JP2020527643A - 新規な水溶性天然多糖抗菌材料及びその調製方法 - Google Patents
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Abstract
Description
キトサンを希酸溶液に溶解して、キトサンの希酸水溶液を得るステップ1)と、
ステップ1)で得られたキトサンの希酸水溶液にシアナミド又はジシアンジアミドを加え、反応させるステップ2)と、
アミノ酸活性化溶液をステップ2)の反応系に加えて、アミド化反応を行うステップ3)と、
塩酸ヒドロキシルアミンを加えて反応を停止するステップ4)と、
反応液をろ過した後、脱イオン水で透析し、マイクロ波真空乾燥させて、新規な水溶性天然多糖抗菌材料を得るステップ5)と、を含む。マイクロ波真空乾燥技術の使用は、エネルギー消費量が低く、効率が高い。
アミノ酸、N−ヒドロキシスクシンイミド及び1−(3−ジメチルアミノプロピル)−3−エチルカルボジイミド塩酸塩を2−(N−モルフォリノ)エタンスルホン酸緩衝液に溶解し、0−35℃の間の一定の温度で0.5−3時間撹拌して活性化させる方法によって得られ、
前記2−(N−モルフォリノ)エタンスルホン酸緩衝液は、濃度30mmol/L、pH5.0±0.5であり、
1−(3−ジメチルアミノプロピル)−3−エチルカルボジイミド塩酸塩とアミノ酸とのモル比は、0.5−5:1であり、N−ヒドロキシスクシンイミドと1−(3−ジメチルアミノプロピル)−3−エチルカルボジイミド塩酸塩とのモル比は、1:1である。
本発明で調製された新規な水溶性天然多糖抗菌材料は、キトサン水溶性を改善するとともに、キトサンの制菌・抗菌性を向上させる。次に、該新規水溶性キトサン抗菌材料は、分子にグアニジル基を有するとともに、アミノ酸を有するため、キトサンの抗菌性を向上するとともに、その生物学的安全性を備え、細胞毒性が低く、環境にやさしい抗菌製品である。
反応させて得た新規な水溶性天然多糖抗菌材料に対して、イオン水による透析方法で処理することによって、小分子副生物又は不純物を除去して、サンプルを精製する。エタノール沈殿法により不純物が完全に除去できないという欠点を解決し、また、マイクロ波真空乾燥方法でサンプルを処理することによって、従来のドライ過程に制菌基が分解することにより制菌効果が低下することを回避し、さらに乾燥効率を大幅に向上させ、工業的生産に適している。
本発明の前記新規な水溶性天然多糖抗菌材料の調製方法は、操作しやすく、反応釜において1回反応させることで製造を完了し、使用される主原料であるキトサンは、入手しやすい天然高分子キトサンであり、使用される装置は、簡単であり、したがって、工業的生産に適している。
以下、図面を参照しながら本発明の具体的な実施形態を詳細に説明する。
キトサン0.5gを濃度0.1mol/Lの希塩酸100mlに加えて、60℃の油浴条件下、半時間機械的に撹拌して、キトサンを完全に溶解し、濃度0.005g/mLの均一なキトサン溶液を得て、油浴を110℃に昇温し、ジシアンジアミドとキトサンとのモル比が5:1となるように、キトサン溶液にジシアンジアミド1.3gを一括して加え、所定の温度を保持しながら6時間撹拌し、反応液を室温に降温し、次に、室温で2時間活性化させたリジン、N−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)及び1−(3−ジメチルアミノプロピル)−3−エチルカルボジイミド塩酸塩(EDC・HCl)の混合溶液(溶媒は、濃度30mmol/Lの2−(N−モルフォリノ)エタンスルホン酸(MES)の緩衝溶液であり、pH5.0程度である)20mLを上記反応液に加え、室温で持続的に24時間撹拌しながら反応させ、ここで、キトサン、リジン、NHS、EDCのモル比は、5:1:2:2であり、反応液をろ過した後、透析袋に入れて、透析袋の両端を縛って脱イオン水に入れて透析処理を行い、4時間おきに水を1回交換し、水を8回交換した後、透析液をマイクロ波真空乾燥機に入れて処理し、前記新規な水溶性抗菌材料を得た。
図1は、原料であるキトサン及び本発明の実施例1で調製される新規な水溶性天然多糖抗菌材料の赤外線スペクトルを示す。2本のスペクトル線(黒色スペクトル線は、原料であるキトサン、赤色スペクトル線は、新規な水溶性天然多糖抗菌材料に対応する)を比較した結果、原料であるキトサンは、3438cm-1に現れるピーク幅が−NH2及び−OHの伸縮振動に対応し、一方、変性した後にこの部位でのピークの位置が赤方に偏移し且つ広くなった。また、この位置でのピークが広くなることは、これら−NH2及び−OHには強度が異なる分子内及び分子間の水素結合があることを示し、ピーク幅の差異は、水素結合の強度を反映している。変性したキトサンのスペクトルにおいては、ピーク位置が赤方に偏移しかつ広くなることは、水素結合が消えることを示し、キトサンが誘導化反応を行ったことを反映し、また、元の原料であるキトサンの1597cm-1に現れた−NH2−屈曲振動が消え、変性したキトサンのスペクトルにおいて、1659cm-1及び1553cm-1に現れるピークは、それぞれC=Nの伸縮振動ピーク及びN−Hの屈曲振動ピークに属する。両方のスペクトルにおけるこれら変化は、変性機能基がアミノ基を介してキトサンの分子鎖にグラフトされていることを示している。
図2は、本発明の実施例1で調製される新規な水溶性天然多糖抗菌材料についてGB15979−2002『使い捨て衛生用品の衛生基準』に記載の混釈平板法によって黄色ブドウ球菌に対して抗菌性試験を行った結果の写真であり、左側から右側へ順次濃度0.5mg/ml、0.25mg/ml、0.125mg/mlの本実施例で調製される新規な水溶性天然多糖抗菌材料(中性の脱イオン水に溶解した)及びブランクコントロール群(あらゆる抗菌剤も添加せず)の培地に菌体を塗布した後、37℃の恒温恒湿インキュベータにおいて36時間培養した後の抗菌試験結果である。該結果から明らかなように、本実施例で調製される新規な水溶性天然多糖抗菌材料は、黄色ブドウ球菌に対して良好な阻害性能を有した。
混釈平板法による、本実施例で調製される製品の黄色ブドウ球菌制菌率のデータ統計結果は、下表で示される。
以上の各データの結果から明らかなように、新規な水溶性天然多糖抗菌材料は、良好な抗菌性を有するとともに、有効制菌濃度で細胞が正常に成長し、良好な生物学的安全性を有した。
キトサン1.0gを濃度0.1mol/Lの希塩酸100mlに加えて、60℃の油浴条件下、1時間機械的に撹拌して、キトサンを完全に溶解し、濃度0.01g/mLの均一なキトサン溶液を得て、油浴を105℃に昇温し、シアナミドとキトサンとのモル比が4:1となるように、キトサン溶液系にシアナミド1.05gを一括して加え、所定の温度を保持しながら6時間撹拌し、次に、油浴内の反応液を室温に降温し、氷水混合浴において3時間活性化させたロイシン、N−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)及び1−(3−ジメチルアミノプロピル)−3−エチルカルボジイミド塩酸塩(EDC・HCl)の混合溶液(溶媒は、30mmol/Lの2−(N−モルフォリノ)エタンスルホン酸(MES)の緩衝溶液である)20mlを上記反応液に加え、室温で持続的に10時間撹拌しながら反応させ、ここで、キトサン、ロイシン、NHS、EDCのモル比は、50:1:5:5であり、反応液をろ過した後、透析袋に入れて、透析袋の両端を縛って脱イオン水に入れて透析処理を行い、4時間おきに水を1回交換し、水を8回交換した後、透析液をマイクロ波真空乾燥機に入れて処理し、前記新規な水溶性天然多糖抗菌材料を得た。
キトサン2.0gを濃度0.15mol/Lの希塩酸100mlに加えて、60℃の油浴条件下、1時間機械的に撹拌して、キトサンを完全に溶解し、濃度0.02g/mLの均一なキトサン溶液を得て、油浴を100℃に昇温し、ジシアンジアミドとキトサンとのモル比が2:1となるように、キトサン油浴液系にジシアンジアミド2.08gを一括して加え、100℃の油浴条件下、温度を保持しながら12時間撹拌し、次に、油浴内の反応液を室温に降温し、氷水混合浴において3時間活性化させたイソロイシン、N−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)及び1−(3−ジメチルアミノプロピル)−3−エチルカルボジイミド塩酸塩(EDC・HCl)の混合溶液(溶媒は、濃度30mmol/Lの2−(N−モルフォリノ)エタンスルホン酸(MES)の緩衝溶液であり、pH5.0程度である)20mlを上記反応液に加え、室温で持続的に24時間撹拌しながら反応させ、キトサン、イソロイシン、NHS、EDCのモル比は、20:1:4:4であり、反応液をろ過した後、透析袋に入れて、透析袋の両端を縛って脱イオン水に入れて透析処理を行い、4時間おきに水を1回交換し、水を8回交換した後、透析液をマイクロ波真空乾燥機に入れて処理し、前記新規な水溶性天然多糖抗菌材料を得た。
キトサン5.0gを濃度0.15mol/Lの希塩酸100mlに加えて、60℃の油浴条件下、1時間機械的に撹拌して、キトサンを完全に溶解し、濃度0.05g/mLの均一なキトサン溶液を得て、油浴を80℃に昇温し、シアナミドとキトサンとのモル比が3:1となるように、キトサン水溶液系にシアナミド3.91gを一括して加え、80℃の条件下、24時間反応させ、次に、油浴内の反応液を室温に降温し、室温で2時間活性化させたリジン、N−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)及び1−(3−ジメチルアミノプロピル)−3−エチルカルボジイミド塩酸塩(EDC・HCl)の混合溶液(溶媒は、濃度30mmol/Lの2−(N−モルフォリノ)エタンスルホン酸(MES)の緩衝溶液であり、PH5.0程度である)20mlを上記反応液に加え、室温で持続的に24時間撹拌しながら反応させ、キトサン、リジン、NHS、EDCのモル比は、5:1:2:2であり、反応液をろ過した後、透析袋に入れて、透析袋の両端を縛って脱イオン水に入れて透析処理を行い、5時間おきに水を1回交換し、水を8回交換した後、透析液をマイクロ波真空乾燥機に入れて処理し、前記新規な水溶性天然多糖抗菌材料を得た。
キトサン7.0gを濃度0.3mol/Lの希塩酸100mlに加えて、70℃の油浴条件下、2時間機械的に撹拌し、キトサンを完全に溶解し、濃度0.07g/mLの均一なキトサン溶液を得て、70℃の油浴条件下、シアナミドとキトサンとのモル比が1:1となるように、キトサン水溶液系にシアナミド1.83gを一括して加え、恒温で36時間保持し、次に、油浴内の反応液を室温に降温し、室温で2時間活性化させたロイシン、N−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)及び1−(3−ジメチルアミノプロピル)−3−エチルカルボジイミド塩酸塩(EDC・HCl)の混合溶液(溶媒は、濃度30mmol/Lの2−(N−モルフォリノ)エタンスルホン酸(MES)の緩衝溶液であり、PH5.0程度である)20mlを上記反応液に加え、室温で持続的に24時間撹拌しながら反応させ、キトサン、ロイシン、NHS、EDCのモル比は、5:1:4:4であり、反応液をろ過した後、透析袋に入れて、透析袋の両端を縛って脱イオン水に入れて透析処理を行い、4時間おきに水を1回交換し、水を8回交換した後、透析液をマイクロ波真空乾燥機に入れて処理し、前記新規な水溶性天然多糖抗菌材料を得た。
キトサン10gを濃度0.5mol/Lの希塩酸100mlに加えて、60℃の油浴条件下、2時間機械的に撹拌し、キトサンを完全に溶解し、濃度0.1g/mLの均一なキトサン溶液を得て、60℃の油浴条件下、ジシアンジアミドとキトサンとのモル比が0.5:1となるように、キトサン水溶液系にジシアンジアミド2.61gを一括して加え、60℃の条件下、48時間反応させ、次に、油浴内の反応液を室温に降温し、室温で2時間活性化させたイソロイシン、N−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)及び1−(3−ジメチルアミノプロピル)−3−エチルカルボジイミド塩酸塩(EDC・HCl)の混合溶液(溶媒は、濃度30mmol/Lの2−(N−モルフォリノ)エタンスルホン酸(MES)の緩衝溶液であり、PH5.0程度である)30mlを上記反応液に加え、35℃の水浴において持続的に24時間撹拌しながら反応させ、キトサン、イソロイシン、NHS、EDCのモル比は、4:1:3:3であり、反応液をろ過した後、透析袋に入れて、透析袋の両端を縛って脱イオン水に入れて透析処理を行い、4時間おきに水を1回交換し、水を8回交換した後、透析液をマイクロ波真空乾燥機に入れて処理し、前記新規な水溶性天然多糖抗菌材料を得た。
Claims (10)
- 分子構造式が式1で示される、
ことを特徴とする新規な水溶性天然多糖抗菌材料。
- キトサンを希酸溶液に溶解して、キトサンの希酸水溶液を得るステップ1)と、
ステップ1)で得られたキトサンの希酸水溶液にシアナミド又はジシアンジアミドを加え、反応させるステップ2)と、
アミノ酸活性化溶液をステップ2)の反応系に加えて、アミド化反応を行うステップ3)と、
塩酸ヒドロキシルアミンを加えて反応を停止するステップ4)と、
反応液をろ過した後、脱イオン水で透析し、マイクロ波真空乾燥させて、新規な水溶性天然多糖抗菌材料を得るステップ5)と、を含む、
ことを特徴とする請求項1に記載の新規な水溶性天然多糖抗菌材料の調製方法。 - ステップ1)では、前記キトサンは、数平均分子量が102−107であり、脱アセチル化度が50−100%であり、
前記希酸は、塩酸又は酢酸であり、酸の濃度が0−0.5mol/Lであり、
前記キトサンの希酸水溶液の濃度は、0.001−0.1g/mLである、
ことを特徴とする請求項2に記載の方法。 - ステップ1)では、前記溶解条件は、60−110℃の間の一定の温度で撹拌することである、
ことを特徴とする請求項2に記載の方法。 - ステップ2)では、前記シアナミド又はジシアンジアミドとキトサンとのモル比は、0.5−5:1であり、
反応条件は、60−110℃の間の一定の温度で6−48時間撹拌することである、
ことを特徴とする請求項2に記載の方法。 - ステップ3)では、前記アミノ酸活性化溶液は、
アミノ酸、N−ヒドロキシスクシンイミド及び1−(3−ジメチルアミノプロピル)−3−エチルカルボジイミド塩酸塩を2−(N−モルフォリノ)エタンスルホン酸緩衝液に溶解して、0−35℃の間の一定の温度で0.5−3時間撹拌して活性化させる方法によって得られ、
前記2−(N−モルフォリノ)エタンスルホン酸緩衝液は、濃度30mmol/L、pH5.0±0.5である、
ことを特徴とする請求項2に記載の方法。 - 前記1−(3−ジメチルアミノプロピル)−3−エチルカルボジイミド塩酸塩とアミノ酸とのモル比は、0.5−5:1であり、N−ヒドロキシスクシンイミドと1−(3−ジメチルアミノプロピル)−3−エチルカルボジイミド塩酸塩とのモル比は、1:1である、
ことを特徴とする請求項6に記載の方法。 - 前記アミノ酸は、ロイシン、イソロイシン又はリジンである、
ことを特徴とする請求項2−7のいずれか1項に記載の方法。 - 前記キトサンとアミノ酸とのモル比は、1−50:1であり、
ステップ3)では、アミド化反応の温度は、0−35℃である、
ことを特徴とする請求項2に記載の方法。 - ステップ5)では、脱イオン水による透析過程に、5−10時間あたり1回、合計6−8回水を交換する、
ことを特徴とする請求項2に記載の方法。
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