CN114478834B - 一种胍基透明质酸抗菌聚合物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种胍基透明质酸抗菌聚合物及其制备方法和应用，属于生物医药技术领域。本发明以透明质酸为主链，利用透明质酸上的羧基与烷基二胺发生酰胺化反应，得到氨基烷基化透明质酸；再与胍基供体经胍基化反应，得到胍基化透明质酸。该改性透明质酸材料，兼有透明质酸与胍基化合物的特性，具有良好的生物相容性、水溶性、保湿性能，且良好的抗菌性能，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等表现出优异的抗菌性能。该类抗菌剂的制备反应操作简单、条件易控制，成本较低，原料易得，在制备抗菌消毒水、滴眼液、抗菌凝胶和抗菌软膏中的应用前景广阔。

Description

一种胍基透明质酸抗菌聚合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种胍基透明质酸抗菌聚合物及其制备方法和应用，属于生物医药技术
领域。
背景技术
迄今为止，胍基是自然界发现的正电性最强的生物活性有机碱，其在生理pH介质下能够质子化，在中性、酸性和碱性条件下均能形成带正电的基团。胍类化合物具有强碱性、强稳定性、较好的生物活性，且易于形成氢键，研究表明胍类化合物具有跨膜作用，对细菌细胞膜具有很强的破坏作用。相对于含卤胺基和季铵(膦)盐基抗菌剂与细菌细胞膜形成的单一氢键，胍类抗菌剂能通过静电吸附作用更高效地与细菌细胞膜上带负电的羧酸盐、膦酸盐和硫酸盐等形成更牢固的双氢键，使其具有比卤胺基和季铵(膦)盐基抗菌剂更高效的抗菌性能。此外，由于真核细胞一般细胞外膜不带电，呈电中性，故胍类抗菌剂对真核细胞无明显细胞毒性。现有的胍基抗菌剂，如洗必泰类、烷基胍类等小分子抗菌剂，存在有效剂量过大，生物相容性过低，易发生过敏反应等缺点；或者如其他技术方案中提到的胍基接枝改性聚偏氟乙烯(CN 110964277 B)、胍基修饰寡聚苯乙炔(CN 111848457 A)、胍基壳聚糖季铵盐(CN 111057164 A)等大分子抗菌剂，则存在水溶性差、生物相容性低等缺点，限制了其应用范围。
在天然高分子中，透明质酸，因其具有良好的生物相容性、可降解性、保湿性能而引起了众多学者研究兴趣。透明质酸，又名玻尿酸(HA)，是由N-乙酰氨基葡糖和D-葡糖醛酸双糖单位重复连接而成的天然高分子黏多糖，广泛地分布于人体与动物的软结缔组织细胞外基质中，有着维持细胞外空间、调节渗透压、润滑等重要生理功能，在医美、保健、生物医药等领域有着十分重要的应用价值。透明质酸结构中含有羟基、羧基等化学活性位点，可进行多种化学修饰使其具有特定的功能，已报道了透明质酸衍生物有乙酰化透明质酸、季胺化透明质酸、羧甲基化透明质酸、硅烷化透明质酸等。但透明质酸本身无抗菌性能，限制了其使用。
因此，找到一种更加适宜的胍类抗菌聚合物，既能保证其高效长久抗菌性，又能保证其生物相容性和水溶性，已成为该领域研究的一个焦点。
发明内容
为了解决现有胍基类抗菌剂有效剂量过大、水溶性差、细胞毒性较大和生物相容性不足等问题，本发明提供胍基透明质酸抗菌聚合物，以天然生物高分子透明质酸为骨架，功能化修饰不同连接链的单胍或双胍，其制备工艺简单，具有产业化前景。胍基透明质酸抗菌剂具有良好水溶性、生物相容性，对常见致病菌(如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等)表现出极好的抗菌性能，有效拓展了胍基高分子材料的应用领域，可作为抗菌剂应用于抗菌消毒水、滴眼液、抗菌凝胶和抗菌软膏等，尤其是，作为医用辅料，用于烧伤、刀伤等伤口处理与皮肤修复，具有抗菌抗感染和促进细胞组织与血管生长功能。
本发明的第一目的在于提供一种胍基透明质酸抗菌聚合物的制备方法，所述的胍基透明质酸抗菌聚合物以透明质酸为骨架结构，经酰胺化反应、胍基化反应，得到单胍或双胍功能化修饰的透明质酸抗菌剂，其结构式为：
作为本发明的一种具体实施方式，所述方法包括如下步骤：
(1)在偶联缩合剂的作用下，透明质酸与烷基二胺发生酰胺化反应，经分离纯化，得到氨基烷基化透明质酸；
(2)在酸催化条件下，氨基烷基化透明质酸与胍基供体发生缩合反应，经分离纯化，干燥得到胍基透明质酸抗菌剂。
作为本发明的一种具体实施方式，步骤(1)中，透明质酸上的羧基与烷基二胺的摩尔比为1:(1～2)。
作为本发明的一种具体实施方式，步骤(1)中，透明质酸上的羧基与烷基二胺的摩尔比为1:1.2。
作为本发明的一种具体实施方式，步骤(1)的酰胺化反应的反应温度为20～80℃。进一步优选为25～60℃。
作为本发明的一种具体实施方式，步骤(1)的酰胺化反应的反应温度为25℃，反应时间为10～25h。进一步优选为12h。
作为本发明的一种具体实施方式，所述透明质酸的分子量为＜10k Da～1000kDa。
作为本发明的一种具体实施方式，所述步骤(1)酰胺化反应中，烷基二胺为乙二胺、丙二胺、丁二胺、己二胺、1,8-二氨基-3,6-二氧杂辛烷、1,11-二氨基-3,6,9-三氧杂癸烷和聚氧乙烯二胺(M.W 1000、2000或4000Da)中的任一种。
作为本发明的一种具体实施方式，所述步骤(1)中的偶联缩合剂为二甲氨基丙乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)/N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、二环己基碳二亚胺(DCC)/N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)中的一种，透明质酸的羧基与偶联缩合剂的摩尔比为1:1.2。
作为本发明的一种具体实施方式，所述步骤(1)的反应溶剂为甲酰胺、DMSO、DMF、H2O中的一种，反应溶剂与透明质酸的质量比为(5-10)：1；反应结束后，经醇沉或超滤、冷冻或喷雾干燥，得到白色的氨基烷基化透明质酸粉末。
作为本发明的一种具体实施方式，所述步骤(2)的缩合反应中，胍基供体为单氰胺或双氰胺，胍基供体的质量为透明质酸的质量的15-30％。酸催化剂为稀盐酸、冰乙酸溶液和稀硫酸中的任一种，酸催化剂的质量为透明质酸的质量的5-10％，酸催化剂的浓度范围为0.1～1M；反应温度为25～40℃，反应时间为48-72h。
作为本发明的一种具体实施方式，所述步骤(2)的缩合反应中，反应溶剂为甲酰胺、DMSO、DMF、H2O中的一种，反应溶剂的质量为透明质酸的质量的5-10倍；反应结束后，经沉降或超滤、冷冻或喷雾干燥，得到白色胍基透明质酸抗菌剂粉末。
本发明的第二目的在于提供前述的方法制得的胍基透明质酸抗菌剂。
本发明的第三目的在于提供前述方法或前述的胍基透明质酸抗菌剂在制备抗菌水溶液、抗菌凝胶和抗菌软膏中的应用。
本发明相较于现有技术的优势和有益效果在于：
(1)本发明的设计思路如下：为在透明质酸链上引入胍基，需要在其侧链修饰伯氨基存在，而透明质酸侧链上的活性基团为羧基可供修饰，所以伯氨基可通过烷基二胺与羧基发生酰胺缩合反应来引入透明质酸链上。
(2)本发明提供了一种胍基透明质酸抗菌剂的制备方法，原料易得，工艺路线简单、易操作，具有良好的产业化前景；可优化调整其结构(或分子量)来适应不同应用的领域，本发明提供了一个全新的探索性研究思路，对抗菌剂的开发具有重要的研究意义和市场价值。
(3)相比于现有的胍基抗菌高分子(胍基接枝改性聚偏氟乙烯、胍基修饰寡聚苯乙炔、胍基壳聚糖季铵盐等)，本发明提供了一种胍基透明质酸抗菌剂，其具有更好的水溶性和生物相容性，适应范围广泛，对常见致病菌(如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等)表现出极好的抗菌性能和抗耐药性，可作为抗菌剂应用于抗菌消毒水、滴眼液、抗菌凝胶和抗菌软膏等，应用于医疗器械消毒、口腔护理、个人卫生和环境清洁等领域；尤其是，作为医用辅料，用于烧伤、刀伤等伤口处理与皮肤修复，具有抗菌抗感染和促进细胞组织与血管生长多功能协调作用。
(4)本发明的胍基透明质酸抗菌聚合物是首次通过化学键的方式将胍基引入透明质酸结构中，聚合物结构更加稳定且具备可设计性和可调控性，抗菌性能和生物相容性也更为优异。而如CN109266457A或CN110664740A都是采用已有的胍基化合物与透明质酸物理共混的方式制备相应产品，其方法属于物理混合，容易造成混合不均匀现象，且未改变所用胍基化合物的理化性质，对其生物利用度等重要指标未得到明显提升。
附图说明
图1为本发明的胍基透明质酸抗菌剂的合成路线简图。
图2为HA和不同接枝率的乙胺透明质酸(HA-E-NH2)的核磁共振氢谱。其中，由HA-E-NH2-a到HA-E-NH2-d，接枝率逐渐升高。在δ＝2.8～3.2ppm处是乙二胺侧链上亚甲基氢的共振峰，说明了反应成功引入了烷基胺；δ＝1.8～2.2ppm处是透明质酸主链上乙酰的甲基氢的共振峰，通过两组共振峰面积的对比，可以计算出乙二胺透明质酸的接枝率(即与透明质酸的羧基实际反应的数量与透明质酸结构中理论上的羧酸基团数量之比)；从图中可知，从HA-E-NH2-a到HA-E-NH2-d，接枝率逐渐升高，即表明了可通过调节反应条件，如反应时间和烷基二胺与透明质酸的摩尔比、酰胺化反应时间来调节烷基二胺透明质酸的接枝率。
图3.A为当反应时间为12h时，EDA与HA羧基的摩尔比的变化对HA-E-NH2的DS的影响；图3.B为当乙二胺(EDA)与HA羧基的摩尔比为1时，反应时间的变化对HA-E-NH2的DS的影响。
图4为实施例3的透明质酸HAM和透明质酸-丁二胺(HAM-B-NH2)的核磁共振氢谱图。
图5为透明质酸HA、透明质酸-乙二胺-单胍(HAL-ESG)、透明质酸-乙二胺-双胍(HAH-EBG)、透明质酸-丁二胺-单胍(HAM-BSG)和透明质酸-丁二胺-双胍(HAL-BBG)的核磁共振氢谱。
图6为透明质酸-乙二胺-单胍(HAL-ESG)、透明质酸-乙二胺-双胍(HAH-EBG)、透明质酸-丁二胺-单胍(HAM-BSG)和透明质酸-丁二胺-双胍(HAL-BBG)的核磁共振碳谱。
图7为透明质酸-乙二胺-单胍(HAL-ESG)、透明质酸-乙二胺-双胍(HAH-EBG)、基透明质酸-丁二胺-单胍(HAM-BSG)和透明质酸-丁二胺-双胍(HAL-BBG)对于大肠杆菌(左)和金黄色葡萄球菌(右)的抗菌效果展示图。
图8为透明质酸-乙二胺-单胍(HAL-ESG)、透明质酸-乙二胺-双胍(HAH-EBG)、透明质酸-丁二胺-单胍(HAM-BSG)和透明质酸-丁二胺-双胍(HAL-BBG)对小鼠成纤维细胞L-929的细胞毒性实验图。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例，实施例不应视作为本发明保护范围的限定。
本发明的胍基透明质酸抗菌剂的合成路线简图如图1所示。想在透明质酸链上引入胍基，就需要其侧链有伯氨基存在，而透明质酸侧链上的活性基团只有羧基可供修饰，所以伯氨基可通过烷基二胺与羧基发生酰胺缩合反应来引入透明质酸链上。
实施例1：
一种透明质酸-乙二胺-单胍(HAL-ESG)的制备方法
步骤S1：将透明质酸(HAL，10K Da，羧基的量为3mmol)完全溶解于10mL超纯水中，得到HAL水溶液；再将二甲氨基丙乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl，3.6mmol)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS，3.6mmol)分批加入HAL水溶液中，常温搅拌1h；然后缓慢滴入乙二胺(3mmol)，在25℃下搅拌反应24h；反应结束后，将反应液在无水乙醇中沉降，沉淀用无水乙醇洗涤2次，经过滤、洗涤、冷冻干燥后，得到透明质酸-乙二胺(HAL-E-NH2)，接枝率(DS)为51％。
步骤S2：将透明质酸-乙二胺(HAL-E-NH2，氨基的量1mmol)完全溶解于10mL去离子纯水中，向其中滴加0.5mL 0.1M HCl溶液，搅拌均匀；然后缓慢滴入单氰胺(2mmol)，在40℃下搅拌反应72h；反应结束后，使反应液在无水乙醇中沉降，沉淀用无水乙醇洗涤2次，经过滤、洗涤、冷冻干燥后，得到透明质酸-乙二胺-单胍(HAL-ESG)，单胍接枝率为51％。
实施例2：
一种透明质酸-乙二胺-双胍(HAH-EBG)的制备方法
步骤S1：将透明质酸(HAH，100k Da，羧基的量为20mmol)完全溶解于300mL甲酰胺中，得到HAH溶液；将二环己基碳二亚胺(DCC，24mmol)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS，24mmol)分批加入HAH溶液中，常温搅拌3h；然后缓慢滴入乙二胺(24mmol)，在40℃下搅拌反应12h，反应结束后，将反应液在丙酮中沉降，过滤得到粗产物，然后，用水复溶、乙醇沉降，反复操作2次，经过滤、洗涤、冷冻干燥后，得到透明质酸-乙二胺(HAH-B-NH2)，DS为51％。
步骤S2：将透明质酸-乙二胺(HAH-B-NH2，氨基的量10mmol)溶解于50mL甲酰胺中；然后，滴加10mL 1M冰乙酸溶液，搅拌均匀；再者，缓慢滴入双氰胺(20mmol)，在60℃下搅拌反应48h；反应结束后，用丙酮沉降，过滤、洗涤，得到粗产物；最后，粗产物用水复溶乙醇沉降，反复操作2次，经过滤、洗涤、冷冻干燥后，得到透明质酸-乙二胺-双胍(HAH-EBG)，双胍接枝率为51％。
实施例3：
一种透明质酸-丁二胺-单胍(HAM-BSG)的制备方法
步骤S1：先将透明质酸(HAM，200k Da，羧基的量50mmol)溶解于1000mL DMSO中，再向溶液分批加入二环己基碳二亚胺(DCC，60mmol)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS，60mmol)，室温搅拌4h；然后，缓慢滴入丁二胺(60mmol)，在60℃下搅拌反应12h；反应结束后，采用无水乙醇沉降，过滤、洗涤得到粗产物；最后，用水复溶，经超滤、冻干，得到透明质酸-丁二胺(HAM-B-NH2)，DS为49％。
步骤S2：将HAM-B-NH2(氨基的量20mmol)完全溶解于200mL DMSO中，向其中滴加0.5M冰乙酸溶液(50mL)，搅拌均匀；然后缓慢滴入单氰胺(40mmol)，在80℃下搅拌反应36h，反应结束后，将反应液在丙酮中沉降，沉淀用无水乙醇洗涤2次；固体粗产物用去离子水复溶，然后超滤，将超滤后的溶液进行冷冻干燥，得到透明质酸-丁二胺-单胍(HAM-BSG)，单胍接枝率为49％。
图4为实施例3的透明质酸HAM和透明质酸-丁二胺(HAM-B-NH2)的核磁共振氢谱图。在δ＝2.8～3.2ppm和δ＝1.2～1.6ppm处为丁二胺的烷基氢的特征峰，说明丁二胺成功接枝到透明质酸上，其接枝率为49％。
实施例4：
一种透明质酸-丁二胺-双胍(HAL-BBG)的制备方法
步骤S1：将透明质酸(HAL，500k Da，羧基的量100mmol)完全溶解于500mL甲酰胺中，向HAL溶液分批加入O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU，120mmol)，常温搅拌2h；然后缓慢滴入丁二胺(120mmol)，在25℃下搅拌反应12h；反应结束后，将反应液在无水乙醇中沉降，沉淀用无水乙醇洗涤2次；粗产物用去离子水复溶，超滤、冷冻干燥，得到透明质酸-丁胺(HAL-B-NH2)，DS为51％。
步骤S2：将HAL-B-NH2(氨基的量40mmol)完全溶解于400mL甲酰胺中，向其中滴加0.5M冰乙酸溶液(60mL)，搅拌均匀；然后缓慢滴入双氰胺(80mmol)，于60℃下搅拌反应48h；反应结束后，将反应液用大量丙酮沉降，过滤、洗涤，得到粗产物；粗产物用去离子水复溶，超滤、喷雾干燥，得到透明质酸-丁二胺-双胍(HAL-BBG)，双胍接枝率为51％。
图5为透明质酸HA、透明质酸-乙二胺-单胍(HAL-ESG)、透明质酸-乙二胺-双胍(HAH-EBG)、透明质酸-丁二胺-单胍(HAM-BSG)和透明质酸-丁二胺-双胍(HAL-BBG)的核磁共振氢谱。在δ＝2.8～3.2ppm处的烷基氢的特征峰消失，而δ＝1.2～1.6ppm处烷基氢的特征峰不变，说明胍基的成功引入，该侧链上的伯氨基被完全单胍化或双胍化了，导致烷基侧链上靠近胍基的烷基氢化学位移变大，原特征峰消失。
图6为透明质酸-乙二胺-单胍(HAL-ESG)、透明质酸-乙二胺-双胍(HAH-EBG)、透明质酸-丁二胺-单胍(HAM-BSG)和透明质酸-丁二胺-双胍(HAL-BBG)的核磁共振碳谱。在δ＝156～162ppm出现单峰或双峰，进一步证明了胍基成功地接枝到透明质酸上。
实施例5：
一种透明质酸-乙二胺-单胍(HAL-ESG)的制备方法，参照实施例1，反应时间定为12h，重点在于调整烷基二胺(实施例1中为乙二胺)的用量，使得乙二胺与透明质酸羧基的摩尔比为0.4～2.0，具体地：
步骤S1：将透明质酸(HAL，10K Da，羧基的量3mmol)完全溶解于10mL超纯水中，得到HAL水溶液；再将二甲氨基丙乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl，3.6mmol)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS，3.6mmol)分批加入HAL水溶液中，常温搅拌1h；然后缓慢滴入乙二胺(1.2～6mmol)，在25℃下搅拌反应12h；反应结束后，将反应液在无水乙醇中沉降，沉淀用无水乙醇洗涤2次，经过滤、洗涤、冷冻干燥后，得到透明质酸-乙二胺(HAL-E-NH2)，记作HA-E-NH2，其核磁共振氢谱图如图2所示，接枝率变化图如图3A所示，计算得到DS为20％～55％。
步骤S2：将透明质酸-乙二胺(HAL-E-NH2，氨基的量1mmol)完全溶解于10mL去离子纯水中，向其中滴加0.5mL 0.1M HCl溶液，搅拌均匀；然后缓慢滴入单氰胺(2mmol)，在40℃下搅拌反应72h；反应结束后，使反应液在无水乙醇中沉降，沉淀用无水乙醇洗涤2次，经过滤、洗涤、冷冻干燥后，得到透明质酸-乙二胺-单胍(HAL-ESG)。
当反应时间为12h时，EDA与HA羧基的摩尔比的变化对HA-E-NH2的DS的影响如图3.A所示。随着EDA与HA羧基的摩尔比的增加，HA-E-NH2的DS也随之迅速增加，当EDA与HA羧基的摩尔比达到1.2时，DS达到最大值，后续随着摩尔比的继续增加，DS反而略有降低。优选地，EDA与HA羧基的摩尔比应为1.0～2.0。
实施例6：
一种透明质酸-乙二胺-单胍(HAL-ESG)的制备方法，一种透明质酸-乙二胺-单胍(HAL-ESG)的制备方法，参照实施例1，区别仅在于，调整反应时间为4h～24h，具体地：
步骤S1：将低分子量透明质酸(HAL，10K Da，羧基的量为3mmol)完全溶解于10mL超纯水中，得到HAL水溶液；再将二甲氨基丙乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl，3.6mmol)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS，3.6mmol)分批加入HAL水溶液中，常温搅拌1h；然后缓慢滴入乙二胺(3mmol)，在25℃下搅拌反应4h～24h；反应结束后，将反应液在无水乙醇中沉降，沉淀用无水乙醇洗涤2次，经过滤、洗涤、冷冻干燥后，得到透明质酸-乙二胺(HAL-E-NH2)，接枝率变化图如图3B所示，计算得到DS为10％～50％。
步骤S2：将透明质酸-乙二胺(HAL-E-NH2，1mmol)完全溶解于10mL去离子纯水中，向其中滴加0.5mL 0.1M HCl溶液，搅拌均匀；然后缓慢滴入单氰胺(2mmol)，在40℃下搅拌反应72h；反应结束后，使反应液在无水乙醇中沉降，沉淀用无水乙醇洗涤2次，经过滤、洗涤、冷冻干燥后，得到透明质酸-乙二胺-单胍(HAL-ESG)。
当乙二胺(EDA)与HA的摩尔比为1时，反应时间的变化对HA-E-NH2的DS的影响如图3.B所示，随着反应时间的增加，HA-E-NH2的DS也随之迅速增加，当反应时间达到12h时，DS达到最大值，后续随着反应时间的继续增加，DS反而略有降低。优选地，酰胺化反应时间为12～24h，此时DS在50％以上。
实施例7：
胍基透明质酸抗菌聚合物的水溶性实验
胍基透明质酸抗菌聚合物的水溶解性测试方法，按照下列步骤进行：
向1000mg待测样品中加入1mL去离子水，在25℃下充分溶解，若存在不溶性组分，则不溶部分悬浮在溶液中。将溶液放置在离心机中离心(速率5000r/min)5min后，将残余固体于丙酮中洗涤3次，然后在真空干燥箱中干燥24h，待固体彻底干燥后称重，记为W1。
按下式计算溶解度：
Solubility(mg/mL)＝(Wo-W1)/V
其中，Wo为固体溶解前的质量(mg)；
W1为未溶解固体的质量(mg)；
V为溶解前溶剂体积
水溶性实验结果表明，本发明的胍基透明质酸抗菌聚合物的水溶性能极其优异，达到了800mg/mL以上；而现有的胍类抗菌剂，例如洗必泰类胍类抗菌剂，如醋酸氯己定，其在水中的溶解度仅有0.18mg/mL，而如其他技术方案中提到的胍基接枝改性聚偏氟乙烯(CN110964277B)、胍基修饰寡聚苯乙炔(CN 111848457 A)、胍基壳聚糖季铵盐(CN111057164A)等大分子抗菌剂，则在纯水中几乎不溶，甚至只能溶于有机溶剂，在应用中局限比较大。而本发明的胍基透明质酸抗菌聚合物有效解决了胍基类抗菌剂水溶性差的难题，拓展了胍基类抗菌剂的应用前景。且测试结果证明基于本发明的方法，透明质酸分子量对胍基透明质酸抗菌聚合物的水中溶解度影响不明显。
实施例8：
胍基透明质酸抗菌聚合物的体外抗菌实验
胍基透明质酸抗菌聚合物(HAL-ESG、HAH-EBG、HAM-BSG和HAL-BBG)的体外抗菌实验，按照下列步骤进行：
在无菌超净台中，分别称取一定量的胍基透明质酸抗菌聚合物，配成10mg/mL的水溶液。取一块96孔板，在每一个孔板内注入100μL的LB液体培养基。在同一块96孔板内，取两行分别作为无菌对照和无药对照，在其余行的第一列内注入100μL所配制的抗菌聚合物溶液，每种抗菌聚合物溶液注入两行作为两组平行试验，在混合均匀后取100μL注入其右侧孔内，重复此步骤直至注满12列孔后，从最后一列抽取100μL溶液丢弃。使用LB液体培养基将之前培养的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌稀释至1×106CFU/mL，在同一块板内，向注有抗菌聚合物溶液的行和无药对照行的每一个孔洞内注入100μL的细菌菌液。之后放入生化培养箱内，在37℃下培养24h，取出观察各个孔洞的浑浊程度变化。
澄清孔洞说明没有细菌菌落生长，其对应浓度的抗菌聚合物对该细菌具有杀灭作用，浑浊的试管则表示在该抗菌聚合物浓度下细菌没有被完全杀灭，细菌仍然在生长繁殖。肉眼观察，澄清透明孔中抗菌聚合物最低浓度无细菌生长的孔，即为受试菌的MIC。
从图7可知，HAL-ESG对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的MIC值分别为156μg/mL、156μg/mL；HAM-BSG对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的MIC值分别为130μg/mL、104μg/mL；HAH-EBG对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的MIC值分别为78μg/mL、65μg/mL；HAL-BBG对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的MIC值分别为39μg/mL、33μg/mL，都拥有极其优异的抗菌效果。相比市面上应用的胍类抗菌剂，如洗必泰类，其对大肠肝菌和金黄色葡萄球菌的MIC均大于1mg/mL；或者如其他技术方案中提到的胍基接枝改性聚偏氟乙烯(CN 110964277 B)、胍基修饰寡聚苯乙炔(CN 111848457 A)、胍基壳聚糖季铵盐(CN 111057164 A)等大分子抗菌剂，它们其对大肠肝菌和金黄色葡萄球菌的MIC均大于500μg/mL；本发明得到的胍基透明质酸类抗菌聚合物抗菌性能更为优异。
实施例9：
胍基透明质酸抗菌聚合物的细胞毒性实验
胍基透明质酸抗菌聚合物(HAL-ESG、HAH-EBG、HAM-BSG和HAL-BBG)的细胞毒性实验，具体实验步骤如下：
消化L-929小鼠成纤维细胞，将细胞悬液调整至适宜浓度50-100万/mL。向96孔板每孔加入100μL的细胞悬液，每孔5000个细胞。96孔板边缘一圈孔用培养液填充。在37℃、5％CO2的培养箱中过夜培养。分别加入10μL浓度为1MIC的胍基透明质酸抗菌聚合物(HAL-ESG、HAH-EBG、HAM-BSG和HAL-BBG)溶液，每个浓度梯度做5个平行样。同时设置调零孔(含培养基和CCK-8)。将96孔板置于37℃、5％CO2的培养箱培养。在24h、48h、72h后加入10μL CCK-8试剂，在培养箱中反应3h后，用酶标仪以450nm的波长测定吸光值。
由图8中可知，经不同种类的胍基透明质酸抗菌剂(HAL-ESG、HAH-EBG、HAM-BSG和HAL-BBG)处理过的细胞存活率均较高，在72h内都超出了对照组，说明本发明的胍基透明质酸类抗菌聚合物能够促进细胞增殖，生物相容性优异，有效弥补了当前胍基类抗菌剂在应用中出现生物相容性差，易过敏的不足。

Claims (4)

1.一种胍基透明质酸抗菌聚合物，其特征在于，所述的胍基透明质酸抗菌聚合物以透明质酸为骨架结构，经酰胺化反应、胍基化反应，得到双胍功能化修饰的透明质酸抗菌剂，其结构式为：
R1＝(CH2)p,p＝4,R2＝[NHC(N＝H)]xNH2 x＝2；
所述胍基透明质酸抗菌聚合物的制备包括如下步骤：
(1)在偶联缩合剂的作用下，透明质酸与烷基二胺发生酰胺化反应，经分离纯化，得到氨基烷基化透明质酸；所述透明质酸上的羧基与烷基二胺的摩尔比为1:(1～2)；所述烷基二胺为丁二胺；所述酰胺化反应的反应温度为25℃，反应时间为10～25h；
(2)在酸催化条件下，氨基烷基化透明质酸与胍基供体发生缩合反应，经分离纯化，干燥得到胍基透明质酸抗菌聚合物。
2.根据权利要求1所述的胍基透明质酸抗菌聚合物，其特征在于，所述步骤(1)中的偶联缩合剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐/N-羟基琥珀酰亚胺、二环己基碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺、O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐中的一种，透明质酸的羧基与偶联缩合剂的摩尔比为1:1.2。
3.根据权利要求1所述的胍基透明质酸抗菌聚合物，其特征在于，所述步骤(2)的缩合反应中，胍基供体为双氰胺，胍基供体的质量为透明质酸的质量的15-30％，酸催化剂为稀盐酸、冰乙酸溶液和稀硫酸中的任一种，酸催化剂的质量为透明质酸质量的5-10％，酸催化剂的浓度范围为0.1～1M；反应温度为25～40℃，反应时间为48-72h。
4.权利要求1～3任一所述的胍基透明质酸抗菌聚合物在制备抗菌水溶液、抗菌凝胶和抗菌软膏中的应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR20240035076A (ko) * 2022-09-08 2024-03-15 서울대학교산학협력단 항균성 고분자 및 이를 포함하는 항균성 고분자 필름
CN116637173B (zh) * 2023-05-11 2024-03-22 南京医科大学附属口腔医院 一种多胍抗菌肽口腔微针

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017141204A2 (en) * 2016-02-17 2017-08-24 Chindera Kantaraja Biguanide grafted / modified biopolymers as drug delivery vehicles
CN110964277A (zh) * 2019-11-30 2020-04-07 华东理工大学 一种胍盐抗菌剂接枝改性聚偏氟乙烯及其制备方法
CN111057164A (zh) * 2019-12-30 2020-04-24 华侨大学 一种胍基壳聚糖季铵盐抗菌剂的制备方法
CN111848457A (zh) * 2020-08-13 2020-10-30 中国工程物理研究院核物理与化学研究所 一种胍基修饰寡聚苯乙炔及其制备方法和抗菌应用

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3632477B1 (en) * 2017-05-23 2024-03-20 Huizhou Foryou Medical Devices Co., Ltd. Antibacterial wound dressing and preparation method and application thereof

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017141204A2 (en) * 2016-02-17 2017-08-24 Chindera Kantaraja Biguanide grafted / modified biopolymers as drug delivery vehicles
CN110964277A (zh) * 2019-11-30 2020-04-07 华东理工大学 一种胍盐抗菌剂接枝改性聚偏氟乙烯及其制备方法
CN111057164A (zh) * 2019-12-30 2020-04-24 华侨大学 一种胍基壳聚糖季铵盐抗菌剂的制备方法
CN111848457A (zh) * 2020-08-13 2020-10-30 中国工程物理研究院核物理与化学研究所 一种胍基修饰寡聚苯乙炔及其制备方法和抗菌应用

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