KR20200115302A

KR20200115302A - Rna를 이용한 표적 dna 편집방법 및 조성물

Info

Publication number: KR20200115302A
Application number: KR1020200036538A
Authority: KR
Inventors: 남홍길; 윤귀염
Original assignee: 기초과학연구원; 재단법인대구경북과학기술원
Priority date: 2019-03-26
Filing date: 2020-03-26
Publication date: 2020-10-07

Abstract

본 발명은 RNA를 포함하는 표적 DNA 편집용 조성물, RNA를 이용하여 표적 DNA를 편집하는 방법 및 변이를 포함하는 표적 DNA에 상보적으로 결합하고, 변이를 포함하지 않는 정상 DNA와 동일한 서열을 가지는 RNA를 포함하는 항암제, 유전자 항상성을 유지 또는 향상시키기 위한 조성물 또는 노화 방지 또는 억제용 조성물에 관한 것이다.

Description

RNA를 이용한 표적 DNA 편집방법 및 조성물 {Method and compositions For Editing Target DNA Using RNA}

ZFN (zinc finger nuclease), TALEN (transcriptional activator-like effector nuclease), 및 CRISPR / Cas (clustered regularly interspaced repeat / CRISPR-associated)와 같은 RGEN (RNA-guided engineered nuclease)은 배양된 세포 및 개체의 유전체 교정에 널리 사용되고 있다. 이를 이용한 유전체 교정 기술은 생명과학, 생명공학 및 의학분야 등에서 다양한 목적으로 이용될 수 있다. 줄기세포 또는 체세포에서 표적화된 유전자 변형을 일으켜 다양한 유전적 질환 또는 후천적 질환에 대한 유전자 치료가 가능하게 되었다.

상동 재조합은 여러 형태의 생명에서 DNA 복구와 유전적 다양성과 관련된 DNA 대사에서 중요한 역할을 한다. 일반적으로 상동 재조합은 2개의 동일한 또는 거의 동일한 DNA 분자 사이에서 유전적 정보 교환을 포함한다 (Heyer, W. D., Ehmsen, K. T. & Liu, J. Regulation of homologous recombination in eukaryotes. Annu. Rev. Genet. 44, 113-139 (2010)). 그러나, RNA 바이러스에서와 같이 상동 재조합은 RNA 분자 사이에서도 일어날 수 있다.

건강한 삶을 영위하고, 자손에 정확한 유전정보 전달을 위해 게놈 무결정의 유지는 개체에 중요한 문제이다. 노화는 유전적 인자, 생활인자 및 환경 인자가 밀접하게 상호작용하는 멀티인자성 과정이다. 비정상적 전사물, 유전적 변이 및 게놈 손상 (예를 들어 DSB (Double Strand Break)의 축적과 같은 유전적 요인들이 노화의 원인이 된다. 게놈 무결성의 유지는 노화 과정을 조절하는 필수적인 것이다.

게놈의 기능에서 RNA의 중요한 역할을 이해하는 것에 대한 증가된 연구들이 보여진다. 전사, 전사후 및 유전자 조절의 에피제닉 메커니즘에서 다양한 범위의 기능을 가진다. RNA 질과 항상성의 조절은 게놈 무결성 유지에 필수적이다. 일단 DNA가 손상되면, 다양한 복구 메커니즘 캐스케이드가 재빠르게 활성화되어 DNA 이상을 보호한다.

다만, DNA 항상성을 유지하기 위해 RNA가 관여하는 것에 대하여는 연구가 적다.

이러한 기술적 배경하에서, 본 출원의 발명자들은 RNA를 통해 DNA를 편집할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 RNA를 포함하는 표적 DNA 편집용 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 목적은 RNA를 이용하여 표적 DNA를 편집하는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 목적은 RNA를 포함하는 항암제를 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 변이를 포함하는 표적 DNA에 상보적으로 결합하고, 변이를 포함하지 않는 정상 DNA와 동일한 서열을 가지는 RNA (non-coding RNA 포함)를 포함하는, 표적 DNA 편집(editing)용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 변이를 포함하는 표적 DNA에 상보적으로 결합하고, 변이를 포함하지 않는 정상 DNA와 동일한 서열을 가지는 RNA를 도입하여, 표적 DNA를 편집하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 변이를 포함하는 표적 DNA에 상보적으로 결합하고, 변이를 포함하지 않는 정상 DNA와 동일한 서열을 가지는 RNA를 포함하는 항암제를 제공한다. 본 발명은 변이를 포함하는 표적 DNA에 상보적으로 결합하고, 변이를 포함하지 않는 정상 DNA와 동일한 서열을 가지는 RNA를 포함하는, 암 치료제를 제공한다. 본 발명은 변이를 포함하는 표적 DNA에 상보적으로 결합하고, 변이를 포함하지 않는 정상 DNA와 동일한 서열을 가지는 RNA를 처리하는 단계를 포함하는 암 치료방법을 제공한다. 본 발명은 암 치료제 제조 용도로, 변이를 포함하는 표적 DNA에 상보적으로 결합하고, 변이를 포함하지 않는 정상 DNA와 동일한 서열을 가지는 RNA의 사용을 제공한다.

본 발명은 또한, 변이를 포함하는 표적 DNA에 상보적으로 결합하고, 변이를 포함하지 않는 정상 DNA와 동일한 서열을 가지는 RNA를 포함하는, 유전자 항상성을 유지 또는 향상시키기 위한 조성물을 제공한다. 본 발명은 변이를 포함하는 표적 DNA에 상보적으로 결합하고, 변이를 포함하지 않는 정상 DNA와 동일한 서열을 가지는 RNA를 처리하는 단계를 포함하는 유전자 항상성을 유지 또는 향상시키기 위한 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 변이를 포함하는 표적 DNA에 상보적으로 결합하고, 변이를 포함하지 않는 정상 DNA와 동일한 서열을 가지는 RNA를 포함하는, 노화 방지 또는 억제용 조성물을 제공한다. 본 발명은 변이를 포함하는 표적 DNA에 상보적으로 결합하고, 변이를 포함하지 않는 정상 DNA와 동일한 서열을 가지는 RNA를 처리하는 단계를 포함하는 노화 방지 또는 억제방법을 제공한다.

도 1은 비코딩 RNA로 DNA를 편집하는 실험 방법 구축을 도시한 것이다.
비코딩 RNA로 DNA를 편집하는 실험 방법 구축한 것에 대한 내용으로 단백질의 변이나 결실을 통해 형광 발현을 전혀 못하는 돌연변이 EGFP 유전자를 포함한 벡터를 제작하고, 여기에 상보적으로 결합하면서 정상적인 염기서열을 가진 비코딩 RNA를 포함하는 벡터를 제작하였다. 각각의 벡터를 세포에 넣어 발현시켰을 경우, RNA는 정상적으로 발현되나 형광은 전혀 발현하지 못하게 된다. (변이를 포함한 EGFP 발현 벡터 혹은 비코팅 RNA를 포함한 벡터) 하지만 이 두 벡터를 함께 넣어 줄 경우 정상 염기서열을 가진 비코딩 RNA에 의해 변이를 가진 EGFP의 DNA editing이 일어나 형광이 발현하게 되는 것을 확인할 수 있다.
도 1a. 유전자 편집의 개략도.
도 1b. 형광발현을 못하는 돌연변이 EGFP 유전자가 비코딩 RNA에 의해 정상적으로 고쳐져 형광을 보이게 되는 것을 인간 세포(293T)에 형질주입 후 형광현미경으로 확인.
도 2a, 2b 및 2c는 비코딩 RNA를 포함하는 조성물에서 mRNA 및 단백질 발현 수준을 qPCR 및 웨스턴 블랏으로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 3a은 비코딩 RNA로 단일 염기 치환 돌연변이 DNA 복원을 검증한 것으로 각각 RNA와 DNA 수준에서 염기 치환이 실제로 일어나 정상 염기서열로 편집되었음을 시퀀싱으로 검증하였다. 도 3b는 비코딩 RNA를 발현에 의한 형광발현을 못하는 EGFP 단백질의 발현 변화를 확인하였다.
도 4는 DNA 및 RNA 수준에서 변이 EGFP 유전자의 교정에 대하여 검증한 결과를 나타낸 것이다. 도 4a. 비코딩 RNA로 단일 염기 치환 및 결실 돌연변이 DNA 복원을 검증하는 방법의 모식도. 4b 및 4c. 비코딩 RNA로 단일 아미노산 결실 돌연변이 DNA 복원을 검증한 것으로 단일 염기 치환뿐만 아니라 결실도 정상 염기서열로 편집 가능함을 증명하였다.
도 5는 비코딩 RNA로 이중 아미노산 치환 돌연변이 DNA 복원을 검증한 결과를 나타낸 것이다. 이중 염기 쌍 변이의 교정 빈도 감소를 통해 상동 재조합 독립 돌연변이 복원을 검증한 것으로 상동 재조합으로 변이가 수정된다면 서로 가깝게 위치하는 이중 염기 쌍의 변이 교정 빈도는 단일 염기 변이 교정 빈도와 비슷해야 한다. 도 5a는 상동 재조합과 독립적으로 일어나기 때문에 교정 빈도가 감소함을 확인하였음을 나타낸 결과이다. 도 5b는 비코딩 RNA에 의한 정상 EGFP 유전자 발현을 단백질 수준에서 확인한 결과이다.
도 6은 DNA 간의 상동 재조합이 아닌, 비코딩 RNA가 단백질 변이 교정할 수 있음을 확인한 결과를 나타낸 것이다. 도 6a는 RNA 발현 시스템서만 RNA가 발현됨을 qPCR을 통해 검증하였다. 도 6b는 RNA 발현 시스템과 RNA 비 발현 시스템을 이용하여 상동 재조합 독립 돌연변이 복원을 확인한 실험으로, RNA를 발현하는 DNA를 넣어 준 경우보다 RNA를 발현하지 못하는 DNA를 넣어 준 경우 돌연변이 DNA 복원 효율이 현저히 감소함을 확인할 수 있다.
도 7은 RNA/DNA hybrid를 분해하는 RNaseH2A를 제거한 세포에서 변이 교정 빈도가 증가함을 확인하였다. 도 7a는 RNaseH2A를 제거한 세포에서 RNaseH2A의 단백질이 전혀 발현되지 않고, 다른 소단위인 RNaseH2C의 발현이 현저히 감소된 것을 확인하였다. 도 7b는 RNA 발현 시스템과 RNA 비 발현 시스템을 이용하여 RNaseH2A가 없을 경우, RNA 발현 유무에 의존하여 RNaseH2가 있는 경우에 비해 2배~2.8배까지 돌연변이 복원이 증가됨을 확인하였다. 도 7c는 Rad51 inhibitor로 상동 재조합을 막는 약물로 알려진 B02를 처리하여 돌연변이 복원과 상동 재조합의 관계를 재 검증하고자 하였다. 돌연변이 유전자와 같은 플라스미드에서 정상 RNA가 발현하는 경우는 B02 처리에 의해 돌연변이 복원 빈도가 크게 낮아졌지만, 돌연변이 유전자와 다른 플라스미드에서 RNA가 발현하는 경우 돌연변이 복원이 오히려 크게 증가하였다. 이를 통해 RNA에 의한 돌연변이 복원이 상동 재조합과 독립적임을 검증하였다. 이는 RNA가 직접 DNA와 hybrid를 통해 DNA editing을 한다는 간접적인 결과로 볼 수 있다.
도 8a은 짧은 RNA 올리고머를 이용한 돌연변이 복원을 검증한 것으로 짧은 RNA 올리고머 (17 mer, 30 mer)가 돌연변이 DNA에 직접 작용해 변이를 편집함을 확인한 결과를 나타낸 것이다. 도 8b는 초고속 유세포 자동분석 분리기로 8a의 짧은 RNA 올리고머를 이용한 돌연변이 복원을 정량하였다. 도 8c, 8d는 TP53 유전자의 빈발성 돌연변이 (recurrent mutation) R248Q를 가지고 직접 인간 세포주 게놈에 돌연변이를 유발할 수 있음을 미세방울디지털 유전자 증폭기를 통해 농도 의존적으로 검증하였다
도 9는 가벼운 스트레스 (mild-stress), 예를 들어, 혈청 제거 (Serum depletion) 및 산화 스트레스 (Oxidative stress, H₂O₂)는 돌연변이 EGFP 유전자의 복원을 1.8~2.0% 증가시킴을 확인하였다. 이는 환경의 변화에 의해 RNA의 게놈 교정이 더욱 빈번하게 일어날 수 있음을 시사한다.
도 10은 게놈 무결성을 유지하기 위해 변이 유전자 교정 과정에서 RNA 품질 제어 및 RNA 항상성이 필수적임을 보여주는 결과를 나타낸 것이다. 도 10a에서는 RNA 간섭을 이용하여 RNA 품질 제어 및 항상성에 필수적인 헬리카제의 발현을 감소(낙다운)시켰을 때, 돌연변이 복원이 현저하게 감소함을 초고속 유세포 자동분석 분리기를 통해 확인하였다. 도 10b 및 10c는 낙다운된 헬리카제의 발현을 RNA 및 단백질 수준에서 확인하였다. 도 10에서 Veh는 EGFP Q70X (or ΔT66_68) + empty vector, AS는 EGFP Q70X (or ΔT66_68) + antisense EGFP, S는 EGFP Q70X (or ΔT66_68) + sense EGFP (EGFP c. Δg61)를 나타낸다.
도 11a는 RNA 헬리카제 유전자의 낙다운이 EGFP 유전자 발현의 영향을 미치는지 확인하기 위해 초고속 유세포 자동분석 분리기로 EGFP의 형광 발현 정도를 확인하였다. 도 11b은 RNA 헬리카제의 낙다운이 돌연변이 EGFP 발현에 영향이 없음을 검증하였고, 도 11c는 낙다운된 RNA 헬리카제의 mRNA 발현 감소를 검증하였다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명에 따르면, 인간 세포에서 RNA에 의한 DNA 변이를 수정하는 것에 대한 평가 시스템을 구축하였다. 비변형 RNA 올리고 뉴클레오티드가 DNA 변이를 수정할 수 있음을 확인하였다. 또한, RNA 올리고 뉴클레오티드는 게놈 변형을 위한 템플레이트로서의 역할을 하였다. RNA 헬리카제 (helicase)의 Knock-down에 의해 DNA 교정 빈도가 감소하였으며, RNA 상태와 항상성 조절은 게놈 무결성을 위해 중요함을 확인하였다. RNA 트랜스크립트의 신규 기능을 제공하며, DNA에 유전정보를 전달하여 게놈 무결성을 유지할 수 있다.

본 발명은 일 관점에서, 변이를 포함하는 표적 DNA에 상보적으로 결합하고, 변이를 포함하지 않는 정상 DNA와 동일한 서열을 가지는 RNA (non-coding RNA)를 포함하는, 표적 DNA 편집(editing)용 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 변이를 포함하는 표적 DNA에 상보적으로 결합하고, 변이를 포함하지 않는 정상 DNA와 동일한 서열을 가지는 RNA를 도입하여, 표적 DNA를 편집하는 방법에 관한 것이다.

노화가 되면서 RNA의 질은 나빠지고 이것은 유전체의 항상성 유지를 저해하게 된다. 본 발명에서는 30 nt의 짧은 RNA가 게놈의 변이를 수정하여 유전체의 항상성을 유지하는데 중요한 역할을 할 수 있음을 실험적으로 확인하였다. 이러한 RNA의 새로운 기능을 규명함으로 노화뿐만 아니라 유전자 변이로 인한 질병을 억제하는 기전을 찾는데 기여하고, RNA를 이용한 유전자 치료요법 개발에 응용할 수 있다.

RNA의 98% 이상이 인간에 중요한 역할을 하는 비코딩 RNA이고, 풍부한 비코딩 RNA는 게놈의 무결성을 유지하기 위한 유전 정보 저장고 역할을 할 가능성이 있다. 이를 고려하여, 본 명세서에서 "RNA"는 비코딩 RNA일 수 있으며, 상기 비코딩 RNA는 단백질로 번역되지 않는 단백질을 코딩하지 않는 RNA를 의미하고, 이러한 RNA는 게놈(genome)으로부터 전사되며, 단백질로 번역되지 않는다. 다만, RNA 수준에서 생물학적 기능을 수행할 수 있다. 본 발명에서는 RNA에 의한 DNA 편집 방법을 구축하고자 protein coding을 하지 못하고, RNA만 발현하는 비코딩 RNA 사용하였다.

상기 RNA는 예를 들어, 15mer 이상일 수 있다. 상기 RNA는 예를 들어, 100mer 이하일 수 있다. 상기 RNA는 예를 들어, 10-100mer, 12-80mer, 15-40mer, 17-40mer, 10mer, 11mer, 12mer, 13mer, 14mer, 15mer, 16mer, 17mer, 18mer, 19mer, 20mer, 21mer, 22mer, 23mer, 24mer, 25mer, 26mer, 27mer, 28mer, 29mer, 30mer의 길이를 가질 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 17mer 또는 30mer의 길이를 가지는 비코딩 RNA를 사용하여 DNA를 편집할 수 있음을 확인하였다.

DNA 변이는 세포 예를 들어, 진핵세포에서 유전자 변형에 의해 이에 의해 발현되는 단백질의 활성 등이 정상 상태와 다르게 된 것을 의미한다.

상기 RNA는 DNA 변이를 포함하는 뉴클레오타이드 서열과 상보적으로 결합하며, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100%의 서열 상보성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 의미할 수 있다.

상기 RNA는 변이를 포함하지 않는 정상 DNA와 동일한 서열을 가지며, 정상 기능을 가지거나 변이에 의해 기능을 나타내지 않는 단백질을 코딩하는 mRNA의 센스 또는 안티센스에 해당할 수 있다. 본 발명의 구체적 실시예에 따르면, 특정 유전자의 게놈 변이는 센스 RNA 올리고뉴클레오티드 에서 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드에 비해 높은 빈도로 발생함을 확인하였다.

RNA는 변이를 포함하지 않는 정상 DNA와 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100%의 서열 상보성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 의미할 수 있다.

DNA 편집은 RNA가 DNA 변이 부위에 상보적으로 결합하여, 변이를 고치는 것뿐 아니라, DNA에 의해 코딩되는 단백질의 기능을 정상화하는 것을 의미한다.

하나의 실시예에서 엑스 비보 (ex vivo) 또는 인 비보(in vivo)에서 진핵세포의 DNA를 편집할 수 있다. 진핵세포는 효모, 곰팡이, 원생동물 (protozoa), 식물, 고등 식물 및 곤충, 또는 양서류의 세포, 또는 CHO, HeLa, HEK293, 및 COS-1과 같은 포유 동물의 세포일 수 있고, 예를 들어, 당업계에서 일반적으로 사용되는, 배양된 세포 (인 비트로 (in vitro)), 이식된 세포 (graft cell) 및 일차 세포 배양 (인 비트로 및 엑스 비보), 및 인 비보 세포, 및 또한 인간을 포함하는 포유동물의 세포 (mammalian cell)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 유기체는 효모, 곰팡이, 원생동물, 식물, 고등 식물 및 곤충, 양서류, 또는 포유 동물일 수 있다.

상기 RNA가 클로닝된 벡터를 도입하여 표적 DNA를 편집할 수 있다.

구체적 일실시예에 따르면, 형광이 발현하지 않는 돌연변이 (Q70X, R97C, G92D, deletion K141 and deletion T66-68) EGFP 유전자에 대한 단백질 비코딩 EGFP RNA (wild-type)-발현 벡터 시스템을 통해 변이를 고쳐 정상적이 단백질을 만드는 것을 확인하고, (b) 시퀀싱을 통해 실제 DNA 및 RNA 서열 변화로 인한 단백질의 형질 변화임을 검증하였으며, 이러한 형질 변화는 DNA 상동 재조합 기전과 독립적으로 DNA의 변이를 고칠 수 있으며, 짧은 비코딩 RNAs 올리고머 (30 mer)에 의해서도 DNA 변이를 고칠 수 있음을 확인하였다.

상기 벡터는 바이러스 벡터일 수 있다. 상기 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 아데노바이러스 파보바이러스 (예컨대, 아데노관련 (adenoassociated) 바이러스(AAV)), 코로나바이러스, 오르소믹소바이러스 (orthomyxovirus)와 같은 음성 가닥 RNA 바이러스들 (예컨대 인플루엔자 바이러스), 랩도바이러스(rhabdovirus) 예컨대, 광견병 및 소포성 구내염 바이러스), 파라믹소바이러스(paramyxovirus) (예컨대, 홍역 및 센다이 (Sendai), 알파바이러스 (alphavirus) 및 피코르나바이러스(picornavirus))와 같은 양성 가닥 RNA 바이러스들, 및 헤르페스바이러스 (예컨대, 단순포진(Herpes Simplex) 바이러스 타입들 1 및 2, 엡스타인(Epstein)-바(Barr) 바이러스, 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus)), 아데노바이러스를 포함하는 이중-가닥의 DNA 바이러스들, 폭스바이러스(poxvirus) (예컨대, 우두(vaccinia), 계두(fowlpox) 또는 카나리아두창(canarypox)) 등일 수 있다.

상기 벡터는 각각 전기천공법 (electroporation), 리포펙션, 바이러스 벡터, 나노파티클 (nanoparticles) 뿐만 아니라, PTD (Protein translocation domain) 융합 단백질 방법 등을 통해 생체 내 또는 세포 내로 전달될 수 있다.

더욱이, 본 발명은 변이를 포함하는 표적 DNA에 상보적으로 결합하고, 변이를 포함하지 않는 정상 DNA와 동일한 서열을 가지는 RNA를 포함하는 항암제에 관한 것이다.

상기 변이가 암을 유발하는 변이인 경우, 변이를 포함하는 세포는 변이에 의해 정상세포와 다르게 질병 상태에 있는 세포, 예를 들어 암 세포일 수 있다.

상기 암 세포 특이적 변이를 포함하는 표적 DNA에 상보적으로 결합하고, 암 세포 특이적 변이를 포함하지 않는 정상 DNA와 동일한 서열을 가지는 RNA를 개체에 투여하여, 암 치료제로 사용할 수 있다.

본 발명은 변이를 포함하는 표적 DNA에 상보적으로 결합하고, 변이를 포함하지 않는 정상 DNA와 동일한 서열을 가지는 RNA를 포함하는, 유전자 항상성을 유지 또는 향상시키기 위한 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 변이를 포함하는 표적 DNA에 상보적으로 결합하고, 변이를 포함하지 않는 정상 DNA와 동일한 서열을 가지는 RNA를 환자에 투여하는 단계를 포함하는 유전자 항상성을 유지 또는 향상시키기 위한 방법에 관한 것이다.

상기 유전자 항상성은 유전자 불안정성 및/또는 이에 의한 병리학적 상태, 예를 들어, 유전자 치환 또는 결실에 의해 유래되는 유전자 변이를 제거하여 유지 또는 향상될 수 있다.

본 발명에 따르면, 변이를 포함하는 표적 DNA에 상보적으로 결합하고, 변이를 포함하지 않는 정상 DNA와 동일한 서열을 가지는 RNA를 통해 정상세포 수준으로 유전자 항상성을 유지 또는 유전자 불안정성을 회복시킬 수 있다.

상기 유전자 불안정성에 의해 체세포의 노화 또는 노화와 관련된 병리학적 상태가 유발될 수 있다. 이에 따라, 본 발명은 변이를 포함하는 표적 DNA에 상보적으로 결합하고, 변이를 포함하지 않는 정상 DNA와 동일한 서열을 가지는 RNA를 포함하는 항노화, 즉 노화의 예방 또는 억제용 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 변이를 포함하는 표적 DNA에 상보적으로 결합하고, 변이를 포함하지 않는 정상 DNA와 동일한 서열을 가지는 RNA를 노화 또는 노화 관련 질환의 개선을 요구하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 노화의 예방 또는 억제방법에 관한 것이다.

실시예

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 단백질 비코딩 RNA에 의한 DNA 변이 복원

나이에 따라 전사체 (transcriptome)을 분석하여 보고하였다. 젊은 개체와 비교하여 나이 든 개체에서 변이를 포함하는 비정상적 트랜스크립트 (transcript)가 많았다. 따라서, RNA가 게놈 무결성 유지의 풀 (pool)로 작용한다고 가정했다. 흥미롭게도, RNA는 Rad52 유래 반대 가닥과의 교환을 통해 RNA 함유 올리고머 또는 RNA 자체를 사용하여 DSB 복원에 핵심 기능을 한다. 또한, 리보 뉴클레오타이드(ribonucleotide)가 유전 정보를 DNA/RNA 키메라 형태로 대장균 및 효모 게놈에 전달할 수 있음을 입증했다. 게놈으로 도입된 RNA는 변이 특성으로 인해 DNA mismatch repair (MMR) 시스템과 RNaseH1 또는 RNaseH2에 의해 제거될 수 있다. 따라서, RNA 트랜스크립트가 유전자를 변형시킬 수 있다고 추정했다. 비코딩 RNA로 DNA를 편집하는 실험 방법 구축한 것에 대한 내용으로 단백질의 변이나 결실을 통해 형광 발현을 전혀 못하는 돌연변이 EGFP 유전자를 포함한 벡터를 제작하고, 여기에 상보적으로 결합하면서 정상적인 염기서열을 가진 비코딩 RNA를 포함하는 벡터를 제작하였다. 정상적인 EGPF 유전자 기능을 하지 못하는 EGFP의 형광 소멸 돌연변이 (Q70X, R97C, G92D, Q70XG92D, K141Del 또는 T66_68Del)와 단백질 비코딩 EGFP 플라스미드 (asEGFP : antisense EGFP) 또는 c.g61Del (sense EGFP))를 구축하였다 (표 1). 이러한 구조에서 mRNA 및 단백질 수준은 qPCR 및 웨스턴 블럿 분석을 통해 각각 평가하였다 (도 2).

사용된 야생형 EGFP, asEGFP 및 Sense EGFP (c.g61Del)의 구체적 서열은 다음과 같다:

도 1에 따르면, 각각의 벡터를 세포에 넣어 발현시켰을 경우, RNA는 정상적으로 발현되나 형광은 전혀 발현하지 못하게 된다 (변이를 포함한 EGFP 발현 벡터 혹은 비코팅 RNA를 포함한 벡터). 그러나, 벡터를 함께 넣어 줄 경우 정상 염기 서열을 가진 비코딩 RNA에 의해 변이를 가진 EGFP의 DNA 편집이 일어나 형광이 발현하게 되는 것을 확인할 수 있다.

[표 1]

도 2에 따르면, 모든 EGFP 플라스미드는 적절하게 전사된 mRNA를 가진다. 형광 소멸 변이 EGFP 플라스미드 또는 단백질 비코딩 EGFP 플라스미드의 단일 발현에서는 녹색 형광이 보이지 않았다 (도 1b 및 도 2a). 형광 소멸 변이와 형광 소멸 변이의 서열에 대응하는 레퍼런스 서열을 포함하는 단백질 비코딩 EGFP의 동시 발현에 의해 변이 EGFP의 형광이 회복되었다 (도 1b 및 표 2). 이러한 데이터는 레퍼런스 서열을 갖는 RNA가 DNA 또는 RNA 수준에서 EGFP 변이를 교정할 수 있음을 시사하고 있다.

변이 교정이 DNA 또는 RNA 수준에서 일어난 것인지 확인하고자 하였다. 초고속 유세포 자동분석 분리기 (flow cytometry)를 이용하여 형광 회복된 세포의 빈도를 분석하였다. asEGFP에 의해 변이 교정된 빈도는 안티센스 RNA의 저해 효과 때문에 센스 EGFP에 비해 14-31배 낮았다 (표 2).

[표 2]

DNA 또는 RNA 수준에서 변이 회복 여부를 확인하기 위해 초고속 유세포 자동분석 분리기를 이용하여 형광 양성 세포를 분리하였고, DNA 또는 RNA (cDNA 형태)로 시퀀싱하였다 (도 3a 및 도 4a). RNA 뿐 아니라 DNA 수준에서 변이 서열은 변화하였다(도 3a, 도 4b 및 도 4c). K141의 결실 EGFP 변이의 경우, 두 가닥의 DNA가 완전히 교정된 경우와 야생형과 K141 결실 변이를 동시에 가지고 있는 이종 유형 (Hetero type)의 DNA도 발견하였다 (도 4c). G92D 변이 및 결실 변이에서 단백질 수준은 sense EGFP에서 약간 회복되었다 (도3b 및 도5b). EGFP 돌연변이의 발현은 asEGFP로 감소하였고, 유전자 변이의 교정 및 안티센스 RNA에 의한 유전자 발현의 조절은 독립적 가능성이 있음을 암시한다 (도 1a 및 표 2).

실시예 2. 상동성 재조합과 독립적인 단백질 비코딩 RNA에 의한 변이 교정 확인

앞서 구축한 플라스미드 DNA 발현 시스템은 EGFP gene의 변이를 제외하고 매우 상동성을 나타낸다. 변이가 상동성 재조합에 의해 교정되는지 평가하기 위하여, 이중 치환 변이체를 구축하였으며, 인접한 변이 Q70XG92D를 포함한다 (도 2a). 도 5a 및 도 5b에 나타낸 바와 같이, Q70XG92D EGFP 변이체에서 녹색 형광의 빈도 복원은 단일 치환 변이체 (Q70X 또는 G92D)와 비교하여 36~44% 감소함을 보여주었다 (표 3). 녹색 형광 회복의 정도와 상응하게 단백질이 발현되었다 (도 5b).

[표 3]

Lac 프로모터를 포함하는 포유동물 세포에서 RNA 비 발현 플라스미드를 제작 (Lac_asEGFP and Lac_senseEGFP) 하였다 (도 6a). RNA가 전사되지 않은 경우, 변이 교정의 빈도는 RNA 발현 플라스미드와 비교하여 43% 이상 감소하였다 (도 6b 및 표 4).

[표 4]

이러한 결과는 DNA 상동성 재조합과 독립적으로 RNA가 DNA 변이 교정에 대한 템플레이트로 직접 역할함을 입증한다.

[표 5]

또한, RNA/DNA hybrid를 분해하는 RNaseH2A를 제거한 세포에서 변이 교정 빈도가 증가함을 검증하였다. RNA 발현 시스템과 RNA 비 발현 시스템을 이용하여 RNaseH2A가 없을 경우, RNA 발현 유무에 의존하여 RNaseH2가 있는 경우에 비해 2배~2.8배까지 돌연변이 복원이 증가됨을 확인하였다 (도 7a, 7b 및 표 5). 또한 상동 재조합을 막는 Rad51 inhibitor인 B02 처리를 하였을 때, 돌연변이 복원이 오히려 크게 증가하는 결과를 통해 돌연변이 복원이 상동 재조합과 독립적으로 일어나는 또 다른 기전임을 입증하였다 (도 7c).

실시예 3. 짧은 길이의 RNA 올리고뉴클레오티드가 게놈으로 유전 정보 전달함을 확인

RNA가 직접 DNA에 유전 정보를 전달할 수 있는지 여부를 조사하기 위해, EGFP Q70X의 변이 서열 영역에 상동성을 가지면서, 기능적인 EGFP 유전자를 복원하기 위한 레퍼런스 서열을 포함하는 비변형 짧은 길이의 RNA 올리고 뉴클레오티드를 설계하였다.

17 nt 및 30 nt RNA 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 상동 재조합의 가능성을 줄였다. 50 nt RNA 올리고뉴클레오티드에 의한 변이 교정은 거의 관찰되지 않았다 (데이터는 나타내지 않음). RNA 올리고뉴클레오티드를 넣어 준 세포에서 녹색 형광 세포 관찰을 통해, RNA 올리고뉴클레오티드가 형광 기능 상실 EGFP 유전자의 복구에 직접 관여하고 있음을 시사한다 (도 8a 및 8b). RNA의 안정성이 EGFP 유전자를 표적으로 하는 것에 영향을 주기 때문에, EGFP 유전자 변이의 복구 효율이 낮았다. 뉴클레아제 또는 기타 제거 기작 등은 RNA 올리고뉴클레오티드를 분해하기 때문이다 (도 8b). 게놈 DNA 변형이 짧은 길이의 RNA 올리고뉴클레오티드에 의해 유도됨을 확인하였다. TP53 유전자를 표적으로 하는 RNA 올리고뉴클레오티드를 제작하였다. TP53 핫스팟 변이인 R175H 및 R248Q 등은 인간의 암에서 가장 빈번하게 일어나는 체세포 변이이다. 게놈 DNA 변이 빈도가 낮기 때문에, 0.1% 미만 변이 대립 유전자를 식별할 수 있는 미세방울디지털 유전자 증폭기 (ddPCR (digital droplet PCR))에서 TP53 유전자 변이를 분석했다 (도 8c 및 8d).

[표 6]

놀랍게도 인간 세포에서 TP53 게놈 변이는 R175H 또는 R248Q 변이 서열 포함 센스 올리고뉴클레오티드 각각에서 0.59 또는 0.49%로 발생하였고, 이는 상대적으로 안정적이라고 알려진 double stranded RNA 보다 현저하게 높은 효율로 변이를 전달하였다 (표 6).

[표 7]

TP53 유전자를 표적으로 하는 RNA 올리고뉴클레오티드는 다른 인간 암세포에서도 TP53 게놈 변이를 일으킬 수 있음을 확인하였다 (표 7).

안티센스의 경우 TP53 유전자가 센스 올리고뉴클레오티드에 비해 7배 낮은 효율로 변환되었고, 가닥에 대한 변이를 나타내는 것으로 보인다. 이 결과는 RNA 올리고뉴클레오티드에 의한 EGFP 플라스미드 DNA의 복구에 대하여, 관찰된 결과와는 반대의 가능성을 나타내는 것으로 보인다 (도 8b). 이러한 데이터는 짧은 길이의 RNA 올리고뉴클레오티드가 DNA 손상 조건 없이 상당히 높은 효율로 인간 게놈에 유전 정보를 직접적으로 전달할 수 있음을 보여준다. 또한 세포의 가벼운 스트레스가 교정 빈도를 높이는 것을 검증함으로 환경의 변화가 RNA의 게놈 교정에 영향을 줄 수 있음을 시사했다 (도 9).

실시예 4. 변이 유전자 교정 과정에서 RNA 항상성 유지의 중요성을 확인

노화 조절에서 RNA 헬리카제, smg-2 (Regulator of nonsense transcripts 1) 및 hel-1 (Spliceosome RNA helicase DDX39B homolog)의 기능은 중요하다. smg-2 인간 homolog는 UPF1 (UPF1 RNA helicase and ATPase)으로, 낙아웃 (knock-out)에 의해 배아 발달 장애를 일으켜 치명적이며, 주로 mRNA 감시를 위한 논센스 매개 mRNA 파괴 (nonsense-mediated mRNA decay)의 중심 분자 역할을 한다. hel-1은 human DDX39A 또는 DDX39B (DExD-box helicase 39)에 상동성을 나타내며, mRNA 스플라이싱 및 핵의 이동에 중요한 요인이다. 증가하는 비정상 RNA 트랜스크립트 및 게놈의 불안정성은 노화의 지표 중 하나로 고려되고 있다. RNA 항상성은 게놈 무결성을 유지하고, 잠재적으로 유해한 단백질 생산을 방지하는데 필수적이다. RNA에 대한 제어가 가능한지 확인하고, RNA에 의한 유전자 교정에 RNA 항상성이 중요한지 확인하기 위해, RNA 간섭을 통한 UPF1 또는 DDX39 낙다운 세포에서 변이 EGFP 유전자를 복구하는 실험을 진행하였다.

DDX39A 및 DDX39B는 파라로그 (paralog)이기 때문에, DDX39 결핍 세포를 위해 2개의 유전자 모두를 낙다운하였다. 이에 따라, UPF1 또는 DDX39의 결함에 의해 형광 양성 세포의 빈도는 유의하게 감소하였다 (도 10a). UPF1 및 DDX39의 낙다운에 의해 단일 치환 돌연변이에 대해서는 형광 세포 복구 빈도가 각각 49%와 43% 감소하였고, 결실 돌연변이에 대해서는 29%와 52%로 각각 감소하였다. 이러한 결과는 UPF1 및 DDX39가 단일 유전자 변이 및 결실 변이의 회복에 다르게 기능할 수 있음을 의미한다. UPF1 또는 DDX39의 RNA 발현 결핍과 단백질 수준을 qPCR (도 10b 및 11c)과 웨스턴 블롯 분석을 통해 각각 검증(도 10c)하였다. 또한 RNA 헤리카제 유전자의 낙다운이 EGFP 유전자 발현 자체에는 영향을 미치지 않음도 확인하였다(도 11a 및 11b). 이러한 데이터를 통해 RNA 질 조절 및 항상성이 RNA에 의한 DNA 변이에 중요한 역할을 함을 나타낸다.

이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Institute for Basic Science Daegu Gyeongbuk Institute of Science and Technology <120> Method and compositions For Editing Target DNA Using RNA <130> 300 <150> KR KR19/0034199 <151> 2019-03-26 <160> 20 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 720 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pEGFP-N1 EGFP wild-type <400> 1 atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagttggac 60 ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120 ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180 ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240 cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300 ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360 gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420 aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480 ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540 gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg 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Claims

변이를 포함하는 표적 DNA에 상보적으로 결합하고, 변이를 포함하지 않는 정상 DNA와 동일한 서열을 가지는 RNA (RNA)를 포함하는, 표적 DNA 편집(editing)용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 RNA는 벡터에 삽입된 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서, 상기 RNA는 10-100mer의 길이를 가지는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서, 상기 RNA는 변이를 포함하는 표적 DNA에 대한 센스 올리고뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서, 엑스 비보(ex vivo) 또는 인 비보(in vivo)에서 진핵세포의 DNA를 편집하는 것을 특징으로 하는 조성물.
변이를 포함하는 표적 DNA에 상보적으로 결합하고, 변이를 포함하지 않는 정상 DNA와 동일한 서열을 가지는 RNA를 도입하여, 표적 DNA를 편집하는 방법.
제6항에 있어서, 상기 RNA는 벡터에 삽입된 것을 특징으로 하는 방법.
제6항에 있어서, 상기 RNA는 10-100mer의 길이를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
제6항에 있어서, 상기 RNA는 변이를 포함하는 표적 DNA에 대한 센스 올리고뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 조성물.
제6항에 있어서, 엑스 비보(ex vivo) 또는 인 비보(in vivo)에서 진핵세포의 DNA를 편집하는 것을 특징으로 하는 방법.
변이를 포함하는 표적 DNA에 상보적으로 결합하고, 변이를 포함하지 않는 정상 DNA와 동일한 서열을 가지는 RNA를 포함하는, 암 치료용 조성물.
변이를 포함하는 표적 DNA에 상보적으로 결합하고, 변이를 포함하지 않는 정상 DNA와 동일한 서열을 가지는 RNA를 포함하는, 암 치료제.
변이를 포함하는 표적 DNA에 상보적으로 결합하고, 변이를 포함하지 않는 정상 DNA와 동일한 서열을 가지는 RNA를 처리하는 단계를 포함하는 암 치료방법.
변이를 포함하는 표적 DNA에 상보적으로 결합하고, 변이를 포함하지 않는 정상 DNA와 동일한 서열을 가지는 RNA를 포함하는, 유전자 항상성을 유지 또는 향상시키기 위한 조성물.
변이를 포함하는 표적 DNA에 상보적으로 결합하고, 변이를 포함하지 않는 정상 DNA와 동일한 서열을 가지는 RNA를 포함하는, 노화 방지 또는 억제용 조성물.