JP2019503657A - 昆虫フェロモンの生成のための微生物及び関連する化合物 - Google Patents
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Abstract
Description
本願に付随する配列表は紙の複製物の代わりにテキスト形式で提供され、及び本明細書によって参照により本明細書に援用される。配列表を含むテキストファイルの名称は、PRVI_007_02WO_SeqList_ST25.txtである。このテキストファイルは約54KBであり、2016年11月15日に作成されており、EFS−Webから電子的に提出されるものである。
本願は、昆虫フェロモン、フレグランス、フレーバー、及びポリマー中間体として有用であり得る不飽和C6〜C24脂肪アルコール、アルデヒド、及びアセテートの生合成に有用な組換え微生物に関する。本願は、本組換え微生物を使用して不飽和C6〜C24脂肪アルコール、アルデヒド、及びアセテートを生成する方法、並びにこれらの化合物の1つ以上及び/又は本組換え微生物を含む組成物に更に関する。
世界的な食糧需要の増大に伴い、有効な害虫防除の必要性が高まっている。従来の殺虫剤は、容易に入手可能で即効性があり、且つ確実性が高いため、最も普及している化学防除剤の1つである。しかしながら、これらの化学薬品の過剰使用、誤用、及び乱用が、耐性のある害虫、自然生態系の改変、及びある場合には環境被害につながっている。
本願は、不飽和C6〜C24脂肪アルコール、アルデヒド、及びアセテートから選択される1つ以上の化合物を生成する生合成経路を有する組換え微生物に関する。本明細書に記載される組換え微生物は、不飽和C6〜C24脂肪アルコール、アルデヒド、及びアセテートから選択される、昆虫フェロモン、フレグランス、又はフレーバー剤などの少なくとも1つの化合物の生成に用いられ得る。
本開示の例示的実施形態を図面に示す。
配列番号1〜配列番号38の配列表は本願の一部であり、参照によって本明細書に援用される。この配列表は本文書の末尾に提供される。
定義
本開示を解釈する際、以下の定義及び略記を用いるものとする。
本開示は、低コスト原料から高価値の生成物を費用効率良く生産する新規技術の必要性に対処するものである。具体的には、本発明者らは、合成昆虫フェロモン、フレグランス、フレーバー、及びポリマー中間体を含めた広範囲に及ぶ不飽和C6〜C24脂肪アルコール、アルデヒド、及びアセテートを低コスト原料から生成する能力を有する組換え微生物の開発によってこの必要性に対処した。従って、本開示の態様は、低コスト原料から高価値産物を生成するように組換え微生物を改変することができ、それにより高価値産物を生成するための従来の合成方法を回避し得るという本発明者らの発見に基づく。
上記に記載したとおり、本開示の実施形態は、組換え微生物を用いた1つ以上の昆虫フェロモンの合成を提供する。フェロモンは、種内における化学的コミュニケーション機能のため特定の昆虫によって分泌される揮発性の化学的化合物である。即ち、フェロモンは、同じ種のメンバーに社会的反応を惹起する、分泌又は排泄される化学的因子である。とりわけ、警報フェロモン、食物の道標フェロモン、性フェロモン、集合フェロモン、自己顕示フェロモン、解発フェロモン、起動フェロモン、及び縄張りフェロモンがあり、これらは行動又は生理に影響を及ぼす。
本開示は、脂肪アシル基質を対応する不飽和脂肪アシル基質に不飽和化する酵素を記載する。
本開示は、脂肪アシル基質を対応する脂肪アルコール又はアルデヒドに還元する酵素を記載する。
本開示は、脂肪酸を対応する脂肪アシル−ACPに結合させる酵素を記載する。
本開示は、脂肪酸における炭素鎖の伸長を触媒する酵素を記載する。
本開示は、脂肪アルデヒドの脂肪アルコールへの変換を触媒する酵素を記載する。一部の実施形態では、脂肪アルデヒドの脂肪アルコールへの変換を触媒するためアルコールデヒドロゲナーゼ(ADH、表3)が使用される。アルカン代謝活性型生物、蛍光菌(Pseudomonas fluorescens)NRRL B−1244(Hou et al. 1983)、シュードモナス・ブタノボラ(Pseudomonas butanovora)ATCC 43655(Vangnai and Arp 2001)、及びアシネトバクター属種(Acinetobacter sp.)株M−1(Tani et al. 2000)から同定された幾つものADHが、短鎖〜中鎖アルキルアルコール(C2〜C14)に対して活性があることを示す。加えて、Sigmaから市販されているADH、ウマ肝臓ADH及びパン酵母ADHが、長さC10以上の基質に対する検出可能な活性を有する。より長鎖の脂肪アルコールに対する既報告の活性は、基質の難可溶化の影響を受け得る。Sigmaの酵母ADHは、C12〜C14アルデヒドに対する活性がほとんど乃至全くないことが(Tani et al. 2000)によって観察され、しかしながら、C12及びC16ヒドロキシ−ω−脂肪酸に対する活性は観察されている(Lu et al. 2010)。最近になって、LadAヒドロキシラーゼを用いてC15〜C36アルカンを分解する生物であるゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス(Geobacillus thermodenitrificans)NG80−2から2つのADHが特徴付けられた。両方のADHにメタノールから1−トリアコンタノール(C30)への活性が検出され、ADH2については1−オクタノール及びADH1についてはエタノールが好ましい基質であった(Liu et al. 2009)。
本開示は、脂肪アルコールを脂肪アルデヒドに酸化する酵素を記載する。
本開示は、アルコールを脂肪アセテートに変換する酵素を記載する。
アシル−ACPチオエステラーゼは、アシル−ACPから、デノボ脂肪酸生合成により合成された遊離脂肪酸を放出する。この反応は脂肪酸生合成を終了させる。植物では、脂肪酸生合成はプラスチドで起こり、従ってプラスチド局在アシル−ACPチオエステラーゼが必要である。全ての植物の栄養組織においてアシル−ACPチオエステラーゼの主な生成物はオレイン酸塩(C18:0)、及びそれより程度は少ないがパルミチン酸塩(C16:0)である。放出された遊離脂肪酸はプラスチドエンベロープにおいて補酵素Aと再エステル化され、プラスチドから運び出される。
本開示は、組換え微生物によってコードされる毒性タンパク質、ペプチド、又は小分子を記載する。一部の実施形態では、毒性タンパク質、ペプチド、又は小分子は昆虫フェロモンと共に生合成的に生成される。
上記で考察したとおり、第1の態様において、本開示は、飽和C6〜C24脂肪アシル−CoAの内因性又は外因性供給源から一不飽和又は多価不飽和C6〜C24脂肪アルコールを生成する能力を有する組換え微生物に関する。第1の態様の例示的な実施形態を図1に示す。青色の線は、不飽和脂肪アシルCoA変換の基質としての役割を果たす飽和アシル−CoAの生成に用いられる生化学的経路を示す。基質の不飽和脂肪アシル−CoAへの変換は、宿主の内因性又は外因性酵素によって実施されてもよい。緑色の線は、酵素をコードする外因性核酸分子によって触媒される変換を示す。従って、一部の実施形態では、飽和脂肪アシル−CoAの一不飽和又は多価不飽和脂肪アシル−CoAへの変換は、外因性核酸分子によってコードされる少なくとも1つのデサチュラーゼによって触媒される。更なる実施形態では、一不飽和又は多価不飽和脂肪アシル−CoAの一不飽和又は多価不飽和脂肪アルコールへの変換は、外因性核酸分子によってコードされる少なくとも1つのレダクターゼによって触媒される。灰色の破線は、アルコールオキシダーゼ又は酸化剤を用いた一不飽和又は多価不飽和脂肪アルデヒドの生成、及びアセチルトランスフェラーゼ又はアセチルクロリドなどの化学物質を用いた一不飽和又は多価不飽和脂肪アセテートの生成など、フェロモン、フレグランス、フレーバー、及びポリマー中間体の合成の下流ステップを示す。赤色のバツ印は宿主にとって天然の経路の欠失又は下方制御を示し、これは改変経路へのフラックスを増加させる。
本開示は、様々な外因性酵素を発現するように改変することのできる微生物を提供する。
組換え微生物の酵素は、基質の生成物への変換の1つ以上の側面が向上するように改変することができる。本開示の方法での使用向けに更に改変し得る酵素の非限定的な例としては、デサチュラーゼ(例えば、脂肪アシル−CoAデサチュラーゼ又は脂肪アシル−ACPデサチュラーゼ)、アシル−ACPシンテターゼ、脂肪酸シンテターゼ、脂肪酸シンターゼ複合体、アセチルトランスフェラーゼ、デヒドロゲナーゼ、及びアルコールオキシダーゼ、及びこれらの組み合わせが挙げられる。これらの酵素は、触媒活性の向上、選択性の向上、安定性の向上、様々な発酵条件(温度、pH等)に対する耐性の向上、又は様々な代謝基質、生成物、副生成物、中間体等に対する耐性の向上のため改変することができる。
本明細書に記載される様々な実施形態において、本明細書に記載される生合成経路に関与する組換え微生物の外因性及び内因性酵素は過剰発現させてもよい。
本開示は、組換え微生物によって合成された生成物を下流生成物に変換するために用いることのできる化学変換を記載する。
Mはルテニウム又はオスミウムであり;
L及びL’は、各々独立して、任意の中性電子供与体リガンドであり、ホスフィン、スルホン化ホスフィン、ホスフィト、ホスフィニト、ホスホニト、アルシン、スチブナイト、エーテル、アミン、アミド、イミン、スルホキシド、カルボキシル、ニトロシル、ピリジン、チオエーテル、又は複素環式カルベンから選択され;及び
A及びA’は、ハロゲン、水素、C1〜C20アルキル、アリール、C1〜C20アルコキシド、アリールオキシド、C2〜C20アルコキシカルボニル、アリールカルボキシレート、C1〜C20カルボキシレート、アリールスルホニル、C1〜C20アルキルスルホニル、C1〜C20アルキルスルフィニルから独立して選択されるアニオン性リガンドであり;各リガンドは、任意選択でC1〜C5アルキル、ハロゲン、C1〜C5アルコキシで置換されているか;又はハロゲン、C1〜C5アルキル、又はC1〜C5アルコキシによって任意選択で置換されているフェニル基で置換されており;及びA及びA’は一緒になって任意選択で二座リガンドを含んでもよく;及び
Rb及びRcは、水素、C1〜C20アルキル、アリール、C1〜C20カルボキシレート、C1〜C20アルコキシ、アリールオキシ、C1〜C20アルコキシカルボニル、C1〜C20アルキルチオ、C1〜C20アルキルスルホニル及びC1〜C20アルキルスルフィニルから独立して選択され、Rb及びRcの各々は、任意選択でC1〜C5アルキル、ハロゲン、C1〜C5アルコキシで置換されているか、又はハロゲン、C1〜C5アルキル、又はC1〜C5アルコキシによって任意選択で置換されているフェニル基で置換されている)の中性ルテニウム又はオスミウム金属カルベン錯体を含む(Pederson and Grubbs 2002)。
上記に記載したとおり、本明細書に記載される方法によって作られる生成物はフェロモンである。本発明の方法により調製されるフェロモンは、昆虫防除組成物としての使用向けに製剤化することができる。フェロモン組成物は担体を含んでもよく、及び/又はディスペンサーに入っていてもよい。担体は、限定はされないが、不活性な液体又は固体であり得る。
一部の実施形態では、本フェロモン組成物を活性化学剤と組み合わせて相乗効果を生じさせる。本教示の方法によって得られる相乗効果はコルビー(Colby)の式(即ち(E)=X+Y−(X×Y/100)に従い定量化することができる。Colby, R. S., “Calculating Synergistic and Antagonistic Responses of Herbicide Combinations”, 1967 Weeds, vol. 15, pp. 20-22(全体として参照により本明細書に援用される)を参照されたい。従って、「相乗的」とは、その存在のおかげで所望の効果を相加的な量より多く増加させる成分が意図される。本方法のフェロモン組成物及び補助剤は、農業用活性化合物及びまた農業用補助化合物の有効性を相乗的に高めることができる。
フェロモン組成物は1つ以上の殺虫剤を含み得る。一実施形態では、殺虫剤は当業者に公知の化学的殺虫剤である。化学的殺虫剤の例としては、限定はされないが、シフルトリン、ペルメトリン、シペルメトリン、ビフェントリン、フェンバレレート、フルシトリネート、アジンホスメチル、メチルパラチオン、ブプロフェジン、ピリプロキシフェン、フロニカミド、アセタミプリド、ジノテフラン、クロチアニジン、アセフェート、マラチオン、キナルホス、クロルピリホス、プロフェノホス、ベンダイオカルブ、ビフェントリン、クロルピリホス、シフルトリン、ダイアジノン、除虫菊、フェンプロパトリン、キノプレン、殺虫ソープ又はオイル、ネオニコチノイド、ジアミド、アベルメクチン及び誘導体、スピノサド及び誘導体、アザジラクチン、ピリダリル、及びこれらの混合物を含めたピレスロイド系又は有機リン系殺虫剤の1つ以上が挙げられる。
本開示の別の実施形態によれば、本フェロモン組成物は、組成物の安定性を増進する1つ以上の添加剤を含み得る。添加剤の例としては、限定はされないが、脂肪酸及び植物油、例えば、オリーブ油、ダイズ油、トウモロコシ油、ベニバナ油、キャノーラ油、及びこれらの組み合わせが挙げられる。
本開示の別の実施形態によれば、本フェロモン組成物は1つ以上の充填剤を含み得る。充填剤の例としては、限定はされないが、1つ以上の鉱物クレー(例えばアタパルジャイト)が挙げられる。一部の実施形態では、誘引剤組成物は1つ以上の有機増粘剤を含み得る。かかる増粘剤の例としては、限定はされないが、メチルセルロース、エチルセルロース、及びこれらの任意の組み合わせが挙げられる。
別の実施形態によれば、本開示のフェロモン組成物は1つ以上の溶媒を含み得る。溶媒を含有する組成物は、ハケ塗り、浸漬、ロール塗り、吹き付け、又はその他の方法で、使用者がフェロモンコーティングを付与しようとする被塗物(例えばルアー)に液体組成物を適用することによって適用され得る液体組成物を使用者が利用する場合に望ましい。一部の実施形態では、使用する溶媒は、フェロモン組成物の1つ以上の成分を可溶化、又は実質的に可溶化するように選択される。溶媒の例としては、限定はされないが、水、水性溶媒(例えば、水とエタノールの混合物)、エタノール、メタノール、塩素化炭化水素、石油溶媒、テルペンチン、キシレン、及びこれらの任意の組み合わせが挙げられる。
一部の実施形態では、本開示のフェロモン組成物は可溶化剤を含む。可溶化剤はサーファクタントであり、限界ミセル濃度を上回る濃度では水中でミセルを形成し得る。このとき、ミセルは、ミセルの疎水性部分の内部に水不溶性材料を溶解させ又は可溶化することが可能である。可溶化に通常用いられるサーファクタントのタイプは、非イオン剤:モノオレイン酸ソルビタン;モノオレイン酸ソルビタンエトキシレート;及びオレイン酸メチルエステルである。
本開示の別の実施形態によれば、本フェロモン組成物は1つ以上の結合剤を含み得る。結合剤は、前記組成物を塗布する材料の表面へのフェロモン組成物の結合を促進するために使用し得る。一部の実施形態では、結合剤は、フェロモン組成物及び/又は材料の表面への別の添加剤(例えば、殺虫剤、昆虫成長調整物質など)の結合を促進するために使用し得る。例えば、結合剤は、ペンキ及びコーティングに典型的に用いられる合成又は天然樹脂を含み得る。これらは、塗布表面が、コーティングの構造的完全性はなおも維持しつつ、昆虫に組成物の成分(例えば、殺虫剤、昆虫成長調整物質など)をかじり取らせ摂食させるのに十分な脆さとなるように修飾されてもよい。
一部の実施形態では、本フェロモン組成物は界面活性剤を含む。一部の実施形態では、界面活性剤は液体農業用組成物に添加される。他の実施形態では、界面活性剤は固形製剤、特に適用前に担体で希釈するように設計された固形製剤に添加される。従って、一部の実施形態では、本フェロモン組成物はサーファクタントを含む。サーファクタントは時に、噴霧タンク混合物に対する補助剤として単独で、或いは鉱物油若しくは植物油などの他の添加剤と共に使用され、標的に対するフェロモンの生物学的性能を向上させる。界面活性剤はアニオン性、カチオン性、又は非イオン性の性質であってもよく、乳化剤、湿潤剤、懸濁剤として、又は他の目的で用いることができる。一部の実施形態では、サーファクタントは、アルキルエトキシレート、直鎖脂肪族アルコールエトキシレート、及び脂肪族アミンエトキシレートなど、非イオン剤である。製剤の技術分野で従来用いられている且つ本製剤にも使用し得るサーファクタントは、McCutcheon’s Detergents and Emulsifiers Annual, MC Publishing Corp., Ridgewood, N.J.,1998、及びEncyclopedia of Surfactants, Vol. I-III, Chemical Publishing Co., New York, 1980-81に記載されている。一部の実施形態において、本開示は、芳香族スルホン酸、例えば、リグノスルホン酸、フェノールスルホン酸、ナフタレンスルホン酸及びジブチルナフタレンスルホン酸の、及びアリールスルホン酸塩の脂肪酸の、アルキルエーテルの、ラウリルエーテルの、脂肪アルコール硫酸塩の及び脂肪アルコールグリコールエーテル硫酸塩のアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩又はアンモニウム塩、スルホン化ナフタレン及びその誘導体とホルムアルデヒドとの縮合物、ナフタレン又はナフタレンスルホン酸とフェノール及びホルムアルデヒドとの縮合物、フェノール又はフェノールスルホン酸とホルムアルデヒドとの縮合物、フェノールとホルムアルデヒド及び亜硫酸ナトリウムとの縮合物、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、エトキシ化イソオクチルフェノール、オクチルフェノール又はノニルフェノール、トリブチルフェニルポリグリコールエーテル、アルキルアリールポリエーテルアルコール、イソトリデシルアルコール、エトキシ化ヒマシ油、エトキシ化トリアリールフェノール、リン酸化トリアリールフェノールエトキシレートの塩、ラウリルアルコールポリグリコールエーテルアセテート、ソルビトールエステル、亜硫酸リグニン廃液又はメチルセルロース、又はこれらの組成物を含めたサーファクタントの使用を教示する。
一部の実施形態では、本フェロモン組成物は湿潤剤を含む。湿潤剤は、液体に加えたときに液体とそれが展着する表面との間の界面張力を低減することによってその液体の展着力又は浸透力を増加させる物質である。湿潤剤は、農薬製剤中に2つの主な機能:加工及び製造中に可溶性液体濃縮物又は懸濁濃縮物を作製するための粉末の水に対する濡れ速度を高めるため;及び噴霧タンク又は他のベッセル内で生成物を水と混合するときに濡れ性粉末の濡れ時間を短縮し、及び水分散性顆粒への水の浸透を向上させるために使用される。一部の実施形態では、本開示のフェロモン組成物に使用される湿潤剤の例は、濡れ性粉末、懸濁濃縮物、及び水分散性顆粒製剤を含め、ラウリル硫酸ナトリウム;ジオクチルスルホコハク酸ナトリウム;アルキルフェノールエトキシレート;及び脂肪族アルコールエトキシレートである。
一部の実施形態では、本開示のフェロモン組成物は分散剤を含む。分散剤は、粒子の表面上に吸着して粒子が分散した状態を保つことを促進し、その再集合を防ぐ物質である。一部の実施形態では、分散剤は、製造中の分散及び懸濁を促進し、及び噴霧タンク内で粒子が水中に再び分散することを確実にするため、本開示のフェロモン組成物に添加される。一部の実施形態では、分散剤は、濡れ性粉末、懸濁濃縮物、及び水分散性顆粒に使用される。分散剤として使用されるサーファクタントは粒子表面上に強力に吸着する能力を有し、粒子の再集合に対する電荷的又は立体的バリアを提供する。一部の実施形態では、最も一般的に用いられるサーファクタントは、アニオン性、非イオン性、又はこれらの2つのタイプの混合物である。
一部の実施形態では、本開示のフェロモン組成物はポリマーサーファクタントを含む。一部の実施形態では、ポリマーサーファクタントは、非常に長い疎水性「骨格」と、「櫛」サーファクタントの「歯」を形成する多数のエチレンオキシド鎖とを有する。一部の実施形態では、これらの高分子量ポリマーは、疎水性骨格が粒子表面上へのアンカリング点を多く有するため、懸濁濃縮物に極めて良好な長期安定性を付与することができる。一部の実施形態では、本開示のフェロモン組成物に使用される分散剤の例は、リグノスルホン酸ナトリウム;ナフタレンスルホン酸ナトリウムホルムアルデヒド縮合物;トリスチリルフェノールエトキシレートリン酸エステル;脂肪族アルコールエトキシレート;アルキルエトキシレート;EO−POブロック共重合体;及びグラフト共重合体である。
一部の実施形態では、本開示のフェロモン組成物は乳化剤を含む。乳化剤は、ある液相の液滴の別の液相中における懸濁液を安定化させる物質である。乳化剤がなければ、これらの2つの液体は2つの不混和性液相に分離し得る。一部の実施形態において、最も一般的に用いられる乳化剤ブレンドには、12個以上のエチレンオキシド単位を有するアルキルフェノール又は脂肪族アルコールと、ドデシルベンゼンスルホン酸の油溶性カルシウム塩とが含まれる。8〜18の範囲の親水性−親油性バランス(「HLB」)値が、通常、良好な安定エマルションをもたらす。一部の実施形態において、時に少量のEO−POブロック共重合体サーファクタントを加えることによりエマルション安定性を向上させることができる。
一部の実施形態では、本フェロモン組成物はゲル化剤を含む。増粘剤又はゲル化剤は主に懸濁濃縮物、エマルション、及びサスポエマルションの製剤中に、液体のレオロジー又は流れ特性を改良し、且つ分散した粒子又は液滴の分離及び沈降を防ぐために使用される。増粘剤、ゲル化剤、及び沈降防止剤は、概して2種類、即ち水不溶性微粒子と水溶性ポリマーとに分けられる。クレー及びシリカを用いて懸濁濃縮物製剤を作製することが可能である。一部の実施形態では、本フェロモン組成物は、限定はされないが、モンモリロナイト、例えばベントナイト;ケイ酸アルミウニムマグネシウム;及びアタパルジャイトを含めた1つ以上の増粘剤を含む。一部の実施形態において、本開示は、増粘剤としての多糖類の使用を教示する。最も一般的に用いられる多糖類のタイプは、種子及び海藻の天然抽出物又はセルロースの合成誘導体である。一部の実施形態はキサンタンを利用し、一部の実施形態はセルロースを利用する。一部の実施形態において、本開示は、限定はされないが、グアーガム;ローカストビーンガム;カラギーナン;アルギン酸塩;メチルセルロース;カルボキシメチルセルロースナトリウム(SCMC);ヒドロキシエチルセルロース(HEC)を含めた増粘剤の使用を教示する。一部の実施形態において、本開示は、加工デンプン、ポリアクリレート、ポリビニルアルコール、及びポリエチレンオキシドなど、他のタイプの沈降防止剤の使用を教示する。別の良好な沈降防止剤はキサンタンガムである。
一部の実施形態では、界面張力を低下させるサーファクタントの存在により、製造時の混合操作中及び噴霧タンクを用いた適用時に水性製剤に泡立ちが生じ得る。従って、一部の実施形態では、起泡傾向を抑えるため、製造段階で、又は瓶/噴霧タンクへの充填前に、多くの場合に消泡剤が添加される。概して、2つのタイプの消泡剤、即ちシリコーン系と非シリコーン系とがある。シリコーン系は、通常ジメチルポリシロキサンの水性エマルションであり、一方、非シリコーン系消泡剤はオクタノール及びノナノールなどの水不溶性油、又はシリカである。いずれの場合にも、消泡剤の機能は、気水界面からサーファクタントを排除することである。
一部の実施形態では、本フェロモン組成物は保存剤を含む。
本開示の別の実施形態によれば、本フェロモン組成物は1つ以上の昆虫摂食刺激物質を含み得る。昆虫摂食刺激物質の例としては、限定はされないが、粗綿実油、フィトールの脂肪酸エステル、ゲラニルゲラニオールの脂肪酸エステル、他の植物アルコールの脂肪酸エステル、植物抽出物、及びこれらの組み合わせが挙げられる。
一部の実施形態では、本明細書に開示されるフェロモン組成物は、噴霧可能組成物(即ち、噴霧可能なフェロモン組成物)として製剤化することができる。噴霧可能組成物には、水性溶媒、例えば、水、又は水とアルコール、グリコール、ケトン、又は他の水混和性溶媒との混合物を使用することができる。一部の実施形態では、かかる混合物の含水量は、少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、又は少なくとも約90%である。一部の実施形態では、噴霧可能組成物は濃縮物、即ち、フェロモンと水性溶媒中の他の添加剤(例えば、蝋様物質、安定剤など)との濃縮懸濁液であり、溶媒(例えば水)を加えることにより最終使用濃度に希釈され得る。
一部の実施形態では、本明細書に開示されるフェロモン組成物は、Ill’lchev, AL et al., J. Econ. Entomol. 2006;99(6):2048-54;及びStelinki, LL et al., J. Econ. Entomol. 2007;100(4):1360-9に開示されるようなマイクロカプセル化フェロモンとして製剤化することができる。マイクロカプセル化フェロモン(MEC)は、ポリマーカプセル内に封入されたフェロモンの小液滴である。このカプセルは周囲環境へのフェロモンの放出速度を制御し、十分に小さいため、噴霧殺虫剤に用いられるのと同じ方法で適用される。マイクロカプセル化フェロモン製剤の野外有効寿命は、とりわけ、気候条件、カプセルサイズ及び化学的特性に依存して、数日〜1週間を僅かに超える範囲であり得る。
フェロモン組成物は、大気中への徐放をもたらすように、及び/又は放出後の分解から保護されるように製剤化することができる。例えば、フェロモン組成物は、マイクロカプセル、生分解性フレーク及びパラフィン蝋ベースのマトリックスなどの担体に含まれてもよい。或いは、フェロモン組成物は、徐放噴霧可能なものとして製剤化することができる。
本開示のフェロモン組成物はルアーに塗布又は噴霧されてもよく、又はその他の方法でルアーにフェロモン組成物を含浸させてもよい。
本開示のフェロモン組成物は、任意の昆虫種、例えば鱗翅目(Lepidoptera)の昆虫を誘引するために一般的に用いられるものなど、トラップにおいて使用し得る。かかるトラップは当業者に周知であり、多くの州及び国で昆虫根絶計画において一般的に用いられている。一実施形態では、トラップは、フェロモン組成物を保持するための1つ以上の隔壁、容器、又は貯蔵用の入れ物を備える。従って、一部の実施形態において、本開示は、少なくとも1つのフェロモン組成物が充填されたトラップを提供する。従って、本開示のフェロモン組成物は、例えばトラップに毒性物質を組み込んで捕獲した昆虫を殺虫することによる、昆虫モニタリング、大量捕獲、交信撹乱、又はルアー/誘引殺虫戦略の一環として例えば昆虫を誘引するため、トラップにおいて使用することができる。
フェロモン組成物は、特定の環境において組成物を放出するためのディスペンサーと併せて使用することができる。当該技術分野において公知の任意の好適なディスペンサーを使用し得る。かかるディスペンサーの例としては、限定はされないが、エアロゾル放出器、手作業で適用するディスペンサー、フェロモンがゆっくりと放出される透過性バリアを有するリザーバを含むバブルキャップ、フェロモン組成物を含浸させたゴム、プラスチック、革、綿、脱脂綿、木材又は木材産物でできたパッド、ビーズ、チューブ、ロッド、スパイラル又はボールが挙げられる。例えば、フェロモン組成物が蒸発するポリ塩化ビニルラミネート、ペレット、顆粒、ロープ又はスパイラル、又はゴムセプタム。当業者は、所望の適用、貯蔵、輸送又は取扱い方法に好適な担体及び/又はディスペンサーを選択することが可能であろう。
本明細書に開示される方法により調製したフェロモン組成物を使用して、昆虫の行動を制御又は調節し得る。一部の実施形態では、標的の昆虫の行動は、特に、昆虫が特定の場所に誘引されるが前記場所と接触はしないように、又はかかる昆虫が実際に前記場所に接触するように、組成物中のフェロモンと位置異性体との比率を変えることによって調整可能な方法で調節し得る。従って、一部の実施形態では、フェロモンを使用して昆虫を誘引して、被害を受け易い作物範囲から引き離すことができる。従って、本開示はまた、ある場所に昆虫を誘引する方法も提供する。この方法は、ある場所に有効量のフェロモン組成物を投与することを含む。
本開示の方法により調製されるフェロモンはまた、交尾の阻害にも使用することができる。交信撹乱は、昆虫を混乱させて交尾場所の特定及び/又は求愛を阻害し、それにより交尾を防ぎ、生殖周期を遮断する人工刺激(例えば、本明細書に開示されるとおりのフェロモン組成物)を導入することによって害虫を防除するように設計された害虫管理法である。
誘引殺虫方法は、性フェロモンなどの誘引剤を利用して殺虫性の化学物質、表面、装置等に標的種の昆虫を誘き寄せ、大量死滅させて、最終的には個体数を抑制するものであり、大量捕獲と同じ効果があり得る。例えば、合成雌性フェロモンを用いて雄の害虫、例えば蛾を誘き寄せる場合、誘引殺虫戦略では、多数の雄の蛾を長期間にわたって死滅させることにより交尾及び繁殖を低下させ、最終的に害虫の個体数を抑制しなければならない。誘引殺虫手法は、トラップの手入れ又は他の頻繁な保守が不要であるため、大量捕獲の有利な代替法であり得る。本明細書に記載される様々な実施形態では、組換え微生物が、(i)昆虫フェロモンの生成経路、及び(ii)昆虫にとって毒性のタンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、又は小分子を共発現し得る。このようにして、組換え微生物は、誘引殺虫手法における使用に好適な物質を同時生成することができる。
仮想例1.メタセシス及び化学変換による酵素的に誘導されたゴンド酸からのフェロモン生成物の生成
この仮想例は、種々の脂肪酸をフェロモン又はフェロモン前駆体の生合成生成の出発物質として使用し得ることを示す。本明細書に開示される生合成プロセスから得られる生成物を更なる化学変換に供して種々の生成物を生じさせることができる。
この仮想例は、本明細書に開示される組換え微生物を使用して昆虫フェロモンの合成ブレンドを作成し得ることを示す。
背景及び理論的根拠
微生物による脂肪酸からの昆虫脂肪アルコールの生成の改変は、合成経路の機能発現を必要とする。1つのかかる経路は、脂肪アシル−CoAの、位置特異的及び立体特異的不飽和脂肪アシル−CoAへの、及び続く脂肪アルコールへの変換を媒介する膜貫通デサチュラーゼ、及びアルコール形成レダクターゼを含む。これらの酵素をコードする幾つもの遺伝子がある種の昆虫(並びに脂肪アルコールレダクターゼの場合にはある種の微細藻類)に見られ、好ましい生成宿主である酵母における合成経路の構築に使用することができる。幾つもの膜貫通デサチュラーゼ及びアルコール形成レダクターゼ変異体をスクリーニングして、単一の昆虫脂肪アルコール又は脂肪アルコールのブレンドの高レベル合成を可能にする集団を同定し得る。加えて、これらの酵素を複数の宿主(サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、カンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis)、及びヤロウイア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica))にわたってスクリーニングすることにより、これらの膜貫通タンパク質の最適発現に好適な宿主を見つけ出すための検索を最適化し得る。
昆虫由来の3つのアルコール形成レダクターゼを選択した。
アルコール形成レダクターゼ変異体をS.セレビシエ(S. cerevisiae)W303(野生型)及びBY4742 ΔPOX1(β酸化欠失突然変異体)における活性に関してスクリーニングした。酵素活性の評価には、Z11−ヘキサデセン酸を基質として選択した。インビボ生物変換アッセイから、エジプトヨトウ(Spodoptera littoralis)、オオタバコガ(Helicoverpa armigera)、及びカブラヤガ(Agrotis segetum)に由来する酵素変異体(Ding, B-J., Loefstedt, C. Analysis of the Agrotis segetum pheromone gland transcriptome in the light of sex pheromone biosynthesis. BMC Genomics 16:711 (2015))をW303Aで発現させるとZ11−ヘキサデセノール生成がもたらされ、タンパク質誘導から48時間以内にそれぞれ約37μM(8mg/L)、約70μM(約16mg/L)、及び11μM(約3mg/L)にまで達したことが示された(図5及び図6)。生物学的に生成されたZ11−ヘキサデセノールは、GC−MSによって決定するとき、Z11−ヘキサデセノール標準物質(Bedoukian)と一致した(図7)。BY4742 ΔPOX1はまた、重要なβ酸化経路酵素の欠失がZ11−ヘキサデセン酸の分解を制限し得たため、発現宿主としても調べた。しかしながら、β酸化欠失突然変異体におけるレダクターゼ変異体の発現は、野生型宿主における発現と比較したときに生成物力価を低下させた(図5)。BY4742 ΔPOX1を宿主として使用したときの力価低下の1つの寄与因子は、W303と比較したときのバイオマスの減少であった(図8)。
S.セレビシエ(S. cerevisiae)における昆虫膜貫通アルコール形成レダクターゼの機能発現が実証された。試験したレダクターゼの中で、オオタバコガ(Helicoverpa armigera)に由来する変異体がZ11−ヘキサデセン酸に対して最も高活性である。
株の樹立及び機能発現アッセイ
S.セレビシエ(S. cerevisiae)W303(MATA ura3-1 trp1-1 leu2-3_112 his3-11_15 ade2-1 can1-100)及びBY4742(MATa POX1::kanMX his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0)を発現宿主として使用した。脂肪アルコールレダクターゼ変異体をコードするDNA配列をS.セレビシエ(S. cerevisiae)における発現が最適化されるように再設計した(配列番号1〜3)。生じたシントン(Genscript)をpESC−URAベクターにBamHI−XhoI部位を使用してクローニングして、Gal1プロモーターを利用したタンパク質発現を促進した。得られたプラスミドコンストラクトを使用してW303を形質転換し、CM寒天培地(2%グルコース含有、及びウラシル不含)(Teknova)で陽性形質転換体を選択した。機能発現を評価するため、CM寒天培地(2%グルコース含有、及びウラシル不含)にパッチした2つの陽性形質転換クローンを使用して、24ディープウェルプレートフォーマットを用いてCM液体培地を播種した。タンパク質発現を誘導するため、次に、28℃で成長させておいた一晩培養物にガラクトース、ラフィノース、及びYNBをそれぞれ2%、1%、及び6.7g/Lの最終濃度となるように補足した。タンパク質誘導の24時間後、生物変換基質Z11−ヘキサデセン酸(エタノール中)又はヘプタデカン酸(エタノール中)を300mg/Lの最終濃度となるように加えた。生物変換アッセイを28℃で48時間進めた後、GC−MS分析を行った。
Hagstroem et al.(Hagstroem, A. K., Lienard, M. A., Groot, A. T., Hedenstroem, E. & Loefstedt, C. Semi-Selective Fatty Acyl Reductases from Four Heliothine Moths Influence the Specific Pheromone Composition. PLoS One 7: e37230 (2012))の変法により脂質を抽出した。1.5mL細胞培養物を15mLファルコンチューブに移した。この細胞懸濁液を1mL 5N HClで酸性化した。5μLテトラデカン二酸(エタノール中10mM)を内部標準として加えた。1.5mLヘキサンを加えることによりこの混合物を抽出し、次に37℃、250rpmで1時間振盪した。相分離を促進するため、試料を2000gで10分間遠心した。次に1mLの有機ヘキサン相を1.5mLプラスチックチューブに移した。この試料を90℃で30分間加熱することにより溶媒を除去した。試料を蒸発乾固させた後、50μLのBSTFA(1%のトリメチルクロロシランを含有するN,O−ビス(トリメチルシリル)トリフルオロアセタミド)を加えた。1.5mLプラスチックチューブを10秒間にわたり2回激しく振盪した。ガラスインサートが入ったスクリューキャップGCガラスバイアルに移す前に、試料を1分間(13000rpm)遠心した。バイアルをキャップし、90℃で30分間加熱した。この方法によって生じたトリメチルシリルエステルを続いてGC−MS分析によって分析した。GC−MSパラメータを表6に指定する。SIMモード(特徴的生成物及びISイオン)を使用すると、バックグラウンドノイズの低下により検出感度が高まり、2.4μM(0.6mg/L)もの低量の生成物の検出が可能となる。スプリット比を更に低下させると、今後の適用向けに更なる感度上昇の可能性がもたらされる。図9に示すZ11−ヘキサデセノール検量線を使用して、酵母から生成されたZ11−ヘキサデセノールを定量化した。容易に区別されるヘプタデカノール生成物が成功したGC−MSランのベンチマークに用いられた可能性があるため、ヘプタデカン酸の生物変換も試験した。しかしながら、試験したレダクターゼのいずれも、ヘプタデカン酸に対して何ら活性を示さなかった。
背景及び理論的根拠
微生物による脂肪酸からの昆虫脂肪アルコールの生成の改変には、合成経路の機能発現が必要である。1つのかかる経路は、脂肪アシル−CoAの、位置特異的及び立体特異的不飽和脂肪アシル−CoAへの、及び続く脂肪アルコールへの変換を媒介する膜貫通デサチュラーゼ、及びアルコール形成レダクターゼを含む。これらの酵素をコードする幾つもの遺伝子が、ある種の昆虫並びにある種の微細藻類に見られる。幾つもの膜貫通デサチュラーゼ及びアルコール形成レダクターゼ変異体をスクリーニングして、単一の昆虫脂肪アルコール又は脂肪アルコールのブレンドの高レベル合成を可能にする集団を同定し得る。加えて、これらの酵素を複数の宿主(サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、カンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis)、及びヤロウイア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica))にわたってスクリーニングすることにより、これらの膜貫通タンパク質の最適発現に好適な宿主を見つけ出すための検索を最適化し得る。
デサチュラーゼ(昆虫由来:カブラヤガ(Agrotis segetum)、イラクサギンウワバ(Trichoplusia ni)、クルミマダラメイガ(Amyelois transitella)、アメリカタバコガ(Helicoverpa zea)、及び海洋性珪藻:タラシオシラ・シュードナナ(Thalassiosira pseudonana))の小さい組をテストケースとして選択して、機能発現アッセイ、代謝産物抽出方法、及び分析化学を調査し及び確立した。
S.セレビシエ(S. cerevisiae)において膜貫通デサチュラーゼ変異体をスクリーニングした。当初3つの変異体を試験して、機能発現アッセイ、代謝産物抽出方法、及び分析化学を調査及び確立した。これらのデサチュラーゼをS.セレビシエ(S. cerevisiae)において機能発現させるため、pOLE1カセットと呼ばれるエピソーム合成発現カセット(図10)を構築し、これは、OLE1プロモーター領域、S.セレビシエ(S. cerevisiae)OLE1の最初の27アミノ酸をコードするN末端リーダー配列、及びVPS13(原生胞子の膜形成に関与するタンパク質、これのターミネーターは、RNA半減期を延長させることにより潜在的に異種タンパク質発現を増加させることが既に特徴付けられている)のターミネーター領域からなった。pOLE1カセットの機能性をそのGFP発現能力によってバリデートした(図11A〜図11E)。続いて、昆虫デサチュラーゼシントン、及び酵母OLE1シントンをpOLE1カセットにクローニングし、S.セレビシエ(S. cerevisiae)ΔOLE1株で発現させた。OLE1対立遺伝子(これはパルミトイル:CoA/ステアロイル:CoA(z)−9−デサチュラーゼをコードする)を欠失させると、それを機能性昆虫デサチュラーゼのスクリーニングツールとして利用することが可能になるため、この株を選択した。具体的には、活性デサチュラーゼであれば、UFAを外因的に補充する必要なしに成長を補完することが可能になり得る。pOLE1カセットを使用してOLE1を発現させると、UFAなしでのΔOLE1成長の成長が補完された(図11A〜図11E);従って、これは補完アッセイの陽性対照としての役割を果たす。昆虫デサチュラーゼを発現させたとき、本発明者らは、それらがUFAなしでのΔOLE1成長を様々な程度でレスキューしたことを観察した。富栄養培地(YPD)寒天プレート上では、S.セレビシエ(S. cerevisiae)OLE1の発現は最も高いレベルの成長をもたらし、それにイラクサギンウワバ(T. ni)デサチュラーゼが続いた(図12A)。後者は、イラクサギンウワバ(T. ni)デサチュラーゼによる不飽和脂肪アシル:CoAの生成がΔOLE1における欠損した(Z)−9−ヘキサデセノイル:CoA生合成のサロゲートとしての役割を果たし得ることを示した。T.シュードナナ(T. pesudonana)及びカブラヤガ(A. segetum)デサチュラーゼの発現はYPD上での成長をそれほど良好にはレスキューしないように見えた(図12A)。最少培地(CM−Uraグルコース)寒天プレート上にパッチしたとき、S.セレビシエ(S. cerevisiae)OLE1及びイラクサギンウワバ(T. ni)デサチュラーゼの発現のみが、外因性UFAなしでのΔOLE1成長をレスキューした(図12B)。T.シュードナナ(T. pseudonana)及びカブラヤガ(A. segetum)デサチュラーゼの発現は最少培地寒天上でのΔOLE1の成長をもたらさなかったことから、UFAの生成におけるそれらの活性が限られていることが示唆される(結果は図示せず)。カンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis)においてデサチュラーゼライブラリをスクリーニングすると、クルミマダラメイガ(A. transitella)及びアメリカタバコガ(H. Zea)デサチュラーゼの機能発現が同定された。これらのデサチュラーゼをΔOLE1で発現させたとき、それらはYPD培地及びCM−Uraグルコース培地の両方でイラクサギンウワバ(T. ni)デサチュラーゼの発現と同程度にUFAなしでの成長をもたらした(図12B)。
S.セレビシエ(S. cerevisiae)における昆虫由来の膜貫通デサチュラーゼの機能発現が達成された。
株の樹立及び機能発現アッセイ
S.セレビシエ(S. cerevisiae)ΔOLE1(MATA OLE1::LEU2 ura3-52 his4)を発現宿主として使用した。OLE1プロモーター領域(配列番号5及び6)、27N末端アミノ酸のOLE1リーダー配列をコードするヌクレオチド(配列番号7)、及びVPS13ターミネーター配列(配列番号8)を含むpOLE1と呼ばれる合成発現カセット(図10、配列番号4)を作成し、pESC−URAベクターのSacI部位とEcoRI部位との間にクローニングした。pOLE1カセットの機能性を試験するため、SpeI部位と及びNotI部位との間にDasher GFPシントンを挿入してpOLE1−GFPプラスミドを作成した。コンピテントΔOLE1をpOLE1−GFPで形質転換し、UFAを含有するCM−Uraグルコース寒天プレート(Teknova)に置いた(20mm CM−URAグルコース寒天プレートに、1%テルジトール(tergitol)及び3μLパルミトレイン酸を含有する100μL CM−Uraグルコース培地を塗布した)。30℃で5日間インキュベートした後、ΔOLE1形質転換体の緑色の呈色によって示されるとおり、Dasher GFP発現が見えた。この結果から、pOLE1カセットが異種タンパク質発現をドライブする能力を有したことが示された。OLE1活性を回復させることにより、ΔOLE1補完性の検証を実施した。具体的には、リーダー配列を欠くpOLE1カセットに天然S.セレビシエ(S. cerevisiae)OLE1シントンを挿入してpOLE1−OLE1プラスミドを作成した。ΔOLE1の形質転換、及びUFAを含有するCM−Uraグルコース寒天での選択後、UFAを含まないYPD及びCM−Uraグルコースにシングルコロニーをパッチした。30℃で5日間インキュベートした後、成長を観察した(図11A〜図11E)。予想どおり、Dasher GFP発現はUFAなしでのΔOLE1成長を補完できなかった(図11A〜図11E)。デサチュラーゼ変異体をコードするDNA配列を合成し(クローニング目的で用いられる制限部位を除去するヌクレオチド変化を含めた)、SpeI−NotI部位を用いてpOLE1にクローニングした(Genscript、配列番号9〜13)。昆虫デサチュラーゼによるΔOLE1の補完アッセイをOLE1デサチュラーゼと同様に実施した。
全脂質組成並びに(Z)−11−ヘキサデセン酸定量化は、Moss et al. (1982)(Moss, C. W., Shinoda, T. & Samuels, J. W. Determination of cellular fatty acid compositions of various yeasts by gas-liquid chromatography. J. Clin. Microbiol. 16: 1073-1079 (1982))及びYousuf et al (2010)(Yousuf, A., Sannino, F., Addorisio, V. & Pirozzi, D. Microbial Conversion of Olive Oil Mill Wastewaters into Lipids Suitable for Biodiesel Production. J. Agric. Food Chem. 58: 8630-8635 (2010))による変法に基づいた。通常約10mg〜80mgのペレット状細胞(1.5mLプラスチックチューブ内)を5%(w/w)の水酸化ナトリウム含有メタノール中に再懸濁した。アルカリ性細胞懸濁液を1.8mLスクリューキャップGC−バイアルに移した。この混合物を90℃のヒートブロックで1時間加熱した。400 2.5N HClで酸性化する前に、バイアルを放冷して室温に戻した。1mMヘプタデカン酸を含有する500μLクロロホルムを加え、この混合物を激しく振盪し、次に水相及び有機相の両方を1.5mLプラスチックチューブに移した。この混合物を13,000rpmで遠心した後、450μLの有機相を新しい1.5mLプラスチックチューブに移した。水相を2回目に500μLクロロホルムで、今回はヘプタデカン酸なしに抽出した。合わせた有機相を90℃で蒸発させた。室温に冷却した後、残留する脂肪酸メチルエステル及び遊離脂肪酸を溶解し、0.2M TMSH(水酸化トリメチルスルホニウム)を含有するメタノール中で誘導体化した。
背景及び理論的根拠
微生物による脂肪酸からの昆虫脂肪アルコールの生成の改変には、合成経路の機能発現が必要である。1つのかかる経路は、脂肪アシル−CoAの、位置特異的及び立体特異的不飽和脂肪アシル−CoAへの、及び続く脂肪アルコールへの変換を媒介する膜貫通デサチュラーゼ、及びアルコール形成レダクターゼを含む。これらの酵素をコードする幾つもの遺伝子が、ある種の昆虫並びにある種の微細藻類に見られる。幾つもの遺伝子変異体をスクリーニングすることにより、単一の昆虫脂肪アルコール又はそのブレンドの高レベル合成能を有する経路の作成を可能にする酵素活性を同定した。加えて、これらの膜貫通タンパク質の最適発現に好適な宿主を見つけ出すため、これらの酵素を複数の宿主(サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、カンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis)、及びヤロウイア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica))にわたってスクリーニングした。
パルミチン酸からの(Z)−11−ヘキサデセン酸の合成を可能にするため選択の機能性膜貫通デサチュラーゼ変異体を発現するようにS.セレビシエ(S. cerevisiae)を予め改変した。これにより、変異体を同定して、それらの生物変換性能に基づき順位付けすることが可能であった(実施例4を参照されたい)。
目標は、S.セレビシエ(S. cerevisiae)の1つ以上の昆虫脂肪アルコール生合成経路を改変することであった。これまでに、S.セレビシエ(S. cerevisiae)における昆虫由来の幾つかの膜貫通デサチュラーゼの機能発現が実証された(実施例4を参照されたい)。簡潔に言えば、OLE1プロモーター領域、S.セレビシエ(S. cerevisiae)OLE1の最初の27アミノ酸をコードするN末端リーダー配列、及びVPS13のターミネーター領域からなる発現カセットを設計することにより、異種デサチュラーゼ発現が可能であった。活性デサチュラーゼのスクリーニングは、2つの手法を用いることにより行った。第一に、不飽和脂肪酸(UFA)を外因的に加えない場合のΔOLE1成長をレスキューするその能力に関して活性デサチュラーゼをスクリーニングし、第二に、パルミチン酸の(Z)−11−ヘキサデセン酸への生物変換に関するインビボスクリーニングによって活性デサチュラーゼをスクリーニングした。これらのスクリーニング戦略により、幾つかの活性変異体を同定し、それらの相対活性を順位付けすることが可能になった。これらのスクリーニング結果に基づき、イラクサギンウワバ(Trichoplusia ni)(TN_desat)及びS.セレビシエ(S. cerevisiae)(SC_desat)由来のデサチュラーゼを脂肪アルコール経路におけるコンビナトリアル発現用に選択した。S.セレビシエ(S. cerevisiae)デサチュラーゼはパルミトレイン酸及びオレイン酸を形成することが知られている。
昆虫フェロモンの脂肪アルコール前駆体であるZ11−16OH及びZ9−16OHの合成のためのパン酵母の改変が実証された。
株の樹立及び機能発現アッセイ
S.セレビシエ(S. cerevisiae)ΔOLE1(MATA OLE1::LEU2 ura3-52 his4)、及びW303A(MATA ura3-1 trp1-1 leu2-3_112 his3-11_15 ade2-1 can1-100)を発現宿主として使用した。分子設計により、BamHI及びXhoIを利用してレダクターゼシントンを切り出すコンビナトリアル経路アセンブリ(実施例3を参照されたい)及びpOLE1−デサチュラーゼコンストラクトを含有するプラスミドへのサブクローニング(実施例4を参照されたい)が可能である。コンピテント酵母を経路コンストラクトで形質転換し、CM−Uraグルコース寒天プレート(Teknova)にプレーティングした。ΔOLE1形質転換の場合、コロニーのプレーティングには、1%テルジトール(tergitol)及び3μLパルミトレイン酸を含有する100μL CM−Uraグルコース培地を塗布した20mM CM−Uraグルコース寒天プレートを利用した。
脂肪酸分析は実施例4に記載されるとおりであり、但し試料は2回抽出するのでなく、試料は1mMヘプタデカン酸メチル(C17:0Me)を含有するクロロホルムで1回抽出したのみであった。脂肪アルコール分析は実施例3に記載されるとおりであり、但しヘキサン(テトラデカン二酸を含有する)でなく、クロロホルム(1mMヘプタデカン酸メチルを含有する)を使用した。抽出時間は1時間から20秒間に短縮した。その後、試料は1.5mLプラスチックチューブでなく、1.8mL GCバイアルに収集した。質量分析計はSIMモード(m/z 208、297.3及び387.3)で使用した。
背景及び理論的根拠
微生物による脂肪酸からの昆虫脂肪アルコールの生成の改変には、合成経路の機能発現が必要である。1つのかかる経路は、脂肪アシル−CoAの、位置特異的及び立体特異的不飽和脂肪アシル−CoAへの、及び続く脂肪アルコールへの変換を媒介する膜貫通デサチュラーゼ、及びアルコール形成レダクターゼを含む。これらの酵素をコードする幾つもの遺伝子が、ある種の昆虫並びにある種の微細藻類に見られる。幾つもの遺伝子変異体をスクリーニングすることにより、単一の昆虫脂肪アルコール又はそのブレンドの高レベル合成能を有する経路の作成を可能にする酵素活性を同定した。加えて、これらの酵素を複数の宿主(サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、カンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis)、及びヤロウイア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica))にわたってスクリーニングすることにより、これらの膜貫通タンパク質の最適発現に好適な宿主を見つけ出すための検索を最適化し得る。
デサチュラーゼ(昆虫由来:カブラヤガ(Agrotis segetum)、クルミマダラメイガ(Amyelois transitella)、アメリカタバコガ(Helicoverpa zea)、イラクサギンウワバ(Trichoplusia ni)、アワノメイガ(Ostrinia furnacalis)、及びカラントシュートボーラー(Lampronia capitella)及び海洋性珪藻:タラシオシラ・シュードナナ(Thalassiosira pseudonana))の小さい組をテストケースとして選択して、機能発現アッセイ、代謝産物抽出方法、及び分析化学を調査し及び確立した。
ライブラリ構築
この試験は、C.トロピカリス(C. tropicalis)(SPV053)における膜貫通デサチュラーゼ変異体のスクリーニングに焦点を置いた。スクリーニングには、パルミトイル−CoA(C16:0)に対して既報告のZ11デサチュラーゼ活性を有する5つの昆虫デサチュラーゼ(配列番号16〜19、23)及び既報告のZ9デサチュラーゼ活性を有する3つの昆虫デサチュラーゼ(配列番号20〜22)を含めた。1つの変異体、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)OLE1 N末端の27アミノ酸が昆虫配列の上流に融合したカブラヤガ(A. segetum)由来のZ11デサチュラーゼ(配列番号16)もサブクローニングした(図20、配列番号15)。構築時点では、カブラヤガ(A. segetum)Z11デサチュラーゼは陽性対照であると考えられ、及びC.アルビカンス(C. albicans)OLE1融合物は、カンジダ属(Candida)リーダー配列を含めると機能発現が向上し得るかどうかを試験するために構築した。このコンストラクトは、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)デサチュラーゼスクリーニングで使用されるものを模倣するように設計した(実施例4を参照されたい)。最後に、組込み及び発現に関する陽性対照及び組換えデサチュラーゼ活性に関する陰性対照としての役割を果たすように、mCherry赤色蛍光タンパク質(配列番号14)を発現する対照コンストラクトを含めた(図21A〜図21D)。
一連のインビボ生物変換実験によって異種デサチュラーゼの機能発現を特徴付けた。エタノール(誘導のため)及び飽和酸基質(パルミチン酸、パルミチン酸メチル、ミリスチン酸メチル)を補足した富栄養(YPD)培地又は限定(CMグルコース)培地において、昆虫デサチュラーゼを発現するC.トロピカリス(C. tropicalis)SPV053由来の株を培養した。小規模(2ml)培養物は24ディープウェルプレートで合計72時間、最初の24時間が経った後に基質を追加して培養した。
C.トロピカリス(C. tropicalis)SPV053における昆虫由来の膜貫通デサチュラーゼの機能発現が達成された。
株の樹立
遺伝子の記録には従来手法を用いた。CTGロイシンコドンをTTAに置き換えたことを除き、天然配列は変化させなかった。GenscriptによるNcoI及びNotI制限部位を使用して、全ての遺伝子をpPV0053にクローニングした。大腸菌(E. coli)NEB10βへの形質転換後、Zyppyプラスミドミニプレップキット(Zymo Research、Irvine, CA)を用いてプラスミドをミニプレップした。BsiWI(New England Biolabs、Ipswich, MA)で消化することによりプラスミドを線状化した後、SPV053に形質転換した。消化後、Clean and Concentrator Kit(Zymo Research、Irvine, CA)を使用してDNAを単離した。約1μgのDNAを電気穿孔によって形質転換した。TE+100mM酢酸リチウム+DTTとインキュベートする代わりに、細胞はTE+100mM酢酸リチウムのみで2時間インキュベートした。陽性組込み体は部位特異的であることが分かり、チェックPCRにより遺伝子タイピングを行った。低効率転換の更なるスクリーニングに二段階手法を取った。約60コロニーをYPD+300μg/mlゼオシンに再パッチし、一晩成長させた。急速に成長した(24時間以内の高密度増殖)一部のパッチをコロニーPCRによってスクリーニングした。急速に成長するパッチの圧倒的多数が陽性組込み体として同定された。
YPD及びCMグルコースにおけるパルミチン酸補足
陽性分離株をYPD+300μg/mlゼオシンに再パッチし、一晩成長させて、次に4℃で保存した。株をパッチプレートから24ディープウェルプレート(四角形ウェル、ピラミッド形底)内の2mlのYPDに接種した。各デサチュラーゼ変異体及びmCherry発現対照株につき3つの陽性クローンを接種した。ディープウェルプレートを30℃、1000rpm、及び80%湿度でInfors HT Multitron Proプレートシェーカーにおいて24時間インキュベートした。24時間インキュベートした後、培養物を1mlの等量に分けて2組の同一プレートを作製した。両組のプレートとも500×gで遠心することによりペレット化した。一方の組のプレートは2mlのYPD+0.3%(v/v)エタノールに再懸濁し、第2の組は2mlのCMグルコース+0.3%エタノールに再懸濁した。この段階でエタノールを加えて、ICLプロモーターからの組換え酵素発現を誘導した。培養物を同じ条件下で更に24時間インキュベートした後、エタノール中90g/Lストック溶液からの培養物に300mg/Lパルミチン酸を加えた。この結果は、新鮮0.3%エタノールをパルミチン酸と併せて加えることであった。一部の株はまた、パルミチン酸を加えることなく培養した。これらの培養物は代わりに0.3%エタノールを加えた。全ての培養物を更に24時間インキュベートした後、最後に0.3%エタノールを加えた。更に24時間インキュベートした後、1.5mlの各培養物を1.7ml微量遠心管に回収し、ペレット化した。上清は新鮮なチューブに保管し、ペレットは以下に記載するとおり処理した。一部の上清試料はまた抽出して、細胞外培地中の遊離酸を調べた。
パルミチン酸及びパルミチン酸メチルの両方を基質として使用してmCherry対照及び確認された陽性変異体を再スクリーニングした。培養は、エタノールストック溶液(パルミチン酸メチル94g/Lストック、313mg/L最終濃度)から等モル量(1.17mM)の基質を加えて上記に記載したとおり行った。株の完全なパネルでも、84g/Lストックのミリスチン酸メチル(C14:0)を使用して同じプロトコルを繰り返した。基質の最終濃度は再び1.17mMであった。
(Z)−11−ヘキサデセン酸合成を確認するためインビボ生物変換アッセイをスケールアップした。株SPV0302、SPV0303、及びSPV0304(mCherry)、SPV0304、SPV0305、及びSPV0306(クルミマダラメイガ(A. transitella)Z11デサチュラーゼ)、並びにSPV0307、SPV0308、及びSPV0309(アメリカタバコガ(H. Zea)Z11デサチュラーゼ)の2ml YPDシード培養物をInfors HT Multitronプレートシェーカーにおいて30℃、1000rpm、80%湿度で一晩成長させた。3つのクローン分離株の各々からの200μlの一晩培養物をプールし、20ml YPDが入った単一の125mlバッフル付きフラスコに接種した。得られた3つのフラスコを30℃及び250rpm(Inforsフラスコシェーカー)で24時間成長させた。培養物を500×gで遠心することによりペレット化し、20mlのYPD+0.3%(v/v)エタノールに再懸濁し、125mlバッフル付き振盪フラスコに戻した。培養物を更に24時間インキュベートした後、エタノール中90g/Lストックの300mg/Lパルミチン酸(1フラスコ当たり221μl)を加えた。24時間インキュベートした後、誘導を持続させるため各フラスコに更なる0.3%(v/v)エタノール(221μl)を加えた。フラスコを更に24時間インキュベートした後、FAME分析及びDMDS誘導体化のため細胞を回収した。
全脂質組成並びに(Z)−11−ヘキサデセン酸定量化は、Moss et al. (1982)及びYousuf et al (2010)による変法に基づいた。通常約10mg〜80mgのペレット化した細胞(1.5mLプラスチックチューブ内)を、5%(w/w)の水酸化ナトリウムを含有するメタノール中に再懸濁した。アルカリ性細胞懸濁液を1.8mLスクリューキャップGC−バイアルに移した。この混合物を90℃のヒートブロックで1時間加熱した。400 2.5N HClで酸性化する前に、バイアルを放冷して室温に戻した。1mMヘプタデカン酸を含有する500μLクロロホルムを加え、この混合物を激しく振盪し、次に水相及び有機相の両方を1.5mLプラスチックチューブに移した。この混合物を13,000rpmで遠心した後、450μLの有機相を新しい1.5mLプラスチックチューブに移した。水相を2回目に500μLクロロホルムで、今回はヘプタデカン酸なしに抽出した。合わせた有機相を90℃で蒸発させた。室温に冷却した後、残留する脂肪酸メチルエステル及び遊離脂肪酸を溶解し、0.2M TMSH(水酸化トリメチルスルホニウム)を含有するメタノール中で誘導体化した。
背景及び理論的根拠
微生物による脂肪酸からの昆虫脂肪アルコールの生成の改変には、合成経路の機能発現が必要である。1つのかかる経路は、脂肪アシル−CoAの、位置特異的及び立体特異的不飽和脂肪アシル−CoAへの、及び続く脂肪アルコールへの変換を媒介する膜貫通デサチュラーゼ、及びアルコール形成レダクターゼを含む。これらの酵素をコードする幾つもの遺伝子が、ある種の昆虫並びにある種の微細藻類に見られる。或いは、位置特異的及び立体特異的デサチュラーゼを使用して、脂肪酸前駆体リッチな微生物油を生成することができる。次に微生物油は誘導体化し、活性成分に還元することができる。幾つもの遺伝子変異体をスクリーニングすることにより、単一の昆虫脂肪酸及びアルコール又はそのブレンドの高レベル合成能を有する経路の作成を可能にする酵素活性を同定した。加えて、これらの酵素を複数の宿主(サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、カンジダ・ビスワナチイ(トロピカリス)(Candida viswanathii(tropicalis))、及びヤロウイア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica))にわたってスクリーニングすることにより、これらの膜貫通タンパク質の最適発現に好適な宿主を見つけ出すための検索を最適化し得る。
Z11デサチュラーゼ(昆虫由来:クルミマダラメイガ(Amyelois transitella)、アメリカタバコガ(Helicoverpa zea)、イラクサギンウワバ(Trichoplusia ni))の焦点を絞ったライブラリ(これらはS.セレビシエ(S. cerevisiae)又はC.ビスワナチイ(C. viswanathii)のいずれかにおいて活性が観察された)を、URA3選択マーカーを有するXPR2遺伝子座を標的とするダブルクロスオーバーカセットにクローニングした。タンパク質コード配列は、天然昆虫配列(配列番号24、25)、ヒト(Homo sapiens)最適化コード配列(配列番号26、27)、又はN末端84塩基(アメリカタバコガ(H. Zea)、配列番号29)又は81塩基(イラクサギンウワバ(T. ni)、配列番号28)がY.リポリティカ(Y. lipolytica)OLE1(YALI0C05951)遺伝子のN末端96塩基と交換されているヒト(Homo sapiens)最適化配列のいずれかを使用する。S.セレビシエ(S. cerevisiae)及びC.ビスワナチイ(C. viswanathii)スクリーニングと異なり、リーダー配列キメラは、宿主リーダー配列が完全長デサチュラーゼコード配列のN末端に連結されているのではなく、リーダー配列の直接的な交換を試験する。クルミマダラメイガ(A. transitella)デサチュラーゼについては、天然コード配列のみを使用した(配列番号30)。
株の樹立
XPR2遺伝子座への組込みを標的とするY.リポリティカ(Y. lipolytica)発現カセットを含むpPV101ベクターにデサチュラーゼ変異体をクローニングした。
C.ビスワナチイ(C. viswanathii)SPV053における膜貫通デサチュラーゼ発現に使用したプロトコルの変法によって機能的活性を評価した(実施例6を参照されたい)。簡潔に言えば、昆虫デサチュラーゼを発現するY.リポリティカ(Y. lipolytica)SPV140及びSPV300由来の株を富栄養(YPD)培地で培養してバイオマスを生じさせた。YPDで生じたバイオマスを使用して、小規模(2ml)培養物をパルミチン酸と共に24ディープウェルプレートにおいて合計48時間培養した(詳細については材料及び方法を参照されたい)。
アメリカタバコガ(H. Zea)Z11デサチュラーゼは活性であり、約500mg/L パルミチン酸基質から約100mg/L Z11−ヘキサデセン酸の生成をもたらす。3つの陽性組込み体及び24ウェルプレートアッセイにおけるレプリケート実験にわたって機能発現が実証された。
株の樹立
全てのデサチュラーゼ遺伝子を合成した(Genscript)。天然配列又はヒト(Homo sapiens)コドン最適化のいずれかを使用した。合成した遺伝子はpPV101にサブクローニングした。プラスミドを形質転換し、Zyppyプラスミドミニプレップキット(Zymo Research、Irvine, CA)を使用して大腸菌(E. coli)EPI400からプレップした。Frozen-EZ Yeast Transformation II Kit(Zymo Research、Irvine, CA)を使用して約1〜2μgの線状化DNAを形質転換した。形質転換混合物全体をCMグルコース −ura寒天プレートにプレーティングした。陽性組込み体は部位特異的であることが分かり、チェックPCRにより遺伝子タイピングを行った。
YPDにおけるパルミチン酸補足
陽性分離株をYPDに再パッチし、一晩成長させ、次に4℃で保存した。株をパッチプレートから24ディープウェルプレート(四角形ウェル、ピラミッド形底)内の2mlのYPDに接種した。各デサチュラーゼ変異体につき3つの陽性クローンを接種した。SPV140及び親SPV300におけるpPV101の3つの分離株を陰性対照として使用した。ディープウェルプレートを28℃及び250rpmでInfors Multitron冷却フラスコシェーカーにおいて24時間インキュベートした。24時間インキュベートした後、1ml容積の各培養物を500×gで遠心することによりペレット化した。各ペレットを2mlのYPDに再懸濁した。エタノール中90g/Lストック溶液からの培養物に500mg/Lパルミチン酸を加えた。この結果、0.5%エタノールをパルミチン酸基質と共に加えることになった。培養物は全て、48時間インキュベートした後にエンドポイント試料を採取した。最終細胞密度はTecan Infinite 200proプレートリーダーで測定した。0.75又は0.8mlの各培養物を1.7ml微量遠心管に回収し、ペレット化した。上清を除去し、ペレットを以下に記載するとおり処理した。
全脂質組成並びに(Z)−11−ヘキサデセン酸定量化は、Moss et al. (1982)及びYousuf et al (2010)による変法に基づいた。通常約10mg〜80mgのペレット化した細胞(1.5mLプラスチックチューブ内)を、5%(w/w)の水酸化ナトリウムを含有するメタノール中に再懸濁した。アルカリ性細胞懸濁液を1.8mLクリンプバイアルに移した。この混合物を90℃のヒートブロックで1時間加熱した。400 2.5N HClで酸性化する前に、バイアルを放冷して室温に戻した。1mMヘプタデカン酸メチルを含有する500μLクロロホルムを加え、この混合物を激しく振盪し、次に水相及び有機相の両方を1.5mLプラスチックチューブに移した。この混合物を13,000rpmで遠心した後、450μLの有機相をGCバイアルに移した。脂質の分析及び脂肪酸の定量化のため、50μLの0.2M TMSH(メタノール中水酸化トリメチルスルホニウム)を加え、試料をGC−FIDによって分析した。
背景及び理論的根拠
昆虫膜貫通デサチュラーゼ及びレダクターゼの変異体を予めスクリーニングし、カンジダ・ビスワナチイ(Candida viswanathii)又はサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)のいずれかにおけるそれらの機能発現に基づき順位付けした(実施例3、4及び6を参照されたい)。アメリカタバコガ(Helicoverpa zea)デサチュラーゼ及びオオタバコガ(Helicoverpa armigera)レダクターゼを選択してC.ビスワナチイ(C. viswanathii)における合成昆虫脂肪アルコール経路をアセンブルした。カンジダ属(Candida)イソクエン酸リアーゼ(ICL)プロモーター下にあるコドン最適化アメリカタバコガ(H. Zea)デサチュラーゼと、カンジダ属(Candida)転写伸長因子(TEF)プロモーター下にあるコドン最適化オオタバコガ(H. armigera)レダクターゼとの同時発現を完全脂肪アルコール経路のゲノム組込みによって達成した。組換え株(SPV0490)の培養物において単純炭素源及びパルミチン酸を使用してZ11−16OHの蓄積を達成した。
推定構成的C.トロピカリス(C. tropicalis)プロモーター(pTEF)によってドライブされるオオタバコガ(Helicoverpa armigera)レダクターゼと対にした機能性アメリカタバコガ(Helicoverpa zea)デサチュラーゼ(実施例6を参照されたい)を含む組込みプラスミドを設計した。
ICLプロモーター下にあるアメリカタバコガ(H. Zea)デサチュラーゼ及びTEFプロモーター下にあるオオタバコガ(H. armigera)レダクターゼを発現するように改変されたカンジダ属(Candida)の培養物にZ11−16OHの蓄積が検出された(表12及び図30)。
株の樹立
2つの発現カセットを含む組込みプラスミド(ppV0228)を設計した。第一のカセットは、C.ビスワナチイ(C. viswanathii)ICLプロモーター(配列番号33)によってドライブされるアメリカタバコガ(H. Zea)コドン最適化デサチュラーゼ(配列番号31)を含む。第2のカセットは、C.トロピカリス(C. tropicalis)TEFプロモーター(配列番号34)によってドライブされるコドン最適化オオタバコガ(H. armigera)レダクターゼ(配列番号32)を含む。ICLプロモーターカセットの遺伝子発現はICLターミネーター配列(配列番号35)によって終結する。TEFプロモーターカセットの遺伝子発現はTEFターミネーター配列(配列番号36)によって終結する。遺伝子の記録には従来手法を用いた。天然遺伝子CTGロイシンコドンをTTAに置き換えたことを除き、配列は変化させなかった。大腸菌(E. coli)NEB10βへの形質転換後、Zyppyプラスミドミニプレップキット(Zymo Research、Irvine, CA)を用いてプラスミドをミニプレップした。BsiWI(New England Biolabs、Ipswich, MA)で消化することによりプラスミドを線状化した後、SPV053に形質転換した。消化後、Clean and Concentrator Kit(Zymo Research、Irvine, CA)を使用してDNAを単離した。約3〜5μgのDNAを電気穿孔によって形質転換した。陽性組込み体は部位特異的であることが分かり、チェックPCRにより遺伝子タイピングを行った。低効率転換の更なるスクリーニングに二段階手法を取った。約100コロニーをYPD+250μg/mlゼオシンに再パッチし、一晩成長させた。急速に成長した(24時間以内の高密度増殖)一部のパッチをコロニーPCRによってスクリーニングした。
YPDにおけるパルミチン酸補足
陽性分離株をYPD+300μg/mlゼオシンに再パッチし、一晩成長させ、次に4℃で保存した。株をパッチプレートから24ディープウェルプレート(四角形ウェル、ピラミッド形底)内の2mlのYPDに接種した。各デサチュラーゼ及びレダクターゼ変異体につき4つの陽性クローンを接種し、及び各デサチュラーゼ及びmCherry発現対照株につき3つの陽性クローンを接種した。ディープウェルプレートを30℃、1000rpm、及び80%湿度でInfors HT Multitron Proプレートシェーカーにおいて24時間インキュベートした。24時間インキュベートした後、1ml容積の各培養物を500×gで遠心することによりペレット化した。各ペレットは2mlのYPD+0.3%(v/v)エタノールに再懸濁した。この段階でエタノールを加えて、ICLプロモーターからの組換え酵素発現を誘導した。培養物を同じ条件下で更に24時間インキュベートした後、エタノール中90g/Lストック溶液からの培養物に300mg/Lパルミチン酸を加えた。この結果は、新鮮0.3%エタノールをパルミチン酸と併せて加えることであった。全ての培養物を更に24時間インキュベートした後、最後に0.3%エタノールを加えた。更に24時間インキュベートした後、1.5mlの各培養物を1.7ml微量遠心管に回収し、ペレット化した。上清を除去し、ペレットを以下に記載するとおり処理した。
通常約10mg〜80mgのペレット化した細胞(1.5mLプラスチックチューブ内)を、5%(w/w)の水酸化ナトリウムを含有するメタノール中に再懸濁した。アルカリ性細胞懸濁液を1.8mLクリンプバイアルに移した。この混合物を90℃のヒートブロックで1時間加熱した。400μL 2.5N HClで酸性化する前に、バイアルを放冷して室温に戻した。1mMヘプタデカン酸メチルを含有する500μLクロロホルムを加え、この混合物を激しく振盪し、次に水相及び有機相の両方を1.5mLプラスチックチューブに移した。この混合物を13,000rpmで遠心した後、450μLの有機相をGCバイアルに移した。有機相を90℃のヒートブロックにおいて30分間蒸発させた。1%トリメチルクロロシランを含有する50μL N,O−ビス(トリメチルシリル)トリフルオロアセタミドに残渣を溶解した。ガラスインサートに移す前に、この混合物を90℃で5分加熱した。この試料をGC−MSによって分析した(表13)。
背景及び理論的根拠
パルミチン酸からの昆虫脂肪アルコール(Z11−16OH及びZ9−16OH)合成の生成プラットフォームとしてヤロウイア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)を改変した。
2つの生物不飽和化−還元(Bdr)経路変異体をH222 ΔPΔAΔF(SPV300)バックグラウンドで試験した。第1は、アメリカタバコガ(Helicoverpa zea)Z11デサチュラーゼをオオタバコガ(Helicoverpa armigera)脂肪アシル−CoAレダクターゼ(FAR)と対にした組換え発現を組み合わせてZ11−16OH合成経路を作り出した。第2は、天然Y.リポリティカ(Y. lipolytica)Z9デサチュラーゼ活性をオオタバコガ(H. armigera)脂肪アシル−CoAレダクターゼ(FAR)発現と組み合わせてZ9−16OH経路を作り出した。
アメリカタバコガ(H. Zea)デサチュラーゼ(pTEF)及びオオタバコガ(H. armigera)レダクターゼ(pEXP1)を発現する10個の分離株をスクリーニングした。インビボ生物変換アッセイにより、全ての分離株からのZ11−16OH生成が確認された。
株の樹立
文献のエビデンスから、昆虫デサチュラーゼ及びFARは両方とも、活性部位が細胞質に向かって配向した小胞体の膜に局在することが示唆される。機能変異体のうち、アメリカタバコガ(H. Zea)由来のZ11デサチュラーゼ及びオオタバコガ(H. armigera)由来のFARを選択し、1つ仮説は、同じ属(ヘリコベルパ属(Helicoverpa))由来の酵素であれば、ER膜に起こり得るタンパク質間相互作用をより良好に保つことができるであろうというものであった。
インビボ24ウェルプレートアッセイを用いてZ11−16OHの生成を判定した。このアッセイは、スクリーニングデサチュラーゼ及びレダクターゼ変異体に用いられる設計、並びに脂肪酸蓄積を増加させるために用いられる条件に基づいた。10g/Lパルミチン酸メチルを生物変換基質として補足した富栄養培地(YPD)及び半限定培地を使用した。半限定培地は約80のC:N比を有し、5g/Lグリセロール及び60g/Lグルコースを含んだ(更なる詳細については材料及び方法を参照されたい)。
インビボフラスコ規模アッセイを用いてZ9−16OH生成を試験した。親対照株のH222 ΔPΔAΔF(SPV300)を、オオタバコガ(H. armigera)FARを発現する株(Z9−16CoA前駆体(SPV471)の合成を天然Z9デサチュラーゼ活性に頼る)と比較した。プレートアッセイを模倣するYPDシード培養によってバイオマスを作成した。生物変換フラスコをZ11−16OHプレートアッセイにおいて用いた同じ半限定C:N=80培地に初期OD600=1又はOD600=4で接種した(詳細については材料及び方法を参照されたい)。予想どおり、対照フラスコは検出可能なZ9−16OHを生成しなかったが、SPV471フラスコは24時間のインキュベーション後に最大4.30±2.23mg/Lを生成した(図37A〜図37B)。レプリケート間には大きいばらつきがあったが、全てのSPV471(オオタバコガ(H. armigera)FAR)レプリケートが1mg/L力価を超えた。播種密度を増加させてもZ9−16Acid又はZ9−16OH力価は増加しなかった。24時間における前駆体Z9−16Acid力価は、Z11−16OHの生成に用いられるデュアル発現カセット株について観察されたZ11−16Acid前駆体よりも著しく低かった(<0.5g/L)。他の脂肪酸種の相対的存在量も、先に観察されたプロファイルと同様であり、次に最も豊富な種としてZ9−18Acidがあった(図38)。48時間の経過中に脂質試料及びアルコール試料の両方を採取して、Z9−16OH力価及び脂質力価の時間変化を作成した。Z9−16OH力価は24時間でピークとなり、その後2日目にわたって低下した(図39A)。Z9−16Acidは最初の24時間で急速に増加し、その後次の24時間にわたって安定化し、又はゆっくりと増加した(図39B)。用いた分析的方法は細胞ペレットのみを利用するため、Z9−16OH力価の低下は、アルコール生成物が下流で消費又は分泌されるという仮説を裏付けている。アルコール生成物は酸化されるか(ω−酸化)、遊離アルコールとして分泌されるか、又は誘導体化されてエステルとして分泌され得る。FID及びMS SCAN検出を用いた上清試料の分析から、検出可能なZ9−16OH又はZ9−16OH誘導体がないことが明らかになり、酸化経路を通じた消費の仮説を裏付けている。
ヘリコベルパ属(Helicoverpa)Z11デサチュラーゼと脂肪アシル−CoAレダクターゼとの組み合わせ発現は、Y.リポリティカ(Y. lipolytica)H222 ΔPΔAΔF(SPV300)における力価>1mg/LでのZ11−16OHの生成につながった。
株の樹立
全てのデサチュラーゼ及びレダクターゼ遺伝子はGenscriptから注文した。ヒト(Homo sapiens)コドン最適化を用いた(Genscriptアルゴリズム)。新しく合成した発現カセットをGenscriptによってSapI制限部位を用いてpPV199にサブクローニングした。プラスミドを形質転換し、大腸菌(E. coli)EPI400からZyppy Plamsid Miniprep Kit(Zymo Research、Irvine, CA)を用いてプレップした。プラスミドをPmeI(New England Biolabs、Ipswich, MA)で消化し、Zymoclean Gel DNA recovery Kit(Zymo Research、Irvine, CA)を用いたゲル抽出によって精製した。Clean and Concentrator Kit(Zymo Research、Irvine, CA)を用いてDNAを更に濃縮した。Frozen-EZ Yeast Transformation II Kit(Zymo Research、Irvine, CA)を用いて約1〜2μgのDNAを形質転換した。製造者のプロトコルを以下のとおり変更した:2ml YPDシード培養物はコンピテント細胞調製前日の午前9時に接種した。シードは8時間(午後5時まで)成長させて、その後250mlバッフル付き振盪フラスコに入った40mlのYPD(又は125mlバッフル付きフラスコ内の20ml)を0.0005の初期OD600になるように接種した。培養物は28℃及び250rpmで約24時間インキュベートした。OD600=0.5〜1で細胞を回収した。製造者の指示にあるとおり10mlの培養物を1mlの溶液2に再懸濁する(OD600約10)代わりに、10mlのSPV140培養物を0.5mlに再懸濁した(OD600約20〜30)。溶液2アリコートは全て、チューブを密閉されたスタイロフォームボックスに置いた後−80℃のフリーザーに入れることによりゆっくりと−80℃に凍結した。1.7mlエッペンドルフ試験管内のコンピテント細胞の50μlアリコートを氷上で解凍し、水中に溶出したDNAを直接細胞に加え、及び500μlの溶液3を用いて穏やかにピペッティングしながら細胞を懸濁した。チューブを28℃で3時間、30分毎に穏やかにボルテックスしながらインキュベートした。形質転換混合物全体をCMグルコース −ura寒天プレートにプレーティングした。陽性組込み体は部位特異的であることが分かり、チェックPCRにより遺伝子タイピングを行った。
陽性分離株をYPDに再パッチし、一晩成長させ、次に4℃で保存した。株をパッチプレートから24ディープウェルプレート(四角形ウェル、ピラミッド形底)内の2mlのYPDに接種した。各パッチからレプリケート接種を行った。陰性対照株はグリセロールストックからYPDにストリーク(struck out)し、個々のコロニーを使用して接種した。ディープウェルプレートを28℃及び250rpmでInfors Multitron冷却フラスコシェーカーにおいて24時間インキュベートした。24時間インキュベートした後、0.85ml容積の各培養物を800×gで遠心することによりペレット化した。各ペレットは2mlのYPD又は半限定培地のいずれかに再懸濁した(以下の表17に記載する)。培養物に10g/Lパルミチン酸メチル(約50℃に予熱した)を加えた。培養物は全て、48時間インキュベートした後にエンドポイント試料を採取した。最終細胞密度はTecan Infinite 200proプレートリーダーで測定した。1.5ml(アルコール分析)又は500μl(脂質分析)を1.7ml微量遠心管に移し、ペレット化した。上清を清浄なチューブに移し、試料を以下に記載するとおり処理した。
SPV300(陰性対照)及びSPV471をYPD寒天プレートにストリーク(struck out)し、一晩成長させ、次に4℃で保存した。株をコロニーから2mlのYPDに接種し、14ml丸底培養管において28℃及び250rpmで約8時間インキュベートした。インキュベーション後、2mlの培養物を使用して125mlバッフル付き振盪フラスコ内の20mlのYPDを接種した。振盪フラスコを28℃及び250rpmで24時間インキュベートした。インキュベーション後、Tecan Infinite 200proプレートリーダーを使用して振盪フラスコ内の細胞密度を測定した。適切な容積の培養物をペレット化することにより、細胞を25mlの半限定C:N=80培地(上記表17を参照されたい)に初期OD600=1(約1gDCW/L)又は4(約4gDCW/L)で再懸濁した。この再懸濁培養物を250mlバッフル付き振盪フラスコに加えた。50℃に予熱した後にニートなパルミチン酸メチルを10g/Lの最終濃度で加えた。基質を加えた後、フラスコを28℃及び250rpmで2日間インキュベートした。12、18、24、36、42、及び48時間目に500μl(脂質分析)及び1.5ml(アルコール分析)の試料を1.7ml微量遠心管に採取した。試料をペレット化し、上清を清浄な微量遠心管に移した。
アルコール分析
通常約10mg〜80mgのペレット化した細胞(1.5mLプラスチックチューブ内)を、5%(w/w)の水酸化ナトリウムを含有するメタノール中に再懸濁した。アルカリ性細胞懸濁液を1.8mLクリンプバイアルに移した。この混合物を90℃のヒートブロックで1時間加熱した。400μL 2.5N HClで酸性化する前に、バイアルを放冷して室温に戻した。1mMヘプタデカン酸メチルを含有する500μLクロロホルムを加え、この混合物を激しく振盪し、次に水相及び有機相の両方を1.5mLプラスチックチューブに移した。この混合物を13,000rpmで遠心した後、450μLの有機相をGCバイアルに移した。有機相を90℃のヒートブロックにおいて30分間蒸発させた。1%トリメチルクロロシランを含有する50μL N,O−ビス(トリメチルシリル)トリフルオロアセタミドに残渣を溶解した。ガラスインサートに移す前に、この混合物を90℃で5分加熱した。この試料をGC−MSによって分析した(表18)。
全脂質組成は、Moss et al. (1982)及びYousuf et al (2010)による変法に基づいた。通常約10mg〜80mgのペレット化した細胞(1.5mLプラスチックチューブ内)を、5%(w/w)の水酸化ナトリウムを含有するメタノール中に再懸濁した。アルカリ性細胞懸濁液を1.8mLガラスクリンプGC−バイアルに移した。この混合物を90℃のヒートブロックで1時間加熱した。400μL 2.5N HClで酸性化する前に、バイアルを放冷して室温に戻した。1mMヘプタデカン酸メチルを含有する500μLクロロホルムを加え、この混合物を激しく振盪し、次に水相及び有機相の両方を1.5mLプラスチックチューブに移した。この混合物を13,000rpmで遠心した後、450μLの有機相を新しい1.8mLガラススクリューキャップGC−バイアルに移した。室温に冷却した後、残留する脂肪酸メチルエステル及び遊離脂肪酸を溶解し、0.2M TMSH(水酸化トリメチルスルホニウム)を含有するメタノール中で誘導体化した(表19)。
Claims (94)
- 飽和C6〜C24脂肪アシル−CoAの内因性又は外因性供給源から一不飽和又は多価不飽和C6〜C24脂肪アルコールを生成する能力を有する組換え微生物であって、
(a)飽和C6〜C24脂肪アシル−CoAの、対応する一不飽和又は多価不飽和C6〜C24脂肪アシル−CoAへの変換を触媒する脂肪アシルデサチュラーゼをコードする少なくとも1つの外因性核酸分子;及び
(b)(a)からの前記一不飽和又は多価不飽和C6〜C24脂肪アシル−CoAの、前記対応する一不飽和又は多価不飽和C6〜C24脂肪アルコールへの変換を触媒する脂肪アルコール形成脂肪アシルレダクターゼをコードする少なくとも1つの外因性核酸分子
を発現する組換え微生物。 - 前記脂肪アシルデサチュラーゼが、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、又は24炭素原子の鎖長を有する脂肪アシル−CoAを基質として利用する能力を有するデサチュラーゼである、請求項1に記載の組換え微生物。
- 前記脂肪アシルデサチュラーゼがZ11デサチュラーゼである、請求項1又は2に記載の組換え微生物。
- 前記Z11デサチュラーゼが、カブラヤガ(Agrotis segetum)、クルミマダラメイガ(Amyelois transitella)、アカオビコハマキ(Argyrotaenia velutiana)、ハスオビハマキ(Choristoneura rosaceana)、カラントシュートボーラー(Lampronia capitella)、イラクサギンウワバ(Trichoplusia ni)、アメリカタバコガ(Helicoverpa zea)、又はタラシオシラ・シュードナナ(Thalassiosira pseudonana)種の生物由来である、請求項3に記載の組換え微生物。
- 前記Z11デサチュラーゼが、脂肪アシル−CoAの、Z11−13:アシル−CoA、E11−13:アシル−CoA、(Z,Z)−7,11−13:アシル−CoA、Z11−14:アシル−CoA、E11−14:アシル−CoA、(E,E)−9,11−14:アシル−CoA、(E,Z)−9,11−14:アシル−CoA、(Z,E)−9,11−14:アシル−CoA、(Z,Z)−9,11−14:アシル−CoA、(E,Z)−9,11−15:アシル−CoA、(Z,Z)−9,11−15:アシル−CoA、Z11−16:アシル−CoA、E11−16:アシル−CoA、(E,Z)−6,11−16:アシル−CoA、(E,Z)−7,11−16:アシル−CoA、(E,Z)−8,11−16:アシル−CoA、(E,E)−9,11−16:アシル−CoA、(E,Z)−9,11−16:アシル−CoA、(Z,E)−9,11−16:アシル−CoA、(Z,Z)−9,11−16:アシル−CoA、(E,E)−11,13−16:アシル−CoA、(E,Z)−11,13−16:アシル−CoA、(Z,E)−11,13−16:アシル−CoA、(Z,Z)−11,13−16:アシル−CoA、(Z,E)−11,14−16:アシル−CoA、(E,E,Z)−4,6,11−16:アシル−CoA、(Z,Z,E)−7,11,13−16:アシル−CoA、(E,E,Z,Z)−4,6,11,13−16:アシル−CoA、Z11−17:アシル−CoA、(Z,Z)−8,11−17:アシル−CoA、Z11−18:アシル−CoA、E11−18:アシル−CoA、(Z,Z)−11,13−18:アシル−CoA、(E,E)−11,14−18:アシル−CoA、又はこれらの組み合わせから選択される一不飽和又は多価不飽和生成物への変換を触媒する、請求項3に記載の組換え微生物。
- 前記脂肪アシルデサチュラーゼがZ9デサチュラーゼである、請求項1又は2に記載の組換え微生物。
- 前記Z9デサチュラーゼが、アワノメイガ(Ostrinia furnacalis)、ヨーロッパアワノメイガ(Ostrinia nobilalis)、ハスオビハマキ(Choristoneura rosaceana)、カラントシュートボーラー(Lampronia capitella)、タバコガ(Helicoverpa assulta)、又はアメリカタバコガ(Helicoverpa zea)種の生物由来である、請求項6に記載の組換え微生物。
- 前記Z9デサチュラーゼが、脂肪アシル−CoAの、Z9−11:アシル−CoA、Z9−12:アシル−CoA、E9−12:アシル−CoA、(E,E)−7,9−12:アシル−CoA、(E,Z)−7,9−12:アシル−CoA、(Z,E)−7,9−12:アシル−CoA、(Z,Z)−7,9−12:アシル−CoA、Z9−13:アシル−CoA、E9−13:アシル−CoA、(E,Z)−5,9−13:アシル−CoA、(Z,E)−5,9−13:アシル−CoA、(Z,Z)−5,9−13:アシル−CoA、Z9−14:アシル−CoA、E9−14:アシル−CoA、(E,Z)−4,9−14:アシル−CoA、(E,E)−9,11−14:アシル−CoA、(E,Z)−9,11−14:アシル−CoA、(Z,E)−9,11−14:アシル−CoA、(Z,Z)−9,11−14:アシル−CoA、(E,E)−9,12−14:アシル−CoA、(Z,E)−9,12−14:アシル−CoA、(Z,Z)−9,12−14:アシル−CoA、Z9−15:アシル−CoA、E9−15:アシル−CoA、(Z,Z)−6,9−15:アシル−CoA、Z9−16:アシル−CoA、E9−16:アシル−CoA、(E,E)−9,11−16:アシル−CoA、(E,Z)−9,11−16:アシル−CoA、(Z,E)−9,11−16:アシル−CoA、(Z,Z)−9,11−16:アシル−CoA、Z9−17:アシル−CoA、E9−18:アシル−CoA、Z9−18:アシル−CoA、(E,E)−5,9−18:アシル−CoA、(E,E)−9,12−18:アシル−CoA、(Z,Z)−9,12−18:アシル−CoA、(Z,Z,Z)−3,6,9−18:アシル−CoA、(E,E,E)−9,12,15−18:アシル−CoA、(Z,Z,Z)−9,12,15−18:アシル−CoA、又はこれらの組み合わせから選択される一不飽和又は多価不飽和生成物への変換を触媒する、請求項7に記載の組換え微生物。
- 飽和C6〜C24脂肪アシル−CoAの、対応する一不飽和又は多価不飽和C6〜C24脂肪アシル−CoAへの変換を触媒する脂肪アシルデサチュラーゼをコードする少なくとも2つの外因性核酸分子を発現する、請求項1〜8のいずれか一項に記載の組換え微生物。
- 飽和又は一不飽和C6〜C24脂肪アシル−CoAの内因性又は外因性供給源から多価不飽和C6〜C24脂肪アルコールを生成する能力を有する組換え微生物であって、
(a)飽和又は一不飽和C6〜C24脂肪アシル−CoAの、対応する多価不飽和C6〜C24脂肪アシル−CoAへの変換を触媒する脂肪アシルコンジュガーゼをコードする少なくとも1つの外因性核酸分子;及び
(b)(a)からの前記多価不飽和C6〜C24脂肪アシル−CoAの、前記対応する多価不飽和C6〜C24脂肪アルコールへの変換を触媒する脂肪アルコール形成脂肪アシルレダクターゼをコードする少なくとも1つの外因性核酸分子
を発現する組換え微生物。 - 飽和又は一不飽和C6〜C24脂肪アシル−CoAの、対応する多価不飽和C6〜C24脂肪アシル−CoAへの変換を触媒する脂肪アシルコンジュガーゼをコードする少なくとも2つの外因性核酸分子を発現する、請求項10に記載の組換え微生物。
- 飽和又は一不飽和C6〜C24脂肪アシル−CoAの内因性又は外因性供給源から多価不飽和C6〜C24脂肪アルコールを生成する能力を有する組換え微生物であって、
(a)飽和又は一不飽和C6〜C24脂肪アシル−CoAの、対応する多価不飽和C6〜C24脂肪アシル−CoAへの変換を触媒する、脂肪アシルデサチュラーゼをコードする少なくとも1つの外因性核酸分子及び脂肪アシルコンジュガーゼをコードする少なくとも1つの外因性核酸分子;及び
(b)(a)からの前記多価不飽和C6〜C24脂肪アシル−CoAの、前記対応する多価不飽和C6〜C24脂肪アルコールへの変換を触媒する脂肪アルコール形成脂肪アシルレダクターゼをコードする少なくとも1つの外因性核酸分子
を発現する組換え微生物。 - 飽和又は一不飽和C6〜C24脂肪アシル−CoAの、対応する多価不飽和C6〜C24脂肪アシル−CoAへの変換を触媒する、脂肪アシルデサチュラーゼをコードする少なくとも2つの外因性核酸分子及び脂肪アシルコンジュガーゼをコードする少なくとも2つの外因性核酸分子を発現する、請求項12に記載の組換え微生物。
- 前記脂肪アシルコンジュガーゼが、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、又は24炭素原子の鎖長を有する脂肪アシル−CoAを基質として利用する能力を有するコンジュガーゼである、請求項10〜13のいずれか一項に記載の組換え微生物。
- 前記脂肪アルコール形成脂肪アシルレダクターゼが、カブラヤガ(Agrotis segetum)、エジプトヨトウ(Spodoptera littoralis)、又はオオタバコガ(Helicoverpa amigera)種の生物由来である、請求項1〜14のいずれか一項に記載の組換え微生物。
- 前記脂肪アシルレダクターゼが、一不飽和又は多価不飽和脂肪アシル−CoAの、(Z)−3−ヘキセノール、(Z)−3−ノネノール、(Z)−5−デセノール、(E)−5−デセノール、(Z)−7−ドデセノール、(E)−8−ドデセノール、(Z)−8−ドデセノール、(Z)−9−ドデセノール、(Z)−9−テトラデセノール、(Z)−9−ヘキサデセノール、(Z)−11−テトラデセノール、(Z)−7−ヘキサデセノール、(Z)−11−ヘキサデセノール、(E)−11−テトラデセノール、又は(Z,Z)−11,13−ヘキサデカジエノール、(11Z,13E)−ヘキサデカジエノール、(E,E)−8,10−ドデカジエノール、(E,Z)−7,9−ドデカジエノール、(Z)−13−オクタデセノール、又はこれらの組み合わせから選択される脂肪アルコール生成物への変換を触媒する、請求項15に記載の組換え微生物。
- (a)からの前記一不飽和又は多価不飽和C6〜C24脂肪アシル−CoAの、前記対応する一不飽和又は多価不飽和C6〜C24脂肪アルコールへの変換を触媒する脂肪アルコール形成脂肪アシルレダクターゼをコードする少なくとも2つの外因性核酸分子を発現する、請求項1〜16のいずれか一項に記載の組換え微生物。
- C6〜C24脂肪酸の内因性又は外因性供給源から一不飽和又は多価不飽和C6〜C24脂肪アルコールを生成する能力を有する組換え微生物であって、
(a)飽和C6〜C24脂肪酸の、対応する飽和C6〜C24脂肪アシル−ACPへの変換を触媒するアシル−ACPシンテターゼをコードする少なくとも1つの外因性核酸分子;
(b)飽和C6〜C24脂肪アシル−ACPの、対応する一不飽和又は多価不飽和C6〜C24脂肪アシル−ACPへの変換を触媒する脂肪アシル−ACPデサチュラーゼをコードする少なくとも1つの外因性核酸分子;
(c)(b)からの前記一不飽和又は多価不飽和C6〜C24脂肪アシル−ACPの、(b)の前記生成物と比べて2炭素の伸長を有する対応する一不飽和又は多価不飽和C6〜C24脂肪アシル−ACPへの変換を触媒する脂肪酸シンターゼ複合体をコードする1つ以上の内因性又は外因性核酸分子;
(d)(c)からの前記一不飽和又は多価不飽和C6〜C24脂肪アシル−ACPの、前記対応するC6〜C24脂肪アルデヒドへの変換を触媒する脂肪アルデヒド形成脂肪アシルレダクターゼをコードする少なくとも1つの外因性核酸分子;及び
(e)(d)からの前記一不飽和又は多価不飽和C6〜C24脂肪アルデヒドの、対応する一不飽和又は多価不飽和C6〜C24脂肪アルコールへの変換を触媒するデヒドロゲナーゼをコードする少なくとも1つの内因性又は外因性核酸分子
を発現する組換え微生物。 - 前記アシル−ACPシンテターゼが、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、又は24炭素原子の鎖長を有する脂肪酸を基質として利用する能力を有するシンテターゼである、請求項18に記載の組換え微生物。
- 前記アシル−ACPシンテターゼが、ビブリオ・ハーベイ(Vibrio harveyi)、ロドトルラ・グルチニス(Rhodotorula glutinis)、又はヤロウイア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)種の生物由来である、請求項18又は19に記載の組換え微生物。
- 前記脂肪アシル−ACPデサチュラーゼが可溶性デサチュラーゼである、請求項18〜20のいずれか一項に記載の組換え微生物。
- 前記脂肪アシル−ACPデサチュラーゼが、ハナテンジクアオイ(Pelargonium hortorum)、オオトウワタ(Asclepias syriaca)、又はキャッツクロー(Uncaria tomentosa)種の生物由来である、請求項18〜20のいずれか一項に記載の組換え微生物。
- 脂肪酸シンターゼ複合体をコードする前記1つ以上の核酸分子が内因性核酸分子である、請求項18〜22のいずれか一項に記載の組換え微生物。
- 脂肪酸シンターゼ複合体をコードする前記1つ以上の核酸分子が外因性核酸分子である、請求項18〜22のいずれか一項に記載の組換え微生物。
- 前記脂肪アルデヒド形成脂肪アシルレダクターゼが、ハナテンジクアオイ(Pelargonium hortorum)、オオトウワタ(Asclepias syriaca)、及びキャッツクロー(Uncaria tomentosa)種の生物由来である、請求項18〜24のいずれか一項に記載の組換え微生物。
- デヒドロゲナーゼをコードする前記核酸分子が前記組換え微生物にとって内因性である、請求項18〜25のいずれか一項に記載の組換え微生物。
- デヒドロゲナーゼをコードする前記核酸分子が前記組換え微生物にとって外因性である、請求項18〜25のいずれか一項に記載の組換え微生物。
- デヒドロゲナーゼをコードする前記内因性又は外因性核酸分子が、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、大腸菌(Escherichia coli)、ヤロウイア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)、又はカンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis)種の生物から単離される、請求項18〜25のいずれか一項に記載の組換え微生物。
- C6〜C24脂肪酸の内因性又は外因性供給源から不飽和C6〜C24脂肪アルコールを生成する能力を有する組換え微生物であって、
(a)C6〜C24脂肪酸の、対応する飽和C6〜C24脂肪アシル−ACPへの変換を触媒するアシル−ACPシンテターゼをコードする少なくとも1つの外因性核酸分子;
(b)飽和C6〜C24脂肪アシル−ACPの、対応する一不飽和又は多価不飽和C6〜C24脂肪アシル−ACPへの変換を触媒する脂肪アシル−ACPデサチュラーゼをコードする少なくとも1つの外因性核酸分子;
(c)(b)からの前記一不飽和又は多価不飽和C6〜C24脂肪アシル−ACPの、対応する一不飽和又は多価不飽和C6〜C24脂肪酸への変換を触媒する少なくとも1つの外因性脂肪アシル−ACPチオエステラーゼ;
(d)(c)からの前記一不飽和又は多価不飽和C6〜C24脂肪酸のCoA活性化から誘導される一不飽和又は多価不飽和C6〜C24脂肪アシル−CoAの、(c)の前記生成物と比べて2炭素以上の伸長を有する対応する一不飽和又は多価不飽和C6〜C24脂肪アシル−CoAへの変換を触媒するエロンガーゼをコードする1つ以上の内因性又は外因性核酸分子;及び
(e):(d)からの前記一不飽和又は多価不飽和C6〜C24脂肪アシル−CoAの、対応する一不飽和又は多価不飽和C6〜C24脂肪アルコールへの変換を触媒する脂肪アルコール形成脂肪アシルレダクターゼをコードする少なくとも1つの外因性核酸分子
を発現する組換え微生物。 - 前記アシル−ACPシンテターゼが、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、又は24炭素原子の鎖長を有する脂肪酸を基質として利用する能力を有するシンテターゼである、請求項29に記載の組換え微生物。
- 前記アシル−ACPシンテターゼが、ビブリオ・ハーベイ(Vibrio harveyi)、ロドトルラ・グルチニス(Rhodotorula glutinis)、又はヤロウイア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)種の生物由来である、請求項29又は30に記載の組換え微生物。
- 前記脂肪アシル−ACPデサチュラーゼが可溶性デサチュラーゼである、請求項29〜31のいずれか一項に記載の組換え微生物。
- 前記脂肪アシル−ACPデサチュラーゼが、ハナテンジクアオイ(Pelargonium hortorum)、オオトウワタ(Asclepias syriaca)、又はキャッツクロー(Uncaria tomentosa)種の生物由来である、請求項29〜31のいずれか一項に記載の組換え微生物。
- 前記組換え微生物が、アルコールオキシダーゼ又はアルコールデヒドロゲナーゼをコードする少なくとも1つの内因性又は外因性核酸分子を更に含み、前記アルコールオキシダーゼ又はアルコールデヒドロゲナーゼが、C6〜C24脂肪アルコールの、対応するC6〜C24脂肪アルデヒドへの変換を触媒する能力を有する、請求項1〜33のいずれか一項に記載の組換え微生物。
- C6〜C24脂肪アルコールの、対応するC6〜C24脂肪アセテートへの変換を触媒する能力を有するアセチルトランスフェラーゼをコードする少なくとも1つの内因性又は外因性核酸分子を更に含む、請求項1〜34のいずれか一項に記載の組換え微生物。
- 昆虫にとって毒性のあるタンパク質又はポリペプチドをコードする1つ以上の核酸分子を発現する、請求項1〜35のいずれか一項に記載の組換え微生物。
- 昆虫にとって毒性のあるタンパク質又はポリペプチドをコードする前記核酸が昆虫病原生物に由来する、請求項36に記載の組換え微生物。
- 前記昆虫病原生物が、バチルス・チューリンギエンシス(Bacillus thuringiensis)、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)、及びセラチア・マルセセンス(Serratia marcescens)から選択される、請求項37に記載の組換え微生物。
- 前記核酸分子がバチルス・チューリンギエンシス(Bacillus thuringiensis)毒素をコードする、請求項36〜38のいずれか一項に記載の組換え微生物。
- 発現時に昆虫にとって毒性のある小分子を生成する代謝経路を発現するように改変される、請求項1〜39のいずれか一項に記載の組換え微生物。
- 一不飽和又は多価不飽和C6〜C24脂肪アルコール、アルデヒド、又はアセテートを生成する生合成経路と競合する経路内の反応を触媒する1つ以上の内因性酵素の活性を欠失し、破壊し、変異させ、及び/又は低下させるように操作される、請求項1〜40のいずれか一項に記載の組換え微生物。
- 脂肪酸のω−ヒドロキシ脂肪酸への変換を触媒する1つ以上の内因性酵素の活性を欠失し、破壊し、変異させ、及び/又は低下させるように操作される、請求項41に記載の組換え微生物。
- 脂肪酸のω−ヒドロキシ脂肪酸への変換を触媒する前記酵素が、XP_504406、XP_504857、XP_504311、XP_500855、XP_500856、XP_500402、XP_500097、XP_501748、XP_500560、XP_501148、XP_501667、XP_500273、BAA02041、CAA39366、CAA39367、BAA02210、BAA02211、BAA02212、BAA02213、BAA02214、AAO73952、AAO73953、AAO73954、AAO73955、AAO73956、AAO73958、AAO73959、AAO73960、AAO73961、AAO73957、XP_002546278、BAM49649、AAB80867、AAB17462、ADL27534、AAU24352、AAA87602、CAA34612、ABM17701、AAA25760、CAB51047、AAC82967、WP_011027348、及びこれらのホモログからなる群から選択される、請求項42に記載の組換え微生物。
- 脂肪アシル−CoAのα,β−エノイル−CoAへの変換を触媒する1つ以上の内因性酵素の活性を欠失し、破壊し、変異させ、及び/又は低下させるように操作される、請求項41に記載の組換え微生物。
- 脂肪アシル−CoAのα,β−エノイル−CoAへの変換を触媒する前記酵素が、CAA04659、CAA04660、CAA04661、CAA04662、CAA04663、CAG79214、AAA34322、AAA34361、AAA34363、CAA29901、BAA04761、AAA34891、AAB08643、CAB15271、BAN55749、CAC44516、ADK16968、AEI37634、WP_000973047、WP_025433422、WP_035184107、WP_026484842、CEL80920、WP_026818657、WP_005293707、WP_005883960、及びこれらのホモログからなる群から選択される、請求項44に記載の組換え微生物。
- ペルオキシソームバイオジェネシスに関与する1つ以上のタンパク質の活性を欠失し、破壊し、変異させ、及び/又は低下させるように操作される、請求項41に記載の組換え微生物。
- ペルオキシソームバイオジェネシスに関与する前記1つ以上のタンパク質が、XP_505754、XP_501986、XP_501311、XP_504845、XP_503326、XP_504029、XP_002549868、XP_002547156、XP_002545227、XP_002547350、XP_002546990、EIW11539、EIW08094、EIW11472、EIW09743、EIW0828、及びこれらのホモログからなる群から選択される、請求項46に記載の組換え微生物。
- 1つ以上の不飽和脂肪アシル−CoA中間体の生合成経路と競合する経路内の反応を触媒する1つ以上の内因性酵素の活性を欠失し、破壊し、変異させ、及び/又は低下させるように操作される、請求項41に記載の組換え微生物。
- 前記1つ以上の内因性酵素が1つ以上のジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼを含む、請求項48に記載の組換え微生物。
- 前記1つ以上のジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼが、YALI0E32769g、YALI0D07986g及びCTRG_06209、又はこれらのホモログからなる群から選択される、請求項49に記載の組換え微生物。
- 前記1つ以上の内因性酵素が1つ以上のグリセロールリン脂質アシルトランスフェラーゼを含む、請求項48に記載の組換え微生物。
- 前記1つ以上のグリセロールリン脂質アシルトランスフェラーゼが、YALI0E16797g若しくはCTG_04390、又はこれらのホモログから選択される、請求項51に記載の組換え微生物。
- 前記1つ以上の内因性酵素が1つ以上のアシル−CoA/ステロールアシルトランスフェラーゼを含む、請求項48に記載の組換え微生物。
- 前記1つ以上のアシル−CoA/ステロールアシルトランスフェラーゼが、YALI0F06578g、CTRG_01764及びCTRG_01765、又はこれらのホモログからなる群から選択される、請求項53に記載の組換え微生物。
- 脂肪アルデヒド中間体を酸化する経路内の反応を触媒する1つ以上の内因性酵素の活性を欠失し、破壊し、変異させ、及び/又は低下させるように操作される、請求項41に記載の組換え微生物。
- 前記1つ以上の内因性酵素が1つ以上の脂肪アルデヒドデヒドロゲナーゼを含む、請求項55に記載の組換え微生物。
- 前記1つ以上の脂肪アルデヒドデヒドロゲナーゼが、YALI0A17875g、YALI0E15400g、YALI0B01298g、YALI0F23793g、CTRG_05010及びCTRG_04471、又はこれらのホモログからなる群から選択される、請求項56に記載の組換え微生物。
- 脂肪アセテート生成物を消費する経路内の反応を触媒する1つ以上の内因性酵素の活性を欠失し、破壊し、変異させ、及び/又は低下させるように操作される、請求項41に記載の組換え微生物。
- 前記1つ以上の内因性酵素が1つ以上のステロールエステラーゼを含む、請求項58に記載の組換え微生物。
- 前記1つ以上のステロールエステラーゼが、YALI0E32035g、YALI0E00528g、CTRG_01138、CTRG_01683及びCTRG_04630、又はこれらのホモログからなる群から選択される、請求項59に記載の組換え微生物。
- 前記1つ以上の内因性酵素が1つ以上のトリアシルグリセロールリパーゼを含む、請求項58に記載の組換え微生物。
- 前記1つ以上のトリアシルグリセロールリパーゼが、1つ以上のYALI0D17534g、YALI0F10010g、CTRG_00057及びCTRG_06185、又はこれらのホモログを含む、請求項61に記載の組換え微生物。
- 前記1つ以上の内因性酵素が1つ以上のモノアシルグリセロールリパーゼを含む、請求項58に記載の組換え微生物。
- 前記1つ以上のモノアシルグリセロールリパーゼが、1つ以上のYALI0C14520g、CTRG_03360及びCTRG_05049、又はこれらのホモログを含む、請求項63に記載の組換え微生物。
- 前記1つ以上の内因性酵素が1つ以上の細胞外リパーゼを含む、請求項58に記載の組換え微生物。
- 前記1つ以上の細胞外リパーゼが、1つ以上のYALI0A20350g、YALI0D19184g、YALI0B09361g、CTRG_05930、CTRG_04188、CTRG_02799、CTRG_03052及びCTRG_03885、又はこれらのホモログを含む、請求項65に記載の組換え微生物。
- 真核微生物である、請求項1〜66のいずれか一項に記載の組換え微生物。
- 前記真核微生物が酵母である、請求項67に記載の組換え微生物。
- 前記酵母が、ヤロウイア属(Yarrowia)、カンジダ属(Candida)、サッカロミセス属(Saccharomyces)、ピキア属(Pichia)、ハンゼヌラ属(Hansenula)、クルイベロミセス属(Kluyveromyces)、イサチェンキア属(Issatchenkia)、ザイゴサッカロミセス属(Zygosaccharomyces)、デバリオミセス属(Debaryomyces)、シゾサッカロミセス属(Schizosaccharomyces)、パキソレン属(Pachysolen)、クリプトコッカス属(Cryptococcus)、トリコスポロン属(Trichosporon)、ロドトルラ属(Rhodotorula)、及びミクソザイマ属(Myxozyma)からなる群から選択される属のメンバーである、請求項68に記載の組換え微生物。
- 前記酵母が油産生酵母である、請求項68に記載の組換え微生物。
- 前記油産生酵母が、ヤロウイア属(Yarrowia)、カンジダ属(Candida)、ロドトルラ属(Rhodotorula)、ロドスポリジウム属(Rhodosporidium)、クリプトコッカス属(Cryptococcus)、トリコスポロン属(Trichosporon)、及びリポミセス属(Lipomyces)からなる群から選択される属のメンバーである、請求項70に記載の組換え微生物。
- 前記油産生酵母が、ヤロウイア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)、カンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis)、ロドスポリジウム・トルロイデス(Rhodosporidium toruloides)、リポミセス・スタルケイ(Lipomycesstarkey)、L.リポフェルス(L. lipoferus)、C.レブカウフィ(C. revkaufi)、C.プルケリマ(C. pulcherrima)、C.ウチリス(C. utilis)、ロドトルラ・ミヌタ(Rhodotorula minuta)、トリコスポロン・プルランス(Trichosporon pullans)、T.クタネウム(T. cutaneum)、クリプトコッカス・カルバツス(Cryptococcus curvatus)、R.グルチニス(R. glutinis)、及びR.グラミニス(R. graminis)から選択される種のメンバーである、請求項71に記載の組換え微生物。
- 原核微生物である、請求項1〜66のいずれか一項に記載の組換え微生物。
- 前記原核微生物が、大腸菌属(Escherichia)、クロストリジウム属(Clostridium)、ザイモモナス属(Zymomonas)、サルモネラ属(Salmonella)、ロドコッカス属(Rhodococcus)、シュードモナス属(Pseudomonas)、バチルス属(Bacillus)、ラクトバチルス属(Lactobacillus)、エンテロコッカス属(Enterococcus)、アルカリゲネス属(Alcaligenes)、クレブシエラ属(Klebsiella)、パエニバチルス属(Paenibacillus)、アルスロバクター属(Arthrobacter)、コリネバクテリウム属(Corynebacterium)、及びブレビバクテリウム属(Brevibacterium)からなる群から選択される属のメンバーである、請求項73に記載の組換え微生物。
- 請求項1〜74のいずれか一項に記載の組換え微生物を使用して一不飽和又は多価不飽和C6〜C24脂肪アルコール、アルデヒド、又はアセテートを生成する方法であって、前記一不飽和又は多価不飽和C6〜C24脂肪アルコール、アルデヒド、又はアセテートが生成されるまで、炭素源を供給する原料が入った培養培地で前記組換え微生物を培養することを含む方法。
- 前記一不飽和又は多価不飽和C6〜C24脂肪アルコール、アルデヒド、又はアセテートを回収するステップを更に含む、請求項75に記載の方法。
- 前記回収するステップが蒸留を含む、請求項76に記載の方法。
- 前記回収するステップが、膜に基づく分離を含む、請求項76に記載の方法。
- 前記炭素源が、糖、グリセロール、アルコール、有機酸、アルカン、脂肪酸、リグノセルロース、タンパク質、二酸化炭素、及び一酸化炭素から選択される、請求項75〜78のいずれか一項に記載の方法。
- 前記糖が、グルコース、フルクトース、及びスクロースからなる群から選択される、請求項79に記載の方法。
- 前記一不飽和又は多価不飽和C6〜C24脂肪アルコール、アルデヒド、又はアセテートが昆虫フェロモンである、請求項75〜80のいずれか一項に記載の方法。
- 前記昆虫フェロモンが、(Z)−11−ヘキサデセナール、(Z)−11−ヘキサデセニルアセテート、(Z)−9−テトラデセニルアセテート、(Z,Z)−11,13−ヘキサデカジエナール、(9Z,11E)−ヘキサデカ−9,1−ジエナール、(E,E)−8,10−ドデカジエン−1−オール、(7E,9Z)−ドデカジエニルアセテート、(Z)−3−ノネン−1−オール、(Z)−5−デセン−1−オール、(Z)−5−デセニルアセテート、(E)−5−デセン−1−オール、(E)−5−デセニルアセテート、(Z)−7−ドデセン−1−オール、(Z)−7−ドデセニルアセテート、(E)−8−ドデセン−1−オール、(E)−8−ドデセニルアセテート、(Z)−8−ドデセン−1−オール、(Z)−8−ドデセニルアセテート、(Z)−9−ドデセン−1−オール、(Z)−9−ドデセニルアセテート、(Z)−9−テトラデセン−1−オール、(Z)−11−テトラデセン−1−オール、(Z)−11−テトラデセニルアセテート、(E)−11−テトラデセン−1−オール、(E)−11−テトラデセニルアセテート、(9Z,12E)−テトラデカジエニルアセテート、(Z)−7−ヘキサデセン−1−オール、(Z)−7−ヘキサデセナール、(Z)−9−ヘキサデセン−1−オール、(Z)−9−ヘキサデセナール、(Z)−9−ヘキサデセニルアセテート、(Z)−11−ヘキサデセン−1−オール、(Z)−13−オクタデセン−1−オール、及び(Z)−13−オクタデセナールからなる群から選択される、請求項75〜81のいずれか一項に記載の方法。
- 前記一不飽和又は多価不飽和C6〜C24脂肪アルコール、アルデヒド、又はアセテートを不飽和C3〜C10炭化水素とメタセシスし、それにより伸長型一不飽和若しくは多価不飽和C6〜C24脂肪アルコール、アルデヒド、若しくはアセテート、又はトランケート型一不飽和若しくは多価不飽和C6〜C24脂肪アルコール、アルデヒド、若しくはアセテートを形成することを更に含む、請求項75〜80のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1〜74のいずれか一項に記載の1つ以上の組換え微生物を含む組成物。
- 1つ以上の一不飽和又は多価不飽和C6〜C24脂肪アルコール、アルデヒド、及び/又はアセテートを更に含む、請求項84に記載の組成物。
- 前記一不飽和又は多価不飽和C6〜C24脂肪アルコール、アルデヒド、又はアセテートが昆虫フェロモンである、請求項85に記載の組成物。
- 前記昆虫フェロモンが、(Z)−11−ヘキサデセナール、(Z)−11−ヘキサデセニルアセテート、(Z)−9−テトラデセニルアセテート、(Z,Z)−11,13−ヘキサデカジエナール、(9Z,11E)−ヘキサデカ−9,1−ジエナール、(E,E)−8,10−ドデカジエン−1−オール、(7E,9Z)−ドデカジエニルアセテート、(Z)−3−ノネン−1−オール、(Z)−5−デセン−1−オール、(Z)−5−デセニルアセテート、(E)−5−デセン−1−オール、(E)−5−デセニルアセテート、(Z)−7−ドデセン−1−オール、(Z)−7−ドデセニルアセテート、(E)−8−ドデセン−1−オール、(E)−8−ドデセニルアセテート、(Z)−8−ドデセン−1−オール、(Z)−8−ドデセニルアセテート、(Z)−9−ドデセン−1−オール、(Z)−9−ドデセニルアセテート、(Z)−9−テトラデセン−1−オール、(Z)−11−テトラデセン−1−オール、(Z)−11−テトラデセニルアセテート、(E)−11−テトラデセン−1−オール、(E)−11−テトラデセニルアセテート、(9Z,12E)−テトラデカジエニルアセテート、(Z)−7−ヘキサデセン−1−オール、(Z)−7−ヘキサデセナール、(Z)−9−ヘキサデセン−1−オール、(Z)−9−ヘキサデセナール、(Z)−9−ヘキサデセニルアセテート、(Z)−11−ヘキサデセン−1−オール、(Z)−13−オクタデセン−1−オール、及び(Z)−13−オクタデセナールからなる群から選択される、請求項86に記載の組成物。
- 昆虫にとって毒性のある1つ以上のタンパク質、ポリペプチド、又は小分子を更に含む、請求項84〜87のいずれか一項に記載の組成物。
- 昆虫にとって毒性のある前記タンパク質、ポリペプチド、又は小分子が前記組換え微生物によって生成される、請求項88に記載の組成物。
- 前記一不飽和又は多価不飽和C6〜C24脂肪アルコールが、表1に列挙される一不飽和又は多価不飽和C6〜C24脂肪アルコールの1つ以上である、請求項1又は2に記載の組換え微生物。
- 前記一不飽和又は多価不飽和C6〜C24脂肪アルコールが、表2aに列挙される一不飽和又は多価不飽和C6〜C24脂肪アルコールの1つ以上である、請求項1又は2に記載の組換え微生物。
- 前記一不飽和又は多価不飽和C6〜C24脂肪アルコールが、本明細書に列挙される一不飽和又は多価不飽和C6〜C24脂肪アルコールの1つ以上である、請求項1又は2に記載の組換え微生物。
- 前記脂肪アシルコンジュガーゼが、コドリンガ(Cydia pomonella)、エンドウシンクイ(Cydia nigricana)、ホソバヒメハマキ(Lobesia botrana)、ゴママダラメイガ(Myelois cribrella)、ノシメマダラメイガ(Plodia interpunctella)、マッソンマツカレハ(Dendrolimus punctatus)、カラントシュートボーラー(Lampronia capitella)、ハスモンヨトウ(Spodoptera litura)、クルミマダラメイガ(Amyelois transitella)、タバコスズメガ(Manduca sexta)、カイコガ(Bombyx mori)、キンセンカ(Calendula officinalis)、キカラスウリ(Trichosanthes kirilowii)、ザクロ(Punica granatum)、ツルレイシ(Momordica charantia)、ホウセンカ(Impatiens balsamina)、及びリンゴウスチャイロハマキ(Epiphyas postvittana)種の生物由来である、請求項10〜14のいずれか一項に記載の組換え微生物。
- 前記少なくとも1つの脂肪アシルコンジュガーゼが、A0A059TBF5、A0A0M3L9E8、A0A0M3L9S4、A0A0M3LAH8、A0A0M3LAS8、A0A0M3LAH8、B6CBS4、XP_013183656.1、XP_004923568.2、ALA65425.1、NP_001296494.1、NP_001274330.1、Q4A181、Q75PL7、Q9FPP8、AY178444、AY178446、AF182521、AF182520、Q95UJ3、及びこれらのホモログからなる群から選択される、請求項10〜14のいずれか一項に記載の組換え微生物。
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