ES2864102T3 - Microorganismos para la producción de feromonas de insectos y compuestos relacionados - Google Patents

Microorganismos para la producción de feromonas de insectos y compuestos relacionados

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Abstract

Un microorganismo Yarrowia lipolytica recombinante capaz de convertir un acil graso C6-C24 saturado-CoA en un acil graso C6-C24 mono o poliinsaturado-CoA correspondiente, que comprende: a) una molécula de ácido nucleico heteróloga que codifica una acil graso desaturasa de Helicoverpa que cataliza la conversión de un acil graso C6-C24 saturado-CoA en un acil graso C6-C24 mono o poliinsaturado-CoA correspondiente.

Description

DESCRIPCIÓN
Microorganismos para la producción de feromonas de insectos y compuestos relacionados
Declaración respecto a la lista de secuencias
La lista de secuencias asociada con esta memoria descriptiva se proporciona en formato de texto en lugar de una copia en papel, y forma parte de la memoria descriptiva. El nombre del archivo de texto que contiene la lista de secuencias es PRVI_007_02WO_SeqList_ST25.txt. El archivo de texto tiene aproximadamente 54 KB, se creó el 15 de noviembre de 2016.
Campo técnico
Esta memoria descriptiva se refiere a microorganismos recombinantes útiles en la biosíntesis de alcoholes, aldehídos y acetatos grasos C6-C24 insaturados, que pueden ser útiles como feromonas de insectos, fragancias, sabores y compuestos intermedios de polímeros. La memoria descriptiva se refiere además a métodos para producir alcoholes, aldehídos y acetatos grasos C6-C24 insaturados, usando los microorganismos recombinantes, así como a composiciones que comprenden uno o más de estos compuestos y/o los microorganismos recombinantes.
Antecedentes
A medida que crece la demanda mundial de alimentos, aumenta la necesidad del control efectivo de plagas. Los insecticidas convencionales están entre los agentes de control químico más populares porque están fácilmente disponibles, son de acción rápida y muy fiables. Sin embargo, el uso excesivo, mal uso y abuso de estos productos químicos ha conducido a plagas resistentes, alteración de la ecología natural y, en algunos casos, daños ambientales.
El uso de feromonas de insectos para controlar poblaciones de plagas ha ganado cada vez más popularidad como una alternativa viable, segura y que no daña el medio ambiente, a los insecticidas convencionales. Desde su descubrimiento a finales de la década de 1950, estas moléculas han mostrado eficacia para reducir poblaciones de insectos a través de una variedad de métodos, que incluyen capturas masivas, atracción y muerte y disrupción del apareamiento. El último método, en particular, representa un medio no tóxico de control de plagas y usa la capacidad de las feromonas sintéticas para enmascarar las feromonas que se encuentran de forma natural, provocando así confusión y disrupción del apareamiento.
Aunque las feromonas tienen un potencial significativo en el control de insectos agrícolas, el coste de sintetizar feromonas usando las técnicas disponibles actualmente es muy alto, lo que prohíbe el uso generalizado de esta tecnología sostenible más allá de los cultivos de alto valor. Por lo tanto, existe una necesidad de desarrollar nuevas tecnologías para la producción rentable de feromonas de insectos y fragancias, sabores y compuestos intermedios de polímeros relacionados. Los autores de la presente invención abordan esta necesidad con el desarrollo de microorganismos recombinantes capaces de producir una amplia variedad de alcoholes, aldehídos y acetatos grasos C6-C24 insaturados, incluyendo feromonas sintéticas de insectos a partir de materias primas de bajo coste.
Hagstrom et al. (Microbial Cell Factories; 2013; 12: 123; páginas 1-11) describen que se pueden "elaborar" componentes de feromonas de polillas biológicamente activos a través de la coexpresión in vitro de enzimas biosintéticas y feromonas.
Resumen de la descripción
En un aspecto de la invención, se proporciona un microorganismo Yarrowia lipolytica recombinante como se define en la reivindicación 1.
En otro aspecto de la invención, se proporciona un método para producir un alcohol graso C6-C24 mono o poliinsaturado, que comprende cultivar un microorganismo Yarrowia lipolytica recombinante, en donde el método es como se define en las reivindicaciones.
La presente memoria descriptiva se refiere a microorganismos recombinantes que tienen una ruta biosintética para la producción de uno o más compuestos seleccionados de alcoholes, aldehídos y acetatos grasos C6-C24 insaturados. Los microorganismos recombinantes descritos en el presente documento se pueden usar para la producción de al menos un compuesto, tal como una feromona de insecto, una fragancia o un agente de sabor, seleccionado de alcoholes, aldehídos y acetatos grasos C6-C24 insaturados.
En una realización, el microorganismo recombinante comprende una ruta biosintética para la producción de un alcohol graso C6-C24 insaturado. Se describe un microorganismo recombinante capaz de producir un alcohol graso C6-C24 insaturado a partir de una fuente endógena o exógena de acil graso C6-C24 saturado-CoA, en donde el microorganismo recombinante expresa (a): al menos una molécula de ácido nucleico exógena que codifica una acil graso desaturasa que cataliza la conversión de un acil graso C6-C24 saturado-CoA en un acil graso C6-C24 mono o poliinsaturado-CoA correspondiente; y (b): al menos una molécula de ácido nucleico exógena que codifica una acil graso reductasa formadora de alcohol graso que cataliza la conversión del acil graso C6-C24 mono o poliinsaturado-CoA de (a) en el correspondiente alcohol graso C6-C24 mono o poliinsaturado.
En algunas realizaciones, el alcohol graso C6-C24 mono o poliinsaturado es una feromona de insecto. En algunas realizaciones, el alcohol graso C6-C24 mono o poliinsaturado es una fragancia o un agente de sabor. En algunas realizaciones, el microorganismo recombinante comprende además al menos una molécula de ácido nucleico endógena o exógena que codifica una alcohol oxidasa o una alcohol deshidrogenasa, en donde la alcohol oxidasa o la alcohol deshidrogenasa es capaz de catalizar la conversión del alcohol graso C6-C24 mono o poliinsaturado de (b) en el correspondiente aldehído graso C6-C24 mono o poliinsaturado. En algunas realizaciones, el microorganismo recombinante comprende además al menos una molécula de ácido nucleico endógena o exógena que codifica una acetil transferasa capaz de catalizar la conversión del alcohol graso C6-C24 mono o poliinsaturado de (b) en un acetato graso C6-C24 mono o poliinsaturado correspondiente.
En algunas realizaciones, la acil graso desaturasa es una desaturasa capaz de usar una acil graso-CoA como sustrato que tiene una longitud de cadena de 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 o 24 átomos de carbono.
En algunas realizaciones, la acil graso desaturasa es capaz de generar un doble enlace en la posición C5, C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12 o C13 en el ácido graso o sus derivados, tales como por ejemplo, ésteres de ácidos grasos-CoA.
En una realización de ejemplo de la invención, la acil graso desaturasa es una Z11desaturasa de Helicoverpa. En algunas realizaciones, la Z11 desaturasa, o la secuencia de ácido nucleico que la codifica, se puede aislar de Helicoverpa zea. En diversos ejemplos descritos también en el presente documento, la Z11 desaturasa, o la secuencia de ácido nucleico que la codifica, se puede aislar de organismos de las especies Agrotis segetum, Amyelois transitella, Argyrotaenia velutiana, Choristoneura rosaceana, Lampronia capitella, Trichoplusia ni o Thalassiosira pseudonana. Se pueden aislar Z11 desaturasas adicionales, o las secuencias de ácido nucleico que las codifican, de Bombyx mori, Manduca sexta, Diatraea grandiosella, Earias insulana, Earias vittella, Plutella xylostella, Bombyx mori o Diaphania nitidalis. En otros ejemplos, la Z11 desaturasa comprende una secuencia seleccionada de los n° de acceso en GenBank JX679209, JX964774, AF416738, AF545481, EU152335, AAD03775, AAF81787 y AY493438. En otros ejemplos, en una secuencia de ácido nucleico que codifica una Z11 desaturasa de organismos de las especies Agrotis segetum, Amyelois transitella, Argyrotaenia velutiana, Choristoneura rosaceana, Lampronia capitella, Trichoplusia ni o Thalassiosira pseudonana se realiza la optimización de codones. En realizaciones de ejemplo de la invención, en una secuencia de ácido nucleico que codifica una Z11 desaturasa de organismos de las especies Helicoverpa zea se optimizan los codones. En otros ejemplos, la Z11 desaturasa comprende una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 9, 18, 24 y 26 de Trichoplusia ni. En otros ejemplos, la Z11 desaturasa comprende una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 10 y 16 de Agrotis segetum. En algunos ejemplos, la Z11 desaturasa comprende una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 11 y 23 de Thalassiosira pseudonana. En ciertos ejemplos, la Z11 desaturasa comprende una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 12, 17 y 30 de Amyelois transitella. En realizaciones adicionales de la invención, la Z11 desaturasa comprende una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 13, 19, 25, 27 y 31 de Helicoverpa zea. En algunas realizaciones, la Z11 desaturasa comprende un polipéptido quimérico. En algunas realizaciones, una Z11 desaturasa completa o parcial se fusiona con otro polipéptido. En ciertas realizaciones, la secuencia líder natural N-terminal de una Z11 desaturasa se sustituye por una secuencia líder de oleosina. En ciertas realizaciones de la invención, la Z11 desaturasa comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 29. También se describen ejemplos en donde la Z11 desaturasa comprende una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 15 y 28.
En ciertas realizaciones, la Z11 desaturasa cataliza la conversión de una acil graso-CoA en un producto mono o poliinsaturado seleccionado de Z11-13:Acil-CoA, E11-13:Acil-CoA, (Z,Z)-7,11-13:Acil-CoA, Z11-14:Acil-CoA, E11-14:Acil-CoA, (E,E)-9,11-14:Acil-CoA, (E,Z)-9,11-14:Acil-CoA, (Z,E)-9,11-14:Acil-CoA, (Z,Z)-9,11-14:Acil-CoA, (E,Z)-9.11 -15:Acil-CoA, (Z,Z)-9,11-15:Acil-CoA, Z11-16:Acil-CoA, E11-16:Acil-CoA, (E,Z)-6,11-16:Acil-CoA, (E,Z)-7,11-16:Acil-CoA, (E,Z)-8,11-16:Acil-CoA, (E,E)-9,11-16:Acil-CoA, (E,Z)-9,11-16:Acil-CoA, (Z, E)-9,11-16:Acil-CoA, (Z,Z)-9.11 -16:Acil-CoA, (E,E)-11,13-16:Acil-CoA, (E,Z)-11,13-16:Acil-CoA, (Z,E)-11,13-16:Acil-CoA, (Z,Z)-11,13-16:Acil-CoA, (Z,E)-11,14-16:Acil-CoA, (E,E,Z)-4,6,11-16:Acil-CoA, (Z,Z,E)-7,11,13-16:Acil-CoA, (E,E,Z,Z)-4,6,11,13-16:Acil-CoA, Z11-17:Acil-CoA, (Z,Z)-8,11-17:Acil-CoA, Z11-18:Acil-CoA, E11-18:Acil-CoA, (Z,Z)-11,13-18:Acil-CoA, (E,E)-11,14-18:Acil-CoA, o combinaciones de los mismos.
En otra realización de ejemplo de la invención, la acil graso desaturasa es una Z9 desaturasa de Helicoverpa. En algunas realizaciones, la Z9 desaturasa, o la secuencia de ácido nucleico que la codifica, se puede aislar de organismos de las especies Helicoverpa assulta o Helicoverpa zea.
En varios ejemplos también se describe en el presente documento, que la Z9 desaturasa, o la secuencia de ácido nucleico que la codifica, se puede aislar de organismos de las especies Ostrinia furnacalis, Ostrinia nobilalis, Choristoneura rosaceana o Lampronia capitella. En otros ejemplos, la Z9 desaturasa comprende una secuencia seleccionada de los n2 de acceso de GenBank AY057862, AF243047, AF518017, EU152332, AF482906 y AAF81788.
En algunas realizaciones de la invención, una secuencia de ácido nucleico que codifica una Z9 desaturasa tiene optimización de codones. En algunos ejemplos, la Z9 desaturasa comprende una secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 20 de Ostrinia furnacalis. En otros ejemplos, la Z9 desaturasa comprende una secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 21 de Lampronia capitella. En algunas realizaciones de la invención, la Z9 desaturasa comprende una secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 22 de Helicoverpa zea.
En ciertas realizaciones, la Z9 desaturasa cataliza la conversión de un acil graso-CoA en un producto monoinsaturado o poliinsaturado seleccionado de Z9-11:Acil-CoA, Z9-12:Acil-CoA, E9-12:Acil-CoA, (E,E)-7,9-12:Acil-CoA, (E,Z)-7,9-12:Acil-CoA, (Z,E)-7,9-12:Acil-CoA, (Z,Z)-7,9-12:Acil-CoA, Z9-13:Acil-CoA, E9-13:Acil-CoA, (E,Z)-5,9-13:Acil-CoA, (Z,E)-5,9-13:Acil-CoA, (Z,Z)-5,9-13:Acil-CoA, Z9-14:Acil-CoA, E9-14:Acil-CoA, (E,Z)-4,9-14:Acil-CoA, (E,E)-9,11-14:Acil-CoA, (E,Z)-9,11-14:Acil-CoA, (Z,E)-9,11-14:Acil-CoA, (Z,Z)-9,11-14:Acil-CoA, (E,E)-9,12-14:Acil-CoA, (Z,E)-9,12-14:Acil-CoA, (Z,Z)-9,12-14:Acil-CoA, Z9-15:Acil-CoA, E9-15:Acil-CoA, (Z,Z)-6,9-15:Acil-CoA, Z9-16:Acil-CoA, E9-16:Acil-CoA, (E,E)-9,11-16:Acil-CoA, (E,Z)-9,11-16:Acil-CoA, (Z,E)-9,11-16:Acil-CoA, (Z,Z)-9,11-16:Acil-CoA, Z9-17:Acil-CoA, E9-18:Acil-CoA, Z9-18:Acil-CoA, (E,E)-5,9-18:Acil-CoA, (E,E)-9,12-18:Acil-CoA, (Z,Z)-9,12-18:Acil-CoA, (Z,Z,Z)-3,6,9-18:Acil-CoA, (E,E,E)-9,12,15-18:Acil-CoA, (Z,Z,Z)-9,12,15-18:Acil-CoA, o combinaciones de los mismos.
En algunas realizaciones, el microorganismo recombinante puede expresar una desaturasa bifuncional capaz de catalizar la posterior desaturación de dos dobles enlaces.
En algunas realizaciones, el microorganismo recombinante puede expresar más de una molécula de ácido nucleico exógena que cataliza una acil graso desaturasa que cataliza la conversión de un acil graso C6-C24 saturado-CoA en un acil graso C6-C24 mono o poliinsaturado-CoA correspondiente. Por ejemplo, el microorganismo recombinante puede expresar una molécula de ácido nucleico exógena que codifica una Z11 desaturasa y otra molécula de ácido nucleico exógena que codifica una Z9 desaturasa.
En algunas realizaciones, el microorganismo recombinante puede expresar una acil graso conjugasa que actúa independientemente o junto con una acil graso desaturasa para catalizar la conversión de un acil graso saturado o monoinsaturado-CoA en un acil graso poliinsaturado conjugado-CoA.
La descripción proporciona un microorganismo recombinante capaz de producir un alcohol graso C6-C24 poliinsaturado a partir de una fuente endógena o exógena de acil graso C6-C24 saturado o monoinsaturado-CoA, en donde el microorganismo recombinante expresa: (a) al menos una molécula de ácido nucleico exógena que codifica una acil graso conjugasa que cataliza la conversión de un acil graso C6-C24 saturado o monoinsaturado-CoA en un acil graso C6-C24 poliinsaturado-CoA correspondiente; y (b) al menos una molécula de ácido nucleico exógena que codifica una acil graso reductasa formadora de alcohol que cataliza la conversión del acil graso C6-C24 poliinsaturado-CoA de (a) en el alcohol graso C6-C24 poliinsaturado correspondiente.
En otra realización, el microorganismo recombinante expresa al menos dos moléculas de ácido nucleico exógenas que codifican acil graso conjugasas que catalizan la conversión de un acil graso C6-C24 saturado o monoinsaturado-CoA en un acil graso C6-C24 poliinsaturado-CoA correspondiente.
La descripción proporciona un microorganismo recombinante capaz de producir un alcohol graso C6-C24 poliinsaturado a partir de una fuente endógena o exógena de acil graso C6-C24 saturado o monoinsaturado-CoA, en donde el microorganismo recombinante expresa: (a) al menos una molécula de ácido nucleico exógena que codifica una acil graso desaturasa y al menos una molécula de ácido nucleico exógena que codifica una acil graso conjugasa que cataliza la conversión de un acil graso C6-C24 saturado o monoinsaturado-CoA en un acil graso C6-C24 poliinsaturado-CoA correspondiente; y (b) al menos una molécula de ácido nucleico exógena que codifica una acil graso reductasa formadora de alcohol que cataliza la conversión del acil graso C6-C24 poliinsaturado-CoA de (a) en el alcohol graso C6-C24 poliinsaturado correspondiente.
En otra realización, el microorganismo recombinante expresa al menos dos molécula de ácido nucleico exógenas que codifican acil graso desaturasas y al menos dos moléculas de ácido nucleico exógenas que codifican acil graso conjugasas que catalizan la conversión de un acil graso C6-C24 saturado o monoinsaturado-CoA en un acil graso C6-C24 poliinsaturado-CoA correspondiente.
En otra realización más, la acil graso conjugasa es una conjugasa capaz de usar un acil graso-CoA como un sustrato que tiene una longitud de cadena de 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 o 24 átomos de carbono.
En ciertas realizaciones, la conjugasa, o la secuencia de ácido nucleico que la codifica, se puede aislar de organismos de las especies Cydia pomonella, Cydia nigricana, Lobesia botrana, Myelois cribrella, Plodia interpunctella, Dendrolimus punctatus, Lampronia capitella, Spodoptera litura, Amyelois transitella, Manduca sexta, Bombyx mori, Calendula officinalis, Trichosanthes kirilowii, Punica granatum, Momordica charantia, Impatiens balsamina y Epiphyas postvittana. En realizaciones de ejemplo, la conjugasa comprende una secuencia seleccionada de los n° de acceso en GenBank o la base de datos Uniprot: A0A059TBF5, A0A0M3L9E8, A0A0M3L9S4, A0A0M3LAH8, A0A0M3LAS8, A0A0M3LAH8, B6CBS4, XP_013183656.1, XP_004923568.2, ALA65425.1, NP_001296494.1, NP_001274330.1, Q4A181, Q75PL7, Q9FPP8, AY178444, AY178446, AF182521, AF182520, Q95UJ3.
En varias realizaciones descritas en el presente documento, la acil-CoA reductasa que forma alcohol graso, es decir, la acil graso reductasa que forma alcohol graso, o la secuencia de ácido nucleico que la codifica, se puede aislar de organismos de las especies Agrotis segetum, Spodoptera littoralis o Helicoverpa amigera. En realizaciones de ejemplo, la reductasa comprende una secuencia seleccionada de los n° de acceso en GenBank JX679210 y HG423128, y n° de acceso en UniProt I3PN86. En algunas realizaciones, una secuencia de ácido nucleico que codifica una acil graso reductasa de organismos de las especies Agrotis segetum, Spodoptera littoralis o Helicoverpa amigera tiene optimización de codones. En algunas realizaciones, la reductasa comprende una secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 1 de Agrotis segetum. En otras realizaciones, la reductasa comprende una secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 2 de Spodoptera littoralis. En algunas realizaciones, la reductasa comprende una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 3 y 32 de Helicoverpa armígera.
En ciertas realizaciones, la acil graso reductasa formadora de alcohol graso cataliza la conversión de un acil graso mono o poliinsaturado-CoA en un producto de alcohol graso seleccionado de (Z)-3-hexenol, (Z)-3-nonenol, (Z)-5-decenol, (E)-5-decenol, (Z)-7-dodecenol, (E)-8-dodecenol, (Z)-8-dodecenol, (Z)-9-dodecenol, (Z)-9-tetradecenol, (Z)-9-hexadecenol, (Z)-11-tetradecenol, (Z)-7-hexadecenol, (Z)-11-hexadecenol, (E)-11-tetradecenol o (Z,Z)-11,13-hexadecadienol, (11Z,13E)-hexadecadienol, (E,E)-8,10-dodecadienol, (E,Z)-7,9-dodecadienol, (Z)-13-octadecenol, o combinaciones de los mismos.
En algunas realizaciones, el microorganismo recombinante puede expresar más de una molécula de ácido nucleico exógena que codifica una acil graso reductasa formadora de alcohol que cataliza la conversión de un acil graso C6-C24 mono o poliinsaturado-CoA en un alcohol graso C6-C24 mono o poliinsaturado correspondiente. Dichos microorganismos recombinantes se pueden usar ventajosamente para producir mezclas de diferentes feromonas de insectos.
Además de la ruta biosintética descrita en el primer aspecto anterior, la presente memoria descriptiva proporciona una ruta biosintética adicional para producir un alcohol graso C6-C24 insaturado usando una acil graso C6-C24 saturado-ACP intermedia derivada de un ácido graso C6-C24. Por consiguiente, en un segundo aspecto, la memoria descriptiva se refiere a un microorganismo recombinante capaz de producir un alcohol graso C6-C24 insaturado a partir de una fuente endógena o exógena de ácido graso C6-C24, en donde el microorganismo recombinante expresa (a): al menos una molécula de ácido nucleico exógena que codifica una acil-ACP sintetasa que cataliza la conversión de un ácido graso C6-C24 en un acil graso C6-C24 saturado-ACP correspondiente; (b) al menos una molécula de ácido nucleico exógena que codifica una acil graso-ACP desaturasa que cataliza la conversión de un acil graso C6-C24 saturado-ACP en un acil graso C6-C24 mono o poliinsaturado-ACP correspondiente; (c) una o más moléculas de ácido nucleico endógenas o exógenas que codifican un complejo de ácido graso sintasa que cataliza la conversión del acil graso C6-C24 mono o poliinsaturado-ACP de (b) en un acil graso C6-C24 mono o poliinsaturado-ACP correspondiente con un alargamiento de dos carbonos con respecto al producto de (b); (d): al menos una molécula de ácido nucleico exógena que codifica una acil graso reductasa formadora de aldehído graso que cataliza la conversión del acil graso C6-C24 mono o poliinsaturado-ACP de (c) en un aldehído graso C6-C24 mono o poliinsaturado correspondiente; y (e) al menos una molécula de ácido nucleico endógena o exógena que codifica una deshidrogenasa que cataliza la conversión del aldehído graso C6-C24 mono o poliinsaturado C6-C24 de (d) en un alcohol graso C6-C24 mono o poliinsaturado correspondiente. En algunos ejemplos, el alcohol graso C6-C24 mono o poliinsaturado es una feromona de insecto. En algunos ejemplos, el alcohol graso C6-C24 mono o poliinsaturado es una fragancia o agente de sabor. En algunos ejemplos, el microorganismo recombinante comprende además al menos una molécula de ácido nucleico endógena o exógena que codifica una alcohol oxidasa o una alcohol deshidrogenasa, en donde la alcohol oxidasa o alcohol deshidrogenasa es capaz de catalizar la conversión del alcohol graso C6-C24 mono o poliinsaturado de (e) en un aldehído graso C6-C24 mono o poliinsaturado correspondiente. En algunos ejemplos, el microorganismo recombinante comprende además al menos una molécula de ácido nucleico endógena o exógena que codifica una acetil transferasa capaz de catalizar la conversión del alcohol graso C6-C24 mono o poliinsaturado de (e) en un acetato graso C6-C24 mono o poliinsaturado correspondiente.
En algunos ejemplos, la acil-ACP sintetasa es una sintetasa capaz de usar un ácido graso como un sustrato que tiene una longitud de cadena de 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23 o 24 átomos de carbono.
En varios ejemplos descritos en el presente documento, la acil-ACP sintetasa, o el ácido nucleico que la codifica, se puede aislar de organismos de las especies Vibrio harveyi, Rhodotorula glutinis o Yarrowia lipolytica.
En algunos ejemplos, la acil graso-ACP desaturasa es una desaturasa soluble. En varios ejemplos descritos en el presente documento, la acil graso-ACP desaturasa, o el ácido nucleico que la codifica, se puede aislar de organismos de las especies Pelargonium hortorum, Asclepias syriaca o Uncaria tomentosa.
En algunos ejemplos, el microorganismo recombinante puede expresar más de una molécula de ácido nucleico exógena que codifica una acil graso desaturasa que cataliza la conversión de un acil graso C6-C24 saturado-ACP en un acil graso C6-C24 mono o poliinsaturado-ACP correspondiente.
Como se ha descrito antes, las enzimas de elongación de ácido graso, es decir, un complejo de ácido graso sintasa, se pueden usar para extender la longitud de cadena de un acil graso C6-C24 mono o poliinsaturado-ACP en dos carbonos adicionales en el carbono alfa. En algunos ejemplos, los dos carbonos adicionales derivan de malonil-CoA endógeno. En un ejemplo, la una o más moléculas de ácido nucleico que codifican un complejo de ácido graso sintasa son moléculas de ácido nucleico endógenas, es decir, la o las moléculas de ácido nucleico son naturales para el microorganismo recombinante. En otro ejemplo, la una o más moléculas que codifican un complejo de ácido graso sintasa son moléculas de ácido nucleico exógenas.
En varios ejemplos descritos en el presente documento, la acil-ACP reductasa formadora de aldehído graso, es decir, la acil graso reductasa formadora de aldehído graso, o la secuencia de ácido nucleico que la codifica, se puede aislar de organismos de las especies, se puede aislar de organismos de las especies Pelargonium hortorum, Asclepias syriaca y Uncaria tomentosa.
En algunos ejemplos, el microorganismo recombinante puede expresar más de una molécula de ácido nucleico exógena que codifica una acil graso reductasa formadora de aldehído graso que cataliza la conversión de un acil graso C6-C24 mono o poliinsaturado-ACP en un aldehído graso C6-C24 mono o poliinsaturado correspondiente. Dichos microorganismos recombinantes se pueden usar ventajosamente para producir mezclas de diferentes feromonas de insectos. Una mezcla de ejemplo de acuerdo con la presente invención comprende (Z)-11-hexadecenal (Z11 -16:Ald) y (Z)-9-hexadecenal (Z9-16 :Ald). En un ejemplo, la relación de la mezcla es una relación 90:10, 91:9, 92:8, 93:7, 94:6, 95:5, 96:4, 97:3, 98:2 o 99:1 de (Z)-11-hexadecenal (Z11-16:Ald) a (Z)-9-hexadecenal (Z9-16:Ald). En un ejemplo, la mezcla es una relación 97:3 de (Z)-11-hexadecenal (Z11-16:Ald) a (Z)-9-hexadecenal (Z9-16:Ald), que corresponde a los componentes clave de la hembra virgen de Helicoverpa.
Como se ha indicado antes, el microorganismo recombinante de acuerdo con el segundo aspecto comprende al menos una molécula de ácido nucleico endógena o exógena que codifica una deshidrogenasa capaz de catalizar la conversión del aldehído graso C6-C24 mono o poliinsaturado de (d) en un alcohol graso C6-C24 mono o poliinsaturado correspondiente. En un ejemplo, la deshidrogenasa es codificada por una molécula de ácido nucleico endógena. En otro ejemplo, la deshidrogenasa es codificada por una molécula de ácido nucleico exógena. En ejemplos, la molécula de ácido nucleico endógena o exógena que codifica una deshidrogenasa se aísla de organismos de las especies Saccharomyces cerevisiae, Escherichia coli, Yarrowia lipolytica o Candida tropicalis.
Además de la ruta biosintética descrita en el primer y segundo aspectos anteriores, la presente memoria descriptiva proporciona una ruta biosintética adicional para la producción de un alcohol graso C6-C24 insaturado usando un acil graso C6-C24 saturado-ACP intermedio derivado de un ácido graso C6-C24. Por consiguiente, en un tercer aspecto, la memoria descriptiva se refiere a un microorganismo recombinante capaz de producir un alcohol graso C6-C24 insaturado a partir de una fuente endógena o exógena de ácido graso C6-C24, en donde el microorganismo recombinante expresa (a): al menos una molécula de ácido nucleico exógena que codifica una acil-ACP sintetasa que cataliza la conversión de un ácido graso C6-C24 en un acil graso C6-C24 saturado-ACP correspondiente; (b) al menos una molécula de ácido nucleico exógena que codifica una acil graso-ACP desaturasa que cataliza la conversión de un acil graso C6-C24 saturado-ACP en un acil graso C6-C24 mono o poliinsaturado-ACP correspondiente; (c) al menos una acil graso-ACP tioesterasa exógena que cataliza la conversión del acil graso C6-C24 mono o poliinsaturado-ACP de (b) en un ácido graso C6-C24 mono o poliinsaturado correspondiente; (d) una o más moléculas de ácido nucleico endógenas o exógenas que codifican una elongasa que cataliza la conversión del acil graso C6-C24 mono o poliinsaturado-CoA derivado de la activación por CoA del ácido graso C6-C24 mono o poliinsaturado de (c) en un acil graso C6-C24 mono o poliinsaturado-CoA correspondiente con una elongación de dos o más carbonos con respecto al producto de (c); y (e): al menos una molécula de ácido nucleico exógena que codifica una acil graso reductasa formadora de alcohol que cataliza la conversión del acil graso C6-C24 mono o poliinsaturado-CoA de (d) en un alcohol graso C6-C24 mono o poliinsaturado correspondiente. En algunos ejemplos, el alcohol graso C6-C24 mono o poliinsaturado es una feromona de insecto. En algunos ejemplos, el alcohol graso C6-C24 mono o poliinsaturado es una fragancia o agente de sabor. En algunos ejemplos, el microorganismo recombinante comprende además al menos una molécula de ácido nucleico endógena o exógena que codifica una alcohol oxidasa o una alcohol deshidrogenasa, en donde la alcohol oxidasa o alcohol deshidrogenasa es capaz de catalizar la conversión del alcohol graso C6-C24 mono o poliinsaturado de (e) en un aldehído graso C6-C24 mono o poliinsaturado correspondiente. En algunos ejemplos, el microorganismo recombinante comprende además al menos una molécula de ácido nucleico endógena o exógena que codifica una acetil transferasa capaz de catalizar la conversión del alcohol graso C6-C24 mono o poliinsaturado de (e) en un acetato graso C6-C24 mono o poliinsaturado correspondiente.
En algunos ejemplos de acuerdo con este tercer aspecto, se puede usar una acil graso-ACP tioesterasa para convertir un acil graso C6-C24 mono o poliinsaturado-ACP en un ácido graso C6-C24 mono o poliinsaturado correspondiente. En un ejemplo particular, se pueden usar acil graso-ACP tioesterasas solubles para liberar ácido grasos libres para la reactivación a un tioéster de CoA. Se pueden usar acil graso-ACP tioesterasas que incluyen Q41635, Q39473, P05521.2, AEM72519, AEM72520, AEM72521, AEM72523, AAC49784, CAB60830, EER87824, EER96252, ABN54268, AAO77182, CAH09236, ACL08376, y homólogos de las mismas. En algunos ejemplos, el acil graso C6-C24 mono o poliinsaturado-CoA puede servir como un sustrato para una elongasa, que se puede usar para extender la longitud de cadena de un acil graso C6-C24 mono o poliinsaturado-CoA en dos carbonos adicionales en el carbono alfa. En algunos ejemplos, los dos carbonos adicionales derivan de malonil-CoA endógeno.
Como se ha descrito antes, en algunas realizaciones, el microorganismo recombinante de acuerdo con el primer, segundo o tercer aspectos comprende además al menos una molécula de ácido nucleico endógena o exógena que codifica una alcohol oxidasa capaz de catalizar la conversión de un alcohol graso C6-C24 mono o poliinsaturado en un aldehído graso C6-C24 mono o poliinsaturado correspondiente. En ciertas realizaciones, la alcohol oxidasa, o la secuencia de ácido nucleico que la codifica, se puede aislar de organismos de las especies Candida boidinii, Komagataella pastoris, Tanacetum vulgare, Simmondsia chinensis, Arabidopsis thaliana, Lotus japónicas o Candida tropicalis. En realizaciones de ejemplo, la alcohol oxidasa comprende una secuencia seleccionada de los n° de acceso en GenBank Q00922, F2QY27, Q6QIR6, Q8LDP0 y L7VFV2.
En realizaciones alternativas, el alcohol graso se puede convertir en un aldehído graso usando métodos químicos, que incluyen, pero no se limitan al uso de TEMPO-lejía, TEMPO-cobre-aire, TEMPO-Phl(OAc)2 , oxidación de Swern o metal noble-aire.
Como se ha descrito antes, en algunas realizaciones, el microorganismo recombinante de acuerdo con el primer o segundo aspecto comprende además al menos una molécula de ácido nucleico endógena o exógena que codifica una acetil transferasa capaz de catalizar la conversión de un alcohol graso C6-C24 en un acetato graso C6-C24 correspondiente. En ciertas realizaciones, la acetil transferasa, o la secuencia de ácido nucleico que la codifica, se puede aislar de organismos de las especies Saccharomyces cerevisiae, Danaus plexippus, Heliotis virescens, Bombyx mori, Agrotis ipsilon, Agrotis segetum, Euonymus alatus. En realizaciones de ejemplo, la acetil transferasa comprende una secuencia seleccionada de los n° de acceso en GenBank AY242066, AY242065, AY242064, AY242063, AY242062, EHJ65205, ACX53812, NP_001182381, EHJ65977, EHJ68573, KJ579226, GU594061.
En realizaciones alternativas, el alcohol graso se puede convertir en un acetato graso usando métodos químicos, p. ej., por catálisis química usando un agente químico tal como cloruro de acetilo, anhídrido acético, cloruro de butirilo, anhídrido butírico, cloruro de propanoilo y anhídrido propiónico.
En algunas realizaciones, el microorganismo recombinante que comprende una ruta biosintética para la producción de un alcohol, aldehído o acetato graso C6-C24 insaturado se puede modificar para expresar uno o más ácidos nucleicos que codifican una proteína o polipéptido que, cuando se expresa, es tóxico para un insecto. Genes que producen productos tóxicos de ejemplo adecuados para la presente descripción, se pueden obtener de organismos entomopatógenos, tales como Bacillus thuringiensis, Pseudomonas aeruginosa, Serratia marcescens, y miembros del género Streptomyces. En una realización de ejemplo, el microorganismo recombinante que comprende una ruta biosintética para la producción de un alcohol, aldehído o acetato graso C6-C24 insaturado se puede modificar para expresar un ácido nucleico que codifica una toxina de Bacillus thuringiensis ("Bt"). En realizaciones adicionales o alternativas, el microorganismo recombinante que comprende una ruta biosintética para la producción de un alcohol, aldehído o acetato graso C6-C24 insaturado se puede modificar para expresar un ácido nucleico que codifica otras proteínas tóxicas tales como veneno de araña.
En algunas realizaciones, el microorganismo recombinante que comprende una ruta biosintética para la producción de un alcohol, aldehído o acetato graso C6-C24 insaturado se puede modificar para expresar una molécula de ARNi que, cuando se expresa, produce un oligonucleótido que es tóxico para un insecto.
En algunas realizaciones, el microorganismo recombinante que comprende una ruta biosintética para la producción de un alcohol, aldehído o acetato graso C6-C24 insaturado se puede modificar para expresar una ruta metabólica que, cuando se expresa, produce una molécula pequeña que es tóxica para un insecto. Ejemplos no limitantes de moléculas pequeñas tóxicas incluyen azadiractina, espinosad, avermectina, piretrinas y diferentes terpenoides.
En varios ejemplos descritos en el presente documento, el microorganismo recombinante que comprende una ruta biosintética para la producción de un alcohol, aldehído o acetato graso C6-C24 insaturado puede ser un microorganismo eucariota, tal como una levadura, un hongo filamentoso, o un alga, o alternativamente, un microorganismo procariota, tal como una bacteria. Por ejemplo, las células hospedantes adecuadas pueden incluir células de un género seleccionado del grupo que consiste en Yarrowia, Candida, Saccharomyces, Pichia, Hansenula, Clostridium, Zymomonas, Escherichia, Salmonella, Rhodococcus, Pseudomonas, Bacillus, Lactobacillus, Enterococcus, Alcaligenes, Klebsiella, Paenibacillus, Arthrobacter, Corynebacterium, Brevibacterium y Streptomyces.
En algunos ejemplos, el microorganismo recombinante que comprende una ruta biosintética para la producción de un alcohol, aldehído o acetato graso C6-C24 insaturado es una levadura. Ejemplos de levaduras adecuadas incluyen levaduras del género seleccionado del grupo que consiste en Yarrowia, Candida, Saccharomyces, Pichia, Hansenula, Kluyveromyces, Issatchenkia, Zygosaccharomyces, Debaryomyces, Schizosaccharomyces, Pachysolen, Cryptococcus, Trichosporon, Rhodotorula o Myxozyma. En ciertos ejemplos, la levadura es una levadura oleaginosa. Las levaduras oleaginosas de ejemplo adecuadas para usar en la presente descripción incluyen miembros de los géneros Yarrowia, Candida, Rhodotorula, Rhodosporidium, Cryptococcus, Trichosporon, y Lipomyces, incluyendo, pero no limitado a las especies Candida tropicalis, Rhodosporidium toruloides, Lipomyces starkey, L. lipoferus, C. revkaufi, C. pulcherrima, C. utilis, Rhodotorula minuta, Trichosporon pullans, T. cutaneum, Cryptococcus curvatus, R. glutinis, y R. graminis. En realizaciones de la invención, el microorganismo recombinante es de la especie Yarrowia lipolytica.
Como se entenderá en la técnica, las enzimas endógenas pueden convertir sustratos y/o compuestos intermedios críticos corriente arriba de o dentro de la ruta biosintética de alcohol, aldehído o acetato graso C6-C24 insaturado en subproductos no deseados. Por consiguiente, en algunas realizaciones, el microorganismo recombinante se manipula para eliminar, alterar, mutar y/o reducir la actividad de una o más enzimas endógenas que catalizan una reacción en una ruta que compite con la ruta biosintética del alcohol, aldehído o acetato graso C6-C24 insaturado.
En una realización, el microorganismo recombinante se manipula para eliminar, alterar, mutar y/o reducir la actividad de una o más enzimas endógenas que catalizan la conversión de un ácido graso en un w-hidroxiácido graso. En el contexto de un microorganismo levadura recombinante, el microorganismo levadura recombinante se modifica para eliminar, alterar, mutar y/o reducir la actividad de una o más enzimas seleccionadas de XP_504406, XP_504857, XP_504311, XP_500855, XP_500856, XP_500402, XP_500097, XP_501748, XP_500560, XP_501148, XP_501667, XP_500273, BAA02041, CAA39366, CAA39367, BAA02210, BAA02211, BAA02212, BAA02213, BAA02214, AAO73952, AAO73953, AAO73954, AAO73955, AAO73956, AAO73958, AAO73959, AAO73960, AAO73961, AAO73957, XP_002546278, u homólogos de las mismas. En el contexto de un microorganismo bacteria recombinante, el microorganismo bacteria recombinante se modifica para eliminar, alterar, mutar y/o reducir la actividad de una o más enzimas seleccionadas de BAM49649, AAB80867, AAB17462, ADL27534, AAU24352, AAA87602, CAA34612, ABM17701, AAA25760, CAB51047, AAC82967, WP_011027348, u homólogos de las mismas.
En otra realización, el microorganismo recombinante se modifica para eliminar, alterar, mutar y/o reducir la actividad de una o más enzimas endógenas que catalizan la conversión de un acil graso-CoA en a,p-enoil-CoA. En el contexto de un microorganismo levadura recombinante, el microorganismo levadura recombinante se modifica para eliminar, alterar, mutar y/o reducir la actividad de una o más enzimas seleccionadas de CAA04659, CAA04660, CAA04661, CAA04662, CAA04663, CAG79214, AAA34322, AAA34361, AAA34363, CAA29901, BAA04761, AAA34891, u homólogos de las mismas. En el contexto de un microorganismo bacteria recombinante, el microorganismo bacteria recombinante se modifica para eliminar, alterar, mutar y/o reducir la actividad de una o más enzimas seleccionadas de AAB08643, CAB15271, BAN55749, CAC44516, ADK16968, AEI37634, WP_000973047, WP_025433422, WP_035184107, WP_026484842, CEL80920, WP_026818657, WP_005293707, WP_005883960, u homólogos de las mismas.
En realizaciones donde el microorganismo recombinante es un microorganismo levadura, el microorganismo recombinante se modifica para eliminar, alterar, mutar y/o reducir la actividad de una o más enzimas implicadas en el ensamblaje del peroxisoma y/o importación de enzimas al peroxisoma. El microorganismo levadura recombinante se modifica para eliminar, alterar, mutar y/o reducir la actividad de una o más enzimas seleccionadas de XP_505754, XP_501986, XP_501311, XP_504845, XP_503326, XP_504029, XP_002549868, XP_002547156, XP_002545227, XP_002547350, XP_002546990, EIW11539, EIW08094, EIW11472, EIW09743, EIW08286, u homólogos de las mismas.
En otra realización, el microorganismo recombinante se manipula para eliminar, alterar, mutar y/o reducir la actividad de una o más enzimas reductasas o desaturasas endógenas que interfieren con el alcohol, aldehído o acetato graso C6-C24 insaturado, es decir, catalizan la conversión de un sustrato o producto de la ruta en un subproducto no deseado.
En otra realización, el microorganismo recombinante se manipula para eliminar, alterar, mutar y/o reducir la actividad de una o más enzimas alcohol oxidasa o alcohol deshidrogenasa endógenas que catalizan la conversión no deseada del producto deseado, p. ej., alcohol graso C6-C24 insaturado en un aldehído graso C6-C24 insaturado correspondiente.
En otra realización, el microorganismo recombinante se manipula para eliminar, alterar, mutar y/o reducir la actividad de una o más enzimas endógenas que catalizan una reacción en una ruta que compite con la ruta de biosíntesis por uno o más acil graso-CoA insaturado intermedios. En una realización, la uno o más enzimas endógenas comprenden una o más diacilglicerol aciltransferasas. En el contexto de un microorganismo levadura recombinante, el microorganismo levadura recombinante se modifica para eliminar, alterar, mutar y/o reducir la actividad de una o más diacilglicerol aciltransferasas seleccionadas del grupo que consiste en YALI0E32769g, YALI0D07986g y CTRG_06209, u homólogos de las mismas. En otra realización, la una o más enzimas endógenas comprenden una o más glicerolfosfolípido aciltransferasas. En el contexto de un microorganismo levadura recombinante, el microorganismo levadura recombinante se modifica para eliminar, alterar, mutar y/o reducir la actividad de una o más glicerolfosfolípido aciltransferasas seleccionadas del grupo que consiste en YALI0E16797g y CTG_04390, u homólogos de las mismas. En otra realización, la una o más enzimas endógenas comprenden una o más acil-CoA/esterol aciltransferasas. En el contexto de un microorganismo levadura recombinante, el microorganismo levadura recombinante se modifica para eliminar, alterar, mutar y/o reducir la actividad de una o más acil-CoA/esterol aciltransferasas seleccionadas del grupo que consiste en YALI0F06578g, CTRG_01764 y CTRG_01765, u homólogos de las mismas.
En otra realización, el microorganismo recombinante se modifica para eliminar, alterar, mutar y/o reducir la actividad de una o más enzimas endógenas que catalizan una reacción en una ruta que oxida aldehídos grasos intermedios. En una realización, la una o más enzimas endógenas comprenden una o más aldehído graso deshidrogenasas. En el contexto de un microorganismo levadura recombinante, el microorganismo levadura recombinante se modifica para eliminar, alterar, mutar y/o reducir la actividad de una o más aldehído graso deshidrogenasas seleccionadas del grupo que consiste en YALI0A17875g, YALI0E15400g, YALI0B01298g, YALI0F23793g, CTRG_05010 y CTRG_04471, u homólogos de las mismas.
En otra realización, el microorganismo recombinante se modifica para eliminar, alterar, mutar y/o reducir la actividad de una o más enzimas endógenas que catalizan una reacción en una ruta que consume productos de acetato graso. En una realización, la una o más enzimas endógenas comprenden una o más esterol esterasas. En el contexto de un microorganismo levadura recombinante, el microorganismo levadura recombinante se modifica para eliminar, alterar, mutar y/o reducir la actividad de una o más esterol esterasas seleccionadas del grupo que consiste en YALI0E32035g, YALI0E00528g, CTRG_01138, CTRG_01683 y CTRG_04630, u homólogos de las mismas. En otra realización, la una o más enzimas endógenas comprenden una o más triacilglicerol lipasas. En el contexto de un microorganismo levadura recombinante, el microorganismo levadura recombinante se modifica para eliminar, alterar, mutar y/o reducir la actividad de una o más triacilglicerol lipasas seleccionadas del grupo que consiste en YALI0D17534g, YALI0F10010g, CTRG_00057 y CTRG_06185, u homólogos de las mismas. En otra realización, la una o más enzimas endógenas comprenden una o más monoacilglicerol lipasas. En el contexto de un microorganismo levadura recombinante, el microorganismo levadura recombinante se modifica para eliminar, alterar, mutar y/o reducir la actividad de una o más monoacilglicerol lipasas seleccionadas del grupo que consiste en YALI0C14520g, CTRG_03360 y CTRG_05049, u homólogos de las mismas. En otra realización, la una o más enzimas endógenas comprenden una o más lipasas extracelulares. En el contexto de un microorganismo levadura recombinante, el microorganismo levadura recombinante se modifica para eliminar, alterar, mutar y/o reducir la actividad de una o más lipasas extracelulares seleccionadas del grupo que consiste en YALI0A20350g, YALI0D19184g, YALI0B09361g, CTRG_05930, CTRG_04188, CTRG_02799, Ct RG_03052 y CTRG_03885, u homólogos de las mismas.
En realizaciones donde el microorganismo recombinante es un microorganismo levadura, uno o más de los genes de la ruta de alcohol, aldehído o acetato graso C6-C24 insaturado exógena codifican una enzima que está localizada en un compartimento de la levadura seleccionado del grupo que consiste en el citosol, la mitocondria o el retículo endoplásmico. En una realización de ejemplo, el uno o más genes de la ruta exógena codifican una enzima que está localizada en el retículo endoplásmico. En otra realización, al menos dos genes de la ruta exógena codifican una enzima que está localizada en el retículo endoplásmico. En otra realización más, todos los genes de la ruta exógena codifican una enzima que está localizada en el retículo endoplásmico.
En un cuarto aspecto, la presente memoria descriptiva proporciona métodos para producir un alcohol, aldehído o acetato graso C6-C24 insaturado usando un microorganismo recombinante como se describe en el presente documento. En una realización, el método incluye cultivar el microorganismo recombinante en un medio de cultivo que contiene una materia prima que proporciona una fuente de carbono hasta que se produce el alcohol aldehído o acetato graso C6-C24 insaturado, y opcionalmente, recuperar el alcohol, aldehído o acetato graso C6-C24 insaturado. Una vez producido, el alcohol, aldehído o acetato graso C6-C24 insaturado, se puede aislar del medio de fermentación usando varios métodos conocidos en la técnica, que incluyen, entre otros, destilación, separación de gases por separación por membranas, extracción con disolvente y adsorción en lecho expandido.
En algunas realizaciones, el microorganismo recombinante, p. ej., una levadura, se puede recuperar y producir en forma de partículas secas. En realizaciones que implican levaduras, la levadura se puede secar para producir levadura en polvo. En algunas realizaciones, el procedimiento para producir levadura en polvo comprende secar por atomización una composición líquida de levadura en aire, seguido opcionalmente por secado adicional. En algunas realizaciones, la composición de microorganismos recombinantes comprenderá el alcohol, aldehído o acetato graso C6-C24 insaturado cuando se seque.
Como se describe en el presente documento, los microorganismos recombinantes preferidos de la descripción tendrán la capacidad de usar alcanos y ácidos grasos como fuentes de carbono. Sin embargo, como se entenderá en la técnica, se puede usar una variedad de fuentes de carbono, que incluyen, pero no se limitan a diversos azúcares (p. ej., glucosa, fructosa o sacarosa), glicerol, alcoholes (p. ej., etanol), ácidos orgánicos, lignocelulosa, proteínas, dióxido de carbono, monóxido de carbono, así como los alcanos y ácidos grasos antes mencionados. En una realización de ejemplo, el microorganismo recombinante convertirá la fuente de carbono en el alcohol, aldehído o acetato graso C6-C24 insaturado en condiciones aeróbicas.
Como se ha destacado antes, la presente memoria descriptiva proporciona métodos para producir uno o más alcoholes, aldehídos o acetatos grasos C6-C24 insaturados usando un microorganismo recombinante como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, el producto es una feromona de insecto. Como apreciará el experto en la técnica equipado con la presente descripción, se puede expresar una variedad de diferentes enzimas exógenas y endógenas en un microorganismo hospedante recombinante para producir una feromona de insecto deseada. Las feromonas de insectos de ejemplo en forma de alcoholes grasos, aldehídos grasos o acetatos grasos que se pueden generar usando los microorganismos recombinantes y los métodos descritos en el presente documento incluyen, pero no se limitan a (Z)-11-hexadecenal, acetato de (Z)-11-hexadecenilo, acetato de (Z)-9-tetradecenilo, (Z,Z)-11,13-hexadecadienal, (9Z,11E)-hexadecadienal, (E,E)-8,10-dodecadien-1-ol, acetato de (7E,9Z)-dodecadienilo, (Z)-3-nonen-1-ol, (Z)-5-decen-1-ol, acetato de (Z)-5-decenilo, (E)-5-decen-1-ol, acetato de (E)-5-decenilo, (Z)-7-dodecen-1-ol, acetato de (Z)-7-dodecenilo, (E)-8-dodecen-1-ol, acetato de (E)-8-dodecenilo, (Z)-8-dodecen-1-ol, acetato de (Z)-8-dodecenilo, (Z)-9-dodecen-1-ol, acetato de (Z)-9-dodecenilo, (Z)-9-tetradecen-1-ol, (Z)-11-tetraceden-1-ol, acetato de (Z)-11-tetracedenilo, (E)-11-tetradecen-1-ol, acetato de (E)-11-tetradecenilo, (Z)-7-hexadecen-1-ol, (Z)-7-hexadecenal, (Z)-9-hexadecen-1-ol, (Z)-9-hexadecenal, acetato de (Z)-9-hexadecenilo, (Z)-11-hexadecen-1-ol, (Z)-13-octadecen-1-ol y (Z)-13-octadecenal.
En un quinto aspecto, la presente memoria descriptiva proporciona composiciones que comprenden uno o más de los microorganismos recombinantes productores de feromonas de insectos descritos en el presente documento. En determinadas realizaciones, la composición puede comprender además una o más feromonas de insectos producidas por el microorganismo recombinante. En realizaciones adicionales, pueden comprender adicionalmente una o más proteínas o polipéptidos tóxicos producidos por el microorganismo recombinante.
Breve descripción de los dibujos
Se ilustran ejemplos ilustrativos de la descripción en los dibujos, en los que:
La Figura 1 ilustra la conversión de un acil graso saturado-CoA en un alcohol graso insaturado.
La Figura 2 ilustra la conversión de un ácido graso saturado en un aldehído, alcohol o acetato graso mono o poliinsaturado.
La Figura 3 ilustra una ruta adicional para la conversión de un ácido graso saturado en un aldehído, alcohol o acetato graso mono o poliinsaturado.
La Figura 4 ilustra una ruta para la conversión de un ácido graso saturado en varios trienos, dienos, epóxidos y feromonas de numeración impar.
La Figura 5 muestra la producción de Z11 -hexadecenol a partir de W303A y BY4742 APOX1. Cepa que expresa vector vacío (EV), reductasa de S. littoralis (FAR-SL), reductasa de H. armígera (FAR-HA), reductasa de A. segetum (FAR-AS). Las barras de error representan la desviación estándar derivada de N=2 muestras biológicamente independientes.
La Figura 6A-Figura 6B muestra cromatogramas de muestra del producto de biotransformación del ácido Z11-hexadecenoico usando S. cerevisiae que expresa un vector vacío (Figura 6A) o reductasa formadora de alcohol de Helicoverpa armigera (Figura 6B). Líneas negras: sin sustrato añadido. Línea púrpura: Se añadió ácido Z11-hexadecenoico como sustrato.
La Figura 7A-Figura 7B muestra una comparación del patrón de fragmentación por GC-MS del compuesto auténtico Z11 -hexadecenol (Figura 7A), y Z11 -hexadecenol derivado biológicamente (Figura 7B).
La Figura 8 muestra la biomasa en el momento de la recolección para el análisis del producto de W303A (tipo natural) y BY4742 APOX1 (mutante por deleción de beta-oxidación). Cepa que expresa vector vacío (EV), reductasa de S. littoralis (FAR-SL), reductasa de H. armigera (FAR-HA), reductasa de A. segetum (FAR-AS). Las barras de error representan la desviación estándar derivada de N=2 muestras biológicamente independientes,
La Figura 9 muestra una curva de calibración de Z11-hexedecenol construida usando una referencia auténtica. Las muestras se generaron con el método de extracción y análisis descrito en Materiales y métodos del ejemplo 3. Las barras de error representan la desviación estándar derivada de N = 3 muestras.
La Figura 10 muestra un casete pOLE1 que comprende una secuencia de promotor de OLE1 extendida (amarillo claro), promotor de OLE1 (naranja), secuencia líder de OLE1 (gris oscuro), un sintón tal como una secuencia de desaturasa de insecto (gris claro) y la secuencia de terminador de VSP13 (azul).
La Figura 11 A-Figura 11E muestra la validación del casete pOLE1 y el ensayo de complementación. Figura 11 A: YPD ácido palmitoleico; Figura 11 B: YPD - ácido palmitoleico; Figura 11C: CM-Ura con glucosa ácido palmitoleico; Figura 11 D: CM-Ura con glucosa - ácido palmitoleico; Figura 11 E: Mapa de cepas en la Figura 11A-Figura 11D. Dasher = sintón de GFP.
La Figura 12A muestra la complementación del crecimiento de AOLE1 sin UFA en YPD.
La Figura 12B muestra la complementación del crecimiento de AOLE1 sin UFA en CM-Ura con glucosa.
La Figura 13A muestra el espectro completo de ácidos grasos de una cepa AOLE1 que expresa: OLE1 desaturasa de S. cerevisiae (azul), desaturasa de T. ni quimérica (rojo).
La Figura 13B muestra un espectro de ácidos grasos centrado dentro de un tiempo de retención de 5,5 min - 8 min de la cepa AOLE1 de S. cerevisiae que expresa OLE1 desaturasa de S. cerevisiae (rojo) y desaturasa de T. ni quimérica (azul).
La Figura 14A-Figura 14B muestra una comparación del patrón de fragmentación por GC-MS del ácido (Z)-11-hexadecenoico de un compuesto auténtico (Figura 14A) y derivado biológicamente (Figura 14B).
La Figura 15 muestra la producción de alcohol graso C16 de AOLE1 que expresa diversas variantes de la ruta del alcohol graso en cultivo complementado con ácido palmítico y palmitoleico. Las barras de error representan un 5% de incertidumbre en la precisión de la cuantificación de metabolitos.
La Figura 16 muestra cromatogramas representativos de los ácidos grasos C16 productos de biotransformación usando S. cerevisiae que expresa las rutas de alcohol graso TN__desat - HA_reduc cuando se alimenta con ácido palmítico (negro) y cuando se alimenta con ácido palmítico y palmitoleico (naranja). Perfil de una cepa de control negativo (que alberga un vector vacío) alimentada con ácido palmítico (púrpura).
La Figura 17 muestra que se detectó ácido (Z)-11-hexadecenoico en los sedimentos celulares de S. cerevisiae que expresan las rutas de alcoholes grasos TN_desat-SL_reduc (azul), SC_desat-HA_reduc (rojo), TN_desat-HA_reduc (verde), SC_desat- SL_reduc (rosa).
La Figura 18 muestra la producción de alcohol graso C16 de AOLE1 que expresa diversas variantes de la ruta de alcohol graso en cultivo complementado con ácido palmítico solamente. Las barras de error representan 5% de incertidumbre en la precisión de la cuantificación de metabolitos.
La Figura 19A-Figura 19C muestra la detección de (Z)-11-hexadecenol. Figura 19A: Patrón de fragmentación de una referencia auténtica. La m/z 297,3 se usó en experimentos de seguimiento para detectar selectivamente el alcohol. Para detectar también la referencia interna, también se incluyeron las masas 208 y 387,3. Figura 19B: además de la detección del fragmento de masa específico, el tiempo de retención se usó como confirmación de la segunda etapa. El tiempo de retención es 6,22. Figura 19C: Comparación de los dos regioisómeros diferentes 9Z- y 11Z-hexadecenol cuando se detectan en el modo SIM (297,3) con el mismo método.
La Figura 20 muestra la arquitectura del casete de expresión de pXICL. También se muestra la fusión de líder de OLE1 de C. albicans-desaturasa de A. segetum.
La Figura 21A-Figura 21 D muestra la integración del control mCherry. Figura 21 A: Placa de transformación de control negativo (solo agua). Figura 21 B: placa de transformación de pPV0137 mCherry. Figura 21C: placas de parches de clones de control negativo. Figura 21 D: placas de parches de los clones pPV0137.
La Figura 22 muestra la eficiencia de la integración en función de las colonias totales observadas. Se observó que una placa de control sin ADN añadido a la transformación tenía 350 colonias (indicado por la línea naranja). La fracción de clones confirmada como integrantes positivos se correlaciona positivamente con el recuento total de colonias. Se observa un fuerte aumento por encima de las 6.000 colonias totales. Los datos sugieren que la presencia de integrantes positivos aumenta el crecimiento de fondo observado. Para algunas transformaciones, la eficiencia era lo suficientemente alta como para que la población de fondo fuera pequeña en relación con la población integrante positiva.
La Figura 23 muestra una superposición de cromatogramas de cepas de SPV053 de Candida tropicalis. En comparación con el experimento de control de mCherry (rojo), se observa un pico claro a los 6,22 min para la desaturasa de A. transitella (azul) y H. zea (verde). Por lo tanto, la formación de ácido Z-11-hexadecenoico sólo es observable en cepas que expresan Z11-desaturasa activa.
La Figura 24A-Figura 24E muestra la confirmación del regioisómero 11Z. Figura 24A: El pico específico con un fragmento iónico de m/z 245 solo se observó en SPV053 de C. tropicalis que expresa la Z11-desaturasa de A. transitella o H. zea. Figura 24B: Los patrones de fragmentación de la referencia auténtica. Figura 24D: Los patrones de fragmentación del compuesto recién formado en muestras con desaturasa expresada a partir de H. zea coinciden con los de la referencia. Figura 24E: Los patrones de fragmentación del compuesto recién formado en muestras con desaturasa expresada a partir de A. transitella coinciden con los de la referencia. Figura 24C: Los patrones de fragmentación del control mCherry difieren significativamente de los de la Figura 24B, Figura 24D y Figura 24E.
La Figura 25A-Figura 25B muestra un cromatograma de GC-FID de diferentes cepas de SPV053 de C. tropicalis incubadas con tretradecanoato de metilo. Figura 25A: Espectro general. La aparición del pico de Z11 -C16:1 es observable para las cepas que expresan las Z11-desaturasas de A. transiteila y H. zea. Figura 25B: Ampliación del área de C14 a C18. Un nuevo pico es visible a los 4,8 min, que podría corresponder a Z11 -C14:1. También es visible otro pico cerca de Z9-C18:1, que podría corresponder a Z11 -C18:1.
La Figura 26 muestra que solo las variantes de desaturasa de H. zea con codones optimizados producen ácido Z11-hexadecenoico detectable en el cribado de SPV140. Control = pPV101 integrantes de SPV140, T. ni nativa = Z11 desaturasa de T. ni con uso de codones nativo (pPV195), T. ni HS opt = Z11 desaturasa de T. ni con optimización de codones de Homo sapiens (pPV196), T. ni HS opt líder YI = Z11 desaturasa de T. ni con optimización de codones para Homo sapiens y secuencia líder de OLE1 de Y. lipolytica intercambiada (pPV197), H. zea nativa = Z11 desaturasa de H. zea con uso de codones nativo (pPV198), H. zea HS opt = Z11 desaturasa de H. zea con optimización de codones para Homo sapiens (pPV199), H. zea HS opt líder YI = Z11 desaturasa de T. ni H. zea con optimización de codones para Homo sapiens y secuencia líder de OLE1 de Y. lipolytica intercambiada (pPV200), A. transitella nativa = Z11 desaturasa de A. transitella con uso de codones nativo (pPV201). Todos los datos son promedio de 3 repeticiones biológicas. Las barras de error representan la desviación estándar.
La Figura 27 muestra que sólo las variantes de desaturasa de H. zea con codón optimizado producen ácido Z11-hexadecenoico detectable en el cribado de SPV300. Las etiquetas indican la cepa parental y el plásmido del casete de expresión de desaturasa. pPV101 =hrGFP control, pPV198= Z11 desaturasa de H. zea con uso de codones nativo, pPV199= Z11 desaturasa de H. zea con optimización de codones para Homo sapiens, pPV200= Z11 desaturasa de H. zea con optimización de codones para Homo sapiens y secuencia líder de OLE1 de Y. lipolytica intercambiada, pPV201 = Z11 desaturasa de A. transitella con uso de codones nativo.
La Figura 28 muestra las densidades celulares finales para el cribado de desaturasa en contextos de SPV140 y SPV300. Las cepas SPV300 con casetes de desaturasa integrados crecieron a densidades celulares mayores.
La Figura 29 muestra los títulos de ácido Z11-hexadecenoico del aislado individual para las cepas SPV140 y SPV300 que expresan Z11 desaturasa de H. zea con optimización de codones de H. sapiens.
La Figura 30 muestra una superposición de cromatogramas de metabolitos extraídos para la cepa productora de Z11-16OH (SPV0490) frente a la cepa de control (SPV0488) de Candida viswanathii (tropicalis).
La Figura 31 ilustra rutas que se pueden eliminar o alterar para reducir o eliminar la competencia con la ruta biosintética para la producción de un alcohol, aldehído o acetato graso C6-C24 mono o poliinsaturado.
La Figura 32A-Figura 32B muestra los títulos de Z9-16OH y Z11-16OH en medio YPD (Figura 32A) y semidefinido C:N=80 (Figura 32B) para clones pEXP. Se compararon diez aislados que expresan la desaturasa de H. zea bajo el promotor TEF y la reductasa de H. armígera bajo el promotor EXP de dos preparaciones de células competentes independientes (Preparación de células comp. 1, Preparación de células comp. 2) con un control negativo parental (SPV300) y un control negativo de solo desaturasa (SPV459 Hz_desat solo). Las barras de error representan el EEM (error estándar de la media) medido a partir de repeticiones técnicas para cada cepa y condición (N=2). *Se perdió una repetición del Clon 5 y el Clon 18 en las condiciones semidefinidas C:N=80 durante el tratamiento de la muestra, por lo que los títulos para esa condición son de un solo punto de datos (N=1, Preparación de células comp. 1 Clon 18 y Preparación de células comp. 2 Clon 5).
La Figura 33A-Figura 33B muestra perfiles de especies de ácidos grasos de 16 carbonos en medios YPD (Figura 33A) y semidefinido C:N=80 (Figura 33B) para los clones pEXP1. Se comparan los perfiles de lípidos de 16 carbonos de 5 clones seleccionados que expresan la desaturasa de H. zea bajo el promotor TEF y la reductasa de H. armigera bajo el promotor EXP con un control negativo parental (SPV300) y un control negativo de solo desaturasa (SPV459 Hz_desat solo). Las barras de error representan el EEM (error estándar de la media) medido a partir de repeticiones técnicas para cada cepa y condición (N=2).
La Figura 34 muestra los títulos de Z9-16OH y Z11-16OH en medio semidefinido C:N=80 para los clones pTAL1. Se compararon nueve aislados que expresaban la desaturasa de H. zea bajo el promotor TEF y la reductasa de H. armigera bajo el promotor TAL con un control negativo parental (SPV300) y controles de la ruta Bdr positivos usando el promotor EXP para dirigir la expresión de FAR de H. armigera (SPV575, SPV578). Las barras de error representan el EEM (error estándar de la media) medido a partir de repeticiones técnicas para cada cepa y condición (N=2).
La Figura 35 muestra perfiles de especies de ácidos grasos de 16 carbonos en medio semidefinido C:N=80 para clones pTAL1. Se comparan los perfiles de lípidos de 16 carbonos de 5 clones seleccionados que expresan la desaturasa de H. zea bajo el promotor TEF y la reductasa de H. armigera bajo el promotor EXP con un control negativo parental (SPV300) y controles de la ruta Bdr positivos utilizando el promotor EXP para dirigir la expresión de FAR de H. armigera (SPV575, SPV578). Las barras de error representan el EEM (error estándar de la media) medido a partir de repeticiones técnicas para cada cepa y condición (N=2). *Indica clones para los que se perdió una de las repeticiones durante el procesamiento de la muestra, N=1.
La Figura 36 muestra perfiles de lípidos completos del cribado de pTAL1 de la ruta Bdr completa (cepas que expresan Z11 desaturasa de H. zea (pTEF) y FAR de H. armigera) en medio semidefinido C:N=80 después de 48 horas de bioconversión. Las barras de error representan el EEM (error estándar de la media) medido a partir de repeticiones técnicas para cada cepa y condición (N=2). *Indica clones para los que se perdió una de las repeticiones durante el procesamiento de la muestra, N=1.
La Figura 37A:Figura 37B muestra los títulos de Z9-16OH de SPV471 (H222 APAAAFP que expresa OLE1 de Y. lipolytica nativa y FAR de H. armigera) (Figura 37A) y ácidos grasos (Figura 37B) en medio semidefinido C:N=80 después de 24 horas de bioconversión. Las barras de error representan el EEM (error estándar de la media) medido a partir de repeticiones técnicas para cada cepa y condición (N=2).
La Figura 38 muestra perfiles de lípidos completos de SPV471 (H222 APAAAFP que expresa OLE1 de Y. lipolytica nativa y FAR de H. armigera) en medio semidefinido C:N=80 después de 24 horas de bioconversión.
La Figura 39A-Figura 39B muestra las evoluciones temporales de títulos de Z9-16OH de SPV471 (H222 APAAAFP que expresa OLE1 de Y. lipolytica nativa y FAR de H. armigera) (Figura 39A) y ácido-Z9-16 (Figura 39B). La bioconversión del ácido-16 se llevó a cabo en medio semidefinido C:N=80 usando un sustrato de palmitato de metilo (ácido-16).
Secuencias
Una lista de secuencias para SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 38 es parte de esta memoria descriptiva
Descripción detallada
Definiciones
Las siguientes definiciones y abreviaturas son para usar para la interpretación de la descripción.
Como se usa en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" y "el", "la" incluyen referencias plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por lo tanto, por ejemplo, la referencia a "una feromona" incluye una pluralidad de dichas feromonas y la referencia a "el microorganismo" incluye la referencia a uno o más microorganismos, y así sucesivamente.
Como se usa en el presente documento, los términos "comprende", "que comprende", "incluye", "que incluye", "tiene", "que tiene", "contiene", "que contiene" o cualquier otra variación de los mismos, pretenden cubrir una inclusión exclusiva. Una composición, mezcla, procedimiento, método, artículo o aparato que comprende una lista de elementos no se limita necesariamente solo a esos elementos, sino que puede incluir otros elementos no citados expresamente o inherentes a dicha composición, mezcla, procedimiento, método, artículo o aparato. Además, a menos que se indique expresamente lo contrario, "o" se refiere a un inclusivo "o" y no a un "o" exclusivo.
Los términos "aproximadamente" y "alrededor", como se usan en el presente documento para modificar un valor numérico, indican un intervalo cercano que rodea ese valor explícito. Si "X" fuera el valor, "aproximadamente X" o "alrededor de X" indicaría un valor de 0,9X a 1,1X, o, en algunas realizaciones, un valor de 0,95X a 1,05X. Cualquier referencia a "aproximadamente X" o "alrededor de X" indica específicamente al menos los valores X, 0,95X, 0,96X, 0,97X, 0,98X, 0,99X, 1,01X, 1,02X, 1,03X, 1,04X y 1,05X. Por lo tanto, "aproximadamente X" y "alrededor de X" están destinados a enseñar y proporcionar soporte a la descripción escrita para una limitación de reivindicación de, p. ej., "0,98X".
Como se usa en el presente documento, los términos "microbiano", "organismo microbiano" y "microorganismo" incluyen cualquier organismo que exista como una célula microscópica que esté incluida dentro de los dominios de arqueas, bacterias o eucariotas, los últimos incluyendo levaduras y hongos filamentosos, protozoos, algas o protistas superiores. Por lo tanto, el término pretende abarcar células u organismos procariotas o eucariotas que tienen un tamaño microscópico e incluye bacterias, arqueas y eubacterias de todas las especies, así como microorganismos eucariotas tales como levaduras y hongos. También se incluyen cultivos celulares de cualquier especie que se pueda cultivar para la producción de un producto químico.
Como se describe en el presente documento, en algunos ejemplos, los microorganismos recombinantes son microorganismos procariotas. En algunos ejemplos, los microorganismos procariotas son bacterias. "Bacteria" o "eubacteria" se refiere a un dominio de organismos procariotas. Las bacterias incluyen al menos once grupos distintos como sigue: (1) bacterias Gram positivas (Gram+), de las cuales hay dos subdivisiones principales: (1) grupo de G+C alto (Actinomycetes, Mycobacteria, Micrococcus, otros) (2) Grupo de G+C bajo (Bacillus, Clostridia, Lactobacillus, Staphylococci, Streptococci, Mycoplasmas); (2) Proteobacterias, p. ej., bacterias Gram negativas fotosintéticas no fotosintéticas púrpura (incluye las bacterias Gram negativas más "comunes"); (3) Cianobacterias, p. ej., fotótrofos oxigénicos; (4) Espiroquetas y especies relacionadas; (5) Planctomicetos; (6) Bacteroides, Flavobacterias; (7) clamidia; (8) Bacterias verdes del azufre; (9) Bacterias verdes no del azufre (también fotótrofos anaeróbicos); (10) Micrococos radiorresistentes y relacionados; (11) Termófilos Thermotoga y Thermosipho.
Las "bacterias Gram negativas" incluyen cocos, bacilos no entéricos y bacilos entéricos. Los géneros de bacterias Gram negativas incluyen, por ejemplo, Neisseria, Spirillum, Pasteurella, Brucella, Yersinia, Francisella, Haemophilus, Bordetella, Escherichia, Salmonella, Shigella, Klebsiella, Proteus, Vibrio, Pseudomonas, Bacteroides, Acetobacter, Aerobacter, Agrobacterium, Azotobacter, Spirilla, Serratia, Vibrio, Rhizobium, Chlamydia, Rickettsia, Treponema, y Fusobacterium.
Las "bacterias Gram positivas" incluyen cocos, bacilos no esporulados y bacilos esporulados. Los géneros de bacterias Gram positivas incluyen, por ejemplo, Actinomyces, Bacillus, Clostridium, Corynebacterium, Erysipelothrix, Lactobacillus, Listeria, Mycobacterium, Myxococcus, Nocardia, Staphylococcus, Streptococcus, y Streptomyces.
La expresión "microorganismo recombinante" y "célula hospedante recombinante" se usan indistintamente en el presente documento y se refieren a microorganismos que han sido modificados genéticamente para expresar o sobreexpresar enzimas endógenas, para expresar enzimas heterólogas, tales como las incluidas en un vector, en una construcción de integración, o que tienen una alteración en la expresión de un gen endógeno. Por "alteración" se entiende que la expresión del gen, o el nivel de una molécula de ARN o moléculas de ARN equivalentes que codifican uno o más polipéptidos o subunidades de polipéptidos, o la actividad de uno o más polipéptidos o subunidades de polipéptidos está regulada por aumento o por disminución, de manera que dicha expresión, nivel o actividad es mayor o menor que la observada en ausencia de la alteración. Por ejemplo, el término "alterar" puede significar "inhibir", pero el uso de la palabra "alterar" no se limita a esta definición. Se entiende que las expresiones "microorganismo recombinante" y "célula hospedante recombinante" se refieren no sólo al microorganismo recombinante particular sino a la progenie o la progenie potencial de dicho microorganismo. Debido a que pueden ocurrir ciertas modificaciones en las generaciones sucesivas debido a mutaciones o influencias ambientales, dicha progenie puede no ser, de hecho, idéntica a la célula parental, pero todavía están incluidas dentro del alcance del término como se usa en el presente documento.
El término "expresión" con respecto a una secuencia génica se refiere a la transcripción del gen y, según sea adecuado, a la traducción del transcrito de ARNm resultante en una proteína. Por lo tanto, como será evidente por el contexto, la expresión de una proteína resulta de la transcripción y traducción de la secuencia del marco de lectura abierto. El nivel de expresión de un producto deseado en una célula hospedante se puede determinar basándose en la cantidad de ARNm correspondiente que está presente en la célula, o la cantidad del producto deseado codificado por la secuencia seleccionada. Por ejemplo, el ARNm transcrito a partir de una secuencia seleccionada se puede cuantificar por qRT-PCR o por hibridación Northern (véase Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)). La proteína codificada por una secuencia seleccionada se puede cuantificar por varios métodos, p. ej., por ELISA, por ensayo de la actividad biológica de la proteína, o usando ensayos que son independientes de dicha actividad, tales como transferencia Western o radioinmunoensayo, usando anticuerpos que reconocen y se unen a la proteína. Véase Sambrook et al., 1989, véase antes.
El término "polinucleótido" se usa en el presente documento de manera intercambiable con el término "ácido nucleico" y se refiere a un polímero orgánico compuesto de dos o más monómeros que incluyen nucleótidos, nucleósidos o análogos de los mismos, incluyendo, pero no limitados a ácido desoxirribonucleico (ADN) monocatenario o bicatenario, paralelo o antiparalelo de cualquier longitud y, cuando sea adecuado, ácido ribonucleico (ARN) monocatenario o bicatenario, paralelo o antiparalelo de cualquier longitud, incluyendo ARNip. El término "nucleótido" se refiere a cualquiera de varios compuestos que consisten en un azúcar ribosa o desoxirribosa unido a una base de purina o pirimidina y a un grupo fosfato, y que son las unidades estructurales básicas de los ácidos nucleicos. El término "nucleósido" se refiere a un compuesto (tal como guanosina o adenosina) que consiste en una base de purina o pirimidina combinada con desoxirribosa o ribosa y se encuentra en especial en ácidos nucleicos. Las expresiones "análogo de nucleótido" o "análogo de nucleósido" se refieren, respectivamente, a un nucleótido o nucleósido en el que uno o más átomos individuales se han reemplazado por un átomo diferente o por un grupo funcional diferente. Por consiguiente, el término polinucleótido incluye ácidos nucleicos de cualquier longitud, ADN, ARN, análogos y fragmentos de los mismos. Un polinucleótido de tres o más nucleótidos también se denomina oligómero nucleotídico u oligonucleótido.
Se entiende que los polinucleótidos descritos en el presente documento incluyen "genes" y que las moléculas de ácido nucleico descritas en el presente documento incluyen "vectores" o "plásmidos". Por consiguiente, el término "gen", también llamado un "gen estructural" se refiere a un polinucleótido que codifica una secuencia particular de aminoácidos, que comprende todas o parte de una o más proteínas o enzimas, y puede incluir secuencias de ADN reguladoras (no transcritas), tales como secuencias promotoras, que determinan, por ejemplo, las condiciones en las que se expresa el gen. La región transcrita del gen puede incluir regiones no traducidas, que incluyen intrones, región 5' no traducida (UTR) y 3'-UTR, así como la secuencia codificante.
El término "enzima" como se usa en el presente documento se refiere a cualquier sustancia que cataliza o promueve una o más reacciones químicas o bioquímicas, que normalmente incluye enzimas compuestas total o parcialmente por un polipéptido o polipéptidos, pero puede incluir enzimas compuestas por una molécula diferente incluyendo polinucleótidos.
Como se usa en el presente documento, la expresión "no se encuentra de forma natural", cuando se usa en referencia a un organismo microorganismo o actividad enzimática de la descripción, pretende significar que el organismo microorganismo o enzima tiene al menos una alteración genética que normalmente no se encuentra en una cepa que ocurre naturalmente de la especie indicada, incluyendo las cepas de tipo natural de la especie indicada. Las alteraciones genéticas incluyen, por ejemplo, modificaciones que introducen ácidos nucleicos expresables que codifican polipéptidos metabólicos, otras adiciones de ácidos nucleicos, eliminaciones de ácidos nucleicos y/u otra alteración funcional del material genético del microorganismo. Dichas modificaciones incluyen, por ejemplo, regiones codificantes y fragmentos funcionales de las mismas, para polipéptidos heterólogos, homólogos o tanto heterólogos como homólogos para las especies indicadas. Modificaciones adicionales incluyen, por ejemplo, regiones reguladoras no codificantes en las que las modificaciones alteran la expresión de un gen u operón. Un ejemplo de actividad enzimática o microorganismo no naturales incluye la actividad de hidroxilación descrita antes.
El término "exógeno" como se usa en el presente documento con referencia a varias moléculas, p. ej., polinucleótidos, polipéptidos, enzimas, etc., se refiere a moléculas que no se encuentran normalmente o de forma natural y/o no son producidas por una levadura, bacteria, organismo, microorganismo o línea celular dados en la naturaleza.
Por otro lado, el término "endógeno" o "nativo" como se usa en el presente documento con referencia a varias moléculas, p. ej., polinucleótidos, polipéptidos, enzimas, etc., se refiere a moléculas que se encuentran normalmente o de forma natural y/o son producidas por una levadura, bacteria, organismo, microorganismo o célula dados en la naturaleza,
El término "heterólogo" como se usa en el presente documento en el contexto de una célula hospedante modificada se refiere a varias moléculas, p. ej., polinucleótidos, polipéptidos, enzimas, etc., en donde al menos uno de los siguientes es verdad: (a) la o las moléculas son extrañas ("exógenas") a (es decir, no se encuentran naturalmente en) la célula hospedante; (b) la o las moléculas se encuentran naturalmente en (p. ej., son "endógenas de") un microorganismo hospedante o célula hospedante dados, pero se producen en un sitio no natural o en una cantidad no natural en la célula; y/o (c) la o las moléculas difieren en la secuencia de nucleótidos o aminoácidos de la o las secuencias de nucleótidos o aminoácidos endógenas de manera que la molécula que difiere en la secuencia de nucleótidos o aminoácidos del nucleótido o aminoácido endógeno tal como se encuentra de forma endógena, se produce en una cantidad no natural (p. ej., mayor que la que se encuentra naturalmente) en la célula.
El término "homólogo", como se usa en el presente documento con respecto a una enzima o gen original de una primera familia o especie, se refiere a enzimas o genes distintas de una segunda familia o especie que por análisis funcionales, estructurales o genómicos se determina que son una enzima o gen de la segunda familia o especie que corresponde a la enzima o gen original de la primera familia o especie. Los homólogos suelen tener similitudes funcionales, estructurales o genómicas. Se conocen técnicas mediante las cuales los homólogos de una enzima o gen se pueden clonar fácilmente usando sondas genéticas y PCR. La identidad de las secuencias clonadas como homólogos se puede confirmar usando ensayos funcionales y/o por mapeo genómico de los genes.
Una proteína tiene "homología" o es "homóloga" a una segunda proteína si la secuencia de aminoácidos codificada por un gen tiene una secuencia de aminoácidos similar a la del segundo gen. Alternativamente, una proteína tiene homología con una segunda proteína si las dos proteínas tienen secuencias de aminoácidos "similares". Por lo tanto, la expresión "proteínas homólogas" pretende significar que las dos proteínas tienen secuencias de aminoácidos similares. En ciertos casos, la homología entre dos proteínas es indicativa de su ascendencia compartida, relacionada por la evolución.
El término "ácido graso" como se usa en el presente documento se refiere a un compuesto de estructura R-COOH, en el que R es un hidrocarburo C6 a C24 saturado, insaturado, lineal, ramificado o cíclico y el grupo carboxilo está en la posición 1. En una realización particular, R es un hidrocarburo C6 a C24 lineal saturado o insaturado y el grupo carboxilo está en la posición 1.
El término "alcohol graso", como se usa en el presente documento, se refiere a un alcohol alifático que tiene la fórmula R-OH, en donde R es un hidrocarburo C6 a C24 saturado, insaturado, lineal, ramificado o cíclico. En una realización particular, R es un hidrocarburo C6 a C24 lineal saturado o insaturado.
El término "acil graso-CoA " se refiere a un compuesto que tiene la estructura R-(CO)-SR1, en donde R1 es coenzima A, y el término "acil graso-ACP " se refiere a un compuesto que tiene la estructura R-(CO)-S-R1, en donde R1 es una proteína transportadora de acilo ACP.
Introducción
La presente descripción se dirige a la necesidad de tecnologías novedosas para la producción rentable de productos valiosos a partir de materias primas de bajo coste. Específicamente, los autores de la presente invención han abordado esta necesidad con el desarrollo de microorganismos recombinantes capaces de producir una amplia variedad de alcoholes, aldehídos y acetatos grasos C6-C24 insaturados, que incluyen feromonas sintéticas de insectos, fragancias, sabores e intermedios poliméricos a partir de materias primas de bajo coste. Por lo tanto, aspectos de la descripción se basan en el descubrimiento de los autores de la invención de que se pueden modificar microorganismos recombinantes con el fin de producir productos valiosos a partir de materias primas de bajo coste, lo que evita las metodologías sintéticas convencionales para producir productos valiosos.
Como se ha descrito antes, los microorganismos recombinantes se pueden modificar para sintetizar alcoholes grasos C6-C24 mono o poliinsaturados. Los alcoholes grasos C6-C24 mono o poliinsaturados sintetizados como se describe en el presente documento se pueden convertir además en los aldehídos o acetatos correspondientes. Por lo tanto, se pueden usar diversas realizaciones de la presente descripción para sintetizar una variedad de feromonas de insectos seleccionadas entre alcoholes, aldehídos y acetatos grasos. Además, las realizaciones descritas en el presente documento también se pueden usar para la síntesis de fragancias, sabores y productos intermedios poliméricos.
Feromonas
Como se ha descrito antes, realizaciones de la descripción proporcionan la síntesis de una o más feromonas de insectos usando un microorganismo recombinante. Una feromona es un compuesto químico volátil que es secretado por un insecto en particular para la función de comunicación química dentro de la especie. Es decir, una feromona es un factor químico secretado o excretado que desencadena una respuesta social en miembros de la misma especie. Existen, entre otras, feromonas de alarma, feromonas de rastro alimentario, feromonas sexuales, feromonas de agregación, feromonas epidícticas, feromonas liberadoras, feromonas cebadoras y feromonas territoriales que afectan el comportamiento o la fisiología.
Los ejemplos no limitantes de feromonas de insectos que se pueden sintetizar usando los microorganismos recombinantes y métodos descritos en el presente documento incluyen alcoholes, aldehidos y acetatos lineales citados en la Tabla 1.
Tabla 1. Feromonas lineales C6-C20
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En algunos aspectos, las feromonas sintetizadas como se enseña en esta descripción incluyen al menos una feromona citada en la tabla 2a para modular el comportamiento de un insecto citado en la tabla 2a. En otros aspectos, los ejemplos no limitantes de feromonas de insectos que se pueden sintetizar usando los microorganismos recombinantes y los métodos descritos en el presente documento incluyen alcoholes, aldehídos y acetatos citados en la tabla 2a. Sin embargo, los microorganismos descritos en el presente documento no se limitan a la síntesis de feromonas C6-C20 citadas en la tabla 1 y tabla 2a. Por el contrario, los microorganismos descritos también se pueden usar en la síntesis de diversos alcoholes, aldehídos y acetatos grasos mono o poliinsaturados C6-C24, incluyendo fragancias, sabores y productos intermedios poliméricos.
Tabla 2a. Feromonas de ejemplo que se pueden sintetizar según los métodos descritos en la presente descripción.
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La mayoría de las feromonas comprenden una cadena principal hidrocarbonada con el hidrógeno terminal sustituido por un grupo funcional (Ryan MF (2002). Insect Chemoreception. Fundamental and Applied. Kluwer Academic Publishers). La tabla 2b muestra algunos grupos funcionales comunes, junto con sus fórmulas, prefijos y sufijos. La presencia de uno o más dobles enlaces, generados por la pérdida de hidrógenos de los carbonos adyacentes, determina el grado de insaturación de la molécula y altera la designación de un hidrocarburo de -ano (sin enlaces múltiples) a -eno. La presencia de dos y tres dobles enlaces se indica terminando el nombre con -dieno y -trieno, respectivamente. La posición de cada doble enlace se representa por un número correspondiente al carbono a partir del cual empieza, con cada carbono numerado a partir del unido al grupo funcional. El carbono al que está unido el grupo funcional se designa -1-. Las feromonas pueden tener, pero no se limitan a, longitudes de cadena hidrocarbonada de 10 (deca-), 12 (dodeca-), 14 (tetradeca-), 16 (hexadeca-), o 18 (octadeca-) carbonos de largo. La presencia de un doble enlace tiene otro efecto. Impide la rotación de la molécula fijándola en una de dos configuraciones posibles, cada una de las cuales representa isómeros geométricos que son moléculas diferentes. Estos se designan E (de la palabra alemana Entgegen, opuesto) o Z (Zusammen, juntos), cuando las cadenas de carbonos están conectadas en lados opuestos (trans) o en el mismo (cis), respectivamente, del doble enlace.
Tabla 2b. Prefijos y sufijos para grupos funcionales comunes
Grupo funcional Fórmula Prefijo Sufijo
Alcohol -OH Hidroxi- -ol
Aldehído -CH=O Formil- -al
Amina -NH2 Amino- -amina
Ácido carboxílico -COOH Carboxi- ácido -oico Éster -COOR R-oxicarbonil- -R-oato Cetona >C=O Oxo- -ona
Howse, PE, Stevens, IDR y Jones, OT (1998). Insect pheromones and their use in pest management. London: Chapman and Hall.
Las feromonas descritas en el presente documento se pueden nombrar usando la nomenclatura IUPAC o diversas abreviaturas o variaciones conocidas por un experto en la técnica. Por ejemplo, (11Z)-hexadecen-1-al, también se puede escribir como Z-11-hexadecen-1-al, Z-11-hexadecenal, o Z-x-y:Ald, donde x representa la posición del doble enlace e y representa el número de carbonos en la cadena principal hidrocarbonada. Las abreviaturas usadas en el presente documento y conocidas por los expertos en la técnica para identificar grupos funcionales en la cadena principal hidrocarbonada incluyen "Ald", que indica un aldehído, "OH", que indica un alcohol, y "Ac", que indica un acetilo. Además, el número de carbonos en la cadena se puede indicar usando números en lugar de usar el nombre escrito. Por lo tanto, como se usa en el presente documento, una cadena de carbonos insaturada compuesta por dieciséis carbonos se puede escribir como hexadeceno o 16.
Se usan abreviaturas y derivados similares en el presente documento para describir precursores de feromonas. Por ejemplo, los precursores acil graso-CoA de (11Z)-hexadecen-1-al se pueden identificar como (11Z)-hexadecenil-CoA o Z-11-16:Acil-CoA.
La presente descripción se refiere a la síntesis de alcoholes aldehídos y acetatos grasos mono o poliinsaturados C6-C24, usando un microorganismo recombinante que comprende una o más enzimas heterólogas, que catalizan conversiones de sustrato a producto para una o más etapas en el procedimiento de síntesis.
Desaturasa
La presente descripción describe enzimas que desaturan sustratos de acilo graso en sustratos de acilo graso insaturado correspondientes.
En algunas realizaciones, se usa una desaturasa para catalizar la conversión de un acil graso-CoA o acil-ACP en un acil graso-CoA o acil-ACP insaturado correspondiente. Una desaturasa es una enzima que cataliza la formación de un doble enlace carbono-carbono en un ácido graso saturado o derivado de ácido graso, p. ej., acil graso-CoA o acil graso-ACP (denominados colectivamente en el presente documento como "acil graso"), eliminando al menos dos átomos de hidrógeno para producir un ácido/acilo graso insaturado correspondiente. Las desaturasas se clasifican con respecto a la capacidad de la enzima para catalizar selectivamente la formación de dobles enlaces en un carbono subterminal con respecto al extremo metilo del ácido/acilo graso o un carbono subterminal con respecto al extremo carbonilo del ácido/acilo graso. Las desaturasas omega (w) catalizan la formación de un doble enlace carbono-carbono en un carbono subterminal fijo con respecto al extremo metilo de un ácido/acilo graso. Por ejemplo, una desaturasa w3 cataliza la formación de un doble enlace entre el tercer y cuarto carbono con respecto al extremo metilo de un ácido/acilo graso. Las desaturasas delta (A) catalizan la formación de un doble enlace carbono-carbono en una posición específica con respecto al grupo carboxilo de un ácido graso o al grupo carbonilo de un acil graso CoA. Por ejemplo, una desaturasa A9 cataliza la formación de un doble enlace entre los carbonos C9 y C10 con respecto al extremo carboxilo del ácido graso o el grupo carbonilo de un acil graso CoA.
Como se usa en el presente documento, una desaturasa se puede describir con referencia al sitio en el que la desaturasa cataliza la formación de un doble enlace y la configuración geométrica resultante (es decir, E/Z) del hidrocarburo insaturado. Por consiguiente, como se usa en el presente documento, una desaturasa Z9 se refiere a una desaturasa A que cataliza la formación de un doble enlace entre los carbonos C9 y C10 con respecto al extremo carbonilo de un ácido/acilo graso, orientando así dos hidrocarburos en lados opuestos de los dobles enlaces carbonocarbono en la configuración cis o Z. De manera similar, como se usa en el presente documento, una Z11 desaturasa se refiere a una desaturasa A que cataliza la formación de un doble enlace entre los carbonos C11 y C12 con respecto al extremo carbonilo de un ácido/acilo graso.
Las desaturasas tienen un motivo estructural conservado. Este motivo de la secuencia de las desaturasas transmembrana se caracteriza por [HX3-4HX7-41(3 no-His)HX2-3(1 no-His)HHX61-189(40 no-His)HX2-3(1 no-His)HH]. El motivo de la secuencia de las desaturasas solubles se caracteriza por la aparición de [D/EEXXH].
En algunas realizaciones, la desaturasa es una acil graso-CoA desaturasa que cataliza la formación de un doble enlace en un acil graso-CoA. En algunas de dichas realizaciones, la acil graso-CoA desaturasa descrita en el presente documento es capaz de usar un acil graso-CoA como un sustrato que tiene una longitud de cadena de 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 o 24 átomos de carbono. Por lo tanto, la desaturasa usada en el microorganismo recombinante se puede seleccionar basada en la longitud de cadena del sustrato.
En algunas realizaciones, la acil graso desaturasa descrita en el presente documento es capaz de catalizar la formación de un doble enlace en el carbono deseado con respecto a la CoA terminal en el acil graso insaturado-CoA. Por lo tanto, en algunas realizaciones, se puede seleccionar una desaturasa para usar en el microorganismo recombinante que cataliza la inserción de doble enlace en la posición 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o 13 con respecto al grupo carbonilo en un acil graso-CoA.
En algunas realizaciones, la acil graso desaturasa descrita en el presente documento es capaz de catalizar la formación de un doble enlace en un acil graso saturado-CoA de modo que el acil graso insaturado-CoA resultante tiene una configuración geométrica cis o trans (es decir, Z o E).
En algunas realizaciones, la desaturasa es una acil graso-ACP desaturasa que cataliza la formación de un doble enlace en un acil graso-ACP. En algunas realizaciones, la acil graso-ACP desaturasa descrita en el presente documento es capaz de usar un acil graso-CoA como un sustrato que tiene una longitud de cadena de 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 o 24 átomos de carbono. Por lo tanto, la desaturasa usada en el microorganismo recombinante se puede seleccionar basado en la longitud de cadena del sustrato.
En algunas realizaciones, la acil graso-ACP desaturasa descrita en el presente documento es capaz de catalizar la formación de un doble enlace en un carbono deseado con respecto al carbonilo terminal en el acil graso insaturado-ACP. Por lo tanto, en algunas realizaciones, se puede seleccionar una desaturasa para usar en el microorganismo recombinante que cataliza la inserción de doble enlace en la posición 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o 13 con respecto al grupo carbonilo en un acil graso-ACP.
En algunas realizaciones, la acil graso desaturasa descrita en el presente documento es capaz de catalizar la formación de un doble enlace en un acil graso saturado-CoA de modo que el acil graso insaturado-ACP resultante tiene una configuración geométrica cis o trans (es decir, Z o E).
En una realización, la acil graso desaturasa es una Z11 desaturasa. En algunos ejemplos, una secuencia de ácido nucleico que codifica una Z11 desaturasa de organismos de las especies Agrotis segetum, Amyelois transitella, Argyrotaenia velutiana, Choristoneura rosaceana, Lampronia capitella, Trichoplusia ni, Helicoverpa zea, o Thalassiosira pseudonana es de codones optimizados. En algunos ejemplos, la Z11 desaturasa comprende una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 9, 18, 24 y 26 de Trichoplusia ni. En otros ejemplos, la Z11 desaturasa comprende una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 10 y 16 de Agrotis segetum. En algunos ejemplos, la Z11 desaturasa comprende una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 11 y 23 de Thalassiosira pseudonana. En ciertos ejemplos, la Z11 desaturasa comprende una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 12, 17 y 30 de Amyelois transitella. En algunas realizaciones, la Z11 desaturasa comprende una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 13, 19, 25, 27 y 31 de Helicoverpa zea. En algunas realizaciones, la Z11 desaturasa comprende un polipéptido quimérico. En algunas realizaciones, una Z11 desaturasa completa o parcial se fusiona con otro polipéptido. En ciertas realizaciones, la secuencia líder nativa N-terminal de una Z11 desaturasa se sustituye por una secuencia líder de oleosina de otra especie. En ciertos ejemplos, la Z11 desaturasa comprende una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 15, 28 y 29.
En una realización, la acil graso desaturasa es una Z9 desaturasa. En algunas realizaciones, una secuencia de ácido nucleico que codifica una Z9 desaturasa es de codones optimizados. En algunos ejemplos, la Z9 desaturasa comprende una secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 20 de Ostrinia furnacalis. En otros ejemplos, la Z9 desaturasa comprende una secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 21 de Lampronia capitella. En algunas realizaciones, la Z9 desaturasa comprende una secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 22 de Helicoverpa zea.
Acil graso reductasa
La presente descripción describe enzimas que reducen sustratos de acilo graso a los correspondientes alcohol o aldehídos grasos.
En algunas realizaciones, se usa una acil graso-reductasa formadora de alcohol graso para catalizar la conversión de un acil graso-CoA en un alcohol graso correspondiente. En algunas realizaciones, se usa una acil graso-reductasa formadora de aldehído graso para catalizar la conversión de un acil graso-ACP en un aldehído graso correspondiente. Una acil graso reductasa es una enzima que cataliza la reducción de un acil graso-CoA en un alcohol graso correspondiente o la reducción de un acil graso-ACP en un aldehído graso correspondiente. Un acil graso-CoA y acil graso-ACP tiene una estructura de R-(CO)-S-R1, en donde R es un hidrocarburo C6 a C24 saturado, insaturado, lineal, ramificado o cíclico, y R1 representa CoA o ACP. En una realización particular, R es un hidrocarburo C6 a C24 lineal, saturado o insaturado. "CoA" es un grupo transportador de acilo no proteico implicado en la síntesis y oxidación de ácidos grasos. "ACP" es una proteína transportadora de acilo, es decir, un polipéptido o subunidad de proteína, de la ácido graso sintasa usada en la síntesis de ácidos grasos.
Por lo tanto, en algunas realizaciones, la descripción proporciona una acil graso-reductasa formadora de alcohol graso que cataliza la reducción de un acil graso-CoA al alcohol graso correspondiente. Por ejemplo, R-(CO)-S-CoA se convierte en R-CH2OH y CoA-SH cuando dos moléculas de NAD(P)H se oxidan a NAD(P)+. Por consiguiente, en algunas de dichas realizaciones, un microorganismo recombinante descrito en el presente documento puede incluir una acil graso-reductasa formadora de alcohol graso heterólogo, que cataliza la reducción de un acil graso-CoA al alcohol graso correspondiente. En una realización de ejemplo, un microorganismo recombinante descrito en el presente documento incluye al menos una molécula de ácido nucleico exógena que codifica una acil graso reductasa formadora de alcohol que cataliza la conversión de un acil graso C6-C24 mono o poliinsaturado-CoA en el alcohol graso C6-C24 mono o poliinsaturado correspondiente.
En otras realizaciones, la descripción proporciona una acil graso-reductasa formadora de aldehído graso que cataliza la reducción de un acil graso-ACP al aldehído graso correspondiente. Por ejemplo, R-(CO)-S-ACP se convierte en R-(CO)-H y ACP-SH cuando una molécula de NAD(P)H es oxida a NAD(P)+. En algunas de dichas realizaciones, un microorganismo recombinante descrito en el presente documento puede incluir una acil graso-reductasa formadora de aldehído graso heteróloga, que cataliza la reducción de un acil graso-ACP al aldehído graso correspondiente. En una realización de ejemplo, un microorganismo recombinante descrito en el presente documento incluye al menos una molécula de ácido nucleico exógena que codifica una acil graso reductasa formadora de aldehído graso que cataliza la conversión de un acil graso C6-C24 mono o poliinsaturado-ACP en el aldehído graso C6-C24 mono o poliinsaturado correspondiente.
En algunas realizaciones, una secuencia de ácido nucleico que codifica una acil graso reductasa de organismos de las especies Agrotis segetum, Spodoptera littoralis o Helicoverpa amigera es de codones optimizados. En algunas realizaciones, la acil graso reductasa comprende una secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 1 de Agrotis segetum. En otras realizaciones, la acil graso reductasa comprende una secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 2 de Spodoptera littoralis. En algunas realizaciones, la acil graso reductasa comprende una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 3 y 32 de Helicoverpa armígera.
Acil-ACP sintetasa
La presente descripción describe enzimas que ligan un ácido graso al correspondiente acil graso-ACP.
En algunas realizaciones, se usa una acil-ACP sintetasa para catalizar la conversión de un ácido graso en un acil graso-ACP correspondiente. Una acil-ACP sintetasa es una enzima capaz de ligar un ácido graso a ACP para producir un ácido graso acil-ACP. En algunas realizaciones, se puede usar una acil-ACP sintetasa para catalizar la conversión de un ácido graso en un acil graso-ACP correspondiente. En algunas realizaciones, la acil-ACP sintetasa es una sintetasa capaz de usar un ácido graso como un sustrato que tiene una longitud de cadena de 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23 o 24 átomos de carbono. En una de dichas realizaciones, un microorganismo recombinante descrito en el presente documento puede incluir una acil-ACP sintetasa heteróloga, que cataliza la conversión de un ácido graso en un acil graso-ACP correspondiente. En una realización de ejemplo, un microorganismo recombinante descrito en el presente documento incluye al menos una molécula de ácido nucleico exógena que codifica una acil-ACP sintetasa que cataliza la conversión de un ácido graso C6-C24 saturado en un acil graso C6-C24 saturado-ACP correspondiente.
Complejo de ácido graso sintasa
La presente descripción describe enzimas que catalizan la elongación de una cadena de carbonos en un ácido graso.
En algunas realizaciones, se usa un complejo de ácido graso sintasa para catalizar el inicio y elongación de una cadena de carbonos en un ácido graso. Un "complejo de ácido graso sintasa" se refiere a un grupo de enzimas que cataliza el inicio y elongación de una cadena de carbonos en un ácido graso. La ACP junto con las enzimas en la ruta de la ácido graso sintasa (FAS) controlan la longitud, el grado de saturación y la ramificación de los ácidos grasos producidos. Las etapas en esta ruta son catalizadas por enzimas de las familias de genes de biosíntesis de ácidos grasos (fab) y acetil-CoA carboxilasa (acc). Dependiendo del producto deseado, uno o más de estos genes se pueden atenuar, expresar o sobreexpresar. En realizaciones de ejemplo, uno o más de estos genes es sobreexpresado.
Hay dos clases principales de ácido graso sintasas. Los sistemas de tipo I (FAS I) usan un único polipéptido grande, multifuncional y son comunes tanto de mamíferos como de hongos (aunque la disposición estructural de las sintasas de hongos y mamíferos difiere). El sistema FAS tipo I también se encuentra en el grupo de bacterias CMN (corinebacterias, micobacterias y nocardia). La FAS de tipo II (FAS II) se caracteriza por el uso de enzimas monofuncionales discretas para la síntesis de ácidos grasos y se encuentra en arqueas y bacterias.
El mecanismo de FAS I y la elongación y reducción de FAS II es sustancialmente similar, ya que los dominios de los polipéptidos multienzimáticos de las enzimas FAS I y FAS II se conservan en gran medida.
Los ácidos grasos se sintetizan mediante una serie de reacciones de condensación de Claisen descarboxilativas a partir de acetil-CoA y malonil-CoA. Las etapas en esta ruta son catalizadas por enzimas de las familias de genes de biosíntesis de ácidos grasos (fab) y acetil-CoA carboxilasa (acc). Para una descripción de esta ruta, véase, p. ej., Heath et al., Prog. Lipid Res. 40:467, 2001. Sin estar limitados por la teoría, en las bacterias, la acetil-CoA es carboxilada por la acetil-CoA carboxilasa (Acc, una enzima de múltiples subunidades codificada por cuatro genes separados, accABCD), para formar malonil-CoA. En la levadura, la acetil-CoA es carboxilada por los equivalentes de levaduras de la acetil-CoA carboxilasa, codificadas por ACC1 y ACC2. En las bacterias, el grupo malonato se transfiere a ACP por la malonil-CoA:ACP transacilasa (FabD) para formar malonil-ACP. En la levaduras, un dominio de malonilpalmitil transferasa añade malonilo del malonil-CoA al dominio de ACP del complejo FAS. Después se produce una reacción de condensación, donde el malonil-ACP se fusiona con acil-CoA, dando como resultado p-cetoacil-ACP. De esta manera, el sustrato hidrocarbonado se alarga en 2 carbonos.
Después de la elongación, el grupo p-ceto se reduce a la cadena de carbonos completamente saturada por la acción secuencial de una ceto-reductasa (KR), deshidratasa (DH) y enol reductasa (ER). La cadena de ácidos grasos alargada es transportada entre estos sitios activos mientras está unida covalentemente al grupo prostético de fosfopanteteína de la ACP. Primero, el p-cetoacil-ACP es reducido por NADPH para formar p-hidroxiacil-ACP. En bacterias, esta etapa es catalizada por la p-cetoacil-ACP reductasa (FabG). La reacción equivalente en levaduras es catalizada por el dominio de cetoreductasa (KR) de FAS. Después, la p-hidroxiacil-ACP se deshidrata para formar trans-2-enoil-ACP, que es catalizada por la p-hidroxiacil-ACP deshidratasa/isomerasa (FabA) o p-hidroxiacil-ACP deshidratasa (FabZ) en bacterias o el dominio deshidratasa (DH) de FAS en levaduras. La trans-2-enoil-ACP reductasa I, II o III dependiente de NADPH (Fabl, FabK y FabL, respectivamente) en bacterias y el dominio de enol reductasa (ER) de FAS en levaduras reduce el trans-2-enoil-ACP para formar acil-ACP. Los ciclos posteriores se inician por la condensación de malonil-ACP con acil-ACP por la p-cetoacil-ACP sintasa I o la p-cetoacil-ACP sintasa II (FabB y FabF, respectivamente, en bacterias o el dominio de la beta-cetoacil sintasa (KS) en levaduras).
En algunas realizaciones, se puede usar un complejo de ácido graso sintasa para catalizar el alargamiento de un acil graso-ACP a un acil graso-ACP correspondiente con un alargamiento de dos carbonos con respecto al sustrato.
Deshidrogenasa
La presente descripción describe enzimas que catalizan la conversión de un aldehído graso en un alcohol graso. En algunas realizaciones, se usa una alcohol deshidrogenasa (ADH, tabla 3) para catalizar la conversión de un aldehído graso en un alcohol graso. Una serie de ADH identificadas de organismos alcanotróficos, Pseudomonas fluorescens NRRL B-1244 (Hou et al. 1983), Pseudomonas butanovora ATCC 43655 (Vangnai y Arp 2001), y Acinetobacter sp. cepa M-1 (Tani et al. 2000), han mostrado ser activas en alcoholes alquílicos de cadena corta a media (C2 a C14). Adicionalmente, las ADH disponibles en el mercado de Sigma, ADH de hígado de caballo y ADH de levadura de panadería tienen actividad detectable para sustratos con longitud de C10 y mayor. Las actividades descritas para alcoholes grasos más largos pueden estar afectadas por dificultades en la solubilización de los sustratos. Para la ADH de levadura de Sigma, se observa poca o ninguna actividad para aldehídos C12 a C14 (Tani et al. 2000), sin embargo, se ha observado actividad para hidroxi-w-ácido grasos C12 y C16 (Lu et al.2010). Recientemente, se han caracterizado dos ADH de Geobacillus thermodenitrificans NG80-2, un organismo que degrada alcanos C15 a C36 usando la LadA hidroxilasa. Se detectó actividad de metanol a 1-triacontanol (C30) para ambas ADH, siendo el 1-octanol el sustrato preferido para la ADH2 y el etanol para la ADH1 (Liu et al. 2009).
El uso de ADH en bioconversiones de célula entera se ha centrado principalmente en la producción de alcoholes quirales a partir de cetonas (Ernst et al. 2005) (Schroer et al. 2007). Mediante el uso de ADH de Lactobacillus brevis y regeneración de cofactor acoplado con isopropanol, Schroer et al. describieron la producción de 797 g de (R)-3 hidroxibutanoato de metilo a partir de acetoacetato de metilo, con un rendimiento en el tiempo de 29 g/l/h (Schroer et al. 2007). Se han descrito ejemplos de oxidación de alcohol alifático en transformaciones de célula entera con S. cerevisiae obtenida en el mercado para la conversión de hexanol en hexanal (Presecki et al. 2012) y de 2-heptanol en 2-heptanona (Cappaert y Larroche 2004).
Tabla 3. Enzimas alcohol deshidrogenasas de ejemplo.
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Alcohol oxidasa
La presente descripción describe enzimas que oxidan alcoholes grasos a aldehidos grasos.
En algunas realizaciones, se usa una alcohol oxidasa (AOX) para catalizar la conversión de un alcohol graso en un aldehído graso. Las alcohol oxidasas catalizan la conversión de alcoholes en los correspondientes aldehídos (o cetonas) con transferencia de electrones mediante el uso de oxígeno molecular para formar peróxido de hidrógeno como subproducto. Las enzimas AOX usan dinucleótido de flavina y adenina (FAD) como un cofactor esencial y se regeneran con la ayuda del oxígeno en el medio de reacción. Las enzimas catalasa se pueden acoplar con la AOX para evitar la acumulación de peróxido de hidrógeno a través de la conversión catalítica en agua y oxígeno.
Basándose en las especificidades del sustrato, las AOX se pueden clasificar en cuatro grupos: (a) oxidasa de alcohol de cadena corta, (b) oxidasa de alcohol de cadena larga, (c) oxidasa de alcohol aromático y (d) oxidasa de alcohol secundario (Goswami et al. 2013). Dependiendo de la longitud de la cadena del sustrato deseado, algunos miembros de estos cuatro grupos son más adecuados que otros como candidatos para la evaluación.
Las oxidasas de alcohol de cadena corta (incluyendo, pero no limitadas a las clasificadas actualmente como EC 1.1.3.13, tabla 4) catalizan la oxidación de sustratos de alcohol de longitud de cadena inferior en el intervalo de C1-C8 carbonos (van der Kiel et al. 1991) (Ozimek et al. 2005). Las oxidasas de alcohol alifático de levaduras metilotróficas tales como Candida boidiniiy Komagataella pastoris (anteriormente Pichia pastoris) catalizan la oxidación de alcanoles primarios a los correspondientes aldehídos con preferencia por alcoholes alifáticos de cadena corta no ramificados.
La especificidad de sustrato más amplia se encuentra para la alcohol oxidasa de Pichia pastoris que incluye alcohol propargílico, 2-cloroetanol, 2-cianoetanol (Dienys et al. 2003). El principal desafío que se encuentra en la oxidación del alcohol es la alta reactividad del producto aldehído. El uso de un sistema de dos fases líquidas (agua/disolvente) puede proporcionar la separación in situ del producto aldehído de la fase de reacción antes de que se convierta en el ácido. Por ejemplo, la producción de hexanal a partir de hexanol usando alcohol oxidasa de Pichia pastoris acoplada con catalasa de hígado bovino se logró en un sistema bifásico aprovechando la presencia de una alcohol oxidasa estable en fase acuosa (Karra-Chaabouni et al, 2003). Por ejemplo, la alcohol oxidasa de Pichia pastoris podía oxidar alcoholes alifáticos de C6 a C11 cuando se usaba un sistema de reacción orgánico bifásico (Murray y Duff 1990). Se citan los métodos para usar alcohol oxidasas en un sistema bifásico de acuerdo con Karra-Chaabouni et al. 2003 y Murray y Duff 1990.
Las oxidasas de alcohol de cadena larga (incluyendo, pero no limitadas a las clasificadas actualmente como EC 1.1.3.20; Tabla 5) incluyen oxidasas de alcohol graso, oxidasas de ácido graso de cadena larga y oxidasas de alcohol graso de cadena larga que oxidan sustratos de alcohol con una longitud de cadena de carbonos de más de seis (Goswami et al. 2013). Banthorpe et al. describieron una oxidasa de alcohol de cadena larga purificada de hojas de Tanacetum vulgare que podía oxidar sustratos de alcohol de cadena larga saturada e insaturada incluyendo hex-trans-2-en-1 -ol y octan-1 -ol (Banthorpe 1976) (Cardemil 1978). Otras especies de plantas, incluyendo Simmondsia chinensis (Moreau, R.A., Huang 1979), Arabidopsis thaliana (Cheng et al. 2004), y Lotus japonicas (Zhao et al. 2008) también se han descrito como fuentes de oxidasas de alcohol de cadena larga. Las oxidasas de alcohol graso se describen principalmente de especies de levaduras (Hommel y Ratledge 1990) (Vanhanen et al. 2000) (Hommel et al. 1994) (Kemp et al. 1990) y estas enzimas tienen una función importante en el metabolismo de ácidos grasos de cadena larga (Cheng et al. 2005). Las oxidasas de alcohol graso de especies de levaduras que degradan y crecen sobre alcanos de cadena larga y ácido graso catalizan la oxidación de alcoholes grasos. La oxidasa de alcohol graso de Candida tropicalis se ha aislado como fracciones celulares microsomales y se ha caracterizado para una variedad de sustratos (Eirich et al. 2004) (Kemp et al. 1988) (Kemp et al. 1991) (Mauersberger et al. 1992). Se observa actividad significativa para alcoholes primarios de longitud Cs a C16 con una Km descrita en el intervalo de 10-50 pM (Eirich et al. 2004). Las alcohol oxidasas descritas se pueden usar para la conversión de alcoholes alifáticos de cadena media en aldehídos como se describe, por ejemplo, para células completas de Candida boidinii (Gabelman y Luzio 1997), y Pichia pastoris (Duff y Murray 1988) (Murray y Duff 1990). Las oxidasas de alcohol de cadena larga de hongos filamentosos se produjeron durante el crecimiento en sustratos hidrocarbonados (Kumar y Goswami 2006) (Savitha y Ratledge 1991). La oxidasa de alcohol graso de cadena larga (LjFAO1) de Lotus japonicas se ha expresado de forma heteróloga en E. coli y presentaba una especificidad de sustrato amplia para la oxidación de alcoholes que incluían 1-dodecanol y 1-hexadecanol (Zhao et al. 2008).
Tabla 4. Enzimas alcohol oxidasas capaces de oxidar alcoholes de cadena corta (EC 1.1.3.13)
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Tabla 5. Enzimas alcohol oxidasas capaces de oxidar alcoholes de cadena larga incluyendo alcoholes grasos (EC 1.1.3.20)
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Acetil transferasa
La presente descripción describe enzimas que convierten alcoholes en acetatos grasos.
En algunas realizaciones, se usa una acetil transferasa para catalizar la conversión de un alcohol graso en un acetato graso. Una acetil transferasa es una enzima que tiene la capacidad de producir un éster de acetato mediante la transferencia del grupo acetilo del acetil-CoA a un alcohol. En algunas realizaciones, la acetil transferasa puede tener un número EC de 2.3.1.84.
La acetil transferasa, o la secuencia de ácido nucleico que la codifica, se puede aislar de varios organismos, incluyendo, pero no limitados a organismos de las especies Saccharomyces cerevisiae, Danaus plexippus, Heliotis virescens, Bombyx mori, Agrotis ipsilon, Agrotis segetum, Euonymus alatus. En realizaciones de ejemplo, la acetil transferasa comprende una secuencia seleccionada de los n° de acceso de GenBank AY242066, AY242065, AY242064, AY242063, AY242062, EHJ65205, ACX53812, NP_001182381, EHJ65977, EHJ68573, KJ579226, GU594061. Se pueden encontrar péptidos de acetil transferasa de ejemplo adicionales en el documento US2010/0199548.
Acil graso-ACP tioesterasa
La acil-ACP tioesterasa libera ácidos grasos libres de los acil-ACP, sintetizados a partir de la biosíntesis de ácidos grasos nuevos. La reacción termina la biosíntesis de ácidos grasos. En las plantas, la biosíntesis de ácidos grasos se produce en los plastos y, por lo tanto, requiere acil-ACP tioesterasas localizadas en los plastos. Los productos principales de la acil-ACP tioesterasa son el oleato (C18:0) y en menor medida el palmitato (C16:0) en los tejidos vegetativos de todas las plantas. Los ácidos grasos libres liberados se reesterifican con coenzima A en la envoltura del plasto y se exportan fuera del plasto.
Hay dos isoformas de acil-ACP tioesterasa, FatA y FatB. La especificidad de sustrato de estas isoformas determina la longitud de la cadena y el nivel de ácidos grasos saturados en las plantas. La actividad más alta de FatA es con C18:1-ACP. FatA tiene actividades muy bajas hacia otros acil-ACP en comparación con C18:1-ACP. FatB tiene la mayor actividad con C16:0-ACP. También tiene una actividad alta significativa con C18:1-ACP, seguido de C18:0-ACP y C16:1-ACP. Los estudios cinéticos de FatA y FatB indican que sus especificidades de sustrato con diferentes acil-ACP provienen de los valores de Kcat, en lugar de Km. Los valores de Km de las dos isoformas con diferentes sustratos son similares, del orden micromolar. El intercambio de dominios de FatA y FatB indica que el extremo N de las isoformas determina sus especificidades de sustrato (Salas JJ and Ohlrogge JB (2002) "Characterization of substrate specificity of plant FatA and FatB acil-ACP tioesterasas". Arch Biochem Biophys 403(1): 25-34). Para aquellas plantas que acumulan predominantemente ácidos grasos saturados de longitud de cadena media en semillas, evolucionaron con tioesterasas FatB y/o FatA especializadas (Voelker T and Kinney AJ (2001) "Variations in the biosynthesis of seedstorage lipids". Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 52: 335-361). Por ejemplo, el laurato (12:0) es el aceite de semilla predominante en el coco. De forma correspondiente, se detectó la actividad de acil-ACP tioesterasa específica de cadena media en semillas de coco.
En una realización, se seleccionan una o más acil graso-ACP tioesterasas grasas del grupo que consiste en Q41635, Q39473, P05521.2, AEM72519, AEM72520, AEM72521, AEM72523, AAC49784, CAB60830, EER87824, EER96252, ABN54268, AAO77182, CAH09236, ACL08376, y homólogos de los mismos.
Expresión de proteínas o polipéptidos tóxicos
La presente descripción describe una proteína, péptido o molécula pequeña tóxicos que pueden ser codificados por un microorganismo recombinante. En algunas realizaciones, la proteína, péptido o molécula pequeña tóxicos se producen biosintéticamente junto con una feromona de insecto.
En algunas realizaciones, el microorganismo recombinante expresa una o más moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína o polipéptido que es tóxico para un insecto. En algunas realizaciones, la proteína o polipéptido tóxico es de un organismo entomopatógeno. En algunas realizaciones, el organismo entomopatógeno se selecciona de Bacillus thuringiensis, Pseudomonas aeruginosa y Serratia marcescens. En una realización particular, la molécula de ácido nucleico codifica una toxina de Bacillus thuringiensis.
En algunas realizaciones, un microorganismo recombinante se modifica para expresar una ruta metabólica que, cuando se expresa, produce una molécula pequeña que es tóxica para un insecto.
En realizaciones de ejemplo, una feromona de insecto producida por un microorganismo recombinante descrito en el presente documento se puede usar para atraer un insecto de plaga y, posteriormente, el insecto de plaga se erradica con una sustancia tóxica, tal como una proteína, péptido o molécula pequeña tóxicos, que ha sido coproducido por un microorganismo recombinante descrito en el presente documento.
Biosíntesis de feromonas usando un microorganismo recombinante
Como se ha descrito antes, en un primer aspecto, la presente descripción se refiere a un microorganismo recombinante capaz de producir un alcohol graso C6-C24 mono o poliinsaturado a partir de una fuente endógena o exógena de acil graso C6-C24 saturado-CoA. En la Figura 1 se muestra una realización ilustrativa del primer aspecto. Las líneas azules designan rutas bioquímicas usadas para producir un acil saturado-CoA, que actúa como un sustrato para la conversión en el acil graso insaturado-CoA. La conversión del sustrato en acil graso insaturado-CoA puede ser llevada a cabo por enzimas endógenas o exógenas en un hospedante. Las líneas verdes indican conversiones catalizadas por una molécula de ácido nucleico exógena que codifica una enzima. Por consiguiente, en algunas realizaciones, la conversión de un acil graso saturado-CoA en un acil graso mono o poliinsaturado-CoA es catalizada por al menos una desaturasa, que es codificada por una molécula de ácido nucleico exógena. En realizaciones adicionales, la conversión del acil graso mono o poliinsaturado-CoA en un alcohol graso mono o poliinsaturado es catalizada por al menos una reductasa, que es codificada por una molécula de ácido nucleico exógeno. Las líneas grises discontinuas indican las etapas posteriores para la síntesis de feromonas, fragancias, sabores y productos intermedios poliméricos, tales como el uso de una alcohol oxidasa o un oxidante para producir un aldehído graso mono o poliinsaturado y una acetiltransferasa o una sustancia química tal como cloruro de acetilo para producir un acetato graso mono o poliinsaturado. Las cruces rojas indican rutas eliminadas o reguladas por disminución nativas del hospedante, que aumentan el flujo hacia la ruta modificada.
Por consiguiente, en una realización, el microorganismo recombinante expresa: (a) al menos una molécula de ácido nucleico exógeno que codifica una acil graso desaturasa que cataliza la conversión de un acil graso C6-C24 saturado-CoA en un acil graso C6-C24 mono o poliinsaturado-CoA correspondiente; y (b) al menos una molécula de ácido nucleico exógeno que codifica una acil graso reductasa formadora de alcohol graso que cataliza la conversión del acil graso C6-C24 mono o poliinsaturado-CoA de (a) en el alcohol graso C6-C24 mono o poliinsaturado correspondiente. En algunas realizaciones, el acil graso C6-C24 saturado-CoA se puede producir usando enzimas endógenas en el microorganismo hospedante. En otras realizaciones, el acil graso C6-C24 saturado-CoA se puede producir usando una o más enzimas exógenas en el microorganismo hospedante.
Como se ha descrito antes, una acil graso desaturasa cataliza la desaturación de la cadena hidrocarbonada, p. ej., en una molécula de acil graso saturado-CoA para generar una molécula de acil graso insaturado CoA correspondiente. En algunas realizaciones, se puede seleccionar una acil graso desaturasa exógena y expresar en un microorganismo recombinante para catalizar la formación de al menos un doble enlace en la molécula de acil graso-CoA que tiene de 6 a 24 carbonos en la cadena hidrocarbonada. Por consiguiente, en algunas realizaciones, la acil graso desaturasa es una desaturasa capaz de usar un acil graso-CoA como un sustrato que tiene una longitud de cadena de 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23 o 24 átomos de carbono.
Se puede seleccionar una acil graso desaturasa exógena descrita en el presente documento para catalizar la desaturación en una posición deseada en la cadena hidrocarbonada. Por consiguiente, en algunas realizaciones, la acil graso desaturasa es capaz de generar un doble enlace en la posición C5, C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12 o C13, en el ácido graso o sus derivados, tales como por ejemplo, ésteres de ácido graso CoA.
Una o más de una acil graso-CoA desaturasa pueden ser expresadas en el hospedante para catalizar la desaturación en múltiples posiciones en la cadena hidrocarbonada. En algunas realizaciones, la acil graso-CoA desaturasa es heteróloga para el microorganismo hospedante. Por consiguiente, varias realizaciones proporcionan microorganismos recombinantes que comprenden al menos una molécula de ácido nucleico exógena, que codifica una acil graso desaturasa que cataliza la conversión de un acil graso C6-C24 saturado-CoA en un acil graso C6-C24 mono o poliinsaturado-CoA correspondiente.
En una realización de ejemplo, la acil graso desaturasa es una Z11 desaturasa. La acil graso Z11 desaturasa cataliza la formación de doble enlace entre los carbonos 11° y 12° en el sustrato con respecto al grupo carbonilo. En varios ejemplos descritos en el presente documento, la Z11 desaturasa, o la secuencia de ácido nucleico que la codifica, se puede aislar de organismos de las especies Agrotis segetum, Amyelois transitella, Argyrotaenia velutiana, Choristoneura rosaceana, Lampronia capitella, Trichoplusia ni, Helicoverpa zea o Thalassiosira pseudonana. Se pueden aislar Z11 -desaturasas adicionales, o las secuencias de ácidos nucleicos que las codifican, de Bombyx mori, Manduca sexta, Diatraea grandiosella, Earias insulana, Earias vittella, Plutella xylostella, Bombyx mori o Diaphania nitidalis. En ejemplos, la Z11 desaturasa comprende una secuencia seleccionada de los n° de acceso de GenBank JX679209, JX964774, AF416738, AF545481, EU152335, AAD03775, AAF81787 y AY493438. En algunos ejemplos, una secuencia de ácido nucleico que codifica una Z11 desaturasa de organismos de las especies Agrotis segetum, Amyelois transitella, Argyrotaenia velutiana, Choristoneura rosaceana, Lampronia capitella, Trichoplusia ni, Helicoverpa zea o Thalassiosira pseudonana es de codones optimizados. En algunos ejemplos, la Z11 desaturasa comprende una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 9, 18, 24 y 26 de Trichoplusia ni. En otros ejemplos, la Z11 desaturasa comprende una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 10 y 16 de Agrotis segetum. En algunos ejemplos, la Z11 desaturasa comprende una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 11 y 23 de Thalassiosira pseudonana. En ciertos ejemplos, la Z11 desaturasa comprende una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 12, 17 y 30 de Amyelois transitella. En algunas realizaciones, la Z11 desaturasa comprende una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 13, 19, 25, 27 y 31 de Helicoverpa zea. En algunas realizaciones, la Z11 desaturasa comprende un polipéptido quimérico. En algunas realizaciones, una Z11 desaturasa completa o parcial se fusiona con otro polipéptido. En ciertas realizaciones, la secuencia líder nativa N-terminal de una Z11 desaturasa se sustituye por una secuencia líder de oleosina de otra especie. En ciertos ejemplos, la Z11 desaturasa comprende una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 15, 28 y 29.
En ciertas realizaciones, la Z11 desaturasa cataliza la conversión de un acil graso-CoA en un producto mono o poliinsaturado seleccionado de Z11-13:Acil-CoA, E11-13:Acil-CoA, (Z,Z)-7,11-13:Acil-CoA, Z11-14:Acil-CoA, E11-14:Acil-CoA, (E,E)-9,11-14:Acil-CoA, (E,Z)-9,11-14:Acil-CoA, (Z,E)-9,11-14:Acil-CoA, (Z,Z)-9,11-14:Acil-CoA, (E,Z)-9.11- 15:Acil-CoA, (Z,Z)-9,11-15:Acil-CoA, Z11-16:Acil-CoA, E11-16:Acil-CoA, (E,Z)-6,11-16:Acil-CoA, (E,Z)-7,11-16:Acil-CoA, (E,Z)-8,11-16:Acil-CoA, (E,E)-9,11-16:Acil-CoA, (E,Z)-9,11-16:Acil-CoA, (Z,E)-9,11-16:Acil-CoA, (Z,Z)-9,11 -16:Acil-CoA, (E,E)-11,13-16:Acil-CoA, (E,Z)-11,13-16:Acil-CoA, (Z,E)-11,13-16:Acil-CoA, (Z,Z)-11,13-16:Acil-CoA, (Z,E)-11,14-16:Acil-CoA, (E,E,Z)-4,6,11-16:Acil-CoA, (Z,Z,E)-7,11,13-16:Acil-CoA, (E,E,Z,Z)-4,6,11,13-16:Acil-CoA, Z11-17:Acil-CoA, (Z,Z)-8,11-17:Acil-CoA, Z11-18:Acil-CoA, E11-18:Acil-CoA, (Z,Z)-11,13-18:Acil-CoA, (E,E)-11,14-18:Acil-CoA, o combinaciones de los mismos.
En otra realización de ejemplo, la acil graso desaturasa es una Z9 desaturasa. La Z9 acil graso desaturasa cataliza la formación de doble enlace entre los carbonos 9° y 10° en el sustrato con respecto al grupo carbonilo. En varios ejemplos descritos en el presente documento, la Z9 desaturasa, o la secuencia de ácido nucleico que la codifica, se puede aislar de organismos de las especies Ostrinia furnacalis, Ostrinia nobilalis, Choristoneura rosaceana, Lampronia capitella, Helicoverpa assulta o Helicoverpa zea. En ejemplos, la Z9 desaturasa comprende una secuencia seleccionada de los n° de acceso de GenBank AY057862, AF243047, AF518017, EU152332, AF482906, y AAF81788. En algunas realizaciones, una secuencia de ácido nucleico que codifica una Z9 desaturasa es de codones optimizados. En algunos ejemplos, la Z9 desaturasa comprende una secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 20 de Ostrinia furnacalis. En otros ejemplos, la Z9 desaturasa comprende una secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 21 de Lampronia capitella. En algunas realizaciones, la Z9 desaturasa comprende una secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 22 de Helicoverpa zea.
En ciertas realizaciones, la Z9 desaturasa cataliza la conversión de un acil graso-CoA en un producto monoinsaturado o poliinsaturado seleccionado de Z9-11:Acil-CoA, Z9-12:Acil-CoA, E9-12:Acil-CoA, (E,E)-7,9-12:Acil-CoA, (E,Z)-7,9-12:Acil-CoA, (Z,E)-7,9-12:Acil-CoA, (Z,Z)-7,9-12:Acil-CoA, Z9-13:Acil-CoA, E9-13:Acil-CoA, (E,Z)-5,9-13:Acil-CoA, (Z,E)-5,9-13:Acil-CoA, (Z,Z)-5,9-13:Acil-CoA, Z9-14:Acil-CoA, E9-14:Acil-CoA, (E,Z)-4,9-14:Acil-CoA, (E,E)-9,11 -14:Acil-CoA, (E,Z)-9,11-14:Acil-CoA, (Z,E)-9,11-14:Acil-CoA, (Z,Z)-9,11-14:Acil-CoA, (E,E)-9,12-14:Acil-CoA, (Z,E)-9.12- 14:Acil-CoA, (Z,Z)-9,12-14:Acil-CoA, Z9-15:Acil-CoA, E9-15:Acil-CoA, (Z,Z)-6,9-15:Acil-CoA, Z9-16:Acil-CoA, E9-16:Acil-CoA, (E,E)-9,11-16:Acil-CoA, (E,Z)-9,11-16:Acil-CoA, (Z,E)-9,11-16:Acil-CoA, (Z,Z)-9,11-16:Acil-CoA, Z9-17:Acil-CoA, E9-18:Acil-CoA, Z9-18:Acil-CoA, (E,E)-5,9-18:Acil-CoA, (E,E)-9,12-18:Acil-CoA, (Z,Z)-9,12-18:Acil-CoA, (Z,Z,Z)-3,6,9-18:Acil-CoA, (E,E,E)-9,12,15-18:Acil-CoA, (Z,Z,Z)-9,12,15-18:Acil-CoA, o combinaciones de los mismos.
La desaturación de un acil graso C6-C24 saturado-CoA puede proceder por una pluralidad de reacciones para producir un acil graso C6-C24 poliinsaturado-CoA. En algunas realizaciones, el microorganismo recombinante puede expresar una desaturasa bifuncional capaz de catalizar la formación de al menos dos dobles enlaces. En algunas realizaciones, el microorganismo recombinante puede expresar más de una molécula de ácido nucleico exógena que codifica más de una acil graso desaturasa que cataliza la conversión de un acil graso C6-C24 saturado-CoA en un acil graso C6-C24 poliinsaturado-CoA correspondiente. Por ejemplo, el microorganismo recombinante puede expresar una molécula de ácido nucleico exógena que codifica una Z11 desaturasa y otra molécula de ácido nucleico exógena que codifica una Z9 desaturasa. Por lo tanto, el acil graso poliinsaturado-CoA resultante tendría un doble enlace entre el carbono 9° y 10° y otro doble enlace entre el carbono 11° y 12°.
En algunas realizaciones, el microorganismo recombinante puede expresar una acil graso conjugasa que actúa independientemente o junto con una acil graso desaturasa para catalizar la conversión de un acil graso saturado o monoinsaturado-CoA en un acil graso poliinsaturado conjugado-CoA.
En una realización, la descripción proporciona un microorganismo recombinante capaz de producir un alcohol graso C6-C24 poliinsaturado a partir de una fuente endógena o exógena de acil graso C6-C24 saturado o monoinsaturado-CoA, en donde el microorganismo recombinante expresa: (a) al menos una molécula de ácido nucleico exógena que codifica una acil graso conjugasa que cataliza la conversión de un acil graso C6-C24 saturado o monoinsaturado-CoA en un acil graso C6-C24 poliinsaturado-CoA correspondiente; y (b) al menos una molécula de ácido nucleico exógena que codifica una acil graso reductasa formadora de alcohol que cataliza la conversión del acil graso C6-C24 poliinsaturado-CoA de (a) en el alcohol graso C6-C24 poliinsaturado correspondiente.
En otra realización, el microorganismo recombinante expresa al menos dos moléculas de ácido nucleico exógenas que codifican acil graso conjugasas que catalizan la conversión de un acil graso C6-C24 saturado o monoinsaturado-CoA en un acil graso C6-C24 poliinsaturado-CoA correspondiente.
En una realización adicional, la descripción proporciona un microorganismo recombinante capaz de producir un alcohol graso C6-C24 poliinsaturado a partir de una fuente endógena o exógena de acil graso C6-C24 saturado o monoinsaturado-CoA, en donde el microorganismo recombinante expresa: (a) al menos una molécula de ácido nucleico exógena que codifica una acil graso desaturasa y al menos una molécula de ácido nucleico exógena que codifica una acil graso conjugasa que cataliza la conversión de un acil graso C6-C24 saturado o monoinsaturado-CoA en un acil graso C6-C24 poliinsaturado-CoA correspondiente; y (b) al menos una molécula de ácido nucleico exógena que codifica una acil graso reductasa formadora de alcohol que cataliza la conversión del acil graso C6-C24 poliinsaturado-CoA de (a) en el alcohol graso C6-C24 poliinsaturado correspondiente.
En otra realización, el microorganismo recombinante expresa al menos dos moléculas de ácido nucleico exógenas que codifican acil graso desaturasas y al menos dos moléculas de ácido nucleico exógenas que codifican acil graso conjugasas que catalizan la conversión de un acil graso C6-C24 saturado o monoinsaturado-CoA en un acil graso C6-C24 poliinsaturado-CoA correspondiente.
En otra realización más, la acil graso conjugasa es una conjugasa capaz de usar un acil graso-CoA como un sustrato que tiene una longitud de cadena de 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 o 24 átomos de carbono.
En ciertas realizaciones, la conjugasa, o la secuencia de ácido nucleico que la codifica, se puede aislar de organismos de las especies Cydia pomonella, Cydia nigricana, Lobesia botrana, Myelois cribrella, Plodia interpunctella, Dendrolimus punctatus, Lampronia capitella, Spodoptera litura, Amyelois transitella, Manduca sexta, Bombyx mori, Calendula officinalis, Trichosanthes kirilowii, Punica granatum, Momordica charantia, Impatiens balsamina y Epiphyas postvittana. En realizaciones de ejemplo, la conjugasa comprende una secuencia seleccionada de los n° de acceso de GenBank o la base de datos Uniprot: A0A059TBF5, A0A0M3L9E8, A0AM3L9S4, A0A0M3LAH8, A0A0M3LAS8, A0A0M3LAH8, B6CBS4, XP_013183656.1, XP_004923568.2, ALA65425.1, NP_001296494.1, NP_001274330.1, Q4A181, Q75PL7, Q9FPP8, AY178444, AY178446, AF182521, AF182520, Q95UJ3.
Como se ha descrito antes, una acil graso reductasa cataliza la reducción de un grupo carbonilo, p. ej., en una molécula de acil graso insaturado-CoA para generar una molécula de ácido graso insaturado correspondiente. En algunas realizaciones, la acil graso CoA reductasa formadora de alcohol graso es heteróloga para el microorganismo. Por consiguiente, diversas realizaciones proporcionan un microorganismo recombinante que comprende al menos una molécula de ácido nucleico exógena, que codifica una acil graso reductasa formadora de alcohol graso que cataliza la reducción de un grupo carbonilo en una molécula de acil graso insaturado-CoA para generar una molécula de ácido graso insaturado correspondiente.
En algunas realizaciones, la acil graso reductasa es de un organismo de las especies Agrotis segetum, Spodoptera littoralis o Helicoverpa amigera. En algunas realizaciones, una secuencia de ácido nucleico que codifica una acil graso reductasa es de codones optimizados. En algunas realizaciones, la acil graso reductasa comprende una secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 1 de Agrotis segetum. En otras realizaciones, la acil graso reductasa comprende una secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 2 de Spodoptera littoralis. En algunas realizaciones, la acil graso reductasa comprende una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 3 y 32 de Helicoverpa armígera.
En realizaciones de ejemplo, la acil graso reductasa cataliza la conversión de un acil graso mono o poliinsaturado-CoA en un producto de alcohol graso seleccionado de (Z)-3-hexenol, (Z)-3-nonenol, (Z)-5-decenol, (E)-5-decenol, (Z)-7-dodecenol, (E)-8-dodecenol, (Z)-8-dodecenol, (Z)-9-dodecenol, (Z)-9-tetradecenol, (Z)-9-hexadecenol, (Z)-11-tetradecenol, (Z)-7-hexadecenol, (Z)-11-hexadecenol, (E)-11-tetradecenol o (Z,Z)-11,13-hexadecadienol, (11Z,13E)-hexadecadienol, (E,E)-8,10-dodecadienol, (E,Z)-7,9-dodecadienol, (Z)-13-octadecenol, o combinaciones de los mismos.
En algunas realizaciones, un microorganismo recombinante descrito en el presente documento puede incluir una pluralidad de acil graso reductasas. Por consiguiente, en dichas realizaciones, el microorganismo recombinante expresa al menos dos molécula de ácido nucleico exógenas, que codifican acil graso reductasas que catalizan la conversión del acil graso C6-C24 mono o poliinsaturado-CoA en el alcohol graso C6-C24 mono o poliinsaturado correspondiente.
Como se ha descrito antes, en un segundo aspecto, la memoria descriptiva se refiere a un microorganismo recombinante capaz de producir un alcohol graso C6-C24 insaturado a partir de una fuente endógena o exógena de ácido graso C6-C24. Se muestra un ejemplo ilustrativo del segundo aspecto en la figura 2. Las líneas azules indican rutas bioquímicas endógenas para el hospedante, p. ej., rutas para convertir un n-alcano, alcohol graso, o aldehido graso en un ácido graso, o la conversión de un ácido graso en acil graso-CoA, acetil-CoA, o ácido dicarboxílico. La conversión del sustrato al ácido graso insaturado se puede llevar a cabo por enzimas endógenas o exógenas en un hospedante. Las líneas amarillas indican conversiones catalizadas por una molécula de ácido nucleico exógena que codifican una enzima. Por consiguiente, en algunas realizaciones, la conversión de un ácido graso saturado en un acil graso saturado-ACP puede ser catalizada por al menos una acil graso saturado-ACP sintetasa, en donde la acil graso-ACP sintetasa es codificada por una molécula de ácido nucleico exógena. En realizaciones adicionales, la conversión del acil graso saturado-ACP en un acil graso mono o poliinsaturado-ACP puede ser catalizada por al menos una acil graso-ACP desaturasa, en donde la acil graso-ACP desaturasa es codificada por una molécula de ácido nucleico exógena. En otras realizaciones más, el acil graso mono o poliinsaturado-ACP se puede alargar en al menos 2 carbonos relativos usando un complejo de ácido graso sintasa y una fuente de carbono, p. ej., malonil-ACP. En dicha realización, la conversión del acil graso mono o poliinsaturado-ACP en un acil graso mono o poliinsaturado-ACP correspondiente alargado en dos carbonos puede ser catalizada por al menos un complejo de ácido graso sintasa, en donde el complejo de ácido graso sintasa es codificado por una o más moléculas de ácido nucleico exógenas. En otras realizaciones más, la conversión del acil graso mono o poliinsaturado-ACP alargado en un aldehído graso mono o poliinsaturado puede ser catalizada por una acil graso reductasa formadora de aldehído graso, en donde la acil graso reductasa formadora de aldehído graso es codificada por una molécula de ácido nucleico exógena. En algunas realizaciones, el aldehído graso mono o poliinsaturado se puede convertir en un alcohol graso mono o poliinsaturado correspondiente, en donde la conversión del sustrato al producto es catalizada por una deshidrogenasa, en donde la deshidrogenasa es codificada por una molécula de ácido nucleico endógena o exógena. Las líneas discontinuas indican etapas posteriores de la descripción, tal como el uso de una acetil transferasa o metátesis, o posteriores transformaciones químicas para producir feromonas funcionalizadas. Las cruces rojas indican rutas eliminadas o reguladas por disminución nativas del hospedante, que aumentan el flujo hacia la ruta modificada.
En una realización, el microorganismo recombinante expresa (a): al menos una molécula de ácido nucleico exógena que codifica una acil-ACP sintetasa que cataliza la conversión de un ácido graso C6-C24 en un acil graso C6-C24 saturado-ACP correspondiente; (b) al menos una molécula de ácido nucleico exógena que codifica una acil graso-ACP desaturasa que cataliza la conversión de un acil graso C6-C24 saturado-ACP en un acil graso C6-C24 mono o poliinsaturado-ACP correspondiente; (c) una o más moléculas de ácido nucleico endógenas o exógenas que codifican un complejo de ácido graso sintasa que cataliza la conversión del acil graso C6-C24 mono o poliinsaturado-ACP de (b) en un acil graso C6-C24 mono o poliinsaturado-ACP correspondiente con un alargamiento de dos carbonos con respecto al producto de (b); (d): al menos una molécula de ácido nucleico exógena que codifica una acil graso reductasa formadora de aldehído graso que cataliza la conversión del acil graso C6-C24 mono o poliinsaturado-ACP de (c) en un aldehído graso C6-C24 mono o poliinsaturado correspondiente; y (e) al menos una molécula de ácido nucleico endógena o exógena que codifica una deshidrogenasa que cataliza la conversión del aldehído graso C6-C24 mono o poliinsaturado C6-C24 de (d) en un alcohol graso C6-C24 mono o poliinsaturado correspondiente. En algunas realizaciones, el ácido graso C6-C24 se puede producir usando enzimas endógenas en el microorganismo recombinante. En otras realizaciones, el ácido graso C6-C24 saturado puede ser producido por una o más enzimas exógenas en el microorganismo recombinante.
En algunas realizaciones, el microorganismo recombinante descrito en el presente documento incluye una acil-ACP sintetasa para catalizar la conversión de un ácido graso C6-C24 en un acil graso C6-C24 saturado-ACP correspondiente. En algunas realizaciones la acil-ACP sintetasa es una sintetasa capaz de usar un ácido graso como un sustrato que tiene una longitud de cadena de 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23 o 24 átomos de carbono. En realizaciones de ejemplo, el microorganismo recombinante puede incluir una acil-ACP sintetasa heteróloga de un organismo de las especies Vibrio harveyi, Rhodotorula glutinis o Yarrowia lipolytica.
En algunas realizaciones, el microorganismo recombinante incluye una acil graso-ACP desaturasa. En algunas realizaciones, la acil graso-ACP desaturasa es una desaturasa soluble. En otras realizaciones, la acil graso-ACP desaturasa es de un organismo de las especies Pelargonium hortorum, Asclepias syriaca o Uncaria tomentosa.
En algunas realizaciones, el microorganismo recombinante incluye un complejo de ácido graso sintasa. En algunas realizaciones, la una o más moléculas de ácido nucleico que codifican el complejo de ácido graso sintasa son moléculas de ácido nucleico endógenas. En otras realizaciones, la una o más moléculas de ácido nucleico que codifican un complejo de ácido graso sintasa son moléculas de ácido nucleico exógenas.
En algunas realizaciones, el microorganismo recombinante descrito en el presente documento incluye una acil graso reductasa formadora de aldehído graso que cataliza la conversión de un acil graso C6-C24-ACP en el aldehído graso C6-C24 correspondiente. En realizaciones de ejemplo, la acil graso reductasa formadora de aldehído graso es de un organismo de las especies Pelargonium hortorum, Asclepias syriaca y Uncaria tomentosa. En algunas realizaciones, el microorganismo recombinante incluye una deshidrogenasa para convertir el aldehído graso insaturado en un alcohol graso insaturado correspondiente. En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico que codifica la deshidrogenasa es endógena para el microorganismo recombinante. En otras realizaciones, la molécula de ácido nucleico que codifica una deshidrogenasa es exógena para el microorganismo recombinante. En realizaciones de ejemplo, la molécula de ácido nucleico endógena o exógena que codifica una deshidrogenasa se aísla de organismos de las especies Saccharomyces cerevisiae, Escherichia coli, Yarrowia lipolytica o Candida tropicalis.
Como se ha descrito antes, en un tercer aspecto, la memoria descriptiva se refiere a un microorganismo recombinante capaz de producir un alcohol graso C6-C24 insaturado a partir de una fuente endógena o exógena de ácido graso C6-C24. Se muestra un ejemplo ilustrativo del segundo aspecto en la figura 3. Las líneas azules indican rutas bioquímicas endógenas para el hospedante, p. ej., rutas para convertir un n-alcano, alcohol graso o aldehído graso en un ácido graso, o la conversión de un ácido graso en acil graso-CoA, acetil-CoA o ácido dicarboxílico. La conversión del sustrato en ácido graso insaturado se puede llevar a cabo mediante enzimas endógenas o exógenas en un hospedante. Las líneas amarillas indican conversiones catalizadas por una molécula de ácido nucleico exógena que codifica una enzima. Por consiguiente, en algunas realizaciones, la conversión de un ácido graso saturado en un acil graso saturado-ACP puede ser catalizada por al menos una acil graso saturado-ACP sintetasa, en donde la acil graso-ACP sintetasa es codificada por una molécula de ácido nucleico exógena. Los tioésteres de acil graso saturado-ACP no nativos crean un sustrato adecuado para la desaturación y distinto de los CoA-tioésteres usados para la beta-oxidación o alargamiento de ácido graso. En realizaciones adicionales, la conversión del acil graso saturado-ACP en un acil graso mono o poliinsaturado-ACP puede ser catalizada por al menos una acil graso-ACP desaturasa, en donde la acil graso-ACP desaturasa es codificada por una molécula de ácido nucleico exógena. En otras realizaciones más, el acil graso mono o poliinsaturado-ACP se puede convertir en un ácido graso mono o poliinsaturado correspondiente por una acil graso-ACP tioesterasa. En una realización particular, se pueden usar acil graso-ACP tioesterasas solubles para liberar ácidos grasos libres para la reactivación a un tioéster CoA. Se pueden usar acil graso-ACP tioesterasas que incluyen Q41635, Q39473, P05521.2, AEM72519, AEM72520, AEM72521, AEM72523, AAC49784, CAB60830, EER87824, EER96252, ABN54268, AAO77182, CAH09236, ACL08376, y homólogos de las mismas. En una realización adicional, el acil graso mono o poliinsaturado-CoA se puede alargar en al menos 2 carbonos relativos usando una elongasa y una fuente de carbono, p. ej., malonil-ACP. En otras realizaciones más, la conversión del acil graso mono o poliinsaturado-CoA alargado en un mono- o polialcohol graso insaturado puede ser catalizada por una acil graso reductasa formadora de alcohol graso, en donde la acil graso reductasa formadora de alcohol graso es codificada por una molécula de ácido nucleico exógena. Las líneas discontinuas indican etapas posteriores de la descripción, tal como el uso de una acetil transferasa o metátesis, o posteriores transformaciones químicas para producir feromonas funcionalizadas. Las cruces rojas indican rutas eliminadas o reguladas por disminución nativas del hospedante, que aumentan el flujo hacia la ruta modificada.
Los alcoholes grasos producidos como se enseña en el presente documento se pueden convertir además para producir productos posteriores tales como feromonas de insectos, fragancias, sabores y productos intermedios poliméricos. Por lo tanto, en algunas realizaciones, el microorganismo recombinante comprende además al menos una molécula de ácido nucleico endógena o exógena que codifica una alcohol oxidasa o una alcohol deshidrogenasa, en donde la alcohol oxidasa o alcohol deshidrogenasa es capaz de catalizar la conversión de un alcohol graso C6-C24 en un aldehído graso C6-C24 correspondiente. En otras realizaciones, el microorganismo recombinante puede comprender además al menos una molécula de ácido nucleico endógena o exógena que codifica una acetil transferasa capaz de catalizar la conversión de un alcohol graso C6-C24 en un acetato graso C6-C24 correspondiente. En ciertas realizaciones, la acetil transferasa, o la secuencia de ácido nucleico que la codifica, se puede aislar de organismos de las especies Saccharomyces cerevisiae, Danaus plexippus, Heliotis virescens, Bombyx morí, Agrotis Ípsilon, Agrotis segetum, Euonymus alatus. En realizaciones de ejemplo, la acetil transferasa comprende una secuencia seleccionada de los n2 de acceso de GenBank AY242066, AY242065, AY242064, AY242063, AY242062, EHJ65205, ACX53812, NP_001182381, EHJ65977, EHJ68573, KJ579226, GU594061.
Microorganismo recombinante
La descripción proporciona microorganismos que se pueden modificar para expresar diversas enzimas exógenas.
En varios ejemplos descritos en el presente documento, el microorganismo recombinante es un microorganismo eucariota. En algunos ejemplos, el microorganismo es una levadura. En ejemplos ilustrativos, la levadura es un miembro de un género seleccionado del grupo que consiste en Yarrowia, Candida, Saccharomyces, Pichia, Hansenula, Kluyveromyces, Issatchenkia, Zygosaccharomyces, Debaryomyces, Schizosaccharomyces, Pachysolen, Cryptococcus, Trichosporon, Rhodotorula y Myxozyma.
Los autores de la presente invención han descubierto que levaduras oleaginosas, tales como Candida y Yarrowia, tienen una tolerancia sorprendentemente alta frente a sustratos y productos de alcohol graso C6-C24. Por consiguiente, en un ejemplo, el microorganismo recombinante de la presente descripción es una levadura oleaginosa. En realizaciones adicionales, la levadura oleaginosa es un miembro de un género seleccionado del grupo que consiste en Yarrowia, Candida, Rhodotorula, Rhodosporidium, Cryptococcus, Trichosporon y Lipomyces. En incluso otras realizaciones, la levadura oleaginosa es un miembro de una especie seleccionada de Candida tropicalis, Rhodosporidium toruloides, Lipomyces starkey, L. lipoferus, C. revkaufi, C. pulcherrima, C. utilis, Rhodotorula minuta, Trichosporon pullans, T. cutaneum, Cryptococcus curvatus, R. glutinis, y R. graminis. En realizaciones de la invención, el microorganismo recombinante es de la especie Yarrowia lipolytica.
En algunos ejemplos, el microorganismo recombinante es un microorganismo procariota. En ejemplos, el microorganismo procariota es un miembro de un género seleccionado del grupo que consiste en Escherichia, Clostridium, Zymomonas, Salmonella, Rhodococcus, Pseudomonas, Bacillus, Lactobacillus, Enterococcus, Alcaligenes, Klebsiella, Paenibacillus, Arthrobacter, Corynebacterium y Brevibacterium.
En algunas realizaciones, el microorganismo recombinante se usa para producir un alcohol, aldehído o acetato graso C6-C24 mono o poliinsaturado, descrito en el presente documento.
Por consiguiente, en otro aspecto, las presentes invenciones proporcionan un método para producir un alcohol, aldehído o acetato graso C6-C24 mono o poliinsaturado usando un microorganismo recombinante de la invención. En una realización, el método comprende cultivar el microorganismo recombinante en un medio de cultivo que contiene una materia prima que proporciona una fuente de carbono hasta que se produce el alcohol, aldehído o acetato graso C6-C24 mono o poliinsaturado. En una realización adicional, se recupera el alcohol, aldehído o acetato graso C6-C24 mono o poliinsaturado. La recuperación puede ser por métodos conocidos en la técnica, tales como destilación, separación de gases por separación basada en membrana, extracción con disolvente y adsorción en lecho expandido.
En algunas realizaciones, la materia prima comprende una fuente de carbono. En diversas realizaciones descritas en el presente documento, la fuente de carbono se puede seleccionar de azúcares, glicerol, alcoholes, ácidos orgánicos, alcanos, ácidos grasos, lignocelulosa, proteínas, dióxido de carbono y monóxido de carbono. En una realización adicional, el azúcar se selecciona del grupo que consiste en glucosa, fructosa y sacarosa.
Modificación de enzimas
Las enzimas en el microorganismo recombinante se pueden modificar para mejorar uno o más aspectos de la conversión del sustrato en producto. Los ejemplos no limitantes de enzimas que se pueden modificar adicionalmente para usar en los métodos de la descripción incluyen una desaturasa (p. ej., una acil graso-CoA desaturasa o acil graso-ACP desaturasa), una acil-ACP sintetasa, una ácido graso sintetasa, un complejo de ácido graso sintasa, una acetil transferasa, deshidrogenasa y una alcohol oxidasa, y combinaciones de las mismas. Estas enzimas se pueden modificar para mejorar la actividad catalítica, mejorar la selectividad, mejorar la estabilidad, mejorar la tolerancia frente a diversas condiciones de fermentación (temperatura, pH, etc.) o mejorar la tolerancia frente a diversos sustratos metabólicos, productos, subproductos, productos intermedios, etc.
Las enzimas desaturasas se pueden modificar para mejorar la actividad catalítica en la desaturación de un sustrato insaturado, para mejorar la selectividad de hidrocarburos, para mejorar la selectividad de un producto Z frente a un producto E, o un producto E frente a un producto Z. Por ejemplo, la Z9 acil graso desaturasa se puede modificar para mejorar el rendimiento en la conversión del sustrato en producto de un acil graso saturado-CoA en el correspondiente acil graso insaturado-CoA y, además o como alternativa, para mejorar la selectividad de la desaturación en la posición 9 para producir un Z-9 acil graso-CoA correspondiente. En otros ejemplos no limitantes, la acil-ACP sintetasa grasa se puede modificar para mejorar la actividad de ligado de la ACP; una enzima de complejo de ácido graso sintasa se puede modificar para mejorar la actividad catalítica de alargamiento de un sustrato de ácido graso; una acil grasoreductasa formadora de alcohol graso se puede modificar para mejorar la actividad catalítica en la reducción de un acil graso-CoA a un alcohol graso correspondiente; una acil graso-reductasa formadora de aldehído graso se puede modificar para mejorar la actividad catalítica en la reducción de un acil graso-ACP a un aldehído graso correspondiente; una deshidrogenasa se puede modificar para mejorar la actividad catalítica en la conversión de un acil graso-ACP en un alcohol graso correspondiente; una alcohol oxidasa se puede modificar para mejorar la actividad catalítica en la conversión de un alcohol graso en un aldehído graso correspondiente; y una acetil transferasa se puede modificar para mejorar la actividad catalítica en la conversión de un alcohol graso en un acetato graso correspondiente.
La expresión "actividad catalítica mejorada", como se usa en el presente documento con respecto a una actividad enzimática particular, se refiere a un nivel más alto de actividad enzimática que el medido con respecto a una enzima no modificada comparable, tal como una enzima desaturasa (p. ej. acil graso-CoA desaturasa o acil graso-ACP desaturasa), acil graso reductasa formadora de alcohol graso o aldehído, acil-ACP sintetasa, ácido graso sintetasa, complejo de ácido graso sintasa, acil transferasa, deshidrogenasa o alcohol oxidasa no modificadas. Por ejemplo, la sobreexpresión de una enzima específica puede conducir a un mayor nivel de actividad de esa enzima en las células. Se pueden introducir mutaciones en una enzima desaturasa (p. ej. acil graso-CoA desaturasa o acil graso-ACP desaturasa), una acil graso reductasa formadora de alcohol o aldehído graso, acil-ACP sintetasa, una ácido graso sintetasa, un complejo de ácido graso sintasa, una acil transferasa, una deshidrogenasa o una alcohol oxidasa que da como resultado enzimas modificadas con actividad catalítica mejorada. Los expertos en la técnica conocen métodos para aumentar la actividad enzimática. Dichas técnicas pueden incluir aumentar la expresión de la enzima aumentando el número de copias de plásmido y/o el uso de un promotor más fuerte y/o el uso de ribointerruptores activadores, introducción de mutaciones para aliviar la regulación negativa de la enzima, introducción de mutaciones específicas para aumentar la actividad y/o disminuir la Km para el sustrato, o por evolución dirigida. Véase, p. ej., Methods in Molecular Biology (vol. 231), ed. Arnold y Georgiou, Humana Press (2003).
Modificación metabólica - Sobreexpresión de enzimas y eliminación/regulación por disminución de genes para aumentar el flujo de la ruta
En diversas realizaciones descritas en el presente documento, las enzimas exógenas y endógenas en el microorganismo recombinante que participan en las rutas de biosíntesis descritas en el presente documento pueden ser sobreexpresadas. Los términos "sobreexpresado" o "sobreexpresión" se refieren a un nivel elevado (p. ej., nivel aberrante) de ARNm que codifica una proteína(s) y/o niveles elevados de proteína(s) en células en comparación con células no modificadas correspondientes similares que expresan niveles basales de ARNm o que tienen niveles basales de proteínas. En realizaciones particulares, los ARNm o proteína(s) pueden ser sobreexpresados al menos 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 8 veces, 10 veces, 12 veces, 15 veces o más en microorganismos modificados para presentar ARNm, proteína y/o actividad génica aumentada.
En algunas realizaciones, un microorganismo recombinante de la descripción se genera a partir de un hospedante que contiene la capacidad enzimática para sintetizar un sustrato de ácido graso. En esta realización específica, puede ser útil aumentar la síntesis o acumulación de un ácido graso para, por ejemplo, aumentar la cantidad de ácido graso disponible para una ruta de producción de alcohol graso modificada.
En algunas realizaciones, puede ser útil aumentar la expresión de enzimas endógenas o exógenas implicadas en la ruta de producción de alcohol, aldehído o acetato graso para aumentar el flujo desde el ácido graso al alcohol, aldehído o acetato graso, dando así como resultado una mayor síntesis o acumulación del alcohol, aldehído o acetato graso.
En algunas realizaciones, puede ser útil aumentar la expresión de enzimas endógenas o exógenas para aumentar los niveles intracelulares de una coenzima. En una realización, la coenzima es NADH. En otra realización, la coenzima es NADPH. En una realización, la expresión de proteínas en la ruta de las pentosas fosfato aumenta para aumentar los niveles intracelulares de NADPH. La ruta de las pentosas fosfato es una ruta catabólica importante para suministrar equivalentes de reducción y una ruta anabólica importante para las reacciones de biosíntesis. En una realización, una glucosa-6-fosfato deshidrogenasa que convierte glucosa-6-fosfato en 6-fosfo D-glucono-1,5-lactona es sobreexpresada. En algunas realizaciones, la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa es ZWF1 de levadura. En otra realización, la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa es ZWF1 (YNL241C) de Saccharomyces cerevisiae. En una realización, una glucosa-6-fosfato-1-deshidrogenasa que convierte D-glucopiranosa-6-fosfato en 6-fosfo D-glucono-1,5-lactona es sobreexpresada. En otra realización, la glucosa-6-fosfato-1-deshidrogenasa es zwf de bacteria. En ciertas realizaciones, la glucosa-6-fosfato-1-deshidrogenasa es zwf (NP_416366) de E. coli. En una realización, una 6-fosfogluconolactonasa que convierte 6-fosfo D-glucono-1,5-lactona en D-gluconato 6-fosfato es sobreexpresada. En algunas realizaciones, la 6-fosfogluconolactonasa es SOL3 de levadura. En ciertas realizaciones, la 6-fosfogluconolactonasa es SOL3 (NP_012033) de Saccharomyces cerevisiae. En algunas realizaciones, la 6-fosfogluconolactonasa es SOL4 de levadura. En ciertas realizaciones, la 6-fosfogluconolactonasa es SOL4 (NP_011764) de Saccharomyces cerevisiae. En algunas realizaciones, la 6-fosfogluconolactonasa es pgl de bacteria. En ciertas realizaciones, la 6-fosfogluconolactonasa es pgl (NP_415288) de E. coli. En una realización, una 6-fosfogluconato deshidrogenasa que convierte D-gluconato 6-fosfato en D-ribulosa 5-fosfato es sobreexpresada. En algunas realizaciones, la 6-fosfogluconato deshidrogenasa es GND1 de levadura. En ciertas realizaciones, la 6-fosfogluconato deshidrogenasa es GND1 (YHR183W) de Saccharomyces cerevisiae. En algunas realizaciones, la 6-fosfogluconato deshidrogenasa es GND2 de levadura. En ciertas realizaciones, la 6-fosfogluconato deshidrogenasa es GND2 (YGR256W) de Saccharomyces cerevisiae. En algunas realizaciones, la 6-fosfogluconato deshidrogenasa es gnd de bacteria. En ciertas realizaciones, la 6-fosfogluconato deshidrogenasa es gnd (NP_416533) de E. coli. En una realización, una transaldolasa que interconvierte D-gliceraldehído 3-fosfato y D-sedoheptulosa 7-fosfato en p-D-fructofuranosa 6-fosfato y D-eritrosa 4-fosfato es sobreexpresada. En algunas realizaciones, la transaldolasa es TAL1 de levadura. En ciertas realizaciones, la transaldolasa es TAL1 (NP_013458) de Saccharomyces cerevisiae. En algunas realizaciones, la transaldolasa es NQM1 de levadura. En ciertas realizaciones, la transaldolasa es NQM1 (NP_011557) de Saccharomyces cerevisiae. En algunas realizaciones, la transaldolasa es tal de bacteria. En ciertas realizaciones, la transaldolasa es talB (NP_414549) de E. coli. En ciertas realizaciones, la transaldolasa es talA (NP_416959) de E. coli. En una realización, una transcetolasa que interconvierte D-eritrosa 4-fosfato y D-xilulosa 5-fosfato en p-D-fructofuranosa 6-fosfato y D-gliceraldehído 3-fosfato y/o interconvierte D-sedoheptulosa 7-fosfato y D-gliceraldehído 3-fosfato en D-ribosa 5-fosfato y la D-xilulosa 5-fosfato es sobreexpresada. En algunas realizaciones, la transcetolasa es TKL1 de levadura. En ciertas realizaciones, la transcetolasa es TKL1 (NP_015399) de Saccharomyces cerevisiae. En algunas realizaciones, la transcetolasa es TKL2 de levadura. En algunas realizaciones, la transcetolasa es TKL2 (NP_009675) de Saccharomyces cerevisiae. En algunas realizaciones, la transcetolasa es tkt de bacteria. En ciertas realizaciones, la transcetolasa es tktA (YP_026188) de E. coli. En ciertas realizaciones, la transcetolasa es tktB (NP_416960) de E. coli. En una realización, una ribosa-5-fosfato cetol-isomerasa que interconvierte D-ribosa 5-fosfato y D-ribulosa 5-fosfato es sobreexpresada. En algunas realizaciones, la ribosa-5-fosfato cetol-isomerasa es RKI1 de levadura. En ciertas realizaciones, la ribosa-5-fosfato cetol-isomerasa es RKI1 (NP_014738) de Saccharomyces cerevisiae. En algunas realizaciones, la ribosa-5-fosfato isomerasa es rpi de bacteria. En ciertas realizaciones, la ribosa-5-fosfato isomerasa es rpiA (NP_417389) de E. coli. En ciertas realizaciones, la ribosa-5-fosfato isomerasa es rpiB (NP_418514) de E. coli. En una realización, una D-ribulosa-5-fosfato 3-epimerasa que interconvierte D-ribulosa 5-fosfato y D-xilulosa 5-fosfato es sobreexpresada. En algunas realizaciones, la D-ribulosa-5-fosfato 3-epimerasa es RPE1 de levadura. En ciertas realizaciones, la D-ribulosa-5-fosfato 3-epimerasa es RPE1 (NP_012414) de Saccharomyces cerevisiae. En algunas realizaciones, la D-ribulosa-5-fosfato 3-epimerasa es rpe de bacteria. En ciertas realizaciones, la D-ribulosa-5-fosfato 3-epimerasa es rpe (NP_417845) de E. coli.
En una realización, se aumenta la expresión de una isocitrato deshidrogenasa dependiente de NADP+ para aumentar los niveles intracelulares de una coenzima. En una realización, una isocitrato deshidrogenasa dependiente de NADP+ oxida D-treo-isocitrato a 2-oxoglutarato con generación concomitante de NADPH. En otra realización, una isocitrato deshidrogenasa dependiente de NADP+ oxida D-treo-isocitrato a 2-oxalosuccinato con generación concomitante de NADPH. En algunas realizaciones, la isocitrato deshidrogenasa dependiente de NADP+ es IDP de levadura. En ciertas realizaciones, la isocitrato deshidrogenasa dependiente de NADP+ es IDP2 (YLR174W) de Saccharomyces cerevisiae. En algunas realizaciones, la isocitrato deshidrogenasa dependiente de NADP+ es icd de bacteria. En ciertas realizaciones, la isocitrato deshidrogenasa dependiente de NADP+ es icd (NP_415654) de E. coli.
En algunas realizaciones, se aumenta la expresión de una enzima málica que descarboxila malato en piruvato con generación concomitante de NADH o NADPH para aumentar los niveles intracelulares de una coenzima. En una realización, la enzima málica es dependiente de NAD+. En otra realización, la enzima málica es dependiente de NADP+. En una realización, la enzima málica es una malato deshidrogenasa dependiente de NAD+ de bacteria. En algunas realizaciones, la malato deshidrogenasa dependiente de NAD+ es maeA (NP_415996) de E. coli. En algunas realizaciones, la malato deshidrogenasa dependiente de NAD+ es maeE (CAQ68119) de Lactobacillus casei. En otra realización, la enzima málica es una malato deshidrogenasa mitocondrial dependiente de NAD+ de levadura. En algunas realizaciones, la malato deshidrogenasa dependiente de NAD+ es MAE1 (YKL029C) de S. cerevisiae. En otra realización, la enzima málica es una malato deshidrogenasa mitocondrial dependiente de NAD+ de un nematodo parasitario. En algunas realizaciones, la malato deshidrogenasa dependiente de NAD+ es M81055 de Ascaris suum. En una realización, la enzima málica es una malato deshidrogenasa dependiente de NADP+ de bacteria. En algunas realizaciones, la malato deshidrogenasa dependiente de NADP+ es maeB (NP_416958) de E. coli. En una realización, la enzima málica es una malato deshidrogenasa dependiente de NADP+ del maíz. En algunas realizaciones, la malato deshidrogenasa dependiente de NADP+ es me1 de Zea mays.
En algunas realizaciones, se aumenta la expresión de una aldehído deshidrogenasa que oxida un aldehído a un ácido carboxílico con generación concomitante de NADH o NADPH para aumentar los niveles intracelulares de una coenzima. En una realización, la aldehído deshidrogenasa es dependiente de NAD+. En otra realización, la aldehído deshidrogenasa es dependiente de NADP+. En una realización, la aldehído deshidrogenasa es una aldehído deshidrogenasa dependiente de NAD+ de bacteria. En algunas realizaciones, la aldehído deshidrogenasa dependiente de NAD+ es aldA (NP_415933) de E. coli. En otra realización, la aldehído deshidrogenasa es una aldehído deshidrogenasa dependiente de NADP+ citosólico de levadura. En algunas realizaciones, la aldehído deshidrogenasa dependiente de NADP+ es ALD6 (YPL061W) de S. cerevisiae. En otra realización, la aldehído deshidrogenasa es una aldehído deshidrogenasa dependiente de NADP+ citosólica de bacteria. En algunas realizaciones, la aldehído deshidrogenasa dependiente de NADP+ es aldB (NP_418045) de E. coli.
En una realización, la sobreexpresión de una enzima para aumentar los niveles intracelulares de una coenzima comprende el acoplamiento con complementación de un cosustrato y la sobreexpresión de la enzima. En una realización, la sobreexpresión de una enzima acoplada con la complementación de un cosustrato de la enzima aumenta el flujo hacia la ruta bioquímica. En una realización, una alcohol deshidrogenasa dependiente de NAD+ o NADP+ se expresa con un cosustrato. En ciertas realizaciones, una alcohol deshidrogenasa se expresa con un cosustrato de isopropanol. En una realización, una glucosa deshidrogenasa dependiente de NAD+ o NADP+ se expresa con un cosustrato. En ciertas realizaciones, una glucosa deshidrogenasa se expresa con un cosustrato de glucosa.
En una realización, se aumenta la expresión de una transhidrogenasa para interconvertir NADH y NADPH. En algunas realizaciones, la transhidrogenasa es una piridina nucleótido transhidrogenasa. En algunas realizaciones, la piridina nucleótido transhidrogenasa es de bacteria. En ciertas realizaciones, la piridina nucleótido transhidrogenasa es pntAB (subunidad beta: NP_416119; subunidad alfa: NP_416120) de E. coli. En algunas realizaciones, la piridina nucleótido transhidrogenasa es de ser humano. En ciertas realizaciones, la piridina nucleótido transhidrogenasa es NNT (NP_036475) de Homo sapiens. En ciertas realizaciones, la piridina nucleótido transhidrogenasa es de Solanum tuberosum. En ciertas realizaciones, la piridina nucleótido transhidrogenasa es de Spinacea oleracea.
En algunas realizaciones, puede ser útil aumentar la expresión de proteínas endógenas o exógenas para inducir la proliferación de la membrana del retículo endoplásmico (ER). En algunas realizaciones, la inducción de la proliferación de la membrana del retículo endoplásmico puede mejorar la producción de alcohol, aldehídos o acetatos grasos. En una realización, se aumenta la expresión de la HMG-CoA reductasa (hidroximetilglutaril-CoA reductasa) inactivada que contiene uno o más bucles de cara al ER. En ciertas realizaciones, el uno o más bucles es entre los dominios transmembrana 6 y 7 de una HMG-CoA reductasa inactivada. En algunas realizaciones, la HMG-CoA reductasa inactivada comprende una proteína o quimera inactivada que codifica los primeros 500 aminoácidos o una subsecuencia de los primeros 500 aminoácidos de YALI0E04807p de Yarrowia lipolytica. En otras realizaciones, la HMG-CoA reductasa inactivada comprende una proteína o quimera inactivada que codifica los primeros 522 aminoácidos o una subsecuencia de los primeros 522 aminoácidos de HMG1 de Saccharomyces cerevisiae (NP_013636.1). En otras realizaciones, la HMG-CoA reductasa inactivada comprende una proteína o quimera inactivada que codifica los primeros 522 aminoácidos o una subsecuencia de los primeros 522 aminoácidos de HMG2 de Saccharomyces cerevisiae (NP_013555.1). En algunas realizaciones, se aumenta la expresión de una o más proteínas reguladoras para aumentar la producción de alcoholes, aldehídos o acetatos grasos. En ciertas realizaciones, la proteína reguladora comprende el factor de transcripción HAC1 de Saccharomyces cerevisiae (NP_116622.1). En ciertas realizaciones, la proteína reguladora comprende el factor de transcripción HAC1 de Yarrowia lipolytica (YALI0B12716p).
La mayor síntesis o acumulación se puede lograr, por ejemplo, por sobreexpresión de ácidos nucleicos que codifican una o más de las enzimas de la ruta de un alcohol graso descritas antes. La sobreexpresión de una enzima o enzimas de la ruta de alcoholes grasos puede ocurrir, por ejemplo, por una mayor expresión de un gen o genes endógenos, o por la expresión, o mayor expresión, de un gen o genes exógenos. Por lo tanto, los organismos de origen natural se pueden modificar fácilmente para generar microorganismos productores de alcohol graso no naturales mediante la sobreexpresión de una o más moléculas de ácido nucleico que codifican una enzima de la ruta biosintética del alcohol graso. Además, se puede generar un organismo de origen no natural por mutagénesis de un gen endógeno que da como resultado un aumento de la actividad de una enzima en las rutas biosintéticas de los alcoholes grasos.
Equipado con la presente descripción, el experto en la técnica podrá construir fácilmente los microorganismos recombinantes descritos en el presente documento, ya que los microorganismos recombinantes de la descripción se pueden construir usando métodos bien conocidos en la técnica como se ha ilustrado antes para expresar de forma exógena al menos un ácido nucleico que codifica una enzima de la ruta de los alcoholes grasos en cantidades suficientes para producir un alcohol graso.
Los métodos para construir y ensayar los niveles de expresión de un hospedante productor de alcohol graso de origen no natural se pueden llevar a cabo, por ejemplo, mediante métodos recombinantes y de detección bien conocidos en la técnica. Dichos métodos se pueden encontrar descritos, por ejemplo, en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Tercera Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York (2001); Ausubo et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Md. (1999).
Se puede usar una variedad de mecanismos conocidos en la técnica para expresar, o sobreexpresar, genes exógenos o endógenos. Por ejemplo, se puede construir un vector o vectores de expresión para albergar uno o más ácidos nucleicos que codifican enzimas de la ruta biosintética de alcoholes grasos como se ilustra en el presente documento operativamente unidos a secuencias funcionales de control de la expresión en el organismo hospedante. Los vectores de expresión aplicables para usar en los organismos hospedantes microbianos de la invención incluyen, por ejemplo, plásmidos, vectores fagos, vectores virales, episomas y cromosomas artificiales, incluyendo vectores y secuencias de selección o marcadores operables para la integración estable en un cromosoma del hospedante. También se pueden incluir genes de marcadores seleccionables que, por ejemplo, proporcionan resistencia a antibióticos o toxinas, complementan deficiencias auxotróficas o suministran nutrientes críticos que no se encuentran en el medio de cultivo. Las secuencias de control de la expresión pueden incluir promotores constitutivos e inducibles, potenciadores de la transcripción, terminadores de la transcripción y similares que son bien conocidos en la técnica. Cuando se van a coexpresar dos o más ácidos nucleicos codificantes exógenos, se pueden insertar ambos ácidos nucleicos, por ejemplo, en un solo vector de expresión o en vectores de expresión separados. Para la expresión de un solo vector, los ácidos nucleicos codificantes se pueden unir operativamente a una secuencia de control de expresión común o unir a diferentes secuencias de control de expresión, tales como un promotor inducible y un promotor constitutivo. La transformación de secuencias de ácido nucleico exógenas implicadas en una ruta metabólica o sintética se puede confirmar usando métodos bien conocidos en la técnica.
Las secuencias de control de la expresión son conocidas en la técnica e incluyen, por ejemplo, promotores, potenciadores, señales de poliadenilación, terminadores de la transcripción, sitios internos de entrada al ribosoma (IRES) y similares, que proporcionan la expresión de la secuencia de polinucleótidos en una célula hospedante. Las secuencias de control de la expresión interaccionan específicamente con proteínas celulares involucradas en la transcripción (Maniatis et al., Science, 236:1237-1245 (1987)). Se describen ejemplos de secuencias de control de la expresión en, por ejemplo, Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Vol. 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990).
En varias realizaciones, una secuencia de control de la expresión puede estar operativamente unida a una secuencia de polinucleótido. Por "operativamente unida" se entiende que una secuencia de polinucleótido y una secuencia(s) de control de la expresión están conectadas de tal manera que permiten la expresión génica cuando las moléculas adecuadas (p. ej., proteínas activadoras de la transcripción) se unen a la o las secuencias de control de la expresión. Los promotores operativamente unidos se localizan en la dirección 5' de la secuencia de polinucleótido seleccionada en términos de la dirección de transcripción y traducción. Los potenciadores operativamente unidos se pueden localizar en la dirección 5', dentro o dirección 3' del polinucleótido seleccionado.
En algunas realizaciones, el microorganismo recombinante se modifica para eliminar, alterar, mutar y/o reducir la actividad de una o más enzimas endógenas que catalizan una reacción en una ruta que compite con la ruta de biosíntesis para la producción de un alcohol, aldehído o acetato graso C6-C24 mono o poliinsaturado.
En algunas realizaciones, el microorganismo recombinante se modifica para eliminar, alterar, mutar y/o reducir la actividad de una o más enzimas endógenas que catalizan la conversión de un ácido graso en un w-hidroxiácido graso. En algunas de dichas realizaciones, las enzimas que catalizan la conversión de un ácido graso en un w-hidroxiácido graso se seleccionan del grupo que consiste en XP_504406, XP_504857, XP_504311, XP_500855, XP_500856, XP_500402, XP_500097, XP_501748, XP_500560, XP_501148, XP_501667, XP_500273, BAA02041, CAA39366, CAA39367, BAA02210, BAA02211, BAA02212, BAA02213, BAA02214, AAO73952, AAO73953, AAO73954, AAO73955, AAO73956, AAO73958, AAO73959, AAO73960, AAO73961, AAO73957, XP_002546278, BAM49649, AAB80867, AAB17462, ADL27534, AAU24352, AAA87602, CAA34612, ABM17701, AAA25760, CAB51047, AAC82967, WP_011027348, u homólogos de las mismas.
En otras realizaciones, el microorganismo recombinante se modifica para eliminar, alterar, mutar y/o reducir la actividad de una o más enzimas endógenas que catalizan la conversión de un acil graso-CoA en a,p-enoil-CoA. En algunas de dichas realizaciones, las enzimas que catalizan la conversión de un acil graso-CoA en a,p-enoil-CoA se seleccionan del grupo que consiste en CAA04659, CAA04660, CAA04661, CAA04662, CAA04663, CAG79214, AAA34322, AAA34361, AAA34363, CAA29901, BAA04761, AAA34891, AAB08643, CAB15271, BAN55749, CAC44516, ADK16968, AEI37634, WP_000973047, WP_025433422, WP_035184107, WP_026484842, CEL80920, WP_026818657, WP_005293707, WP_005883960, u homólogos de las mismas.
En algunas realizaciones, el microorganismo recombinante se modifica para eliminar, alterar, mutar y/o reducir la actividad de una o más proteínas implicadas en la biogénesis del peroxisoma. En dichas realizaciones, la una o más proteínas implicadas en la biogénesis del peroxisoma se seleccionan del grupo que consiste en XP_505754, XP_501986, XP_501311, XP_504845, XP_503326, XP_504029, XP_002549868, XP_002547156, XP_002545227, XP_002547350, XP_002546990, EIW11539, EIW08094, EIW11472, EIW09743, EIW0828, u homólogos de las mismas.
En algunas realizaciones, el microorganismo recombinante se manipula para eliminar, alterar, mutar y/o reducir la actividad de una o más enzimas endógenas que catalizan una reacción en una ruta que compite con la ruta biosintética para uno o más acil grasos insaturados-CoA intermedios. En una realización, la una o más enzimas endógenas comprenden una o más diacilglicerol aciltransferasas. En el contexto de un microorganismo levadura recombinante, el microorganismo levadura recombinante se modifica para eliminar, alterar, mutar y/o reducir la actividad de una o más diacilglicerol aciltransferasas seleccionadas del grupo que consiste en YALI0E32769g, YALI0D07986g y CTRG_06209, u homólogos de las mismas. En otra realización, la una o más enzimas endógenas comprenden una o más glicerolfosfolípido aciltransferasas. En el contexto de un microorganismo levadura recombinante, el microorganismo levadura recombinante se modifica para eliminar, alterar, mutar y/o reducir la actividad de una o más glicerolfosfolípido aciltransferasas seleccionadas del grupo que consiste en YALI0E16797g y CTG_04390, u homólogos de las mismas. En otra realización, la una o más enzimas endógenas comprenden una o más acil-CoA/esterol aciltransferasas. En el contexto de un microorganismo levadura recombinante, el microorganismo levadura recombinante se modifica para eliminar, alterar, mutar y/o reducir la actividad de una o más acil-CoA/esterol aciltransferasas seleccionadas del grupo que consiste en YALI0F06578g, CTRG_01764 y CTRG_01765, u homólogos de las mismas.
En otra realización, el microorganismo recombinante se manipula para eliminar, alterar, mutar y/o reducir la actividad de una o más enzimas endógenas que catalizan una reacción en una ruta que oxida aldehídos grasos intermedios. En una realización, la una o más enzimas endógenas comprenden una o más aldehído graso deshidrogenasas. En el contexto de un microorganismo levadura recombinante, el microorganismo levadura recombinante se modifica para eliminar, alterar, mutar y/o reducir la actividad de una o más aldehído graso deshidrogenasas seleccionadas del grupo que consiste en YALI0A17875g, YALI0E15400g, YALI0B01298g, YALI0F23793g, CTRG_05010 y CTRG_04471, u homólogos de las mismas.
En otra realización, el microorganismo recombinante se modifica para eliminar, alterar, mutar y/o reducir la actividad de una o más enzimas endógenas que catalizan una reacción en una ruta que consume productos de acetato graso. En una realización, la una o más enzimas endógenas comprenden una o más esterol esterasas. En el contexto de un microorganismo levadura recombinante, el microorganismo levadura recombinante se modifica para eliminar, alterar, mutar y/o reducir la actividad de una o más esterol esterasas seleccionadas del grupo que consiste en YALI0E32035g, YALI0E00528g, CTRG_01138, CTRG_01683 y CTRG_04630, u homólogos de las mismas. En otra realización, la una o más enzimas endógenas comprenden una o más triacilglicerol lipasas. En el contexto de un microorganismo levadura recombinante, el microorganismo levadura recombinante se modifica para eliminar, alterar, mutar y/o reducir la actividad de una o más triacilglicerol lipasas seleccionadas del grupo que consiste en YALI0D17534g, YALI0F10010g, CTRG_00057 y CTRG_06185, u homólogos de las mismas. En otra realización, la una o más enzimas endógenas comprenden una o más monoacilglicerol lipasas. En el contexto de un microorganismo levadura recombinante, el microorganismo levadura recombinante se modifica para eliminar, alterar, mutar y/o reducir la actividad de una o más monoacilglicerol lipasas seleccionadas del grupo que consiste en YALI0C14520g, CTRG_03360 y CTRG_05049, u homólogos de las mismas. En otra realización, la una o más enzimas endógenas comprenden una o más lipasas extracelulares. En el contexto de un microorganismo levadura recombinante, el microorganismo levadura recombinante se modifica para eliminar, alterar, mutar y/o reducir la actividad de una o más lipasas extracelulares seleccionadas del grupo que consiste en YALI0A20350g, YALI0D19184g, YALI0B09361g, CTRG_05930, CTRG_04188, CTRG_02799, Ct RG_03052 y CTRG_03885, u homólogos de las mismas.
En otra realización, el microorganismo recombinante se modifica para eliminar, alterar, mutar y/o reducir la actividad de una o más enzimas reductasas o desaturasas endógenas que interfieren con el alcohol, aldehído o acetato graso C6-C24 insaturado, es decir, catalizan la conversión de un sustrato o producto de la ruta en un subproducto no deseado.
Conversión química de producto de la síntesis en microorganismo
La presente descripción describe conversiones químicas que se pueden usar para convertir un producto sintetizado por un microorganismo recombinante en un producto corriente abajo.
En algunas realizaciones, un alcohol, aldehído, acetato o ácido carboxílico graso insaturado producido por un microorganismo puede sufrir una conversión química posterior para producir una feromona, fragancia, sabor, polímero o polímero intermedio. Los ejemplos no limitantes de transformaciones químicas incluyen esterificación, metátesis y polimerización.
Los ácidos carboxílicos grasos insaturados se pueden esterificar por métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la esterificación de Fischer se puede usar para convertir un ácido carboxílico graso en un éster graso correspondiente. Véase, p. ej., Komura, K. et al., Synthesis 2008. 3407-3410.
El alargamiento de la cadena de carbonos se puede llevar a cabo por métodos conocidos para convertir un alcohol graso insaturado en un derivado alargado del mismo. Se puede llevar a cabo metástasis de olefinas con catalizador para aumentar el número de carbonos en la cadena de carbono grasa e impartir estereoquímica Z o E al producto insaturado correspondiente.
En general, se puede usar cualquier catalizador de metátesis estable en las condiciones de reacción y no reactivo con grupos funcionales en el sustrato graso (p. ej., alcohol, éster, ácido carboxílico, aldehído o acetato) con la presente descripción. Dichos catalizadores son, por ejemplo, los descritos por Grubbs (Grubbs, R.H., "Synthesis of large and small molecules using olefin metathesis catalysts." PMSE Prepr, 2012). Dependiendo del isómero de la olefina deseado, como catalizador de metátesis selectiva de cis se puede usar, por ejemplo, uno de los descritos por Shahane et al. (Shahane, S., et al. ChemCatChem, 2013. 5(12): p. 3436-3459). Se muestran a continuación catalizadores específicos 1-5 que presentan selectividad en cis (Esquema 1) y se han descrito previamente (Khan, R.K., et al. J. Am. Chem. Soc, 2013. 135(28): p. 10258-61; Hartung, J. et al. J. Am. Chem. Soc, 2013. 135(28): p. 10183-5.; Rosebrugh, L.E., et al. J. Am. Chem. Soc., 2013. 135(4): p. 1276-9.; Marx, V.M., et al. J. Am. Chem. Soc., 2013. 135(1): p. 94-7.; Herbert, M.B., et al. Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 2013. 52(1): p. 310-4; Keitz, B.K., et al. J. Am. Chem. Soc., 2012. 134(4): p. 2040-3.; Keitz, B.K., et al. J. Am. Chem. Soc., 2012. 134(1): p. 693-9.; Endo, K. et al. J. Am. Chem. Soc., 2011. 133(22): p. 8525-7).
Figure imgf000052_0001
Se describen catalizadores selectivos de Z adicionales en Cannon y Grubbs 2013; Bronner et al. 2014; Hartung et al.
2014; Pribisko et al. 2014; Quigley y Grubbs 2014. Debido a su excelente estabilidad y tolerancia a grupos funcionales, en algunas realizaciones los catalizadores de metátesis incluyen, pero no se limitan a complejos neutros de carbeno y metal rutenio u osmio que poseen centros metálicos que están formalmente en el estado de oxidación 2, tienen un recuento de electrones de 16, están pentacoordinados y tienen la fórmula general LL'AA'M=CRbRc o LL'AA'M=(C=)nCRbRc (Pederson y Grubbs 2002); en donde
M es rutenio u osmio;
L y L' son cada uno independientemente cualquier ligando donador de electrones neutro y seleccionado de fosfina, fosfina sulfonada, fosfito, fosfinito, fosfonito, arsina, estibnita, éter, amina, amida, imina, sulfóxido, carboxilo, nitrosilo, piridina, tioéter, o carbenos heterocíclicos; y
A y A' son ligandos aniónicos seleccionados independientemente de halógeno, hidrógeno, alquilo C1-C20, arilo, alcóxido C1-C20, arilóxido, alcoxicarbonilo C2-C20, arilcarboxilato, carboxilato C1-C20, arilsulfonilo, alquilsulfonilo C1-C20, alquilsulfinilo C1-C20 ; estando cada ligando opcionalmente sustituido con alquilo C1-C5 , halógeno, alcoxi C1-C5 ; o con un grupo fenilo que está opcionalmente sustituido con halógeno, alquilo C1-C5 , o alcoxi C1-C5 ; y A y A' juntos pueden comprender opcionalmente un ligando bidentado; y
Rb y Rc se seleccionan independientemente de hidrógeno, alquilo C1-C20, arilo, carboxilato C1-C20, alcoxi C1-C20, ariloxi, alcoxicarbonilo C1-C20, alquiltio C1-C20, alquilsulfonilo C1-C20 y alquilsulfinilo C1-C20, cada uno de Rb y Rc opcionalmente sustituido con alquilo C1-C5 , halógeno, alcoxi C1-C5 o con un grupo fenilo que está opcionalmente sustituido con halógeno, alquilo C1-C5 , o alcoxi C1-C5.
También se pueden usar otros catalizadores de metátesis tales como "catalizadores bien definidos". Dichos catalizadores incluyen, pero no se limitan a catalizadores de metátesis de molibdeno de Schrock, bis(hexafluoro-tbutóxido) de 2,6-diisopropilfenilimido-neofilidenmolibdeno (VI), descrito por Grubbs et al. (Tetrahedron 1998, 54: 4413 4450) y catalizador de metátesis de tungsteno de Basset descrito por Couturier, J. L. et al. (Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1992, 31: 628).
Lo catalizadores útiles en los métodos de la descripción también incluyen los descritos por Peryshkov, et al. J. Am. Chem. Soc. 2011,133: 20754-20757; Wang, et al. Angewandte Chemie, 2013, 52: 1939-1943; Yu, et al. J. Am. Chem. Soc., 2012, 134: 2788-2799; Halford. Chem. Eng. News, 2011, 89 (45): 11; Yu, et al. Nature, 2011,479: 88-93; Lee. Nature, 2011,471: 452-453; Meek, et al. Nature, 2011: 471,461 -466; Flook, et al. J. Am. Chem. Soc.2011, 133: 1784­ 1786; Zhao, et al. Org Lett., 2011, 13(4): 784-787; Ondi, et al. "High activity, stabilized formulations, efficient synthesis and industrial use of Mo- and W-based metathesis catalysts" XiMo Technology Updates, 2015: http-//www.ximoinc.com/fileslximo/uploads/ download/Summary_3.11.15.pdf; Schrock, et al. Macromolecules, 2010: 43, 7515-7522; Peryshkov, et al. Organometallics 2013: 32, 5256-5259; Gerber, et al. Organometallics 2013: 32, 5573-5580; Marinescu, et al. Organometallics 2012: 31, 6336-6343; Wang, et al. Angew. Chem. Int. Ed. 2013: 52, 1939 - 1943; Wang, et al. Chem. Eur. J. 2013: 19, 2726-2740; y Townsend et al. J. Am. Chem. Soc. 2012: 134, 11334-11337.
Los catalizadores útiles en los métodos de la descripción también incluyen los descritos en la publicación internacional n° WO 2014/155185; publicación internacional n° WO 2014/172534; publicación de solicitud de patente de EE.UU. n° 2014/0330018; publicación internacional n° WO 2015/003815; y publicación internacional n° WO 2015/003814.
Los catalizadores útiles en los métodos de la descripción también incluyen los descritos en la patente de EE.UU. n° 4.231.947; patente de EE.UU. n° 4.245.131; patente de EE.UU. n° 4.427.595; patente de EE.UU. n° 4.681.956; patente de EE.UU. n° 4.727.215; publicación internacional n° WO 1991/009825; patente de EE.UU. n° 5.0877.10; patente de EE.UU. n° 5.142.073; patente de EE.UU. n° 5.146.033; publicación internacional n° WO 1992/019631; patente de EE.UU. n° 6.121.473; patente de EE.UU. n° 6.346.652; patente de EE.UU. n° 8.987.531; publicación de solicitud de patente de EE.UU. n° 2008/0119678; publicación internacional n° WO 2008/066754; publicación internacional n° WO 2009/094201; publicación de solicitud de patente de EE.UU. n° 2011/0015430; publicación de solicitud de patente de EE.UU. n° 2011/0065915; publicación de solicitud de patente de EE.UU. n° 2011/0077421; publicación internacional n° WO 2011/040963; publicación internacional n° WO 2011/097642; publicación de solicitud de patente de EE.UU. n° 2011/0237815; publicación de solicitud de patente de EE.UU. n° 2012/0302710; publicación internacional n° WO 2012/167171; publicación de solicitud de patente de EE.UU. n° 2012/0323000; publicación de solicitud de patente de EE.UU. n° 2013/0116434; publicación internacional n° WO 2013/070725; publicación de solicitud de patente de EE.UU. n° 2013/0274482; publicación de solicitud de patente de EE.UU. n° 2013/0281706; publicación internacional n° WO 2014/139679; publicación internacional n° WO 2014/169014; publicación de solicitud de patente de EE.UU. n° 2014/0330018; y publicación de solicitud de patente de EE.UU. n° 2014/0378637.
Los catalizadores útiles en los métodos de la descripción también incluyen los descritos en la publicación internacional n° WO 2007/075427; publicación de solicitud de patente de EE.UU. n° 2007/0282148; publicación internacional n° WO 2009/126831; publicación internacional n° WO 2011/069134; publicación de solicitud de patente de EE.UU. n° 2012/0123133; publicación de solicitud de patente de EE.UU. n° 2013/0261312; publicación de solicitud de patente de EE.UU. n° 2013/0296511; publicación internacional n° WO 2014/134333; y publicación de solicitud de patente de EE.UU. n° 2015/0018557.
Los catalizadores útiles en los métodos de la descripción también incluyen los descritos en la siguiente tabla:
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Figure imgf000054_0001
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Figure imgf000056_0001
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Los catalizadores útiles en los métodos de la descripción también incluyen los descritos en la publicación de solicitud de patente de EE.UU. n° 2008/0009598; publicación de solicitud de patente de EE.UU. n° 2008/0207911; publicación de solicitud de patente de EE.UU. n° 2008/0275247; publicación de solicitud de patente de EE.UU. n° 2011/0040099; publicación de solicitud de patente de EE.UU. n° 2011/0282068; y publicación de solicitud de patente de EE.UU. n° 2015/0038723.
Los catalizadores útiles en los métodos de la descripción incluyen los descritos en la publicación internacional n° WO 2007/140954; publicación de solicitud de patente de EE.UU. n° 2008/0221345; publicación internacional n° WO 2010/037550; publicación de solicitud de patente de EE.UU. n° 2010/0087644; publicación de solicitud de patente de EE.UU. n° 2010/0113795; publicación de solicitud de patente de EE.UU. n° 2010/0174068; publicación internacional n° WO 2011/091980; publicación internacional n° WO 2012/168183; publicación de solicitud de patente de EE.UU. n° 2013/0079515; publicación de solicitud de patente de EE.UU. n° 2013/0144060; publicación de solicitud de patente de EE.UU. n° 2013/0211096; publicación internacional n° WO 2013/135776; publicación internacional n° WO 2014/001291; publicación internacional n° WO 2014/067767; publicación de solicitud de patente de EE.UU. n° 2014/0171607; y publicación de solicitud de patente de EE.UU. n° 2015/0045558.
El catalizador se proporciona típicamente en la mezcla de reacción en una cantidad subestequiométrica (p. ej., cantidad catalítica). En determinadas realizaciones, esa cantidad está en el intervalo de aproximadamente 0,001 a aproximadamente 50% en moles con respecto al reactivo limitante de la reacción química, dependiendo de qué reactivo está en exceso estequiométrico. En algunas realizaciones, el catalizador está presente en menos de o igual a aproximadamente 40% en moles con respecto al reactivo limitante. En algunas realizaciones, el catalizador está presente en menos de o igual a aproximadamente 30% en moles con respecto al reactivo limitante. En algunas realizaciones, el catalizador está presente en menos de aproximadamente 20% en moles, menos de aproximadamente 10% en moles, menos de aproximadamente 5% en moles, menos de aproximadamente 2,5% en moles, menos de aproximadamente 1% en moles, menos de aproximadamente 0,5% en moles, menos de aproximadamente 0,1% en moles, menos de aproximadamente 0,015% en moles, menos de aproximadamente 0,01% en moles, menos de aproximadamente 0,0015% en moles, o menos, con respecto al reactivo limitante. En algunas realizaciones, el catalizador está presente en el intervalo de aproximadamente 2,5% en moles a aproximadamente 5% en moles con respecto al reactivo limitante. En algunas realizaciones, la mezcla de reacción contiene aproximadamente 0,5% en moles de catalizador. En el caso donde la fórmula molecular del complejo de catalizador incluya más de un metal, la cantidad del complejo de catalizador usada en la reacción se puede ajustar en consecuencia.
En algunos casos, los métodos descritos en el presente documento se pueden llevar a cabo en ausencia de disolvente (p. ej., solo). En algunos casos, los métodos pueden incluir el uso de uno o más disolventes. Los ejemplos de disolventes que pueden ser adecuados para usar en la descripción incluyen, pero no se limitan a benceno, p-cresol, tolueno, xileno, éter dietílico, glicol, éter dietílico, éter de petróleo, hexano, ciclohexano, pentano, cloruro de metileno, cloroformo, tetracloruro de carbono, dioxano, tetrahidrofurano (THF), dimetilsulfóxido, dimetilformamida, triamida hexametilfosfórica, acetato de etilo, piridina, trietilamina, picolina y similares, así como mezclas de los mismos. En algunas realizaciones, el disolvente se selecciona de benceno, tolueno, pentano, cloruro de metileno y THF. En determinadas formas de realización, el disolvente es benceno.
En algunas realizaciones, el método se lleva a cabo a presión reducida. Esto puede ser ventajoso en los casos en los que se pueda producir un subproducto volátil, tal como etileno, durante el curso de la reacción de metátesis. Por ejemplo, la eliminación del subproducto de etileno del recipiente de reacción puede cambiar ventajosamente el equilibrio de la reacción de metátesis hacia la formación del producto deseado. Las siguientes presiones se presentan 101325
en torr. Un torres igual a ^60 pascales. En algunas realizaciones, el método se lleva a cabo a una presión de aproximadamente menos de 760 torr (101325 Pa). En algunas realizaciones, el método se lleva a cabo a una presión de aproximadamente menos de 700 torr. En algunas realizaciones, el método se lleva a cabo a una presión de aproximadamente menos de 650 torr. En algunas realizaciones, el método se lleva a cabo a una presión de aproximadamente menos de 600 torr. En algunas realizaciones, el método se lleva a cabo a una presión de aproximadamente menos de 550 torr. En algunas realizaciones, el método se lleva a cabo a una presión de aproximadamente menos de 500 torr. En algunas realizaciones, el método se lleva a cabo a una presión de aproximadamente menos de 450 torr. En algunas realizaciones, el método se lleva a cabo a una presión de aproximadamente menos de 400 torr. En algunas realizaciones, el método se lleva a cabo a una presión de aproximadamente menos de 350 torr. En algunas realizaciones, el método se lleva a cabo a una presión de aproximadamente menos de 300 torr. En algunas realizaciones, el método se lleva a cabo a una presión de aproximadamente menos de 250 torr. En algunas realizaciones, el método se lleva a cabo a una presión de aproximadamente menos de 200 torr. En algunas realizaciones, el método se lleva a cabo a una presión de aproximadamente menos de 150 torr. En algunas realizaciones, el método se lleva a cabo a una presión de aproximadamente menos de 100 torr. En algunas realizaciones, el método se lleva a cabo a una presión de aproximadamente menos de 90 torr. En algunas realizaciones, el método se lleva a cabo a una presión de aproximadamente menos de 80 torr. En algunas realizaciones, el método se lleva a cabo a una presión de aproximadamente menos de 70 torr. En algunas realizaciones, el método se lleva a cabo a una presión de aproximadamente menos de 60 torr. En algunas realizaciones, el método se lleva a cabo a una presión de aproximadamente menos de 50 torr. En algunas realizaciones, el método se lleva a cabo a una presión de aproximadamente menos de 40 torr. En algunas realizaciones, el método se lleva a cabo a una presión de aproximadamente menos de 30 torr. En algunas realizaciones, el método se lleva a cabo a una presión de aproximadamente menos de 20 torr. En algunas realizaciones, el método se lleva a cabo a una presión de aproximadamente 20 torr (2666 Pa).
En algunas realizaciones, el método se lleva a cabo a una presión de aproximadamente 19 torr (2533 Pa). En algunas realizaciones, el método se lleva a cabo a una presión de aproximadamente 18 torr. En algunas realizaciones, el método se lleva a cabo a una presión de aproximadamente 17 torr. En algunas realizaciones, el método se lleva a cabo a una presión de aproximadamente 16 torr. En algunas realizaciones, el método se lleva a cabo a una presión de aproximadamente 15 torr. En algunas realizaciones, el método se lleva a cabo a una presión de aproximadamente 14 torr. En algunas realizaciones, el método se lleva a cabo a una presión de aproximadamente 13 torr. En algunas realizaciones, el método se lleva a cabo a una presión de aproximadamente 12 torr. En algunas realizaciones, el método se lleva a cabo a una presión de aproximadamente 11 torr. En algunas realizaciones, el método se lleva a cabo a una presión de aproximadamente 10 torr. En algunas realizaciones, el método se lleva a cabo a una presión de aproximadamente 10 torr. En algunas realizaciones, el método se lleva a cabo a una presión de aproximadamente 9 torr. En algunas realizaciones, el método se lleva a cabo a una presión de aproximadamente 8 torr. En algunas realizaciones, el método se lleva a cabo a una presión de aproximadamente 7 torr. En algunas realizaciones, el método se lleva a cabo a una presión de aproximadamente 6 torr. En algunas realizaciones, el método se lleva a cabo a una presión de aproximadamente 5 torr. En algunas realizaciones, el método se lleva a cabo a una presión de aproximadamente 4 torr. En algunas realizaciones, el método se lleva a cabo a una presión de aproximadamente 3 torr. En algunas realizaciones, el método se lleva a cabo a una presión de aproximadamente 2 torr. En algunas realizaciones, el método se lleva a cabo a una presión de aproximadamente 1 torr. En algunas realizaciones, el método se lleva a cabo a una presión de menos de aproximadamente 1 torr (133 Pa).
En algunas realizaciones, los dos reaccionantes de metátesis están presentes en cantidades equimolares. En algunas realizaciones, los dos reaccionantes de metátesis no están presentes en cantidades equimolares. En ciertas realizaciones, los dos reaccionantes están presentes en una relación molar de aproximadamente 20:1, 19:1, 18:1, 17:1, 16:1, 15:1, 14:1, 13:1, 12:1, 11:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, o 1:20. En ciertas realizaciones, los dos reaccionantes están presentes en una relación molar de aproximadamente 10:1. En ciertas realizaciones, los dos reaccionantes están presentes en una relación molar de aproximadamente 7:1. En ciertas realizaciones, los dos reaccionantes están presentes en una relación molar de aproximadamente 5:1. En ciertas realizaciones, los dos reaccionantes están presentes en una relación molar de aproximadamente 2:1. En ciertas realizaciones, los dos reaccionantes están presentes en una relación molar de aproximadamente 1:10. En ciertas realizaciones, los dos reaccionantes están presentes en una relación molar de aproximadamente 1:7. En ciertas realizaciones, los dos reaccionantes están presentes en una relación molar de aproximadamente 1:5. En ciertas realizaciones, los dos reaccionantes están presentes en una relación molar de aproximadamente 1:2.
En general, las reacciones con muchos de los catalizadores de metátesis descritos en el presente documento proporcionan rendimientos mejores de 15%, mejores de 50%, mejores de 75% o mejores de 90%. Además, los reactivos y productos se eligen para proporcionar al menos una diferencia de 5°C, una diferencia mayor de 20°C o una diferencia mayor de 40°C en los puntos de ebullición. Además, el uso de catalizadores de metátesis permite una formación de producto mucho más rápida que el subproducto, es deseable realizar estas reacciones tan rápido como sea práctico. En particular, las reacciones se realizan en menos de aproximadamente 24 horas, menos de 12 horas, menos de 8 horas o menos de 4 horas.
Un experto en la técnica apreciará que el tiempo, temperatura y disolvente pueden depender entre sí, y que cambiar uno puede requerir cambiar los otros para preparar los productos piretroides e intermedios en los métodos de la descripción. Las etapas de la metátesis pueden proceder a una variedad de temperaturas y tiempos. En general, las reacciones en los métodos de la descripción se llevan a cabo usando tiempos de reacción de varios minutos a varios días. Por ejemplo, se pueden usar tiempos de reacción de aproximadamente 12 horas a aproximadamente 7 días. En algunas realizaciones, se pueden usar tiempos de reacción de 1 a 5 días. En algunas realizaciones, se pueden usar tiempos de reacción de aproximadamente 10 minutos a aproximadamente 10 horas. En general, las reacciones en los métodos de la descripción se llevan a cabo a una temperatura de aproximadamente 0°C a aproximadamente 200°C. Por ejemplo, las reacciones se pueden llevar a cabo a Í5-1002C. En algunas realizaciones, la reacción se puede llevar a cabo a 20-80°C. En algunas realizaciones, las reacciones se pueden llevar a cabo a 100-150°C.
Los ésteres grasos insaturados se pueden reducir usando un agente reductor adecuado que reduce selectivamente el éster al aldehído o alcohol correspondiente pero no reduce el doble enlace. Un éster graso insaturado se puede reducir al aldehído graso insaturado correspondiente usando haluro de di-isobutilaluminio (DIBAL) o Vitride®. El aldehído graso insaturado se puede reducir al alcohol graso correspondiente con, p. ej., DIBAL o Vitride®. En algunas realizaciones, el éster graso insaturado se puede reducir al correspondiente alcohol graso usando AlH3 o 9-Borabiciclo (3.3.1)nonano (9-BBN). (Véase Galatis P. Enciclopedia of Reagents for Organic Synthesis. 2001. New York: John Wiley & Sons; y Carey y Sunderburg. Organic Chemistry, Part B: Reactions and Synthesis, 5a edición. 2007. New York. Springer Sciences).
Composiciones de feromonas y usos de las mismas
Como se ha descrito antes, los productos hechos por los métodos descritos en el presente documento son feromonas. Las feromonas preparadas según los métodos de la invención se pueden formular para usar como composiciones de control de insectos. Las composiciones de feromonas pueden incluir un vehículo y/o estar contenidas en un dispensador. El vehículo puede ser, pero no se limita a un líquido o sólido inerte.
Los ejemplos de vehículos sólidos incluyen, pero no se limitan a cargas tales como caolín, bentonita, dolomita, carbonato de calcio, talco, magnesia en polvo, tierra de Fuller, cera, yeso, tierra de diatomeas, caucho, plástico, arcilla china, tierras minerales tales como sílices, geles de sílice, silicatos, attaclay, piedra caliza, creta, loess, arcilla, dolomita, sulfato de calcio, sulfato de magnesio, óxido de magnesio, materiales sintéticos molidos, fertilizantes tales como sulfato de amonio, fosfato de amonio, nitrato de amonio, tiourea y urea, productos de origen vegetal tales como harinas de cereales, harina de corteza de árbol, harina de madera y harina de cáscara de nuez, polvos de celulosa, atapulgitas, montmorillonitas, mica, vermiculitas, sílices sintéticas y silicatos de calcio sintéticos, o composiciones de estos.
Los ejemplos de vehículos líquidos incluyen, pero no se limitan a agua; alcoholes, tales como etanol, butanol o glicol, así como sus éteres o ésteres, tales como acetato de metilglicol; cetonas, tales como acetona, ciclohexanona, metiletilcetona, metilisobutilcetona o isoforona; alcanos tales como hexano, pentano o heptanos; hidrocarburos aromáticos, tales como xilenos o alquil-naftalenos; aceites minerales o vegetales; hidrocarburos clorados alifáticos, tales como tricloroetano o cloruro de metileno; hidrocarburos aromáticos clorados, tales como clorobencenos; disolventes solubles en agua o fuertemente polares tales como dimetiformamida, dimetilsulfóxido o N-metilpirrolidona; gases licuados; ceras, tales como cera de abejas, lanolina, cera de goma laca, cera de carnauba, cera de frutas (tales como cera de mírica o de caña de azúcar), cera de candelilla, otras ceras tales como microcristalina, ozocerita, ceresina o montana; sales tales como sal de monoetanolamina, sulfato de sodio, sulfato de potasio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, acetato de sodio, hidrogenosulfato de amonio, cloruro de amonio, acetato de amonio, formiato de amonio, oxalato de amonio, carbonato de amonio, hidrogenocarbonato de amonio, tiosulfato de amonio, hidrogenodifosfato de amonio, dihidrogenomonofosfato de amonio, hidrogenofosfato de sodio y amonio, tiocianato de amonio, sulfamato de amonio o carbamato de amonio y mezclas de los mismos. También se pueden añadir cebos o estimulantes de la alimentación al transportador.
Agente sinérgico
En algunas realizaciones, la composición de feromonas se combina con un agente químico activo de manera que se produce un efecto sinérgico. El efecto sinérgico obtenido por los métodos enseñados se puede cuantificar de acuerdo con la fórmula de Colby (es decir, (E) =X+Y-(X*Y/100). Véase Colby, R. S., "Calculating Synergistic and Antagonistic Responses of Herbicide Combinations", 1967 Weeds, vol. 15, pág. 20-22. Por lo tanto, por "sinérgico" se entiende un componente que, en virtud de su presencia, aumenta el efecto deseado en más de una cantidad aditiva. Las composiciones y adyuvantes de feromonas de los presentes métodos pueden aumentar de forma sinérgica la eficacia de los compuestos activos agrícolas y también los compuestos auxiliares agrícolas.
Por lo tanto, en algunas realizaciones, se puede formular una composición de feromonas con un agente sinérgico. El término "agente sinérgico", como se usa en el presente documento, se refiere a una sustancia que se puede usar con una feromona para reducir la cantidad de la dosis de feromona o mejorar la efectividad de la feromona para atraer al menos una especie de insecto. El agente sinérgico puede ser o no un atractor independiente de un insecto en ausencia de una feromona.
En algunas realizaciones, el agente sinérgico es un fitoquímico volátil que atrae al menos una especie de lepidópteros. El término "fitoquímica", como se usa en el presente documento, significa un compuesto que se encuentra de forma natural en una especie vegetal. En una realización particular, el agente sinérgico se selecciona del grupo que comprende p-cariofileno, isocariofileno, a-humuleno, inalool, Z3-hexenol/acetato, p-farneseno, benzaldehído, fenilacetaldehído y combinaciones de los mismos.
La composición de feromona puede contener la feromona y el agente sinérgico en una forma mezclada o combinada de otro modo, o puede contener la feromona y el agente sinérgico independientemente en una forma no mezclada.
Insecticida
La composición de feromonas puede incluir uno o más insecticidas. En una realización, los insecticidas son insecticidas químicos conocidos por los expertos en la técnica. Ejemplos de insecticidas químicos incluyen uno o más de insecticidas piretroides u organofosforados, que incluyen pero no se limitan a ciflutrina, permetrina, cipermetrina, bifintrina, fenvalerato, flucitrinato, azinfos-metil, metil paratión, buprofezina, piriproxifen, flonicamid, acetamipirid, dinotefuran, acefato, malatión, quinolfos, cloropirifos, profenofos, bendiocarb, bifentrina, clorpirifos, ciflutrina, diazinón, piretro, fenpropatrina, quinopreno, jabón o aceite insecticida, neonicotinoides, diamidas, avermectina y derivados, spinosad y derivados, azadiractina y derivados, y mezclas de los mismos.
En otra realización, los insecticidas son uno o más insecticidas biológicos conocidos por un experto en la técnica. Los ejemplos de insecticidas biológicos incluyen, pero no se limitan a azadiractina (aceite de neem), toxinas de piretrinas naturales, Bacillus thuringiencis y Beauveria bassiana, virus (p. ej., CYD-X™, CYD-X HP™, Germstar™, Madex HP™ y Spod-X™), péptidos (Spear-T™, Spear-P™ y Spear-C™)
En otra realización, los insecticidas son insecticidas que se dirigen al nervio y al músculo. Los ejemplos incluyen inhibidores de acetilcolinesterasa (AChE), tales como carbamatos (p. ej., metomil y tiodicarb) y organofosfatos (p. ej., clorpirifos), antagonistas de los canales de cloruro activados por GABA, tales como organoclorados de ciclodieno (p. ej., endosulfán) y fenilpirazoles (p. ej., fipronil), moduladores de canales de sodio, tales como piretrinas y piretroides (p. ej., cipermetrina y A-cihalotrina), agonistas del receptor nicotínico de acetilcolina (nAChR), tales como neonicotinoides (p. ej., acetamiprid, tiacloprid, tiametoxam), moduladores alostéricos del receptor nicotínico de acetilcolina (nAChR), tales como espinosinas (p. ej., espinosa y espinetoram), activadores de canales de cloruro, tales como avermectinas y milbemicinas (p. ej., abamectina, benzoato de emamectina), bloqueadores del receptor nicotínico de acetilcolina (nAChR), tales como bensultap y cartap, bloqueadores de los canales de sodio dependientes de voltaje, tales como indoxacarb y metaflumizona, modulador del receptor de rianodina, tal como diamidas (p. ej., dhorantraniliprol y flubendiamida). En otra realización, los insecticidas son insecticidas que se dirigen a la respiración. Los ejemplos incluyen sustancias químicas que desacoplan la fosforilación oxidativa a través de la alteración del gradiente de protones, tales como el clorfenapir, y los inhibidores del transporte de electrones del complejo I mitocondrial.
En otra realización, los insecticidas son insecticidas que se dirigen al intestino medio. Los ejemplos incluyen disruptores microbianos de las membranas del intestino medio de los insectos, tales como Bacillus thuringiensis y Bacillus sphaericus.
En otra realización, los insecticidas son insecticidas que se dirigen al crecimiento y desarrollo. Los ejemplos incluyen imitadores de hormonas juveniles, tales como análogos de hormonas juveniles (p. ej., fenoxicarb), inhibidores de la biosíntesis de quitina, tipo 0, tales como benzoilureas (p. ej., flufenoxurón, lufenurón y novalurón), y agonistas del receptor de ecdisona, tales como diacilhidrazinas (p. ej., metoxifenozida y tebufenozida)
Estabilizante
Según otra realización de la descripción, la composición de feromonas puede incluir uno o más aditivos que mejoran la estabilidad de la composición. Los ejemplos de aditivos incluyen, pero no se limitan a, ácidos grasos y aceites vegetales, tales como por ejemplo aceite de oliva, aceite de soja, aceite de maíz, aceite de cártamo, aceite de canola y combinaciones de los mismos.
Carga
Según otra realización de la descripción, la composición de feromonas puede incluir una o más cargas. Los ejemplos de cargas incluyen, pero no se limitan a una o más arcillas minerales (p. ej., atapulgita). En algunas realizaciones, la composición atractora puede incluir uno o más espesantes orgánicos. Los ejemplos de dichos espesantes incluyen, pero no se limitan a metilcelulosa, etilcelulosa y cualquier combinación de los mismos.
Disolvente
Según otra realización, las composiciones de feromonas de la presente descripción pueden incluir uno o más disolventes. Las composiciones que contienen disolventes son deseables cuando un usuario va a emplear composiciones líquidas que se pueden aplicar con brocha, por inmersión, balanceo, pulverización o de otro modo aplicando las composiciones líquidas a sustratos a los que el usuario desea proporcionar un recubrimiento de feromonas (p. ej., un señuelo). En algunas realizaciones, el o los disolvente que se van a usar se seleccionan para así solubilizar, o solubilizar sustancialmente, el uno o más ingredientes de la composición de feromonas. Los ejemplos de disolventes incluyen, pero no se limitan a agua, disolvente acuoso (p. ej., mezcla de agua y etanol), etanol, metanol, hidrocarburos clorados, disolventes de petróleo, trementina, xileno y cualquier combinación de los mismos.
En algunas realizaciones, las composiciones de feromonas de la presente descripción comprenden disolventes orgánicos. Los disolventes orgánicos se usan principalmente en la formulación de concentrados emulsionables, formulaciones ULV y, en menor medida, formulaciones granulares. A veces se usan mezclas de disolventes. En algunas realizaciones, la presente descripción enseña el uso de disolventes que incluyen aceites parafínicos alifáticos tales como queroseno o parafinas refinadas. En otras realizaciones, la presente descripción enseña el uso de disolventes aromáticos tales como xileno y fracciones de mayor peso molecular de disolventes aromáticos C9 y C10. En algunas realizaciones, los hidrocarburos clorados son útiles como codisolventes para evitar la cristalización cuando la formulación se emulsiona en agua. A veces se usan alcoholes como codisolventes para aumentar el poder disolvente.
Agente solubilizante
En algunas realizaciones, las composiciones de feromonas de la presente descripción comprenden agentes solubilizantes. Un agente solubilizante es un tensioactivo que formará micelas en el agua en concentraciones superiores a la concentración micelar crítica. Las micelas pueden entonces disolver o solubilizar materiales insolubles en agua dentro de la parte hidrófoba de la micela. Los tipos de tensioactivos que se usan habitualmente para la solubilización son no iónicos: monoleatos de sorbitán; monooleatos de sorbitán etoxilados; y ésteres de oleato de metilo.
Aglutinante
Según otra realización de la descripción, la composición de feromonas puede incluir uno o más aglutinantes. Se pueden usar aglutinantes para promover la asociación de la composición de feromonas con la superficie del material sobre el que se aplica como recubrimiento dicha composición. En algunas realizaciones, el aglutinante se puede usar para promover la asociación de otro aditivo (p. ej., insecticida, reguladores del crecimiento de insectos y similares) a la composición de feromonas y/o la superficie de un material. Por ejemplo, un aglutinante puede incluir una resina sintética o natural que se usa típicamente en pinturas y recubrimientos. Estos se pueden modificar para hacer que la superficie recubierta sea lo suficientemente friable como para permitir que los insectos muerdan e ingieran los componentes de la composición (p. ej., insecticida, reguladores del crecimiento de insectos y similares), mientras se mantiene la integridad estructural del revestimiento.
Los ejemplos no limitantes de aglutinantes incluyen polivinilpirrolidona, poli(alcohol vinílico), poli(acetato de vinilo) parcialmente hidrolizado, carboximetilcelulosa, almidón, copolímeros de vinilpirrolidona/acetato de vinilo y poli(acetato de vinilo), o composiciones de estos; lubricantes tales como estearato de magnesio, estearato de sodio, talco o polietilenglicol, o composiciones de estos; antiespumantes tales como emulsiones de silicona, alcoholes de cadena larga, ésteres fosfóricos, acetilendioles, ácidos grasos o compuestos organofluorados, y agentes complejantes tales como: sales de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), sales de ácido trinitrilotriacético o sales de ácidos polifosfóricos, o composiciones de estas.
En algunas realizaciones, el aglutinante también actúa como carga y/o espesante. Los ejemplos de dichos aglutinantes incluyen, pero no se limitan a uno o más de goma laca, acrílicos, epoxis, alquidos, poliuretanos, aceite de linaza, aceite de tung y cualquier combinación de los mismos.
Agentes tensioactivos
En algunas realizaciones, las composiciones de feromonas comprenden agentes tensioactivos. En algunas realizaciones, los agentes tensioactivos se añaden a composiciones agrícolas líquidas. En otras realizaciones, los agentes tensioactivos se añaden a formulaciones sólidas, en especial aquellas diseñadas para ser diluidas con un vehículo antes de la aplicación. Por lo tanto, en algunas realizaciones, las composiciones de feromonas comprenden tensioactivos. A veces los tensioactivos se usan, ya sea solos o con otros aditivos, tales como aceites minerales o vegetales, como adyuvantes para mezclas de tanque de pulverización para mejorar el rendimiento biológico de la feromona en el objetivo. Los agentes tensioactivos pueden ser de carácter aniónico, catiónico o no iónico y se pueden usar como agentes emulsionantes, agentes humectantes, agentes de suspensión o para otros fines. En algunas realizaciones, los tensioactivos son no iónicos tales como: etoxilatos de alquilo, etoxilatos de alcohol alifático lineal y etoxilatos de amina alifática. Los tensioactivos usados convencionalmente en la técnica de la formulación y que también se pueden usar en las presentes formulaciones se describen en McCutcheon's Detergents and Emulsifiers Annual, MC Publishing Corp., Ridgewood, N.J., 1998, y en Encyclopedia of Surfactants, vol. I-III, Chemical Publishing Co., Nueva York, 1980-81. En algunas realizaciones, la presente descripción enseña el uso de tensioactivos que incluyen sales de metales alcalinos, metales alcalinotérreos o amonio de ácidos sulfónicos aromáticos, por ejemplo, ácido ligno- fenol- naftaleno y dibutilnaftalenosulfónico, y de ácidos grasos de arisulfonatos, de alquiléteres, de lauriléteres, de sulfatos de alcoholes grasos y de glicol éter sulfatos de alcoholes grasos, condensados de naftaleno sulfonado y sus derivados con formaldehído, condensados de naftaleno o de ácidos naftalenosulfónicos con fenol y formaldehído, condensados de fenol o ácido fenolsulfónico con formaldehído, condensados de fenol con formaldehído y sulfito de sodio, polioxietilenoctilfeniléter, isooctil-, octil- o nonifenol etoxilado, tributilfenilpoliglicoléter, alquilarilpoliéter de alcoholes, alcohol de isotridecilo, aceite de ricino etoxilado, triarilfenoles etoxilados, sales de triarilfenoletoxilados fosfatados, acetato de poliglicoléter de alcohol de laurilo, ésteres de sorbitán, lejía de residuos lignosulfíticos o metilcelulosa, o composiciones de estos.
En algunas realizaciones, la presente descripción enseña otros agentes tensioactivos adecuados, que incluyen sales de alquil-sulfatos, tales como lauril-sulfato de dietanolamonio; sales de alquiarisulfonato, tales como dodecilbencenosulfonato de calcio; productos de adición de alquilfenol-óxido de alquileno, tales como nonifenoletoxilato C18; productos de adición de alcohol-óxido de alquileno, tales como alcohol tridecílico-etoxilato C16; jabones, tales como estearato de sodio; sales de alquilnaftaleno-sulfonato, tales como dibutilnaftalenosulfonato de sodio; ésteres de dialquilo de sales de sulfosuccinato, tales como di(2-etilhexil)sulfosuccinato de sodio; ésteres de sorbitol, tales como oleato de sorbitol; aminas cuaternarias, tales como cloruro de lauriltrimetilamonio; ésteres de polietilenglicol de ácidos grasos, tales como estearato de polietilenglicol; copolímeros de bloques de óxido de etileno y óxido de propileno; sales de ésteres de mono y dialquilfosfato; aceites vegetales tales como aceite de soja, aceite de colza/canola, aceite de oliva, aceite de ricino, aceite de girasol, aceite de coco, aceite de maíz, aceite de semilla de algodón, aceite de linaza, aceite de palma, aceite de cacahuete, aceite de cártamo, aceite de sésamo, aceite de tung y similares; y ésteres de los aceites vegetales anteriores, particularmente ésteres metílicos.
Agentes humectantes
En algunas realizaciones, las composiciones de feromonas comprenden agentes humectantes. Un agente humectante es una sustancia que cuando se añade a un líquido aumenta el poder de extensión o penetración del líquido reduciendo la tensión interfacial entre el líquido y la superficie sobre la cual se está extendiendo. Los agentes humectantes se usan para dos funciones principales en las formulaciones agroquímicas: durante el procesamiento y fabricación para aumentar la tasa de humectación de los polvos en agua para hacer concentrados para líquidos solubles o suspensiones concentradas; y durante el mezclamiento de un producto con agua en un tanque de pulverización u otro recipiente para reducir el tiempo de humectación de los polvos humectables y mejorar la penetración del agua en los gránulos dispersables en agua. En algunas realizaciones, ejemplos de agentes humectantes usados en las composiciones de feromonas de la presente descripción, que incluyen polvos humectables, suspensiones concentradas y formulaciones de gránulos dispersables en agua, son: laurilsulfato de sodio; dioctilsulfosuccinato de sodio; etoxilatos de alquilfenol; y etoxilatos de alcohol alifático.
Agente dispersante
En algunas realizaciones, las composiciones de feromonas de la presente descripción comprenden agentes dispersantes. Un agente dispersante es una sustancia que se adsorbe sobre la superficie de las partículas y ayuda a preservar el estado de dispersión de las partículas y evita que se vuelvan a agregar. En algunas realizaciones, se añaden agentes dispersantes a las composiciones de feromonas de la presente descripción para facilitar la dispersión y suspensión durante la fabricación, y para asegurar que las partículas se vuelvan a dispersar en agua en un tanque de pulverización. En algunas realizaciones, los agentes dispersantes se usan en polvos humectables, concentrados en suspensión y gránulos dispersables en agua. Los tensioactivos que se usan como agentes dispersantes tienen la capacidad de adsorberse fuertemente sobre la superficie de una partícula y proporcionar una barrera cargada o estérica para la reagregación de partículas. En algunas realizaciones, los tensioactivos más comúnmente usados son aniónicos, no iónicos o mezclas de los dos tipos.
En algunas realizaciones, para formulaciones en polvo humectables, los agentes dispersantes más comunes son lignosulfonatos de sodio. En algunas realizaciones, las suspensiones concentradas proporcionan muy buena adsorción y estabilización usando polielectrolitos, tales como condensados de naftalenosulfonato de sodioformaldehído. En algunas realizaciones, también se usan ésteres de fosfato de triestirilfenol etoxilado. En algunas realizaciones, tales como condensados de óxido de alquilariletileno y copolímeros de bloques de EO-PO se combinan a veces con aniones como agentes dispersantes para suspensiones concentradas.
Tensioactivo polimérico
En algunas realizaciones, las composiciones de feromonas de la presente descripción comprenden tensioactivos poliméricos. En algunas realizaciones, los tensioactivos poliméricos tienen "cadenas principales" hidrófobas muy largas y un gran número de cadenas de óxido de etileno que forman los "dientes" de un tensioactivo de "peine". En algunas realizaciones, estos polímeros de alto peso molecular pueden dar muy buena estabilidad a largo plazo a las suspensiones concentradas, porque las cadenas principales hidrófobas tienen muchos puntos de anclaje sobre las superficies de las partículas. En algunas realizaciones, ejemplos de agentes dispersantes usados en las composiciones de feromonas de la presente descripción son: lignosulfonatos de sodio; condensados de naftalenosulfonato de sodio-formaldehído; ésteres de fosfato de triestirilfenol etoxilado; etoxilatos de alcohol alifático; etoxilatos de alquilo; copolímeros de bloques de EO-PO; y copolímeros de injerto.
Agente emulsionante
En algunas realizaciones, las composiciones de feromonas de la presente descripción comprenden agentes emulsionantes. Un agente emulsionante es una sustancia que estabiliza una suspensión de gotitas de una fase líquida en otra fase líquida. Sin el agente emulsionante, los dos líquidos se separarían en dos fases líquidas inmiscibles. En algunas realizaciones, las mezclas de emulsionantes más comúnmente usadas incluyen alquilfenol o alcohol alifático con 12 o más unidades de óxido de etileno y la sal de calcio soluble en aceite del ácido dodecilbencenosulfónico. Un intervalo de valores de equilibrio hidrófilo-lipófilo ("HLB") de 8 a 18 normalmente proporcionará buenas emulsiones estables. En algunas realizaciones, la estabilidad de la emulsión a veces se puede mejorar por la adición de una pequeña cantidad de un tensioactivo de copolímero de bloques de EO-PO.
Agente gelificante
En algunas realizaciones, las composiciones de feromonas comprenden agentes gelificantes. Los agentes espesantes o gelificantes se usan principalmente en la formulación de suspensiones concentradas, emulsiones y suspoemulsiones para modificar la reología o las propiedades de flujo del líquido y evitar la separación y sedimentación de las partículas o gotitas dispersas. Los agentes espesantes, gelificantes y antisedimentación generalmente se dividen en dos categorías, en concreto, partículas insolubles en agua y polímeros solubles en agua. Se pueden producir formulaciones de suspensión concentrada usando arcillas y sílices. En algunas realizaciones, las composiciones de feromonas comprenden uno o más espesantes que incluyen, pero no se limitan a: montmorillonita, p. ej. bentonita; silicato de magnesio y aluminio; y atapulgita. En algunas realizaciones, la presente descripción enseña el uso de polisacáridos como agentes espesantes. Los tipos de polisacáridos más usados habitualmente son extractos naturales de semillas y algas marinas o derivados sintéticos de celulosa. Algunas realizaciones usan xantano y algunas realizaciones usan celulosa. En algunas realizaciones, la presente descripción enseña el uso de agentes espesantes que incluyen, pero no se limitan a: goma guar; goma de algarrobilla; carragenina; alginatos; metilcelulosa; carboximetilcelulosa de sodio (SCMC); hidroxietilcelulosa (HEC). En algunas realizaciones, la presente descripción enseña el uso de otros tipos de agentes antisedimentación tales como almidones modificados, poliacrilatos, poli(alcohol vinílico) y poli(óxido de etileno). Otro buen agente antisedimentación es la goma xantana.
Agente antiespumante
En algunas realizaciones, la presencia de tensioactivos, que reducen la tensión interfacial, puede hacer que las formulaciones basadas en agua formen espuma durante las operaciones de mezclado en la producción y en la aplicación a través de un tanque de pulverización. Por lo tanto, en algunas realizaciones, con el fin de reducir la tendencia a la formación de espuma, a menudo se añaden agentes antiespumantes durante la etapa de producción o antes del llenado en botellas/tanques de pulverización. En general, existen dos tipos de agentes antiespumantes, en concreto, siliconas y no siliconas. Las siliconas normalmente son emulsiones acuosas de dimetilpolisiloxano, mientras que los agentes antiespumantes que no son de silicona son aceites insolubles en agua, tales como octanol y nonanol, o sílice. En ambos casos, la función del agente antiespumante es desplazar el tensioactivo de la interfase de aireagua.
Conservante
En algunas realizaciones, las composiciones de feromonas comprenden un conservante.
Agente activo adicional
De acuerdo con otra realización de la descripción, la composición de feromonas puede incluir uno o más estimuladores de alimentación de insectos. Los ejemplos de estimuladores de alimentación de insectos incluyen, pero no se limitan a aceite de semilla de algodón bruto, ésteres de ácido graso y fitol, ésteres de ácidos graso y geranil geraniol, ésteres de ácido graso y otros alcoholes vegetales, extractos vegetales, y combinaciones de los mismos.
De acuerdo con otra realización de la descripción, la composición de feromonas puede incluir uno o más reguladores del crecimiento de insectos ("IGR"). Los IGR se pueden usar para alterar el crecimiento del insecto y producir insectos deformados. Los ejemplos de reguladores del crecimiento de insectos incluyen, por ejemplo, dimilina.
De acuerdo con otra realización de la descripción, la composición atractora puede incluir uno o más esterilizantes de insectos que esterilizan los insectos atrapados o bloquea de otra forma su capacidad de reproducción, de modo que reducen la población en la siguiente generación. En algunas situaciones dejar que sobrevivan los insectos esterilizados y que compitan con los insectos no atrapados para apareamientos puede ser más eficaz que matarlos completamente.
Composiciones pulverizables
En algunas realizaciones, las composiciones de feromonas descritas en el presente documento se pueden formular como una composición pulverizable (es decir, una composición de feromonas pulverizable). Se puede usar un disolvente acuoso en la composición pulverizable, p. ej., agua o una mezcla de agua y un alcohol, glicol, cetona u otro disolvente miscible con el agua. En algunas realizaciones, el contenido de agua de dicha mezcla es al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 40%, 50%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80%, o al menos aproximadamente 90%. En algunas realizaciones, la composición pulverizable está concentrada, es decir, una suspensión concentrada de la feromona y otros aditivos (p. ej., una sustancia cérea, un estabilizante y similares) en el disolvente acuoso, y se puede diluir a la concentración de uso final por adición de disolvente (p. ej., agua).
En algunas realizaciones, la sustancia cérea se puede usar como vehículo para la feromona y su isómero de posición en la composición pulverizable. La sustancia cérea puede ser, p. ej., una cera biodegradable, tal como cera de abeja, cera de carnauba y similares, cera de candelilla (cera de hidrocarburo), cera montana, goma laca y ceras similares, ácidos grasos saturados o insaturados, tales como ácido láurico, palmítico, oleico o esteárico, amidas y ésteres de ácidos grasos, ésteres de ácidos grasos hidroxílicos, tales como ésteres de ácidos grasos hidroxietílicos o hidroxipropílicos, alcoholes grasos y poliésteres de bajo peso molecular tales como poli(succinatos de alquileno).
En algunas realizaciones, se puede usar un estabilizante con las composiciones de feromonas pulverizables. El estabilizante se puede usar para regular el tamaño de partículas del concentrado y/o para permitir la preparación de una suspensión estable de la composición de feromonas. En algunas realizaciones, el estabilizante se selecciona de polímeros hidroxílicos y/o etoxilados. Los ejemplos incluyen copolímero de óxido de etileno y óxido de propileno, polialcoholes, incluyendo almidón, maltodextrina y otros carbohidratos solubles o sus éteres o ésteres, éteres de celulosa, gelatina, poli(ácido acrílico) y sales y ésteres parciales de los mismos y similares. En otras realizaciones, el estabilizante puede incluir poli(alcoholes vinílicos) y copolímeros de los mismos, tales como poli(acetato de vinilo) parcialmente hidrolizado. El estabilizante se puede usar a un nivel suficiente para regular el tamaño de partículas y/o para preparar una suspensión estable, p. ej., entre 0,1% y 15% de la solución acuosa.
En algunas realizaciones, se puede usar un aglutinante con las composiciones de feromonas pulverizables. En algunas realizaciones, el aglutinante puede actuar para estabilizar más la dispersión y/o mejorar la adherencia de la dispersión pulverizada al sitio objetivo (p. ej., trampa, señuelo, planta y similares). El aglutinante puede ser un polisacárido, tal como un alginato, derivado de celulosa (acetato, alquilo, carboximetilo, hidroxialquilo), almidón o derivado de almidón, dextrina, goma (arábiga, guar, algarrobilla, tragacanto, carragenano y similares), sacarosa, y similares. El aglutinante también puede ser un polímero soluble en agua, no carbohidrato, tal como polivinilpirrolidona, o un polímero ácido tal como poli(ácido acrílico) o poli(ácido metacrílico), en forma de ácido y/o sal, o mezclas de dichos polímeros.
Feromonas microencapsuladas
En algunas realizaciones, las composiciones de feromonas descritas en el presente documento se pueden formular como una feromona microencapsulada, tal como se describe en III'Ichev, AL et al., J. Econ. Entomol. 2006;99(6):2048-54; y Stelinki, LL et al., J. Econ. Entomol. 2007;100(4):1360-9. Las feromonas microencapsuladas (MEC) son pequeñas gotas de feromona encerradas dentro de cápsulas de polímero. Las cápsulas controlan la velocidad de liberación de la feromona en el entorno circundante y son lo suficientemente pequeñas para aplicarse con el mismo método que se usa para pulverizar insecticidas. La duración en campo efectiva de las formulaciones de feromonas microencapsuladas puede variar desde unos pocos días hasta algo más de una semana, dependiendo, entre otras cosas, de las condiciones climáticas, el tamaño de la cápsula y las propiedades químicas.
Formulación de liberación lenta
Las composiciones de feromonas se pueden formular para así proporcionar una liberación lenta a la atmósfera y/o para estar así protegidas de la degradación después de la liberación. Por ejemplo, las composiciones de feromonas se pueden incluir en vehículos tales como microcápsulas, escamas biodegradables y matrices basadas en cera de parafina. Alternativamente, la composición de feromonas se puede formular como un pulverizable de liberación lenta.
En determinadas realizaciones, la composición de feromonas puede incluir uno o más agentes poliméricos conocidos por un experto en la técnica. Los agentes poliméricos pueden controlar la velocidad de liberación de la composición al medio ambiente. En algunas realizaciones, la composición atractora polimérica es resistente a las condiciones ambientales. El agente polimérico también puede ser un agente de liberación sostenida que permite que la composición se libere al medio ambiente de una manera sostenida.
Los ejemplos de agentes poliméricos incluyen, pero no se limitan a celulosas, proteínas tales como caseína, polímeros basados en fluorocarbonos, colofonias hidrogenadas, ligninas, melamina, poliuretanos, polímeros vinílicos tales como poli(acetato de vinilo) (PVAC), policarbonatos, poli(dinitrilo de vinilideno), poliamidas, poli(alcohol vinílico) (PVA), poliamida-aldehído, poli(aldehído vinílico), poliésteres, poli(cloruro de vinilo) (PVC), polietilenos, poliestirenos, polivinilideno, siliconas y combinaciones de los mismos. Los ejemplos de celulosas incluyen, pero no se limitan a, metilcelulosa, etilcelulosa, acetato de celulosa, acetato-butirato de celulosa, acetato-propionato de celulosa, propionato de celulosa y combinaciones de los mismos.
Otros agentes que se pueden usar en formulaciones de liberación lenta o de liberación sostenida incluyen ésteres de ácidos grasos (tales como un éster sebacato, laurato, palmitato, estearato o araquidato) o alcoholes grasos (tales como undecanol, dodecanol, tridecanol, tridecenol, tetradecanol, tetradecenol, tetradecadienol, pentadecanol, pentadecenol, hexadecanol, hexadecenol, hexadecadienol, octadecenol y octadecadienol).
Las feromonas preparadas de acuerdo con los métodos de la invención, así como composiciones que contienen las feromonas, se pueden usar para controlar el comportamiento y/o el crecimiento de insectos en varios entornos. Las feromonas se pueden usar, por ejemplo, para atraer o repeler insectos macho o hembra hacia o desde un área objetivo particular. Las feromonas se pueden usar para atraer insectos lejos de zonas de cultivo vulnerables. Las feromonas también se pueden usar por ejemplo para atraer insectos como parte de una estrategia para el monitoreo de insectos, captura masiva, señuelo/atracción y muerte o disrupción del apareamiento.
Señuelos
Las composiciones de feromonas de la presente descripción se pueden aplicar como recubrimiento o pulverizar sobre un señuelo, o el señuelo se puede impregnar de otro modo con una composición de feromonas.
Trampas
Las composiciones de feromonas de la descripción se pueden usar en trampas, tales como las que se usan habitualmente para atraer cualquier especie de insecto, p. ej., insectos del orden Lepidoptera. Dichas trampas son bien conocidas por los expertos en la técnica y se usan normalmente en muchos estados y países en programas de erradicación de insectos. En una realización, la trampa incluye uno o más septos, recipientes o receptáculos de almacenamiento para contener la composición de feromonas. Por lo tanto, en algunas realizaciones, la presente descripción proporciona una trampa cargada con al menos una composición de feromonas. Por lo tanto, las composiciones de feromonas de la presente descripción se pueden usar en trampas, por ejemplo, para atraer insectos como parte de una estrategia para el monitoreo de insectos, captura masiva, disrupción del apareamiento o cebo/atracción y muerte, por ejemplo, incorporando una sustancia tóxica en la trampa para matar insectos atrapados.
La captura masiva implica poner una alta densidad de trampas en un cultivo que se va a proteger, de modo que se elimina una gran proporción de los insectos antes de que el cultivo se dañe. Las técnicas de cebo/atracción y muerte son similares excepto que una vez que el insecto es atraído a un cebo, se somete a un agente letal. Cuando el agente letal es un insecticida, un dispensador también puede contener un señuelo o estimulador de la alimentación que incitará a los insectos a ingerir una cantidad eficaz de un insecticida. El insecticida puede ser un insecticida conocido por los expertos en la técnica. El insecticida se puede mezclar con la composición atractora o puede estar presente por separado en una trampa. Las mezclas pueden realizar la doble función de atraer y matar al insecto.
Dichas trampas pueden tener cualquier forma adecuada, y las trampas para matar no necesitan necesariamente incorporar sustancias tóxicas, matándose los insectos opcionalmente por otros medios, tales como ahogamiento o electrocución. Alternativamente, las trampas pueden contaminar al insecto con un hongo o virus que mata al insecto más tarde. Incluso cuando no se matan los insectos, la trampa puede servir para eliminar los insectos macho del lugar de las hembras, para evitar la reproducción.
Una persona experta en la técnica apreciará que es posible una variedad de trampas diferentes. Ejemplos adecuados de dichas trampas incluyen trampas de agua, trampas pegajosas y trampas unidireccionales. Hay muchas variedades de trampas pegajosas. Un ejemplo de trampa pegajosa es una construcción de cartón, triangular o en forma de cuña en sección transversal, donde las superficies interiores están recubiertas con una sustancia pegajosa que no seca. Los insectos se ponen en contacto con la superficie pegajosa y quedan atrapados. Las trampas de agua incluyen recipientes de agua y detergente que se usan para atrapar insectos. El detergente destruye la tensión superficial del agua, provocando que los insectos que son atraídos al recipiente se ahoguen en el agua. Las trampas unidireccionales permiten que un insecto entre en la trampa, pero evitan que salga. Las trampas de la descripción se pueden colorear con colores brillantes para proporcionar una atracción adicional para los insectos.
En algunas realizaciones, las trampas de feromonas que contienen la composición se pueden combinar con otros tipos de mecanismos de captura. Por ejemplo, además de la composición de feromonas, la trampa puede incluir una o más luces fluorescentes, uno o más sustratos pegajosos y/o una o más superficies coloreadas para atraer polillas.
En otras realizaciones, la trampa de feromonas que contiene la composición puede no tener otros tipos de mecanismos de captura.
La trampa se puede colocar en cualquier época del año en un campo. Los expertos en la técnica pueden determinar fácilmente una cantidad apropiada de las composiciones para usar en una trampa particular, y también pueden determinar una densidad apropiada de trampas/hectárea de campo de cultivo a proteger.
La trampa se puede colocar en un área infestada (o potencialmente infestada) de insectos. En general, la trampa se pone sobre o cerca de un árbol o planta. El aroma de la feromona atrae a los insectos a la trampa. A continuación, los insectos pueden ser capturados, inmovilizados y/o matados dentro de la trampa, por ejemplo, mediante el agente letal presente en la trampa.
Las trampas también se pueden poner dentro de un huerto para abrumar las feromonas emitidas por las hembras, de modo que los machos simplemente no puedan localizar a las hembras. En este sentido, una trampa no tiene que ser más que un simple aparato, por ejemplo, una mecha protegida para dispensar feromonas.
Las trampas de la presente descripción se pueden proporcionar en forma constituida, donde ya se ha aplicado el compuesto de la descripción. En tal caso, dependiendo de la semivida del compuesto, el compuesto se puede exponer o se puede sellar de manera convencional, como es habitual con otros dispensadores aromáticos, retirándose el sello solo una vez que la trampa está en su lugar.
Alternativamente, las trampas se pueden vender por separado, y el compuesto de la descripción se puede proporcionar en formato dispensable para que se pueda aplicar una cantidad a la trampa, una vez que la trampa esté en su lugar. Por lo tanto, la presente descripción puede proporcionar el compuesto en una bolsita u otro dispensador.
Dispensador
Las composiciones de feromonas se pueden usar junto con un dispensador para liberar la composición en un entorno particular. Se puede usar cualquier dispensador adecuado conocido en la técnica. Ejemplos de dichos dispensadores incluyen, pero no se limitan a emisores de aerosol, dispensadores de aplicación manual, bandejas de burbujeo que comprenden un depósito con una barrera permeable a través de la cual se liberan lentamente las feromonas, almohadillas, perlas, tubos, varillas, espirales o bolas compuestas de caucho, plástico, cuero, algodón, algodón en rama, madera o productos de madera que están impregnados con la composición de feromonas. Por ejemplo, laminados, pellets, gránulos, cuerdas o espirales de poli(cloruro de vinilo) de los que se evapora la composición de feromonas o septos de caucho. Un experto en la técnica podrá seleccionar vehículos y/o dispensadores adecuados para el modo deseado de aplicación, almacenamiento, transporte o manipulación.
En otra realización, se puede usar un dispositivo que contamine a los insectos macho con un polvo que contenga la propia sustancia de feromona. Los machos contaminados después salen volando y proporcionan una fuente de disrupción del apareamiento al permear la atmósfera con la sustancia de feromona, o al atraer a otros machos a los machos contaminados, en lugar de a las hembras reales.
Modificación de comportamiento
Las composiciones de feromonas preparadas de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento se pueden usar para controlar o modular el comportamiento de los insectos. En algunas realizaciones, el comportamiento de los insectos objetivo se puede modular de una manera ajustable, entre otros, variando la relación de la feromona al isómero de posición en la composición de modo que el insecto sea atraído a un lugar particular pero no se ponga en contacto con dicho lugar o de modo que el insecto, de hecho, se ponga en contacto con dicho lugar. Por lo tanto, en algunas realizaciones, las feromonas se pueden usar para atraer insectos lejos de áreas de cultivo vulnerables. Por consiguiente, la descripción también proporciona un método para atraer insectos a un lugar. El método incluye administrar en un lugar una cantidad eficaz de la composición de feromonas.
El método de disrupción del apareamiento puede incluir la vigilancia periódica del número total o cantidad de insectos atrapados. La vigilancia se puede realizar contando el número de insectos atrapados durante un periodo de tiempo predeterminado, tal como, por ejemplo, diario, semanal, quincenal, mensual, una vez cada tres meses o cualquier otro periodo de tiempo seleccionado por el que vigila. Dicha vigilancia de los insectos atrapados puede ayudar a estimar la población de insectos para ese periodo particular y, por lo tanto, ayudar a determinar un tipo y/o dosis particular de control de plagas en un sistema de manejo integrado de plagas. Por ejemplo, un descubrimiento de una gran población de insectos puede requerir el uso de métodos para eliminar el insecto. La alerta temprana de una infestación en un nuevo hábitat puede permitir que se tomen medidas antes de que la población se vuelva inmanejable. Por el contrario, el descubrimiento de una población de insectos baja puede llevar a la decisión de que es suficiente continuar la vigilancia de la población. Las poblaciones de insectos se pueden vigilar regularmente para que los insectos se controlen solo cuando alcancen un cierto umbral. Esto proporciona un control rentable de los insectos y reduce el impacto ambiental del uso de insecticidas.
Disrupción del apareamiento
Las feromonas preparadas de acuerdo con los métodos de la descripción también se pueden usar para la disrupción del apareamiento. La disrupción del apareamiento es una técnica de manejo de plagas diseñada para controlar plagas de insectos mediante la introducción de estímulos artificiales (p. ej., una composición de feromonas como se describe en el presente documento) que confunde a los insectos y altera la localización de la pareja y/o el cortejo, evitando así el apareamiento y bloqueando el ciclo reproductivo.
En muchas especies de insectos de interés para la agricultura, como las del orden Lepidóptera, las hembras emiten un rastro por el aire de una mezcla química específica que constituye la feromona sexual de esa especie. Este rastro aéreo se conoce como penacho de feromonas. Los machos de esa especie usan la información contenida en el penacho de feromonas para localizar a la hembra emisora (conocida como hembra "que llama"). La disrupción del apareamiento aprovecha la respuesta natural de los insectos macho para seguir el penacho introduciendo una feromona sintética en el hábitat de los insectos, que está diseñada para imitar la feromona sexual producida por el insecto hembra. Por lo tanto, en algunas realizaciones, la feromona sintética usada en la disrupción del apareamiento es una composición de feromonas obtenida sintéticamente que comprende una feromona que tiene una estructura química de una feromona sexual y un isómero de posición de la misma que no es producido por el insecto objetivo.
El efecto general de la disrupción del apareamiento es confundir a los insectos macho enmascarando los penachos de feromonas naturales, haciendo que los machos sigan "rastros de feromonas falsos" a expensas de encontrar parejas, y afecta a la capacidad de los machos para responder a las hembras que "llaman". Por consiguiente, la población de machos experimenta una probabilidad reducida de localizar con éxito y aparearse con las hembras, lo que conduce al eventual cese de la reproducción y al colapso de la infestación de insectos.
Las estrategias de disrupción del apareamiento incluyen confusión, enmascaramiento de rastros y seguimiento de rastros falsos. La exposición constante de los insectos a una alta concentración de una feromona puede evitar que los insectos macho respondan a los niveles normales de la feromona liberada por los insectos hembra. El enmascaramiento de rastros usa una feromona para destruir el rastro de feromonas liberadas por las hembras. El seguimiento de rastros falsos se lleva a cabo colocando numerosos puntos de una feromona en alta concentración para presentar al macho muchos rastros falsos para seguir. Cuando se liberan en cantidades suficientemente altas, los insectos macho son incapaces de encontrar la fuente natural de las feromonas sexuales (los insectos hembra) por lo que no puede ocurrir el apareamiento.
En algunas realizaciones, se puede adaptar una mecha o trampa para emitir una feromona durante un periodo al menos equivalente al de la o las temporadas de reproducción del mosquito, provocando así la disrupción del apareamiento. Si el mosquito tiene una temporada de reproducción prolongada, o una temporada de reproducción repetida, la presente descripción proporciona una mecha o trampa capaz de emitir feromonas durante un periodo de tiempo, especialmente aproximadamente dos semanas, y generalmente entre aproximadamente 1 y 4 semanas y hasta 6 semanas, que se puede rotar o reemplazar por trampas similares posteriores. Se puede poner una pluralidad de trampas que contienen la composición de feromonas en un lugar, p. ej., adyacente a un campo de cultivo. Las ubicaciones de las trampas y la altura de las trampas desde el suelo se pueden seleccionar de acuerdo con métodos conocidos por un experto en la técnica.
Alternativamente, la composición de feromonas se puede dispensar a partir de formulaciones tales como microcápsulas o ataduras de torsión (twist-ties), tales como las que se usan habitualmente para la disrupción del apareamiento de plagas de insectos.
Atracción y muerte
El método de atracción y muerte usa un atrayente, tal como una feromona sexual, para atraer a los insectos de la especie objetivo a un producto químico, superficie, dispositivo insecticidas, etc., para matar en masa y finalmente suprimir la población, y puede tener el mismo efecto que la captura masiva. Por ejemplo, cuando se usa una feromona sexual femenina sintética para atraer plagas de machos, p. ej., polillas, en una estrategia de atracción y muerte, se debe matar un gran número de polillas macho durante periodos prolongados de tiempo para reducir los apareamientos y la reproducción, y finalmente suprimir la población de la plaga. El enfoque de atracción y muerte puede ser una alternativa favorable a la captura masiva porque no se requiere el servicio de trampas u otro de mantenimiento frecuente. En varias realizaciones descritas en el presente documento, un microorganismo recombinante puede coexpresar (i) una ruta para la producción de una feromona de insecto, y (ii) una proteína, péptido, oligonucleótido o molécula pequeña que es tóxica para el insecto. De esta manera, el microorganismo recombinante puede coproducir sustancias adecuadas para usar en un enfoque de atracción y muerte.
Como resultará evidente para un experto en la técnica, la cantidad de una feromona o composición de feromona usada para una aplicación particular puede variar dependiendo de varios factores tales como el tipo y nivel de infestación; el tipo de composición usada; la concentración de los componentes activos; cómo se proporciona la composición, por ejemplo, el tipo de dispensador usado; el tipo de ubicación que se va a tratar; el tiempo durante el que se va a usar el método; y factores ambientales tales como temperatura, velocidad y dirección del viento, lluvia y humedad. Los expertos en la técnica podrán determinar una cantidad eficaz de una feromona o composición de feromonas para usar en una aplicación dada.
Como se usa en el presente documento, una "cantidad eficaz" significa la cantidad de la composición de feromonas descrita que es suficiente para afectar a los resultados deseados. Una cantidad eficaz se puede administrar en una o más administraciones. Por ejemplo, una cantidad eficaz de la composición se puede referir a una cantidad de la composición de feromonas que es suficiente para atraer a un insecto dado a un lugar determinado. Además, una cantidad eficaz de la composición se puede referir a una cantidad de la composición de feromonas que es suficiente para interrumpir el apareamiento de una población de insectos particular de interés en una localidad dada.
Ejemplos
Ejemplo profético 1. Producción de productos de feromonas a partir de ácido gondoico obtenido enzimáticamente por metátesis y conversión química
Este ejemplo profético ilustra que se pueden usar diferentes ácidos grasos como material de partida para la producción biosintética de una feromona o precursor de feromona. El producto obtenido del procedimiento biosintético descrito en el presente documento se puede someter a conversiones químicas adicionales para generar diferentes productos.
Figure imgf000068_0001
El alargamiento enzimático de dos carbonos del ácido oleico produce ácido gondoico. Después de esterificación, el éster metílico del ácido graso gondoico (FAME) se puede convertir luego mediante metátesis de olefinas selectiva de Z en productos FAME C16 y C18 que contienen una insaturación C11. Tras la reducción del éster, se pueden producir materiales de feromonas de aldehído y alcohol graso. La acetilación del producto de alcohol graso puede generar las feromonas de acetato graso correspondientes. Además, el ácido gondoico se puede convertir directamente en feromonas de aldehído, alcohol y acetato graso C20 mediante la aplicación de la misma transformación química del ácido oleico modificado enzimáticamente.
Ejemplo profético 2: Mezclas sintéticas adaptadas
Este ejemplo profético ilustra que los microorganismos recombinantes descritos en el presente documento se pueden usar para crear mezclas sintéticas de feromonas de insectos.
Figure imgf000069_0001
Como se muestra en el esquema anterior, usando tetradecil-ACP (14:ACP), se puede producir una mezcla de feromonas de acetato de E- y Z-tetradecenilo (E11-14:OAc y Z11-14:OAC) con el microorganismo recombinante. Esta mezcla es producida por una variedad de insectos, p. ej., Choristoneura roseceana (una polilla de la familia Tortricidae).
De forma similar, usando hexadecil-ACP (16:ACP), se puede producir una mezcla de feromonas de acetato de Z- y E-hexadecenilo (E11 -16:OAc y Z11 -16:OAc) con el microorganismo recombinante.
El microorganismo se puede manipular con diferentes desaturasas u otras enzimas como reductasas, etc. para producir la mezcla deseada de feromonas. Una mezcla de particular relevancia que se puede producir usando los microorganismos recombinantes y los métodos de la presente invención es una relación 97:3 de (Z)-11-hexadecenal (Z11-16:Ald) y (Z)-9-hexadecenal (Z9-16:Ald).
Ejemplo 3: Expresión de reductasas formadoras de alcohol transmembrana en S. cerevisiae
Antecedentes y fundamento
La producción microbiana de ingeniería de alcoholes grasos de insectos a partir de ácidos grasos implica la expresión funcional de una ruta sintética. Una de dichas rutas comprende una desaturasa transmembrana y una reductasa formadora de alcohol para mediar la conversión de acil graso-CoA en acil graso insaturado-CoA regio- y estereoespecífico, y posteriormente en alcoholes grasos. Una serie de genes que codifican estas enzimas se encuentran en algunos insectos (así como en algunas microalgas en el caso de la alcohol graso reductasa) y se pueden usar para construir la ruta sintética en levaduras, que son hospedantes de producción preferidos. Se cribará una serie de variantes de desaturasas transmembrana y reductasas formadoras de alcohol para identificar conjuntos que permitan la síntesis de alto nivel de un solo alcohol graso de insecto o una mezcla de alcoholes grasos. Además, estas enzimas se cribarán en múltiples hospedantes (Saccharomyces cerevisiae, Candida tropicalis y Yarrowia lipolytica) para optimizar la búsqueda para encontrar un hospedante adecuado para la expresión óptima de estas proteínas transmembrana.
Resumen del enfoque
Se seleccionaron tres reductasas formadoras de alcohol procedentes de insecto.
Los ácidos nucleicos que codifican las reductasas se sintetizaron (sintones) con optimización de codones para la expresión en S. cerevisiae.
Cada ácido nucleico que codifica una reductasa dada se subclonó en un casete de expresión episomal bajo el promotor de Gal1.
S. cerevisiae de tipo natural y mutante por deleción de beta-oxidación se transformaron con construcciones de expresión.
La proteína heteróloga era inducida por galactosa y la expresión funcional de las reductasas se evaluó in vivo por bioconversión de ácido Z11 -hexadecenoico en Z11 -hexedecenol.
Se usó el análisis de GC-MS para identificar y cuantificar los metabolitos.
Resultados
Se cribaron las variantes de reductasa formadoras de alcohol según su actividad en S. cerevisiae W303 (tipo natural) y BY4742 APOX1 (mutante por deleción de beta-oxidación). Se eligió ácido Z11-hexadecenoico como sustrato para evaluar la actividad enzimática. El ensayo de bioconversión in vivo mostraba que la expresión de las variantes enzimáticas derivadas de Spodoptera littoralis, Helicoverpa armígera y Agrotis segetum (Ding, B-J., Lofstedt, C. Analysis of the Agrotis segetum pheromone gland transcriptome in the light of sex pheromone biosynthesis. BMC Genomics 16:711 (2015)) en W303A confería la producción de Z11-hexadecenol y alcanzaba hasta ~37 pM (8 mg/l), ~70 pM (~16 mg/l), y 11 pM (~3 mg/l), respectivamente, en el plazo de 48 h de la inducción de proteína (Figura 5 y Figura 6). El Z11-hexadecenol producido biológicamente se correspondía con el Z11-hexadecenol de referencia auténtico (Bedoukian) determinado por GC-MS (Figura 7). BY4742 APOX1 también se exploró como un hospedante de expresión puesto que la deleción en la enzima de la ruta de beta-oxidación clave podía limitar la degradación del ácido Z11 -hexadecenoico. Sin embargo, la expresión de las variantes de reductasa en el mutante de deleción de betaoxidación, reducía el título de producto cuando se comparaba con la expresión en el hospedante de tipo natural (Figura 5). Un factor que contribuye a la reducción del título cuando se usa BY4742 APOX1 como hospedante era la reducción de biomasa en comparación con W303 (Figura 8).
Por lo tanto, la expresión funcional de al menos dos reductasas formadoras de alcohol en S. cerevisiae confería bioconversión del ácido Z11 -hexadecenoico en Z11 -hexedecenol.
Conclusiones
Se demostró la expresión funcional de la reductasa formadora de alcohol transmembrana de insecto en S. cerevisiae. Entre las reductasas ensayadas, la variante derivada de Helicoverpa armigera es la más activa frente al ácido Z11 -hexadecenoico.
Se puede explorar la bioconversión de otros sustratos ácidos grasos para evaluar la plasticidad de las enzimas.
Materiales y métodos
Construcción de la cepa y ensayo de expresión funcional
Se usaron S. cerevisiae W303 (MATA ura3-1 trp1-1 leu2-3_112 his3-11_15 ade2-1 can1-100) y BY4742 (MATa POX1 ::kanMX his3A1 leu2A0 lys2A0 ura3A0) como hospedantes de expresión. Las secuencias de ADN que codifican variantes de reductasa de alcohol graso se rediseñaron para optimizar la expresión en S. cerevisiae (SEQ ID NO: 1­ 3). Los sintones generados (Genscript) se clonaron en el vector pESC-URA usando sitios BamHI-Xhol para facilitar la expresión de proteínas usando el promotor de Gal1. Las construcciones de plásmidos resultantes se usaron para transformar W303, y los transformantes positivos se seleccionaron en medio de agar CM (con glucosa al 2% y sin uracilo) (Teknova). Para evaluar la expresión funcional, se usaron dos clones de transformación positiva que se han cultivado en parches en medio de agar CM (con glucosa al 2% y sin uracilo) para sembrar medio líquido CM usando un formato de placa de 24 pocillos profundos. Para inducir la expresión de proteínas, los cultivos durante la noche que habían crecido a 28°C después se suplementaron con galactosa, rafinosa e YNB hasta una concentración final de 2%, 1% y 6,7 g/l, respectivamente. Después de 24 h de la inducción de proteínas, se añadió el sustrato de bioconversión el ácido Z11 -hexadecenoico (en etanol) o ácido heptadecanoico (en etanol) hasta una concentración final de 300 mg/l. El ensayo de bioconversión procedió durante 48 horas a 28°C antes del análisis por GC-MS.
Extracción de metabolitos y detección por GC-MS
Los lípidos se extrajeron de acuerdo con un procedimiento modificado de Hagstrom et al. (2012) (Hagstrom, Á. K., Liénard, M. A., Groot, A. T., Hedenstrom, E. y Lofstedt, C. "Semi-Selective Acil graso Reductases from Four Heliothine Moths Influence the Specific Pheromone Composition". PLoS One 7: e37230 (2012)). Se transfirieron 1,5 ml de cultivo celular a un tubo Falcon de 15 ml. La suspensión celular se acidificó con 1 ml de HCl 5 N. Se añadieron 5 pl de ácido tetradecanodioico (10 mM en etanol) como referencia interna. La mezcla se extrajo por adición de 1,5 ml de hexano, y después agitando durante 1 h a 37°C, 250 rpm. Para facilitar la separación de fases, la muestra se centrifugó durante 10 min a 2000 g. Después, se transfirió 1 ml de la fase orgánica de hexano a un tubo de plástico de 1,5 ml. El disolvente se separó calentando la muestra 30 min a 90°C. Después de evaporar la muestra a sequedad, se añadieron 50 pl de BSTFA (N,0-bis(trimetilsililo)-trifluoroacetamida que contiene 1% de trimetilclorosilano). Los tubos de plástico de 1,5 ml se agitaron vigorosamente dos veces durante 10 s. Antes de la transferencia a un vial de vidrio GC con tapón de rosca que contenía un inserto de vidrio, la muestra se centrifugó durante 1 min (13000 rpm). Los viales se taparon y se calentaron durante 30 min a 90°C. Posteriormente los ésteres de trimetilsililo que se generaron por este método, se analizaron por análisis de GC-MS. Los parámetros de GC-MS se especifican en la Tabla 6. El uso del modo SIM (producto característico e iones IS) aumenta la sensibilidad de detección al reducir el ruido de fondo, permitiendo una detección del producto tan baja como de 2,4 pM (0,6 mg/l). Una reducción adicional en la relación de división ofrece la posibilidad de aumentar aún más la sensibilidad para aplicaciones futuras. Se usó la curva de calibración de Z11-hexadecenol mostrada en la Figura 9 para cuantificar el Z11-hexadecenol producido de levaduras. También se ensayó la bioconversión del ácido heptadecanoico, ya que el producto heptadecanol, fácilmente distinguible, se podría usar como referencia para las pruebas de GC-MS con éxito. Sin embargo, ninguna de las reductasa ensayadas mostraba actividad hacia el ácido heptadecanoico.
Tabla 6. Parámetros de GC-MS
Sistema Agilent 6890 N GC, ChemStation G1701EA E.02.01.1177
Columna Rtx-530m x 320 pm x 25 pm
Presión = 0,82 kg/cm2 (11,74 psi); Flujo = 7,1 ml/min
Entrada Calentador = 250°C; Presión = 0,82 kg/cm2 (11,74 psi);
Flujo total {He} = 19,5 ml/min
Portador He a 147 cm/s, 0,82 kg/cm2 (11,74 psi)
Señal Velocidad de datos = 2 Hz/0,1 min
Horno 150°C durante 1 min
Rampa 12°C/min a 220°C, mantenimiento 3 min
Rampa 35°C/min a 300°C, mantenimiento 4 min
Inyección División, 250°C
Relación de división - 20:1
Detector HP 5973 MSD en modo SIM (m/z: 297,3 y 387,3),
Permanencia 100 ms, modo EMV: Factor de ganancia 1,
retraso de disolvente 3 min, 8,33 ciclos/s|
Muestra Volumen de inyección = 1 ul
Ejemplo 4: Expresión de desaturasas transmembrana en S. cerevisiae
Antecedentes y fundamento
La producción microbiana de ingeniería de alcoholes grasos de insectos a partir de ácidos grasos requiere la expresión funcional de una ruta sintética. Una de dichas rutas comprende una desaturasa transmembrana y una reductasa formadora de alcohol para mediar la conversión de acil graso-CoA en acil graso insaturado-CoA regio- y estereoespecífico, y posteriormente en alcoholes grasos. En algunos insectos, así como en algunas microalgas, se encuentran una serie de genes que codifican estas enzimas. Se cribará una serie de desaturasas transmembrana y variantes de reductasa formadoras de alcohol para identificar conjuntos que permitan la síntesis de alto nivel de un solo alcohol graso de insecto o una mezcla de alcoholes grasos. Además, estas enzimas se cribarán en múltiples hospedantes (Saccharomyces cerevisiae, Candida tropicalis y Yarrowia lipolytica) para optimizar la búsqueda para encontrar un hospedante adecuado para la expresión óptima de estas proteínas transmembrana.
Resumen del enfoque
Se seleccionó un pequeño conjunto de desaturasas (procedentes de insectos: Agrotis segetum, Trichoplusia ni, Amyelois transitella, Helicoverpa zea, y diatomea marina: Thalassiosira pseudonana) como caso de prueba para explorar y establecer ensayos de expresión funcional, métodos de extracción de metabolitos y química analítica.
Se construyó un casete sintético para la expresión de las desaturasas en S. cerevisiae. El casete consiste en la región del promotor de OLE1, la secuencia líder N-terminal de OLE1 y el terminador de VSP13.
Se ensayó la funcionalidad del casete de expresión mediante la expresión de una variante de GFP. La validación del casete permitió su uso para explorar la expresión de la desaturasa de insectos.
DOLE1 de S. cerevisiae se transformó con construcciones de expresión que contenían desaturasas heterólogas. La funcionalidad de las desaturasas se evaluó por la capacidad para rescatar el crecimiento de DOLE1 sin la complementación exógena de ácidos grasos insaturados (UFA). Se usó la desaturasa de S. cerevisiae (OLE1) como control positivo de la complementación satisfactoria.
La funcionalidad de la desaturasa se validó mediante una bioconversión in vivo de ácido hexadecanoico (ácido palmítico) en ácido (Z)-11-hexadecenoico (ácido palmitvaccénico).
Se usó el análisis de GC-MS para identificar y cuantificar los metabolitos.
Resultados
Las variantes de desaturasa transmembrana se cribaron en S. cerevisiae. Inicialmente se ensayaron tres variantes para explorar y establecer ensayos de expresión funcional, métodos de extracción de metabolitos y química analítica. Para permitir la expresión funcional de estas desaturasas en S. cerevisiae, se construyó un casete de expresión sintético episomal denominado casete pOLEI (Figura 10), que consistía en una región promotora de OLE1, una secuencia líder N-terminal que codifica los primeros 27 aminoácidos de OLE1 de S. cerevisiae, y una región de terminación de VPS13 (una proteína implicada en la formación de la membrana de protosporas, cuyo terminador se ha caracterizado previamente para aumentar la expresión de proteínas heterólogas potencialmente al extender la semivida del ARNm). La funcionalidad del casete pOLE1 se validó por su capacidad para expresar una GFP (Figura 11A-Figura 11 E). Posteriormente, se clonaron sintones de desaturasa de insecto y sintón de OLE1 de levadura en el casete pOLE1 y se expresaron en la cepa AOLE1 de S. cerevisiae.
Se eligió esta cepa ya que la deleción del alelo de OLE1 (que codifica palmitoil:CoA/estearoil:CoA (z)-9-desaturasa) permite su uso como herramienta para el cribado de la desaturasa de insecto funcional. Específicamente, una desaturasa activa permitiría la complementación del crecimiento sin requerir la complementación exógena de UFA. La expresión de OLE1 usando el casete pOLE1 complementó el crecimiento del crecimiento de DOLE1 sin UFA (Figura 11A-Figura 11 E); por lo tanto, sirve como control positivo en los ensayos de complementación. Cuando se expresaron las desaturasas de insectos, se observó que rescataban el crecimiento de DOLE1 sin UFA en diversos grados. En una placa de agar de medio rico (YPD), la expresión de OLE1 de S. cerevisiae confería el nivel más alto de crecimiento, seguido de la desaturasa de T. ni (Figura 12A). Este último indicaba que la producción de acil graso insaturado:CoA por la desaturasa de T. ni podría actuar como un sustituto de la biosíntesis que falta de (Z)-9-hexadecenoil:CoA en DOLE1. La expresión de las desaturasas de T. pesudonana y A. segetum no parecía rescatar muy bien el crecimiento en YPD (Figura 12A). Cuando se sembró en parches en una placa de agar de medio mínimo (CM-Ura con glucosa), solo la expresión de OLE1 de S. cerevisiae y la desaturasa de T. ni rescató el crecimiento de DOLE1 sin UFA exógeno (Figura 12B). La expresión de desaturasas de T. pesudonana y A. segetum no confería crecimiento de DOLE1 en agar de medio mínimo, lo que sugiere su actividad limitada en la producción de UFA (resultados no mostrados). El cribado de una biblioteca de desaturasas en Candida tropicalis identificó la expresión funcional de las desaturasas de A. transitella y H. zea. Cuando estas desaturasas se expresaron en DOLE1, conferían crecimiento sin UFA en los medios tanto YPD como CM-Ura con glucosa similar a la expresión de la desaturasa T. ni (Figura 12B).
La expresión funcional de las desaturasas heterólogas se caracterizó además por bioconversión in vivo de ácido palmítico en UFA específico de insecto. Después del cultivo de ~96 h en medio mínimo que contenía ácido palmítico, el análisis de ácidos grasos totales de DOLE1 de S. cerevisiae que expresaba desaturasa de T. ni puso de manifiesto la producción de una nueva especie de ácido graso, el ácido (Z)-11-hexadecenoico que no está presente en la cepa de control que expresa la desaturasa OLE1 de levadura nativa (Figura 13A-Figura 13B). El ácido (Z)-11 -hexadecenoico no se detecta en cepas que expresan desaturasa de A. segetum o T. pseudonana (resultados no mostrados). Además del ácido (Z)-11-hexadecenoico, también se detectó ácido (Z)-9-hexadecenoico en la cepa DOLE1 que expresa desaturasa de T. ni (Figura 13A-Figura 13B). En las condiciones de cultivo, los ácidos grasos C16 en DOLE1 que expresa la desaturasa de T. ni están compuesto por aproximadamente 84,7% de ácido hexadecanoico, 5,6% de ácido (Z)-9-hexadecenoico y 9,8% de ácido (Z)-11-hexadecenoico. En comparación, la fracción de ácido graso C16 de DOLE1 que expresa la desaturasa OLE1 está compuesta de aproximadamente 68,6% de ácido hexadecanoico y 31,4% de ácido (Z)-9-hexadecenoico. La biosíntesis del ácido (Z)-11-hexadecenoico en DOLE1 que expresa la desaturasa de T. ni representa ~1,5 mg/l. Se puede cuantificar la cantidad de ácidos grasos totales y de cada ácido graso dentro de esta mezcla. El ácido (Z)-11 -hexadecenoico producido biológicamente también coincide con el tiempo de retención y el patrón de fragmentación del ácido (Z)-11-hexadecenoico de referencia auténtico (Larodan), determinado por GC-MS (Figura 14A-Figura 14B). Por lo tanto, se confirmó el regio- y estereoisómero del ácido (Z)-11-hexadecenoico producido biológicamente. También se puede realizar la caracterización in vivo de la desaturasa de A. transitella y H. zea.
En resumen, se identificaron al menos tres desaturasas de insectos capaces de rescatar el crecimiento de DOLE1 de S. cerevisiae sin complementación exógena de UFA, es decir, ácido (Z)-9-hexadecenoico (ácido palmitoleico).
El grado de crecimiento en medio rico (YPD) de la construcción de expresión que lleva DOLE1 de S. cerevisiae fue en el siguiente orden de contenido de desaturasa: OLE1, T. ni, T. pseudonana y A. segetum.
El grado de crecimiento en medio mínimo (CM con glucosa sin uracilo) de la construcción de expresión que lleva DOLE1 de S. cerevisiae fue en el siguiente orden de contenido de desaturasa: OLE1, T. ni.
También se realizaron ensayos de complementación usando desaturasas de A. transitella y H. zea, demostrando expresión funcional en Candida tropicalis mediante ensayo de bioconversión in vivo. Estas desaturasas también complementaron el crecimiento de DOLE1 de S. cerevisiae en medios rico y mínimo al menos tan bien como la desaturasa de T. ni.
La expresión de desaturasas de T. pseudonana y A. segetum no confirió crecimiento de DOLE1 de S. cerevisiae en medio mínimo sin UFA incluso después de un periodo de incubación prolongado de hasta 14 días. No se observó ácido (Z)-11 -hexadecenoico en cepas que albergaban desaturasa de T. pseudonana o A. segetum.
Conclusiones
Se ha logrado la expresión funcional de desaturasas transmembrana procedentes de insectos en S. cerevisiae.
La actividad de una desaturasa heteróloga determinada se puede evaluar por su capacidad para complementar el crecimiento de DOLE1 de S. cerevisiae sin suplementos palmitoleicos exógenos y su capacidad para convertir el ácido palmítico en precursores de feromonas de insectos ácido (Z)-11-hexadecenoico.
La expresión funcional y/o actividad de la desaturasa de insecto en S. cerevisiae varía ampliamente dependiendo del origen de la secuencia. Las variantes derivadas de T. ni presentaban la mejor actividad en comparación con A. segetum y T. pseudonana, según lo medido por los criterios anteriores.
Las desaturasas derivadas de A. transitella y H. zea complementaron DOLE1 así como la desaturasa de T. ni. Se pueden hacer ensayos de bioconversión usando estas desaturasas.
Se puede explorar la bioconversión de otros sustratos de ácidos grasos para evaluar la plasticidad enzimática.
Materiales y métodos
Construcción de cepas y ensayo de expresión funcional
Se usó DOLE1 (MATA OLE1 ::LEU2 ura3-52 his4) de S. cerevisiae como hospedante de expresión. Se creó un casete de expresión sintético denominado pOLE1 (Figura 10, SEQ ID NO: 4) que comprende la región promotora de OLE1 (SEQ ID NO: 5 y 6), nucleótidos que codifican 27 aminoácidos N-terminales de la secuencia líder de OLE1 (SEQ ID NO :7), y una secuencia de terminador de VPS13 (SEQ ID NO: 8) y se clonó en el vector pESC-URA entre los sitios SacI y EcoRI. Para ensayar la funcionalidad del casete pOLE1, se insertó el sintón de GFP Dasher entre los sitios Spel y NotI para crear el plásmido pOLE1-GFP. Se transformó DOLE1 competente con pOLE1-GFP y se cultivó en una placa de agar de CM-Ura con glucosa (Teknova) que contenía UFA (la placa de agar de CM-URA con glucosa de 20 mm se recubrió con 100 gl de medio CM-Ura con glucosa que contenía tergitol al 1% y 3 gl de ácido palmitoleico). Después de la incubación a 30°C durante 5 días, la expresión de GFP Dasher era evidente como se muestra por la coloración verde de los transformantes de DOLE1. Este resultado mostraba que el casete pOLE1 era capaz de impulsar la expresión de proteínas heterólogas. La validación de la complementación de DOLE1 se realizó restableciendo la actividad de OLE1. Específicamente, se insertó el sintón de OLE1 de S. cerevisiae nativo en el casete pOLE1 desprovisto de la secuencia líder para crear el plásmido pOLE1-OLE1. Después de la transformación de DOLE1, y selección en agar CM-Ura con glucosa que contenía UFA, se sembraron en parches colonias individuales en YPD y CM-Ura con glucosa sin UFA. Después de incubación a 30°C durante 5 días, se observó crecimiento (Figura 11A-Figura 11E). Como se esperaba, la expresión de GFP Dasher no podía complementar el crecimiento de DOLE1 sin UFA (Figura 11A-Figura 11E). Se sintetizaron secuencias de ADN que codifican variantes de desaturasa (para incluir cambios de nucleótidos que eliminan sitios de restricción usados con fines de clonación) y se clonaron en pOLE1 usando sitios Spel-Notl (Genscript, SEQ ID NO: 9-13). El ensayo de complementación de DOLE1 con desaturasas de insectos se realizó de la misma forma que con la desaturasa OLE1.
Para evaluar la expresión funcional, se inocularon dos clones de transformación positiva que se habían sembrado en parches en medio agar CM-Ura con glucosa que contenían UFA en 1,5 ml de medio líquido CM-Ura con glucosa que contenía ácido palmítico (en etanol) en una concentración final de 300 mg/l y con 6,7 g/l de YNB. Para la confirmación del isómero (z)-11-hexadecenoico, se generó un cultivo de 20 ml. El ensayo de bioconversión se llevó a cabo durante 96 h a 28°C antes del análisis de Gc -MS.
Extracción de metabolitos y detección por GC-MS
La composición de lípidos totales, así como la cuantificación del ácido (Z)-11-hexadecenoico, se basó en procedimientos modificados de Moss et al. (1982) (Moss, C. W., Shinoda, T. y Samuels, J. W. "Determination of celular fatty acid compositions of various yeasts by gas-liquid chromatography". J. Clin. Microbiol. 16: 1073-1079 (1982)) y Yousuf et al. (2010) (Yousuf, A., Sannino, F., Addorisio, V. y Pirozzi, D. "Microbial Conversion of Olive Oil Mill Wastewaters into Lipids Suitable for Biodiesel Production". J. Agric. Food Chem. 58: 8630-8635 (2010)). Las células sedimentadas (en tubos de plástico de 1,5 ml), normalmente de aproximadamente 10 mg a 80 mg, se resuspendieron en metanol que contenía hidróxido de sodio al 5% (p/p). La suspensión alcalina de células se transfirió a un vial de GC con tapón de rosca de 1,8 ml. La mezcla se calentó durante 1 h en el bloque de calentamiento a 90°C. Antes de la acidificación con 400 de HCl 2,5 N, el vial se dejó enfriar a temperatura ambiente. Se añadieron 500 gl de cloroformo que contenía heptadecanoico 1 mM y la mezcla se agitó enérgicamente, después se transfirieron tanto la fase acuosa como la orgánica a un tubo de plástico de 1,5 ml. La mezcla se centrifugó a 13.000 rpm, después se transfirieron 450 gl de la fase orgánica a un nuevo tubo de plástico de 1,5 ml. La fase acuosa se extrajo una segunda vez con 500 gl de cloroformo, esta vez sin ácido heptadecanoico. Las fases orgánicas combinadas se evaporaron a 90°C. Después de enfriar a temperatura ambiente, los ésteres metílicos de ácidos grasos residuales y los ácidos grasos libres se disolvieron y derivatizaron en metanol que contenía TMSH 0,2 M (hidróxido de trimetilsulfonio).
Se determinó la regioselectividad del ácido (Z)-11 - hexadecenoico producido biológicamente comparando los patrones de fragmentación del derivado de disulfuro de dimetilo (DMDS) con el derivado de DMDS de una referencia auténtica. Un cultivo de levaduras se dividió en 12 partes alícuotas (para no cambiar ningún parámetro en el procedimiento desarrollado). Las células se sedimentaron, lo que dio 63 mg de células (ccw) en promedio (755 mg a partir de 18 ml de cultivo). Los sedimentos se sometieron a metanólisis básica como se ha descrito antes. Sin embargo, después de acidificación, las muestras se combinaron en un tubo Falcon de 50 ml. La muestra combinada se extrajo dos veces con 10 ml de cloroformo. La mezcla se centrifugó 10 min a 3000 rpm para lograr una mejor separación de fases. Las fases orgánicas combinadas, que se combinaron en un Falcon de 50 ml nuevo, se lavaron consecutivamente con 10 ml de salmuera y 10 ml de agua. La fase orgánica se secó con sulfato de sodio anhidro y se concentró al vacío. El aceite concentrado se disolvió en 1,5 ml de cloroformo y se transfirió a un tubo de plástico de 1,5 ml. El cloroformo se evaporó a 90°C. La muestra restante se disolvió en 50 pl de éter de metilo y terc-butilo (MTBE). Los 50 pl se dividieron en 1,5, 10 y 20 pl y se transfirieron a viales de GC sin inserto. A cada vial se le añadieron 200 pl de DMDS (disulfuro de dimetilo) y 50 pl de MTBE (que contenía 60 mg/ml de yodo). Después de calentar la mezcla durante 48 horas a 50°C, se eliminó el exceso de yodo por adición de 100 pl de solución saturada de tiosulfato de sodio. Las muestras se transfirieron a viales de plástico y se extrajeron en veces con 500 pl de diclorometano. Las fases orgánicas combinadas se transfirieron a un nuevo vial de plástico de 1,5 ml y se evaporaron a 90°C. Las muestras se recogieron en 50 pl de DCM y se transfirieron a un vial de GC. La muestra se analizó por GC-MS (Tabla 7) usando el método de Hagstrom et al. (2013) (Hagstrom, Á. K. et al. "A moth pheromone brewery: production of (Z)-11-hexadecenol by heterologous co-expression of two biosynthetic genes from a noctuid moth in a yeast cell factory". Microb. CellFact. 12: 125 (2013)).
Tabla 7. Parámetros analíticos para el análisis por GC-MS de derivados de DMDS
Sistema Agilent 6890 N GC, ChemStation G1701EA E.02.01.1177
Columna Rtx-530m x 320 pm x 25 pm
Presión = 0,82 kg/cm2 (11,74 psi); Flujo = 7,1 ml/min
Entrada Calentador = 250°C; Presión = 0,82 kg/cm2 (11,74 psi);
Flujo total {He} = 19,5 ml/min
Portador He a 147 cm/s, 0,82 kg/cm2 (11,74 psi)
Señal Velocidad de datos = 2 Hz/0,1 min
Horno 80°C durante 2 min
Rampa 10°C/min a 180°C
Rampa 3°C/min a 260°C
Rampa 20°C/min a 280°C, mantenimiento 10 min
Inyección División, 250°C
Relación de división - 1:1
Detector HP 5973 MSD en modo SCAN (intervalo de masa: de 41 a 550 uma)
Permanencia 100 ms, modo EMV: Factor de ganancia 1,
retraso de disolvente 3 min, 8,33 ciclos/s
Muestra Volumen de inyección = 1 ul
Ejemplo 5: S. cerevisiae como una plataforma de producción para la síntesis de alcoholes grasos de insectos
Antecedentes y fundamento
La producción microbiana de ingeniería de alcoholes grasos de insectos a partir de ácidos grasos requiere la expresión funcional de una ruta sintética. Una de dichas rutas comprende una desaturasa transmembrana y una reductasa formadora de alcohol para mediar la conversión de acil graso-CoA en acil graso insaturado-CoA regio- y estereoespecífico, y posteriormente en alcoholes grasos. En algunos insectos, así como en algunas microalgas, se encuentran una serie de genes que codifican estas enzimas. Se cribará una serie de variantes de genes para identificar actividades enzimáticas que permitan la síntesis de alto nivel de uno solo o una mezcla de alcoholes grasos de insecto. Además, estas enzimas se cribarán en múltiples hospedantes (Saccharomyces cerevisiae, Candida tropicalis y Yarrowia lipolytica) con el fin de encontrar un hospedante adecuado para la expresión óptima de estas proteínas transmembrana.
Resumen del enfoque
S. cerevisiae se modificó previamente para expresar variantes de desaturasa transmembrana funcionales seleccionadas para permitir la síntesis de ácido (Z)-11-hexadecenoico a partir de ácido palmítico. Esto permitió la identificación y clasificación jerárquica de las variantes en función de su rendimiento de bioconversión (véase el ejemplo 4).
S. cerevisiae se modificó previamente para expresar variantes de reductasa transmembrana funcionales seleccionadas para permitir la síntesis de (Z)-11-hexadecenol (Z11-16OH) a partir de ácido (Z)-11-hexadecenoico. Esto permitió la identificación y clasificación jerárquica de las variantes en función de su rendimiento de bioconversión (véase el ejemplo 3).
Se ensamblaron varias rutas de alcoholes grasos compuestas por las variantes más activas de desaturasas y reductasas identificadas en los cribados previos.
W303A y DOLE1 de S. cerevisiae se transformaron con las construcciones de la ruta. La funcionalidad de la ruta se evaluó por la capacidad de las levaduras recombinantes para sintetizar Z11 -16OH a partir de ácido palmítico.
Se usó análisis de GC-MS para identificar y cuantificar los metabolitos.
Resultados
El objetivo era modificar una o más rutas biosintéticas de alcohol graso de insectos en S. cerevisiae. Previamente, se demostró la expresión funcional de varias desaturasas transmembrana de insecto en S. cerevisiae (véase el ejemplo 4). Brevemente, la expresión de desaturasa heteróloga se permitió diseñando un casete de expresión que consiste en una región promotora de OLE1, una secuencia líder N-terminal que codifica los primeros 27 aminoácidos de OLE1 de S. cerevisiae y una región terminadora de VPS13. El cribado de desaturasas activas se hizo mediante dos enfoques. Primero, se cribaron desaturasas activas según su capacidad para rescatar el crecimiento de DOLE1 sin la adición exógena de ácido graso insaturado (UFA), y segundo, se cribaron las desaturasas activas por un cribado in vivo para la bioconversión de ácido palmítico en ácido (Z)-11-hexadecenoico. Estas estrategias de cribado permitieron la identificación de varias variantes activas y la clasificación en orden de su actividad relativa. Basándose en estos resultados de cribado, se seleccionaron desaturasas de Trichoplusia ni (TN_desat) y S. cerevisiae (SC_desat) para la expresión combinatoria en rutas de alcoholes grasos. Se sabe que la desaturasa de S. cerevisiae forma ácido palmitoleico y ácido oleico.
La expresión funcional de varias reductasas formadoras de alcohol transmembrana de insecto en S. cerevisiae también se había demostrado previamente (véase el ejemplo 3). Se usó un casete de expresión que comprendía el promotor de GAL1 y el terminador de CYC para permitir la expresión funcional de las reductasas en S. cerevisiae. El cribado de varias reductasas por bioconversión in vivo de ácido (Z)-11-hexadecenoico en Z11-16OH permitió la identificación de variantes activas y la clasificación en orden de su actividad relativa. Basándose en este cribado, se eligieron reductasas de Helicoverpa armígera (HA_reduc), y Spodoptera littoralis (SL_reduc) para el ensamblaje de las rutas de alcoholes grasos.
El ensamblaje combinatorio creó cuatro rutas de alcohol graso, es decir, TN_desat - HA_reduc, TN_desat - SL_reduc, SC_desat - HA_reduc, y SC_desat - SL_reduc. Las rutas con SC_desat sirvieron como control negativo para la síntesis de Z11-16OH de insecto. DOLE1 y W303A de S. cerevisiae se transformaron con construcciones que albergaban estas rutas, y se aislaron los transformantes que crecieron en CM-Ura con glucosa al 2% y recubiertos con ácido palmitoleico. Para ensayar la producción de alcohol graso, se inocularon clones individuales en medio CM-Ura que contenía glucosa al 2%, rafinosa al 1% y galactosa al 2%. Se añadieron 300 mg/l de ácido palmítico y 360 mg/l de ácido palmitoleico como sustratos de bioconversión. También se ensayó la bioconversión usando ácido palmítico sin palmitoleico. Después del cultivo de ~96 h en presencia de ácido palmítico y palmitoleico, el análisis del caldo de cultivo puso de manifiesto la síntesis de Z11-9OH como un producto de alcohol C16 principal en ~0,2 mg/l y ~0,3 mg/l en el cultivo de cepas de DOLE1 que albergan SC_desat-HA_reduc y TN_desat-HA_reduc, respectivamente (Figura 15, Figura 16). También se detectó una cantidad mínima de Z11-16OH en las rutas con desaturasa de T. ni o S. cerevisiae, y reductasa de H. armigera. En general, se esperaba que en presencia de ácido palmítico y ácido palmitoleico, la síntesis de Z9-16OH fuera más favorable que la síntesis de Z11-16OH porque el ácido (Z)-11-hexadecenoico se debe biosintetizar a partir de la desaturasa de T. ni, mientras que la adición exógena de ácido palmitoleico daba como resultado un sustrato más fácilmente disponible para la síntesis de Z9-16OH. También se llevó a cabo el análisis de ácidos grasos. Los resultados mostraban una mayor acumulación de ácido (Z)-11-hexadecenoico (Figura 17) en las rutas que contenían desaturasa de insecto que en las rutas que expresaban desaturasa de S. cerevisiae. Aunque en cantidades mínimas, la detección de Z11-16OH y ácido (Z)-11-hexadecenoico de las rutas que albergan la desaturasa de S. cerevisiae (lo cual era inesperado) abre la posibilidad de una actividad de desaturación A11 menor por la desaturasa de S. cerevisiae. La síntesis de bajo nivel de restos de ácido graso Z11 -16COOH también se puede derivar del alargamiento del acilo graso intermedio Z9-14COOH. Los datos mostrados en la Figura 15 también mostraron que en comparación con las rutas con reductasa de H. armigera, la inclusión de reductasa de S. littoralis daba como resultado la reducción de (hasta ~30 veces) en el título de Z9-16OH. No se pudo detectar Z11-16OH en las rutas que emplean reductasa de S. littoralis. Estos resultados están de acuerdo con el ensayo de cribado de reductasa, que mostraba mayor bioconversión del ácido (Z)-11-hexadecenoico usando reductasa de H. armigera en comparación con reductasa de S. littoralis.
La bioconversión del ácido palmítico también se ensayó sola (sin adición exógena de ácido palmitoleico) por cepas de DOLE1 que expresan TN_desat-HA_reduc y TN_desat-SL_reduc (Figura 18). El análisis del caldo de cultivo determinó la síntesis de Z11 -16OH como el producto de ácido graso C16 insaturado dominante (Figura 16). En este ensayo, se sintetizaron hasta 0,22 mg/l y 0,05 mg/l de Z11 -16OH por una ruta que albergaba reductasa de H. armigera y reductasa de S. littoralis, respectivamente. El Z11-16OH biológicamente producido también coincidía con el tiempo de retención y presentaba el pico característico de m/z 297,3 como el Z11-16OH de referencia auténtico según se determina por GC-MS (SIM). Por lo tanto, se confirmó el regio y estereoisómero del Z11 -16OH producido biológicamente (Figura 19). Además, también se observó Z9-16OH (0,01 mg/l) en el cultivo de la cepa que coexpresaba desaturasa de T. ni y reductasa de H. armigera. Esto sugería que la desaturasa de T. ni también puede tener actividad de desaturación A9.
La deleción de OLE1 deteriora el crecimiento. Por lo tanto, también se exploró la ruta de expresión en W303A, un hospedante con el alelo OLE1 intacto. Sin embargo, a pesar de la mejora del crecimiento, la ruta de expresión en este hospedante daba como resultado una reducción de más del doble de los títulos de Z11-16OH. Este resultado probablemente se debía a la represión del promotor de OLE1 (que conducía a la expresión de desaturasa heteróloga) por acil grasos insaturados:CoA endógenos, los productos de OLE1. El promotor de OLE1 de S. cerevisiae se ha caracterizado previamente con regiones estructurales que se ha encontrado que están reguladas positiva y negativamente por ácidos grasos saturados e insaturados, respectivamente (Choi, J-Y. et al. "Regulatory Elements That Control Transcription Activation and Unsaturated Fatty Acid-mediated Repression of the Saccharomyces cerevisiae OLE1 Gene". J. Biol. Chem. 271: 3581-3589 (1996)). Además de la regulación transcripcional en cis, los ácidos grasos insaturados también interaccionan con elementos del promotor de OLE1 para regular la estabilidad del ARNm (Gonzales, C. I. et al. "Fatty Acid-responsive control of mRNA stability. Unsaturated Fatty Acid-induced degradation of the Saccharomyces OLE1 transcript". J. Biol. Chem. 271: 25801-25809 (1996)). Debido a esta complejidad inherente del promotor de OLE1, el uso de promotores ortogonales no regulados, tales como el promotor de OLE1 de S. kluyveri (Kajiwara, S. "Molecular cloning and characterization of the v9 fatty acid desaturase gene and its promoter region from Saccharomyces kluyveri”. FEMS Yeast. Res. 2: 333-339 (2002)) para impulsar la expresión de desaturasa de insecto se puede explorar para mejorar la producción de alcohol graso.
En resumen, la expresión funcional de las variantes de la ruta de feromonas sintéticas en DOLE1 de S. cerevisiae daba como resultado la síntesis de Z11 -16OH y Z9-16OH a partir de ácidos grasos de aceite de palma (ácido palmítico y ácido palmitoleico) hasta aproximadamente 0,2 mg/l y 0,3 mg/l, respectivamente.
La ruta modificada que daba como resultado los alcoholes grasos más altos, está compuesta por desaturasa de T. ni y reductasa de H. armígera.
También se observó acumulación de ácido (Z)-11-hexadecenoico, un intermedio de la ruta, en cepas que producían Z11-16OH.
No se produjo Z11 -16OH y solo se detectaron trazas de Z9-16OH en la cepa de control negativo (solo alberga vector).
La regio- y estereoquímica del Z11-16OH producido biológicamente se confirmaron comparando el tiempo de retención y el patrón de fragmentación con el compuesto de referencia auténtico por GC-MS.
Conclusiones
Se demostró la modificación de levadura de panadería para la síntesis de Z11-16OH y Z9-16OH, precursores de alcoholes grasos de feromonas de insectos.
La producción de alcohol graso varía dependiendo de la selección de las variantes de desaturasa y reductasa.
La acumulación de ácido (Z)-11-hexadecenoico sugería la posibilidad de una mejora adicional del alcohol graso aumentando el rendimiento de la reductasa formadora de alcohol. Sin embargo, también es posible que la detección del ácido (Z)-11-hexadecenoico se deba a su incorporación como fosfolípido en cualquier membrana que no sea la membrana del retículo endoplásmico (tal como membranas mitocondriales, peroxisoma, envuelta nuclear, etc.), por lo tanto inaccesible a reductasa formadora de alcohol (supuestamente translocada al retículo endoplásmico) que debe usar el ácido (Z)-11 -hexadecenoico en su resto de tioéster de CoA como su sustrato.
Se pueden explorar las condiciones de cultivo para aumentar los títulos de alcoholes grasos. La desaturasa de T. ni puede ser reemplazada en la ruta por desaturasa de A. transitella, otra variante que también mostró alta actividad y rescató el crecimiento de DOLE1 más rápido que la desaturasa de T. ni. La ruta sintética se puede importar a Candida tropicalis y Yarrowia lipolytica, que son levaduras con alta propiedad de adherencia a sustratos hidrófobos como el ácido palmítico y palmitoleico. Al aumentar la accesibilidad del sustrato a la plataforma de producción microbiana, es previsible que se puedan mejorar el título y el rendimiento del producto.
Materiales y métodos
Construcción de cepas y ensayo de expresión funcional
Se usaron AOLE1 (MATA OLE1 ::LEU2 ura3-52 his4), y W303A (MATA ura3-1 trp1 -1 leu2-3_112 his3-11_15 ade2-1 can1-100) de S. cerevisiae como hospedantes de expresión. El diseño modular permite el ensamblaje de la ruta combinatoria usando Bam HI y Xhol para escindir sintones de reductasa (véase el ejemplo 3) y subclonar en plásmidos que contienen construcciones pOLE1-desaturasa (véase el ejemplo 4). Se transformaron levaduras competentes con construcciones de la ruta y se sembraron en placas de agar CM-Ura con glucosa (Teknova). En el caso de la transformación de AOLE1, el cultivo en placa de colonias usaba placas de agar CM-Ura con glucosa 20 mM que se recubrieron con 100 pl de medio CM-Ura con glucosa que contiene tergitol al 1% y 3 pl de ácido palmitoleico.
Para evaluar la expresión funcional, los transformantes se inocularon en ~20 ml de medio líquido CM-Ura que contenía 6,7 g/l de YNB, glucosa al 2%, rafinosa al 1% y galactosa al 2%. Se añadieron sustratos de ácidos grasos, es decir, ácido palmítico (en etanol), en una concentración final de 300 mg/l. Se añadió ácido palmitoleico en una concentración final de 360 mg/l. El ensayo de bioconversión se llevó a cabo durante 96 h a 28°C antes del análisis por GC-MS.
Extracción de metabolitos y detección por GC-MS
El análisis de ácidos grasos fue como se describe en el Ejemplo 4, excepto que en lugar de extraer la muestra dos veces, la muestra solo se extrajo una vez con cloroformo que contenía heptadecanoato de metilo 1 mM (C17:0Me). El análisis de alcoholes grasos fue como se describe en el Ejemplo 3, excepto que en lugar de hexano (que contenía ácido tetradecanodioico), se usó cloroformo (que contenía heptadecanoato de metilo 1 mM). El tiempo de extracción se redujo de 1 h a 20 s. A continuación, las muestras se recogieron en un vial de GC de 1,8 ml y no en un tubo de plástico de 1,5 ml. El espectrómetro de masas se usó en modo SIM (m/z 208, 297,3 y 387,3).
Ejemplo 6: Expresión de desaturasas transmembrana en Candida tropicalis
Antecedentes y fundamento
La producción microbiana de ingeniería de alcoholes grasos de insectos a partir de ácidos grasos requiere la expresión funcional de una ruta sintética. Una de dichas rutas comprende una desaturasa transmembrana y una reductasa formadora de alcohol para mediar la conversión de acil graso-CoA en acil graso insaturado-CoA regio- y estereoespecífico, y posteriormente en alcoholes grasos. Una serie de genes que codifican estas enzimas se encuentran en algunos insectos, así como en algunas microalgas. Se cribó una serie de variantes de genes para identificar actividades enzimáticas que permiten la creación de rutas capaces de un alto nivel de síntesis de uno o una mezcla de alcoholes grasos de insectos. Además, estas enzimas se pueden cribar en múltiples hospedantes (Saccharomyces cerevisiae, Candida tropicalis y Yarrowia lipolytica) para optimizar la búsqueda para encontrar un hospedante adecuado para la expresión óptima de estas proteínas transmembrana.
Resumen del enfoque
Se seleccionó un pequeño conjunto de desaturasas (de insectos: Agrotis segetum, Amyelois transitella, Helicoverpa zea, Trichoplusia ni, Ostrinia fumacalis, y Lampronia capitella y de diatomea marina: Thalassiosira pseudonana) como caso de ensayo para explorar y establecer ensayos de expresión funcional, métodos de extracción de metabolitos y química analítica.
Se confirmó la integración satisfactoria y la expresión funcional del control de mCherry del casete de expresión pXICL en SPV053.
Se integró una biblioteca de desaturasa recombinante que usa el mismo vector pXICL en el contexto de SPV053 (Figura 20). También se clonó una variante, la Z11 desaturasa de Agrotis segetum, para producir un producto de proteína con los primeros 27 aminoácidos de Ole1p de Candida albicans fusionados con el extremo N-terminal de la desaturasa de insecto (SEQ ID NO: 15).
La funcionalidad de la desaturasa se validó por una bioconversión in vivo de ácido hexadecanoico (ácido palmítico) en ácido (Z)-11-hexadecenoico (ácido palmitvaccénico).
Se usaron análisis de GC-FID y GC-MS para identificar y cuantificar metabolitos.
Resultados
Construcción de biblioteca
Este estudio se centró en el cribado de variantes de desaturasa transmembrana en C. tropicalis (SPV053). Se incluyeron en el cribado cinco desaturasas de insectos con actividad descrita de Z11 desaturasa en el palmitoil-CoA (C16:0) (SEQ ID NO: 16-19, 23) y tres desaturasas de insectos con actividad descrita de Z9 desaturasa (SEQ ID NO: 20-22). Una variante, la Z11 desaturasa de A. segetum (SEQ ID NO: 16), también se clonó con 27 aminoácidos del extremo N de OLE1 de Candida albicans fusionados en la dirección 5' de la secuencia del insecto (Figura 20, SEQ ID NO: 15). En el momento de la construcción, se creía que la Z11 desaturasa de A. segetum era un control positivo y la fusión de OLE1 de C. albicans se construyó para ensayar si la inclusión de una secuencia líder de Candida mejoraría la expresión funcional. La construcción se diseñó para imitar las usadas en el cribado de desaturasas de Saccharomyces cerevisiae (véase el ejemplo 4). Finalmente, se incluyó una construcción de control que expresaba la proteína fluorescente roja mCherry (SEQ ID NO: 14) para actuar como un control positivo para la integración y expresión y un control negativo para la actividad de desaturasa recombinante (Figura 21A-Figura 21 D).
Las eficacias de transformación de los plásmidos linealizados en SPV053 variaron enormemente entre las construcciones. A pesar de las bajas eficacias, se identificaron al menos 3 aislados clonales para cada variante (Tablas 8 y 9). Se había planteado la hipótesis de que las colonias más grandes en placas de transformación tenían más probabilidades de ser integrantes positivos porque la presencia del marcador de resistencia a zeocina debería aumentar la tasa de crecimiento bajo la selección de zeocina. El análisis de los resultados del cribado sugería que el número de colonias grandes no se correlaciona con la eficacia de transformación. En cambio, el recuento total de colonias (pequeñas y grandes) se correlacionaba mejor con la eficacia observada (Figura 22). Además, en algunos casos se encontraron clones positivos entre las colonias pequeñas. Es posible que a una densidad de cultivo más baja, la tasa de crecimiento se pueda correlacionar con los sucesos de integración (es decir, los integrantes positivos crecen más rápido). Un cribado secundario de las colonias recultivadas en parches en YPD+Zeocina demostró ser eficaz en el enriquecimiento de integrantes positivos. Los parches de crecimiento rápido tenían más probabilidades de ser integrantes positivos que la población general de colonias en placas de transformación.
Tabla 8: Transformaciones de desaturasa en SPV053. La eficacia de la transformación variaba entre las construcciones con un grado relativamente alto de fondo bajo la selección de zeocina.
plásmido ADN colonias grandes colonias totales
especificidad especie fuente pX IC L u g (placa de control) (placa de control)
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Tabla 9: Construcción de biblioteca de desaturasas de SPV053. Cinco desaturasas de insectos con actividad de desaturación de Z11 putativa y 3 desaturasas de insectos con actividad de desaturación de Z9 putativa se integraron en el contexto de SPV053 usando el vector pXICL. Además, se construyó una cepa de control que expresa mCherry con el mismo vector.
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Ensayo de expresión funcional
La expresión funcional de las desaturasas heterólogas se caracterizó por una serie de experimentos de bioconversión in vivo. Se cultivaron tinciones derivadas de SPV053 de C. tropicalis que expresan desaturasas de insectos en medio rico (YPD) o definido (CM glucosa) complementados con etanol (para inducción) y sustratos ácidos saturados (ácido palmítico, palmitato de metilo, miristato de metilo). Se cultivaron cultivos a pequeña escala (2 ml) durante un total de 72 horas en placas de 24 pocillos profundos con sustrato añadido después de las 24 horas iniciales.
El primer cribado examinaba múltiples medios de bioconversión con complementación de un sustrato de ácido palmítico. Se identificaron dos palmitoil-CoA (Z)-11 desaturasas funcionales por análisis de ésteres metílicos de ácidos grasos (FAME) del contenido de lípidos celulares. Las cepas que expresaban Z11 desaturasas de A. transitella o H. zea (SPV0305-SPV0310) produjeron una especie de ácido graso no observada en las cepas de control mCherry (SPV0302-SPV0304) que eluyeron con el ácido (Z)-11-hexadecenoico de referencia (Figura 23). Ninguna otra cepa ensayada produjo especies de ácidos grasos no nativos (datos no mostrados). La composición aproximada de ácidos grasos de la fracción C16 se da en la tabla 10. La paimitoil-CoA (Z)-9 desaturasa nativa todavía está presente en el contexto de SPV053, lo que significa que la especificidad (Z)-9/(Z)-11 de las desaturasas no se puede determinar rigurosamente. La complementación de ácido palmítico en el medio aumentó la relación de ácido hexadecenoico (Z)-11/(Z)-9 de 0,6 a 1,4 para las cepas que expresaban desaturasa de H. zea. Se observó que los títulos de ácido (Z)-11-hexadecenoico eran aproximadamente 5,62 mg/l para las cepas que expresan desaturasa de A. transitella y 5,96 mg/l para las cepas que expresan desaturasa de H. zea. Se observó un rendimiento similar con la complementación con palmitato de metilo (datos no mostrados).
Tabla 10: Composición de la fracción de ácidos grasos C16 en diferentes SPV053 de C. tropicalis que expresan diferentes desaturasas. *NS = no se añadió sustrato (ácido hexadecanoico).
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El ensayo de bioconversión se aumentó de escala a 20 ml en matraces de agitación con el fin de generar suficiente biomasa para la caracterización adicional de la especie de ácido (Z)-11-hexadecenoico putativo. Aunque las especies observadas eluyeron con el ácido (Z)-11-hexadecenoico de referencia e independientemente del ácido (Z)-9-hexadecenoico de referencia, era posible que un isómero de ácido graso diferente (p. ej. ácido (E)-9-hexadecenoico) pudiera tener un tiempo de retención similar al ácido (Z)-11-hexadecenoico. Puesto que diferentes estereoisómeros eluyen de manera diferente en el DB-23, se podía excluir la aparición de (E)-11-hexadecenoico. La confirmación final de la producción de ácido (Z)-11-hexadecenoico se completó usando detección por espectroscopía de masas de ácidos grasos derivatizados con DMDS para confirmar la regioselectividad de 11. Usando esta técnica de derivatización, los isómeros (Z)-11 y (E)-11 en principio también se podrían resolver. El patrón de fragmentación de las muestras experimentales podría coincidir con el ácido (Z)-11-hexadecenoico de referencia (Figura 24A-24E). Usando esta técnica, se confirmó la producción del regio- y estereoisómero específico del ácido (Z)-11 -hexadecenoico para las cepas tanto de A. transitella como H. zea que expresan desaturasa.
Finalmente, se ensayó el miristato de metilo (C14:0) como sustrato para toda la biblioteca de desaturasas. Se observó una especie de ácido graso no nativo que eluye entre el miristato (C14:0) y el ácido (Z)-9-tetradecenoico (Z9-C14:1) en cepas que expresan Z11 desaturasas de A. transitella o H. zea (Figura 25A). Se plantea la hipótesis de que esta especie no nativa es el ácido el ácido (Z)-11 -tetradecenoico, y esto se puede confirmar con una referencia auténtica. Además, la Z11 desaturasa de A. segetum, Z9 desaturasa de O. furnacalis y Z9 desaturasa de H. zea produjeron todas un pico de hombro que eluyó justo después del pico del miristato (C14:0) (Figura 25B). Se observaron otras especies derivadas de C14 (p. ej., ácido tetradecanodioico) en todas las cepas. Estos resultados sugieren que las desaturasas de A. transitella y H. zea tienen alguna actividad en el miristoil-CoA. Se requiere la confirmación de especies desconocidas y la cuantificación para extraer más conclusiones sobre la especificidad del sustrato de desaturasas in vivo.
En resumen, dos desaturasas de Helicoverpa zea (AAF81787) y de Amyelois transitella (JX964774) eran expresadas en SPV053 y conferían la síntesis de ácido (Z)-11-hexadecenoico a partir de ácido palmítico producido de forma endógena o complementado.
La expresión funcional de desaturasas de H. zea y A. transitella en C. tropicalis SPV053 se confirmó usando un ensayo de bioconversión in vivo en medio tanto rico (YPD) como definido (CM glucosa). Las desaturasas activas generaban ácido (Z)-11-hexadecenoico intracelular que no se observó en las cepas de control que expresaban mCherry. La composición de ácidos grasos C16 de SPV053 que expresa desaturasa de H. zea es aproximadamente 50,0% de ácido hexadecanoico, 30,91% de ácido (Z)-9-hexadecenoico y 19,1% de ácido (Z)-11-hexadeceneoico. Con la complementación con ácido palmítico, la composición es 58,1% de ácido hexadecanoico, 17,5% de ácido (Z)-9-hexadecenoico y 24,4% de ácido (Z)-11-hexadecenoico. La composición de ácidos grasos C16 de SPV053 que expresa desaturasa de A. transitella es 55,5% de ácido hexadecanoico, 14,5% de ácido (Z)-9-hexadecenoico y 30,0% de ácido (Z)-11 -hexadecenoico. En comparación, SPV053 que expresa mCherry producía una composición de ácidos grasos C16 de aproximadamente 72,9% de ácido hexadecanoico, 27,1% de ácido (Z)-9-hexadecenoico y nada de ácido (Z)-11-hexadecenoico. Se produjo ácido (Z)-11-hexadecenoico en aproximadamente 5,5 mg/l en ambas cepas que expresan Z11 desaturasas funcionales.
No se observó ácido (Z)-11-hexadecenoico en cepas que albergaban desaturasa de T. ni, T. pseudonana o A. segetum.
No se observaron diferencias en la composición de ácidos grasos para las cepas que expresaban desaturasas Z9 de insectos de H. zea, O. furnacalis o L. capitella.
El regio- y estereoisómeros del ácido (Z)-11-hexadecenoico producido biológicamente se confirmaron comparando el tiempo de retención y el patrón de fragmentación del compuesto de referencia auténtico por GC-MS después de la derivatización con DMDS.
Las bioconversiones de SPV053 que expresa desaturasas de A. transitella y H. zea con complementación de miristato de metilo produjeron un metabolito no identificado que no se observó en la cepa de control negativo que expresa mCherry. El tiempo de retención de GC de este metabolito se encuentra entre el miristato (C14:0) y el ácido (Z)-9-tetradecenoico.
Conclusiones
Se ha conseguido la expresión funcional de la desaturasa transmembrana de insecto en SPV053de C. tropicalis.
Las desaturasas activas identificadas por cribado en C. tropicalis también complementaban la función de OLE1 cuando se expresaba en AOLE1 de S. cerevisiae (Véase el ejemplo 4).
Se puede usar un ensayo in vivo para ensayar la actividad de desaturasas en C. tropicalis para isómeros de ácidos grasos no nativos (p. ej. ácido (Z)-11-hexadecenoico). Se pueden producir mejores relaciones de ácidos grasos no nativos con complementación de sustratos ácidos saturados tales como ácido palmítico o miristato de metilo.
La expresión funcional y/o la actividad de desaturasas de insecto varía ampliamente en SPV053 de C. tropicalis dependiendo del origen de la secuencia. De manera similar a los resultados observados en el cribado de S. cerevisiae (véase el ejemplo 4), las variantes de A. segetum y T. pseudonana no producían ácido (Z)-11-hexadecenoico detectable. Es interesante que la desaturasa de T. ni tampoco podía producir ácido (Z)-11-hexadecenoico detectable en las condiciones del ensayo. A diferencia del ensayo de S. cerevisiae, la construcción de expresión de T. ni no incluía una secuencia líder de OLE1 quimérica.
Se puede ensayar la inclusión de la secuencia líder OLE1 de C. albicans en la variante funcional de H. zea y la variante no funcional de T. ni.
Se puede explorar la expresión funcional de variantes de desaturasas adicionales para identificar desaturasas específicas de C14.
La expresión de desaturasa funcional con variantes de reductasa se puede hacer y se puede llevar a cabo el cribado posterior de la producción de alcohol graso insaturado.
Materiales y métodos
Construcción de cepas
Se usó un enfoque conservador para la recodificación de genes. Las secuencias nativas no se alteraron excepto por la sustitución de los codones de leucina de CTG por TTA. Todos los genes se clonaron en pPV0053 usando los sitios de restricción Ncol y NotI por Genscript. Después de la transformación en E. coli NEB10p, los plásmidos se miniprepararon usando el kit Zyppy Piasmid Miniprep (Zymo Research, Irvine, CA). Los plásmidos se linealizaron por digestión con BsiWI (New England Biolabs, Ipswich, MA) antes de la transformación en SPV053. Después de digestión, se aisló el ADN usando el kit Clean and Concentrator (Zymo Research, Irvine, CA). Se transformó aproximadamente 1 gg del ADN por electroporación. En lugar de incubación con TE+acetato de litio 100 mM+DTT, las células se incubaron solo en TE+acetato de litio 100 mM durante 2 horas. Se encontró que los integrantes positivos eran específicos del sitio y el genotipado se realizó por PCR de verificación. Se adoptó un enfoque de dos etapas para el cribado adicional de transformaciones de baja eficacia. Aproximadamente 60 colonias se volvieron a sembrar en parches en YPD zeocina 300 g/ml y se cultivaron durante la noche. El subconjunto de parches que crecieron rápidamente (crecimiento denso en 24 horas) se cribó por PCR de colonias. La gran mayoría de los parches de crecimiento rápido se identificaron como integrantes positivos.
Ensayo de expresión funcional
Complementación de ácido palmítico en YPD y CM glucosa
Los aislados positivos se volvieron a sembrar en parches en YPD+zeocina 300 gg/ml y se cultivaron durante la noche y después se almacenaron a 4°C. Se inocularon las cepas de placas de parches en 2 ml de YPD en placas de 24 pocillos profundos (pocillo cuadrado, fondo piramidal). Se inocularon tres clones positivos para cada variante de desaturasa y la cepa de control que expresa mCherry. Las placas de pocillos profundos se incubaron a 30°C, 1000 rpm y 80% de humedad en el agitador de placas Infors HT Multitron Pro durante 24 horas. Después de 24 horas de incubación, los cultivos se dividieron en volúmenes iguales de 1 ml para hacer dos conjuntos de placas idénticas. Ambos conjuntos de placas se sedimentaron por centrifugación a 500xg. Un conjunto de placas se resuspendió en 2 ml de YPD+etanol al 0,3% (v/v) y el segundo conjunto se resuspendió en 2 ml de CM glucosa+etanol al 0,3%. Se añadió etanol en esta etapa para inducir la expresión de la enzima recombinante del promotor ICL. Los cultivos se incubaron durante otras 24 horas en las mismas condiciones antes de añadir 300 mg/l de ácido palmítico a los cultivos a partir de una solución madre de 90 g/l en etanol. El resultado fue la adición de un etanol al 0,3% nuevo junto con el ácido palmítico. También se cultivó un subconjunto de cepas sin adición de ácido palmítico. En su lugar, estos cultivos tenían etanol al 0,3% añadido. Todos los cultivos se incubaron durante 24 h adicionales antes de una adición final de etanol al 0,3%. Después de otro periodo de incubación de 24 h, se recogieron 1,5 ml de cada cultivo en tubos de microcentrífuga de 1,7 ml y se sedimentaron. El líquido sobrenadante se guardó en tubos nuevos y los sedimentos se procesaron como se describe a continuación. También se extrajo un subconjunto de muestras de líquido sobrenadante para buscar ácido libre en el medio extracelular.
Cribado repetido con sustratos alternativos
El control mCherry y las variantes positivas confirmadas se volvieron a cribar usando tanto ácido palmítico como palmitato de metilo como sustratos. El cultivo se realizó como se ha descrito antes con cantidades equimolares (1,17 mM) de sustrato añadidas a partir de soluciones madre en etanol (solución madre de palmitato de metilo de 94 g/l, concentración final de 313 mg/l). El mismo protocolo también se repitió con el panel completo de cepas usando una solución madre de miristato de metilo (C14:0) de 84 g/l. La concentración final de sustrato era de nuevo 1,17 mM.
Confirmación del isómero del ácido (Z)-11-hexadecenoico
El ensayo de bioconversión in vivo se aumentó de escala para confirmar la síntesis de ácido (Z)-11-hexadecenoico. Se cultivaron 2 ml de cultivos sembrados en YPD de las cepas SPV0302, SPV0303 y SPV0304 (mCherry), SPV0304, SPV0305 y SPV0306 (Z11 desaturasa de A. transitella), y SPV0307, SPV0308 y SPV0309 (Z11 desaturasa de H. zea) durante la noche a 30°C, 1000 rpm, 80% de humedad en el agitador de placas Infors HT Multitron. Se reunieron 200 pl de cultivo de toda la noche de cada uno de los tres aislados clonales y se inocularon en un solo matraz con deflectores de 125 ml que contenía 20 ml de YPD. Los tres matraces resultantes se cultivaron durante 24 h a 30°C y 250 rpm (agitador Infors Flask). Los cultivos se sedimentaron por centrifugación a 500xg y se resuspendieron en 20 ml de YPD+etanol al 0,3% (v/v) y se devolvieron a matraces agitados con deflectores de 125 ml. Los cultivos se incubaron durante 24 horas adicionales antes de la adición de 300 mg/l de ácido palmítico en una solución madre de 90 g/l en etanol (221 pl por matraz). Después de 24 horas de incubación, se añadió otro 0,3% (v/v) de etanol (221 pl) a cada matraz para la inducción sostenida. Los matraces se incubaron durante 24 horas más antes de recoger las células para el análisis de FAME y derivatización de DMDS.
Extracción de metabolitos y detección por GC-MS
La composición de lípidos totales, así como la cuantificación del ácido (Z)-11-hexadecenoico, se basó en procedimientos modificados de Moss et al. (1982) y Yousuf et al. (2010). Las células sedimentadas (en tubos de plástico de 1,5 ml), normalmente de aproximadamente 10 mg a 80 mg, se resuspendieron en metanol que contenía hidróxido de sodio al 5% (p/p). La suspensión alcalina de células se transfirió a un vial de GC con tapón de rosca de 1,8 ml. La mezcla se calentó durante 1 h en el bloque de calentamiento a 90°C. Antes de la acidificación con 400 de HCl 2,5 N, el vial se dejó enfriar a temperatura ambiente. Se añadieron 500 pl de cloroformo que contienen 1 ml de ácido heptadecanoico 1 mM y la mezcla se agitó enérgicamente, después tanto la fase acuosa como la orgánica se transfirieron a un tubo de plástico de 1,5 ml. La mezcla se centrifugó a 13.000 rpm, después se transfirieron 450 pl de la fase orgánica a un nuevo tubo de plástico de 1,5 ml. La fase acuosa se extrajo una segunda vez con 500 pl de cloroformo, esta vez sin ácido heptadecanoico. Las fases orgánicas combinadas se evaporaron a 90°C. Después de enfriar a temperatura ambiente, los ésteres metílicos de ácidos grasos residuales y los ácidos grasos libres se disolvieron y derivatizaron en metanol que contenía TMSH 0,2 M (hidróxido de trimetilsulfonio).
La regioselectividad del ácido (Z)-11 -hexadecenoico producido biológicamente se determinó comparando los patrones de fragmentación del derivado de disulfuro de dimetilo (DMDS) con el derivado de DMDS de una referencia auténtica. Un cultivo de levadura se dividió en 12 partes alícuotas (para no cambiar ningún parámetro en el procedimiento desarrollado). Los células se sedimentaron, lo que produjo 63 mg de células (ccw) en promedio (755 mg a partir de 18 ml de cultivo). Los sedimentos se sometieron a metanólisis básica como se ha descrito antes. Sin embargo, después de acidificación, las muestras se combinaron en un tubo Falcon de 50 ml. Las muestras combinadas se extrajeron dos veces con 10 ml de cloroformo. La mezcla se centrifugó 10 min a 3000 rpm para lograr una mejor separación de fases. Las fases orgánicas combinadas se combinaron en un tubo Falcon de 50 ml nuevo y se lavaron consecutivamente con 10 ml de salmuera y 10 ml de agua. La fase orgánica se secó con sulfato de sodio an hidro y se concentró a vacío. El aceite concentrado se disolvió en 1,5 ml de cloroformo y se transfirió a un tubo de plástico de 1,5 ml. El cloroformo se evaporó a 90°C. La muestra restante se disolvió en 50 pl de éter de metilo y terc-butilo (MTBE). Los 50 pl se dividieron en 1,5, 10 y 20 pl y se transfirieron a viales de GC sin inserto. A cada vial se le añadieron 200 pl de DMDS (disulfuro de dimetilo) y 50 pl de MTBE (que contenía 60 mg/ml de yodo). Después de calentar la mezcla 48 h a 50°C, se eliminó el exceso de yodo por adición de 100 pl de solución saturada de tiosulfato de sodio; sin embargo, debido a la formación excesiva de detergentes de la cepa Candida, la capa no se mezcló correctamente. Por lo tanto, las muestras se diluyeron en un tubo Falcon de 15 ml hasta una composición de muestra final de 200 pl, 3,55 ml de MTBE (que contiene yodo y analito), 500 pl de diclorometano, 1,5 ml de agua y 1 ml de etanol. La fase orgánica se evaporó por etapas a 85°C en un vial de vidrio de 1,8 ml. Las muestras se recogieron en 500 pl de diclorometano y la muestra se analizó por GC-MS usando el método de Hagstrom et al. (2013) como en el Ejemplo 4.
Ejemplo 7: Expresión de desaturasas transmembrana en Yarrowia lipolytica
El ejemplo 7 describe un ejemplo de la invención
Antecedentes y fundamento
La producción microbiana de ingeniería de alcoholes grasos de insectos a partir de ácidos grasos requiere la expresión funcional de una ruta sintética. Una de dichas rutas comprende una desaturasa transmembrana y una reductasa formadora de alcohol para mediar la conversión de acil graso-CoA en acil graso insaturado-CoA regio- y estereoespecífico, y posteriormente en alcoholes grasos. Una serie de genes que codifican estas enzimas se encuentran en algunos insectos, así como en algunas microalgas. Alternativamente, se pueden usar desaturasas regio y estereoespecíficas para producir un aceite microbiano rico en precursores de ácidos grasos. El aceite microbiano después se puede derivatizar y reducir a ingredientes activos. Se cribó una serie de variantes de genes para identificar las actividades enzimáticas que permiten la creación de rutas capaces de síntesis de alto nivel de un solo ácido o una mezcla de ácidos grasos y alcoholes de insectos. Además, estas enzimas se cribaron en múltiples hospedantes (Saccharomyces cerevisiae, Candida viswanathii (tropicalis) y Yarrowia lipolytica) para optimizar la búsqueda para encontrar un hospedante adecuado para la expresión óptima de estas proteínas transmembrana.
El cribado inicial de desaturasas en S. cerevisiae y C. viswanathii (tropicalis) identificó tres variantes activas de desaturasa Z11 -C16:1 de Amyelois transitella, Helicoverpa zea y Trichoplusia ni. El cribado de S. cerevisiae usó secuencias codificantes con una secuencia líder N-terminal de la Z9 desaturasa Ole1 p de S. cerevisiae fusionada con la secuencia de Z11 desaturasa de insecto de longitud completa. Esta estrategia se ha usado previamente en la bibliografía científica para expresar desaturasas eucariotas en S. cerevisiae. Las tres desaturasas anteriores mostraron actividad de Z11 desaturasa con la fusión del líder Ole1 p cuando se expresaron en un contexto de deleción de OLE1. Se usó un diseño análogo con una secuencia líder de Ole1p de C. albicans con la Z11 desaturasa de H. zea. Aunque era activa, esta fusión de Ole1p-desaturasa de H. zea no aumentó significativamente el título de ácido Z11-hexadecenoico. Adicionalmente, una Z11 desaturasa de A. transitella optimizada de forma conservadora era activa tanto en S. cerevisiae como en C. viswanathii. El siguiente estudio se centraba en ensayar la expresión funcional de las Z11 desaturasas de H. zea, T. ni y A. transitella en dos cepas diferentes de Y. lipolytica, SPV140 y SPV300. Se usaron tanto secuencias nativas como de Homo sapiens con codones optimizados para las desaturasas de H. zea y T. ni mientras que solo se usó la secuencia nativa para A. transitella. Finalmente, el extremo N de la Z9 estearoil-CoA desaturasa Ole1p de Y. lipolytica se alinea más estrechamente con las desaturasas de insectos que el extremo N de Ole1p de S. cerevisiae o C. albicans. Basándose en este alineamiento se crearon dos versiones adicionales de desaturasa. Se intercambió una secuencia líder putativa de Olel1 p de Y. lipolytica en las desaturasas de T. ni y H. zea.
Resumen del enfoque
Se clonó una biblioteca centrada de Z11 desaturasas (de insecto: Amyelois transitella, Helicoverpa zea, Trichoplusia ni), que se había observado actividad en S. cerevisiae o C. viswanathii en un casete de doble cruce dirigido al locus XPR2 con un marcador de selección URA3. Las secuencias que codifican proteínas usan la secuencia de insecto nativa (SEQ ID NO: 24, 25), secuencia de codificación optimizada para Homo sapiens (SEQ ID NO: 26, 27), o la secuencia optimizada para Homo sapiens con 84 bases N-terminales (H. zea, SEQ ID NO: 29) u 81 bases (T. ni, SEQ ID NO: 28) intercambiada por las 96 bases N-terminales del gen OLE1 de Y. lipolytica (YALI0C05951). A diferencia de los cribados de S. cerevisiae y C. viswanathii, las quimeras de la secuencia líder ensayan un intercambio directo de secuencias líder en lugar de concatenar una secuencia líder del hospedante al extremo N de la secuencia codificante de desaturasa de longitud completa. Sólo se usó la secuencia de codificación nativa para la desaturasa de A. transitella (SEQ ID NO: 30).
Cada una de las 7 construcciones de desaturasa se transformó en SPV140 (PO1f) y SPV300 (H222 AP AA AF AURA3) y se confirmaron los integrantes específicos del sitio.
La actividad desaturasa se ensayó por una bioconversión in vivo de ácido hexadecanoico (ácido palmítico) en ácido (Z)-11-hexadecenoico (ácido palmitovaccénico) en medio YPD.
Se usaron análisis de GC-FID para identificar y cuantificar metabolitos.
Resultados
Construcción de cepas
Se clonaron variantes de desaturasa en el vector pPV101 que contiene un casete de expresión de Y. lipolytica que se dirige a la integración en el locus de XPR2.
Las desaturasas de T. ni y H. zea se sintetizaron cada una con la secuencia de insecto nativa (SEQ ID NO: 24, 25), secuencia de insecto de longitud completa de codones optimizados para Homo sapiens (SEQ ID NO: 26, 27), o con la secuencia líder putativa reemplazada por la secuencia líder de desaturasa OLE1 de Y. lipolytica (SEQ ID NO: 28, 29). También se sintetizó la desaturasa de A. transitella usando la secuencia de codificación de insecto nativa (SEQ ID NO: 30). Las siete variantes de desaturasa se transformaron en SPV140. Basándose en los resultados de actividad previos, solo las variantes de desaturasa de H. zea y A. transitella se transformaron en SPV300.
Ensayo de expresión funcional
La actividad funcional se evaluó por una modificación del protocolo usado para la expresión de desaturasa transmembrana en C. viswanathii SPV053 (véase el ejemplo 6). Brevemente, se cultivaron tinciones derivadas de Y. lipolytica SPV140 y SPV300 que expresan desaturasas de insectos en medio rico (YPD) para generar biomasa. Usando la biomasa generada por YPD, se cultivaron cultivos a pequeña escala (2 ml) con ácido palmítico durante un total de 48 horas en placas de 24 pocillos profundos (véase, Materiales y métodos, para obtener más detalles).
En el cribado inicial de las variantes de T. ni, H. zea y A. transitella, sólo las variantes de desaturasa de H. zea que eran de codones optimizados para Homo sapiens produjeron ácido Z11-hexadecenoico detectable (Figura 26). La expresión de desaturasa de H. zea nativa confirió una producción de 100 ± 5 mg/l de ácido Z11-hexadecenoico y la versión con una secuencia líder de OLE1 de Y. lipolytica produjo 83 ±11 mg/l. Como se ve en la Figura 26, la distribución de las otras especies principales de ácidos grasos no se vio afectada relativamente por la expresión de desaturasa funcional. En las cepas activas, el ácido Z11-hexadecenoico constituía ~10% (g/g) de las especies de ácidos grasos (incluyendo el sustrato de ácido palmítico que se puede adsorber en la superficie exterior de la célula).
Se realizó un experimento de seguimiento comparando variantes activas en el contexto de SPV140 con cepas de desaturasa derivadas de SPV300. Las SPV300 y SPV140 parentales que expresaban hrGFP se usaron como controles negativos. Se usó el mismo protocolo de ensayo de bioconversión. Como en SPV140, solo las variantes optimizadas para H. sapiens produjeron actividad detectable (Figura 27). Las cepas SPV300 crecieron a densidades celulares finales más altas (SPV300 DO600 = 26-28, SPV140 DO600 = 19-22) (Figura 28). Los títulos más altos se observaron para las cepas que expresaban la Z11 desaturasa nativa de H. zea con optimización de codones para H. sapiens (pPV199). Las cepas SPV140 ensayadas nuevamente produjeron 113 ± 1 mg/l (5,5 ± 0,2 mg/L/DO) de ácido Z11-hexadecenoico, que es 13% más alto que los títulos observados en el primer experimento (Figura 29). Las cepas SPV300 que expresan la misma desaturasa generaron un intervalo más amplio de productividad. En promedio, produjeron 89 ± 18 mg/l (3,3 ± 1 ,2 mg/l/DO) de ácido Z11 -hexadecenoico, pero un clon produjo 124 mg/l (4,6 mg/l/DO) ácido Z11 -hexadecenoico.
En resumen, solo las variantes de Z11 desaturasa de H. zea con optimización de codones para Homo sapiens produjeron ácido Z11-hexadecenoico detectable. En las condiciones de ensayo actuales, se observaron títulos ligeramente más altos en el contexto de SPV140 que en SPV300. La tabla 11 resume los títulos de ácido Z11-hexadecenoico.
Tabla 11: Títulos de ácido Z11-hexadecenoico obtenidos a partir de la expresión de desaturasas de ejemplo en Yarrowia lipolytica
Título de ácido Z11-Desaturasa O timización de codones Ce a arental hexadecenoico (mg/l)
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En SPV 300, se ensayó un integrante no específico de sitio de pPV200 (Y. lipolytica OLE1-Z11 desaturasa de H. Zea con optimización de codones para Homo sapiens). Este integrante no produjo ácido Z11-hexadecenoico detectable, mientras que los dos integrantes específicos de sitio produjeron 55 ± 1 mg/l.
No se observaron picos importantes de hidroxi o diácido de los sedimentos de las cepas derivadas de SPV140 o SPV300, y la deleción de los genes de p-oxidación/v-oxidación en SPV300 no aumentó la acumulación de ácido Z11 -hexadecenoico en las condiciones de ensayo actuales (concentración de sustrato relativamente baja, medio rico).
Conclusiones
La Z11 desaturasa de H. zea es activa y confiere producción de ~ 100 mg/l de ácido Z11-hexadecenoico, a partir de ~500 mg/l de sustrato de ácido palmítico. La expresión funcional se demostró a través de tres integrantes positivos y experimentos repetidos en un ensayo de placa de 24 pocillos.
La desaturasa de H. zea requería optimización de codones (para Homo sapiens o potencialmente Y. lipolytica) para la actividad en Y. lipolytica.
La Z11 desaturasa de T. ni, aunque activa en S. cerevisiae, no produce ácido Z11-hexadecenoico detectable en Y. lipolytica.
La reproducibilidad del ensayo para cepas de Y. lipolytica se puede confirmar partiendo de reserva de glicerol.
La puede realizar la optimización de codones de la desaturasa de A. transitella para la expresión en Y. lipolytica.
Puesto que Y. lipolytica es un hospedante de producción candidato, se pueden integrar copias adicionales de desaturasas activas en Y. lipolytica, se pueden identificar condiciones de cultivo para mejorar la bioconversión y se puede cuantificar la conversión del sustrato.
Materiales y métodos
Construcción de cepas
Se sintetizaron todos los genes de la desaturasa (Genscript). Se usaron secuencias nativas u optimización de codones para Homo sapiens. Los genes sintetizados se subclonaron en pPV101. Los plásmidos se transformaron y prepararon a partir de EPI400 de E. coli usando el kit Zyppy Plasmid Miniprep (Zymo Research, Irvine, CA). Aproximadamente ~1-2 gg de ADN linealizado se transformaron usando el kit Frozen-EZ Yeast Transformation II (Zymo Research, Irvine, CA). La mezcla de transformación entera se sembró en placas de agar CM glucosa -ura. Se encontró que los integrantes positivos eran específicos del sitio y el genotipado se llevó a cabo por PCR de verificación.
Ensayo de expresión funcional
Complementación de ácido palmítico en YPD
Los aislados positivos se volvieron a sembrar en parches en YPD, se cultivaron durante la noche y después se almacenaron a 4°C. Las cepas de las placas de parches se inocularon en 2 ml de YPD en placas de 24 pocillos profundos (pocillo cuadrado, fondo piramidal). Se inocularon tres clones positivos para cada variante de desaturasa. Se usaron tres aislados de pPV101 en SPV140 y el SPV300 parental como controles negativos. Las placas de pocillos profundos se incubaron a 28°C y 250 rpm en el agitador de matraz refrigerado Infors Multitron durante 24 horas. Después de 24 horas de incubación, se sedimentó un volumen de 1 ml de cada cultivo por centrifugación a 500xg. Cada sedimento se resuspendió en 2 ml de YPD. Se añadieron 500 mg/l de ácido palmítico a los cultivos de una solución madre de 90 g/l en etanol. El resultado fue la adición de etanol al 0,5% con el sustrato ácido palmítico. Todos los cultivos se incubaron durante 48 horas antes de la toma de muestra de punto final. Las densidades celulares finales se midieron con el lector de placas Tecan Infinite 200pro. Se recogieron 0,75 o 0,8 ml de cada cultivo en tubos de microcentrífuga de 1,7 ml y se sedimentaron. Se separó el líquido sobrenadante y los sedimentos se procesaron como se describe a continuación.
Extracción de metabolitos y análisis de GC-FID
La composición de lípidos totales, así como la cuantificación del ácido (Z)-11-hexadecenoico, se basó en procedimientos modificados de Moss et al. (1982) y Yousuf et al. (2010). Las células sedimentadas (en tubos de plástico de 1,5 ml), normalmente de aproximadamente 10 mg a 80 mg, se resuspendieron en metanol que contenía hidróxido de sodio al 5% (p/p). La suspensión alcalina celular se transfirió a un vial con cuello para encapsulado de 1,8 ml. La mezcla se calentó durante 1 h en el bloque de calentamiento a 90°C. Antes de acidificar con 400 de HCl 2,5 N, el vial se dejó enfriar a temperatura ambiente. Se añadieron 500 gl de cloroformo que contenía heptadecanoato de metilo 1 mM y la mezcla se agitó vigorosamente, después tanto la fase acuosa como la orgánica se transfirieron a un tubo de plástico de 1,5 ml. La mezcla se centrifugó a 13.000 rpm, después se transfirieron 450 gl de la fase orgánica a un vial de GC. Para el análisis de lípidos y la cuantificación de ácidos grasos se añadieron 50 gl de TMSH 0,2 M (hidróxido de trimetilsulfonio en metanol) y la muestra se analizó por GC-FID.
Ejemplo 8: Candida viswanathii (tropicalis) como plataforma de producción para la síntesis de alcoholes grasos de insectos
Antecedentes y fundamento
Se cribaron previamente variantes de desaturasas y reductasas transmembrana de insectos y se clasificaron por jerarquía basándose en su expresión funcional en Candida viswanathii o Saccharomyces cerevisiae (véanse los ejemplos 3, 4 y 6). Se seleccionaron la desaturasa de Helicoverpa zea y la reductasa de Helicoverpa armígera para ensamblar una ruta sintética de alcoholes grasos de insectos en C. viswanathii. Se logró la expresión simultánea de la desaturasa de H. zea de codones optimizados bajo el promotor de isocitrato liasa de Candida (ICL) y la reductasa de H. armigera de codones optimizados bajo el promotor del factor de elongación de transcripción de Candida (TEF) por integración genómica de la ruta completa del alcohol graso. La acumulación de Z11 -16OH se logró en cultivos de la cepa recombinante (SPV0490) usando fuentes de carbono simples y ácido palmítico.
Resumen del enfoque
Se diseñaron plásmidos de integración que contenían una desaturasa de Helicoverpa zea funcional (véase el ejemplo 6) emparejada con una reductasa de Helicoverpa armigera dirigida por un promotor de C. tropicalis supuestamente constitutivo (pTEF).
La funcionalidad de la ruta completa se evaluó por una bioconversión in vivo de ácido hexadecanoico (ácido palmítico) en Z11-16OH.
Se usaron análisis de GC-FID y GC-MS para identificar y cuantificar metabolitos.
Resultados
Se detectó acumulación de Z11 -16OH en cultivos de Candida modificada para expresar desaturasa de H. zea bajo un promotor de ICL y reductasa de H. armigera bajo un promotor de TEF (Tabla 12 y Figura 30).
Tabla 12. Títulos tabulados de Z11-16OH del ensayo de bioconversión de Candida viswanathii. SPV088 es C. viswanathii que se modificó para expresar mCherry (control negativo). SPV0490 es C. viswanathii que se modificó para expresar la ruta de alcohol graso de insecto.
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Materiales y métodos
Construcción de cepas
El plásmido de integración (ppV0228) se diseñó para contener dos casetes de expresión. El primer casete contiene desaturasa de codones optimizados de H. zea (SEQ ID NO: 31) que era dirigida por el promotor de ICL de C. viswanathii (SEQ D NO: 33). El segundo casete contiene reductasa de H. armigera de codones optimizados (SEQ ID NO: 32) dirigida por el promotor de TEF de C. tropicalis (SEQ ID NO: 34). La expresión génica en el casete del promotor de ICL finaliza por la secuencia del terminador de ICL (SEQ ID NO: 35). La expresión génica en el casete del promotor de TEF finaliza por la secuencia del terminador de TEF (SEQ ID NO: 36). Se usó un enfoque conservador para la recodificación de genes. Las secuencias de genes nativos no se alteraron excepto por el reemplazo de los codones de leucina CTG por TTA. Después de la transformación en NEB10p de E. coli, los plásmidos se miniprepararon usando el kit Zyppy Piasmid Mliniprep (Zymo Research, Irvine, CA). Los plásmidos se linealizaron por digestión con BsiWI (New England Biolabs, Ipswich, MA) antes de la transformación en SPV053. Después de digestión, se aisló el ADN usando el kit Clean and Concentrator (Zymo Research, Irvine, CA). Aproximadamente 3-5 gg de ADN se transformaron por electroporación. Se encontró que los integrantes positivos eran específicos del sitio y el genotipado se realizó por PCR de verificación. Se adoptó un enfoque de dos etapas para el cribado adicional de transformaciones de baja eficiencia. Aproximadamente 100 colonias se volvieron a sembrar en parches en YPD+zeocina 250 g/ml y se cultivaron durante la noche. El subconjunto de parches que crecieron rápidamente (crecimiento denso en 24 horas) se cribó por PCR de colonias.
Ensayo de expresión funcional
Complementación de ácido palmítico en YPD
Los aislados positivos se volvieron a sembrar en parches en YPD+zeocina 300 p/ml, se cultivaron durante la noche y luego se almacenaron a 4°C. Las cepas se inocularon de las placas de parches en 2 ml de YPD en placas de 24 pocillos profundos (pocillo cuadrado, fondo piramidal). Se inocularon cuatro clones positivos para cada variante de desaturasa y reductasa y se inocularon tres clones positivos para cada cepa de control que expresaba desaturasa y mCherry. Las placas de pocillos profundos se incubaron a 30°C, 1000 rpm y 80% de humedad en el agitador de placas Infors HT Multitron Pro durante 24 horas. Después de 24 horas de incubación, se sedimentó un volumen de 1 ml de cada cultivo por centrifugación a 500xg. Cada sedimento se resuspendió en 2 ml de YPD+etanol al 0,3% (v/v). Se añadió etanol en esta etapa para inducir la expresión de la enzima recombinante del promotor de ICL. Los cultivos se incubaron durante otras 24 horas en las mismas condiciones antes de que se añadieran 300 mg/l de ácido palmítico a los cultivos a partir de una solución madre de 90 g/l en etanol. El resultado era la adición de etanol al 0,3% nuevo junto con el ácido palmítico. Todos los cultivos se incubaron durante 24 horas adicionales antes de una adición final de etanol al 0,3%. Después de otro periodo de incubación de 24 h, se recogieron 1,5 ml de cada cultivo en tubos de microcentrífuga de 1,7 ml y se sedimentaron. Se separó el líquido sobrenadante y los sedimentos se procesaron como se describe a continuación.
Extracción de metabolitos y detección por GC-MS
Las células sedimentadas (en tubos de plástico de 1,5 ml), normalmente aproximadamente de 10 mg a 80 mg, se resuspendieron en metanol que contenía hidróxido de sodio al 5% (p/p). La suspensión alcalina de células se transfirió a un vial de cuello para encapsulado de 1,8 ml. La mezcla se calentó durante 1 h en un bloque de calentamiento a 90°C. Antes de la acidificación con 400 gl de HCl 2,5 N, el vial se dejó enfriar a temperatura ambiente. Se añadieron 500 gl de cloroformo que contenía heptadecanoato de metilo 1 mM y la mezcla se agitó enérgicamente, después se transfirieron tanto la fase acuosa como la orgánica a un tubo de plástico de 1,5 ml. La mezcla se centrifugó a 13.000 rpm, y después se transfirieron 450 gl de la fase orgánica a un vial de GC. La fase orgánica se evaporó en un bloque de calentamiento a 90°C durante 30 min. El residuo se disolvió en 50 gl de N,O-bis(trimetilsilil)trifluoroacetamida que contenía 1 % de trimetilclorosilano. Antes de transferirla a insertos de vidrio, la mezcla se calentó durante 5 min a 90°C. Las muestras se analizaron por GC-MS (Tabla 13).
Tabla 13. Parámetros analíticos usados para el análisis por GC-MS de metabolitos
Sistema Agilent 6890 N GC, ChemStation G1701EA
E.02.01.1177
Columna DB2330 m x 25 gm x 25 gm
Presión = 0,81 kg/cm2 (11,60 psi); Flujo = 0,6 ml/min
Entrada Calentador = 250°C; Presión = 0,82 kg/cm2 (11,74 psi);
Flujo total {He} = 111 ml/min
Portador He a 29 cm/s, 0,81 kg/cm2 (11,60 psi)
Señal Velocidad de datos = 2 Hz/0,1 min
Horno 150°C durante 1 min
Rampa 12°C/min a 220°C, mantenimiento 3 min
Rampa 35°C/min a 300°C, mantenimiento 4 min
Inyección Sin división, 250°C
Detector HP 5973 MSD en modo SIM (m/z: 208,0, 297,3 y 387,3),
Permanencia 100 ms, modo EMV: Factor de ganancia 1,
retraso de disolvente 2,4 min, 3,09 ciclos/s
Muestra
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Volumen de inyección = 1 gl
Ejemplo 9: Producción de alcoholes grasos de insectos a partir de Yarrowia lipolytica
Yarrowia lipolytica se modificó como una plataforma de producción para la síntesis de alcoholes grasos de insectos (Z11 -16OH y Z9-16OH) a partir del ácido palmítico.
Después de confirmar individualmente la expresión funcional de una Z11 desaturasa (Ejemplo 7) y acil graso-CoA reductasa (FAR), se modificaron las rutas completas de Z11-16OH y Z9-16OH (Bdr) en Y. lipolytica. Con el fin de mejorar los títulos de alcoholes grasos, también se exploraron cultivos diseñados para promover el crecimiento frente a producir almacenamiento de lípidos. Una condición de crecimiento favorece la producción de biomasa, pero limita el tamaño del grupo de acil graso-CoA usado por la ruta modificada y dirige los acil graso-CoA intermedios a la síntesis de la membrana. Por el contrario, una condición de almacenamiento de lípidos crea un fuerte sumidero para la producción de acil grasos-CoA lo cual es deseable. Sin embargo, el transporte de acil graso-CoA hacia los cuerpos lipídicos crea una fuerte competencia por la actividad de FAR. En este segundo escenario, aunque el ácido-Z11-16 o ácido-Z9-16 se acumula en la célula, la mayor parte del mismo es inaccesible para las FAR. Por otro lado, puede haber un flujo continuo de removilización de lípidos en condiciones de almacenamiento de lípidos que conduce a una reserva sostenida de Z11 -16CoA o Z9-16CoA que está disponible para las FAR.
Resumen del enfoque
Se ensayaron dos variantes de la ruta de biodesaturación-reducción (Bdr) en el contexto de H222 APAAAF (SPV300). La primera expresión recombinante combinada de Z11 desaturasa de Helicoverpa zea se emparejaba con una acil graso-CoA reductasa (FAR) de Helicoverpa armígera creando una ruta de síntesis de Z11-16OH. La segunda combinaba la actividad de Z9 desaturasa nativa de Y. lipolytica con la expresión de la acil graso-CoA reductasa (FAR) de H. armigera creando una ruta de Z9-16OH.
Se construyeron dos plásmidos de integración para expresar la desaturasa de H. zea y la FAR de H. armigera. El promotor TEF se usó para la expresión de desaturasa y el promotor EXP1 (proteína de exportación) o el promotor TAL1 (transaldolasa) se usó para la expresión de reductasa.
La integración satisfactoria del casete de la ruta de Z11 -16OH en el contexto de H222 APAAAP (SPV300) se confirmó por PCR de colonias.
Se evaluó la funcionalidad de la ruta completa de Z11 -16OH por una bioconversión in vivo de ácido-16 (ácido palmítico) en Z11 -16OH (Z-11 -hexadecenol).
Se evaluó la funcionalidad de una ruta completa de Z9-16OH por una bioconversión in vivo de ácido-16 (ácido palmítico) usando SPV471 previamente construido (derivado de H222 APAAAP) que expresa FAR de H. armigera dirigido por el promotor de TEF.
Se usó el análisis de GC-MS para identificar y cuantificar Z9-16OH y Z11-16OH. Se usó el análisis por GC-FID para identificar y cuantificar ácidos grasos.
Resumen
Se cribaron diez aislados que expresaban la desaturasa de H. zea (pTEF) y la reductasa de H. armigera (pEXP1). El ensayo de bioconversión in vivo confirmó la producción de Z11-16OH de todos los aislados.
Se observaron títulos de Z11-16OH detectables relativamente bajos (0,26 ± 0,09 mg/l) en un medio YPD complementado con palmitato de metilo 10 g/l. El precursor de ácido-Z11-16 se midió en 220 ± 11 mg/l (a lo largo de los clones 2, 4, 9, 17, 23).
Se observaron títulos más altos de Z11-16OH en un medio semidefinido con una relación C:N de ~80. En los 10 aislados, se producía Z11-16OH en 2,65 ± 0,36 mg/l. El título del precursor de ácido-Z11-16 era 900 ± 30 mg/l. Un aislado (SPV578) producía 3,68 ± 0,31 mg/l de Z11-16OH (ácido-Z11-16840 ± 14 mg/l).
Se cribaron nueve aislados que expresaban la desaturasa de H. zea (pTEF) y la reductasa de H. armigera (pTAL1). El ensayo de bioconversión in vivo confirmó la producción de Z11-16OH de todos los aislados.
Un aislado (SPV603) producía 6,82 ± 1,11 mg/l de Z11-16OH en un medio semidefinido (ácido-Z11-16 1,36 g/l). La cepa de reductasa previamente ensayada, SPV471 (H222 APAAAP que expresaba FAR de H. armigera), producía 4,30 ± 2,33 mg/l de Z9-16OH y 450 ± 80 mg/l de ácido-Z9-16 usando un medio semidefinido (relación C:N de ~80).
Tabla 14: Tabla resumen de los títulos de Z11/Z9-16OH de cepas de la ruta de Bdr
en el ensayo de bioconversión in vivo.
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Resultados
Construcción de cepas
La evidencia en la bibliografía sugiere que tanto las desaturasas de insectos como las FAR están localizadas en la membrana del retículo endoplásmico con sitios activos orientados hacia el citoplasma. De las variantes funcionales, se seleccionaron la Z11 desaturasa de H. zea y la FAR de H. armígera, siendo una hipótesis que el uso de enzimas del mismo género (Heíícoverpa) podría conservar mejor las interacciones proteína-proteína que pueden ocurrir en la membrana del RE.
Se encargaron dos nuevas construcciones de Genscript y se clonaron en el plásmido de desaturasa de H. zea previamente ensamblado, pPV0199. Se clonaron dos sintones de FAR con el promotor EXP1 o TAL1 de Y. lípolytíca en este casete de expresión.
Un plásmido de expresión doble (con el promotor de EXP1) se transformó en la cepa parental SPV300 (H222 Apox1 Apox2 Apox3 Apox4 Apox5 Apox6 Aadh1 Aadh2 Aadh3 Aadh4 Aadh5 Aadh6 Aadh7 Afao1 Aura3). Dos preparaciones de células competentes diferentes de la misma cepa parental se transformaron para estudiar la variabilidad en el rendimiento de la cepa que resulta de la preparación de células competentes. Se confirmó que aproximadamente el 25% de los clones URA+ eran integrantes diana en el locus XPR2 (20% para la preparación 1,33% para la preparación 2). Se seleccionaron dos clones de la preparación de células competentes 1 y ocho clones diana de la preparación de células competentes 2 para el cribado en el ensayo de expresión funcional.
El segundo plásmido de expresión doble (con el promotor TAL1) se integró en la misma cepa parental (SPV300). Se cribaron veintitrés colonias por PCR de verificación y se encontró que 11 eran integrantes diana (48%). Se seleccionaron nueve integrantes para cribado en el ensayo de expresión funcional.
La construcción de SPV471 (H222 APAAAF que expresa FAR de H. armígera) se ha descrito previamente.
Ensayo de expresión funcional de Z11 -16OH
Se usó un ensayo de placa de 24 pocillos in vivo para evaluar la producción de Z11-16OH. El ensayo se basaba en diseños usados para el cribado de variantes de desaturasas y reductasas, así como en las condiciones usadas para aumentar la acumulación de ácidos grasos. Se usó un medio rico (YPD) y un medio semidefinido con 10 g/l de palmitato de metilo complementado como sustrato de bioconversión. El medio semidefinido tenía una relación C:N de ~80 e incluía 5 g/l de glicerol y 60 g/l de glucosa (Véase Materiales y métodos, para más detalles).
El cribado inicial de cepas que albergan la desaturasa de H. zea dirigida por el promotor de TEF y la FAR de H. armígera dirigida por el promotor de EXP1 confirmó que se requería la presencia de FAR para producir Z11 -16OH. No se observó hexadecenol a partir tanto de las cepas parentales como de control de solo desaturasa bajo ninguna condición. En ambas condiciones del medio, se detectaron Z11 -16OH y en menor grado Z9-16OH a partir de clones que expresaban la ruta completa de desaturasa-reductasa. Cuando se completó la conversión en medio rico, se produjeron 0,26 ± 0,09 mg/l de Z11 -16OH y 0,06 ± 0,01 mg/l de Z9-16OH (Figura 32A). Se observó un aumento de 10 veces en el título de Z11 -16OH y un aumento de 3 veces en el título de Z9-16OH cuando se usó el medio semidefinido (Figura 32B). A lo largo de todas las rutas de clones, se produjeron 2,65 ± 0,29 mg/l de Z11-16OH y 0,18 ± 0,02 mg/l de Z9-16OH. El enriquecimiento de Z11-16OH frente a Z9-16OH respalda la posibilidad de modificar una ruta Bdr regioespecífica. La consistencia entre repeticiones técnicas varió entre los clones en las condiciones de medio semidefinido. Los títulos de los clones 2, 4, 6, 9 y 17 eran consistentes con CV <20. Los clones 1, 7 y 23 tienen CV >40%. El título de Z11-16OH consistente más alto se observó para el Clon 17, 3,68 ± 31 mg/l (Tabla 15).
Tabla 15. Tabla resumen de títulos de Z11/Z9-16OH para clones pEXP1. Se ensayó una población de diez aislados que expresaban la desaturasa de H. zea dirigida por pTEF y la reductasa de H. armígera dirigida por pEXP1 de dos preparaciones de células competentes independientes, para determinar la producción de Z11-16OH y Z9-16OH en dos condiciones de medio diferentes. Se presenta la producción de alcohol de los aislados y de clones
seleccionados.
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También se cuantificaron los perfiles de lípidos de los clones de rutas completas. Por simplicidad, se representan las especies de ácidos grasos de 16 carbonos para clones seleccionados en la Figura 33A-33B. En general, los clones de la ruta Bdr completa acumulaban menos ácido Z11-16 que el control solo de desaturasa (0,25 <0,5 g/l en YPD, 0,8­ 1,0 <1,5 g/l en Semidefinido). Pueden resultar títulos de ácido Z11-16 más bajos en clones de la ruta Bdr completa de la expresión reducida de desaturasa en el casete de expresión doble o potencialmente del consumo de ácido Z11-16 por FAR y rutas de subproductos posteriores. No se observó ninguna tendencia en el título de ácido 16 en YPD, mientras que los títulos de ácido 16 eran similares para las cepas de la ruta completa y desaturasa solo en el medio semidefinido.
Las cepas que usaban el segundo casete de expresión doble (pTAL-Ha__FAR) se ensayaron en las mismas condiciones de medio semidefinido que se usó para evaluar los clones pEXP. Se ensayaron nueve clones de pTAL frente a los controles SPV300 (parental), SPV575 (pEXP-Ha__FAR Clon 4) y SPV578 (pEXP-Ha_FAR Clon 17). Como se esperaba, no se observaron productos alcohol del control negativo. Los títulos de alcohol de las cepas de control positivo de pEXP repitieron los resultados observados en el ensayo inicial de los clones de pEXP (Figura 34, Tabla 16).
Excluyendo un clon atípico, el Clon 9, el título de Z11 -16OH era equivalente para los clones pTAL (4,19 ± 0,16 mg/l) y los clones pEXP (4,10 ± 0,22 mg/l). El clon 9 producía Z11 -16OH en 6,82 ± 1,11 mg/l. Como en el primer ensayo con clones pEXP, se observaron títulos bajos pero detectables de Z9-16OH (Figura 34, Tabla 16).
Tabla 16. Tabla resumen de títulos de Z11/Z9-16OH para clones pTAL1. Se ensayó una población de nueve aislados que expresan la desaturasa de H. zea bajo el promotor TEF y la reductasa de H. armígera bajo el promotor TAL para determinar la producción de Z11 -16OH y Z9-16OH en unas condiciones de medio semidefinido. Las clones se compararon con controles positivos que expresan la desaturasa de H. zea bajo el promotor de TEF y la reductasa de H. armígera bajo el promotor de EXP. Se presenta la producción de alcohol a través de aislados y de clones seleccionados.
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También se cuantificaron los perfiles de lípidos de todas las cepas en el segundo cribado de la ruta completa (pTAL). Por simplicidad, las especies de ácidos grasos de 16 carbonos se representan en la Figura 35. Como se esperaba, el ácido Z11-16 está presente solo para cepas que expresan la desaturasa. Los perfiles de lípidos completos eran similares a los observados previamente (Figura 36). El ácido Z9-18 (ácido oleico) era la segunda especie de ácido graso más abundante después del ácido Z11 -16.
Ensayo de expresión funcional de Z9-16OH
Se usó un ensayo in vivo a escala de matraz para ensayar la producción de Z9-16OH. La cepa de control parental, H222 APAAAF (SPV300), se comparó con una cepa que expresaba FAR de H. armígera que se basaba en la actividad de desaturasa Z9 nativa para sintetizar el precursor Z9-16CoA (SPV471). La biomasa se generó a través de un cultivo de semillas en YPD, imitando el ensayo en placa. Los matraces de bioconversión se inocularon a una concentración inicial de DO600 = 1 o DO600 = 4 en el mismo medio semidefinido C:N= 80 usado en el ensayo en placa de Z11-16OH (véase Materiales y métodos para obtener más detalles). Como se esperaba, los matraces de control no producían Z9-16OH detectable mientras que los matraces de SPV471 producían hasta 4,30 ± 2,23 mg/l después de 24 horas de incubación (Figura 37A-Figura 37B). Aunque había una gran variabilidad entre repeticiones, todas las repeticiones de SPV471 (FAR de H. armígera) superaban el título de 1 mg/l. El aumento de la densidad de siembra no aumentó el título del ácido Z9-16 o de Z9-16OH. El título del precursor ácido-Z9-16 a las 24 horas era significativamente menor (<0,5 g/l) que el precursor ácido-Z11-16 observado para las cepas de casete de expresión doble usadas para producir Z11-16OH. La abundancia relativa de otras especies de ácidos grasos era similar a los perfiles previamente observados, con el ácido-Z9-18 como la siguiente especie más abundante (Figura 38). Se tomaron muestras tanto de lípidos como de alcohol en el transcurso de 48 horas para producir una evolución temporal de Z9-16OH y títulos de lípidos. El título de Z9-16OH alcanzó el máximo a las 24 horas antes de disminuir durante el segundo día (Figura 39A). El ácido-Z9-16 aumentó rápidamente a lo largo de las primeras 24 horas antes de estabilizarse o aumentar lentamente a lo largo de las segundas 24 horas (Figura 39B). Puesto que el método analítico empleado usa solo el sedimento celular, la disminución en el título de Z9-16OH apoya la hipótesis del consumo o secreción corriente abajo de los productos de alcohol. Pueden ser oxidados (w-oxidación), secretados como alcohol libre o derivatizados y secretados como un éster. El análisis de las muestras de líquido sobrenadante usando detección SCAN FID y MS no puso de manifiesto Z9-16OH o derivados de Z9-16OH detectables que apoyen la hipótesis de consumo a través de rutas de oxidación.
Conclusiones
La combinación de la expresión de Z11 desaturasa y acil graso-CoA reductasa de Helicoverpa condujo a la producción de Z11-16OH en H222 APAAAF (SPV300) de Y. lipolytica con títulos > 1 mg/l.
Las condiciones de relación C:N alta mejoraban el título de Z11-16OH con respecto a las condiciones de medio rico.
En condiciones de acumulación de lípidos, la combinación de Z9 desaturasa nativa y las actividades de FAR de H. armígera son suficientes para la síntesis de >1 mg/l de Z9-16OH.
Los títulos aumentan, por ejemplo, eliminando las rutas que consumen productos de alcohol graso y/o precursores de ácidos grasos; identificando variantes de FAR que presentan una velocidad de recuperación más alta que FAR de H. armígera; y/o aumentando el número de copias de la ruta.
Se identifican subproductos clave no deseados.
Se explora la posibilidad de que parte del producto de alcohol graso se convierta en acetato graso por la actividad de una o más acetitransferasas endógenas.
Las cepas hospedantes mejoradas se modifican para eliminar la ruta de oxidación w y los componentes de la ruta de almacenamiento de lípidos.
Copias adicionales de desaturasa y FAR se integran en Y. lipolytica.
Materiales y métodos
Construcción de cepas
Todos los genes de desaturasa y reductasa se encargaron a Genscript. Se usó la optimización de codones para Homo sapiens (algoritmo Genscript). El casete de expresión recién sintetizado se subclonó en pPV199 por Genscript usando el sitio de restricción SapI. Los plásmidos se transformaron y prepararon a partir de EPI400 de E.coli usando el kit Zyppy Plamsid Miniprep (Zymo Research, Irvine, CA). Los plásmidos se digirieron con Pmel (New England Biolabs, Ipswich, MA) y se purificaron por extracción en gel usando el kit de recuperación de ADN en gel Zymoclean (Zymo Research, Irvine, CA). El ADN se concentró adicionalmente usando el kit Clean and Concentrator (Zymo Research, Irvine, CA). Se transformaron aproximadamente ~1-2 g de ADN usando el kit Frozen-EZ Yeast Transformation II (Zymo Research, Irvine, CA). El protocolo del fabricante se modificó como sigue: se inoculó un cultivo de semillas de YPD de 2 ml a las 9 am el día anterior a la preparación de células competentes. La semilla se cultivó 8 horas (hasta las 5 pm) antes de inocular 40 ml de YPD en un matraz de agitación con deflectores de 250 ml (o 20 ml en un matraz con deflectores de 125 ml) a una DO600 inicial de 0,0005. El cultivo se incubó a 28°C y 250 rpm durante ~24 horas. Las células se recogieron a una DO600=0,5-1. En lugar de resuspender 10 ml de cultivo en 1 ml de Solución 2 como en las instrucciones del fabricante (DO600~10), se resuspendieron 10 ml de cultivo de SPV140 en 0,5 ml (DO600~20-30). Todas las partes alícuotas de la Solución 2 se congelaron lentamente a -80°C poniendo los tubos en una caja de Sturofoam cerrada antes de ponerlos en el congelador a -80°C. Se descongelaron en hielo partes alícuotas de 50 pl de células competentes en tubos Eppendorf de 1,7 ml, se añadió directamente a las células el ADN eluido en agua y se usaron 500 pl de Solución 3 para suspender las células con un pipeteado suave. Los tubos se incubaron a 28°C durante 3 horas con agitación con vórtice suave cada 30 minutos. La mezcla de transformación completa se sembró en placas de agar CM glucosa -ura. Se encontró que los integrantes positivos eran específicos del sitio y el genotipado se realizó por PCR de verificación.
Ensayo de expresión funcional de Z11 -16OH
Los aislados positivos se volvieron a sembrar en parches en YPD, se cultivaron durante la noche y después se almacenaron a 4°C. Se inocularon las cepas de las placas de parches en 2 ml de YPD en 24 placas de pocillos profundos (pocillo cuadrado, fondo piramidal). Se hicieron inoculaciones repetidas de cada parche. Las cepas de control negativo se echaron en YPD a partir de soluciones madre de glicerol y se usaron colonias individuales para inocular. Las placas de pocillos profundos se incubaron a 28°C y 250 rpm en el agitador de matraces refrigerado Infers Multitron durante 24 horas. Después de 24 horas de incubación, se sedimentó un volumen de 0,85 ml de cada cultivo mediante centrifugación a 800xg. Cada sedimento se resuspendió en 2 ml de YPD o medio semidefinido (descrito en la Tabla 17 a continuación). Se añadieron 10 g/l de palmitato de metilo (precalentado a ~50°C) a los cultivos. Todos los cultivos se incubaron durante 48 horas antes de la toma de muestra del punto final. Las densidades celulares finales se midieron con el lector de placas Tecan Infinite 200pro. Se transfirieron 1,5 ml (análisis de alcoholes) o 500 (análisis de lípidos) a tubos de microcentrífuga de 1,7 ml y se sedimentaron. El líquido sobrenadante se transfirió a tubos limpios y las muestras se procesaron como se describe a continuación.
Tabla 17. Composición del medio semidefinido (C:N=80). Se describen los componentes del medio base semidefinido usado para inducir el almacenamiento de lípidos.
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______ ______
Ensayo de expresión funcional de Z9-16OH
SPV300 (control negativo) y SPV471 se echaron en placas de agar YPD, se cultivaron durante la noche y después se almacenaron a 4°C. Se inocularon cepas de las colonias en 2 ml de YPD y se incubaron a 28°C y 250 rpm en tubos de cultivo de fondo redondo de 14 ml durante ~8 horas. Después de incubación, se usaron 2 ml de cultivo para inocular 20 ml de YPD en un matraz de agitación con deflectores de 125 ml. Los matraces de agitación se incubaron durante 24 horas a 28°C y 250 rpm. Después de la incubación, se midió la densidad celular en los matraces de agitación usando un lector de placas Tecan Infinite 200pro. Se sedimentó un volumen adecuado de cultivo con el fin de resuspender las células en 25 ml de medio semidefinido C:N=80 (véase la Tabla 17 arriba) a una DO600 inicial = 1 (~1 g DCW/l) o 4 (~4 g DCW/l). El cultivo resuspendido se añadió a matraces de agitación con deflectores de 250 ml. Se añadió palmitato de metilo puro a una concentración final de 10 g/l después de precalentar a 50°C. Después de la adición del sustrato, los matraces se incubaron a 28°C y 250 rpm durante dos días. A las 12, 18, 24, 36, 42 y 48 horas se tomaron muestras de 500 gl (análisis de lípidos) y 1,5 ml (análisis de alcoholes) en tubos de microcentrífuga de 1,7 ml. Las muestras se sedimentaron y el líquido sobrenadante se transfirió a un tubo de microcentrífuga limpio.
Extracción de metabolitos y detección por GC-MS
Análisis de alcoholes
Las células sedimentadas (en tubos de plástico de 1,5 ml), normalmente de aproximadamente 10 mg a 80 mg, se resuspendieron en metanol que contenía hidróxido de sodio al 5% (p/p). La suspensión alcalina de células se transfirió a un vial con cuello para encapsulado de 1,8 ml. La mezcla se calentó durante 1 h en el bloque de calentamiento a 90°C. Antes de la acidificación con 400 gl de HCl 2,5 N, el vial se dejó enfriar a temperatura ambiente. Se añadieron 500 gl de cloroformo que contenía heptadecanoato de metilo 1 mM y la mezcla se agitó enérgicamente, y después tanto la fase acuosa como la orgánica se transfirieron a un tubo de plástico de 1,5 ml. La mezcla se centrifugó a 13.000 rpm, después se transfirieron 450 gl de la fase orgánica a un vial de GC. La fase orgánica se evaporó en un bloque de calentamiento a 90°C durante 30 min. El residuo se disolvió en 50 gl de N,0-bis(trimetilsilil)trifluoroacetamida que contenía trimetilclorosilano al 1%. Antes de transferirla a insertos de vidrio, la mezcla se calentó 5 min a 90°C. Las muestras se analizaron por GC-MS (Tabla 18).
Tabla 18. Parámetros de GC-MS
Sistema Agilent 6890 N GC, ChemStation G1701EA E.02.01.1177
Columna DB2330 m x 25 gm x 25 gm
Presión = 0,81 kg/cm2 (11,60 psi); Flujo = 0,6 ml/min
Entrada Calentador = 250°C; Presión = 0,82 kg/cm2 (11,74 psi);
Flujo total {He} = 111 ml/min
Portador He a 29 cm/s, 0,81 kg/cm2 (11,60 psi)
Señal Velocidad de datos = 2 Hz/0,1 min
Horno 150°C durante 1 min
Rampa 12°C/min a 220°C, mantenimiento 3 min
Rampa 35°C/min a 300°C, mantenimiento 4 min
Inyección Sin división, 250°C
Detector Cribado de cepas inicial y primer triplicado técnico: HP 5973
MSD en modo SIM (m/z: 208,0, 297,3 y 387,3),
Cuantificación de alcohol de SPV488/SPV490: HP 5973 MSD en modo SIM (m/z: 284,0 y 297,3), Permanencia 100 ms, modo EMV: Factor de ganancia 1,
retraso de disolvente 2,4 min, 3,09 ciclos/s
Muestra Volumen de inyección = 1 gl
Análisis de lípidos
La composición de lípidos totales se basó en procedimientos modificados de Moss et al. (1982) y Yousuf et al. (2010). Las células sedimentadas (en tubos de plástico de 1,5 ml), normalmente de aproximadamente 10 mg a 80 mg, se resuspendieron en metanol que contenía hidróxido de sodio al 5% (p/p). La suspensión alcalina de células se transfirió a un vial de vidrio de GC con cuello para encapsulado de 1,8 ml. La mezcla se calentó durante 1 h en el bloque de calentamiento a 90°C. Antes de la acidificación con 400 pl de HCl 2,5 N, el vial se dejó enfriar a temperatura ambiente. Se añadieron 500 pl de cloroformo que contenía heptadecanoato de metilo 1 mM y la mezcla se agitó enérgicamente, y después tanto la fase acuosa como la orgánica se transfirieron a un tubo de plástico de 1,5 ml. La mezcla se centrifugó a 13.000 rpm, después se transfirieron 450 pl de la fase orgánica a un nuevo vial de vidrio de GC con tapón de rosca de 1,8 ml. Después de enfriar a temperatura ambiente, los ésteres metílicos de ácidos grasos residuales y los ácidos grasos libres se disolvieron y derivatizaron en metanol que contenía TMSH (hidróxido de trimetilsulfonio) 0,2 M (Tabla 19).
Tabla 19. Parámetros de GC-MS
Sistema Agilent 6890 GC, ChemStation Rev. B.03.02 (341)
Columna J&W DB-2330 m x 25 mm x 25 pm
Presión = 1,12 kg/cm2 (16 psi); Flujo = 0,9 ml/min; Tiempo de análisis = 14,4 min Entrada Calentador = 240°C; Presión = 1,12 kg/cm2 (16 psi);
Flujo total {He} = 31,4 ml/min
Portador H2 a 1 ml/min, 0,63 kg/cm2 (9 psi), 35 cm/s
Señal Velocidad de datos = 2 Hz/0,1 min
Horno 150°C durante 1 min
Rampa 12°C/min a 220°C, mantenimiento 3 min
Rampa 35°C/min a 240°C, mantenimiento 6 min
Tiempo de equilibrado: 2 min________________
Inyección División, 240°C
Relación de división - 30:1; 29,1 ml/min
Detector FID, 240°C
H2 a 35,0 ml/min, Aire a 350 ml/min;; Electrómetro {Desviación de encendido} a 2,0 pA Muestra Volumen de inyección = 1 pl

Claims (23)

REIVINDICACIONES
1. Un microorganismo Yarrowia lipolytica recombinante capaz de convertir un acil graso C6-C24 saturado-CoA en un acil graso C6-C24 mono o poliinsaturado-CoA correspondiente, que comprende:
a) una molécula de ácido nucleico heteróloga que codifica una acil graso desaturasa de Helicoverpa que cataliza la conversión de un acil graso C6-C24 saturado-CoA en un acil graso C6-C24 mono o poliinsaturado-CoA correspondiente.
2. El microorganismo Yarrowia lipolytica recombinante de la reivindicación 1, en donde el microorganismo Yarrowia lipolytica recombinante es capaz de producir un alcohol graso C6-C24 mono o poliinsaturado a partir de una fuente de carbono de ácido graso, y en donde el microorganismo Yarrowia lipolytica comprende además:
b) una molécula de ácido nucleico heteróloga que codifica una acil graso reductasa formadora de alcohol graso que cataliza la conversión del acil graso C6-C24 mono o poliinsaturado-CoA de (a) en el alcohol graso C6-C24 mono o poliinsaturado correspondiente.
3. El microorganismo Yarrowia lipolytica recombinante de la reivindicación 1 o reivindicación 2, en donde la acil graso desaturasa de Helicoverpa es de Helicoverpa zea.
4. El microorganismo Yarrowia lipolytica recombinante de la reivindicación 1 o reivindicación 2, en donde la acil graso desaturasa de Helicoverpa es una Z9 o Z11 desaturasa.
5. El microorganismo Yarrowia lipolytica recombinante de la reivindicación 1 o reivindicación 2, en donde la acil graso desaturasa de Helicoverpa comprende una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 13, 19, 22, 25, 27, 29 y 31.
6. El microorganismo Yarrowia lipolytica recombinante de la reivindicación 1 o reivindicación 2, en donde el microorganismo comprende una eliminación, alteración, mutación y/o reducción en la actividad del gen fao1.
7. El microorganismo Yarrowia lipolytica recombinante de la reivindicación 1 o reivindicación 2, en donde el microorganismo comprende una eliminación, alteración, mutación y/o reducción en la actividad de una o más enzimas endógenas seleccionadas de las siguientes:
a) una o más enzimas que catalizan la conversión de un acil graso-CoA en a,p-enoil-CoA;
b) una o más alcohol graso deshidrogenasas;
c) una o más alcohol graso oxidasas;
d) una o más enzimas que catalizan la conversión de un ácido graso en un w-hidroxiácido graso; y
e) una o más diacilglicerol aciltransferasas.
8. El microorganismo Yarrowia lipolytica recombinante de la reivindicación 7, en donde el microorganismo comprende una eliminación, alteración, mutación y/o reducción en la actividad de una o más enzimas endógenas seleccionadas de las siguiente:
a) una o más enzimas que catalizan la conversión de un acil graso-CoA en a,p-enoil-CoA seleccionadas del grupo que consiste en: CAA04659, CAA04660, CAA04661, CAA04662, CAA04663 y CAG79214;
b) una o más enzimas que catalizan la conversión de un ácido graso en un w-hidroxiácido graso; seleccionadas del grupo que consiste en XP_504406, XP_504857, XP_504311, XP_500855, XP_500856, XP_500402, XP_500097, XP_501748, XP_500560, XP_501148, XP_501667, XP_500273; y
c) una o más diacilglicerol aciltransferasas seleccionadas de YALI0E32769g y YALI0D07986g.
9. El microorganismo Yarrowia lipolytica recombinante de la reivindicación 1 o reivindicación 2, en donde el microorganismo comprende una eliminación, alteración, mutación y/o reducción en la actividad de cada una de las siguientes enzimas que catalizan la conversión de un acil graso-CoA en a,p-enoil-CoA; CAA04659, CAA04660, CAA04661, CAA04662, CAA04663 y CAG79214.
10. El microorganismo Yarrowia lipolytica recombinante de la reivindicación 1 o reivindicación 2, en donde el microorganismo comprende una eliminación, alteración, mutación y/o reducción en la actividad de la enzima FAO1 y cada una de las siguientes enzimas que catalizan la conversión de un acil graso-CoA en a,p-enoil-CoA: CAA04659, CAA04660, CAA04661, CAA04662, CAA04663 y CAG79214.
11. El microorganismo Yarrowia lipolytica recombinante de la reivindicación 2, en donde el alcohol graso C6-C24 mono o poliinsaturado es Z9-16:OH y/o Z11 -16:OH.
12. El microorganismo Yarrowia lipolytica recombinante de la reivindicación 2, en donde la acil graso reductasa formadora de alcohol graso es una acil graso reductasa formadora de alcohol de microalga, y en donde el microorganismo comprende una eliminación, alteración, mutación y/o reducción en la actividad de cada uno de los siguientes genes: fao1, Pox1, Pox2, Pox3, Pox4, Pox5, Pox6, adh1 adh2, adh3, adh4, adh5, adh6 y adh7.
13. El microorganismo Yarrowia lipolytica recombinante de la reivindicación 12, en donde la acil graso desaturasa de Helicoverpa es de Helicoverpa zea.
14. El microorganismo Yarrowia lipolytica recombinante de la reivindicación 12, en donde la acil graso desaturasa de Helicoverpa es una Z9 o Z11 desaturasa.
15. El microorganismo Yarrowia lipolytica recombinante de la reivindicación 12, en donde la molécula de ácido nucleico heteróloga que codifica una acil graso desaturasa de Helicoverpa comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de: SEQ ID NO: 13, 19, 22, 25, 27, 29 y 31.
16. El microorganismo Yarrowia lipolytica recombinante de la reivindicación 12, en donde el microorganismo comprende una eliminación, alteración, mutación y/o reducción en la actividad de una o más enzimas endógenas seleccionadas de las siguientes:
a) una o más alcohol graso deshidrogenasas;
b) una o más enzimas que catalizan la conversión de un ácido graso en un w-hidroxiácido graso; y
c) una o más diacilglicerol aciltransferasas.
17. El microorganismo Yarrowia lipolytica recombinante de la reivindicación 12, en donde el microorganismo comprende una eliminación, alteración, mutación y/o reducción en la actividad de una o más enzimas endógenas seleccionadas de las siguientes:
a) una o más alcohol graso deshidrogenasas;
b) una o más enzimas que catalizan la conversión de un ácido graso en un w-hidroxiácido graso seleccionadas del grupo que consiste en XP_504406, XP_504857, XP_504311, XP_500855, XP_500856, XP_500402, XP_500097, XP_501748, XP_500560, XP_501148, XP_501667, XP_500273; y
c) una o más diacilglicerol aciltransferasas seleccionadas de YALI0E32769g y YALI0D07986g.
18. El microorganismo Yarrowia lipolytica recombinante de la reivindicación 12, en donde el microorganismo comprende una eliminación, alteración, mutación y/o reducción en la actividad de cada una de las siguientes enzimas que catalizan la conversión de un acil graso-CoA en a,p-enoil-CoA: CAA04659, CAA04660, CAA04661, CAA04662, CAA04663 y CAG79214.
19. El microorganismo Yarrowia lipolytica recombinante de la reivindicación 12, en donde el microorganismo comprende una eliminación, alteración, mutación y/o reducción en la actividad de la enzima FAO1 y cada una de las siguientes enzimas que catalizan la conversión de un acil graso-CoA en a,p-enoil-CoA: CAA04659, CAA04660, CAA04661, CAA04662, CAA04663 y CAG79214.
20. El microorganismo Yarrowia lipolytica recombinante de la reivindicación 12, en donde el alcohol graso C6-C24 mono o poliinsaturado es Z9-16:OH y/o Z11 -16:OH.
21. Un método de producción de un alcohol graso C6-C24 mono o poliinsaturado que comprende: cultivar el microorganismo Yarrowia lipolytica recombinante de la reivindicación 2, en un medio de cultivo que contiene una fuente endógena o exógena de acil graso C6-C24 saturado-CoA para la producción del alcohol graso C6-C24 mono o poliinsaturado.
22. El método de la reivindicación 21, en donde dicho alcohol graso C6-C24 mono o poliinsaturado es un alcohol graso de insecto.
23. El método de la reivindicación 21, en donde dicho alcohol graso C6-C24 mono o poliinsaturado es una feromona de insecto.
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