、および（ｉｉｉ）配列番号６（Ｘ１ＱＳＹＳＴＰＬＴであり、Ｘ１はＱまたはＦである）を含むＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域
    を含む、請求項１８７に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  189. （ａ）抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ１が配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ２が配列番号７（ＧＧＩＩＰＩＬＧＡＡＴＹＡ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ３が配列番号８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含み、
    （ｂ）抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ１が配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ２が配列番号７（ＧＧＩＩＰＩＬＧＡＡＴＹＡ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ３が配列番号８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＬ１が配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＬ２が配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＬ３が配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含み、
    （ｃ）抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ１が配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ２が配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ３が配列番号８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＬ１が配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＬ２が配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＬ３が配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含み、
    （ｄ）抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ１が配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ２が配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ３が配列番号８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含み、
    （ｅ）抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ１が配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ２が配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ３が配列番号８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＬ１が配列番号１２（ＲＡＳＱＷＩＳＳＹＬＮ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＬ２が配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＬ３が配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含み、
    （ｆ）抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ１が配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ２が配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ３が配列番号８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＬ１が配列番号１３（ＲＡＳＱＱＩＳＳＹＬＮ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＬ２が配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＬ３が配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含み、
    （ｇ）抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ１が配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ２が配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ３が配列番号８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＬ１が配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＬ２が配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＬ３が配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含み、
    （ｈ）抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ１が配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ２が配列番号１５（ＧＧＩＩＰＩＦＧＩＡＮＹＡ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ３が配列番号８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含み、
    （ｉ）抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ１が配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ２が配列番号１５（ＧＧＩＩＰＩＦＧＩＡＮＹＡ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ３が配列番号８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＬ１が配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＬ２が配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＬ３が配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含み、
    （ｊ）抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ１が配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ２が配列番号１６（ＧＧＩＩＰＮＦＧＴＡＴＹＡ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ３が配列番号１７（ＡＲＬＫＧＥＬＫＧＡＧＤＩ）を含み、
    （ｋ）抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ１が配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ２が配列番号１６（ＧＧＩＩＰＮＦＧＴＡＴＹＡ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ３が配列番号１７（ＡＲＬＫＧＥＬＫＧＡＧＤＩ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＬ１が配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＬ２が配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＬ３が配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含み、
    （ｌ）抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ１が配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ２が配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ３が配列番号１８（ＡＲＬＫＦＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含み、
    （ｍ）抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ１が配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ２が配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ３が配列番号１８（ＡＲＬＫＦＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＬ１が配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＬ２が配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＬ３が配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含み、
    （ｎ）抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ１が配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ２が配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ３が配列番号１９（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＥ）を含み、
    （ｏ）抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ１が配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ２が配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ３が配列番号１９（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＥ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＬ１が配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＬ２が配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＬ３が配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含み、
    （ｐ）抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ１が配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ２が配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ３が配列番号２０（ＡＲＬＫＮＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含み、
    （ｑ）抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ１が配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ２が配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ３が配列番号２０（ＡＲＬＫＮＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＬ１が配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＬ２が配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＬ３が配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含み、
    （ｒ）抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ１が配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ２が配列番号２１（ＧＧＶＩＰＦＬＧＴＡＮＹＡ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ３が配列番号２２（ＡＲＬＫＧＩＬＫＤＡＬＤＩ）を含み、
    （ｓ）抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ１が配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ２が配列番号２１（ＧＧＶＩＰＦＬＧＴＡＮＹＡ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ３が配列番号２２（ＡＲＬＫＧＩＬＫＤＡＬＤＩ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＬ１が配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＬ２が配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＬ３が配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含み、
    （ｔ）抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ１が配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ２が配列番号２９（ＧＲＩＩＰＩＦＧＴＡＤＹＡ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ３が配列番号８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含み、
    （ｕ）抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ１が配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ２が配列番号２９（ＧＲＩＩＰＩＦＧＴＡＤＹＡ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ３が配列番号８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＬ１が配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＬ２が配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＬ３が配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含み、
    （ｖ）抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ１が配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ２が配列番号３１（ＧＧＩＩＰＩＬＧＴＡＴＹＡ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ３が配列番号３２（ＡＲＲＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含み、
    （ｗ）抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ１が配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ２が配列番号３１（ＧＧＩＩＰＩＬＧＴＡＴＹＡ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ３が配列番号３２（ＡＲＲＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＬ１が配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＬ２が配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＬ３が配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含み、
    （ｘ）抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ１が配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ２が配列番号３３（ＧＧＩＩＰＩＶＡＴＡＮＹＡ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ３が配列番号３２（ＡＲＲＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含み、
    （ｙ）抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ１が配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ２が配列番号３３（ＧＧＩＩＰＩＶＡＴＡＮＹＡ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ３が配列番号３２（ＡＲＲＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＬ１が配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＬ２が配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＬ３が配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含み、
    （ｚ）抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ１が配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ２が配列番号３４（ＧＧＩＩＰＩＦＧＫＡＴＹＡ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ３が配列番号３２（ＡＲＲＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含み、
    （ａａ）抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ１が配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ２が配列番号３４（ＧＧＩＩＰＩＦＧＫＡＴＹＡ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ３が配列番号３２（ＡＲＲＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＬ１が配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＬ２が配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＬ３が配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含み、
    （ｂｂ）抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ１が配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ２が配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ３が配列番号８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＬ１が配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＬ２が配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＬ３が配列番号３８（ＦＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含み、
    （ｃｃ）抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ１が配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ２が配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ３が配列番号８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＬ１が配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＬ２が配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＬ３が配列番号３９（ＱＱＳＹＳＴＩＬＴ）を含み、
    （ｄｄ）抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ１が配列番号１４（ＧＴＦＳＳＹＡＦＳ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ２が配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ３が配列番号８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＬ１が配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＬ２が配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＬ３が配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含み、
    （ｅｅ）抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ１が配列番号２３（ＧＴＦＳＳＹＡＩＳ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ２が配列番号２４（ＧＧＩＩＰＩＶＧＩＡＮＹＡ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ３が配列番号８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含み、
    （ｆｆ）抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ１が配列番号２３（ＧＴＦＳＳＹＡＩＳ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ２が配列番号２４（ＧＧＩＩＰＩＶＧＩＡＮＹＡ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ３が配列番号８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＬ１が配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＬ２が配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＬ３が配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含み、
    （ｇｇ）抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ１が配列番号２３（ＧＴＦＳＳＹＡＩＳ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ２が配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ３が配列番号２５（ＡＲＬＫＧＥＦＫＤＡＦＤＩ）を含み、
    （ｈｈ）抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ１が配列番号２３（ＧＴＦＳＳＹＡＩＳ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ２が配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ３が配列番号２５（ＡＲＬＫＧＥＦＫＤＡＦＤＩ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＬ１が配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＬ２が配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＬ３が配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含み、
    （ｉｉ）抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ１が配列番号２３（ＧＴＦＳＳＹＡＩＳ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ２が配列番号２６（ＧＲＩＩＰＬＦＧＴＡＨＹＡ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ３が配列番号８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含み、
    （ｊｊ）抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ１が配列番号２３（ＧＴＦＳＳＹＡＩＳ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ２が配列番号２６（ＧＲＩＩＰＬＦＧＴＡＨＹＡ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ３が配列番号８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＬ１が配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＬ２が配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＬ３が配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含み、
    （ｋｋ）抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ１が配列番号２３（ＧＴＦＳＳＹＡＩＳ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ２が配列番号２７（ＧＲＩＮＰＩＬＧＴＡＮＹＡ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ３が配列番号２８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＳＩ）を含み、
    （ｌｌ）抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ１が配列番号２３（ＧＴＦＳＳＹＡＩＳ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ２が配列番号２７（ＧＲＩＮＰＩＬＧＴＡＮＹＡ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ３が配列番号２８（ＡＲＬＫＧＥＬＫＤＡＦＳＩ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＬ１が配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＬ２が配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＬ３が配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含み、
    （ｍｍ）抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ１が配列番号２３（ＧＴＦＳＳＹＡＩＳ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ２が配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ３が配列番号３０（ＡＲＬＫＧＥＬＫＣＡＦＤＩ）を含み、
    （ｎｎ）抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ１が配列番号２３（ＧＴＦＳＳＹＡＩＳ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ２が配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ３が配列番号３０（ＡＲＬＫＧＥＬＫＣＡＦＤＩ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＬ１が配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＬ２が配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＬ３が配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含み、
    （ｏｏ）抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ１が配列番号３６（ＧＰＦＲＳＨＡＶＳ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ２が配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ３が配列番号３７（ＡＲＬＫＳＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含み、または
    （ｐｐ）抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ１が配列番号３６（ＧＰＦＲＳＨＡＶＳ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ２が配列番号１１（ＧＧＩＩＰＶＦＧＴＡＴＹＡ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＨ３が配列番号３７（ＡＲＬＫＳＥＬＫＤＡＦＤＩ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＬ１が配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＬ２が配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含み、抗原結合の前記第２の単位のＣＤＲＬ３が配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含む、請求項１８８に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  190. 抗原結合の前記第２の単位が、配列番号３５、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、または５８のいずれか１つに対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号５９、６０、６１、６２、または６３のいずれか１つに対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１８８に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  191. （ａ）抗原結合の前記第２の単位の前記重鎖可変領域が、配列番号３５に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、
    （ｂ）抗原結合の前記第２の単位の前記重鎖可変領域が、配列番号４０に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、
    （ｃ）抗原結合の前記第２の単位の前記重鎖可変領域が、配列番号４１に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、
    （ｄ）抗原結合の前記第２の単位の前記重鎖可変領域が、配列番号４２に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、
    （ｅ）抗原結合の前記第２の単位の前記重鎖可変領域が、配列番号４３に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、
    （ｆ）抗原結合の前記第２の単位の前記重鎖可変領域が、配列番号４４に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、
    （ｇ）抗原結合の前記第２の単位の前記重鎖可変領域が、配列番号４５に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、
    （ｈ）抗原結合の前記第２の単位の前記重鎖可変領域が、配列番号４６に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、
    （ｉ）抗原結合の前記第２の単位の前記重鎖可変領域が、配列番号４７に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、
    （ｊ）抗原結合の前記第２の単位の前記重鎖可変領域が、配列番号４８に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、
    （ｋ）抗原結合の前記第２の単位の前記重鎖可変領域が、配列番号４９に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、
    （ｌ）抗原結合の前記第２の単位の前記重鎖可変領域が、配列番号５０に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、
    （ｍ）抗原結合の前記第２の単位の前記重鎖可変領域が、配列番号５１に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、
    （ｎ）抗原結合の前記第２の単位の前記重鎖可変領域が、配列番号５２に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、
    （ｏ）抗原結合の前記第２の単位の前記重鎖可変領域が、配列番号５３に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、
    （ｐ）抗原結合の前記第２の単位の前記重鎖可変領域が、配列番号５４に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、
    （ｑ）抗原結合の前記第２の単位の前記重鎖可変領域が、配列番号５５に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、
    （ｒ）抗原結合の前記第２の単位の前記重鎖可変領域が、配列番号５６に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、
    （ｓ）抗原結合の前記第２の単位の前記重鎖可変領域が、配列番号５７に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、または
    （ｔ）抗原結合の前記第２の単位の前記重鎖可変領域が、配列番号５８に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１８８に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  192. （ａ）抗原結合の前記第２の単位の前記軽鎖可変領域が、配列番号５９に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、
    （ｂ）抗原結合の前記第２の単位の前記軽鎖可変領域が、配列番号６０に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、
    （ｃ）抗原結合の前記第２の単位の前記軽鎖可変領域が、配列番号６１に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、
    （ｄ）抗原結合の前記第２の単位の前記軽鎖可変領域が、配列番号６２に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、または
    （ｅ）抗原結合の前記第２の単位の前記軽鎖可変領域が、配列番号６３に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１８８に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  193. 二重特異性抗体である、請求項１５２乃至１９２のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  194. 前記二重特異性抗体がＰＤ－１およびＰＤ－１リガンドの両方のアンタゴニストである、請求項１９３に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  195. 共通の軽鎖を含む、請求項１５２乃至１９４のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  196. 少なくとも２つの二価抗体またはその抗原結合性部分を含む、請求項１５２乃至１９５のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  197. ＰＤ－１に対して特異的な二価抗体を含む、請求項１５２乃至１９６のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  198. ＰＤ－Ｌ１に対して特異的な二価抗体を含む、請求項１５２乃至１９６のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  199. ＰＤ－１に対して特異的な二価抗体、およびＰＤ－Ｌ１に対して特異的な二価抗体を含む、請求項１５２乃至１９６のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  200. 前記二重特異性抗体がＰＤ－１上の２つの異なるエピトープに結合する、請求項１９３に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  201. 前記二重特異性抗体が前記ＰＤ－１リガンド上の２つの異なるエピトープに結合する、請求項１０３に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  202. 抗原結合の前記第１の単位もしくは抗原結合の前記第２の単位、または両方が、１つまたは複数の免疫グロブリンＦｃ改変を含む重鎖を含む、請求項１５２乃至２０１のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  203. 前記重鎖の免疫グロブリンＦｃドメインが、抗原結合の前記第１および第２の単位のヘテロ二量体化を促進する１つまたは複数のアミノ酸突然変異を含む、請求項２０２に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  204. 前記突然変異が前記重鎖のＣＨ３ドメイン中に存在する、請求項２０３に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  205. クアドローマ細胞中で製造される、請求項１５２乃至２０４のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  206. １つまたは複数の免疫グロブリン定常領域改変を含む、請求項１５２乃至２０５のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  207. 前記免疫グロブリン定常領域が、抗体のヘテロ二量体化を促進する１つまたは複数のアミノ酸突然変異または置換を含む、請求項２０６に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  208. 前記１つまたは複数の突然変異が抗原結合の１つの単位の軽鎖定常領域中に存在し、前記１つまたは複数の突然変異が抗原結合の別の単位の重鎖定常領域中に存在する、請求項２０７に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  209. 二重特異性抗体が、二重特異性ＩｇＧ、二重特異性抗体断片、二重特異性融合タンパク質、付加型ＩｇＧ、および二重特異性抗体コンジュゲートからなる群から選択されるフォーマットのものである、請求項１９３乃至２０８のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  210. 低減したエフェクター機能を有するＦｃ領域を含む、請求項１５２乃至２０９のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  211. 前記構築物の半減期を増進するＦｃ領域を含む、請求項１５２乃至２１０のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  212. 配列番号１００または１０２のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％同一の重鎖アミノ酸配列を含む、請求項１５２乃至２１１のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  213. 配列番号１０１または１０３のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％同一の軽鎖アミノ酸配列を含む、請求項１５２乃至２１２のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  214. 前記構築物が、配列番号１００のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％同一の重鎖アミノ酸配列を含み、前記構築物が、配列番号１０１のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％同一の軽鎖アミノ酸配列を含む、請求項１５２乃至２１３のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  215. 前記構築物が、配列番号１０２のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％同一の重鎖アミノ酸配列を含み、前記構築物が、配列番号１０３のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％同一の軽鎖アミノ酸配列を含む、請求項１５２乃至２１３のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  216. Ｆｃドメインを含まない、請求項１５２乃至２０１のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
  217. 抗原結合の４つの単位を含む多重特異性抗原結合性構築物であって、抗原結合の第１および第２の単位がＰＤ－１に結合し、抗原結合の第３および第４の単位がＰＤ－Ｌ１に結合し、前記多重特異性抗原結合性構築物がＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１の相互作用を遮断し、前記構築物が、配列番号１００のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％同一の重鎖アミノ酸配列、および配列番号１０１のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％同一の軽鎖アミノ酸配列を含む、多重特異性抗原結合性構築物。
  218. 請求項１乃至２１７のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物をコードする核酸。
  219. 請求項２１８に記載の核酸を含む発現ベクター。
  220. １つまたは複数の発現制御配列をさらに含む、請求項２１９に記載の発現ベクター。
  221. 請求項２１９または２２０に記載の発現ベクターを含む細胞。
  222. 哺乳動物細胞である、請求項２２１に記載の細胞。
  223. 前記哺乳動物細胞が齧歯動物細胞である、請求項２２２に記載の細胞。
  224. 前記齧歯動物細胞がＣＨＯ細胞である、請求項２２３に記載の細胞。
  225. 多重特異性抗原結合性構築物を製造する方法であって、請求項２２１乃至２２４のいずれか１項に記載の細胞を前記細胞による前記発現ベクターからの前記多重特異性抗原結合性構築物の発現のために好適な条件下で培養することを含む、方法。
  226. 前記細胞または前記細胞が培養された培地から前記構築物を単離することをさらに含む、請求項２２５に記載の方法。
  227. 請求項１乃至２１７のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物を含む医薬組成物。
  228. （ａ）請求項１乃至２１７のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物および
    （ｂ）（ａ）の多重特異性抗原結合性構築物にコンジュゲート化した異種部分
    を含む、タンパク質コンジュゲート分子。
  229. 前記異種部分が、治療剤、毒素、薬物、または放射性部分である、請求項２２８に記載のタンパク質コンジュゲート分子。
  230. それを必要とする対象において増殖性障害を治療する方法であって、前記対象に治療有効量の請求項１乃至２１７のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物、または請求項２２７に記載の医薬組成物または請求項２２８もしくは２２９に記載のタンパク質コンジュゲート分子を投与し、それにより、前記対象において前記増殖性障害を治療する工程を含む、方法。
  231. それを必要とする対象においてがんを治療しもしくはその進行を遅延させまたは腫瘍成長を低減もしくは阻害する方法であって、前記対象に治療有効量の請求項１乃至２１７のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物、または請求項２２７に記載の医薬組成物または請求項２２８もしくは２２９に記載のタンパク質コンジュゲート分子を投与し、それにより、前記対象においてがんを治療しもしくはその進行を遅延させまたは腫瘍成長を低減もしくは阻害する工程を含む、方法。
  232. 前記増殖性障害ががんである、請求項２３０に記載の方法。
  233. 前記がんが、血液がん、神経学的がん、黒色腫、乳がん、肺がん、頭頸部がん、胃腸がん、肝臓がん、膵臓がん、泌尿生殖器がん、骨がん、および血管がんからなる群から選択される、請求項２３１または２３２に記載の方法。
  234. 前記対象が、ＰＤ－Ｌ１を発現するがんを有する、請求項２３１乃至２３３のいずれか１項に記載の方法。
  235. それを必要とする対象において免疫応答を増進する方法であって、前記対象に治療有効量の請求項１乃至２１７のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物、または請求項２２７に記載の医薬組成物または請求項２２８もしくは２２９に記載のタンパク質コンジュゲート分子を投与し、それにより、前記対象において前記免疫応答を増進する工程を含む、方法。
  236. 前記増進した免疫応答が、増進したＴ細胞機能、増進したＮＫ細胞機能、または増進したマクロファージ機能のいずれか１つまたは複数を含む、請求項２３５に記載の方法。
  237. Ｔ細胞機能の前記増進が、ＰＤ－１もしくはＰＤ－１リガンドのいずれかに結合する剤、またはＰＤ－１に結合する剤およびＰＤ－１リガンドに結合する剤を含むカクテルと比較して、前記多重特異性抗原結合性構築物の投与でより大きい、請求項２３６に記載の方法。
  238. 前記Ｔ細胞機能が、Ｔ細胞からの増加したＩＦＮ－γ産生、増進したＴ細胞生存、増加したＴ細胞増殖、または疲弊Ｔ細胞表現型からのレスキューのいずれか１つまたは複数である、請求項２３７に記載の方法。
  239. 前記増進したＴ細胞機能が、ＰＤ－１もしくはＰＤ－１リガンドのいずれかに結合する剤、またはＰＤ－１に結合する剤およびＰＤ－１リガンドに結合する剤を含むカクテルと比較して、前記多重特異性抗原結合性構築物の投与でより大きい、請求項２３８に記載の方法。
  240. 対象においてがん細胞に対する免疫応答を増進する方法であって、前記対象に有効量の請求項１乃至２１７のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物、または請求項２２７に記載の医薬組成物または請求項２２８もしくは２２９に記載のタンパク質コンジュゲート分子を投与し、それにより、前記対象においてがん細胞に対する免疫応答を増進する工程を含む、方法。
  241. 前記増進した免疫応答が、増進したＴ細胞機能、増進したＮＫ細胞機能、または増進したマクロファージ機能のいずれか１つまたは複数を含む、請求項２４０に記載の方法。
  242. 前記がん細胞が、血液がん細胞、リンパ腫細胞、骨髄腫細胞、白血病細胞、神経学的がん細胞、乳がん細胞、前立腺がん細胞、皮膚がん細胞、肺がん細胞、膀胱がん細胞、腎臓がん細胞、頭頸部がん細胞、胃腸がん細胞、結腸直腸がん細胞、肝臓がん細胞、膵臓がん細胞、泌尿生殖器がん細胞、骨がん細胞、および血管がん細胞である、請求項２４０または２４１に記載の方法。
  243. 前記がん細胞がＰＤ－Ｌ１を発現する、請求項２４０乃至２４２のいずれか１項に記載の方法。
  244. 前記多重特異性抗原結合性構築物、前記医薬組成物、または前記タンパク質コンジュゲートが、皮下、静脈内、皮内、腹腔内、経口的、筋肉内、または頭蓋内に投与される、請求項２４０乃至２４３のいずれか１項に記載の方法。
  245. 前記対象に抗がん療法を投与する工程をさらに含む、請求項２３０乃至２４４のいずれか１項に記載の方法。
  246. 前記抗がん療法が、化学療法、免疫療法、ホルモン療法、細胞療法、サイトカイン療法、放射線療法、寒冷療法、または外科療法である、請求項２４５に記載の方法。
  247. 前記抗がん療法が、前記多重特異性抗原結合性構築物または医薬組成物を用いる治療の前、それと同時、またはその後に投与される、請求項２４５または２４６に記載の方法。
  248. 前記抗がん療法が免疫療法であり、前記対象における前記がんが、前記多重特異性抗原結合性構築物もしくは医薬組成物、または前記タンパク質コンジュゲートを用いる治療の非存在下で前記免疫療法に対して難治性である、請求項２４５乃至２４７のいずれか１項に記載の方法。
  249. 対象における増殖性障害の治療において使用するための、請求項１乃至２１７および２２７乃至２２９のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物、医薬組成物、またはタンパク質コンジュゲート分子。
  250. 対象におけるがんの治療において使用するための、請求項１乃至２１７および２２７乃至２２９のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物、医薬組成物、またはタンパク質コンジュゲート分子。
  251. それを必要とする対象におけるがんの治療もしくはその進行の遅延または腫瘍成長の低減もしくは阻害において使用するための、請求項１乃至２１７および２２７乃至２２９のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物、医薬組成物、またはタンパク質コンジュゲート分子。
  252. 対象における免疫応答の増進において使用するための、請求項１乃至２１７および２２７乃至２２９のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物、医薬組成物、またはタンパク質コンジュゲート分子。
  253. 対象におけるがん細胞に対する免疫応答の増進において使用するための、請求項１乃至２１７および２２７乃至２２９のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物、医薬組成物、またはタンパク質コンジュゲート分子。
  254. 前記増殖性障害ががんである、請求項２４９に記載の使用。
  255. 前記がんが、血液がん、神経学的がん、黒色腫、乳がん、肺がん、頭頸部がん、胃腸がん、肝臓がん、膵臓がん、泌尿生殖器がん、骨がん、および血管がんからなる群から選択される、請求項２５０、２５１、２５３、および２５４のいずれか１項に記載の使用。
  256. 前記対象が、ＰＤ－Ｌ１を発現するがんを有する、請求項２４９乃至２５５のいずれか１項に記載の使用。
  257. 前記増進した免疫応答が、増進したＴ細胞機能、増進したＮＫ細胞機能、または増進したマクロファージ機能のいずれか１つまたは複数を含む、請求項２５２または２５３に記載の使用。
  258. Ｔ細胞機能の前記増進が、ＰＤ－１もしくはＰＤ－１リガンドのいずれかに結合する剤、またはＰＤ－１に結合する剤およびＰＤ－１リガンドに結合する剤を含むカクテルと比較して、前記多重特異性抗原結合性構築物の投与でより大きい、請求項２５７に記載の使用。
  259. 前記増進したＴ細胞機能が、Ｔ細胞からの増加したＩＦＮ－γ産生、増進したＴ細胞生存、増加したＴ細胞増殖、または疲弊Ｔ細胞表現型からのレスキューのいずれか１つまたは複数である、請求項２５７に記載の使用。
  260. 前記多重特異性抗原結合性構築物または医薬組成物またはタンパク質コンジュゲート分子が、皮下、静脈内、皮内、腹腔内、経口的、筋肉内または頭蓋内に投与される、請求項２４９乃至２５９のいずれか１項に記載の使用。
  261. 前記対象に対する抗がん療法をさらに含む、請求項２４９乃至２６０のいずれか１項に記載の使用。
  262. 前記抗がん療法が、化学療法、免疫療法、ホルモン療法、細胞療法、サイトカイン療法、放射線療法、寒冷療法、または外科療法である、請求項２６１に記載の使用。
  263. 前記抗がん療法が、前記多重特異性抗原結合性構築物または医薬組成物またはタンパク質コンジュゲート分子を用いる治療の前、それと同時、またはその後に投与される、請求項２６１または２６２に記載の使用。
  264. 前記抗がん療法が免疫療法であり、前記対象における前記がんが、前記多重特異性抗原結合性構築物または医薬組成物または前記タンパク質コンジュゲート分子を用いる治療の非存在下で前記免疫療法に対して難治性である、請求項２６１乃至２６３のいずれか１項に記載の使用。
  265. 抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合性断片であって、
    （ａ）（ｉ）配列番号７０（ＦＴＦＸ１Ｘ２ＹＡＸ３Ｘ４であり、Ｘ１＝Ｓ、Ｒ、Ｇ、またはＮであり、Ｘ２＝Ｄ、Ｓ、Ｎ、Ａ、Ｒ、またはＧであり、Ｘ３＝ＭまたはＬであり、Ｘ４＝Ｓ、Ｌ、またはＮである）を含むＣＤＲＨ１、（ｉｉ）配列番号７１（ＳＡＩＳＮＳＧＴＹＴＹＹＡ）を含むＣＤＲＨ２、および（ｉｉｉ）配列番号７２（ＡＲＧＬＤＦＩＶＧＸ５ＴＧＮＤＹであり、Ｘ５＝Ａ、Ｙ、またはＲである）を含むＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域、ならびに
    （ｂ）（ｉ）配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含むＣＤＲＬ１、（ｉｉ）配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含むＣＤＲＬ２、および（ｉｉｉ）配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含むＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域
    を含む、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合性断片。
  266. （ａ）（ｉ）配列番号７３、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、または８６のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、（ｉｉ）配列番号７１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、および（ｉｉｉ）配列番号７４、７５、または８５のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域、ならびに
    （ｂ）（ｉ）配列番号９（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）を含むＣＤＲＬ１、（ｉｉ）配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含むＣＤＲＬ２、および（ｉｉｉ）配列番号１０（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含むＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域
    を含む、請求項２６５に記載の抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合性断片。
  267. 前記重鎖可変領域が、配列番号８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９のいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含む、請求項２６５または２６６に記載の抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合性断片。
  268. 前記軽鎖可変領域が、配列番号５９のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含む、請求項２６５乃至２６７のいずれか１項の抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合性断片。
  269. 抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合性断片であって、
    ａ．（ｉ）配列番号１（ＧＴＦＳＳＹＡＩＮ）を含むＣＤＲＨ１、（ｉｉ）配列番号２（ＧＧＩＩＰＸ１Ｘ２ＧＸ３ＡＴＹＡであり、Ｘ１はＶまたはＩであり、Ｘ２はＦ、Ｌ、またはＶであり、Ｘ３はＴまたはＡである）を含むＣＤＲＨ２、および（ｉｉｉ）配列番号３（ＡＲＬＫＸ１ＥＬＫＤＡＦＤＩであり、Ｘ１はＧ、Ｆ、またはＮである）を含むＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域、ならびに
    ｂ．（ｉ）配列番号４（ＲＡＳＱＸ１ＩＳＳＹＬＮであり、Ｘ１はＳ、Ｗ、またはＱである）を含むＣＤＲＬ１、（ｉｉ）配列番号５（ＡＡＳＳＬＱＳ）を含むＣＤＲＬ２、および（ｉｉｉ）配列番号６（Ｘ１ＱＳＹＳＴＰＬＴであり、Ｘ１はＱまたはＦである）を含むＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域
    を含む、抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合性断片。
  270. （ａ）（ｉ）配列番号１、１４、２３または３６のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、（ｉｉ）配列番号１１、１５、１６、２１、２４、２６、２７、２９、３１、３３、または３４のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、および（ｉｉｉ）配列番号８、１７、１８、１９、２０、２２、２５、２８、３０、３２、または３７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域、ならびに（ｂ）（ｉ）配列番号９、１２、または１３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、および（ｉｉｉ）配列番号１０、３８または３９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域
    を含む、請求項２６９に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合性断片。
  271. 前記重鎖可変領域が、配列番号４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、または３５のいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含む、請求項２６９または２７０に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合性断片。
  272. 前記軽鎖可変領域が、配列番号５９、６０、６１、６２、または６３のいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含む、請求項２６９乃至２７１のいずれか１項に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合性断片。
  273. 前記多重特異性抗原結合性構築物が、前記対象中の同じ細胞の表面上に発現されたＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１に結合する、請求項２３０乃至２４８のいずれか１項に記載の方法。
  274. 前記多重特異性抗原結合性構築物が、前記対象中の第１の細胞の表面上に発現されたＰＤ－１に結合し、前記多重特異性抗原結合性構築物が、前記対象中の第２の細胞の表面上に発現されたＰＤ－Ｌ１に結合する、請求項２３０乃至２４８のいずれか１項に記載の方法。
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