CN108191994B - 一种具有选择抑菌特性的壳聚糖衍生物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
Description
技术领域
本发明涉及壳聚糖化学改性领域。更具体地,涉及一种具有选择性抑菌功能壳聚糖衍生物及其制备方法。
背景技术
近年来,由抗菌剂导致的卫生与健康问题频繁出现,使人们对兼具安全性和高效性的新型抗菌剂的需求日益强烈。壳聚糖作为一种碱性多糖,具有良好的生物相容性和生物可降解性,是一种较为理想的抗菌材料。但是,由于壳聚糖抗菌性能难以满足应用要求,且难于加工,通常需要进行衍生化以改善其抗菌性能和水溶性。羧甲基化和季铵盐化是较为常见的衍生化方法,然而上述方法制备的壳聚糖衍生物难以兼顾安全性和高效性。通常抗菌剂在杀灭有害菌的同时,也会对正常菌群带来不同程度的损害。过度使用或不正确使用抗菌剂能够导致菌群失调,使有害菌大量繁殖,引起感染。在不断提高抗菌性能时,抗菌剂对正常菌群的影响常常被忽略。
因此,提供一种抗菌剂在兼具良好抗菌性能和生物安全性的同时,满足维持生理环境菌群平衡的要求是十分必要的。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种具有选择抑菌特性的壳聚糖衍生物,该壳聚糖衍生物在壳聚糖主链上同时接枝碱性氨基酸或其低聚物和疏水性氨基酸或其低聚物,通过对碱性和疏水性单元比例的调控,使壳聚糖衍生物对白色念珠菌和乳酸杆菌的抑制作用具有一定的选择性。
本发明的另一个目的在于提供上述壳聚糖衍生物的制备方法。该制备过程在常温常压条件下进行,无需使用有机溶剂或强酸,不产生污染物。整个生产工艺节能环保,可大规模工业化。
为达到上述目的,本发明采用下述技术方案:
本发明提供了一种具有选择抑菌特性的壳聚糖衍生物,所述壳聚糖衍生物的分子结构式如式(1)所示:
其中,x、y和z为自然数,1≤x,y,z≤10000,R1为碱性氨基酸或其低聚物,R2为疏水性氨基酸或其低聚物。
本发明中,上述分子结构式(1)中,R1可以是一个碱性氨基酸单元或具有多个重复单元的碱性氨基酸低聚物;R2可以是一个疏水性氨基酸单元或具有多个重复单元的疏水性氨基酸低聚物。所述碱性氨基酸低聚物和疏水性氨基酸低聚物的聚合度均不超过100,以避免分子量过高而导致氨基酸低聚物不溶于水,降低产物接枝率,造成原料浪费。
优选地,所述碱性氨基酸为赖氨酸、精氨酸、组氨酸中一种或多种混合物。更优选地,所述碱性氨基酸为赖氨酸和精氨酸中的一种或二者混合物。由于赖氨酸和精氨酸在天然氨基酸中碱性最强,上述优选范围可以赋予壳聚糖衍生物更为理想的正电性。
优选地,所述疏水性氨基酸为异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、丙氨酸中一种或多种混合物。更优选地,所述疏水性氨基酸为异亮氨酸和亮氨酸中的一种或二者混合物。由于异亮氨酸和亮氨酸在天然氨基酸中疏水性最强,上述优选范围能够在壳聚糖分子链上提供更为理想的疏水位点。
本发明中,上述分子结构式(1)中,三个重复单元在高分子链中的排列顺序并非是完全按照结构式中所标注的顺序,而是采取无规则的排列方式在高分子链中排列组合的。也就是说,壳聚糖衍生物分子链中的碱性氨基酸或其低聚物取代基以及疏水性氨基酸或其低聚物呈无规则排列。
本发明还提供了上述具有选择抑菌特性的壳聚糖衍生物的制备方法,包括如下步骤:
(1)将壳聚糖溶于稀酸溶液,制得壳聚糖溶液;
(2)将碱性氨基酸或其低聚物和疏水性氨基酸或其低聚物溶于缓冲溶液,经活化,得到氨基酸活化溶液;
(3)将步骤(1)所述的壳聚糖溶液与步骤(2)所述的氨基酸活化溶液混合,进行反应;
(4)产物经纯化,得到所述具有选择抑菌特性的壳聚糖衍生物。
进一步,步骤(1)中,所述壳聚糖可选用各种市售产品,分子量在103~106Da之间。作为优选方案,应采用分子量在103~105Da之间的壳聚糖。此优选分子量范围既可保证壳聚糖的高分子属性,又不会因为分子量过高导致反应溶液粘度过大,而影响反应转化率。优选地,应采用脱乙酰度在50%以上的壳聚糖。更优选地,脱乙酰度为90%以上。此优选脱乙酰度范围可以确保壳聚糖分子链上有尽可能多的接枝位点,以提高接枝效率。
优选地,所述壳聚糖水溶液中壳聚糖的浓度为1~500mg/mL。更优选地,所述壳聚糖的浓度为10~300mg/mL。此优选壳聚糖浓度范围可以保证反应的高生产效率和产物的高接枝率。壳聚糖浓度过高会增加反应体系粘度,降低反应转化率和反应均一性。
进一步,步骤(1)中,所述稀酸溶液pH值为不超过6.0。
优选地,步骤(2)中,所述碱性氨基酸为赖氨酸、精氨酸、组氨酸中一种或多种混合物。更优选地,所述碱性氨基酸为赖氨酸和精氨酸中的一种或二者混合物。由于赖氨酸和精氨酸在天然氨基酸中碱性最强,上述优选范围可以赋予壳聚糖衍生物更为理想的正点性。
优选地,步骤(2)中,所述疏水性氨基酸为异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、丙氨酸中一种或多种混合物。更优选地,所述疏水性氨基酸为异亮氨酸和亮氨酸中的一种或二者混合物。由于异亮氨酸和亮氨酸在天然氨基酸中疏水性最强,上述优选范围能够在壳聚糖分子链上提供更为理想的疏水位点。
优选地,步骤(2)中,所述碱性氨基酸低聚物和疏水性氨基酸的聚合度均不超过100。上述优选范围可以避免分子量过高而导致氨基酸低聚物不溶于水,降低产物接枝率,造成原料浪费。
优选地,步骤(2)中,所述碱性氨基酸或低聚物与疏水性氨基酸或低聚物分子摩尔比为0.05~50:1。更优选地,所述碱性氨基酸或低聚物与疏水性氨基酸或低聚物分子摩尔比为0.1~10:1。上述优选范围可以同时赋予壳聚糖衍生物更为理想的正点性和足够数量的疏水性位点,使壳聚糖衍生物在抑制白色念珠菌和乳酸杆菌时具有一定的选择性。
步骤(2)中,所述氨基酸活化溶液中氨基酸或其低聚物的浓度为100~600mg/mL;活化时间为不超过12小时。
本发明中,由于原材料为壳聚糖和天然氨基酸或其低聚物,均具有很好的水溶性,全部制备过程在水溶液环境下进行,无需使用强酸、强碱或有机溶剂,反应条件温和,最大限度降低了对环境的污染和能耗。另外,本发明原材料均具有良好的生物相容性和生物可降解性,反应产物及其降解产物具有良好的生物安全性、低细胞毒性、低溶血性、不产生耐药性。
本发明首次成功制备了具有选择抑菌特性的壳聚糖衍生物,该壳聚糖衍生物同时接枝有可调节正电性和疏水性的氨基酸单元。通过改变氨基酸单元的接枝比例,调控壳聚糖衍生物正电性-疏水性平衡,从而改变抗菌剂与微生物细胞表面的相互作用,进而实现对白色念珠菌和乳酸杆菌的选择性抑菌,对白色念珠菌的抑菌率≥90%,同时对乳酸杆菌的抑菌率<50%。该产物是一种高性能的绿色抗菌剂。
本发明进一步提供了上述具有选择抑菌特性壳聚糖衍生物作为抗菌剂的应用。
需要注意的是:在本发明说明书中出现的所有分子结构式中,各个重复单元的排列顺序并非是完全按照结构式中所标注的顺序,而是采取无规则的排列方式在高分子链中排列组合的。
另外注意的是,如果没有特别说明,本发明所记载的任何范围包括端值以及端值之间的任何数值以及以端值或者端值之间的任意数值所构成的任意子范围。
本发明的有益效果如下:
本发明首次成功制备了具有选择抑菌特性的壳聚糖衍生物,在壳聚糖主链上同时接枝碱性氨基酸或其低聚物和疏水性氨基酸或其低聚物,通过对碱性和疏水性单元比例的调控,有效改善了壳聚糖水溶性,提高了对白色念珠菌的抑菌率(≥90%),同时该产物对乳酸杆菌的抑菌率低于50%,是一种高性能的绿色抗菌剂,可作为抗菌剂用于体表创口清洁、外用敷料、一次性卫生用品和日化产品等领域。
本发明原材料均具有很好的水溶性,反应条件温和,在常温常压条件下即可进行反应,无需使用有机溶剂、强碱或强酸,最大限度降低了对环境的污染和能耗。整个制备工艺节能环保,可大规模工业化。另外,本发明原材料均具有良好的生物相容性和生物可降解性,得到的产物及其降解产物具有良好的生物安全性、低细胞毒性、低溶血性、且不产生耐药性。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明,下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解,下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的,不应以此限制本发明的保护范围。
实施例1
称取0.35g壳聚糖溶于35mL稀酸溶液,得到壳聚糖水溶液。将精氨酸与亮氨酸(摩尔比为50:1)溶于15mL缓冲溶液,活化10小时,得到氨基酸浓度为300mg/mL的氨基酸活化溶液。将氨基酸活化溶液与壳聚糖水溶液混合,反应24小时。反应结束后,产物经纯化,得到所述具有选择抑菌特性的壳聚糖衍生物。
依据GB/T 16886.5-2003《医疗器械生物学评价第五部分体外细胞毒性试验》方法要求,对本实施例制备的壳聚糖衍生物进行了检测。该结果显示,在本实施例制备的壳聚糖衍生物溶液2mg/mL浓度下,人永生化表皮细胞的细胞增值率为87%。
依据YY/T 012701-1993《口腔材料生物试验方法溶血试验》试验方法对本实施例制备的壳聚糖衍生物进行了检测。该结果显示,在本实施例制备的壳聚糖衍生物溶液2mg/mL浓度下,溶血率为<5%。
依据GB15979-2002《一次性使用卫生用品卫生标准》附录C试验方法对本实施例制备的壳聚糖衍生物进行了检测。评判标准:抑菌率≥50~90%,产品有菌作用;抑菌率≥99%,产品有较强抑菌作用。该结果表明:本实施例制备的壳聚糖衍生物溶液(0.1mg/mL)与菌液作用2min的条件下,对白色念珠菌(ATCC 10231)的抑菌率为>99%,对乳酸杆菌(CGMCC1.1878)的抑菌率为<50%。
以上各数据结果说明:本实施例制备的壳聚糖衍生物具有低细胞毒性和低溶血率,在对白色念珠菌具有较强抑菌作用的同时,对乳酸杆菌无抑菌率作用。
实施例2
称取0.7g壳聚糖溶于35mL稀酸溶液,得到壳聚糖水溶液。将赖氨酸与异亮氨酸(摩尔比为0.1:1)溶于15mL缓冲溶液,活化6小时,得到氨基酸浓度为600mg/mL的氨基酸活化溶液。将氨基酸活化溶液与壳聚糖水溶液混合,反应24小时。反应结束后,产物经纯化,得到所述具有选择抑菌特性的壳聚糖衍生物。
依据GB/T 16886.5-2003《医疗器械生物学评价第五部分体外细胞毒性试验》方法要求,对本实施例制备的壳聚糖衍生物进行了检测。该结果显示,在本实施例制备的壳聚糖衍生物溶液2mg/mL浓度下,人永生化表皮细胞的细胞增值率为93%。
依据YY/T 012701-1993《口腔材料生物试验方法溶血试验》试验方法对本实施例制备的壳聚糖衍生物进行了检测。该结果显示,在本实施例制备的壳聚糖衍生物溶液2mg/mL浓度下,溶血率为<5%。
依据GB15979-2002《一次性使用卫生用品卫生标准》附录C试验方法对本实施例制备的壳聚糖衍生物进行了检测。评判标准:抑菌率≥50~90%,产品有菌作用;抑菌率≥99%,产品有较强抑菌作用。该结果表明:本实施例制备的壳聚糖衍生物溶液(0.1mg/mL)与菌液作用2min的条件下,对白色念珠菌(ATCC 10231)的抑菌率为>99%,对乳酸杆菌(CGMCC1.1878)的抑菌率为<50%。
以上各数据结果说明:本实施例制备的壳聚糖衍生物具有低细胞毒性和低溶血率,在对白色念珠菌具有较强抑菌作用的同时,对乳酸杆菌无抑菌率作用。
实施例3
称取0.035g壳聚糖溶于35mL稀酸溶液,得到壳聚糖水溶液。将精氨酸低聚物与亮氨酸(摩尔比为0.05:1)溶于15mL缓冲溶液,活化8小时,得到氨基酸浓度为100mg/mL的氨基酸活化溶液。将氨基酸活化溶液与壳聚糖水溶液混合,反应24小时。反应结束后,产物经纯化,得到所述具有选择抑菌特性的壳聚糖衍生物。
依据GB/T 16886.5-2003《医疗器械生物学评价第五部分体外细胞毒性试验》方法要求,对本实施例制备的壳聚糖衍生物进行了检测。该结果显示,在本实施例制备的壳聚糖衍生物溶液2mg/mL浓度下,人永生化表皮细胞的细胞增值率为95%。
依据YY/T 012701-1993《口腔材料生物试验方法溶血试验》试验方法对本实施例制备的壳聚糖衍生物进行了检测。该结果显示,在本实施例制备的壳聚糖衍生物溶液2mg/mL浓度下,溶血率为<5%。
依据GB15979-2002《一次性使用卫生用品卫生标准》附录C试验方法对本实施例制备的壳聚糖衍生物进行了检测。评判标准:抑菌率≥50~90%,产品有菌作用;抑菌率≥99%,产品有较强抑菌作用。该结果表明:本实施例制备的壳聚糖衍生物溶液(0.1mg/mL)与菌液作用2min的条件下,对白色念珠菌(ATCC 10231)的抑菌率为>99%,对乳酸杆菌(CGMCC1.1878)的抑菌率为<50%。
以上各数据结果说明:本实施例制备的壳聚糖衍生物具有低细胞毒性和低溶血率,在对白色念珠菌具有较强抑菌作用的同时,对乳酸杆菌无抑菌率作用。
实施例4
称取9g壳聚糖溶于30mL稀酸溶液,得到壳聚糖水溶液。将精氨酸低聚物与亮氨酸低聚物(摩尔比为10:1)溶于20mL缓冲溶液,活化4小时,得到氨基酸浓度为300mg/mL的氨基酸活化溶液。将氨基酸活化溶液与壳聚糖水溶液混合,反应24小时。反应结束后,产物经纯化,得到所述具有选择抑菌特性的壳聚糖衍生物。
依据GB/T 16886.5-2003《医疗器械生物学评价第五部分体外细胞毒性试验》方法要求,对本实施例制备的壳聚糖衍生物进行了检测。该结果显示,在本实施例制备的壳聚糖衍生物溶液2mg/mL浓度下,人永生化表皮细胞的细胞增值率为91%。
依据YY/T 012701-1993《口腔材料生物试验方法溶血试验》试验方法对本实施例制备的壳聚糖衍生物进行了检测。该结果显示,在本实施例制备的壳聚糖衍生物溶液2mg/mL浓度下,溶血率为<5%。
依据GB15979-2002《一次性使用卫生用品卫生标准》附录C试验方法对本实施例制备的壳聚糖衍生物进行了检测。评判标准:抑菌率≥50~90%,产品有菌作用;抑菌率≥99%,产品有较强抑菌作用。该结果表明:本实施例制备的壳聚糖衍生物溶液(0.1mg/mL)与菌液作用2min的条件下,对白色念珠菌(ATCC 10231)的抑菌率为>99%,对乳酸杆菌(CGMCC1.1878)的抑菌率为<50%。
以上各数据结果说明:本实施例制备的壳聚糖衍生物具有低细胞毒性和低溶血率,在对白色念珠菌具有较强抑菌作用的同时,对乳酸杆菌无抑菌率作用。
对比例1
称取0.35g壳聚糖溶于35mL稀酸溶液,得到壳聚糖水溶液。将亮氨酸溶于15mL缓冲溶液,活化10小时,得到氨基酸浓度为300mg/mL的氨基酸活化溶液。将氨基酸活化溶液与壳聚糖水溶液混合,反应24小时。反应结束后,产物经纯化,得到壳聚糖衍生物。
依据GB15979-2002《一次性使用卫生用品卫生标准》附录C试验方法对本实施例制备的壳聚糖衍生物进行了检测。评判标准:抑菌率≥50~90%,产品有菌作用;抑菌率≥99%,产品有较强抑菌作用。该结果表明:本实施例制备的壳聚糖衍生物溶液(5mg/mL)与菌液作用2min的条件下,对白色念珠菌(ATCC 10231)的抑菌率为<50%。
对比例2
称取0.35g壳聚糖溶于35mL稀酸溶液,得到壳聚糖水溶液。将赖氨酸溶于15mL缓冲溶液,活化10小时,得到氨基酸浓度为300mg/mL的氨基酸活化溶液。将氨基酸活化溶液与壳聚糖水溶液混合,反应24小时。反应结束后,产物经纯化,得到壳聚糖衍生物。
依据GB15979-2002《一次性使用卫生用品卫生标准》附录C试验方法对本实施例制备的壳聚糖衍生物进行了检测。评判标准:抑菌率≥50~90%,产品有菌作用;抑菌率≥99%,产品有较强抑菌作用。该结果表明:本实施例制备的壳聚糖衍生物溶液(0.1mg/mL)与菌液作用2min的条件下,对白色念珠菌(ATCC 10231)和乳酸杆菌(CGMCC1.1878)的抑菌率均为>50%。
对比例3
称取0.35g壳聚糖溶于35mL稀酸溶液,得到壳聚糖水溶液。将精氨酸与亮氨酸(摩尔比为0.01:1)溶于15mL缓冲溶液,活化10小时,得到氨基酸浓度为300mg/mL的氨基酸活化溶液。将氨基酸活化溶液与壳聚糖水溶液混合,反应24小时。反应结束后,产物经纯化,得到壳聚糖衍生物。
依据GB15979-2002《一次性使用卫生用品卫生标准》附录C试验方法对本实施例制备的壳聚糖衍生物进行了检测。评判标准:抑菌率≥50~90%,产品有菌作用;抑菌率≥99%,产品有较强抑菌作用。该结果表明:本实施例制备的壳聚糖衍生物溶液(5mg/mL)与菌液作用2min的条件下,对白色念珠菌(ATCC 10231)的抑菌率为<50%。
对比例4
称取0.35g壳聚糖溶于35mL稀酸溶液,得到壳聚糖水溶液。将精氨酸与亮氨酸(摩尔比为100:1)溶于15mL缓冲溶液,活化10小时,得到氨基酸浓度为300mg/mL的氨基酸活化溶液。将氨基酸活化溶液与壳聚糖水溶液混合,反应24小时。反应结束后,产物经纯化,得到壳聚糖衍生物。
依据GB15979-2002《一次性使用卫生用品卫生标准》附录C试验方法对本实施例制备的壳聚糖衍生物进行了检测。评判标准:抑菌率≥50~90%,产品有菌作用;抑菌率≥99%,产品有较强抑菌作用。该结果表明:本实施例制备的壳聚糖衍生物溶液(0.1mg/mL)与菌液作用2min的条件下,对白色念珠菌(ATCC 10231)和乳酸杆菌(CGMCC1.1878)的抑菌率均为>50%。
显然,本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例,而并非是对本发明的实施方式的限定,对于所属领域的普通技术人员来说,在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动,这里无法对所有的实施方式予以穷举,凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
Claims (6)
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述碱性氨基酸为赖氨酸、精氨酸、组氨酸中一种或多种混合物。
3.根据权利要求1所述的应用,所述碱性氨基酸为赖氨酸和精氨酸中的一种或二者混合物。
4.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述疏水性氨基酸为异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、丙氨酸中一种或多种混合物。
5.根据权利要求1所述的应用,所述疏水性氨基酸为异亮氨酸和亮氨酸中的一种或二者混合物。
6.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述碱性氨基酸低聚物和疏水性氨基酸低聚物的聚合度均不超过100。
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