JP2019507579A5

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Publication number: JP2019507579A5
Application number: JP2018521542A
Authority: JP
Filing date: 2016-10-28
Publication date: 2020-02-20

Description

本明細書で特定される任意の特許、刊行物、または他の開示材料は、別に示されない限り、組み込まれる材料が本明細書で明白に示される存在する説明、定義、記述、または他の開示材料と矛盾しない限り、その全体が本明細書に参照により組み込まれる。そのため、および必要な限り、本明細書で示される明らかな開示は、参照により組み込まれる任意の矛盾する材料に取って代わる。本明細書に参照により組み込まれると述べられているが、本明細書で示される存在する定義、記述、または他の開示材料と矛盾する任意の材料またはその部分は、その組み込まれる材料と存在する開示材料との間で矛盾が生じない限りにおいてのみ組み込まれる。出願人らは、本明細書に参照により組み込まれる、任意の主題またはその部分を明白に列挙するために、本明細書を訂正する権利を有する。
本発明の実施形態の例として、以下の項目が挙げられる。
（項目１）
ヒト細胞内のジストロフィン遺伝子を、ゲノム編集により編集するための方法であって、前記ヒト細胞へと、１または複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを導入するステップであって、前記ジストロフィン遺伝子内またはその近傍に、１または複数の一本鎖切断（ＳＳＢ）または二本鎖切断（ＤＳＢ）であって、前記ジストロフィン遺伝子内またはその近傍に、１もしくは複数のエクソン、または異常なイントロンのスプライスアクセプターもしくはドナー部位の恒久的な欠失、挿入、または置きかえをもたらし、ジストロフィンのリーディングフレームの修復、およびジストロフィンタンパク質の活性の修復をもたらすＳＳＢまたはＤＳＢを生じさせるステップを含む方法。
（項目２）
前記ヒト細胞が、筋細胞または筋前駆細胞である、項目１に記載の方法。
（項目３）
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）を伴う患者を処置するためのｅｘｖｉｖｏ方法であって、
ｉ）ＤＭＤ患者特異的な誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を創出するステップと；
ｉｉ）前記ｉＰＳＣのジストロフィン遺伝子内またはその近傍で編集するステップと；
ｉｉｉ）ゲノム編集されたｉＰＳＣを、Ｐａｘ７＋筋始原細胞へと分化させるステップと；
ｉｖ）前記Ｐａｘ７＋筋始原細胞を、前記患者へと植え込むステップと
を含むｅｘｖｉｖｏ方法。
（項目４）
前記創出するステップが、
ａ）体細胞を、前記患者から単離することと；
ｂ）多能性関連遺伝子のセットを、前記体細胞へと導入することであって、前記体細胞が多能性幹細胞となるように誘導することと
を含む、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記体細胞が、線維芽細胞である、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記多能性関連遺伝子のセットが、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、Ｌｉｎ２８、ＮＡＮＯＧ、およびｃＭＹＣからなる群から選択される遺伝子のうちの１または複数である、項目４に記載の方法。
（項目７）
前記編集するステップが、前記ｉＰＳＣへと、１または複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを導入することであって、前記ジストロフィン遺伝子内またはその近傍に、１または複数の一本鎖切断（ＳＳＢ）または二本鎖切断（ＤＳＢ）であって、前記ジストロフィン遺伝子内またはその近傍に、１もしくは複数のエクソン、または異常なイントロンのスプライスアクセプターもしくはドナー部位の恒久的な欠失、挿入、または置きかえをもたらし、ジストロフィンのリーディングフレームの修復、およびジストロフィンタンパク質の活性の修復をもたらすＳＳＢまたはＤＳＢを生じさせることを含む、項目３から６のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
前記分化させるステップが、前記ゲノム編集されたｉＰＳＣを、Ｐａｘ７＋筋始原細胞へと分化させるように、以下：前記ゲノム編集されたｉＰＳＣを、低分子薬物を含む特異的培地処方物と接触させること；トランス遺伝子の過剰発現；または血清枯渇のうちの１または複数を含む、項目３から７のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
前記植え込むステップが、所望の筋肉への局所注射により、前記Ｐａｘ７＋筋始原細胞を、前記患者へと植え込むことを含む、項目３から８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）を伴う患者を処置するためのｉｎｖｉｖｏ方法であって、前記患者の細胞内のジストロフィン遺伝子を編集するステップを含むｉｎｖｉｖｏ方法。
（項目１１）
前記編集するステップが、前記患者の前記細胞へと、１または複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを導入することであって、前記ジストロフィン遺伝子内またはその近傍に、１または複数の一本鎖切断（ＳＳＢ）または二本鎖切断（ＤＳＢ）であって、前記ジストロフィン遺伝子内またはその近傍に、１もしくは複数のエクソン、または異常なイントロンのスプライスアクセプターもしくはドナー部位の恒久的な欠失、挿入、または置きかえをもたらし、ジストロフィンのリーディングフレームの修復、およびジストロフィンタンパク質の活性の修復をもたらすＳＳＢまたはＤＳＢを生じさせることを含む、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記細胞が、筋細胞または筋前駆細胞である、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記１または複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（また、Ｃｓｎ１およびＣｓｘ１２としても公知である）、Ｃａｓ１００、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、もしくはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼ；これらの相同体、これらの天然に存在する分子の組換え体、これらのコドン最適化体、またはこれらの修飾形、およびこれらの組合せである、項目１、７、または１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
前記細胞へと、前記１または複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする、１または複数のポリヌクレオチドを導入するステップを含む、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記細胞へと、前記１または複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする、１または複数のリボ核酸（ＲＮＡ）を導入するステップを含む、項目１３に記載の方法。
（項目１６）
前記１もしくは複数のポリヌクレオチド、または１もしくは複数のＲＮＡが、１もしくは複数の修飾ポリヌクレオチド、または１もしくは複数の修飾ＲＮＡである、項目１４または１５に記載の方法。
（項目１７）
前記１または複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼが、１または複数のタンパク質またはポリペプチドである、項目１３に記載の方法。
（項目１８）
前記細胞へと、１または複数のガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）を導入するステップをさらに含む、先行する項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９）
前記１または複数のｇＲＮＡが、単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記１もしくは複数のｇＲＮＡ、または１もしくは複数のｓｇＲＮＡが、１もしくは複数の修飾ｇＲＮＡ、または１もしくは複数の修飾ｓｇＲＮＡである、項目１８または１９に記載の方法。
（項目２１）
前記１または複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼを、１もしくは複数のｇＲＮＡ、または１もしくは複数のｓｇＲＮＡとあらかじめ複合体化させる、項目１８から２０のいずれか一項に記載の方法。
（項目２２）
前記細胞へと、野生型ジストロフィンの遺伝子またはｃＤＮＡの少なくとも一部分を含むポリヌクレオチドドナー鋳型を導入するステップをさらに含む、先行する項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目２３）
前記野生型ジストロフィンの遺伝子またはｃＤＮＡの前記少なくとも一部分が、エクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、エクソン６、エクソン７、エクソン８、エクソン９、エクソン１０、エクソン１１、エクソン１２、エクソン１３、エクソン１４、エクソン１５、エクソン１６、エクソン１７、エクソン１８、エクソン１９、エクソン２０、エクソン２１、エクソン２２、エクソン２３、エクソン２４、エクソン２５、エクソン２６、エクソン２７、エクソン２８、エクソン２９、エクソン３０、エクソン３１、エクソン３２、エクソン３３、エクソン３４、エクソン３５、エクソン３６、エクソン３７、エクソン３８、エクソン３９、エクソン４０、エクソン４１、エクソン４２、エクソン４３、エクソン４４、エクソン４５、エクソン４６、エクソン４７、エクソン４８、エクソン４９、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、エクソン５３、エクソン５４、エクソン５５、エクソン５６、エクソン５７、エクソン５８、エクソン５９、エクソン６０、エクソン６１、エクソン６２、エクソン６３、エクソン６４、エクソン６５、エクソン６６、エクソン６７、エクソン６８、エクソン６９、エクソン７０、エクソン７１、エクソン７２、エクソン７３、エクソン７４、エクソン７５、エクソン７６、エクソン７７、エクソン７８、エクソン７９、イントロン領域、合成イントロン領域、断片、これらの組合せ、またはジストロフィン遺伝子もしくはｃＤＮＡ全体の少なくとも一部を含む、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記野生型ジストロフィンの遺伝子またはｃＤＮＡの前記少なくとも一部分が、エクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、エクソン６、エクソン７、エクソン８、エクソン９、エクソン１０、エクソン１１、エクソン１２、エクソン１３、エクソン１４、エクソン１５、エクソン１６、エクソン１７、エクソン１８、エクソン１９、エクソン２０、エクソン２１、エクソン２２、エクソン２３、エクソン２４、エクソン２５、エクソン２６、エクソン２７、エクソン２８、エクソン２９、エクソン３０、エクソン３１、エクソン３２、エクソン３３、エクソン３４、エクソン３５、エクソン３６、エクソン３７、エクソン３８、エクソン３９、エクソン４０、エクソン４１、エクソン４２、エクソン４３、エクソン４４、エクソン４５、エクソン４６、エクソン４７、エクソン４８、エクソン４９、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、エクソン５３、エクソン５４、エクソン５５、エクソン５６、エクソン５７、エクソン５８、エクソン５９、エクソン６０、エクソン６１、エクソン６２、エクソン６３、エクソン６４、エクソン６５、エクソン６６、エクソン６７、エクソン６８、エクソン６９、エクソン７０、エクソン７１、エクソン７２、エクソン７３、エクソン７４、エクソン７５、エクソン７６、エクソン７７、エクソン７８、エクソン７９、イントロン領域、合成イントロン領域、断片、これらの組合せ、またはジストロフィン遺伝子もしくはｃＤＮＡ全体を含む、項目２２に記載の方法。
（項目２５）
前記ドナー鋳型が、一本鎖または二本鎖ポリヌクレオチドである、項目２２から２４のいずれか一項に記載の方法。
（項目２６）
前記細胞へと、１または複数のガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）を導入するステップをさらに含み、前記１または複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼが、５’ローカスにおける第１のＳＳＢまたはＤＳＢによる切断、および３’ローカスにおける第２のＳＳＢまたはＤＳＢによる切断である１対の一本鎖切断（ＳＳＢ）または二本鎖切断（ＤＳＢ）であって、前記ジストロフィン遺伝子内またはその近傍の前記５’ローカスと前記３’ローカスとの間に、１もしくは複数のエクソン、または異常なイントロンのスプライスアクセプターもしくはドナー部位の恒久的な欠失または置きかえをもたらし、前記ジストロフィンのリーディングフレームの修復、および前記ジストロフィンタンパク質の活性の修復をもたらすＳＳＢまたはＤＳＢを生じさせる１または複数のＣａｓ９またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼである、項目１、７、または１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目２７）
１つのｇＲＮＡが、１対のＳＳＢまたはＤＳＢを創出する、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
１つのｇＲＮＡが、前記５’ローカス、前記３’ローカス、または前記５’ローカスと３’ローカスとの間のセグメントと相補的であるスペーサー配列を含む、項目２６に記載の方法。
（項目２９）
第１のｇＲＮＡおよび第２のｇＲＮＡを含み、前記第１のｇＲＮＡが、前記５’ローカスのセグメントと相補的であるスペーサー配列を含み、前記第２のｇＲＮＡが、前記３’ローカスのセグメントと相補的であるスペーサー配列を含む、項目２６に記載の方法。
（項目３０）
前記１または複数のｇＲＮＡが、１または複数の単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である、項目２６から２９のいずれか一項に記載の方法。
（項目３１）
前記１もしくは複数のｇＲＮＡ、または１もしくは複数のｓｇＲＮＡが、１もしくは複数の修飾ｇＲＮＡ、または１もしくは複数の修飾ｓｇＲＮＡである、項目２６から３０のいずれか一項に記載の方法。
（項目３２）
前記１または複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼを、１もしくは複数のｇＲＮＡ、または１もしくは複数のｓｇＲＮＡとあらかじめ複合体化させる、項目２６から３１のいずれか一項に記載の方法。
（項目３３）
前記５’ローカスと前記３’ローカスとの間に染色体ＤＮＡの欠失が存在する、項目２６から３２のいずれか一項に記載の方法。
（項目３４）
前記欠失が、単一エクソンの欠失である、項目２６から３３のいずれか一項に記載の方法。
（項目３５）
前記単一エクソンの欠失が、エクソン２、エクソン８、エクソン４３、エクソン４４、エクソン４５、エクソン４６、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、またはエクソン５３の欠失である、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記５’ローカスが、エクソン２、エクソン８、エクソン４３、エクソン４４、エクソン４５、エクソン４６、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、およびエクソン５３からなる群から選択される単一エクソンの５’境界部に対して近位である、項目３４から３５のいずれか一項に記載の方法。
（項目３７）
前記３’ローカスが、エクソン２、エクソン８、エクソン４３、エクソン４４、エクソン４５、エクソン４６、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、およびエクソン５３からなる群から選択される単一エクソンの３’境界部に対して近位である、項目３４から３６のいずれか一項に記載の方法。
（項目３８）
前記５’ローカスが、エクソン２、エクソン８、エクソン４３、エクソン４４、エクソン４５、エクソン４６、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、およびエクソン５３からなる群から選択される単一エクソンの５’境界部に対して近位であり、前記３’ローカスが、これらの前記３’境界部に対して近位である、項目３４から３７のいずれか一項に記載の方法。
（項目３９）
前記エクソンの前記境界部に対する近位が、隣接イントロンの周囲のスプライスドナーおよびアクセプターを含む、項目３６から３８のいずれか一項に記載の方法。
（項目４０）
前記欠失が、マルチエクソンの欠失である、項目２６から３３のいずれか一項に記載の方法。
（項目４１）
前記マルチエクソンの欠失が、エクソン４５〜５３またはエクソン４５〜５５の欠失である、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
前記５’ローカスが、エクソン４５〜５３およびエクソン４５〜５５からなる群から選択される複数のエクソンの５’境界部に対して近位である、項目４０から４１のいずれか一項に記載の方法。
（項目４３）
前記３’ローカスが、エクソン４５〜５３およびエクソン４５〜５５からなる群から選択される複数のエクソンの３’境界部に対して近位である、項目４０から４２のいずれか一項に記載の方法。
（項目４４）
前記５’ローカスが、エクソン４５〜５３およびエクソン４５〜５５からなる群から選択される複数のエクソンの５’境界部に対して近位であり、３’ローカスが、これらの３’境界部に対して近位である、項目４０から４３のいずれか一項に記載の方法。
（項目４５）
前記エクソンの前記境界部に対する近位が、隣接イントロンの周囲のスプライスドナーおよびアクセプターを含む、項目４２から４４のいずれか一項に記載の方法。
（項目４６）
前記５’ローカスと前記３’ローカスとの間に染色体ＤＮＡの置きかえが存在する、項目２６から３２のいずれか一項に記載の方法。
（項目４７）
前記置きかえが、単一エクソンの置きかえである、項目２６から３２または４６のいずれか一項に記載の方法。
（項目４８）
前記単一エクソンの置きかえが、エクソン２、エクソン８、エクソン４３、エクソン４４、エクソン４５、エクソン４６、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、エクソン５３、またはエクソン７０の置きかえである、項目２６から３２または４６から４７のいずれか一項に記載の方法。
（項目４９）
前記５’ローカスが、エクソン２、エクソン８、エクソン４３、エクソン４４、エクソン４５、エクソン４６、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、エクソン５３、またはエクソン７０からなる群から選択される単一エクソンの５’境界部に対して近位である、項目４７から４８のいずれか一項に記載の方法。
（項目５０）
前記３’ローカスが、エクソン２、エクソン８、エクソン４３、エクソン４４、エクソン４５、エクソン４６、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、エクソン５３、またはエクソン７０からなる群から選択される単一エクソンの３’境界部に対して近位である、項目４７から４９のいずれか一項に記載の方法。
（項目５１）
前記５’ローカスが、エクソン２、エクソン８、エクソン４３、エクソン４４、エクソン４５、エクソン４６、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、エクソン５３、またはエクソン７０からなる群から選択される単一エクソンの５’境界部に対して近位であり、３’ローカスが、これらの３’境界部に対して近位である、項目４７から５０のいずれか一項に記載の方法。
（項目５２）
前記エクソンの前記境界部に対する近位が、隣接イントロンまたは隣接エクソンの周囲のスプライスドナーおよびアクセプターを含む、項目４９から５１のいずれか一項に記載の方法。
（項目５３）
前記置きかえが、マルチエクソンの置きかえである、項目２６から３２または４６のいずれか一項に記載の方法。
（項目５４）
前記マルチエクソンの置きかえが、エクソン４５〜５３またはエクソン４５〜５５の置きかえである、項目５３に記載の方法。
（項目５５）
前記５’ローカスが、エクソン４５〜５３およびエクソン４５〜５５からなる群から選択される複数のエクソンの５’境界部に対して近位である、項目５３から５４のいずれか一項に記載の方法。
（項目５６）
前記３’ローカスが、エクソン４５〜５３およびエクソン４５〜５５からなる群から選択される複数のエクソンの３’境界部に対して近位である、項目５３から５５のいずれか一項に記載の方法。
（項目５７）
前記５’ローカスが、エクソン４５〜５３およびエクソン４５〜５５からなる群から選択される複数のエクソンの５’境界部に対して近位であり、３’ローカスが、これらの３’境界部に対して近位である、項目５３から５６のいずれか一項に記載の方法。
（項目５８）
前記エクソンの前記境界部に対する近位が、隣接イントロンの周囲のスプライスドナーおよびアクセプターを含む、項目５５から５７のいずれか一項に記載の方法。
（項目５９）
前記細胞へと、野生型ジストロフィンの遺伝子またはｃＤＮＡの少なくとも一部分を含むポリヌクレオチドドナー鋳型を導入するステップをさらに含み、前記置きかえが、相同性により導かれる修復（ＨＤＲ）によるものである、項目４６から５８のいずれか一項に記載の方法。
（項目６０）
前記野生型ジストロフィンの遺伝子またはｃＤＮＡの前記少なくとも一部分が、エクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、エクソン６、エクソン７、エクソン８、エクソン９、エクソン１０、エクソン１１、エクソン１２、エクソン１３、エクソン１４、エクソン１５、エクソン１６、エクソン１７、エクソン１８、エクソン１９、エクソン２０、エクソン２１、エクソン２２、エクソン２３、エクソン２４、エクソン２５、エクソン２６、エクソン２７、エクソン２８、エクソン２９、エクソン３０、エクソン３１、エクソン３２、エクソン３３、エクソン３４、エクソン３５、エクソン３６、エクソン３７、エクソン３８、エクソン３９、エクソン４０、エクソン４１、エクソン４２、エクソン４３、エクソン４４、エクソン４５、エクソン４６、エクソン４７、エクソン４８、エクソン４９、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、エクソン５３、エクソン５４、エクソン５５、エクソン５６、エクソン５７、エクソン５８、エクソン５９、エクソン６０、エクソン６１、エクソン６２、エクソン６３、エクソン６４、エクソン６５、エクソン６６、エクソン６７、エクソン６８、エクソン６９、エクソン７０、エクソン７１、エクソン７２、エクソン７３、エクソン７４、エクソン７５、エクソン７６、エクソン７７、エクソン７８、エクソン７９、イントロン領域、合成イントロン領域、断片、これらの組合せ、またはジストロフィン遺伝子もしくはｃＤＮＡ全体の少なくとも一部を含む、項目５９に記載の方法。
（項目６１）
前記野生型ジストロフィンの遺伝子またはｃＤＮＡの前記少なくとも一部分が、エクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、エクソン６、エクソン７、エクソン８、エクソン９、エクソン１０、エクソン１１、エクソン１２、エクソン１３、エクソン１４、エクソン１５、エクソン１６、エクソン１７、エクソン１８、エクソン１９、エクソン２０、エクソン２１、エクソン２２、エクソン２３、エクソン２４、エクソン２５、エクソン２６、エクソン２７、エクソン２８、エクソン２９、エクソン３０、エクソン３１、エクソン３２、エクソン３３、エクソン３４、エクソン３５、エクソン３６、エクソン３７、エクソン３８、エクソン３９、エクソン４０、エクソン４１、エクソン４２、エクソン４３、エクソン４４、エクソン４５、エクソン４６、エクソン４７、エクソン４８、エクソン４９、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、エクソン５３、エクソン５４、エクソン５５、エクソン５６、エクソン５７、エクソン５８、エクソン５９、エクソン６０、エクソン６１、エクソン６２、エクソン６３、エクソン６４、エクソン６５、エクソン６６、エクソン６７、エクソン６８、エクソン６９、エクソン７０、エクソン７１、エクソン７２、エクソン７３、エクソン７４、エクソン７５、エクソン７６、エクソン７７、エクソン７８、エクソン７９、イントロン領域、合成イントロン領域、断片、これらの組合せ、またはジストロフィン遺伝子もしくはｃＤＮＡ全体を含む、項目５９に記載の方法。
（項目６２）
前記細胞へと、１つのガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）と、野生型ジストロフィンの遺伝子の少なくとも一部分を含むポリヌクレオチドドナー鋳型とを導入するステップをさらに含み、前記１または複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼが、前記ジストロフィン遺伝子内またはその近傍のローカスに、前記ポリヌクレオチドドナー鋳型に由来する新たな配列の、前記ローカスにおける染色体ＤＮＡへの挿入を容易とする１つの一本鎖切断（ＳＳＢ）または二本鎖切断（ＤＳＢ）であって、前記ジストロフィン遺伝子内またはその近傍に、１もしくは複数のエクソン、または異常なイントロンのスプライスアクセプターもしくはドナー部位の恒久的な挿入または矯正をもたらし、前記ジストロフィンのリーディングフレームの修復、および前記ジストロフィンタンパク質の活性の修復をもたらすＳＳＢまたはＤＳＢを生じさせる１または複数のＣａｓ９またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼであり、前記ｇＲＮＡが、前記ローカスのセグメントと相補的であるスペーサー配列を含む、項目１、７、または１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目６３）
前記細胞へと、１または複数のガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）と、野生型ジストロフィンの遺伝子の少なくとも一部分を含むポリヌクレオチドドナー鋳型とを導入するステップをさらに含み、前記１または複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼが、前記ジストロフィン遺伝子内またはその近傍に、前記ポリヌクレオチドドナー鋳型に由来する新たな配列の、５’ローカスと３’ローカスとの間における染色体ＤＮＡへの挿入を容易とする、前記５’ローカスにおける第１の切断、および前記３’ローカスにおける第２の切断である１対の一本鎖切断（ＳＳＢ）または二本鎖切断（ＤＳＢ）であって、前記ジストロフィン遺伝子内またはその近傍の前記５’ローカスと前記３’ローカスとの間に、１もしくは複数のエクソン、または異常なイントロンのスプライスアクセプターもしくはドナー部位の恒久的な挿入または矯正をもたらし、前記ジストロフィンのリーディングフレームの修復、および前記ジストロフィンタンパク質の活性の修復をもたらすＳＳＢまたはＤＳＢを生じさせる１または複数のＣａｓ９またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼである、項目１、７、または１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目６４）
１つのｇＲＮＡが、１対のＳＳＢまたはＤＳＢを創出する、項目６３に記載の方法。
（項目６５）
１つのｇＲＮＡが、前記５’ローカス、前記３’ローカス、または前記５’ローカスと前記３’ローカスとの間のセグメントと相補的であるスペーサー配列を含む、項目６３に記載の方法。
（項目６６）
第１のｇＲＮＡおよび第２のｇＲＮＡを含み、前記第１のｇＲＮＡが、前記５’ローカスのセグメントと相補的であるスペーサー配列を含み、前記第２のｇＲＮＡが、前記３’ローカスのセグメントと相補的であるスペーサー配列を含む、項目６３に記載の方法。
（項目６７）
前記１または複数のｇＲＮＡが、１または複数の単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である、項目６２または６３に記載の方法。
（項目６８）
前記１もしくは複数のｇＲＮＡ、または１もしくは複数のｓｇＲＮＡが、１もしくは複数の修飾ｇＲＮＡ、または１もしくは複数の修飾ｓｇＲＮＡである、項目６２から６３または６７のいずれか一項に記載の方法。
（項目６９）
前記１または複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼを、１もしくは複数のｇＲＮＡ、または１もしくは複数のｓｇＲＮＡとあらかじめ複合体化させる、項目６２から６３または６７から６８のいずれか一項に記載の方法。
（項目７０）
前記挿入が、単一エクソンの挿入である、項目６２から６９のいずれか一項に記載の方法。
（項目７１）
前記単一エクソンの挿入が、エクソン２、エクソン８、エクソン４３、エクソン４４、エクソン４５、エクソン４６、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、エクソン５３、またはエクソン７０の挿入である、項目７０に記載の方法。
（項目７２）
前記ローカス、５’ローカスまたは３’ローカスが、エクソン２、エクソン８、エクソン４３、エクソン４４、エクソン４５、エクソン４６、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、エクソン５３、およびエクソン７０からなる群から選択される単一エクソンの境界部に対して近位である、項目７０から７１のいずれか一項に記載の方法。
（項目７３）
前記エクソンの前記境界部に対する近位が、隣接イントロンまたは隣接エクソンの周囲のスプライスドナーおよびアクセプターを含む、項目７２に記載の方法。
（項目７４）
前記挿入が、マルチエクソンの挿入である、項目６２から６９のいずれか一項に記載の方法。
（項目７５）
前記マルチエクソンの挿入が、エクソン４５〜５３またはエクソン４５〜５５の挿入である、項目７４に記載の方法。
（項目７６）
前記ローカス、５’ローカスまたは３’ローカスが、エクソン４５〜５３またはエクソン４５〜５５からなる群から選択されるマルチエクソンの境界部に対して近位である、項目７４から７５のいずれか一項に記載の方法。
（項目７７）
前記エクソンの前記境界部に対する近位が、隣接イントロンの周囲のスプライスドナーおよびアクセプターを含む、項目７６に記載の方法。
（項目７８）
前記野生型ジストロフィンの遺伝子またはｃＤＮＡの少なくとも一部分が、エクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、エクソン６、エクソン７、エクソン８、エクソン９、エクソン１０、エクソン１１、エクソン１２、エクソン１３、エクソン１４、エクソン１５、エクソン１６、エクソン１７、エクソン１８、エクソン１９、エクソン２０、エクソン２１、エクソン２２、エクソン２３、エクソン２４、エクソン２５、エクソン２６、エクソン２７、エクソン２８、エクソン２９、エクソン３０、エクソン３１、エクソン３２、エクソン３３、エクソン３４、エクソン３５、エクソン３６、エクソン３７、エクソン３８、エクソン３９、エクソン４０、エクソン４１、エクソン４２、エクソン４３、エクソン４４、エクソン４５、エクソン４６、エクソン４７、エクソン４８、エクソン４９、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、エクソン５３、エクソン５４、エクソン５５、エクソン５６、エクソン５７、エクソン５８、エクソン５９、エクソン６０、エクソン６１、エクソン６２、エクソン６３、エクソン６４、エクソン６５、エクソン６６、エクソン６７、エクソン６８、エクソン６９、エクソン７０、エクソン７１、エクソン７２、エクソン７３、エクソン７４、エクソン７５、エクソン７６、エクソン７７、エクソン７８、エクソン７９、イントロン領域、合成イントロン領域、断片、これらの組合せ、またはジストロフィン遺伝子もしくはｃＤＮＡ全体の少なくとも一部を含む、項目６２または６３に記載の方法。
（項目７９）
前記野生型ジストロフィンの遺伝子またはｃＤＮＡの少なくとも一部分が、エクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、エクソン６、エクソン７、エクソン８、エクソン９、エクソン１０、エクソン１１、エクソン１２、エクソン１３、エクソン１４、エクソン１５、エクソン１６、エクソン１７、エクソン１８、エクソン１９、エクソン２０、エクソン２１、エクソン２２、エクソン２３、エクソン２４、エクソン２５、エクソン２６、エクソン２７、エクソン２８、エクソン２９、エクソン３０、エクソン３１、エクソン３２、エクソン３３、エクソン３４、エクソン３５、エクソン３６、エクソン３７、エクソン３８、エクソン３９、エクソン４０、エクソン４１、エクソン４２、エクソン４３、エクソン４４、エクソン４５、エクソン４６、エクソン４７、エクソン４８、エクソン４９、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、エクソン５３、エクソン５４、エクソン５５、エクソン５６、エクソン５７、エクソン５８、エクソン５９、エクソン６０、エクソン６１、エクソン６２、エクソン６３、エクソン６４、エクソン６５、エクソン６６、エクソン６７、エクソン６８、エクソン６９、エクソン７０、エクソン７１、エクソン７２、エクソン７３、エクソン７４、エクソン７５、エクソン７６、エクソン７７、エクソン７８、エクソン７９、イントロン領域、合成イントロン領域、断片、これらの組合せ、またはジストロフィン遺伝子もしくはｃＤＮＡ全体を含む、項目６２または６３に記載の方法。
（項目８０）
前記挿入が、相同性により導かれる修復（ＨＤＲ）によるものである、項目６２から７９のいずれか一項に記載の方法。
（項目８１）
前記ドナー鋳型が、一本鎖または二本鎖ポリヌクレオチドである、項目６２から８０のいずれか一項に記載の方法。
（項目８２）
前記Ｃａｓ９またはＣｐｆ１の、ｍＲＮＡ、ｇＲＮＡ、およびドナー鋳型を、各々別個の脂質ナノ粒子へと製剤化するか、またはこれらの全てを、脂質ナノ粒子へと共製剤化する、項目２６から８１のいずれか一項に記載の方法。
（項目８３）
前記Ｃａｓ９またはＣｐｆ１のｍＲＮＡを、脂質ナノ粒子へと製剤化し、前記ｇＲＮＡおよびドナー鋳型の両方を、前記細胞へと、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターにより送達する、項目２６から８１のいずれか一項に記載の方法。
（項目８４）
前記Ｃａｓ９またはＣｐｆ１のｍＲＮＡを、脂質ナノ粒子へと製剤化し、前記ｇＲＮＡを、前記細胞へと、電気穿孔により送達し、ドナー鋳型を、前記細胞へと、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターにより送達する、項目２６から８１のいずれか一項に記載の方法。
（項目８５）
前記ジストロフィン遺伝子が、Ｘ染色体：３１，１１７，２２８〜３３，３４４，６０９（ＧｅｎｏｍｅＲｅｆｅｒｅｎｃｅＣｏｎｓｏｒｔｉｕｍ：ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８）に位置する、先行する項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目８６）
デュシェンヌ型筋ジストロフィーを伴う患者に由来する細胞内のジストロフィン遺伝子を編集するための、１または複数のガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）であって、配列表の配列番号１〜１，４１０，４７２内の核酸配列からなる群から選択されるスペーサー配列を含む、１または複数のｇＲＮＡ。
（項目８７）
１または複数の単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である、項目８６に記載の、１または複数のｇＲＮＡ。
（項目８８）
前記１もしくは複数のｇＲＮＡ、または１もしくは複数のｓｇＲＮＡが、１もしくは複数の修飾ｇＲＮＡ、または１もしくは複数の修飾ｓｇＲＮＡである、項目８６または８７に記載の、１または複数のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ。

Claims

ヒト細胞内のジストロフィン遺伝子を、ゲノム編集により編集するための方法において使用するための、１または複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼまたは１または複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする１または複数のポリヌクレオチドを含む組成物であって、前記方法は、前記ヒト細胞へと、１または複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを導入するステップであって、前記ジストロフィン遺伝子内またはその近傍に、１または複数の一本鎖切断（ＳＳＢ）または二本鎖切断（ＤＳＢ）であって、前記ジストロフィン遺伝子内またはその近傍に、１もしくは複数のエクソン、または異常なイントロンのスプライスアクセプターもしくはドナー部位の恒久的な欠失、挿入、または置きかえをもたらし、ジストロフィンのリーディングフレームの修復、およびジストロフィンタンパク質の活性の修復をもたらすＳＳＢまたはＤＳＢを生じさせるステップを含む、組成物。
前記ヒト細胞が、筋細胞または筋前駆細胞である、請求項１に記載の組成物。
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）を伴う患者を処置するための、Ｐａｘ７＋筋始原細胞を含む組成物であって、前記Ｐａｘ７＋筋始原細胞は、
ｉ）ＤＭＤ患者特異的な誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を創出するステップと；
ｉｉ）前記ｉＰＳＣのジストロフィン遺伝子内またはその近傍で編集するステップと；
ｉｉｉ）ゲノム編集されたｉＰＳＣを、Ｐａｘ７＋筋始原細胞へと分化させるステップと
を含む方法によって産生され、
前記組成物は、前記患者へと植え込まれることを特徴とする、組成物。
前記創出するステップが、
ａ）体細胞を、前記患者から単離することと；
ｂ）多能性関連遺伝子のセットを、前記体細胞へと導入することであって、前記体細胞が多能性幹細胞となるように誘導することと
を含む、請求項３に記載の組成物。
前記体細胞が、線維芽細胞である、請求項４に記載の組成物。
前記多能性関連遺伝子のセットが、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、Ｌｉｎ２８、ＮＡＮＯＧ、およびｃＭＹＣからなる群から選択される遺伝子のうちの１または複数である、請求項４に記載の組成物。
前記編集するステップが、前記ｉＰＳＣへと、１または複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを導入することであって、前記ジストロフィン遺伝子内またはその近傍に、１または複数の一本鎖切断（ＳＳＢ）または二本鎖切断（ＤＳＢ）であって、前記ジストロフィン遺伝子内またはその近傍に、１もしくは複数のエクソン、または異常なイントロンのスプライスアクセプターもしくはドナー部位の恒久的な欠失、挿入、または置きかえをもたらし、ジストロフィンのリーディングフレームの修復、およびジストロフィンタンパク質の活性の修復をもたらすＳＳＢまたはＤＳＢを生じさせることを含む、請求項３から６のいずれか一項に記載の組成物。
前記分化させるステップが、前記ゲノム編集されたｉＰＳＣを、Ｐａｘ７＋筋始原細胞へと分化させるように、以下：前記ゲノム編集されたｉＰＳＣを、低分子薬物を含む特異的培地処方物と接触させること；トランス遺伝子の過剰発現；または血清枯渇のうちの１または複数を含む、請求項３から７のいずれか一項に記載の組成物。
前記組成物が、所望の筋肉への局所注射により、前記患者へと植え込まれることを特徴とする、請求項３から８のいずれか一項に記載の組成物。
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）を伴う患者を処置するためのｉｎｖｉｖｏ方法において使用するための、ジストロフィン遺伝子を編集するための材料を含む組成物であって、前記方法は、前記患者の細胞内のジストロフィン遺伝子を編集するステップを含む、組成物。
前記編集するステップが、前記患者の前記細胞へと、１または複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを導入することであって、前記ジストロフィン遺伝子内またはその近傍に、１または複数の一本鎖切断（ＳＳＢ）または二本鎖切断（ＤＳＢ）であって、前記ジストロフィン遺伝子内またはその近傍に、１もしくは複数のエクソン、または異常なイントロンのスプライスアクセプターもしくはドナー部位の恒久的な欠失、挿入、または置きかえをもたらし、ジストロフィンのリーディングフレームの修復、およびジストロフィンタンパク質の活性の修復をもたらすＳＳＢまたはＤＳＢを生じさせることを含む、請求項１０に記載の組成物。
前記細胞が、筋細胞または筋前駆細胞である、請求項１１に記載の組成物。
前記１または複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（また、Ｃｓｎ１およびＣｓｘ１２としても公知である）、Ｃａｓ１００、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、もしくはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼ；これらの相同体、これらの天然に存在する分子の組換え体、これらのコドン最適化体、またはこれらの修飾形、およびこれらの組合せである、請求項１、７、または１１のいずれか一項に記載の組成物。
前記方法は、前記細胞へと、前記１または複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする、１または複数のポリヌクレオチドを導入するステップを含む、請求項１３に記載の組成物。
前記方法は、前記細胞へと、前記１または複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする、１または複数のリボ核酸（ＲＮＡ）を導入するステップを含む、請求項１３に記載の組成物。
前記１もしくは複数のポリヌクレオチド、または１もしくは複数のＲＮＡが、１もしくは複数の修飾ポリヌクレオチド、または１もしくは複数の修飾ＲＮＡである、請求項１４または１５に記載の組成物。
前記１または複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼが、１または複数のタンパク質またはポリペプチドである、請求項１３に記載の組成物。
前記方法は、前記細胞へと、１または複数のガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）を導入するステップをさらに含む、請求項１から１７のいずれか一項に記載の組成物。
前記１または複数のｇＲＮＡが、単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である、請求項１８に記載の組成物。
前記１もしくは複数のｇＲＮＡ、または１もしくは複数のｓｇＲＮＡが、１もしくは複数の修飾ｇＲＮＡ、または１もしくは複数の修飾ｓｇＲＮＡである、請求項１８または１９に記載の組成物。
前記１または複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼが、１もしくは複数のｇＲＮＡ、または１もしくは複数のｓｇＲＮＡとあらかじめ複合体化されている、請求項１８から２０のいずれか一項に記載の組成物。
前記方法は、前記細胞へと、野生型ジストロフィンの遺伝子またはｃＤＮＡの少なくとも一部分を含むポリヌクレオチドドナー鋳型を導入するステップをさらに含む、請求項１から２０のいずれか一項に記載の組成物。
前記野生型ジストロフィンの遺伝子またはｃＤＮＡの前記少なくとも一部分が、エクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、エクソン６、エクソン７、エクソン８、エクソン９、エクソン１０、エクソン１１、エクソン１２、エクソン１３、エクソン１４、エクソン１５、エクソン１６、エクソン１７、エクソン１８、エクソン１９、エクソン２０、エクソン２１、エクソン２２、エクソン２３、エクソン２４、エクソン２５、エクソン２６、エクソン２７、エクソン２８、エクソン２９、エクソン３０、エクソン３１、エクソン３２、エクソン３３、エクソン３４、エクソン３５、エクソン３６、エクソン３７、エクソン３８、エクソン３９、エクソン４０、エクソン４１、エクソン４２、エクソン４３、エクソン４４、エクソン４５、エクソン４６、エクソン４７、エクソン４８、エクソン４９、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、エクソン５３、エクソン５４、エクソン５５、エクソン５６、エクソン５７、エクソン５８、エクソン５９、エクソン６０、エクソン６１、エクソン６２、エクソン６３、エクソン６４、エクソン６５、エクソン６６、エクソン６７、エクソン６８、エクソン６９、エクソン７０、エクソン７１、エクソン７２、エクソン７３、エクソン７４、エクソン７５、エクソン７６、エクソン７７、エクソン７８、エクソン７９、イントロン領域、合成イントロン領域、断片、これらの組合せ、またはジストロフィン遺伝子もしくはｃＤＮＡ全体の少なくとも一部を含む、請求項２２に記載の組成物。
前記野生型ジストロフィンの遺伝子またはｃＤＮＡの前記少なくとも一部分が、エクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、エクソン６、エクソン７、エクソン８、エクソン９、エクソン１０、エクソン１１、エクソン１２、エクソン１３、エクソン１４、エクソン１５、エクソン１６、エクソン１７、エクソン１８、エクソン１９、エクソン２０、エクソン２１、エクソン２２、エクソン２３、エクソン２４、エクソン２５、エクソン２６、エクソン２７、エクソン２８、エクソン２９、エクソン３０、エクソン３１、エクソン３２、エクソン３３、エクソン３４、エクソン３５、エクソン３６、エクソン３７、エクソン３８、エクソン３９、エクソン４０、エクソン４１、エクソン４２、エクソン４３、エクソン４４、エクソン４５、エクソン４６、エクソン４７、エクソン４８、エクソン４９、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、エクソン５３、エクソン５４、エクソン５５、エクソン５６、エクソン５７、エクソン５８、エクソン５９、エクソン６０、エクソン６１、エクソン６２、エクソン６３、エクソン６４、エクソン６５、エクソン６６、エクソン６７、エクソン６８、エクソン６９、エクソン７０、エクソン７１、エクソン７２、エクソン７３、エクソン７４、エクソン７５、エクソン７６、エクソン７７、エクソン７８、エクソン７９、イントロン領域、合成イントロン領域、断片、これらの組合せ、またはジストロフィン遺伝子もしくはｃＤＮＡ全体を含む、請求項２２に記載の組成物。
前記ドナー鋳型が、一本鎖または二本鎖ポリヌクレオチドである、請求項２２から２４のいずれか一項に記載の組成物。
前記方法が、前記細胞へと、１または複数のガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）を導入するステップをさらに含み、前記１または複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼが、５’ローカスにおける第１のＳＳＢまたはＤＳＢによる切断、および３’ローカスにおける第２のＳＳＢまたはＤＳＢによる切断である１対の一本鎖切断（ＳＳＢ）または二本鎖切断（ＤＳＢ）であって、前記ジストロフィン遺伝子内またはその近傍の前記５’ローカスと前記３’ローカスとの間に、１もしくは複数のエクソン、または異常なイントロンのスプライスアクセプターもしくはドナー部位の恒久的な欠失または置きかえをもたらし、前記ジストロフィンのリーディングフレームの修復、および前記ジストロフィンタンパク質の活性の修復をもたらすＳＳＢまたはＤＳＢを生じさせる１または複数のＣａｓ９またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼである、請求項１、７、または１１のいずれか一項に記載の組成物。
１つのｇＲＮＡが、１対のＳＳＢまたはＤＳＢを創出する、請求項２６に記載の組成物。
１つのｇＲＮＡが、前記５’ローカス、前記３’ローカス、または前記５’ローカスと３’ローカスとの間のセグメントと相補的であるスペーサー配列を含む、請求項２６に記載の組成物。
第１のｇＲＮＡおよび第２のｇＲＮＡを含み、前記第１のｇＲＮＡが、前記５’ローカスのセグメントと相補的であるスペーサー配列を含み、前記第２のｇＲＮＡが、前記３’ローカスのセグメントと相補的であるスペーサー配列を含む、請求項２６に記載の組成物。
前記１または複数のｇＲＮＡが、１または複数の単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である、請求項２６から２９のいずれか一項に記載の組成物。
前記１もしくは複数のｇＲＮＡ、または１もしくは複数のｓｇＲＮＡが、１もしくは複数の修飾ｇＲＮＡ、または１もしくは複数の修飾ｓｇＲＮＡである、請求項２６から３０のいずれか一項に記載の組成物。
前記１または複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼが、１もしくは複数のｇＲＮＡ、または１もしくは複数のｓｇＲＮＡとあらかじめ複合体化されている、請求項２６から３１のいずれか一項に記載の組成物。
前記５’ローカスと前記３’ローカスとの間に染色体ＤＮＡの欠失が存在する、請求項２６から３２のいずれか一項に記載の組成物。
前記欠失が、単一エクソンの欠失である、請求項２６から３３のいずれか一項に記載の組成物。
前記単一エクソンの欠失が、エクソン２、エクソン８、エクソン４３、エクソン４４、エクソン４５、エクソン４６、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、またはエクソン５３の欠失である、請求項３４に記載の組成物。
前記５’ローカスが、エクソン２、エクソン８、エクソン４３、エクソン４４、エクソン４５、エクソン４６、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、およびエクソン５３からなる群から選択される単一エクソンの５’境界部に対して近位である、請求項３４から３５のいずれか一項に記載の組成物。
前記３’ローカスが、エクソン２、エクソン８、エクソン４３、エクソン４４、エクソン４５、エクソン４６、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、およびエクソン５３からなる群から選択される単一エクソンの３’境界部に対して近位である、請求項３４から３６のいずれか一項に記載の組成物。
前記５’ローカスが、エクソン２、エクソン８、エクソン４３、エクソン４４、エクソン４５、エクソン４６、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、およびエクソン５３からなる群から選択される単一エクソンの５’境界部に対して近位であり、前記３’ローカスが、これらの前記３’境界部に対して近位である、請求項３４から３７のいずれか一項に記載の組成物。
前記エクソンの前記境界部に対する近位が、隣接イントロンの周囲のスプライスドナーおよびアクセプターを含む、請求項３６から３８のいずれか一項に記載の組成物。
前記欠失が、マルチエクソンの欠失である、請求項２６から３３のいずれか一項に記載の組成物。
前記マルチエクソンの欠失が、エクソン４５〜５３またはエクソン４５〜５５の欠失である、請求項４０に記載の組成物。
前記５’ローカスが、エクソン４５〜５３およびエクソン４５〜５５からなる群から選択される複数のエクソンの５’境界部に対して近位である、請求項４０から４１のいずれか一項に記載の組成物。
前記３’ローカスが、エクソン４５〜５３およびエクソン４５〜５５からなる群から選択される複数のエクソンの３’境界部に対して近位である、請求項４０から４２のいずれか一項に記載の組成物。
前記５’ローカスが、エクソン４５〜５３およびエクソン４５〜５５からなる群から選択される複数のエクソンの５’境界部に対して近位であり、３’ローカスが、これらの３’境界部に対して近位である、請求項４０から４３のいずれか一項に記載の組成物。
前記エクソンの前記境界部に対する近位が、隣接イントロンの周囲のスプライスドナーおよびアクセプターを含む、請求項４２から４４のいずれか一項に記載の組成物。
前記５’ローカスと前記３’ローカスとの間に染色体ＤＮＡの置きかえが存在する、請求項２６から３２のいずれか一項に記載の組成物。
前記置きかえが、単一エクソンの置きかえである、請求項２６から３２または４６のいずれか一項に記載の組成物。
前記単一エクソンの置きかえが、エクソン２、エクソン８、エクソン４３、エクソン４４、エクソン４５、エクソン４６、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、エクソン５３、またはエクソン７０の置きかえである、請求項２６から３２または４６から４７のいずれか一項に記載の組成物。
前記５’ローカスが、エクソン２、エクソン８、エクソン４３、エクソン４４、エクソン４５、エクソン４６、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、エクソン５３、またはエクソン７０からなる群から選択される単一エクソンの５’境界部に対して近位である、請求項４７から４８のいずれか一項に記載の組成物。
前記３’ローカスが、エクソン２、エクソン８、エクソン４３、エクソン４４、エクソン４５、エクソン４６、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、エクソン５３、またはエクソン７０からなる群から選択される単一エクソンの３’境界部に対して近位である、請求項４７から４９のいずれか一項に記載の組成物。
前記５’ローカスが、エクソン２、エクソン８、エクソン４３、エクソン４４、エクソン４５、エクソン４６、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、エクソン５３、またはエクソン７０からなる群から選択される単一エクソンの５’境界部に対して近位であり、３’ローカスが、これらの３’境界部に対して近位である、請求項４７から５０のいずれか一項に記載の組成物。
前記エクソンの前記境界部に対する近位が、隣接イントロンまたは隣接エクソンの周囲のスプライスドナーおよびアクセプターを含む、請求項４９から５１のいずれか一項に記載の組成物。
前記置きかえが、マルチエクソンの置きかえである、請求項２６から３２または４６のいずれか一項に記載の組成物。
前記マルチエクソンの置きかえが、エクソン４５〜５３またはエクソン４５〜５５の置きかえである、請求項５３に記載の組成物。
前記５’ローカスが、エクソン４５〜５３およびエクソン４５〜５５からなる群から選択される複数のエクソンの５’境界部に対して近位である、請求項５３から５４のいずれか一項に記載の組成物。
前記３’ローカスが、エクソン４５〜５３およびエクソン４５〜５５からなる群から選択される複数のエクソンの３’境界部に対して近位である、請求項５３から５５のいずれか一項に記載の組成物。
前記５’ローカスが、エクソン４５〜５３およびエクソン４５〜５５からなる群から選択される複数のエクソンの５’境界部に対して近位であり、３’ローカスが、これらの３’境界部に対して近位である、請求項５３から５６のいずれか一項に記載の組成物。
前記エクソンの前記境界部に対する近位が、隣接イントロンの周囲のスプライスドナーおよびアクセプターを含む、請求項５５から５７のいずれか一項に記載の組成物。
前記方法が、前記細胞へと、野生型ジストロフィンの遺伝子またはｃＤＮＡの少なくとも一部分を含むポリヌクレオチドドナー鋳型を導入するステップをさらに含み、前記置きかえが、相同性により導かれる修復（ＨＤＲ）によるものである、請求項４６から５８のいずれか一項に記載の組成物。
前記野生型ジストロフィンの遺伝子またはｃＤＮＡの前記少なくとも一部分が、エクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、エクソン６、エクソン７、エクソン８、エクソン９、エクソン１０、エクソン１１、エクソン１２、エクソン１３、エクソン１４、エクソン１５、エクソン１６、エクソン１７、エクソン１８、エクソン１９、エクソン２０、エクソン２１、エクソン２２、エクソン２３、エクソン２４、エクソン２５、エクソン２６、エクソン２７、エクソン２８、エクソン２９、エクソン３０、エクソン３１、エクソン３２、エクソン３３、エクソン３４、エクソン３５、エクソン３６、エクソン３７、エクソン３８、エクソン３９、エクソン４０、エクソン４１、エクソン４２、エクソン４３、エクソン４４、エクソン４５、エクソン４６、エクソン４７、エクソン４８、エクソン４９、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、エクソン５３、エクソン５４、エクソン５５、エクソン５６、エクソン５７、エクソン５８、エクソン５９、エクソン６０、エクソン６１、エクソン６２、エクソン６３、エクソン６４、エクソン６５、エクソン６６、エクソン６７、エクソン６８、エクソン６９、エクソン７０、エクソン７１、エクソン７２、エクソン７３、エクソン７４、エクソン７５、エクソン７６、エクソン７７、エクソン７８、エクソン７９、イントロン領域、合成イントロン領域、断片、これらの組合せ、またはジストロフィン遺伝子もしくはｃＤＮＡ全体の少なくとも一部を含む、請求項５９に記載の組成物。
前記野生型ジストロフィンの遺伝子またはｃＤＮＡの前記少なくとも一部分が、エクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、エクソン６、エクソン７、エクソン８、エクソン９、エクソン１０、エクソン１１、エクソン１２、エクソン１３、エクソン１４、エクソン１５、エクソン１６、エクソン１７、エクソン１８、エクソン１９、エクソン２０、エクソン２１、エクソン２２、エクソン２３、エクソン２４、エクソン２５、エクソン２６、エクソン２７、エクソン２８、エクソン２９、エクソン３０、エクソン３１、エクソン３２、エクソン３３、エクソン３４、エクソン３５、エクソン３６、エクソン３７、エクソン３８、エクソン３９、エクソン４０、エクソン４１、エクソン４２、エクソン４３、エクソン４４、エクソン４５、エクソン４６、エクソン４７、エクソン４８、エクソン４９、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、エクソン５３、エクソン５４、エクソン５５、エクソン５６、エクソン５７、エクソン５８、エクソン５９、エクソン６０、エクソン６１、エクソン６２、エクソン６３、エクソン６４、エクソン６５、エクソン６６、エクソン６７、エクソン６８、エクソン６９、エクソン７０、エクソン７１、エクソン７２、エクソン７３、エクソン７４、エクソン７５、エクソン７６、エクソン７７、エクソン７８、エクソン７９、イントロン領域、合成イントロン領域、断片、これらの組合せ、またはジストロフィン遺伝子もしくはｃＤＮＡ全体を含む、請求項５９に記載の組成物。
前記方法が、前記細胞へと、１つのガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）と、野生型ジストロフィンの遺伝子の少なくとも一部分を含むポリヌクレオチドドナー鋳型とを導入するステップをさらに含み、前記１または複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼが、前記ジストロフィン遺伝子内またはその近傍のローカスに、前記ポリヌクレオチドドナー鋳型に由来する新たな配列の、前記ローカスにおける染色体ＤＮＡへの挿入を容易とする１つの一本鎖切断（ＳＳＢ）または二本鎖切断（ＤＳＢ）であって、前記ジストロフィン遺伝子内またはその近傍に、１もしくは複数のエクソン、または異常なイントロンのスプライスアクセプターもしくはドナー部位の恒久的な挿入または矯正をもたらし、前記ジストロフィンのリーディングフレームの修復、および前記ジストロフィンタンパク質の活性の修復をもたらすＳＳＢまたはＤＳＢを生じさせる１または複数のＣａｓ９またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼであり、前記ｇＲＮＡが、前記ローカスのセグメントと相補的であるスペーサー配列を含む、請求項１、７、または１１のいずれか一項に記載の組成物。
前記方法が、前記細胞へと、１または複数のガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）と、野生型ジストロフィンの遺伝子の少なくとも一部分を含むポリヌクレオチドドナー鋳型とを導入するステップをさらに含み、前記１または複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼが、前記ジストロフィン遺伝子内またはその近傍に、前記ポリヌクレオチドドナー鋳型に由来する新たな配列の、５’ローカスと３’ローカスとの間における染色体ＤＮＡへの挿入を容易とする、前記５’ローカスにおける第１の切断、および前記３’ローカスにおける第２の切断である１対の一本鎖切断（ＳＳＢ）または二本鎖切断（ＤＳＢ）であって、前記ジストロフィン遺伝子内またはその近傍の前記５’ローカスと前記３’ローカスとの間に、１もしくは複数のエクソン、または異常なイントロンのスプライスアクセプターもしくはドナー部位の恒久的な挿入または矯正をもたらし、前記ジストロフィンのリーディングフレームの修復、および前記ジストロフィンタンパク質の活性の修復をもたらすＳＳＢまたはＤＳＢを生じさせる１または複数のＣａｓ９またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼである、請求項１、７、または１１のいずれか一項に記載の組成物。
１つのｇＲＮＡが、１対のＳＳＢまたはＤＳＢを創出する、請求項６３に記載の組成物。
１つのｇＲＮＡが、前記５’ローカス、前記３’ローカス、または前記５’ローカスと前記３’ローカスとの間のセグメントと相補的であるスペーサー配列を含む、請求項６３に記載の組成物。
第１のｇＲＮＡおよび第２のｇＲＮＡを含み、前記第１のｇＲＮＡが、前記５’ローカスのセグメントと相補的であるスペーサー配列を含み、前記第２のｇＲＮＡが、前記３’ローカスのセグメントと相補的であるスペーサー配列を含む、請求項６３に記載の組成物。
前記１または複数のｇＲＮＡが、１または複数の単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である、請求項６２または６３に記載の組成物。
前記１もしくは複数のｇＲＮＡ、または１もしくは複数のｓｇＲＮＡが、１もしくは複数の修飾ｇＲＮＡ、または１もしくは複数の修飾ｓｇＲＮＡである、請求項６２から６３または６７のいずれか一項に記載の組成物。
前記１または複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼが、１もしくは複数のｇＲＮＡ、または１もしくは複数のｓｇＲＮＡとあらかじめ複合体化されている、請求項６２から６３または６７から６８のいずれか一項に記載の組成物。
前記挿入が、単一エクソンの挿入である、請求項６２から６９のいずれか一項に記載の組成物。
前記単一エクソンの挿入が、エクソン２、エクソン８、エクソン４３、エクソン４４、エクソン４５、エクソン４６、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、エクソン５３、またはエクソン７０の挿入である、請求項７０に記載の組成物。
前記ローカス、５’ローカスまたは３’ローカスが、エクソン２、エクソン８、エクソン４３、エクソン４４、エクソン４５、エクソン４６、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、エクソン５３、およびエクソン７０からなる群から選択される単一エクソンの境界部に対して近位である、請求項７０から７１のいずれか一項に記載の組成物。
前記エクソンの前記境界部に対する近位が、隣接イントロンまたは隣接エクソンの周囲のスプライスドナーおよびアクセプターを含む、請求項７２に記載の組成物。
前記挿入が、マルチエクソンの挿入である、請求項６２から６９のいずれか一項に記載の組成物。
前記マルチエクソンの挿入が、エクソン４５〜５３またはエクソン４５〜５５の挿入である、請求項７４に記載の組成物。
前記ローカス、５’ローカスまたは３’ローカスが、エクソン４５〜５３またはエクソン４５〜５５からなる群から選択されるマルチエクソンの境界部に対して近位である、請求項７４から７５のいずれか一項に記載の組成物。
前記エクソンの前記境界部に対する近位が、隣接イントロンの周囲のスプライスドナーおよびアクセプターを含む、請求項７６に記載の組成物。
前記野生型ジストロフィンの遺伝子またはｃＤＮＡの少なくとも一部分が、エクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、エクソン６、エクソン７、エクソン８、エクソン９、エクソン１０、エクソン１１、エクソン１２、エクソン１３、エクソン１４、エクソン１５、エクソン１６、エクソン１７、エクソン１８、エクソン１９、エクソン２０、エクソン２１、エクソン２２、エクソン２３、エクソン２４、エクソン２５、エクソン２６、エクソン２７、エクソン２８、エクソン２９、エクソン３０、エクソン３１、エクソン３２、エクソン３３、エクソン３４、エクソン３５、エクソン３６、エクソン３７、エクソン３８、エクソン３９、エクソン４０、エクソン４１、エクソン４２、エクソン４３、エクソン４４、エクソン４５、エクソン４６、エクソン４７、エクソン４８、エクソン４９、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、エクソン５３、エクソン５４、エクソン５５、エクソン５６、エクソン５７、エクソン５８、エクソン５９、エクソン６０、エクソン６１、エクソン６２、エクソン６３、エクソン６４、エクソン６５、エクソン６６、エクソン６７、エクソン６８、エクソン６９、エクソン７０、エクソン７１、エクソン７２、エクソン７３、エクソン７４、エクソン７５、エクソン７６、エクソン７７、エクソン７８、エクソン７９、イントロン領域、合成イントロン領域、断片、これらの組合せ、またはジストロフィン遺伝子もしくはｃＤＮＡ全体の少なくとも一部を含む、請求項６２または６３に記載の組成物。
前記野生型ジストロフィンの遺伝子またはｃＤＮＡの少なくとも一部分が、エクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、エクソン６、エクソン７、エクソン８、エクソン９、エクソン１０、エクソン１１、エクソン１２、エクソン１３、エクソン１４、エクソン１５、エクソン１６、エクソン１７、エクソン１８、エクソン１９、エクソン２０、エクソン２１、エクソン２２、エクソン２３、エクソン２４、エクソン２５、エクソン２６、エクソン２７、エクソン２８、エクソン２９、エクソン３０、エクソン３１、エクソン３２、エクソン３３、エクソン３４、エクソン３５、エクソン３６、エクソン３７、エクソン３８、エクソン３９、エクソン４０、エクソン４１、エクソン４２、エクソン４３、エクソン４４、エクソン４５、エクソン４６、エクソン４７、エクソン４８、エクソン４９、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、エクソン５３、エクソン５４、エクソン５５、エクソン５６、エクソン５７、エクソン５８、エクソン５９、エクソン６０、エクソン６１、エクソン６２、エクソン６３、エクソン６４、エクソン６５、エクソン６６、エクソン６７、エクソン６８、エクソン６９、エクソン７０、エクソン７１、エクソン７２、エクソン７３、エクソン７４、エクソン７５、エクソン７６、エクソン７７、エクソン７８、エクソン７９、イントロン領域、合成イントロン領域、断片、これらの組合せ、またはジストロフィン遺伝子もしくはｃＤＮＡ全体を含む、請求項６２または６３に記載の組成物。
前記挿入が、相同性により導かれる修復（ＨＤＲ）によるものである、請求項６２から７９のいずれか一項に記載の組成物。
前記ドナー鋳型が、一本鎖または二本鎖ポリヌクレオチドである、請求項６２から８０のいずれか一項に記載の組成物。
前記Ｃａｓ９またはＣｐｆ１の、ｍＲＮＡ、ｇＲＮＡ、およびドナー鋳型が、各々別個の脂質ナノ粒子へと製剤化されているか、またはこれらの全てが、脂質ナノ粒子へと共製剤化されている、請求項２６から８１のいずれか一項に記載の組成物。
前記Ｃａｓ９またはＣｐｆ１のｍＲＮＡが、脂質ナノ粒子へと製剤化されており、前記ｇＲＮＡおよびドナー鋳型の両方が、前記細胞へと、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターにより送達されることを特徴とする、請求項２６から８１のいずれか一項に記載の組成物。
前記Ｃａｓ９またはＣｐｆ１のｍＲＮＡが、脂質ナノ粒子へと製剤化されており、前記ｇＲＮＡが、前記細胞へと、電気穿孔により送達され、ドナー鋳型が、前記細胞へと、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターにより送達されることを特徴とする、請求項２６から８１のいずれか一項に記載の組成物。
前記ジストロフィン遺伝子が、Ｘ染色体：３１，１１７，２２８〜３３，３４４，６０９（ＧｅｎｏｍｅＲｅｆｅｒｅｎｃｅＣｏｎｓｏｒｔｉｕｍ：ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８）に位置する、請求項１から８４のいずれか一項に記載の組成物。
デュシェンヌ型筋ジストロフィーを伴う患者に由来する細胞内のジストロフィン遺伝子を編集するための、１または複数のガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）を含む組成物であって、前記１または複数のｇＲＮＡは、配列表の配列番号１〜１，４１０，４７２内の核酸配列からなる群から選択されるスペーサー配列を含む、組成物。
前記１または複数のｇＲＮＡが、１または複数の単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である、請求項８６に記載の組成物。
前記１もしくは複数のｇＲＮＡ、または１もしくは複数のｓｇＲＮＡが、１もしくは複数の修飾ｇＲＮＡ、または１もしくは複数の修飾ｓｇＲＮＡである、請求項８６または８７に記載の組成物。