CN109321507B - 一株高效降解黄曲霉毒素的短黄杆菌生防菌株及其应用 - Google Patents

一株高效降解黄曲霉毒素的短黄杆菌生防菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属微生物领域，具体涉及一株高效降解黄曲霉毒素的短黄杆菌生防菌株及其应用。短黄杆菌生防菌株3J2MO已于2017年6月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏编号为CCTCC No.M 2017329。本发明中使用的短黄杆菌生防菌株能显著降解黄曲霉毒素。可用于降解黄曲霉毒素，治理粮食作物的黄曲霉毒素污染。

Description

一株高效降解黄曲霉毒素的短黄杆菌生防菌株及其应用
技术领域
本发明属微生物领域，具体涉及一株高效降解黄曲霉毒素的短黄杆菌生防菌株及其应用。
背景技术
黄曲霉菌是一种病原性真菌，能产生一类强致癌有剧毒的真菌毒素-黄曲霉毒素，包括B、G和M族，其中B1最普遍且毒性最强。其能广泛污染花生，玉米等粮食作物，严重威胁人及家畜的健康，并造成极大的经济损失。因此，加强黄曲霉及毒素污染的治理刻不容缓。
传统去除AFB1的方法主要有吸附、萃取、热处理、射线处理、酸碱处理、氧化还原处理，但是有时费时费力、去毒率不高、易造成营养物质流失。而生物法具有安全、高效、持久的优点。因此，加强黄曲霉毒素生物治理的研究对我国农业产业及经济效益具有重要的意义。
细菌及代谢产物生物降解黄曲霉毒素的报道并不多。关舒、李俊霞等应用香豆素培养基筛选出的嗜麦芽窄食单胞菌能降解黄曲霉毒素，降解率为82.5﹪。王宁等对一株来源于灰叶猴粪便的橙红色粘球菌进行研究，发现其在最佳培养条件下对AFB1的降解率达到78.2％。在现有研究中，暂未见使用短黄杆菌降解黄曲霉毒素的报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一株高效降解黄曲霉毒素的短黄杆菌生防菌株3J2MO及其应用。本发明中的短黄杆菌生防菌株3J2MO能显著降解黄曲霉毒素。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
短黄杆菌生防菌株3J2MO(Myroides odoratimimus 3J2MO)，已于2017年6月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏地址：中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC No.M 2017329。
本发明将于湖北黄陂花生地里采集的土壤梯度稀释后取100μL于LB固体培养基中涂平板进行培养，将长出的细菌用接种环挑出转接到新鲜的LB固体培养基中进行平板划线，多次转接后挑取单菌落，通过降解黄曲霉毒素实验筛选出一株对黄曲霉毒素有显著降解作用的菌株3J2MO，保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏地址：中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC No.M 2017329。利用16S rDNA特异性扩增技术结合形态特征、生理生化实验对其菌种鉴定，结果表明这是一株短黄杆菌(Myroides odoratimimus)，属于放线菌目，短杆菌属。
表1：短黄杆菌3J2MO的主要生物学特性：
Figure BDA0001878193530000021
提供用于降解黄曲霉毒素的制剂，其包括上述短黄杆菌3J2MO的发酵物。
按上述方案，所述制剂的制剂形式为液体、喷粉、干燥可湿性粉剂或干燥可湿性颗粒。
按上述方案，所述制剂为液体，制剂中短黄杆菌3J2MO的终浓度为(1-9)×107CFU/mL。
按上述方案，所述制剂为短黄杆菌3J2MO发酵液，短黄杆菌3J2MO发酵液中短黄杆菌3J2MO的终浓度为(1-9)×107CFU/mL。
按上述方案，所述短黄杆菌3J2MO发酵液的制备方法为：短黄杆菌3J2MO在LB平板中活化，在28℃培养箱中培养24h，用挑针挑取短黄杆菌的单菌落，转移至液体培养基中，振荡培养12h-24h，吸1％-3％培养液转接至新鲜的LB液体培养基中，振荡培养12h-24h，获得拮抗菌株短黄杆菌3J2MO的发酵液。
上述用于降解黄曲霉毒素的制剂在黄曲霉毒素降解中的应用。具体的应用方法为：将用于降解黄曲霉毒素的制剂包覆或喷洒在生物样品表面，或和生物样品混合进行黄曲霉毒素的降解，由此来防治生物样品的黄曲霉毒素污染。
上述短黄杆菌3J2MO发酵液在黄曲霉毒素降解中的应用。具体的应用方法为：将短黄杆菌3J2MO发酵液喷洒在生物样品表面，或和生物样品混合降解已被黄曲霉污染的生物样品表面的黄曲霉毒素。
本发明的有益效果：
本发明首次从土壤中分离出一株对黄曲霉毒素有较好降解效果的短黄杆菌菌株3J2MO。可用于降解黄曲霉毒素，治理粮食作物的黄曲霉毒素污染。
具体实施方式
本发明将于湖北黄陂花生地里采集的土壤梯度稀释后取100ul于LB固体培养基中涂平板进行培养，将长出的细菌用接种环挑出转接到新鲜的LB固体培养基中进行平板划线，多次转接后挑取单菌落，通过降解黄曲霉毒素实验筛选出一株对黄曲霉毒素有显著降解作用的菌株3J2MO，保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏编号为CCTCC No.M2017329。
实施例1:
1)将短黄杆菌3J2MO在LB平板中活化，在28℃培养箱中培养24h，用挑针挑取活化出的短黄杆菌的单菌落，转移至装有15mL LB液体培养基的三角瓶中，于28℃、200r·min-1振荡培养12h。吸1％培养液转接至装有15mLLB液体培养基培的三角瓶中，28℃、200r·min-1振荡培养12h，获得拮抗菌株的发酵液。
2)在短黄杆菌发酵液(终浓度为1×107CFU/mL)中加入黄曲霉毒素B1标准液一起培养于LB培养基中，28℃,200rpm共培养5天,每处理设3个重复。
3)测其培养液中的黄曲霉毒素B1含量(表2)。
表2生防菌对黄曲霉毒素的降解效果
Figure BDA0001878193530000031
从实验结果可以看出，该短黄杆菌CCTCC No.M 2017329菌株对黄曲霉毒素的降解率约为95.61％，表明其具有降解黄曲霉毒素产生的能力。
实施例2：
从湖北花生地里取花生粒研磨成粉，称取0.5g花生粉于培养皿中，加入500μL黄曲霉菌孢子液(5×105个/mL)，在28℃培养箱中培养7d。
在长满孢子的花生粉中加入500μL CCTCC No.M 20177329菌株发酵液，以等量LB培养基为对照，在28℃培养基中培养5d，实验内设3个重复。
加入15mL 70％甲醇水，涡旋后放入摇床30min。取3mL上清加入8mL超纯水涡旋离心；
4)取8mL上清用免疫亲和柱-HPLC法测定黄曲霉毒素B1的含量(表3)，实验内设3个重复。
表3生防菌对黄曲霉菌污染花生的治理效果
Figure BDA0001878193530000041
从实验结果看出，在花生上CCTCC M 2017329菌株对黄曲霉毒素的降解率约为98.76％，表明其对被黄曲霉污染的花生具有良好的治理效果。
实施例3:
1)将短黄杆菌3J2MO在LB平板中活化，在28℃培养箱中培养24h，用挑针挑取活化出的短黄杆菌的单菌落，转移至装有15mL LB液体培养基的三角瓶中，于28℃、200r·min-1振荡培养12h。吸1％培养液转接至装有15mLLB液体培养基培的三角瓶中，28℃、200r·min-1振荡培养12h，获得拮抗菌株的发酵液。
2)在短黄杆菌发酵液(终浓度为1×107CFU/mL)中加入黄曲霉毒素B2标准液一起培养于LB培养基中，28℃,200rpm共培养5天,每处理设3个重复。
3)测其培养液中的黄曲霉毒素B2终含量，计算降解率。
上述实验结果经过计算，该短黄杆菌CCTCC No.M2017329菌株对黄曲霉毒素B2的降解率达96.23％，表明其具有降解黄曲霉毒素B2的能力。
实施例4:
1)将短黄杆菌3J2MO在LB平板中活化，在28℃培养箱中培养24h，用挑针挑取活化出的短黄杆菌的单菌落，转移至装有15mL LB液体培养基的三角瓶中，于28℃、200r·min-1振荡培养12h。吸1％培养液转接至装有15mL LB液体培养基培的三角瓶中，28℃、200r·min-1振荡培养12h，获得拮抗菌株的发酵液。
2)在短黄杆菌发酵液(终浓度为1×107CFU/mL)中加入黄曲霉毒素G1标准液一起培养于LB培养基中，28℃,200rpm共培养5天,每处理设3个重复。
3)测其培养液中的黄曲霉毒素G1终含量，计算降解率。
上述实验结果经过计算，该短黄杆菌CCTCC No.M2017329菌株对黄曲霉毒素G1的降解率达96.73％，表明其具有降解黄曲霉毒素G1的能力。
实施例5:
1)将短黄杆菌3J2MO在LB平板中活化，在28℃培养箱中培养24h，用挑针挑取活化出的短黄杆菌的单菌落，转移至装有15mL LB液体培养基的三角瓶中，于28℃、200r·min-1振荡培养12h。吸1％培养液转接至装有15mL LB液体培养基培的三角瓶中，28℃、200r·min-1振荡培养12h，获得拮抗菌株的发酵液。
2)在短黄杆菌发酵液(终浓度为1×107CFU/mL)中加入黄曲霉毒素G2标准液一起培养于LB培养基中，28℃,200rpm共培养5天,每处理设3个重复。
3)测其培养液中的黄曲霉毒素G2终含量，计算降解率。
上述实验结果经过计算，该短黄杆菌CCTCC No.M2017329菌株对黄曲霉毒素G2的降解率达97.55％，表明其具有降解黄曲霉毒素G2的能力。
实施例6:
1)将短黄杆菌3J2MO在LB平板中活化，在28℃培养箱中培养24h，用挑针挑取活化出的短黄杆菌的单菌落，转移至装有15mL LB液体培养基的三角瓶中，于28℃、200r·min-1振荡培养12h。吸1％培养液转接至装有15mL LB液体培养基培的三角瓶中，28℃、200r·min-1振荡培养12h，获得拮抗菌株的发酵液。
2)在短黄杆菌发酵液(终浓度为1×107CFU/mL)中加入黄曲霉毒素M1标准液一起培养于LB培养基中，28℃,200rpm共培养5天,每处理设3个重复。
3)测其培养液中的黄曲霉毒素M1终含量，计算降解率。
上述实验结果经过计算，该短黄杆菌CCTCC No.M2017329菌株对黄曲霉毒素M1的降解率达97.55％，表明其具有降解黄曲霉毒素M1的能力。
实施例7:
采用与专利文献CN 105925513A完全一样的方法，比较专利文献中保藏号为CICC20907的黄杆菌与该短黄杆菌CCTCC No.M2017329菌株对黄曲霉毒素B1的降解效果。比较结果见表4。结果表明：本发明提供的短黄杆菌CCTCCNo.M2017329对黄曲霉毒素B1的降解能力远远超过专利文献CN 105925513A中黄杆菌CICC 20907对黄曲霉毒素B1的降解能力。
表4本发明与专利105925513A中的黄杆菌CICC 20907菌株对黄曲霉毒素B1的降解能力的比较
Figure BDA0001878193530000061
综合实施例1、2、3、4、5、6、7，本发明中的短黄杆菌CCTCCNo.M2017329菌株对常见的五种黄曲霉毒素都具有非常强的降解能力，经查询国内外文献，具备这样强力降解五种常见黄曲霉毒素能力的菌株此前国内外均未见报道。

Claims (8)

1.短黄杆菌(Myroides odoratimimus) 生防菌株3J2MO，其特征在于：于2017年6月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏编号为CCTCC No.M 2017329。
2.用于降解黄曲霉毒素的制剂，其特征在于：包括权利要求1所述的短黄杆菌生防菌株3J2MO的发酵物。
3.根据权利要求2所述的用于降解黄曲霉毒素的制剂，其特征在于：所述制剂的制剂形式为液体、喷粉、干燥可湿性粉剂或干燥可湿性颗粒。
4.根据权利要求2所述的用于降解黄曲霉毒素的制剂，其特征在于：所述制剂为液体，制剂中短黄杆菌生防菌株3J2MO的终浓度为（1-9）×107 CFU/mL。
5.根据权利要求2所述的用于降解黄曲霉毒素的制剂，其特征在于：制剂为短黄杆菌3J2MO发酵液，短黄杆菌3J2MO发酵液中短黄杆菌3J2MO的终浓度为（1-9）×107 CFU/mL。
6.根据权利要求5所述的用于降解黄曲霉毒素的制剂，其特征在于：所述短黄杆菌生防菌株3J2MO发酵液的制备方法为：短黄杆菌生防菌株3J2MO在LB平板中活化，在28℃培养箱中培养24h，用挑针挑取短黄杆菌的单菌落，转移至液体培养基中，振荡培养12 h-24h，吸1%-3%培养液转接至新鲜的LB液体培养基中，振荡培养12h-24h，获得拮抗菌株短黄杆菌3J2MO的发酵液。
7.权利要求2所述的用于降解黄曲霉毒素的制剂在黄曲霉毒素降解中的应用，具体的应用方法为：将用于降解黄曲霉毒素的制剂包覆或喷洒在生物样品表面，或和生物样品混合进行黄曲霉毒素的降解，由此来防治生物样品的黄曲霉毒素污染。
8.权利要求1所述的短黄杆菌生防菌株 3J2MO在黄曲霉毒素降解中的应用，具体的应用方法为：将短黄杆菌生防菌株3J2MO的发酵液喷洒在生物样品表面，或和生物样品混合降解已被黄曲霉污染的生物样品表面的黄曲霉毒素。
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