JP2021503919A - アフラトキシンを効率的に分解するフラボバクテリウムブレーブバイオコントロール株およびその使用 - Google Patents

Abstract

本発明は微生物の分野に属し、具体的には、アフラトキシンを効率的に分解するフラボバクテリウムブレーブバイオコントロール株及びその使用に関する。フラボバクテリウムブレーブバイオコントロール株３Ｊ２ＭＯは、２０１７年６月１３日すでにＣＣＴＣＣと略称される中国典型培養物保存センターに保存され、保存番号はＣＣＴＣＣ Ｎｏ.Ｍ２０１７３２９である。本発明で使用されるフラボバクテリウムブレーブバイオコントロール株は、アフラトキシンを著しく分解することができる。アフラトキシンを分解し、食料作物のアフラトキシン汚染を処理することができる。【選択図】なし

Description

本発明は微生物の分野に属し、具体的には、アフラトキシンを効率的に分解するフラボバクテリウムブレーブバイオコントロール株及びその使用に関する。

アフラトキシンは、一種の病原性真菌であり、強力な発癌性を有し毒性の強い真菌毒素であるアフラトキシンを生成することができ、Ｂ、ＧとＭ族を含み、そのうちＢ１が最も一般的で最も毒性が強い。落花生、コーン、その他の食用作物を広範囲に汚染し、人々や家畜の健康を深刻に脅かし、且つ大きな経済的損失を引き起こす可能性がある。したがって、アフラトキシンと毒素汚染の管理を強化することが急務である。

ＡＦＢ１を除去する従来の方法には、主に吸着、抽出、熱処理、放射線処理、酸アルカリ処理、酸化還元処理があるが、時間と手間がかかる場合があり、解毒率が高くなく、栄養素の損失を引き起こしやすい。一方、生物学的方法は安全で、高効率で、持続的であるという利点を有する。そのため、アフラトキシン生物防除の研究が強化されることは中国の農業産業及び経済的に重要な意義を有する。

細菌および代謝産物によるアフラトキシンの生物分解は広く報告されていない。関舒、李俊霞らがクマリン培地でスクリーニングされたステノトロフォモナスマルトフィリアは、アフラトキシンを８２.５％の分解率で分解できる。王寧らは、灰色の葉のサルの糞便からミクソコッカスオレンジレッドの株を研究し、最適な培養条件でＡＦＢ１の分解率が７８.２％に達することを発見した。既存の研究では、フラボバクテリウムブレーブを使用してアフラトキシンを分解したという報告はない。

中国特許第１０５９２５５１３号明細書

本発明によって解決されるべき技術的問題は、先行技術の欠陥を考慮し、アフラトキシンを効率的に分解するフラボバクテリウムブレーブバイオコントロール株３Ｊ２ＭＯおよびその使用を提供することである。本発明におけるフラボバクテリウムブレーブバイオコントロール株３Ｊ２ＭＯはアフラトキシンを著しく分解することができる。

上記の技術的問題を解決するために、本発明によって採用される技術的解決策は以下の通りである。

フラボバクテリウムブレーブバイオコントロール株３Ｊ２ＭＯ(Ｍｙｒｏｉｄｅｓ ｏｄｏｒａｔｉｍｉｍｕｓ３Ｊ２ＭＯ)は、２０１７年６月１３日すでにＣＣＴＣＣと略称される中国典型培養物保存センターに保存され、保存住所は中国、武漢、武漢大学であり、保存番号はＣＣＴＣＣ Ｎｏ．Ｍ２０１７３２９である。

本発明では、湖北省黄陂の落花生畑から収集された土壌を段階希釈した後１００μＬを取り、ＬＢ固形培地のプレートに塗り培養を行い、成長した細菌を接種リングで取り出して新鮮なＬＢ固形培地に移してプレートスクライブラインを行い、複数回移した後、単一コロニーを採取し、アフラトキシンの分解実験により、アフラトキシンに対して顕著な分解作用を有する菌株３Ｊ２ＭＯをスクリーニングし、ＣＣＴＣＣと略称される中国典型培養物保存センターに保存され、保存住所は中国、武漢、武漢大学であり、保存番号はＣＣＴＣＣ Ｎｏ．Ｍ２０１７３２９である。１６Ｓ ｒＤＮＡの特異的な増幅技術を利用して、形態特徴、生理学的および生化学的実験を組み合わせてその菌種を特定し、その結果はこれが１株のフラボバクテリウムブレーブ（Ｍｙｒｏｉｄｅｓ ｏｄｏｒａｔｉｍｉｍｕｓ）であり、放線菌に、ブレビバクテリウムに属することが分かった。

アフラトキシン分解用製剤を提供し、それは上記フラボバクテリウムブレーブ３Ｊ２ＭＯの発酵物を含む。

上記解決方式によれば、製剤の製剤形態は液体、ダスティング、乾燥水和粉剤又は乾燥水和粒剤である。

上記解決方式によれば、製剤は液体であり、製剤中のフラボバクテリウムブレーブ３Ｊ２ＭＯの最終濃度は（１〜９）×１０^７ＣＦＵ/ｍＬである。

上記解決方式によれば、製剤はフラボバクテリウムブレーブ３Ｊ２ＭＯ発酵液であり、フラボバクテリウムブレーブ３Ｊ２ＭＯ発酵液中のフラボバクテリウムブレーブ３Ｊ２ＭＯの最終濃度は（１〜９）×１０^７ＣＦＵ/ｍＬである。

上記解決方式によれば、フラボバクテリウムブレーブ３Ｊ２ＭＯ発酵液の調製方法は、フラボバクテリウムブレーブ３Ｊ２ＭＯがＬＢプレート中で活性化され、２８℃の培養箱中で２４時間培養され、採取針でフラボバクテリウムブレーブの単一コロニーを採取し、ＬＢ液体培地の中に移し、１２時間〜２４時間振とう培養し、１％〜３％の培養液を吸って新鮮なＬＢ液体培地に移し、１２時間〜２４時間振とう培養し、拮抗菌株フラボバクテリウムブレーブ３Ｊ２ＭＯの発酵液を取得する。

上記アフラトキシン分解用製剤をアフラトキシン分解に適用する。具体的な適用方法は、アフラトキシン分解用製剤を生体試料表面にコーティング又は噴霧し、又は生体試料と混合してアフラトキシン分解を行うことによって、生体試料のアフラトキシン汚染を防止する。

上記フラボバクテリウムブレーブ３Ｊ２ＭＯ発酵液をアフラトキシン分解に適用する。具体的な適用方法は、フラボバクテリウムブレーブ３Ｊ２ＭＯの発酵液を生体試料表面に噴霧し、又は生体試料と混合して、すでにアフラトキシンに汚染された生体試料表面のアフラトキシンを分解する。

本発明は初めて１株のアフラトキシンに対して良好な分解効果を有するフラボバクテリウムブレーブ３Ｊ２ＭＯが土壌から単離され、アフラトキシンを分解し、食用作物のアフラトキシン汚染を制御するために用いることができる。

本発明は、湖北黄陂の落花生畑から収集された土壌を段階希釈した後１００μＬを取り、ＬＢ固形培地のプレートに塗り培養を行い、成長した細菌を接種リングで取り出して新鮮なＬＢ固形培地に移してプレートスクライブラインを行い、複数回移した後、単一コロニーを採取し、アフラトキシンの分解実験により、アフラトキシンに対して顕著な分解作用を有する菌株３Ｊ２ＭＯをスクリーニングし、ＣＣＴＣＣと略称される中国典型培養物保存センターに保存され、保存番号はＣＣＴＣＣ Ｎｏ．Ｍ ２０１７３２９である。

(実施例１）
１)フラボバクテリウムブレーブ３Ｊ２ＭＯをＬＢプレート中で活性化させ、２８℃の培養箱中で２４時間培養し、採取針で活性化されたフラボバクテリウムブレーブの単一コロニーを採取し、１５ｍＬのＬＢ液体培地が入った三角フラスコに移し、２８℃、２００ｒｐｍで１２時間振とう培養する。１％の培養液を吸って１５ｍＬのＬＢ液体培地が入った三角フラスコに移し、２８℃、２００ｒｐｍで１２時間振とう培養し、拮抗菌株の発酵液を取得する。

２)アフラトキシンＢ１標準液をフラボバクテリウムブレーブ発酵液（最終濃度が１×１０^７ＣＦＵ/ｍＬ）の中に入れてＬＢ培地中で一緒に培養し、２８℃、２００ｒｐｍで５日間培養し、処理毎に３つの重複を設ける。

３）培地中のアフラトキシンＢ１の含有量を測定する（表２）。

実験結果から、該フラボバクテリウムブレーブＣＣＴＣＣ Ｎｏ.Ｍ２０１７３２９菌株のアフラトキシンの分解率は約９５.６１％であり、アフラトキシンを分解する能力があることがわかる。

(実施例２）
湖北の落花生畑から落花生の粒を研磨して粉にし、０.５gの落花生粉を量ってペトリ皿の中に入れ、５００μＬアスペルギルス・フラバス胞子液(５×１０^５個/ｍＬ)を加え、２８℃の培養箱で７日間培養する。

胞子に満たされた落花生粉の中に５００μＬのＣＣＴＣＣ Ｎｏ.Ｍ２０１７７３２９菌株発酵液を加え、同じ量のＬＢ培地を対照とし、２８℃の培地の中で５日間培養し、実験内において３つの重複を設ける。

１５ｍＬの７０％メタノール水を加え、ボルテックスした後シェーカーに３０分間入れる。３ｍＬの上清を取って８ｍＬの超純水を加えてボルテックスして遠心分離する。

４）８ｍＬの上清を取り、免疫親和性カラムＨＰＬＣ法によりアフラトキシンＢ１の含有量（表３）を測定し、実験内において３つの重複を設ける。

実験結果から明らかなように、落花生におけるＣＣＴＣＣ Ｍ２０１７３２９菌株はアフラトキシンの毒素生成に対する防除率は約９８.７６％であり、アフラトキシンに汚染された落花生に対して良好な防除効果を有する。

(実施例３）
１)フラボバクテリウムブレーブ３Ｊ２ＭＯをＬＢプレート中で活性化させ、２８℃の培養箱中で２４時間培養し、採取針で活性化されたフラボバクテリウムブレーブの単一コロニーを採取し、１５ｍＬのＬＢ液体培地が入った三角フラスコの中に移し、２８℃、２００ｒｐｍで１２時間振とう培養する。１％の培養液を吸って１５ｍＬのＬＢ液体培地が入った三角フラスコに移し、２８℃、２００ｒｐｍで１２時間振とう培養し、拮抗菌株の発酵液を取得する。

２)アフラトキシンＢ２標準液をフラボバクテリウムブレーブ発酵液（最終濃度が１×１０^７ＣＦＵ/ｍＬ）の中に入れてＬＢ培地中で共培養し、２８℃、２００ｒｐｍで５日間培養し、処理毎に３つの重複を設ける。

３)培養液中のアフラトキシンＢ２の最終含有量を測定し、分解率を計算する。

上記実験結果を計算により、該フラボバクテリウムブレーブＣＣＴＣＣ Ｎｏ.Ｍ２０１７３２９菌株のアフラトキシンＢ２への分解率は９６.２３％に達し、アフラトキシンＢ２を分解する能力を有することが明らかである。

(実施例４）
１)フラボバクテリウムブレーブ３Ｊ２ＭＯをＬＢプレート中で活性化させ、２８℃の培養箱中で２４時間培養し、採取針で活性化されたフラボバクテリウムブレーブの単一コロニーを採取し、１５ｍＬのＬＢ液体培地が入った三角フラスコの中に移し、２８℃、２００ｒｐｍで１２時間振とう培養する。１％の培養液を吸って１５ｍＬのＬＢ液体培地が入った三角フラスコに移し、２８℃、２００ｒｐｍで１２時間振とう培養し、拮抗菌株の発酵液を取得する。

２)アフラトキシンＧ１標準液をフラボバクテリウムブレーブ発酵液（最終濃度が１×１０^７ＣＦＵ/ｍＬ）の中に入れてＬＢ培地中で共培養し、２８℃、２００ｒｐｍで５日間培養し、処理毎に３つの重複を設ける。

３)培養液中のアフラトキシンＧ１の最終含有量を測定し、分解率を計算する。

上記実験結果を計算により、該フラボバクテリウムブレーブＣＣＴＣＣ Ｎｏ.Ｍ２０１７３２９菌株のアフラトキシンＧ１への分解率は９６.７３％に達し、アフラトキシンＧ１を分解する能力を有することが明らかである。

(実施例５）
１)フラボバクテリウムブレーブ３Ｊ２ＭＯをＬＢプレート中で活性化させ、２８℃の培養箱中で２４時間培養し、採取針で活性化されたフラボバクテリウムブレーブの単一コロニーを採取し、１５ｍＬのＬＢ液体培地が入った三角フラスコの中に移し、２８℃、２００ｒｐｍで１２時間振とう培養する。１％の培養液を吸って１５ｍＬのＬＢ液体培地が入った三角フラスコに移し、２８℃、２００ｒｐｍで１２時間振とう培養し、拮抗菌株の発酵液を取得する。

２)アフラトキシンＧ２標準液をフラボバクテリウムブレーブ発酵液（最終濃度が１×１０^７ＣＦＵ/ｍＬ）の中に入れてＬＢ培地中で共培養し、２８℃、２００ｒｐｍで５日間培養し、処理毎に３つの重複を設ける。

３)培養液中のアフラトキシンＧ２の最終含有量を測定し、分解率を計算する。

上記実験結果を計算により、該フラボバクテリウムブレーブＣＣＴＣＣ Ｎｏ.Ｍ２０１７３２９菌株のアフラトキシンＧ２への分解率は９７.５５％に達し、アフラトキシンＧ２を分解する能力を有することが明らかである。

(実施例６）
１)フラボバクテリウムブレーブ３Ｊ２ＭＯをＬＢプレート中で活性化させ、２８℃の培養箱中で２４時間培養し、採取針で活性化されたフラボバクテリウムブレーブの単一コロニーを採取し、１５ｍＬのＬＢ液体培地が入った三角フラスコの中に移し、２８℃、２００ｒｐｍで１２時間振とう培養する。１％の培養液を吸って１５ｍＬのＬＢ液体培地が入った三角フラスコに移し、２８℃、２００ｒｐｍで１２時間振とう培養し、拮抗菌株の発酵液を取得する。

２)アフラトキシンＭ１標準液をフラボバクテリウムブレーブ発酵液（最終濃度が１×１０^７ＣＦＵ/ｍＬ）の中に入れてＬＢ培地中で共培養し、２８℃、２００ｒｐｍで５日間培養し、処理毎に３つの重複を設ける。

３)培養液中のアフラトキシンＭ１の最終含有量を測定し、分解率を計算する。

上記実験結果を計算により、該フラボバクテリウムブレーブＣＣＴＣＣ Ｎｏ．Ｍ２０１７３２９菌株のアフラトキシンＭ１への分解率は９７.５５％に達し、アフラトキシンＭ１を分解する能力を有することが明らかである。

(実施例７）
特許文献１と全く同じ方法を採用し、特許文献における保存番号ＣＩＣＣ２０９０７であるフラボバクテリウムと本発明のフラボバクテリウムブレーブＣＣＴＣＣ Ｎｏ.Ｍ２０１７３２９菌株がアフラトキシンＢ１を分解する効果を比較した。比較した結果を表４に示す。結果は、本発明のフラボバクテリウムブレーブＣＣＴＣＣ Ｎｏ．Ｍ２０１７３２９によるアフラトキシンＢ１を分解する能力が、特許文献ＣＮ１０５９２５５１３ＡにおけるフラボバクテリウムＣIＣＣ２０９０７によるアフラトキシンＢ１を分解する能力をはるかに超えていることを示している。

実施例１、２、３、４、５、６、７を総合して、本発明におけるフラボバクテリウムブレーブＣＣＴＣＣ Ｎｏ.Ｍ２０１７３２９菌株が５つの一般的なアフラトキシン（アフラトキシンＢ１、アフラトキシンＢ２、アフラトキシンＧ１、アフラトキシンＧ２、アフラトキシンＭ１）に対して非常に強い分解能力を有する。国内および海外の文献を検索したところ、５つの一般的なアフラトキシンを分解するそのような強力な能力を持つ菌株は、国内外で報告されていない。

（付記）
（付記１）
２０１７年６月１３日、ＣＣＴＣＣと略称される中国典型培養物保存センターに保存され、保存番号はＣＣＴＣＣ Ｎｏ.Ｍ２０１７３２９であることを特徴とするフラボバクテリウムブレーブバイオコントロール株３Ｊ２ＭＯ。

（付記２）
付記１に記載のフラボバクテリウムブレーブバイオコントロール株３Ｊ２ＭＯの発酵物を含むことを特徴とするアフラトキシン分解用製剤。

（付記３）
前記製剤の製剤形態は液体、ダスティング、乾燥水和粉剤又は乾燥水和粒剤であることを特徴とする、付記２に記載のアフラトキシン分解用製剤。

（付記４）
前記製剤は液体であり、製剤中のフラボバクテリウムブレーブバイオコントロール株３Ｊ２ＭＯの最終濃度は（１〜９）×１０^７ＣＦＵ/ｍＬであることを特徴とする、付記２に記載のアフラトキシン分解用製剤。

（付記５）
前記製剤はフラボバクテリウムブレーブ３Ｊ２ＭＯ発酵液であり、フラボバクテリウムブレーブ３Ｊ２ＭＯ発酵液中のフラボバクテリウムブレーブ３Ｊ２ＭＯの最終濃度は（１〜９）×１０^７ＣＦＵ/ｍＬであることを特徴とする、付記２に記載のアフラトキシン分解用製剤。

（付記６）
前記フラボバクテリウムブレーブバイオコントロール株３Ｊ２ＭＯ発酵液の調製方法は、フラボバクテリウムブレーブバイオコントロール株３Ｊ２ＭＯがＬＢプレート中で活性化され、２８℃の培養箱中で２４時間培養され、採取針でフラボバクテリウムブレーブの単一コロニーを採取し、液体培地に移し、１２時間〜２４時間振とう培養し、１％〜３％の培養液を吸って新鮮なＬＢ液体培地に移し、１２時間〜２４時間振とう培養し、拮抗菌株フラボバクテリウムブレーブ３Ｊ２ＭＯの発酵液を取得することを特徴とする、付記５に記載のアフラトキシン分解用製剤。

（付記７）
前記アフラトキシン分解用製剤を、生体試料表面にコーティング又は噴霧し、又は生体試料と混合してアフラトキシン分解を行うことによって、生体試料のアフラトキシン汚染を防止するアフラトキシンを分解する、付記２に記載の前記アフラトキシン分解用製剤のアフラトキシン分解中における使用。

（付記８）
フラボバクテリウムブレーブバイオコントロール株３Ｊ２ＭＯの発酵液を生体試料表面に噴霧し、又は生体試料と混合して、すでにアフラトキシンに汚染された生体試料表面のアフラトキシンを分解する、付記１に記載のフラボバクテリウムブレーブバイオコントロール株３Ｊ２ＭＯのアフラトキシン分解における使用。

Claims (8)

1. ２０１７年６月１３日、ＣＣＴＣＣと略称される中国典型培養物保存センターに保存され、保存番号はＣＣＴＣＣ Ｎｏ.Ｍ２０１７３２９であることを特徴とするフラボバクテリウムブレーブバイオコントロール株３Ｊ２ＭＯ。
2. 請求項１に記載のフラボバクテリウムブレーブバイオコントロール株３Ｊ２ＭＯの発酵物を含むことを特徴とするアフラトキシン分解用製剤。
3. 前記製剤の製剤形態は液体、ダスティング、乾燥水和粉剤又は乾燥水和粒剤であることを特徴とする、請求項２に記載のアフラトキシン分解用製剤。
4. 前記製剤は液体であり、製剤中のフラボバクテリウムブレーブバイオコントロール株３Ｊ２ＭＯの最終濃度は（１〜９）×１０^７ＣＦＵ/ｍＬであることを特徴とする、請求項２に記載のアフラトキシン分解用製剤。
5. 前記製剤はフラボバクテリウムブレーブ３Ｊ２ＭＯ発酵液であり、フラボバクテリウムブレーブ３Ｊ２ＭＯ発酵液中のフラボバクテリウムブレーブ３Ｊ２ＭＯの最終濃度は（１〜９）×１０^７ＣＦＵ/ｍＬであることを特徴とする、請求項２に記載のアフラトキシン分解用製剤。
6. 前記フラボバクテリウムブレーブバイオコントロール株３Ｊ２ＭＯ発酵液の調製方法は、フラボバクテリウムブレーブバイオコントロール株３Ｊ２ＭＯがＬＢプレート中で活性化され、２８℃の培養箱中で２４時間培養され、採取針でフラボバクテリウムブレーブの単一コロニーを採取し、液体培地に移し、１２時間〜２４時間振とう培養し、１％〜３％の培養液を吸って新鮮なＬＢ液体培地に移し、１２時間〜２４時間振とう培養し、拮抗菌株フラボバクテリウムブレーブ３Ｊ２ＭＯの発酵液を取得することを特徴とする、請求項５に記載のアフラトキシン分解用製剤。
7. 前記アフラトキシン分解用製剤を、生体試料表面にコーティング又は噴霧し、又は生体試料と混合してアフラトキシン分解を行うことによって、生体試料のアフラトキシン汚染を防止するアフラトキシンを分解する、請求項２に記載の前記アフラトキシン分解用製剤のアフラトキシン分解中における使用。
8. フラボバクテリウムブレーブバイオコントロール株３Ｊ２ＭＯの発酵液を生体試料表面に噴霧し、又は生体試料と混合して、すでにアフラトキシンに汚染された生体試料表面のアフラトキシンを分解する、請求項１に記載のフラボバクテリウムブレーブバイオコントロール株３Ｊ２ＭＯのアフラトキシン分解における使用。