CN116284497A - 一种壳聚糖季鏻盐的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种壳聚糖季鏻盐的制备方法，包括如下步骤：步骤1，将A物质溶解在有机溶剂中，加入B物质，反应得到小分子季鏻盐，其中，A物质为对氯甲基苯甲酸；B物质为三苯基膦；步骤2，将壳聚糖溶解在醋酸水溶液中；步骤3，将小分子季鏻盐溶解在水或者水/乙醇的混合溶液中，加入1‑乙基‑(3‑二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N‑羟基丁二酰亚胺，至完全溶解得到小分子季鏻盐溶液；步骤4，将小分子季鏻盐溶液加入到壳聚糖溶液中反应；步骤5，反应结束后，浓缩干燥得到壳聚糖季鏻盐。采用本发明的制备方法合成的壳聚糖季鏻盐抗菌剂的水溶性好，抑、抗菌活性高，能抑制生物被膜形成，对成熟的细菌生物被膜具有一定的清除效果。
Description
技术领域
本发明涉及一种壳聚糖季鏻盐的制备方法，属于壳聚糖抗菌剂的制备及应用领域。
背景技术
细菌附着在材料的表面形成生物被膜，由生物被膜造成的各种慢性感染及各种医疗器械退化也在不断增加，且成熟的生物被膜对抗生素和消毒剂的耐受性增加。
壳聚糖已被证明对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌都具有抗菌性能，且可破坏生物被膜的完整性，促进生物被膜的分解，但是壳聚糖较差的溶解性限制了应用。
鉴于此，本案发明人对上述问题进行深入研究，遂有本案产生。
发明内容
本发明的目的在于提供一种壳聚糖季鏻盐的制备方法，该方法操作简便、取材容易，形成的壳聚糖兼具抗菌和抑制生物被膜形成及生物被膜清除功能。
为了达到上述目的，本发明采用这样的技术方案：
一种壳聚糖季鏻盐的制备方法，包括如下步骤：
步骤1，将A物质溶解在有机溶剂中，A物质的质量百分浓度为0.5-20％，加入B物质，在50-140℃，反应4-48h，反应结束后，经过抽滤、洗涤以及干燥得到小分子季鏻盐，
其中，A物质为对氯甲基苯甲酸、对溴甲基苯甲酸、氯乙酸、氯丙酸或溴乙酸；B物质为三苯基膦、三环己基膦或者三甲基膦；
步骤2，将壳聚糖溶解在醋酸水溶液中，得到质量百分浓度为1％-5％的壳聚糖溶液；
步骤3，将小分子季鏻盐溶解在水或者水/乙醇的混合溶液中，加入1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(即EDC)和N-羟基丁二酰亚胺(即NHS)，至完全溶解得到小分子季鏻盐溶液；
步骤4，将小分子季鏻盐溶液加入到壳聚糖溶液中反应，反应温度为20-50℃，反应时间为12-48h；
步骤5，反应结束后，将产物转移至超滤装置中，加水超滤除去未参与反应的小分子季鏻盐，浓缩干燥得到壳聚糖季鏻盐。
作为本发明的优选方式，所述有机溶剂包括乙酸乙酯、四氢呋喃、丙酮、石油醚和乙腈中一种或多种。
作为本发明的优选方式，所述对氯甲基苯甲酸和所述三苯基膦的摩尔比为1:1-2。
作为本发明的优选方式，步骤2中，所述醋酸水溶液的质量百分浓度为1％～5％。
作为本发明的优选方式，步骤3中，添加的小分子季鏻盐的量为壳聚糖摩尔量的1-3倍。
作为本发明的优选方式，步骤3中，小分子季鏻盐的质量百分浓度为1％-10％。
作为本发明的优选方式，步骤3中，所述1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和所述N-羟基丁二酰亚胺的摩尔比为1:1。
作为本发明的优选方式，所述小分子季鏻盐和所述1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的摩尔比为1:1-3。
本发明具有以下有益效果：首先合成端羧基小分子，而后在EDC和NHS的作用下，将小分子接枝到壳聚糖分子链上，超滤浓缩即可得到壳聚糖季鏻盐。采用本发明的制备方法合成的壳聚糖季鏻盐抗菌剂的水溶性好，抑、抗菌活性高，能抑制生物被膜形成，对成熟的细菌生物被膜具有一定的清除效果。
附图说明
图1为实施例1中N-(4-羧基苄基)-N,N-N-三苯基氯化膦的1H NMR。
图2为实施例1中N-(4-羧基苄基)-N,N-N-三苯基氯化膦的13C NMR。
图3为实施例1中N-(4-羧基苄基)-N,N-N-三苯基氯化膦的31P NMR。
图4为实施例1中壳聚糖季鏻盐的1H NMR。
图5为实施例2中N-(4-羧基苄基)-N,N-N-三环己基氯化膦的1H NMR。
图6为实施例2中N-(4-羧基苄基)-N,N-N-三环己基氯化膦的13C NMR。
图7为实施例2中N-(4-羧基苄基)-N,N-N-三环己基氯化膦的31P NMR。
图8为实施例2中壳聚糖季鏻盐的1H NMR。
图9为实施例3中N-(4-羧基苄基)-N,N-N-三甲基氯化膦的1H NMR。
图10为实施例3中N-(4-羧基苄基)-N,N-N-三甲基氯化膦的13C NMR。
图11为实施例3中N-(4-羧基苄基)-N,N-N-三甲基氯化膦的31P NMR。
图12为实施例3中壳聚糖季鏻盐的1H NMR。
具体实施方式
参照图1至图12，为了进一步解释本发明的技术方案，下面通过具体实施例来对本发明进行详细阐述。所述实施例仅用于解释本发明的内容，并非对本发明保护范围的限制。
实施例1
步骤1、称取1.70kg对氯甲基苯甲酸溶解于20kg乙酸乙酯中，并投入到反应釜中，搅拌状态下加入2.6kg三苯基膦，升高温度至85℃，回流搅拌8h，反应过程中有大量白色固体析出，反应结束后抽滤，滤饼用乙酸乙酯洗涤多次，干燥得N-(4-羧基苄基)-N,N-N-三苯基氯化膦。
步骤2、称取1.61kg壳聚糖溶解在100kg体积分数为2％的醋酸水中，得壳聚糖醋酸溶液，此时壳聚糖的质量百分浓度为1.6％；其中，壳聚糖可以直接从市面上购买。
步骤3、称取4.32kg N-(4-羧基苄基)-N,N-N-三苯基氯化膦溶解在50kg体积分数为50％的乙醇水中，加入1.92kg 1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和1.15kg N-羟基丁二酰亚胺，完全溶解后得到小分子季鏻盐溶液，溶液中N-(4-羧基苄基)-N,N-N-三苯基氯化膦的质量百分浓度为7.7％，1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺的摩尔百分比为1:1。
步骤4、将小分子季鏻盐溶液缓慢滴加到反应釜内的壳聚糖醋酸水溶液中，加料完毕后室温反应24h，本实施例中，N-(4-羧基苄基)-N,N-N-三苯基氯化膦与步骤2中加入的壳聚糖的摩尔比可为1:1；
步骤5、室温反应24h结束后，将产物转移至超滤装置中，加水超滤除去未参与反应的N-(4-羧基苄基)-N,N-N-三苯基氯化膦和羧基活化剂(1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺，下同)，浓缩干燥得到壳聚糖季鏻盐。
实施例2
步骤1、称取1.70kg对氯甲基苯甲酸溶解于20kg乙酸乙酯中，并投入到反应釜中，搅拌状态下加入3.1kg三环己基膦，升高温度至85℃，回流搅拌8h，反应过程中有大量白色固体析出，反应结束后抽滤，滤饼用乙酸乙酯洗涤多次，干燥得N-(4-羧基苄基)-N,N-N-三环己基氯化膦。
步骤2、称取1.61kg壳聚糖溶解在50kg体积分数为2％的醋酸水中，得壳聚糖醋酸溶液，此时壳聚糖的质量百分浓度为3.2％。
步骤3、称取4.50kg N-(4-羧基苄基)-N,N-N-三环己基氯化膦溶解在100kg水中，加入2.30kg 1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和2.3kg N-羟基丁二酰亚胺，完全溶解后得到小分子季鏻盐溶液，溶液中N-(4-羧基苄基)-N,N-N-三环己基氯化膦的质量百分浓度为4.5％，1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺的摩尔百分比为1:1。
步骤4、将小分子季鏻盐溶液缓慢滴加到反应釜内的壳聚糖醋酸水溶液中，加料完毕后30℃反应24h，本实施例中，N-(羧甲基)-N,N-二甲基十二烷基氯化膦与步骤2中加入的壳聚糖的摩尔比为1.2:1；
步骤5、室温反应24h结束后，将产物转移至超滤装置中，加水超滤除去未参与反应的N-(4-羧基苄基)-N,N-N-三环己基氯化膦和羧基活化剂，浓缩干燥得到壳聚糖季鏻盐。
实施例3
步骤1、称取1.70kg对氯甲基苯甲酸溶解于20kg乙酸乙酯中，并投入到反应釜中，搅拌状态下加入0.84kg三甲基膦，升高温度至85℃，回流搅拌10h，反应过程中有大量白色固体析出，反应结束后抽滤，滤饼用乙酸乙酯洗涤多次，干燥得N-(4-羧基苄基)-N,N-N-三甲基氯化膦。
步骤2、称取1.61kg溶解在100kg体积分数为2％的醋酸水中，得壳聚糖醋酸溶液，此时壳聚糖的质量百分浓度为1.6％。
步骤3、称取2.46kg N-(4-羧基苄基)-N,N-N-三甲基氯化膦溶解在50kg体积分数为50％的乙醇水中，加入1.92kg 1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和1.15kg N-羟基丁二酰亚胺，完全溶解后得到小分子季鏻盐溶液，溶液中N-(4-羧基苄基)-N,N-N-三甲基氯化膦的质量百分浓度为2.46％，1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺的摩尔百分比为1:1。
步骤4、将小分子季鏻盐溶液缓慢滴加到反应釜内的壳聚糖醋酸水溶液中，加料完毕后室温反应24h，本实施例中，N-(4-羧基苄基)-N,N-N-三甲基氯化膦与步骤2中加入的壳聚糖的摩尔比为1:1。
步骤5、室温反应24h结束后，将产物转移至超滤装置中，加水超滤除去未参与反应的N-(4-羧基苄基)-N,N-N-三甲基氯化膦和羧基活化剂，浓缩干燥得到壳聚糖季鏻盐。
二、抗菌性能测试
采用平板计数法对实施例中壳聚糖季鏻盐的抗菌性能进行检测，通过公
式1计算抑菌率。
表1不同浓度的壳聚糖季鏻盐对金黄色葡萄球菌(S.aureus)的抑菌效果
| 组别 | 2.5mg/mL | 1.0mg/mL | 0.5mg/mL |
| 实施例1 | 100％ | 100％ | 100％ |
| 实施例2 | 100％ | 100％ | 100％ |
| 实施例3 | 100％ | 100％ | 100％ |
表2不同浓度的壳聚糖季鏻盐对大肠杆菌(E.coli)的抑菌效果
| 组别 | 2.5mg/mL | 1.0mg/mL | 0.5mg/mL |
| 实施例1 | 83.76％ | 62.37％ | 58.51％ |
| 实施例2 | 81.67％ | 61.78％ | 50.28％ |
| 实施例3 | 81.13％ | 61.17％ | 41.97％ |
通过比浊法测定实施例中壳聚糖季鏻盐的最低抑菌浓度(MIC)和最低生物被膜抑制浓度(MBC)，结合平板计数法测定实施例中壳聚糖季鏻盐的最低杀菌浓度(MBC)和最低生物被膜杀灭浓度(MBBC)。
在96孔板中加入稀释好的菌液100μL和100μL经倍半稀释后的壳聚糖溶液，再分别做一个只加壳聚糖季鏻盐溶液不加菌液的对照组和只加菌液不加壳聚糖季鏻盐溶液的对照组，每个浓度的壳聚糖季鏻盐做3组平行，于37℃培养箱中培养18h后观察结果，以澄清的孔中所对应的壳聚糖季鏻盐最低浓度作为MIC，取澄清的孔中的菌液和样品溶液的混合液100μL进行涂板，以每皿菌落数小于5个所对应的最低浓度记为MBC。
在96孔板中加入稀释好的菌液置于37℃培养箱中培养36-48h，使菌液在孔板上形成生物被膜，然后弃去浮游菌，用无菌生理盐水或PBS漂洗，干燥固定，向96孔板中加入稀释好的壳聚糖季鏻盐样品溶液100μL和100μL培养基，以无菌水作为对照组，置于37℃培养箱中培养18h后观察结果，以澄清的孔中所对应的壳聚糖季鏻盐最低浓度作为MBIC，取澄清的孔中的菌液和样品溶液的混合液100μL进行涂板，以每皿菌落数小于5个所对应的最低壳聚糖季鏻盐浓度记为MBBC。
表3金黄色葡萄球菌BF形成前后耐药性的变化
表4大肠杆菌BF形成前后耐药性的变化
结晶紫染色的方法可以快速简便的测量药物对生物被膜的干预作用。通过不同药物作用下OD值的大小，可以反应壳聚糖季鏻盐对生物被膜形成的抑制强弱。
在96孔板中加入稀释好的菌液100μL和100μL稀释至一定浓度的壳聚糖季鏻盐溶液(4MIC、2MIC、MIC)，以水为对照组，壳聚糖季鏻盐的终浓度为2MIC、MIC和1/2MIC。每个浓度的药物做3组平行，于37℃恒温箱中培养36-48h，然后弃去浮游菌及壳聚糖季鏻盐溶液，用无菌生理盐水漂洗，干燥固定，加入0.1％的结晶紫溶液染色15min，弃去结晶紫溶液并用无菌生理盐水漂洗3次，无菌风干燥。加入95％的乙醇溶液，5min后用酶标仪在595nm处测定吸光度，通过式2计算生物被膜形成抑制率。
表5壳聚糖季鏻盐对金黄色葡萄球菌生物被膜形成抑制效果
| 组别 | 1/2MIC | MIC | 2MIC |
| 实施例1 | 62.22 | 86.16 | 94.25 |
| 实施例2 | 60.54 | 80.09 | 93.13 |
| 实施例3 | 53.84 | 61.47 | 84.79 |
表6壳聚糖季鏻盐对大肠杆菌生物被膜形成抑制效果
| 组别 | 1/2MIC | MIC | 2MIC |
| 实施例1 | 56.62 | 64.24 | 78.33 |
| 实施例2 | 46.71 | 69.19 | 76.51 |
| 实施例3 | 33.95 | 50.06 | 62.42 |
在96孔板中加入稀释好的菌液200μL，然后置于37℃恒温培养箱中培养36-48h，弃去菌液，无菌生理盐水漂洗，干燥固定，然后加入壳聚糖季鏻盐溶液200μL，无菌水作为对照组，37℃培养箱中恒温1h，弃去壳聚糖溶液，无菌生理盐水漂洗，结晶紫染色，干燥，加入95％的乙醇溶液，5min后用酶标仪测定595nm处的吸光度，通过公式3计算生物被膜的清除率。
表7壳聚糖季鏻盐对金黄色葡萄球菌生物被膜清除效果
| 组别 | 2.5mg/mL | 5.0mg/mL |
| 实施例1 | 69.95 | 91.45 |
| 实施例2 | 62.70 | 84.03 |
| 实施例3 | 60.40 | 82.87 |
表8壳聚糖季鏻盐对大肠杆菌生物被膜的清除效果
| 组别 | 2.5mg/mL | 5.0mg/mL |
| 实施例1 | 48.85 | 68.54 |
| 实施例2 | 47.16 | 68.32 |
| 实施例3 | 46.40 | 63.01 |
上述结果表明，通过该方法制备的壳聚糖季鏻盐对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌有抑制效果。还能抑制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的生物被膜形成，对成熟的生物被膜有一定的清除作用。
上述实施例和附图并非限定本发明的方法，任何所属技术领域的普通技术人员对其所做的适当变化或修饰，皆应视为不脱离本发明的专利范畴。
本发明的产品形式并非限于本案实施例，任何人对其进行类似思路的适当变化或修饰，皆应视为不脱离本发明的专利范畴。
Claims (8)
1.一种壳聚糖季鏻盐的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1，将A物质溶解在有机溶剂中，A物质的质量百分浓度为0.5-20％，加入B物质，在50-140℃，反应4-48h，反应结束后，经过抽滤、洗涤以及干燥得到小分子季鏻盐，
其中，A物质为对氯甲基苯甲酸、对溴甲基苯甲酸、氯乙酸、氯丙酸或溴乙酸；B物质为三苯基膦、三环己基膦或者三甲基膦；
步骤2，将壳聚糖溶解在醋酸水溶液中，得到质量百分浓度为1％-5％的壳聚糖溶液；
步骤3，将小分子季鏻盐溶解在水或者水/乙醇的混合溶液中，加入1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺，至完全溶解得到小分子季鏻盐溶液；
步骤4，将小分子季鏻盐溶液加入到壳聚糖溶液中反应，反应温度为20-50℃，反应时间为12-48h；
步骤5，反应结束后，将产物转移至超滤装置中，加水超滤除去未参与反应的小分子季鏻盐，浓缩干燥得到壳聚糖季鏻盐。
2.如权利要求1所述的一种壳聚糖季鏻盐的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂包括乙酸乙酯、四氢呋喃、丙酮、石油醚和乙腈中一种或多种。
3.如权利要求2所述的一种壳聚糖季鏻盐的制备方法，其特征在于，所述对氯甲基苯甲酸和所述三苯基膦的摩尔比为1:1-2。
4.如权利要求3所述的一种壳聚糖季鏻盐的制备方法，其特征在于，步骤2中，所述醋酸水溶液的质量百分浓度为1％～5％。
5.如权利要求4所述的一种壳聚糖季鏻盐的制备方法，其特征在于，步骤3中，添加的小分子季鏻盐的量为壳聚糖摩尔量的1-3倍。
6.如权利要求5所述的一种壳聚糖季鏻盐的制备方法，其特征在于，步骤3中，小分子季鏻盐的质量百分浓度为1％-10％。
7.如权利要求6所述的一种壳聚糖季鏻盐的制备方法，其特征在于，步骤3中，所述1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和所述N-羟基丁二酰亚胺的摩尔比为1:1。
8.如权利要求7所述的一种壳聚糖季鏻盐的制备方法，其特征在于，所述小分子季鏻盐和所述1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的摩尔比为1:1-3。
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2023
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