JP2022111117A5

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Publication number: JP2022111117A5
Application number: JP2022077421A
Authority: JP
Filing date: 2022-05-10
Publication date: 2023-06-01

Claims

試料中の標的核酸配列の存在、非存在または量を検出するための方法であって、以下：
（ａ）互いに相補的である第１の鎖および第２の鎖を含む標的核酸配列を等温増幅条件で増幅するステップであって、
前記増幅するステップが、前記標的核酸配列を含む核酸を以下の（ｉ）、（ｉｉ）と接触させることを含み：
（ｉ）第１のプライマーおよび第２のプライマーであって、前記第１のプライマーは前記標的核酸配列の前記第１の鎖の配列にハイブリダイズすることができ、かつ前記第２のプライマーは前記標的核酸配列の前記第２の鎖の配列にハイブリダイズすることができる、第１のプライマーおよび第２のプライマー、ならびに
（ｉｉ）超好熱性ポリメラーゼ活性を有し、それにより、検出可能なレベルで核酸増幅産物を１５分以内に生成する酵素であって、前記核酸増幅産物が以下：
（１）前記第１のプライマー配列またはその逆相補配列、
（２）前記第２のプライマー配列またはその逆相補配列、および
（３）（１）前記第１のプライマー配列またはその逆相補配列と、（２）前記第２のプライマー配列またはその逆相補配列とによって挟まれたスペーサー配列であって、１～１０塩基の長さである、スペーサー配列、
を含む、酵素、かつ
前記増幅するステップが、超好熱菌ポリメラーゼ活性を有する前記酵素以外のいずれの酵素も使用することを含まない、ステップと、
（ｂ）前記核酸増幅産物を検出するステップと、
を含む、上記方法。
試料中の標的核酸配列の存在、非存在または量を検出するための方法であって、以下：
（ａ）互いに相補的である第１の鎖および第２の鎖を含む標的核酸配列を等温増幅条件で増幅するステップであって、
前記増幅するステップが、前記標的核酸配列を含む核酸を以下の（ｉ）、（ｉｉ）と接触させることを含むステップと：
（ｉ）第１のプライマーおよび第２のプライマーであって、前記第１のプライマーは前記標的核酸配列の前記第１の鎖の配列にハイブリダイズすることができ、かつ前記第２のプライマーは前記標的核酸配列の前記第２の鎖の配列にハイブリダイズすることができる、第１のプライマーおよび第２のプライマー、ならびに
（ｉｉ）超好熱性ポリメラーゼ活性を有し、それにより、検出可能なレベルで核酸増幅産物を１５分以内に生成する酵素であって、前記核酸増幅産物が以下：
（１）前記第１のプライマー配列、
（２）前記第２のプライマー配列、および
（３）（１）前記第１のプライマー配列と、（２）前記第２のプライマー配列とによって挟まれたスペーサー配列であって、１～１０塩基の長さである、スペーサー配列、
を含む、酵素、
（ｂ）前記核酸増幅産物を検出するステップと、
を含む、上記方法。
前記核酸が、
（ａ）ゲノム核酸、プラスミド核酸、ミトコンドリア核酸、細胞性核酸、または細胞外核酸；
（ｂ）細菌核酸またはウイルス核酸；
（ｃ）二本鎖ＤＮＡ；または
（ｄ）逆転写反応の産物、ここで細胞性ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、細菌ＲＮＡ、またはウイルスＲＮＡから生成された逆転写反応の産物であってもよい、
である、請求項１または２に記載の方法。
前記増幅するステップ（ａ）の前に逆転写反応によって前記核酸を生成するステップをさらに含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
試料中の標的核酸配列を検出するための方法であって、以下：
（ａ）試料中の試料ＲＮＡを逆転写酵素および超好熱性ポリメラーゼ活性を有する酵素と接触させて二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を生成するステップであって、前記ｄｓＤＮＡは標的核酸配列を含み、前記標的核酸配列は互いに相補的な第１の鎖および第２の鎖を含む、ステップと
（ｂ）等温増幅条件下で前記標的核酸配列を増幅するステップであって、前記増幅するステップが、前記ｄｓＤＮＡを、以下の（ｉ）、（ｉｉ）と接触させることを含むステップと、
（ｉ）第１のプライマーおよび第２のプライマーであって、前記第１のプライマーが前記標的核酸配列の前記第１の鎖の配列にハイブリダイズすることができ、かつ前記第２のプライマーが前記標的核酸配列の前記第２の鎖の配列にハイブリダイズすることができる、第１のプライマーおよび第２のプライマー、
（ｉｉ）超好熱性ポリメラーゼ活性を有し、それにより、検出可能なレベルで核酸増幅産物を１５分以内に生成する酵素であって、前記核酸増幅産物が以下：
（１）前記第１のプライマー配列またはその逆相補配列、
（２）前記第２のプライマー配列またはその逆相補配列、および
（３）（１）前記第１のプライマー配列またはその逆相補配列と、（２）前記第２のプライマー配列またはその逆相補配列とによって挟まれたスペーサー配列であって、１～１０塩基の長さである、スペーサー配列、
を含む、酵素、
（ｃ）前記核酸増幅産物を検出するステップと、
を含み、
前記方法が、前記逆転写酵素および超好熱性ポリメラーゼ活性を有する前記酵素以外のいずれの酵素も使用することを含まない、上記方法。
試料中の標的核酸配列を検出するための方法であって、以下：
（ａ）試料中の試料ＲＮＡを逆転写酵素および超好熱性ポリメラーゼ活性を有する酵素と接触させて二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を生成するステップであって、前記ｄｓＤＮＡは標的核酸配列を含み、前記標的核酸配列は互いに相補的な第１の鎖および第２の鎖を含む、ステップと
（ｂ）等温増幅条件下で前記標的核酸配列を増幅するステップであって、前記増幅するステップが、前記ｄｓＤＮＡを、以下の（ｉ）、（ｉｉ）と接触させることを含むステップと、
（ｉ）第１のプライマーおよび第２のプライマーであって、前記第１のプライマーが前記標的核酸配列の前記第１の鎖の配列にハイブリダイズすることができ、かつ前記第２のプライマーが前記標的核酸配列の前記第２の鎖の配列にハイブリダイズすることができる、第１のプライマーおよび第２のプライマー、
（ｉｉ）超好熱性ポリメラーゼ活性を有し、それにより、検出可能なレベルで核酸増幅産物を１５分以内に生成する酵素であって、前記核酸増幅産物が以下：
（１）前記第１のプライマー配列、
（２）前記第２のプライマー配列、および
（３）（１）前記第１のプライマー配列と、（２）前記第２のプライマー配列とによって挟まれたスペーサー配列であって、１～１０塩基の長さである、スペーサー配列、
を含む、酵素、
（ｃ）前記核酸増幅産物を検出するステップと、
を含む、
上記方法。
前記試料ＲＮＡが、細胞性ＲＮＡ、ｍＲＮＡまたはマイクロＲＮＡ、細菌ＲＮＡ、またはウイルスＲＮＡである、請求項５または６に記載の方法。
前記核酸増幅産物を検出するステップが、前記試料において、前記標的核酸配列を含む前記核酸の量、または前記標的核酸配列を含む前記ｄｓＤＮＡの量を決定することをさらに含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
前記増幅ステップの前または前記増幅ステップの間に、前記核酸または前記ｄｓＤＮＡを一本鎖ＤＮＡ結合性タンパク質と接触させるステップを含まない、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
前記標的核酸配列が、細菌核酸配列またはウイルス核酸配列である、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
（１）超好熱菌ポリメラーゼ活性を有する前記酵素が、逆転写酵素活性を有し、および／またはエキソヌクレアーゼ活性が低いかまたは全く有さない、または、（２）超好熱性ポリメラーゼ活性を有する前記酵素が、配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列またはその機能的断片を含み、ここで超好熱性ポリメラーゼ活性を有する前記酵素は、配列番号８のアミノ酸配列を含むポリメラーゼであってもよい、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
前記試料が原核生物または真核生物由来のＲＮＡを含み、ここで前記試料はウイルスまたは細菌由来のＲＮＡを含んでいてもよい、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
前記標的核酸配列を増幅するステップが、約５５℃から約７５℃の間の一定温度で行われ、ここで前記ステップが約６５℃の一定温度で行われてもよい、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
（ｉ）前記第１のプライマー、前記第２のプライマー、または前記第１のプライマーおよび前記第２のプライマーの両方が、（ａ）約８～１６塩基の長さであり、（ｂ）１つまたは複数のＤＮＡ塩基、修飾ＤＮＡ塩基、またはそれらの組み合わせを含み、または（ａ）および（ｂ）の両方を含み、
（ｉｉ）前記核酸増幅産物が約２０～４０塩基の長さであり、および／または
（ｉｉｉ）前記スペーサー配列が前記標的核酸配列の一部分を含み、ここで前記スペーサー配列は１～５塩基の長さであってもよい、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
前記核酸増幅産物を検出するステップが、以下：
（ａ）前記核酸増幅産物を、前記増幅産物にハイブリダイズすることができるシグナル生成オリゴヌクレオチドと接触させるステップであって、前記シグナル生成オリゴヌクレオチドが、フルオロフォア、消光剤、またはその両方を含む、ステップ、または
（ｂ）蛍光シグナルを検出するステップであって、前記蛍光シグナルは分子ビーコンに由来していてもよい、ステップ、
を含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法、
単一の反応容器内で行われる、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
前記試料がＲＮＡを含み、かつ、前記試料を、前記逆転写酵素、超好熱性ポリメラーゼ活性を有する前記酵素、および前記第１および第２のプライマーに同時に接触させる、請求項５～１６のいずれか一項に記載の方法。