ES2930358T3 - Producción de alcoholes grasos desaturados y acetatos de acilo grasos desaturados en levaduras - Google Patents

Producción de alcoholes grasos desaturados y acetatos de acilo grasos desaturados en levaduras Download PDF

Info

Publication number
ES2930358T3
ES2930358T3 ES17825466T ES17825466T ES2930358T3 ES 2930358 T3 ES2930358 T3 ES 2930358T3 ES 17825466 T ES17825466 T ES 17825466T ES 17825466 T ES17825466 T ES 17825466T ES 2930358 T3 ES2930358 T3 ES 2930358T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
seq
coa
yeast cell
desaturated
desaturase
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES17825466T
Other languages
English (en)
Inventor
Irina Borodina
Carina Holkenbrink
Marie Dam
Christer Löfstedt
Baojian Ding
hong-lei Wang
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Danmarks Tekniskie Universitet
Original Assignee
Danmarks Tekniskie Universitet
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Danmarks Tekniskie Universitet filed Critical Danmarks Tekniskie Universitet
Application granted granted Critical
Publication of ES2930358T3 publication Critical patent/ES2930358T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0008—Oxidoreductases (1.) acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/001—Oxidoreductases (1.) acting on the CH-CH group of donors (1.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y103/00—Oxidoreductases acting on the CH-CH group of donors (1.3)
    • C12Y103/01—Oxidoreductases acting on the CH-CH group of donors (1.3) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.3.1)
    • C12Y103/01086—Crotonyl-CoA reductase (1.3.1.86)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y114/00—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
    • C12Y114/19—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14) with oxidation of a pair of donors resulting in the reduction of molecular oxygen to two molecules of water (1.14.19)
    • C12Y114/19001—Stearoyl-CoA 9-desaturase (1.14.19.1), i.e. DELTA9-desaturase
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/582—Recycling of unreacted starting or intermediate materials

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

La presente invención se refiere a la producción de compuestos comprendidos en feromonas, en particular feromonas de polilla, tales como alcoholes grasos desaturados y acetatos de acilo graso desaturados y derivados de los mismos, a partir de una célula de levadura. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Producción de alcoholes grasos desaturados y acetatos de acilo grasos desaturados en levaduras
Campo técnico
La presente invención se refiere a la producción de compuestos comprendidos en feromonas, en particular feromonas de polilla, tales como alcoholes grasos desaturados y acetatos de alcoholes grasos desaturados y derivados de los mismos, a partir de una célula de levadura.
Antecedentes
Desde la llegada del DDT hace más de 50 años, los insecticidas neurotóxicos de amplio espectro han proporcionado los principales medios para el control de insectos económicamente importantes en la agricultura y los programas de salud pública. Mientras que el uso de insecticidas sintéticos dio lugar inicialmente a aumentos espectaculares en el rendimiento de los cultivos y a la supresión de algunos vectores de enfermedades humanas y animales importantes, el desarrollo de resistencia a los insecticidas en las poblaciones de plagas de insectos y el daño ambiental causado por los insecticidas han sido reconocidos ampliamente como serios inconvenientes para su uso. Entre los problemas ambientales más significativos asociados con la fabricación y el uso de insecticidas se encuentran 1) su toxicidad directa para organismos no diana (incluyendo los seres humanos); 2) su persistencia en la biosfera donde pueden acumularse y causar efectos adversos en el desarrollo y la reproducción en organismos superiores; 3) contaminación significativa de fuente puntual asociada con su fabricación y distribución; 4) su dispersión mundial.
Las feromonas se pueden usar como control de plagas en lugar de los insecticidas. Se ha encontrado que (Z)19-14:OAc, por ejemplo, interrumpe la eficiencia de apareamiento del gusano cogollero con una eficiencia del 86 % cuando se aplica solo, es decir, sin otros componentes de feromonas (Mitchell y McLaughlin, 1982). El uso comercial de feromonas para controlar plagas de insectos mediante la interrupción del apareamiento tiene varias ventajas sobre los insecticidas convencionales. Las feromonas son: 1) no tóxicas y ambientalmente benignas; 2) específicas para una especie diana y no afectan negativamente a los insectos beneficiosos no diana, lo que las hace extremadamente adecuadas para su uso en programas de gestión integrada de plagas; y 3) es mucho menos probable (y nunca se ha demostrado) que produzcan resistencia en el insecto diana. En contraste con la síntesis de feromonas en la naturaleza, los enfoques actuales para la producción comercial de feromonas emplean rutas químicas sintéticas tradicionales. Debido a que las feromonas requieren una pureza muy alta para provocar la respuesta de un insecto, estos métodos de síntesis son costosos y difíciles, y generan grandes cantidades de desechos orgánicos que requieren tratamiento.
Por lo tanto, el principal obstáculo que se interpone en el camino del uso de feromonas sexuales sigue siendo el coste de producción. Como resultado, una parte muy pequeña de la tierra agrícola mundial emplea feromonas (se estima que menos del 0,05 %). Se espera que la producción de feromonas de una fábrica celular reduzca significativamente los costes de producción de las feromonas.
Hagstrom et al. (A moth pheromone brewery: production of (Z)-11-hexadecenol by heterologous co-expression of two biosynthetic genes from a noctuid moth in a yeast cell factory, Microb Cell Fact 12, 125 (2013)) divulgan una célula de Saccharomyces cerevisiae que expresa una A11 acil graso desaturasa heteróloga (AseA11 de Agrotis segetum) y una acil graso reductasa heteróloga (FAR) (AseFAR de Agrotis segetum).
Resumen
La invención es como se define en las reivindicaciones. Cualquier materia objeto que se encuentre fuera del alcance de las reivindicaciones se proporciona solo con fines informativos.
En la presente memoria se proporciona una célula de levadura capaz de producir un alcohol graso desaturado y, opcionalmente, un acetato de alcohol graso desaturado, expresando dicha célula de levadura:
i) al menos una desaturasa heteróloga capaz de introducir al menos un enlace doble en una acil graso-CoA que tiene una longitud de cadena de carbonos de 14, en donde dicha desaturasa es una A9 desaturasa que tiene al menos un 80 % de homología con la A9 desaturasa de Drosophila melanogaster como se muestra en la SEQ ID NO: 10 y tiene una mayor especificidad hacia tetradecanoil-CoA que hacia hexadecanoil-CoA; y ii) al menos una acil graso-CoA reductasa (FAR) heteróloga, capaz de convertir al menos parte de dicha acil graso-CoA desaturada en un alcohol graso desaturado, opcionalmente en donde la FAR tiene una mayor especificidad hacia tetradecanoil-CoA desaturada que hacia hexadecanoil-CoA desaturada; y
iii) opcionalmente, una acetiltransferasa capaz de convertir al menos parte de dicho alcohol graso desaturado en un acetato de alcohol graso desaturado.
También se proporcionan métodos para la producción de un ácido graso desaturado y, opcionalmente, un acetato de acilo graso desaturado en una célula de levadura, comprendiendo dicho método las etapas de proporcionar una célula de levadura e incubar dicha célula de levadura en un medio, en el que la célula de levadura expresa:
i) al menos una desaturasa heteróloga capaz de introducir al menos un enlace doble en una acil graso-CoA que tiene una longitud de cadena de carbonos de 14, en donde dicha desaturasa es una A9 desaturasa que tiene al menos un 80 % de homología con la A9 desaturasa de Drosophila melanogaster como se muestra en la SEQ ID NO: 10 y tiene una mayor especificidad hacia tetradecanoil-CoA que hacia hexadecanoil-CoA, convirtiendo de esta manera al menos parte de dicha acil graso-CoA en una acil graso-CoA desaturada; y ii) al menos una acil graso-CoA reductasa heteróloga, capaz de convertir al menos parte de dicha acil graso-CoA desaturada en un alcohol graso desaturado, opcionalmente en donde la FAR tiene una mayor especificidad hacia tetradecanoil-CoA desaturada que hacia hexadecanoil-CoA desaturada, produciendo de esta manera dicho alcohol graso desaturado; y
iii) opcionalmente, una acetiltransferasa capaz de convertir al menos parte de dicho alcohol graso desaturado en un acetato de alcohol graso desaturado, produciendo de esta manera dicho acetato de alcohol graso desaturado.
También se proporciona un kit de partes que comprende la célula de levadura como se describe en la presente memoria e instrucciones de uso.
Descripción de los dibujos
Figura 1: ruta hacia Z9-C14:OAc. (1) tetradecanoil-CoA (miristoil-CoA), 14:CoA (2) (Z)9-tetradecen-1-il-CoA, Z9-14:CoA, (3) (Z)9-tetradecen-1-ol, Z9-14:OH, (4) acetato de (Z)9-tetradecen-1-ilo, Z9-14:OAc, (5) (Z)9-tetradecenal, Z9-14:Ald. A9 FAD - Z9-acil graso desaturasa, FAR - acil graso-CoA reductasa, AcT - acetil-CoA transferasa.
Figura 2: casetes de expresión. A: casete de expresión de Dmd9 y HarFAR (codificado en el plásmido pCfB6969). B: Casete de expresión de Atf1 (codificado en el plásmido pCfB7600). C: Casetes de expresión de LIP2, LIP7 o LIP8. "Term." significa terminador; "prom." significa promotor. D: Casete de expresión de Atf1 y Dmd9 (pCfB7235). E: Casete de expresión de Dmd9 (pCfB7239). F: Casete de expresión de SliDes11 (pCfB7240). G: Casete de expresión de TesA(LL)/CcFATB1 y Dmd9 (pCfB7251/pCfB7253).
Figura 3: La deleción de genes de lipasa en Y. lipolytica aumenta las titulaciones de alcoholes grasos.
Descripción detallada de la invención
Definiciones
Bioplaguicida: el término "bioplaguicida" es una contracción de "plaguicida biológico" y se refiere a varios tipos de intervención de gestión de plagas: a través de relaciones predatorias, parasitarias, o químicas. En la UE, los bioplaguicidas se han definido como "una forma de plaguicida a base de microorganismos o productos naturales". En los EE.UU., son definidos por la EPA como "que incluyen sustancias de origen natural que controlan plagas (plaguicidas bioquímicos), microorganismos que controlan plagas (plaguicidas microbianos), y sustancias plaguicidas producidas por plantas que contienen material genético añadido (protectores para plantas incorporados) o PIP". La presente divulgación se refiere más particularmente a bioplaguicidas que comprenden productos naturales o sustancias de origen natural. Típicamente, se crean por el crecimiento y la concentración de organismos de origen natural y/o sus metabolitos que incluyen bacterias y otros microbios, hongos, nematodos, proteínas, etc. A menudo, se considera que son componentes importantes de los programas de gestión integrada de plagas (IPM), y han recibido mucha atención práctica como sustitutos para los productos de protección de plantas químicos sintéticos (PPP). El Manual de Agentes de Biocontrol (2009: anteriormente el Manual de Bioplaguicidas) proporciona una revisión de productos insecticidas biológicos disponibles (y otros de control basados en biología).
Desaturado: el término "desaturado" se utilizará en la presente memoria de forma intercambiable con el término "insaturado" y se refiere a un compuesto que contiene uno o más enlaces carbono-carbono dobles o triples.
Derivado de: el término, cuando se refiere a un polipéptido o un polinucleótido derivado de un organismo, significa que dicho polipéptido o polinucleótido es nativo de dicho organismo.
Ácido graso: el término "ácido graso" se refiere a un ácido carboxílico que tiene una cadena alifática larga, es decir, una cadena alifática entre 4 y 28 átomos de carbono, tal como 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 o 28 átomos de carbono. La mayoría de los ácidos grasos naturales no están ramificados. Pueden ser saturados o desaturados.
Acetato de alcohol graso: el término se utilizará en la presente memoria de forma intercambiable con "acetato graso" y se refiere a un acetato que tiene una cadena carbonada grasa, es decir, una cadena alifática entre 4 y 28 átomos de carbono, tal como 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 o 28 átomos de carbono. Los acetatos de alcoholes grasos pueden ser saturados o desaturados.
Acil graso-CoA: el término se utilizará en la presente memoria de forma intercambiable con "éster de acil graso-CoA" y se refiere a compuestos de fórmula general R-CO-SCoA, donde R es una cadena carbonada grasa que tiene una longitud de cadena de carbonos de 4 a 28 átomos de carbono, tal como 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 o 28 átomos de carbono. La cadena carbonada grasa está unida al grupo -SH de la coenzima A por un enlace tioéster. Las acil graso-CoA pueden ser saturadas o desaturadas, dependiendo de si el ácido graso del que se deriva es saturado o desaturado.
Alcohol graso: el término "alcohol graso" se refiere en la presente memoria a un alcohol derivado de una acil graso-CoA, que tiene una longitud de cadena de carbonos de 4 a 28 átomos de carbono, tal como 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27 o 28 átomos de carbono. Los alcoholes grasos pueden ser saturados o desaturados.
Aldehido graso: el término se refiere en la presente memoria a un aldehido derivado de una acil graso-CoA, que tiene una longitud de cadena de carbonos de 4 a 28 átomos de carbono, tal como 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 o 28 átomos de carbono. Los aldehidos grasos pueden ser saturados o desaturados.
Heterólogo: el término "heterólogo" cuando se refiere a un polipéptido, tal como una proteína o una enzima, o a un polinucleótido, se considerará en la presente memoria que hace referencia a un polipéptido o un polinucleótido que no está presente de forma natural en una célula de tipo salvaje. Por ejemplo, el término "A9 desaturasa heteróloga" cuando se aplica a Saccharomyces cerevisiae se refiere a una A9 desaturasa que no está presente de forma natural en una célula de S. cerevisiae de tipo salvaje, p. ej., una A9 desaturasa derivada de Drosophila melanogaster.
Nativo: el término "nativo" cuando se refiere a un polipéptido, tal como una proteína o una enzima, o a un polinucleótido, se considerará en la presente memoria que hace referencia a un polipéptido o un polinucleótido que está presente de forma natural en una célula de tipo salvaje.
Plaga: tal y como se usa en la presente memoria, el término "plaga" se referirá a un organismo, en particular a un animal, perjudicial para los seres humanos o los intereses humanos, en particular en el contexto de la agricultura o la producción ganadera. Una plaga es cualquier organismo vivo que es invasivo o prolífico, perjudicial, molesto, nocivo, destructivo, una molestia para plantas o animales, seres humanos o intereses humanos, ganado, estructuras humanas, ecosistemas salvajes, etc. El término a menudo se superpone con los términos relacionados roedores, malas hierbas, parásitos y patógenos de plantas y animales. Es posible para un organismo ser una plaga en un entorno, pero beneficioso, domesticado o aceptable en otro.
Feromona: las feromonas son compuestos naturales. Las feromonas de lepidópteros se designan por una cadena alifática no ramificada (entre 9 y 18 carbonos, tal como 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 o 18 átomos de carbono) que termina en un grupo funcional alcohol, aldehido o acetato y que contiene hasta 3 enlaces dobles en el esqueleto alifático. Las composiciones de feromonas se pueden producir química o bioquímicamente, por ejemplo, como se describe en la presente memoria. Por lo tanto, las feromonas comprenden alcoholes grasos, aldehídos grasos y/o acetatos de alcoholes grasos desaturados, tales como los que se pueden obtener por los métodos y células descritos en la presente memoria.
Saturado: el término "saturado" se refiere a un compuesto que carece de enlaces carbono-carbono dobles o triples.
Especificidad: la especificidad de una enzima hacia un determinado sustrato es la preferencia que presenta esta enzima para catalizar una reacción a partir de dicho sustrato. En la presente divulgación, una desaturasa y/o una acil graso-CoA reductasa que tiene una mayor especificidad hacia tetradecanoil-CoA (miristoil-CoA) que hacia hexadecanoil-CoA (palmitoil-CoA) cataliza preferiblemente una reacción con tetradecanoil-CoA en lugar de con hexadecanoil-CoA como sustrato. Los métodos para determinar la especificidad de una desaturasa o una acil graso-CoA reductasa son conocidos en la técnica. Por ejemplo, la especificidad de una desaturasa determinada puede determinarse incubando células que expresan dicha desaturasa en una solución que comprende miristato de metilo durante hasta 48 horas, seguido de extracción y esterificación de los productos con metanol. Los perfiles de los ésteres metílicos de ácidos grasos resultantes se pueden determinar mediante GC-MS. Las desaturasas con mayor especificidad hacia miristoil-CoA y baja especificidad hacia palmitoil-CoA darán lugar a una mayor concentración de (Z)9-C14:Me que (Z)9-C16:Me. Por ejemplo, la especificidad de una reductasa determinada se puede determinar incubando células que expresan dicha reductasa en una solución que comprende éster metílico de (Z)9-miristato durante hasta 48 horas, seguido de extracción y análisis de los alcoholes grasos resultantes mediante GC-MS. Las reductasas con mayor especificidad hacia (Z)9-C14:CoA y baja especificidad hacia (Z)9-C16:CoA darán lugar a una mayor concentración de (Z)9-C14:OH que (Z)9-C16:OH.
Desaturasa
En la presente divulgación, los términos “acil graso-CoA reductasa”, “desaturasa”, acil graso desaturasa” y “FAD” se usarán indistintamente. El término generalmente se refiere a una enzima capaz de introducir al menos un enlace doble en confirmaciones E/Z en una acil-CoA que tiene una longitud de cadena de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 o 22 átomos de carbono. El enlace doble puede introducirse en cualquier posición. Por ejemplo, una desaturasa que introduce un enlace doble en la posición 3 se denomina A3 desaturasa. Una desaturasa que introduce un enlace doble en la posición 5 se denomina A5 desaturasa. Una desaturasa que introduce un enlace doble en la posición 6 se denomina A6 desaturasa. Una desaturasa que introduce un enlace doble en la posición 7 se denomina A7 desaturasa. Una desaturasa que introduce un enlace doble en la posición 8 se denomina A8 desaturasa. Una desaturasa que introduce un enlace doble en la posición 9 se denomina A9 desaturasa. Una desaturasa que introduce un enlace doble en la posición 10 se denomina A10 desaturasa. Una desaturasa que introduce un enlace doble en la posición 11 se denomina A11 desaturasa. Una desaturasa que introduce un enlace doble en la posición 12 se denomina A12 desaturasa. Una desaturasa que introduce un enlace doble en la posición 13 se denomina A13 desaturasa. Una desaturasa que introduce un enlace doble en la posición 14 se denomina A14 desaturasa. Una desaturasa que introduce un enlace doble en la posición 15 se denomina A15 desaturasa. Una desaturasa que introduce un enlace doble en la posición 16 se denomina A16 desaturasa. Una desaturasa que introduce un enlace doble en la posición 17 se denomina A17 desaturasa. Una desaturasa que introduce un enlace doble en la posición 18 se denomina A18 desaturasa. Una desaturasa que introduce un enlace doble en la posición 19 se denomina A19 desaturasa. Una desaturasa que introduce un enlace doble en la posición 20 se denomina A20 desaturasa.
Las desaturasas catalizan la reacción (figura 1):
Acil graso-CoA 2 ferrocitocromo b5 O(2) 2 H(+) <=> acil graso-CoA desaturada 2 ferricitocromo b5 2H(2)O
Para el propósito de la presente divulgación, la desaturasa es capaz de introducir al menos un enlace doble en una acil graso-CoA que tiene una longitud de cadena de carbonos de 14.
La célula de levadura divulgada en la presente memoria expresa una desaturasa que tiene una mayor especificidad hacia tetradecanoil-CoA que hacia hexadecanoil-CoA y/o una acil-CoA reductasa que tiene una mayor especificidad hacia tetradecanoil-CoA desaturada que hacia hexadecanoil-CoA desaturada. En otras palabras, la desaturasa es más específica para sustratos que tienen una longitud de cadena de carbonos de 14 que para sustratos que tienen una longitud de cadena de 16. Los métodos para determinar la especificidad de una desaturasa o una acil graso-CoA reductasa son conocidos en la técnica. Por ejemplo, la especificidad de una desaturasa determinada puede determinarse incubando células que expresan dicha desaturasa en una solución que comprende miristato de metilo durante hasta 48 horas, seguido de extracción y esterificación de los productos con metanol. Los perfiles de los ésteres metílicos de ácidos grasos resultantes se pueden determinar mediante GC-MS. Las desaturasas con mayor especificidad hacia miristoil-CoA y baja especificidad hacia palmitoil-CoA darán lugar a una mayor concentración de (Z)9-C14:Me que (Z)9-C16:Me. Por ejemplo, la especificidad de una reductasa determinada se puede determinar incubando células que expresan dicha reductasa en una solución que comprende éster metílico de (Z)9-miristato durante hasta 48 horas, seguido de extracción y análisis de los alcoholes grasos resultantes mediante GC-MS. Las reductasas con mayor especificidad hacia (Z)9-C14:CoA y baja especificidad hacia (Z)9-C16:CoA darán lugar a una mayor concentración de (Z)9-C14:OH que (Z)9-C16:OH.
En una realización, la célula es capaz de expresar al menos una A9 desaturasa heteróloga. El gen que codifica la desaturasa heteróloga puede tener codones optimizados para la célula de levadura, como se sabe en la técnica.
En una realización, la al menos una desaturasa heteróloga es una A9 desaturasa que tiene al menos un 80 % de homología con la A9 desaturasa de Drosophila melanogaster como se muestra en la SEQ ID NO: 10, tal como al menos un 81 %, tal como al menos un 82 %, tal como al menos un 83 %, tal como al menos un 84 %, tal como al menos un 85 %, tal como al menos un 86 %, tal como al menos un 87 %, tal como al menos un 88 %, tal como al menos un 89 %, tal como al menos un 90 %, tal como al menos un 91 %, tal como al menos un 92 %, tal como al menos un 93 %, tal como al menos un 94 %, tal como al menos un 95 %, tal como al menos un 96 %, tal como al menos un 97 %, tal como al menos un 98 %, tal como al menos un 99 %, tal como un 100 % de homología con la A9 desaturasa de Drosophila melanogaster como se muestra en la SEQ ID NO: 10.
En algunas realizaciones, la desaturasa heteróloga se deriva de Drosophila melanogaster.
La desaturasa heteróloga puede derivar de un organismo perteneciente al orden de Lepidoptera. Así, en una realización, la desaturasa heteróloga se deriva de Choristoneura rosaceana. En otra realización, la desaturasa heteróloga se deriva de Choristoneura parallela.
Una desaturasa heteróloga puede expresarse a partir de un ácido nucleico introducido en la célula, p. ej., en un vector tal como un plásmido, o por integración genómica. El ácido nucleico puede tener codones optimizados como se sabe en la técnica para la célula de levadura específica utilizada.
En una realización, la célula de levadura expresa al menos una desaturasa heteróloga que es una A9 desaturasa que tiene al menos un 80 % de homología con la A9 desaturasa de Drosophila melanogaster como se muestra en la SEQ ID NO: 10, que puede estar codificada por un ácido nucleico que tiene al menos un 60 % de homología con el ácido nucleico que codifica la A9 desaturasa de Drosophila melanogaster como se muestra en la SEQ ID NO: 9, tal como al menos un 61 % de homología, tal como al menos un 62 % de homología, tal como al menos un 63 % de homología, tal como al menos un 64 % de homología, tal como al menos un 65 % de homología, tal como al menos un 66 % de homología, tal como al menos un 67 % de homología, tal como al menos un 68 % de homología, tal como al menos un 69 % de homología, tal como al menos un 70 % de homología, tal como al menos un 71 % de homología, tal como al menos un 72 %, tal como al menos un 73 %, tal como al menos un 74 %, tal como al menos un 75 %, tal como al menos un 76 %, tal como al menos un 77 %, tal como al menos un 78 %, tal como al menos un 79 %, tal como al menos un 80 %, tal como al menos un 81 %, tal como al menos un 82 %, tal como al menos un 83 %, tal como al menos un 84 %, tal como al menos un 85 %, tal como al menos un 86 %, tal como al menos un 87 %, tal como al menos un 88 %, tal como al menos un 89 %, tal como al menos un 90 %, tal como al menos un 91 %, tal como al menos un 92 %, tal como al menos un 93 %, tal como al menos un 94 %, tal como al menos un 95 %, tal como al menos un 96 %, tal como al menos un 97 %, tal como al menos un 98 %, tal como al menos un 99 %, tal como un 100 % de homología con el ácido nucleico que codifica la A9 desaturasa de Drosophila melanogaster como se muestra en la SEQ ID NO: 9.
En otra realización, la célula de levadura expresa al menos una desaturasa heteróloga que es una A9 desaturasa que tiene al menos un 80 % de homología con la A9 desaturasa de Drosophila melanogaster como se muestra en la SEQ ID NO: 10, que puede estar codificada por un ácido nucleico que tiene al menos un 60 % de homología con el ácido nucleico que codifica la A9 desaturasa de Drosophila melanogaster como se muestra en la SEQ ID NO: 36, tal como al menos un 61 % de homología, tal como al menos un 62 % de homología, tal como al menos un 63 % de homología, tal como al menos un 64 % de homología, tal como al menos un 65 % de homología, tal como al menos un 66 % de homología, tal como al menos un 67 % de homología, tal como al menos un 68 % de homología, tal como al menos un 69 % de homología, tal como al menos un 70 % de homología, tal como al menos un 71 % de homología, tal como al menos un 72 %, tal como al menos un 73 %, tal como al menos un 74 %, tal como al menos un 75 %, tal como al menos un 76 %, tal como al menos un 77 %, tal como al menos un 78 %, tal como al menos un 79 %, tal como al menos un 80 %, tal como al menos un 81 %, tal como al menos un 82 %, tal como al menos un 83 %, tal como al menos un 84 %, tal como al menos un 85 %, tal como al menos un 86 %, tal como al menos un 87 %, tal como al menos un 88 %, tal como al menos un 89 %, tal como al menos un 90 %, tal como al menos un 91 %, tal como al menos un 92 %, tal como al menos un 93 %, tal como al menos un 94 %, tal como al menos un 95 %, tal como al menos un 96 %, tal como al menos un 97 %, tal como al menos un 98 %, tal como al menos un 99 %, tal como un 100 % de homología con el ácido nucleico que codifica la A9 desaturasa de Drosophila melanogaster como se muestra en la SEQ ID NO: 36.
La célula de levadura que se va a modificar puede expresar una desaturasa nativa, lo que puede tener un impacto negativo en la producción de alcohol graso desaturado y/o acetato de alcohol graso desaturado. Por consiguiente, si la célula de levadura que se va a modificar expresa dicha desaturasa nativa, la célula se puede modificar preferiblemente de modo que la actividad de la desaturasa nativa se reduzca o desaparezca.
Para garantizar la falta de actividad de una desaturasa nativa, se pueden emplear métodos conocidos en la técnica. El gen que codifica la desaturasa nativa puede delecionarse o delecionarse parcialmente para garantizar que no se exprese la desaturasa nativa. Alternativamente, el gen se puede mutar de modo que la desaturasa nativa se exprese, pero carezca de actividad, p. ej., por mutación del sitio catalítico de la enzima. Alternativamente, la traducción del ARNm a una proteína activa puede evitarse por métodos tales como silenciar el ARN o siARN. Alternativamente, la célula de levadura se puede incubar en un medio que comprende un inhibidor que inhibe la actividad de la desaturasa nativa. También se puede proporcionar un compuesto que inhiba la transcripción del gen que codifica la desaturasa nativa, de modo que la transcripción se inactive cuando dicho compuesto esté presente.
Por lo tanto, la inactivación de la desaturasa nativa puede ser permanente o a largo plazo, es decir, la célula de levadura modificada exhibe una actividad reducida o nula de la desaturasa nativa de manera estable, o puede ser transitoria, es decir, la célula de levadura modificada puede exhibir actividad de la desaturasa nativa durante periodos de tiempo, pero esta actividad puede ser suprimida durante otros periodos de tiempo.
Acil graso-CoA reductasa formadora de alcohol (EC 1.2.1.84)
Los términos “acil graso-CoA reductasa formadora de alcohol”, “acil graso-CoA reductasa” y “FAR” se usarán en la presente memoria indistintamente. El término "FAR heteróloga" se refiere a una FAR que no se expresa naturalmente por la célula de levadura.
Las FAR catalizan la reacción de dos etapas (figura 1)
acil-CoA 2 NADPH <=> CoA alcohol 2 NADP(+)
en donde, en una primera etapa, la acil graso-CoA se reduce a un aldehído graso, antes de que el aldehído graso se reduzca aún más a un alcohol graso en una segunda etapa. La acil graso-CoA puede ser una acil graso-CoA desaturada.
Las FAR capaces de catalizar dicha reacción son acil graso-CoA reductasas formadoras de alcohol con un número EC 1.2.1.84.
En algunas realizaciones, la FAR se selecciona del grupo que consiste en Har_FAR (SEQ ID NO: 25, FAR de Helicoverpa armígera) o una variante de la misma, tal como la Har_FAR modificada como se muestra en la SEQ ID NO: 27, Has_FAR (SEQ ID NO 29, FAR de Helicoverpa assulta) o una variante de la misma, tal como la Has_FAR modificada como se muestra en la SEQ ID n O: 31, Hs_FAR (SEQ ID: 33, FAR de Heliothis subflexa) o una variante de la misma, tal como la Hs_FAR modificada como se muestra en la SEQ ID NO: 35, y una Ban_FAR (SEQ ID NO: 45, FAR de Bicyclus anynana). En realizaciones específicas, el FAR es Har_FAR como se muestra en la SEQ ID NO: 25 o una variante de la misma, tal como la Har_FAR modificada como se muestra en la SEQ ID NO: 27.
En una realización, la FAR es Har_FAR (SEQ ID NO: 25, FAR de Helicoverpa armigera) o una variante de la misma que tiene al menos un 75 % de homología con Har_FAR, tal como al menos un 76 %, tal como al menos un 77 %, tal como al menos un 78 %, tal como al menos un 79 %, tal como al menos un 80 %, tal como al menos un 81 %, tal como al menos un 82 %, tal como al menos un 83 %, tal como al menos un 84 %, tal como al menos un 85 %, tal como al menos un 86 %, tal como al menos un 87 %, tal como al menos un 88 %, tal como al menos un 89 %, tal como al menos un 90 %, tal como al menos un 91 %, tal como al menos un 92 %, tal como al menos un 93 %, tal como al menos un 94 %, tal como al menos un 95 %, tal como al menos un 96 %, tal como al menos un 97 %, tal como al menos un 98 %, tal como al menos un 99 %, tal como un 100 % de homología con Har_FAR (SEQ ID NO: 25).
En otra realización, la FAR es una Har_FAR modificada (SEQ ID NO: 27, FAR de Helicoverpa armigera en donde el péptido señal se ha modificado a HDEL) o una variante de la misma que tiene al menos un 75 % de homología con esta, tal como al menos un 76 %, tal como al menos un 77 %, tal como al menos un 78 %, tal como al menos un 79 %, tal como al menos un 80 %, tal como al menos un 81 %, tal como al menos un 82 %, tal como al menos un 83 %, tal como al menos un 84 %, tal como al menos un 85 %, tal como al menos un 86 %, tal como al menos un 87 %, tal como al menos un 88 %, tal como al menos un 89 %, tal como al menos un 90 %, tal como al menos un 91 %, tal como al menos un 92 %, tal como al menos un 93 %, tal como al menos un 94 %, tal como al menos un 95 %, tal como al menos un 96 %, tal como al menos un 97 %, tal como al menos un 98 %, tal como al menos un 99 %, tal como un 100 % de homología con la Har_FAR modificada como se muestra en la SEQ ID NO: 27.
En otra realización, la FAR es Has_FAR (SEQ ID NO: 29, FAR de Helicoverpa assulta) o una variante de la misma que tiene al menos un 75 % de homología con Has_FAR, tal como al menos un 76 %, tal como al menos un 77 %, tal como al menos un 78 %, tal como al menos un 79 %, tal como al menos un 80 %, tal como al menos un 81 %, tal como al menos un 82 %, tal como al menos un 83 %, tal como al menos un 84 %, tal como al menos un 85 %, tal como al menos un 86 %, tal como al menos un 87 %, tal como al menos un 88 %, tal como al menos un 89 %, tal como al menos un 90 %, tal como al menos un 91 %, tal como al menos un 92 %, tal como al menos un 93 %, tal como al menos un 94 %, tal como al menos un 95 %, tal como al menos un 96 %, tal como al menos un 97 %, tal como al menos un 98 %, tal como al menos un 99 %, tal como un 100 % de homología con Has_FAR (SEQ ID NO: 29).
En otra realización, la FAR es una Has_FAR modificada (SEQ ID NO: 31, FAR de Helicoverpa assulta en donde el péptido señal se ha modificado a HDEL) o una variante de la misma que tiene al menos un 75 % de homología con esta, tal como al menos un 76 %, tal como al menos un 77 %, tal como al menos un 78 %, tal como al menos un 79 %, tal como al menos un 80 %, tal como al menos un 81 %, tal como al menos un 82 %, tal como al menos un 83 %, tal como al menos un 84 %, tal como al menos un 85 %, tal como al menos un 86 %, tal como al menos un 87 %, tal como al menos un 88 %, tal como al menos un 89 %, tal como al menos un 90 %, tal como al menos un 91 %, tal como al menos un 92 %, tal como al menos un 93 %, tal como al menos un 94 %, tal como al menos un 95 %, tal como al menos un 96 %, tal como al menos un 97 %, tal como al menos un 98 %, tal como al menos un 99 %, tal como un 100 % de homología con la Has_FAR modificada como se muestra en la SEQ ID NO: 31.
En otra realización, la FAR es Hs_FAR (SEQ ID NO: 33, FAR de Heliothis subflexa) o una variante de la misma que tiene al menos un 75 % de homología con Hs_FAR, tal como al menos un 76 %, tal como al menos un 77 %, tal como al menos un 78 %, tal como al menos un 79 %, tal como al menos un 80 %, tal como al menos un 81 %, tal como al menos un 82 %, tal como al menos un 83 %, tal como al menos un 84 %, tal como al menos un 85 %, tal como al menos un 86 %, tal como al menos un 87 %, tal como al menos un 88 %, tal como al menos un 89 %, tal como al menos un 90 %, tal como al menos un 91 %, tal como al menos un 92 %, tal como al menos un 93 %, tal como al menos un 94 %, tal como al menos un 95 %, tal como al menos un 96 %, tal como al menos un 97 %, tal como al menos un 98 %, tal como al menos un 99 %, tal como un 100 % de homología con Hs_FAR (SEQ ID NO: 33).
En otra realización, la FAR es una Hs_FAR modificada (SEQ ID NO: 35, FAR de Heliothis subflexa en donde el péptido señal se ha modificado a HDEL) o una variante de la misma que tiene al menos un 75 % de homología con esta, tal como al menos un 76 %, tal como al menos un 77 %, tal como al menos un 78 %, tal como al menos un 79 %, tal como al menos un 80 %, tal como al menos un 81 %, tal como al menos un 82 %, tal como al menos un 83 %, tal como al menos un 84 %, tal como al menos un 85 %, tal como al menos un 86 %, tal como al menos un 87 %, tal como al menos un 88 %, tal como al menos un 89 %, tal como al menos un 90 %, tal como al menos un 91 %, tal como al menos un 92 %, tal como al menos un 93 %, tal como al menos un 94 %, tal como al menos un 95 %, tal como al menos un 96 %, tal como al menos un 97 %, tal como al menos un 98 %, tal como al menos un 99 %, tal como un 100 % de homología con la Hs_FAR modificada como se muestra en la SEQ ID NO: 35.
En otra realización, la FAR es Ban_FAR (SEQ ID NO: 45, FAR de Bicyclus anynana) o una variante de la misma que tiene al menos un 75 % de homología con Hs_FAR, tal como al menos un 76 %, tal como al menos un 77 %, tal como al menos un 78 %, tal como al menos un 79 %, tal como al menos un 80 %, tal como al menos un 81 %, tal como al menos un 82 %, tal como al menos un 83 %, tal como al menos un 84 %, tal como al menos un 85 %, tal como al menos un 86 %, tal como al menos un 87 %, tal como al menos un 88 %, tal como al menos un 89 %, tal como al menos un 90 %, tal como al menos un 91 %, tal como al menos un 92 %, tal como al menos un 93 %, tal como al menos un 94 %, tal como al menos un 95 %, tal como al menos un 96 %, tal como al menos un 97 %, tal como al menos un 98 %, tal como al menos un 99 %, tal como un 100 % de homología con Ban_FAR (SEQ ID NO: 45).
En una realización, la FAR se selecciona de una FAR que tiene al menos un 60 % de homología con la SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35 o SEQ ID NO: 45. En otra realización, la FAR se selecciona de una FAR que tiene al menos un 60 % de homología con la SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33 o SEQ ID NO: 35. En otra realización, la FAR se selecciona de una FAR que tiene al menos un 60 % de homología con la SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35 o SEQ ID NO: 45. En otra realización, la FAR se selecciona de una FAR que tiene al menos un 60 % de homología con la SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35 o SEQ ID NO: 45. En otra realización, la FAR se selecciona de una FAR que tiene al menos un 60 % de homología con la SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31 o SEQ ID NO: 45.
En algunas realizaciones, la expresión de la desaturasa y/o de la FAR puede inducirse, por ejemplo, si los genes que codifican estas enzimas están bajo el control de promotores inducibles, como se conoce en la técnica. La célula de levadura se incuba en condiciones adecuadas, tales como en un medio apropiado y a una temperatura apropiada como conoce un experto en la técnica. Los medios adecuados que soportan el crecimiento de levaduras son conocidos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a: medios completos no definidos, tales como YEPD (o YPD, Extracto de Levadura Peptona Dextrosa); medio completo definido, tal como SC (Completo Sintético); medio deficiente definido, tal como SD (Dextrosa Sintética) que carece de uno o más elementos tales como un aminoácido o un inductor; o medio mineral, que consiste en sales, vitaminas y una fuente de carbono, y otros.
Una acil graso-CoA reductasa heteróloga puede expresarse a partir de un ácido nucleico introducido en la célula, p. ej., en un vector tal como un plásmido, o por integración genómica. El ácido nucleico puede tener codones optimizados como se sabe en la técnica para la célula de levadura específica utilizada.
En algunas realizaciones, la célula de levadura puede expresar al menos dos, tal como dos, reductasas heterólogas. En una realización específica, la célula de levadura expresa la reductasa de H. armigera y la reductasa de H. subflexa, o variantes de las mismas como se describe en la presente memoria.
Acetiltransferasa (EC 2.3.1.84)
El término "acetiltransferasa" se refiere a enzimas con número EC 2.3.1.84 y también puede denominarse "alcohol-O-acetiltransferasa" o "AcT". La enzima actúa sobre los alcoholes alifáticos y cataliza la reacción (figura 1):
Acetil-CoA un alcohol <=> CoA un éster de acetilo.
La célula de levadura de la presente divulgación preferiblemente sobreexpresa una acetiltransferasa. La acetiltransferasa puede ser una acetiltransferasa nativa que la célula que se va a modificar ya sea capaz de expresar, o puede ser una acetiltransferasa heteróloga. Si la célula de levadura expresa una acetiltransferasa nativa, la célula de levadura se modifica preferiblemente para que aumente la expresión de la acetiltransferasa nativa. Esto se puede hacer mediante métodos conocidos en la técnica, tales como, pero no limitados a, la introducción de copias adicionales del ácido nucleico que codifica la acetiltransferasa en el genoma o en un vector, la modificación del promotor a un promotor constitutivo con un alto nivel de expresión, o a un promotor inducible que tras la inducción conduce a altos niveles de expresión.
Si la célula de levadura no expresa una acetiltransferasa nativa o si la actividad de la acetiltransferasa nativa es insuficiente, lo que da como resultado titulaciones bajas, se puede introducir en la célula un ácido nucleico que codifica una acetiltransferasa heteróloga, ya sea en una localización genómica o en un vector, para permitir la expresión de la acetiltransferasa. Preferiblemente, la acetiltransferasa se expresa a un alto nivel, p. ej., introduciendo múltiples copias del ácido nucleico que codifica la acetiltransferasa, o aprovechando un promotor constitutivo con un alto nivel de expresión, o un promotor inducible que tras la inducción conduce a altos niveles de expresión. La acetiltransferasa se puede expresar a partir de un ácido nucleico introducido en la célula, p. ej., en un vector tal como un plásmido, o por integración genómica. El ácido nucleico puede tener codones optimizados como se sabe en la técnica para la célula de levadura específica utilizada.
El término "sobreexpresa" se refiere así a la sobreexpresión de una acetiltransferasa en una célula de levadura cuando se compara con una célula de levadura que no ha sido modificada para sobreexpresar la acetiltransferasa, es decir, la cepa parental.
En algunas realizaciones, la acetiltransferasa es la AcT de la SEQ ID NO: 21 (Atf1, la AcT de S. cerevisiae) o una variante de la misma que tiene al menos un 75 % de homología con Sc_Atf1, tal como al menos un 76 %, tal como al menos un 77 %, tal como al menos un 78 %, tal como al menos un 79 %, tal como al menos un 80 %, tal como al menos un 81 %, tal como al menos un 82 %, tal como al menos un 83 %, tal como al menos un 84 %, tal como al menos un 85 %, tal como al menos un 86 %, tal como al menos un 87 %, tal como al menos un 88 %, tal como al menos un 89 %, tal como al menos un 90 %, tal como al menos un 91 %, tal como al menos un 92 %, tal como al menos un 93 %, tal como al menos un 94 %, tal como al menos un 95 %, tal como al menos un 96 %, tal como al menos un 97 %, tal como al menos un 98 %, tal como al menos un 99 %, tal como un 100 % de homología con la SEQ ID NO: 21.
Producción de un alcohol graso desaturado
Las células de levadura de la presente divulgación pueden usarse para la producción de un alcohol graso desaturado y, opcionalmente, un acetato de alcohol graso desaturado. La célula de levadura expresa:
i) al menos una desaturasa heteróloga capaz de introducir al menos un enlace doble en una acil graso-CoA que tiene una longitud de cadena de carbonos de 14, en donde dicha desaturasa es una A9 desaturasa que tiene al menos un 80 % de homología con la A9 desaturasa de Drosophila melanogaster como se muestra en la SEQ ID NO: 10 y tiene una mayor especificidad hacia tetradecanoil-CoA que hacia hexadecanoil-CoA; y ii) al menos una acil graso-CoA heteróloga reductasa (FAR), capaz de convertir al menos parte de dicha acil graso-CoA desaturada en un alcohol graso desaturado, opcionalmente en donde la FAR tiene una mayor especificidad hacia tetradecanoil-CoA desaturada que hacia hexadecanoil-CoA desaturada; y
iii) opcionalmente, una acetiltransferasa capaz de convertir al menos parte de dicho alcohol graso desaturado en un acetato de alcohol graso desaturado.
La célula de levadura, la desaturasa, la acil graso-CoA reductasa y la acetiltransferasa pueden ser todas como se ha descrito anteriormente.
Por lo tanto, la célula de levadura de la presente divulgación puede usarse para la producción de un rango de alcoholes grasos desaturados, tales como:
- alcoholes grasos (Z)-A9 desaturados que tienen una longitud de cadena de carbonos de 14;
- alcoholes grasos (E)-A9 desaturados que tienen una longitud de cadena de carbonos de 14;
La célula de levadura divulgada en la presente memoria puede expresar una A9 desaturasa heteróloga y una acil graso-CoA reductasa, y utilizarse para producir (Z)9-C14:OH, es decir, un alcohol graso que tiene una longitud de cadena de carbonos de 14 que alberga una desaturación en la conformación Z en la posición 9. Este alcohol graso es un precursor de (Z)9-C14:OAc, que es un componente importante de las feromonas derivadas de varias especies, por ejemplo, el gusano cogollero Spodoptera frugiperda.
Los alcoholes grasos desaturados producidos por la presente célula de levadura pueden estar desaturados en más de una posición. Los alcoholes grasos desaturados pueden estar desaturados en al menos dos posiciones, tal como al menos en tres posiciones, tal como en cuatro posiciones.
Por ejemplo, pueden producirse alcoholes grasos (E)7, (Z)9 desaturados que tienen una longitud de cadena de carbonos de 14. Pueden producirse alcoholes grasos (Z)9, (E)11, (E)13 desaturados que tienen una longitud de cadena de carbonos de 14.
Los alcoholes grasos desaturados así producidos pueden modificarse adicionalmente como se sabe en la técnica, por ejemplo, mediante el acortamiento de la cadena de carbonos, con el fin de obtener alcoholes grasos desaturados que tienen una cadena de carbonos de menos de 14, tal como 12, 10, 8, 6 o 4. Así, pueden producirse alcoholes grasos (E)7, (Z)9 desaturados con una longitud de cadena de carbonos de 12 , y pueden producirse alcoholes grasos (z )9, (E)11, (E)13 desaturados con un longitud de la cadena de carbonos de 12.
Con el fin de aumentar aún más la producción de alcoholes grasos desaturados, puede ser beneficioso mutar uno o más genes que codifican una lipasa para que la lipasa correspondiente tenga una pérdida parcial o total de actividad. Por consiguiente, en algunas realizaciones, la célula de levadura puede ser como se describe en la presente memoria y, además, portar una o más mutaciones que dan lugar a la pérdida total o parcial de la actividad de una o más lipasas.
Se sabe en la técnica que existen numerosos genes que codifican lipasas. Su expresión y/o actividad puede ser una función del medio en el que se cultiva la célula de levadura. Por consiguiente, la elección del medio puede ayudar a elegir qué gen de lipasa debe delecionarse o mutarse con el fin de que la lipasa correspondiente tenga una actividad reducida o pérdida total de actividad en dicho medio.
Varias lipasas pueden ser activas en un medio al mismo tiempo. Por tanto, en algunas realizaciones, la célula de levadura tiene varias mutaciones, lo que da lugar a la pérdida total o parcial de la actividad de varias lipasas. Con el fin de limitar la degradación del acetato de alcohol graso, en algunas realizaciones, la célula de levadura tiene varias mutaciones que dan lugar a la pérdida total o parcial de la actividad de todas las lipasas que se sabe o se sospecha que son activas en un medio dado.
A modo de ejemplo, la lipasa 2, la lipasa 5 y la lipasa 8 son las principales lipasas activas en Yarrowia lipolytica cuando las células crecen en glucosa. Por consiguiente, si se emplea un medio basado en glucosa, puede considerarse la pérdida total o parcial de actividad de una, dos o todas de la lipasa 2, lipasa 5 y lipasa 8.
En algunas realizaciones, la lipasa tiene al menos un 60 % de homología con la lipasa 2 de Y. lipolytica como se muestra en la SEQ ID NO: 72, tal como al menos un 61 % de homología, tal como al menos un 62 % de homología, tal como al menos un 63 % de homología, tal como al menos un 64 % de homología, tal como al menos un 65 % de homología, tal como al menos un 66 % de homología, tal como al menos un 67 % de homología, tal como al menos un 68 % de homología, tal como al menos un 69 % de homología, tal como al menos un 70 % de homología, tal como al menos un 71 % de homología, tal como al menos un 72 %, tal como al menos un 73 %, tal como al menos un 74 %, tal como al menos un 75 %, tal como al menos un 76 %, tal como al menos un 77 %, tal como al menos un 78 %, tal como al menos un 79 %, tal como al menos un 80 %, tal como al menos un 81 %, tal como al menos un 82 %, tal como al menos un 83 %, tal como al menos un 84 %, tal como al menos un 85 %, tal como al menos un 86 %, tal como al menos un 87 %, tal como al menos un 88 %, tal como al menos un 89 %, tal como al menos un 90 %, tal como al menos un 91 %, tal como al menos un 92 %, tal como al menos un 93 %, tal como al menos un 94 %, tal como al menos un 95 %, tal como al menos un 96 %, tal como al menos un 97 %, tal como al menos un 98 %, tal como al menos un 99 %, tal como un 100 % de homología. En otras realizaciones, la lipasa tiene al menos un 60 % de homología con la lipasa 7 de Y. lipolytica como se muestra en la SEQ ID NO: 73, tal como al menos un 61 % de homología, tal como al menos un 62 % de homología, tal como al menos un 63 % de homología, tal como al menos un 64 % de homología, tal como al menos un 65 % de homología, tal como al menos un 66 % de homología, tal como al menos un 67 % de homología, tal como al menos un 68 % de homología, tal como al menos un 69 % de homología, tal como al menos un 70 % de homología, tal como al menos un 71 % de homología, tal como al menos un 72 %, tal como al menos un 73 %, tal como al menos un 74 %, tal como al menos un 75 %, tal como al menos un 76 %, tal como al menos un 77 %, tal como al menos un 78 %, tal como al menos un 79 %, tal como al menos un 80 %, tal como al menos un 81 %, tal como al menos un 82 %, tal como al menos un 83 %, tal como al menos un 84 %, tal como al menos un 85 %, tal como al menos un 86 %, tal como al menos un 87 %, tal como al menos un 88 %, tal como al menos un 89 %, tal como al menos un 90 %, tal como al menos un 91 %, tal como al menos un 92 %, tal como al menos un 93 %, tal como al menos un 94 %, tal como al menos un 95 %, tal como al menos un 96 %, tal como al menos un 97 %, tal como al menos un 98 %, tal como al menos un 99 %, tal como un 100 % de homología. En otras realizaciones, la lipasa tiene al menos un 60 % de homología con la lipasa 8 de Y. lipolytica como se muestra en la SEQ ID NO: 74, tal como al menos un 61 % de homología, tal como al menos un 62 % de homología, tal como al menos un 63 % de homología, tal como al menos un 64 % de homología, tal como al menos un 65 % de homología, tal como al menos un 66 % de homología, tal como al menos un 67 % de homología, tal como al menos un 68 % de homología, tal como al menos un 69 % de homología, tal como al menos un 70 % de homología, tal como al menos un 71 % de homología, tal como al menos un 72 %, tal como al menos un 73 %, tal como al menos un 74 %, tal como al menos un 75 %, tal como al menos un 76 %, tal como al menos un 77 %, tal como al menos un 78 %, tal como al menos un 79 %, tal como al menos un 80 %, tal como al menos un 81 %, tal como al menos un 82 %, tal como al menos un 83 %, tal como al menos un 84 %, tal como al menos un 85 %, tal como al menos un 86 %, tal como al menos un 87 %, tal como al menos un 88 %, tal como al menos un 89 %, tal como al menos un 90 %, tal como al menos un 91 %, tal como al menos un 92 %, tal como al menos un 93 %, tal como al menos un 94 %, tal como al menos un 95 %, tal como al menos un 96 %, tal como al menos un 97 %, tal como al menos un 98 %, tal como al menos un 99 %, tal como un 100 % de homología.
En algunas realizaciones, la célula de levadura tiene:
- una mutación que da lugar a la pérdida total o parcial de la actividad de una lipasa que tiene al menos un 60 % de homología con la lipasa 2 de Y. lipolytica como se muestra en la SEQ ID NO: 72; y
- una mutación que da lugar a la pérdida total o parcial de la actividad de una lipasa que tiene al menos un 60 % de homología con la lipasa 7 de Y. lipolytica como se muestra en la SEQ ID NO: 73.
En otras realizaciones, la célula de levadura tiene:
- una mutación que da lugar a la pérdida total o parcial de la actividad de una lipasa que tiene al menos un 60% de homología con la lipasa 2 de Y. lipolytica como se muestra en la SEQ ID NO: 72; y
- una mutación que da lugar a la pérdida total o parcial de la actividad de una lipasa que tiene al menos un 60 % de homología con la lipasa 8 de Y. lipolytica como se muestra en la SEQ ID NO: 74.
En otras realizaciones, la célula de levadura tiene:
- una mutación que da lugar a la pérdida total o parcial de la actividad de una lipasa que tiene al menos un 60 % de homología con la lipasa 7 de Y. lipolytica como se muestra en la SEQ ID NO: 73; y
- una mutación que da lugar a la pérdida total o parcial de la actividad de una lipasa que tiene al menos un 60 % de homología con la lipasa 8 de Y. lipolytica como se muestra en la SEQ ID NO: 74.
En algunas realizaciones, la célula de levadura tiene:
- una mutación que da lugar a la pérdida total o parcial de la actividad de una lipasa que tiene al menos un 60 % de homología con la lipasa 2 de Y. lipolytica como se muestra en la SEQ ID NO: 72; y
- una mutación que da lugar a la pérdida total o parcial de la actividad de una lipasa que tiene al menos un 60 % de homología con la lipasa 7 de Y. lipolytica como se muestra en la SEQ ID NO: 73; y
- una mutación que da lugar a la pérdida total o parcial de la actividad de una lipasa que tiene al menos un 60 % de homología con la lipasa 8 de Y. lipolytica como se muestra en la SEQ ID NO: 74.
Producción de un acetato de alcohol graso desaturado
La célula de levadura de la presente divulgación puede opcionalmente expresar o sobreexpresar una acetiltransferasa nativa o heteróloga capaz de convertir al menos parte de los alcoholes grasos desaturados producidos por la célula en acetatos de alcoholes grasos desaturados y, por lo tanto, puede usarse para la producción de un rango de acetatos grasos desaturados, tales como:
- acetatos grasos (Z)-A9 desaturados que tienen una longitud de cadena de carbonos de 14;
- acetatos grasos (E)-A9 desaturados que tienen una longitud de cadena de carbonos de 14;
Por consiguiente, en una realización, la célula de levadura expresa una A9 desaturasa heteróloga, una FAR heteróloga y una acetiltransferasa y puede usarse para obtener (Z)9-C14:OAc, es decir, un acetato de alcohol graso que tiene una longitud de cadena de carbonos de 14 que alberga una desaturación en conformación Z en la posición 9. Este acetato de alcohol graso es un componente importante de las feromonas derivadas de varias especies, por ejemplo, el gusano cogollero Spodoptera frugiperda.
Los acetatos grasos desaturados producidos por la presente célula de levadura pueden estar desaturados en más de una posición. Los acetatos grasos desaturados pueden estar desaturados en al menos dos posiciones, tal como al menos en tres posiciones, tal como en cuatro posiciones.
Por ejemplo, pueden producirse acetatos grasos (E)7, (Z)9 desaturados que tienen una longitud de cadena de carbonos de 14. Pueden producirse acetatos grasos (Z)9, (E)11, (E)13 desaturados que tienen una longitud de cadena de carbonos de 14.
Los acetatos grasos desaturados así producidos pueden modificarse adicionalmente como se sabe en la técnica, por ejemplo, mediante el acortamiento de la cadena de carbonos, con el fin de obtener acetatos grasos desaturados que tienen una cadena de carbonos de menos de 14, tal como 12, 10, 8, 6 o 4. Así, pueden producirse acetatos grasos (E)7, (Z)9 desaturados que tienen una longitud de cadena de carbonos de 12 , y pueden producirse acetatos grasos (Z)9, (E)11, (E)13 desaturados que tienen una longitud de la cadena de carbonos de 12.
Producción de un aldehido graso desaturado
Si bien la presente divulgación proporciona métodos para producir alcoholes grasos desaturados y acetatos de alcoholes grasos desaturados, puede ser de interés convertir además dichos alcoholes grasos en los aldehídos correspondientes. Por lo tanto, en algunas realizaciones, el método puede comprender además la etapa de convertir al menos parte de los alcoholes grasos en aldehídos grasos, produciendo así aldehídos grasos. Esto se puede lograr por métodos químicos o por ingeniería adicional de la célula de levadura.
En algunas realizaciones, la etapa de convertir al menos parte de los alcoholes grasos en los aldehídos correspondientes es una etapa de conversión química. La conversión química se basa en la oxidación de alcoholes grasos a los aldehídos correspondientes. Los métodos para llevar a cabo esta conversión son conocidos en la técnica. Los métodos preferidos son respetuosos con el medio ambiente y minimizan la cantidad de residuos peligrosos.
Por tanto, en algunas realizaciones, la conversión química puede estar libre de metal, evitando reactivos a base de metales pesados tóxicos, tales como óxidos de manganeso, óxidos de cromo (ox. de Jones, PDC, PCC) o compuestos de rutenio (TPAP, ox. de Ley-Griffith). En algunas realizaciones, la conversión no implica reacciones con sulfóxido de dimetilo activado, tal como la oxidación de Swern o el tipo de Pfitzner-Moffat. Dichas reacciones pueden implicar la formación estereotípica de trazas de compuestos orgánicos de azufre que huelen intensamente, tales como sulfuro de dimetilo que puede ser difícil de eliminar del producto diana.
En algunas realizaciones, el método comprende una reacción de Dess-Martin (Yadav et al., 2004, Meyer et al., 1994). En algunas realizaciones, el método comprende una reacción de oxidación del alcohol aeróbica catalizada por Cobre(I)/ABNO (Steves y Stahl, 2013).
En otras realizaciones, la conversión química comprende la oxidación con hipoclorito de sodio en condiciones de dos fases /acuosa/orgánica (Okada et al., 2014; Tamura et al., 2012; Li et al., 2009). En algunas realizaciones, la oxidación química se puede realizar con 1-clorobenzotriazol en un medio de cloruro de metileno que contiene piridina al 25 % (Ferrell y Yao, 1972).
Alternativamente, la oxidación de un alcohol graso al aldehído graso correspondiente puede realizarse enzimáticamente por alcohol deshidrogenasas. El experto en la técnica sabrá cómo realizar la oxidación enzimática. Por ejemplo, la oxidación enzimática se puede llevar a cabo poniendo en contacto enzimas purificadas, extractos celulares o células enteras, con el alcohol graso.
Los alcoholes grasos que se pueden obtener mediante las células y los métodos descritos en la presente memoria se pueden convertir adicionalmente en aldehídos grasos introduciendo un gen que codifica una acil graso-CoA reductasa formadora de aldehído EC 1.2.1.50 (FAR'). De esta manera, al menos una parte de la acil graso-CoA desaturada puede convertirse en el aldehído graso correspondiente mediante una acil graso-CoA reductasa formadora de aldehído (FAR'). Las enzimas capaces de catalizar esta conversión pueden catalizar una reacción de reducción, donde la acil graso-CoA se reduce a un aldehído graso. Dichas enzimas son acil graso-CoA reductasas formadoras de aldehído, también referidas en la presente memoria como FAR' o "FAR' formadora de aldehído”, con un número EC 1.2.1.50. Catalizan la siguiente reacción:
Acil graso-CoA NADPH = aldehído graso NADP+ coenzima A.
En algunas realizaciones, se puede inducir la expresión de la FAR' formadora de aldehído, por ejemplo, si el gen que codifica esta enzima está bajo el control de promotores inducibles, como se conoce en la técnica. La célula de levadura se incuba en condiciones adecuadas, tales como un medio apropiado y a una temperatura apropiada, como conoce un experto en la técnica. Los medios adecuados que soportan el crecimiento de levaduras son conocidos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a: medios completos no definidos, tales como YEPD (o YPD, Extracto de Levadura de Peptona Dextrosa), medio completo definido, tal como SC (Completo Sintético); medio deficiente definido, tal como SD (Dextrosa Sintética) que carece de uno o más elementos tales como un aminoácido o un inductor.
Así, se pueden obtener los siguientes aldehídos:
- aldehídos grasos (Z)-A9 desaturados que tienen una longitud de cadena de carbonos de 14;
- aldehídos grasos (E)-A9 desaturados que tienen una longitud de cadena de carbonos de 14;
Los aldehídos grasos desaturados producidos por la presente célula de levadura pueden estar desaturados en más de una posición. Los aldehidos grasos desaturados pueden estar desaturados en al menos dos posiciones, tal como al menos en tres posiciones, tal como en cuatro posiciones.
Por ejemplo, pueden producirse aldehídos grasos (E)7, (Z)9 desaturados que tienen una longitud de cadena de carbonos de 14. Pueden producirse aldehídos grasos (Z)9, (E)11, (E)13 desaturados que tienen una longitud de cadena de carbonos de 14.
Los aldehídos grasos desaturados así producidos pueden modificarse adicionalmente como se sabe en la técnica, por ejemplo, mediante el acortamiento de la cadena de carbonos, con el fin de obtener aldehídos grasos desaturados que tienen una cadena de carbonos de menos de 14, tal como 12, 10, 8, 6 o 4. Así, pueden producirse aldehídos grasos (E)7, (Z)9 desaturados que tienen una longitud de cadena de carbonos de 12, y pueden producirse aldehídos grasos (Z)9, (E)11, (E)13 desaturados que tienen una longitud de la cadena de carbonos de 12.
Acil graso-CoA
Con el fin de que la célula de levadura produzca alcoholes grasos desaturados y acetatos de alcoholes grasos desaturados como se describe en la presente memoria, es necesario proporcionar a la célula de levadura acil graso-CoA como sustrato. Preferiblemente, la acil graso-CoA tiene una longitud de cadena de carbonos de 14 y es miristoil-CoA.
Dicha acil graso-CoA puede proporcionarse en el medio en el que se incuba la célula de levadura, o la célula de levadura puede producir naturalmente dicha acil graso-CoA, o la célula de levadura puede modificarse por ingeniería con el fin de producir o aumentar la producción de dicha acil graso-CoA. Preferiblemente, se proporciona a la célula de levadura o es capaz de producir miristoil-CoA.
En algunas realizaciones, la célula de levadura no es naturalmente capaz de producir una acil graso-CoA que tenga una longitud de cadena de carbonos de 14. En este caso, la célula de levadura puede modificarse por ingeniería como se conoce en la técnica, por ejemplo, mediante la introducción de una tioesterasa heteróloga. Así, en algunas realizaciones, se introduce un ácido nucleico que codifica una tioesterasa en la célula de levadura, en un vector o por integración genómica. El gen de la tioesterasa puede estar bajo el control de un promotor inducible o bajo el control de un promotor constitutivo. El ácido nucleico que codifica una tioesterasa puede tener codones optimizados para la célula de levadura, como se sabe en la técnica. En particular, el ácido nucleico puede tener codones optimizados para una célula de Yarrowia, tal como una célula de Yarrowia lipolytica.
En algunas realizaciones, la tioesterasa se deriva de un organismo seleccionado de Cuphea palustris, Cuphea hookeriana, Cinnamomum camphora o de Escherichia coli. En realizaciones preferidas, la tioesterasa se deriva de Escherichia coli o Cinnamomum camphora. En algunas realizaciones, la tioesterasa tiene al menos un 60 % de homología con una tioesterasa seleccionada de la tioesterasa derivada de Cuphea palustris como se muestra en la SEQ ID NO: 23, la tioesterasa derivada de Cuphea hookeriana como se muestra en la SEQ ID NO: 38, la tioesterasa derivada de Cinnamomum camphora como se muestra en la SEQ ID NO: 40, y la tioesterasa derivada de Escherichia coli como se muestra en la SEQ ID NO: 42. Preferiblemente, la tioesterasa tiene al menos un 60 % de homología con la tioesterasa derivada de Cinnamomum camphora como se muestra en la SEQ ID NO: 40 o de Escherichia coli como se muestra en la SEQ ID NO: 42. En una realización, la tioesterasa tiene al menos un 60 % de homología con la tioesterasa derivada de Cinnamomum camphora como se muestra en la SEQ ID NO: 40. En otra realización, la tioesterasa tiene al menos un 60 % de homología con la tioesterasa derivada de Escherichia coli como se muestra en la SEQ ID NO: 42.
En otra realización, la tioesterasa tiene al menos un 60 % de homología con la tioesterasa derivada de Cinnamomum camphora como se muestra en la SEQ ID NO: 40, tal como al menos un 61 % de homología, tal como al menos un 62 % de homología, tal como al menos un 63 % de homología, tal como al menos un 64 % de homología, tal como al menos un 65 % de homología, tal como al menos un 66 % de homología, tal como al menos un 67 % de homología, tal como al menos un 68 % de homología, tal como al menos un 69 % de homología, tal como al menos un 70 % de homología, tal como al menos un 71 % de homología, tal como al menos un 72 %, tal como al menos un 73 %, tal como al menos un 74 %, tal como al menos un 75 %, tal como al menos un 76 %, tal como al menos un 77 %, tal como al menos un 78 %, tal como al menos un 79 %, tal como al menos un 80 %, tal como al menos un 81 %, tal como al menos un 82 %, tal como al menos un 83 %, tal como al menos un 84 %, tal como al menos un 85 %, tal como al menos un 86 %, tal como al menos un 87 %, tal como al menos un 88 %, tal como al menos un 89 %, tal como al menos un 90 %, tal como al menos un 91 %, tal como al menos un 92 %, tal como al menos un 93 %, tal como al menos un 94 %, tal como al menos un 95 %, tal como al menos un 96 %, tal como al menos un 97 %, tal como al menos un 98 %, tal como al menos un 99 %, tal como un 100 % de homología con la tioesterasa derivada de Cinnamomum camphora como se muestra en la SEQ ID NO: 40.
En otra realización, la tioesterasa tiene al menos un 60 % de homología con la tioesterasa derivada de Escherichia coli como se muestra en la SEQ ID NO: 42, tal como al menos un 61 % de homología, tal como al menos un 62 % de homología, tal como al menos un 63 % de homología, tal como al menos un 64 % de homología, tal como al menos un 65 % de homología, tal como al menos un 66 % de homología, tal como al menos un 67 % de homología, tal como al menos un 68 % de homología, tal como al menos un 69 % de homología, tal como al menos un 70 % de homología, tal como al menos un 71 % de homología, tal como al menos un 72 %, tal como al menos un 73 %, tal como al menos un 74 %, tal como al menos un 75 %, tal como al menos un 76 %, tal como al menos un 77 %, tal como al menos un 78 %, tal como al menos un 79 %, tal como al menos un 80 %, tal como al menos un 81 %, tal como al menos un 82 %, tal como al menos un 83 %, tal como al menos un 84 %, tal como al menos un 85 %, tal como al menos un 86 %, tal como al menos un 87 %, tal como al menos un 88 %, tal como al menos un 89 %, tal como al menos un 90 %, tal como al menos un 91 %, tal como al menos un 92 %, tal como al menos un 93 %, tal como al menos un 94 %, tal como al menos un 95 %, tal como al menos un 96 %, tal como al menos un 97 %, tal como al menos un 98 %, tal como al menos un 99 %, tal como un 100 % de homología con la tioesterasa derivada de Escherichia coli como se muestra en la SEQ ID NO: 42.
El ácido nucleico que codifica una tioesterasa puede tener codones optimizados como se sabe en la técnica. En una realización, la célula de levadura es una célula de Yarrowia, preferiblemente una célula de Yarrowia lipolytica, y el ácido nucleico tiene codones optimizados en consecuencia.
En una realización, la al menos una tioesterasa está codificada por un ácido nucleico que tiene al menos un 60 % de homología con el ácido nucleico que codifica la tioesterasa derivada de Cinnamomum camphora como se muestra en la SEQ ID NO: 39, tal como al menos un 61 % de homología, tal como al menos un 62 % de homología, tal como al menos un 63 % de homología, tal como al menos un 64 % de homología, tal como al menos un 65 % de homología, tal como al menos un 66 % de homología, tal como al menos un 67 % de homología, tal como al menos un 68 % de homología, tal como al menos un 69 % de homología, tal como al menos un 70 % de homología, tal como al menos un 71 % de homología, tal como al menos un 72 %, tal como al menos un 73 %, tal como al menos un 74 %, tal como al menos un 75 %, tal como al menos un 76 %, tal como al menos un 77 %, tal como al menos un 78 %, tal como al menos un 79 %, tal como al menos un 80 %, tal como al menos un 81 %, tal como al menos un 82 %, tal como al menos un 83 %, tal como al menos un 84 %, tal como al menos un 85 %, tal como al menos un 86 %, tal como al menos un 87 %, tal como al menos un 88 %, tal como al menos un 89 %, tal como al menos un 90 %, tal como al menos un 91 %, tal como al menos un 92 %, tal como al menos un 93 %, tal como al menos un 94 %, tal como al menos un 95 %, tal como al menos un 96 %, tal como al menos un 97 %, tal como al menos un 98 %, tal como al menos un 99 %, tal como un 100 % de homología con el ácido nucleico que codifica la tioesterasa de Cinnamomum camphora como se muestra en la SEQ ID NO: 39.
En una realización, la al menos una tioesterasa está codificada por un ácido nucleico que tiene al menos un 60 % de homología con el ácido nucleico que codifica la tioesterasa derivada de Escherichia coli como se muestra en la SEQ ID NO: 41, tal como al menos un 61 % de homología, tal como al menos un 62 % de homología, tal como al menos un 63 % de homología, tal como al menos un 64 % de homología, tal como al menos un 65 % de homología, tal como al menos un 66 % de homología, tal como al menos un 67 % de homología, tal como al menos un 68 % de homología, tal como al menos un 69 % de homología, tal como al menos un 70 % de homología, tal como al menos un 71 % de homología, tal como al menos un 72 %, tal como al menos un 73 %, tal como al menos un 74 %, tal como al menos un 75 %, tal como al menos un 76 %, tal como al menos un 77 %, tal como al menos un 78 %, tal como al menos un 79 %, tal como al menos un 80 %, tal como al menos un 81 %, tal como al menos un 82 %, tal como al menos un 83 %, tal como al menos un 84 %, tal como al menos un 85 %, tal como al menos un 86 %, tal como al menos un 87 %, tal como al menos un 88 %, tal como al menos un 89 %, tal como al menos un 90 %, tal como al menos un 91 %, tal como al menos un 92 %, tal como al menos un 93 %, tal como al menos un 94 %, tal como al menos un 95 %, tal como al menos un 96 %, tal como al menos un 97 %, tal como al menos un 98 %, tal como al menos un 99 %, tal como un 100 % de homología con el ácido nucleico que codifica la tioesterasa de Escherichia coli como se muestra en la SEQ ID NO: 41.
En algunas realizaciones, la disponibilidad de ácidos grasos que tienen una longitud de cadena de 14 puede incrementarse o incrementarse aún más. Por ejemplo, el complejo de ácido graso sintasa puede modificarse por ingeniería de modo que aumente la formación de acil graso-CoA C14. El complejo de ácido graso sintasa (EC 2.3.1.86) consiste en de dos subunidades, Fas1 (subunidad beta) y Fas2 (subunidad alfa). La subunidad alfa comprende un dominio de cetoacil sintasa (un "bolsillo de unión") que se supone que está involucrado en la determinación de la longitud de los ácidos grasos sintetizados. En Yarrowia lipolityca, el FAS2 nativo (de tipo salvaje) es como se muestra en la SEQ ID NO: 71.
Por consiguiente, con el fin de dirigir el flujo metabólico hacia la producción de alcoholes, acetatos o aldehídos grasos desaturados que tienen una longitud de cadena de 14 C, la célula de levadura puede expresar además una variante de acil graso sintasa que tiene un dominio de cetona sintasa modificado. Sin estar ligado a la teoría, se plantea la hipótesis de que el dominio de cetona sintasa modificado da lugar a un bolsillo de unión modificado, que por lo tanto acomoda más fácilmente sustratos de longitud media tales como sustratos C14, produciendo así una mayor proporción de productos C14.
En una realización, la célula de levadura es una célula de Yarrowia lipolytica como se describe en la presente memoria, en donde la célula expresa además un complejo de ácido graso sintasa modificado. En una realización, el complejo de ácido graso sintasa se modifica mutando el gen que codifica la subunidad alfa del complejo. En algunas realizaciones, la mutación está en el gen que codifica FAS2. La mutación puede dar lugar a la modificación de uno o más del residuo 1220 (11220), residuo 1217 (M1217) o residuo 1226 (M1226) de la SEQ ID NO: 71, dando lugar a un FAS2 variante. El experto en la técnica sabrá cómo diseñar dichas mutaciones.
Preferiblemente, la mutación da lugar a una variante I1220F, una variante I1220W, una variante I1220Y o una variante I1220H. En una realización específica, la mutación da lugar a una variante I1220F. En algunas realizaciones, la mutación da lugar a una variante M1217F, una variante M1217W, una variante M1217Y o una variante M1217H. En otras realizaciones, la mutación da lugar a una variante M1226F, una variante M1226W, una variante M1226Y o una variante M1226H. También se contemplan células de levadura con más de una de las mutaciones anteriores, tal como dos mutaciones o tres mutaciones en el residuo 11220, M1217 o M1226.
Célula de levadura
La presente divulgación proporciona una célula de levadura que se ha modificado para producir un alcohol graso desaturado y, opcionalmente, un acetato de alcohol graso desaturado. Los alcoholes grasos desaturados y los acetatos de alcoholes grasos desaturados son componentes de las feromonas, en particular de las feromonas de polilla. La célula de levadura divulgada en la presente memoria proporciona una plataforma para la producción de feromonas de polilla respetuosas con el medio ambiente.
La célula de levadura puede ser una célula de levadura de origen no natural, por ejemplo, una célula de levadura que ha sido modificada por ingeniería para producir alcoholes grasos desaturados y acetatos de alcoholes grasos desaturados.
En algunas realizaciones, la célula se ha modificado a nivel genómico, p. ej., mediante la edición de genes en el genoma. La célula también puede modificarse mediante la inserción de al menos una construcción de ácido nucleico, tal como al menos un vector. El vector puede diseñarse como sabe el experto en la técnica para permitir la integración de secuencias de ácido nucleico en el genoma o para permitir la expresión de un polipéptido codificado por una secuencia de ácido nucleico comprendida en el vector sin integración en el genoma.
La célula de levadura puede ser de un género seleccionado de Saccharomyces, Pichia, Yarrowia, Kluyveromyces, Candida, Rhodotorula, Rhodosporidium, Cryptococcus, Trichosporon y Lipomyces. En una realización preferida, el género es Saccharomyces o Yarrowia, lo más preferiblemente el género es Yarrowia.
La célula de levadura puede ser de una especie seleccionada de Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Kluyveromyces marxianus, Cryptococcus albidus, Lipomyces lipofera, Lipomyces starkeyi, Rhodosporidium toruloides, Rhodotorula glutinis, Trichosporon pullulan y Yarrowia lipolytica. En realizaciones preferidas, la célula de levadura es una célula de Saccharomyces cerevisiae o una célula de Yarrowia lipolytica, lo más preferiblemente la célula de levadura es una célula de Yarrowia lipolytica.
La célula de levadura que se va a modificar, que también se denominará célula huésped, puede expresar enzimas nativas que son de la misma clase que las enzimas necesarias para la producción de alcoholes grasos desaturados y acetatos de alcoholes grasos desaturados. En algunos casos, sin embargo, dichas enzimas nativas pueden tener un impacto negativo en la titulación de alcoholes grasos desaturados y/o acetatos de alcoholes grasos desaturados que se pueden obtener; las enzimas nativas pueden así inactivarse mediante métodos conocidos en la técnica, tal como la edición de genes. Por ejemplo, los genes que codifican las enzimas nativas que tienen un impacto negativo en la titulación pueden delecionarse o mutarse para conducir a la pérdida total o parcial de la actividad de la enzima nativa.
Las células de levadura de la presente divulgación expresan al menos una desaturasa heteróloga capaz de introducir al menos un enlace doble en una acil graso-CoA que tiene una longitud de cadena de carbonos de 14 como se describe en la presente memoria, al menos una acil graso-CoA heteróloga reductasa capaz de convertir al menos parte de dicha acil graso-CoA desaturada en un alcohol graso desaturado como se describe en la presente memoria, y opcionalmente una acetiltransferasa capaz de convertir al menos parte de dicho alcohol graso desaturado en un acetato de alcohol graso desaturado, en donde la desaturasa es una A9 desaturasa que tiene al menos al menos un 80 % de homología con la A9 desaturasa de Drosophila melanogaster como se muestra en la SEQ ID NO: 10 y tiene una mayor especificidad hacia tetradecanoil-CoA que hacia hexadecanoil-CoA y, opcionalmente, en donde la acil graso-CoA reductasa tiene una mayor especificidad hacia tetradecanoil-CoA desaturada que hacia hexadecanoil-CoA desaturada.
En algunas realizaciones, la levadura también expresa una acetiltransferasa. En algunas realizaciones, la levadura también expresa una tioesterasa.
En una realización, la célula de levadura expresa:
i) al menos una A9 desaturasa heteróloga que tiene al menos un 80 % de homología con la A9 desaturasa de Drosophila melanogaster como se muestra en la SEQ ID NO: 10; y
ii) al menos una FAR heteróloga; y
iii) opcionalmente, sobreexpresa una acetiltransferasa, y
iv) opcionalmente, sobreexpresa una tioesterasa,
en donde la A9 desaturasa tiene una mayor especificidad hacia tetradecanoil-CoA que hacia hexadecanoil-CoA y/o en donde la acil graso-CoA reductasa tiene una mayor especificidad hacia tetradecanoil-CoA desaturada que hacia hexadecanoil-CoA desaturada, mediante lo cual la célula de levadura produce un alcohol graso que tiene una longitud de cadena de carbonos de 14 y desaturado en la posición 9. La acetiltransferasa puede ser la AcT de la SEQ ID NO: 21 (Atf1, la AcT de S. cerevisiae) o una variante de la misma que tiene al menos un 75 % de homología con Sc_Atf1, tal como al menos un 76 %, tal como al menos un 77 %, tal como al menos un 78 %, tal como al menos un 79 %, tal como al menos un 80 %, tal como al menos un 81 %, tal como al menos un 82 %, tal como al menos un 83 %, tal como al menos un 84 %, tal como al menos un 85 %, tal como al menos un 86 %, tal como al menos un 87 %, tal como al menos un 88 %, tal como al menos un 89 %, tal como al menos un 90 %, tal como al menos un 91 %, tal como al menos un 92 %, tal como al menos un 93 %, tal como al menos un 94 %, tal como al menos un 95 %, tal como al menos un 96 %, tal como al menos un 97 %, tal como al menos un 98 %, tal como al menos un 99 %, tal como un 100 % de homología con la SEQ ID NO: 21. En algunas realizaciones, la tioesterasa tiene al menos un 60 % de homología con una tioesterasa seleccionada de la tioesterasa derivada de Cuphea palustris como se muestra en la SEQ ID NO: 23, la tioesterasa de Cuphea hookeriana como se muestra en la SEQ ID NO: 38, la tioesterasa de Cinnamomum camphora como se muestra en la SEQ ID NO: 40, y la tioesterasa de Escherichia coli como se muestra en la SEQ ID NO: 42. Preferiblemente, la tioesterasa tiene al menos un 60 % de homología con la tioesterasa derivada de Cinnamomum camphora como se muestra en la SEQ ID NO: 40 o de Escherichia coli como se muestra en la SEQ ID NO: 42. En una realización, la tioesterasa tiene al menos un 60 % de homología con la tioesterasa derivada de Cinnamomum camphora como se muestra en la SEQ ID NO: 40. En otra realización, la tioesterasa tiene al menos un 60 % de homología con la tioesterasa derivada de Escherichia coli como se muestra en la SEQ ID NO: 42.
En una realización particular, la célula de levadura expresa:
- una A9 desaturasa que tiene al menos un 80 % de homología con la A9 desaturasa de Drosophila melanogaster como se muestra en la SEQ ID NO: 10, tal como al menos un 81 %, tal como al menos un 82 %, tal como al menos un 83 %, tal como al menos un 84 %, tal como al menos un 85 %, tal como al menos un 86 %, tal como al menos un 87 %, tal como al menos un 88 %, tal como al menos un 89 %, tal como al menos un 90 %, tal como al menos un 91 %, tal como al menos un 92 %, tal como al menos un 93 %, tal como al menos un 94 %, tal como al menos un 95 %, tal como al menos un 96 %, tal como al menos un 97 %, tal como al menos un 98 %, tal como al menos un 99 %, tal como un 100 % de homología con la A9 desaturasa de Drosophila melanogaster como se muestra en la SEQ ID NO: 10; y
- una FAR que tiene al menos un 75 % de homología con Har_FAR como se muestra en la SEQ ID NO: 25 o SEQ ID NO: 27, tal como al menos un 76 %, tal como al menos un 77 %, tal como al menos un 78 %, tal como al menos un 79 %, tal como al menos un 80 %, tal como al menos un 81 %, tal como al menos un 82 %, tal como al menos un 83 %, tal como al menos un 84 %, tal como al menos un 85 %, tal como al menos un 86 %, tal como al menos un 87 %, tal como al menos un 88 %, tal como al menos un 89 %, tal como al menos un 90 %, tal como al menos un 91 %, tal como al menos un 92 %, tal como al menos un 93 %, tal como al menos un 94 %, tal como al menos un 95 %, tal como al menos un 96 %, tal como al menos un 97 %, tal como al menos un 98 %, tal como al menos un 99 %, tal como un 100 % de homología con Har_FAR como se muestra en la SEQ ID NO: 25 o SEQ ID NO: 27;
- y, opcionalmente, expresa o sobreexpresa una acetiltransferasa y/o una tioesterasa. Preferiblemente, la tioesterasa tiene al menos un 60 % de homología con la tioesterasa derivada de Cinnamomum camphora como se muestra en la SEQ ID NO: 40 o de Escherichia coli como se muestra en la SEQ ID NO: 42. En una realización, la tioesterasa tiene al menos un 60 % de homología con la tioesterasa derivada de Cinnamomum camphora como se muestra en la SEQ ID NO: 40. En otra realización, la tioesterasa tiene al menos un 60 % de homología con la tioesterasa derivada de Escherichia coli como se muestra en la SEQ ID NO: 42.
En otra realización particular, la célula de levadura expresa:
- una A9 desaturasa que tiene al menos un 80 % de homología con la A9 desaturasa de Drosophila melanogaster como se muestra en la SEQ ID NO: 10, tal como al menos un 81 %, tal como al menos un 82 %, tal como al menos un 83 %, tal como al menos un 84 %, tal como al menos un 85 %, tal como al menos un 86 %, tal como al menos un 87 %, tal como al menos un 88 %, tal como al menos un 89 %, tal como al menos un 90 %, tal como al menos un 91 %, tal como al menos un 92 %, tal como al menos un 93 %, tal como al menos un 94 %, tal como al menos un 95 %, tal como al menos un 96 %, tal como al menos un 97 %, tal como al menos un 98 %, tal como al menos un 99 %, tal como un 100 % de homología con la A9 desaturasa de Drosophila melanogaster como se muestra en la SEQ ID NO: 10; y
- una FAR que tiene al menos un 75 % de homología con Has_FAR como se muestra en la SEQ ID NO: 29 o SEQ ID NO: 31, tal como al menos un 76 %, tal como al menos un 77 %, tal como al menos un 78 %, tal como al menos un 79 %, tal como al menos un 80 %, tal como al menos un 81 %, tal como al menos un 82 %, tal como al menos un 83 %, tal como al menos un 84 %, tal como al menos un 85 %, tal como al menos un 86 %, tal como al menos un 87 %, tal como al menos un 88 %, tal como al menos un 89 %, tal como al menos un 90 %, tal como al menos un 91 %, tal como al menos un 92 %, tal como al menos un 93 %, tal como al menos un 94 %, tal como al menos un 95 %, tal como al menos un 96 %, tal como al menos un 97 %, tal como al menos un 98 %, tal como al menos un 99 %, tal como un 100 % de homología con Has_FAR como se muestra en la SEQ ID NO: 29 o SEQ ID NO: 31;
- y, opcionalmente, expresa o sobreexpresa una acetiltransferasa y/o una tioesterasa. Preferiblemente, la tioesterasa tiene al menos un 60 % de homología con la tioesterasa derivada de Cinnamomum camphora como se muestra en la SEQ ID NO: 40 o de Escherichia coli como se muestra en la SEQ ID NO: 42. En una realización, la tioesterasa tiene al menos un 60 % de homología con la tioesterasa derivada de Cinnamomum camphora como se muestra en la SEQ ID NO: 40. En otra realización, la tioesterasa tiene al menos un 60 % de homología con la tioesterasa derivada de Escherichia coli como se muestra en la SEQ ID NO: 42.
En otra realización particular, la célula de levadura expresa:
- una A9 desaturasa que tiene al menos un 80 % de homología con la A9 desaturasa de Drosophila melanogaster como se muestra en la SEQ ID NO: 10, tal como al menos un 81 %, tal como al menos un 82 %, tal como al menos un 83 %, tal como al menos un 84 %, tal como al menos un 85 %, tal como al menos un 86 %, tal como al menos un 87 %, tal como al menos un 88 %, tal como al menos un 89 %, tal como al menos un 90 %, tal como al menos un 91 %, tal como al menos un 92 %, tal como al menos un 93 %, tal como al menos un 94 %, tal como al menos un 95 %, tal como al menos un 96 %, tal como al menos un 97 %, tal como al menos un 98 %, tal como al menos un 99 %, tal como un 100 % de homología con la A9 desaturasa de Drosophila melanogaster como se muestra en la SEQ ID NO: 10; y
- una FAR que tiene al menos un 75 % de homología con Hs_FAR como se muestra en la SEQ ID NO: 33 o SEQ ID NO: 35, tal como al menos un 76 %, tal como al menos un 77 %, tal como al menos un 78 %, tal como al menos un 79 %, tal como al menos un 80 %, tal como al menos un 81 %, tal como al menos un 82 %, tal como al menos un 83 %, tal como al menos un 84 %, tal como al menos un 85 %, tal como al menos un 86 %, tal como al menos un 87 %, tal como al menos un 88 %, tal como al menos un 89 %, tal como al menos un 90 %, tal como al menos un 91 %, tal como al menos un 92 %, tal como al menos un 93 %, tal como al menos un 94 %, tal como al menos un 95 %, tal como al menos un 96 %, tal como al menos un 97 %, tal como al menos un 98 %, tal como al menos un 99 %, tal como un 100 % de homología con Hs_FAR como se muestra en la SEQ ID NO: 33 o SEQ ID NO: 35;
- y, opcionalmente, expresa o sobreexpresa una acetiltransferasa y/o una tioesterasa. Preferiblemente, la tioesterasa tiene al menos un 60 % de homología con la tioesterasa derivada de Cinnamomum camphora como se muestra en la SEQ ID NO: 40 o de Escherichia coli como se muestra en la SEQ ID NO: 42. En una realización, la tioesterasa tiene al menos un 60 % de homología con la tioesterasa derivada de Cinnamomum camphora como se muestra en la SEQ ID NO: 40. En otra realización, la tioesterasa tiene al menos un 60 % de homología con la tioesterasa derivada de Escherichia coli como se muestra en la SEQ ID NO: 42.
En otra realización particular, la célula de levadura expresa:
- una A9 desaturasa que tiene al menos un 80 % de homología con la A9 desaturasa de Drosophila melanogaster como se muestra en la SEQ ID NO: 10, tal como al menos un 81 %, tal como al menos un 82 %, tal como al menos un 83 %, tal como al menos un 84 %, tal como al menos un 85 %, tal como al menos un 86 %, tal como al menos un 87 %, tal como al menos un 88 %, tal como al menos un 89 %, tal como al menos un 90 %, tal como al menos un 91 %, tal como al menos un 92 %, tal como al menos un 93 %, tal como al menos un 94 %, tal como al menos un 95 %, tal como al menos un 96 %, tal como al menos un 97 %, tal como al menos un 98 %, tal como al menos un 99 %, tal como un 100 % de homología con la A9 desaturasa de Drosophila melanogaster como se muestra en la SEQ ID NO: 10; y
- una FAR que tiene al menos un 75 % de homología con Ban_FAR como se muestra en la SEQ ID NO: 45, tal como al menos un 76 %, tal como al menos un 77 %, tal como al menos un 78 %, tal como al menos un 79 %, tal como al menos un 80 %, tal como al menos un 81 %, tal como al menos un 82 %, tal como al menos un 83 %, tal como al menos un 84 %, tal como al menos un 85 %, tal como al menos un 86 %, tal como al menos un 87 %, tal como al menos un 88 %, tal como al menos un 89 %, tal como al menos un 90 %, tal como al menos un 91 %, tal como al menos un 92 %, tal como al menos un 93 %, tal como al menos un 94 %, tal como al menos un 95 %, tal como al menos un 96 %, tal como al menos un 97 %, tal como al menos un 98 %, tal como al menos un 99 %, tal como un 100 % de homología con Ban_FAR como se muestra en la SEQ ID NO: 45;
- y, opcionalmente, expresa o sobreexpresa una acetiltransferasa y/o una tioesterasa. Preferiblemente, la tioesterasa tiene al menos un 60 % de homología con la tioesterasa derivada de Cinnamomum camphora como se muestra en la SEQ ID NO: 40 o de Escherichia coli como se muestra en la SEQ ID NO: 42. En una realización, la tioesterasa tiene al menos un 60 % de homología con la tioesterasa derivada de Cinnamomum camphora como se muestra en la SEQ ID NO: 40. En otra realización, la tioesterasa tiene al menos un 60 % de homología con la tioesterasa derivada de Escherichia coli como se muestra en la SEQ ID NO: 42.
En algunas realizaciones, la célula de levadura tiene además una o más mutaciones que dan lugar a una pérdida parcial o total de la actividad de una o más lipasas, como se ha detallado anteriormente en la presente memoria. En algunas realizaciones, la célula de levadura tiene además una mutación que da lugar a la modificación de una o más subunidades del complejo de acil graso sintasa; en particular, se contemplan mutaciones que dan lugar a modificaciones del dominio cetona sintasa, como se ha detallado anteriormente en la presente memoria.
En algunas realizaciones, la célula de levadura tiene además una o más mutaciones que dan lugar a una pérdida parcial o total de la actividad de una o más lipasas y una mutación en una o más modificaciones de una o más subunidades del complejo de acil graso sintasa, particularmente mutaciones que dan lugar a modificaciones del dominio cetona sintasa, como se ha descrito anteriormente en la presente memoria.
Métodos para la producción de alcoholes grasos desaturados y/o acetatos de alcoholes grasos desaturados
En la presente memoria, se proporciona un método para la producción de un ácido graso desaturado y, opcionalmente, un acetato de acilo graso desaturado en una célula de levadura, comprendiendo dicho método las etapas de proporcionar una célula de levadura e incubar dicha célula de levadura en un medio, en donde la célula de levadura expresa:
i) al menos una desaturasa heteróloga capaz de introducir al menos un enlace doble en una acil graso-CoA que tiene una longitud de cadena de carbonos de 14, en donde dicha desaturasa es una A9 desaturasa que tiene al menos un 80 % de homología con la A9 desaturasa de Drosophila melanogaster como se muestra en la SEQ ID NO: 10 y tiene una mayor especificidad hacia tetradecanoil-CoA que hacia hexadecanoil-CoA, convirtiendo de esta manera al menos parte de dicha acil graso-CoA en una acil graso-CoA desaturada; y ii) al menos una acil graso-CoA reductasa heteróloga, capaz de convertir al menos parte de dicha acil graso-CoA desaturada en un alcohol graso desaturado, opcionalmente en donde la FAR tiene una mayor especificidad hacia tetradecanoil-CoA desaturada que hacia hexadecanoil-CoA desaturada, produciendo de esta manera dicho alcohol graso desaturado; y
iii) opcionalmente, una acetiltransferasa capaz de convertir al menos parte de dicho alcohol graso desaturado en un acetato de alcohol graso desaturado, produciendo de esta manera dicho acetato de alcohol graso desaturado.
La célula de levadura puede ser capaz de sintetizar tetradecanoil-CoA de forma natural o puede modificarse por ingeniería para sintetizar tetradecanoil-CoA o se puede proporcionar tetradecanoil-CoA en el medio en el que se incuba la célula, como se describe en la sección "acil graso-CoA". La al menos una desaturasa heteróloga y al menos una acil graso-CoA reductasa heteróloga pueden ser como se describe en otra parte de la presente memoria. La célula de levadura puede ser como se ha descrito anteriormente.
Las células de levadura descritas en la presente memoria se pueden utilizar en un método para producir un alcohol graso desaturado y/o un acetato de alcohol graso desaturado que tiene una longitud de cadena de 14 con titulaciones sin precedentes.
En particular, en algunas realizaciones, la relación de tetradecanoil-CoA desaturada a hexadecanoil-CoA desaturada es de al menos 2, tal como al menos 3, tal como al menos 4, tal como al menos 5, tal como al menos 6, tal como al menos 7, tal como al menos 8, tal como al menos 9, tal como al menos 10, tal como al menos 12,5, tal como al menos 15, o más.
En algunas realizaciones, el método rinde una titulación de alcoholes grasos desaturados de al menos 1 mg/L, tal como al menos 1,5 mg/L, tal como al menos 5 mg/L, tal como al menos 10 mg/L, tal como al menos 25 mg/L, tal como al menos 50 mg/L, tal como al menos 100 mg/L, tal como al menos 250 mg/L, tal como al menos 500 mg/L, tal como al menos 750 mg/L, tal como al menos 1 g/L, tal como al menos 2 g/L, tal como al menos 3 g/L, tal como al menos 4 g/L, tal como al menos 5 g/L, o más.
En algunas realizaciones, el método rinde una titulación de alcoholes grasos desaturados que tienen una longitud de cadena de 14 de al menos 1 mg/L, tal como al menos 1,5 mg/L, tal como al menos 5 mg/L, tal como al menos 10 mg/L, tal como al menos 25 mg/L, tal como al menos 50 mg/L, tal como al menos 100 mg/L, tal como al menos 250 mg/L, tal como al menos 500 mg/L, tal como al menos 750 mg/L, tal como al menos 1 g/L, tal como al menos 2 g/L, tal como al menos 3 g/L, tal como al menos 4 g/L, tal como al menos 5 g/L, o más.
En algunas realizaciones, el método rinde alcoholes grasos desaturados que comprenden al menos un 1 % de un alcohol graso desaturado que tiene una longitud de cadena de 14, tal como al menos un 1,5%, tal como al menos un 2 %, tal como al menos un 2,5 %, tal como al menos un 3 %, tal como al menos un 3,5 %, tal como al menos un 4 %, tal como al menos un 4,5 %, tal como al menos un 5 %, tal como al menos un 7,5 %, tal como al menos un 10 %, o más.
En algunas realizaciones, el método rinde una titulación de acetatos grasos desaturados de al menos 1 mg/L, tal como al menos 1,5 mg/L, tal como al menos 5 mg/L, tal como al menos 10 mg/L, tal como al menos 25 mg/L, tal como al menos 50 mg/L, tal como al menos 100 mg/L, tal como al menos 250 mg/L, tal como al menos 500 mg/L, tal como al menos 750 mg/L, tal como al menos 1 g/L, tal como al menos 2 g/L, tal como al menos 3 g/L, tal como al menos 4 g/L, tal como al menos 5 g/L, o más.
En algunas realizaciones, el método rinde una titulación de acetato graso desaturado que tiene una longitud de cadena de 14 de al menos 1 mg/L, tal como al menos 1,5 mg/L, tal como al menos 5 mg/L, tal como al menos 10 mg/L, tal como al menos 25 mg/L, tal como al menos 50 mg/L, tal como al menos 100 mg/L, tal como al menos 250 mg/L, tal como al menos 500 mg/L, tal como al menos 750 mg/L, tal como al menos 1 g/L, tal como al menos 2 g/L, tal como al menos 3 g/L, tal como al menos 4 g/L, tal como al menos 5 g/L, o más. En algunas realizaciones, el método rinde acetatos grasos desaturados que comprenden al menos un 1 % de un acetato graso desaturado que tiene una longitud de cadena de 14, tal como al menos un 1,5 %, tal como al menos un 2 %, tal como al menos un 2,5 %, tal como al menos un 3 %, tal como al menos un 3,5 %, tal como al menos un 4 %, tal como al menos un 4,5 %, tal como al menos un 5 %, tal como al menos un 7,5 %, tal como al menos un 10 %.
En algunas realizaciones, la célula de levadura puede expresar además una acil graso-CoA reductasa formadora de aldehído EC 1.2.1.50 (FAR') como se ha descrito anteriormente en la presente memoria.
Recuperación
Puede ser deseable recuperar los productos obtenidos por los métodos divulgados en la presente memoria. Por lo tanto, los presentes métodos pueden comprender una etapa adicional de recuperación del alcohol graso desaturado y/o el acetato de alcohol graso desaturado producido por la presente célula de levadura.
En algunas realizaciones, el método comprende una etapa de recuperación de los alcoholes grasos desaturados. En una realización particular, el método comprende una etapa de recuperación de los alcoholes grasos desaturados que tienen una longitud de cadena de carbonos de 14. En otras realizaciones, el método comprende una etapa de recuperación de los acetatos de alcoholes grasos. En una realización particular, el método comprende una etapa de recuperación de los acetatos de alcoholes grasos que tienen una longitud de cadena de carbonos de 14.
Los métodos de recuperación de los productos obtenidos por la presente invención son conocidos en la técnica y pueden comprender una extracción con un disolvente hidrófobo, tal como decano, hexano o un aceite vegetal. Los productos recuperados se pueden modificar más, por ejemplo, los alcoholes grasos desaturados se pueden convertir en los correspondientes aldehídos grasos desaturados como se ha descrito anteriormente en la presente memoria.
Los productos recuperados, es decir, los alcoholes grasos desaturados y/o acetatos de alcoholes grasos desaturados, también se pueden formular en una composición de feromonas. La composición puede comprender además uno o más compuestos adicionales, tales como un vehículo o sustrato líquido o sólido. Los aldehídos grasos obtenidos a partir de dichos alcoholes grasos desaturados también pueden estar comprendidos en dichas composiciones.
Kit
En la presente memoria, se proporciona un kit de partes para realizar los presentes métodos. El kit de partes puede comprender una célula de levadura "lista para usar" como se describe en la presente memoria. En una realización, la célula de levadura es una célula de Yarrowia, tal como una célula de Yarrowia lipolytica.
El kit de partes puede comprender opcionalmente la célula de levadura que se va a modificar.
En algunas realizaciones, el kit de partes comprende todo lo anterior.
Composición de feromonas
Por lo tanto, la presente divulgación proporciona compuestos, en particular alcoholes grasos y acetatos de alcoholes grasos, así como derivados de los mismos, y su uso. En particular, los compuestos que se pueden obtener usando las presentes células y métodos son útiles como componentes de composiciones de feromonas. Dichas composiciones de feromonas pueden ser útiles para la gestión integrada de plagas. Se pueden usar como se sabe en la técnica, p. ej., para interrumpir el apareamiento.
Los alcoholes grasos desaturados y los acetatos de alcoholes grasos desaturados que se pueden obtener mediante los presentes métodos o usando las presentes células de levadura se pueden formular en una composición de feromonas.
Dichas composiciones de feromonas pueden utilizarse como productos de gestión integrada de plagas, que pueden utilizarse en un método para monitorizar la presencia de plagas o en un método para interrumpir el apareamiento de la plaga.
Las composiciones de feromonas como se divulgan en la presente memoria pueden utilizarse como bioplaguicidas. Dichas composiciones pueden pulverizarse o dispensarse en un cultivo, en un campo o en un huerto. Pueden también, como es conocido en la técnica, por ejemplo, ser empapadas, p. ej., en septos de goma, o mezcladas con otros componentes. Esto puede dar lugar a una interrupción del apareamiento, impidiendo de este modo la reproducción de plagas, o puede utilizarse en combinación con un dispositivo de captura para atrapar las plagas. Los ejemplos no limitantes de plagas contra las que se pueden utilizar las presentes composiciones de feromonas son: gusano bellotero del algodón (Helicoverpa armígera), gorgojo del tallo rayado (Chilo suppressalis), polilla de espalda de diamante (Plutella xylostella), polilla de la col (Mamestra brassicae), gran oruga de corazón de col (Crocidolomia binotalis), gorgojo del tallo del maíz europeo (Sesamia nonagrioides), polilla de alas transparentes corriente (Synanthedon tipuliformis) y polilla de la pluma de alcachofa (Platyptilia carduidactylal). Por consiguiente, el uso de las presentes composiciones en un cultivo puede conducir a un mayor rendimiento de los cultivos, sustancialmente sin impacto medioambiental.
Las cantidades relativas de alcoholes grasos y acetatos de alcoholes grasos en las presentes composiciones de feromonas pueden variar dependiendo de la naturaleza del cultivo y/o de la plaga que se va a controlar; también pueden existir variaciones geográficas. La determinación de las cantidades relativas óptimas puede, por tanto, requerir la optimización rutinaria. Las composiciones de feromonas también pueden comprender aldehídos grasos.
Los ejemplos de composiciones utilizadas como repelentes pueden encontrarse en Kehat y Dunkelblum, 1993, para H. armigera, en Alfaro et al., 2009, para C. suppressalis, en Eizaguirre et al., 2002, para S. nonagrioides; en Wu et al., 2012, para P. xylostella; en Bari et al., 2003, para P. carduidactyla
En algunas realizaciones, la composición de feromonas puede comprender además uno o más compuestos adicionales, tales como un vehículo o sustrato líquido o sólido. Por ejemplo, los vehículos o sustratos adecuados incluyen aceites vegetales, aceites minerales refinados o fracciones de los mismos, cauchos, plásticos, sílice, tierra de diatomeas, matriz de cera y polvo de celulosa.
La composición de feromonas se puede formular como se conoce en la técnica. Por ejemplo, puede encontrarse en la forma de una solución, un gel, un polvo. La composición de feromonas puede formularse de modo que pueda dispensarse fácilmente, como se conoce en la técnica.
Ejemplos
Ejemplo 1: Construcción de plásmidos y cepas
Los genes que codifican desaturasas de Pelargonium hortorum (SEQ ID NO: 1) y Ricinus communis (SEQ ID NO: 3) fueron sintetizados por GeneArt (Life Technologies) en versiones con codones optimizados para Y. lipolytica. Los genes que codifican desaturasas de Amyelois transitella (SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 7), de Drosophila melanogaster (SEQ ID NO: 9), y OLE1 de S. cerevisiae fueron sintetizados por GeneArt en versiones con codones optimizados para S. cerevisiae. Los genes sintéticos que codifican la desaturasa de Amyelois transitella y la desaturasa de S. cerevisiae OLE1 tenían sitios attB1-attB2 incorporados, lo que permitió clonar estos genes en el vector pDONR 221 a través del sistema de clonación Gateway (Invitrogen: Gateway® Technology Manual. [http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/ gatewayman.pdf]. El gen que codifica la alcohol acetiltransferasa ATF1 (SEQ ID NO: 19) se amplificó a partir de una preparación de ADN genómico de la cepa de S. cerevisiae CEN.PK102-5B. Un gen que codifica la acil graso reductasa de Helicoverpa armigera se modificó de modo que su supuesta señal KKSYE nativa se reemplazó con la señal HDEL de S. cerevisiae y este gen también fue sintetizado por GeneArt (Life Technologies) en una versión con codones optimizados para S. cerevisiae. Todos los genes fueron amplificados por PCR para obtener los fragmentos para la clonación en vectores de expresión de levadura. Los cebadores se enumeran en la Tabla 1 y los fragmentos de ADN resultantes se enumeran en la Tabla 2. Los productos de PCR se separaron en un gel de agarosa al 1 % que contenía RedSafe™ (iNtRON Biotechnology). Los productos de PCR del tamaño correcto se escindieron del gel y se purificaron utilizando el gel NucleoSpin® y el kit de limpieza de PCR (Macherey-Nagel).
Tabla 1: Cebadores.
Figure imgf000021_0001
Tabla 2: fragmentos de ADN obtenidos por PCR utilizando el molde y cebadores indicados.
Figure imgf000022_0001
Ejemplo 2: Clonación de vectores pYEX-CHT-Dmd9, pYEX-CHT-Phd9, pYEX-CHT-Rcd9, pYEX-CHT-Atrd1432, pYEX-CHT-Atrd236 y pYEX-CHT-OLE1
Los fragmentos de ADN BB1870, BB1871 y BB1872 se amplificaron a partir de los plásmidos pCfB5316, pCfB4584 y pCfB4585, respectivamente, utilizando la Mezcla Maestra de PCR Maxima Hot Start Green (2X) (ThermoFisher Scientific) de acuerdo con el protocolo del fabricante. La mezcla de PCR contenía 20 j l de agua, 25 j l de Mezcla Maestra de PCR Maxima Hot Start Green, 2,5 j l de cebador directo (10 jM ), 2,5 j l de cebador inverso (10 jM ) y 5 ng de molde de ADN y se utilizó el siguiente programa de PCR: 94 °C durante 2 min, 35 ciclos de [94 °C durante 15 seg, 55 °C durante 30 seg, 72 °C durante 2 min 30 seg], 72 °C durante 7 min. Los productos de PCR se separaron en un gel de agarosa al 1 %. Los productos de PCR del tamaño correcto se escindieron del gel y se purificaron utilizando el gel NucleoSpin® y el kit de limpieza de PCR (Macherey-Nagel).
Los fragmentos de ADN resultantes (BB1870, BB1871 y BB1872) se clonaron en el vector pDONR 221 mediante la tecnología de clonación Gateway creando los denominados "clones de entrada" (ThermoFisher Scientific). La reacción de BP se realizó mezclando 100 ng de genes sintéticos, 100 ng de pDONR 221 y 1 jL de clonasa BP (Life Technologies). La reacción se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. La mezcla de reacción se transformó en células HB101 competentes de E. coli (Life Technologies) por choque térmico y las células se sembraron en placas de agar de Caldo de Lisogenia (LB) con 50 mg/L de kanamicina y se incubaron toda la noche a 37 °C. Se inocularon colonias individuales en 5 ml de LB líquido con 50 mg/L de kanamicina en tubos estériles de 13 ml y se cultivaron con agitación toda la noche. Los plásmidos se purificaron a partir cultivos de E. coli de toda la noche y la clonación correcta se confirmó por secuenciación. Los genes se trasladaron desde los clones de entrada al vector de expresión de levadura de destino pYEX-CHT-DEST (Ding BJ, Carraher C, Lofstedt C. 2016. Sequence variation determining stereochemistry of a A11 desaturase active in moth sex pheromone biosynthesis. Insect Biochem Mol Biol. 74: 68-75. doi: 10.1016/j.ibmb.2016.05.002.) mezclando 100 ng de los clones de entrada con 100 ng del vector de destino pYEX-CHT-DEST y 1 jL de clonasa LR (Invitrogen). La reacción se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora, seguido de transformación en células HB101 competentes de E. coli mediante choque térmico. Las células se sembraron en placas de agar de Caldo de Lisogenia (LB) con 100 mg/L de ampicilina. Los plásmidos se purificaron a partir cultivos de E. coli de toda la noche y la clonación correcta se confirmó por secuenciación.
Ejemplo 3: Clonación de vectores pCfB5316, pCfB4584, pCfB4585, pCfB4580
Los bioladrillos de ADN BB0410, BB1696, BB0301, BB1420, BB0301, BB1421, BB0464, BB0915 y BB1422 se amplificaron por PCR como sigue. La mezcla de PCR contenía 32 j l de agua, 10 j l de tampón de polimerasa de alta fidelidad Phusion® (5x), 1 j l de dNTP (10mM), 1 j l de polimerasa U Phusion , 2,5 j l de cebador directo (10 jM ), 2,5 j l de cebador inverso (10 jM ) y 1 j l de molde de ADN y se utilizó el siguiente programa de PCR: 94 °C durante 2 min, 30 ciclos a [94 °C durante 15 seg, 52 °C durante 20 seg, 68 °C durante 1 min 30 seg], 68 °C durante 2 min, pausa a 10 °C.
El vector integrador EasyClone 2.0 pCfB2909 (XII-5-Sin Marcador) se describe en Jessop-Fabre et. al., 2016 y pCfB2190 se describe en Stovicek et al., 2015. El plásmido pCfB2912 se construyó mediante la fusión USER de los fragmentos de ADN BB0593 (contiene el núcleo del vector pCfB387) y BB0598 (contiene el casete de resistencia a nourseotricina), como se describe en Stovicek et al, 2015. Todos los vectores integradores se linealizaron con FastDigest® AsiSI (Fermentas) durante 2 horas a 37 °C y luego se mellaron con Nb.Bsml (New England Biolabs) durante 1 hora a 65 °C. Los vectores resultantes que contienen extremos cohesivos se separaron por electroforesis en gel, se escindieron y se purificaron usando el gel NucleoSpin® y el kit de limpieza de PCR (Macherey-Nagel). Los fragmentos de a Dn se clonaron en los vectores así preparados por clonación USER mediante el siguiente protocolo: se mezclaron 1 j l de plásmido linealizado, 1 j l de fragmento de promotor, 1,5 j l de fragmento de gen, 1 j l de tampón de polimerasa de alta fidelidad Phusion® (5x), y 0,5 j l de enzima USER (New England Biolabs) y se incubaron a 37 °C durante 25 min y a 25 °C durante 25 min. La reacción se transformó en células DHalfa químicamente competentes de E. coli y las células se sembraron en placas de agar con Caldo de Lisogenia (LB) con 100 mg/l de ampicilina. Las placas se incubaron toda la noche a 37 °C y las colonias resultantes se cribaron por PCR de colonias. Los plásmidos se purificaron a partir cultivos de E. coli de toda la noche y la clonación correcta se confirmó por secuenciación. Los vectores construidos se enumeran en la Tabla 3.
Tabla 3: Vectores de expresión.
Figure imgf000023_0001
Ejemplo 4: Construcción de cepas
Los vectores de expresión recombinantes derivados de pYEX-CHT que contenían los diferentes genes de desaturasa se introdujeron en S. cerevisiae deficiente tanto para OLE1 como para ELO1 (MATa elo1::HIS3 ole1::LEU2 ade2 his3 leu2 ura3; (Schneiter et al., 2000)), utilizando el kit de transformación de levadura S.c.
easy (Life Technologies). Para la selección de clones prototróficos de uracilo y leucina, las células de levadura transformadas se sembraron en placas en medio compuesto por YNB al 0,7 % (sin aminoácido, con sulfato de amonio), mezcla deficiente al 1,546 % que carecía de uracilo y leucina (Formedium™ LTD, Norwich, Inglaterra), glucosa al 2 %, tergitol al 1 % (tipo Nonidet NP-40, Sigma-Aldrich Sweden AB, Estocolmo, Suecia), adenina al 0,01 % (Sigma) y ácido oleico 0,5 mM (Sigma). Las cepas de levadura construidas se enumeran en la Tabla 4.
Los vectores de expresión integradores pCfB4580 y pCfB5316 se linealizaron con FastDigest® Notl (Fermentas). pCfB4580 se transformó en S. cerevisiae CEN.PK102-5B utilizando el protocolo de litio-acetato (Gietz y Schiestl, 2007) dando lugar a la cepa ST4854. Los transformantes positivos se seleccionaron en placas deficientes sintéticas de levadura sin leucina (Sigma-Aldrich). La integración correcta de las construcciones de expresión en el genoma de S. cerevisiae se confirmó por PCR de colonias. La cepa ST5290 se construyó integrando pCfB5316 en ST4854 utilizando un método descrito en (Jessop-Fabre et al., 2016). Las cepas construidas se enumeran en la Tabla 5.
Ejemplo 5: Actividades y especificidades de las A9 desaturasas
Las actividades y especificidades de las desaturasas se ensayaron en una cepa de S. cerevisiae con deleciones de los genes OLE1 y ELO1, que codifican la A9-ácido graso desaturasa y la acil elongasa de cadena media, respectivamente (Schneiter et al., 2000).
Tres colonias individuales de las cepas ST_Atr1432, ST_Atr236, ST_Phd9, ST_Rcd9, ST_ScOLE1 y ST_DmeD9 se inocularon en 1 mL de medio selectivo (SC-Ura-Leu) y se incubaron a 30 °C y 300 rpm durante 48 h. Los cultivos se diluyeron a una DO600 de 0,4 en 5 mL de medio selectivo suplementado con CuSO42 mM y miristato de metilo 0,5 mM (14:Me) (Larodan Fine Chemicals, Suecia). La preparación madre de miristato de metilo se preparó a una concentración de 100 mM en etanol al 96 %. Los cultivos de levadura se incubaron a 30 °C a 300 rpm durante 48 horas.
Se tomó una muestra de 1 mL de cultivo y se añadieron 3,12 |jg de éster metílico de ácido nonadecílico como estándar interno. Los lípidos totales se eXtrajeron usando 3,75 mL de metanol/cloroformo (2:1, v/v), en un vial de vidrio. Se añadieron al tubo un mL de ácido acético (0,15 M) y 1,25 mL de agua. Los tubos se agitaron con vórtex vigorosamente y se centrifugaron a 2.000xg durante 2 min. La fase de cloroformo del fondo, aproximadamente 1 mL, que contenía los lípidos totales, se transfirió a un vial de vidrio nuevo y el solvente se evaporó hasta sequedad. Los ésteres metílicos de ácidos grasos (FAME) se prepararon a partir de este extracto de lípidos totales mediante metanólisis ácida. Se añadió al tubo un mililitro de ácido sulfúrico al 2 % en metanol (v/v), se agitó con vórtex vigorosamente y se incubó a 90 °C durante 1 h. Después de la incubación, se añadió 1 mL de agua y se mezcló bien, y luego se utilizó 1 mL de hexano para extraer los FAME.
Las muestras de éster metílico se sometieron a análisis por GC-MS en un GC Hewlett Packard 6890 acoplado a un detector de masa selectivo HP 5973. El GC estaba equipado con una columna INNOWax (30 m * 0,25 mm * 0,25 jm ) y se utilizó helio como gas portador (velocidad promedio: 33 cm/s). La MS se hizo funcionar en el modo de impacto electrónico (70 eV), y el inyector se configuró en el modo sin división a 220 °C. La temperatura del horno se fijó a 80 °C durante 1 min, luego se incrementó a una tasa de 10 °C/min hasta 210 °C, seguido de un mantenimiento a 210 °C durante 15 min, y luego se aumentó a una tasa de 10 °C/min hasta 230 °C seguido de un mantenimiento a 230 °C durante 20 min. Los productos de ácido graso monoinsaturado se identificaron comparando sus tiempos de retención y espectros de masas con los de los estándares sintéticos. Los datos se analizaron con el software ChemStation (Agilent, Technologies, EE. UU.).
Las concentraciones medidas de Z9-14:Me y Z9-16:Me (Tabla 4) muestran que la cepa ST_DmeD9, que expresaba desaturasa de D. melanogaster, dio lugar a la concentración más alta de Z9-14:Me (3,67 mg/L) y a la relación máxima de Z9-14:Me y Z9-16:Me. Esto indica que entre las desaturasas ensayadas, la desaturasa de D. melanogaster tiene la mayor actividad y especificidad hacia el sustrato C14-CoA.
Tabla 4: Actividad especificidad de desaturasas heterólo as en levadura.
Figure imgf000024_0001
Figure imgf000025_0001
Ejemplo 6: Producción de acetato de (Z)9-tetradecen-1-ilo
Las cepas para la producción de feromonas se crearon sobre la base de S. cerevisiae CEN.PK102-5B, que tenía genes OLE1 y ELO1 activos. Las cepas obtenidas se enumeran en la tabla 5.
Las cepas ST4854 y ST5290 se inocularon en 5 ml de medio completo sintético (que carecía de histidina, leucina, triptófano suplementado con 20 mg/L de uracilo y 76 mg/L de histidina) y se cultivaron en tubos de vidrio de 12 ml (Duran, Wertheim, Alemania) con tapas de metal labocap (Lüdiswiss, Flawil, Suiza) toda la noche a 30 °C con agitación a 250 rpm.
Al día siguiente, se centrifugó el cultivo de toda la noche, el sobrenadante se desechó y el sedimento se resuspendió en 2 ml de medio mineral, que tenía la composición como se describe en (Jensen et al, 2014). El medio se suplementó con 76 mg/L de histidina y 20 mg/L de uracilo. Los cultivos se incubaron a 30 °C con agitación a 250 rpm durante 48 horas.
Se transfirió 1 mL de muestra del cultivo a un vial de vidrio de 4 mL y se añadieron 10 pL de preparación madre de estándar interno (1 pg/pl de éster metílico de (Z)10-heptan-1-ilo en etanol al 100 %). Los viales se cubrieron con pequeños trozos de papel de aluminio y se utilizó una aguja para perforar pequeños agujeros en las cubiertas de papel de aluminio. Las muestras se agitaron con vórtex y se pusieron a -80 °C para su almacenamiento hasta el análisis. Las muestras se liofilizaron (Freezone6 y secador de bandeja Stoppening, Labconco, Kansas City, EE. UU.) a -40 °C, a continuación, se añadió 1 mL de cloroformo:metanol 2:1 para la disrupción de las células. La mezcla se agitó con vórtex durante 45 s y se dejó a temperatura ambiente durante 4 horas. Los solventes orgánicos se evaporaron lentamente bajo una corriente de nitrógeno. Se añadió 1 ml de hexano, las muestras se agitaron con vórtex durante 10 s, se centrifugaron y se transfirieron 200 pl a un vial de vidrio nuevo. El análisis por GC-MS se realizó como se describe en el Ejemplo 5. La concentración de acetato de (Z)-9-tetradecen-1-ilo se calculó sobre la base de un estándar interno.
Como es evidente a partir de los resultados, la sobreexpresión de la desaturasa de D. melanogaster aumentó la titulación de Z9:14:OAc más de 5 veces. Además, la fracción del producto de los acetatos de alcoholes grasos totales aumentó del 2 al 10 %.
T l : Pr i n Z - - r n-1-il r l v r
Figure imgf000025_0002
Ejemplo 7: Método para producir Z11-C14:OAc
Un gen, que codifica una A11 desaturasa que produce preferentemente Z11-C14:CoA se sobreexpresa en una cepa de levadura junto con HarFAR y Atf1. La cepa resultante se crece en un medio de cultivo y produce Z11-14:OAc. El gen codifica, por ejemplo, la A11 desaturasa de la polilla enrolladora de hojas con bandas oblicuas Choristoneura rosaceana (SEQ iD NO: 65). La feromona se recupera del caldo y se formula en un producto de interrupción del apareamiento para controlar plagas, como p. ej., el barrenador europeo del maíz Ostrinia nubilalis.
Ejemplo 8: Método para producir E11-C14:OAc
Un gen, que codifica una A11 desaturasa que produce preferentemente E11-C14:CoA se sobreexpresa en una cepa de levadura junto con HarFAR y Atf1. La cepa resultante se crece en un medio de cultivo y produce E11-14:OAc. El gen codifica, por ejemplo, la A11 desaturasa de la polilla del gusano de fuego moteado Choristoneura parallela (SEQ ID NO: 66). La feromona se recupera del caldo y se formula en un producto de interrupción del apareamiento para controlar plagas, como p. ej., la polilla marrón clara de la manzana Epiphyas postvittana.
Ejemplo 9: Construcción de plásmidos y cepas de Yarrowia lipolytica
Se sintetizaron genes que codifican desaturasas de Amyelois transitella (SEQ ID NO: 68), Spodoptera litura (SEQ ID NO: 12) y Drosophila melanogaster (Dmd9; SEQ ID NO: 10), la acil graso reductasa de Helicoverpa armigera (HarFAR; SEQ ID NO: 25), las tioesterasas de Escherichia coli (SEQ ID NO: 42) y de Cinnamomum camphora (SEQ ID NO: 40) y la alcohol acetiltransferasa de Saccharomyces cerevisiae (Atf1; SEQ ID NO: 21) por GeneArt (Life Technologies) en versiones con codones optimizados para Y. lipolytica. La acil graso reductasa de Heliothis subflexa fue sintetizada por GeneArt (Life technologies) en una versión con codones optimizados para Saccharomyces cerevisiae (s Eq ID NO: 70).
En la cepa ST6629, se delecionó el marco de lectura abierto de los genes HFD4 (YALI0B01298g), HFD3 (YALI0A17875), HFD2 (YALI0E15400) y HFD1 (YALI0F23793g), así como los nucleótidos -1130 a -100 aguar arriba de la secuencia codificante de GPAT (YALI0C00209g). Se introdujo un codón de parada prematuro y un desplazamiento de marco en PEX10 (YALI0C01023g) y Fa O1 (YALI0B14014g), dando lugar a genes no funcionales.
La cepa ST7394 se basa en ST6629 y expresa Dmd9, HarFAR y Atf1 como se describe en pCfB6969 y pCfB7600 (Fig. 2) de regiones intergénicas en los cromosomas C (nucleótidos 2192680-2193710) y D (nucleótidos 1842294-1843343).
En la cepa ST6365, los marcos de lectura abiertos de HFD1, HFD4, PEX10 y FAO1 se reemplazaron con casetes de marcadores de selección. ST6365 expresó la A11 desaturasa de A. transitella y la acil graso reductasa de Heliothis subflexa.
La cepa ST6357 expresa Atf1 y HarFAR de una región intergénica en el cromosoma E (nucleótidos 1722042­ 1723055) como se describe en pCfB7235 (Fig. 2).
La cepa ST6359 expresa Atf1 y HarFAR de una región intergénica en el cromosoma E (nucleótidos 1722042­ 1723055) como se describe en pCfB7235 (Fig. 2) y Dmd9 de una región intergénica en el cromosoma E (2881519-2882566) como se describe en pCfB7239 (Fig. 2).
La cepa ST6360 expresa Atf1 y HarFAR de una región intergénica en el cromosoma E (nucleótidos 1722042­ 1723055) como se describe en pCfB7235 y SliDes11 de una región intergénica en el cromosoma E (2881519­ 2882566) como se describe en pCfB7240 (Fig. 2).
La cepa ST6373 expresa Atf1 y HarFAR de una región intergénica en el cromosoma E (nucleótidos 1722042­ 1723055) como se describe en pCfB7235 y Dmd9 and TesA(LL) de una región intergénica en el cromosoma E (2881519-2882566) como se describe en pCfB7251 (Fig. 2).
La cepa ST6375 expresa Atf1 y HarFAR de una región intergénica en el cromosoma E (nucleótidos 1722042­ 1723055) como se describe en pCfB7235 y Dmd9 y CcFATB1 de una región intergénica en el cromosoma E (2881519-2882566) como se describe en pCfB7253 (Fig. 2).
En la cepa ST7010, los nucleótidos 3658-3660 (ATC) del gen de la acil graso sintetasa 2 nativa de Y. lipolytica (YALI19382) se reemplazaron por TTC.
En la cepa ST7895 y ST7944 se delecionaron los marcos de lectura abiertos de los genes LIP2 y LIP2 LIP8, respectivamente.
Ejemplo 10: Método para aumentar la producción de (Z)9-14:OH y (Z)9-14:Ac en Yarrowia lipolytica por expresión heteróloga de tioesterasas
Las cepas de la tabla 9 se inocularon en 2 mL de medio YPG (20 g/L de peptona, 10 g/L de extracto de levadura y 70 g/L de glicerol) a una densidad óptica (600 nm) de 1 y se cultivaron en tubos de vidrio de 12 ml (Duran, Wertheim, Alemania) con tapas de metal labocap (Lüdiswiss, Flawil, Suiza) durante 48 horas a 30 °C agitados a 250 rpm. Si se indicó, el medio se suplementó con 1 g/L de miristato de metilo.
Para la extracción de alcoholes grasos, se transfirió 1 mL de cultivo a un vial de vidrio de 4 mL y se añadieron 10 |jL de solución de estándar interno (2 |jg/pL de éster metílico de (Z)-10-heptan-1-ilo en etanol al 100 %). Los viales se cubrieron con pequeños trozos de papel de aluminio y se utilizó una aguja para perforar pequeños agujeros en las cubiertas de papel de aluminio. Las muestras se agitaron con vórtex y se pusieron a -80 °C para el almacenamiento hasta el análisis. Las muestras se liofilizaron en un sistema de liofilización (Freezone6 y secador de bandeja Stoppening, Labconco, Kansas City, EE. UU.) a -40 °C, a continuación, se añadió 1 mL de cloroformo:metanol 2:1 para la disrupción de las células. La mezcla se agitó con vórtex durante 45 s y se dejó a temperatura ambiente durante 4 horas. Los solventes orgánicos se evaporaron lentamente bajo una corriente de nitrógeno. Se añadió 1 ml de hexano, las muestras se agitaron con vórtex durante 10 s, se centrifugaron y se transfirieron 200 j l a un vial de vidrio nuevo. La cuantificación se realizó con un SCION TQ GC-MS (Bruker), equipado con una columna INNOWax 30 m * 0,25 mm * 0,25 jm , con helio como gas portador. El inyector se configuró en modo sin división a 250 °C, la temperatura del horno se fijó a 80 °C durante 1 min, luego se aumentó a una tasa de 10 °C /min hasta 210 °C, seguido de un mantenimiento a 210 °C durante 10 min, y luego se aumentó a una tasa de 10 °C/min hasta 230 °C seguido de un mantenimiento a 230 °C durante 5 min. El MS se operó en modo de impacto de electrones (70eV), escaneando entre m/z 30 y 350. Los compuestos se identificaron por comparación de los tiempos de retención y los espectros de masas con los de los compuestos de referencia. Los compuestos se cuantificaron por la corriente de iones total (TIC) registrada. Los datos se analizaron con el software BrukerMSWorkstation. Las concentraciones de los alcoholes grasos se calcularon sobre la base de estándares internos (Tabla 9).
El ejemplo muestra la producción de (Z)9-14:OH y (Z)9-14:OAc en la levadura Y. lipolytica. La expresión adicional de tioesterasa bien de E. coli o C. camphora aumentó la producción de los compuestos en un 20 % y 25 %, respectivamente.
Tabla 9. Producción aumentada de (Z)9-14:OH y (Z)9-14:OAc en Yarrowia lipolytica por expresión heteróloga de tioesterasas. En las dos columnas de la derecha, la línea superior indica productos C14, la línea inferior productos C16. N.A.: no disponible.
Figure imgf000027_0001
Ejemplo 11: Método para aumentar la producción de (Z)9-14:OH en Yarrowia lipolytica mediante la introducción de una mutación puntual en la acil graso sintetasa de Yarrowia lipolytica (FAS2)
Las cepas de la tabla 10 se cultivaron como se describe en el ejemplo 10, pero el medio no se suplementó.
Al introducir una mutación puntual (I1220F) en la la acil graso sintetasa nativa (FAS2), la producción de (Z)9-14:OH aumentó aproximadamente 15 veces.
Tabla 10
Figure imgf000027_0002
Figure imgf000028_0001
Ejemplo 12: Método para aumentar la producción de (Z)9-14:Ac en Yarrowia lipolytica por deleción de genes de lipasa de Yarrowia lipolytica
Las cepas de la tabla 11 se cultivaron como se describe en el ejemplo 10. El medio se suplementó con 1 g/L de miristato de metilo. La deleción de la lipasa 2 sola o de la lipasa 2 y la lipasa 8 juntas dio lugar a un aumento de las titulaciones de alcoholes grasos, como puede verse en la fig. 3.
Tabla 11
Figure imgf000028_0002
Secuencias
Compendio
SEQ ID NO: 1 - Secuencia de nucleótidos con codones optimizados para Y. lipolytica de A9 desaturasa de Pelargonium hortorum
SEQ ID NO: 2 - A9 desaturasa de Pelargonium hortorum
SEQ ID NO: 3 - Secuencia de nucleótidos con codones optimizados para Y. lipolytica de A9 desaturasa de Ricinus communis
SEQ ID NO: 4 - A9 desaturasa de Ricinus communis
SEQ ID NO: 5 - Secuencia de nucleótidos con codones optimizados para S. cerevisiae de A9 desaturasa de Amyelois transitella Atr236
Se Q ID NO: 6 - A9 desaturasa de Amyelois transitella Atr236
SEQ ID NO: 7 - Secuencia de nucleótidos con codones optimizados para S. cerevisiae de A9 desaturasa de Amyelois transitella Atr1432
Se Q ID NO: 8 - A9 desaturasa de Amyelois transitella Atr1432
SEQ ID NO: 9 - Secuencia de nucleótidos con codones optimizados para S. cerevisiae de A9 desaturasa de Drosophila melanogaster Dmd9
SEQ ID NO: 10 - A9 desaturasa de Drosophila melanogaster Dmd9
SEQ ID NO: 11 - Secuencia de nucleótidos con codones optimizados para Y. lipolytica de A9 desaturasa de Spodoptera litura Des11
SEQ iD NO: 12 - A9 desaturasa de Spodoptera litura Des11
SEQ ID NO: 13 - Secuencia de nucleótidos con codones optimizados para Y. lipolytica de A9 desaturasa de Chauliognathus lugubris Cld9
SEQ ID NO: 14 - A9 desaturasa de Chauliognathus lugubris Cld9
SEQ ID NO: 15 - Secuencia de nucleótidos con codones optimizados para Y. lipolytica de desaturasa de Tribolium castaneum D6
SEQ ID NO: 16 - desaturasa de Tribolium castaneum D6
SEQ ID NO: 17 - Secuencia de nucleótidos con codones optimizados para Y. lipolytica de desaturasa de Tribolium castaneum D8
SEQ ID NO: 18 - desaturasa de Tribolium castaneum D8
SEQ ID NO: 19 - Secuencia de ADN de ATF1 de Saccharomyces cerevisiae; secuencia de ADN codificante. SEQ ID NO: 20 - Secuencia de nucleótidos con codones optimizados para Y.lipolytica de alcohol acetiltransferasa de S. cerevisiae ATF1
SEQ ID NO: 21 - Secuencia de aminoácidos de ATF1p de Saccharomyces cerevisiae
SEQ ID NO: 22 - Secuencia de nucleótidos con codones optimizados para Y.lipolytica de tioesterasa de Cuphea palustris CpFATB2
SEQ ID NO: 23 - secuencia de proteína de tioesterasa de Cuphea palustris CpFATB2
SEQ ID NO: 24 - Secuencia de nucleótidos con codones optimizados para S. cerevisiae de acil graso reductasa de Helicoverpa armigera; secuencia de ARNm codificante
SEQ ID NO: 25 -Acil graso reductasa de H. armigera
SEQ ID NO: 26 - Secuencia de nucleótidos con codones optimizados para S. cerevisiae de acil graso reductasa de H. armigera con péptido señal cambiado a HDEL; secuencia de ADN codificante.
SEQ ID NO: 27 - Acil graso reductasa de H. armigera con péptido señal cambiado a HDEL
SEQ ID NO: 28 - Secuencia de nucleótidos con codones optimizados para S.cerevisiae de acil graso reductasa de H. assulta; secuencia de ARNm codificante.
SEQ ID NO: 29 - Secuencia de aminoácidos de acil graso reductasa de H. assulta
SEQ ID NO: 30 - Secuencia de nucleótidos con codones optimizados para S.cerevisiae de acil graso reductasa de Helicoverpa assulta con péptido señal cambiado a HDEL; secuencia de ARNm codificante
SEQ ID NO: 31 - secuencia de aminoácidos de acil graso reductasa de H. assulta con péptido señal cambiado a HDEL
SEQ ID NO: 32 - secuencia de nucleótidos con codones optimizados para S. cerevisiae de acil graso reductasa de Heliothis subflexa; secuencia de ARNm codificante.
SEQ ID NO: 33 - Secuencia de aminoácidos de acil graso reductasa de H. subflexa
SEQ ID NO: 34 - Secuencia de nucleótidos con codones optimizados para S. cerevisiae de acil graso reductasa de H. subflexa con péptido señal cambiado a HDEL; secuencia de ARNm codificante
SEQ ID NO: 35 - secuencia de aminoácidos de acil graso reductasa de H. subflexa con péptido señal cambiado a HDEL
SEQ ID NO: 36 - Secuencia de nucleótidos con codones optimizados para Y. lipolytica de A9 desaturasa de Drosophila melanogaster Dmd9
SEQ ID NO: 37 - Secuencia de nucleótidos con codones optimizados para Y. lipolytica de tioesterasa de Cuphea hookeriana ChFatB3
SEQ ID NO: 38 - secuencia de aminoácidos de tioesterasa de Cuphea hookeriana ChFatB3
SEQ ID NO: 39 - Secuencia de nucleótidos con codones optimizados para Y. lipolytica de tioesterasa de Cinnamomum camphora CcFatB1
SEQ ID NO: 40 - secuencia de aminoácidos de tioesterasa de Cinnamomum camphora CcFatB1
SEQ ID NO: 41 - Secuencia de nucleótidos con codones optimizados para Y.lipolytica de tioesterasa de Escherichia coli TesA, sin la secuencia líder, denominada TesA(LL)
SEQ ID NO: 42 - secuencia de proteína de tioesterasa de Escherichia coli TesA, sin la secuencia líder, denominada TesA(LL)
SEQ ID NO: 43 - Secuencia de nucleótidos con codones optimizados para Y. lipolytica de acil graso reductasa de H. armigera Har_FAR
SEQ ID NO: 44 -Secuencia de nucleótidos con codones optimizados para Y.lipolytica de acil graso reductasa de Bicyclus anynana Ban-wFAR2
SEQ ID NO: 45 - secuencia de proteína de acil graso reductasa de Bicyclus anynanaBan-wFAR2
SEQ ID NO: 46 - PR-1852 (PTDH3_dir)
SEQ ID NO: 47 PR-1853 (PTDH3_inv)
SEQ ID NO: 48 PR-1565 (PTEF1)
SEQ ID NO: 49 PR-8332 (Har_FAR_U1_dir)
SEQ ID NO: 50 PR-10739 (Har_FAR_HDEL_U1_inv)
SEQ ID NO: 51 PR-14318 (Phd9_U2_dir)
SEQ ID NO: 52 PR-14276 (Phd9_U2_inv)
SEQ ID NO: 53 PR-14319 (RCd9_U2_dir)
SEQ ID NO: 54 PR-14278 (RCd9_U2_inv)
SEQ ID NO: 55 PR-14320 (Atf1_U2_dir)
SEQ ID NO: 56 PR-14321 (Atf1_U2_inv)
SEQ ID NO: 57 PR-15974 (Dmd9_U1_dir)
SEQ ID NO: 58 PR-15975 (Dmd9_U1_inv)
SEQ ID NO: 59 PR-15976 (attB1_Dmd9_D)
SEQ ID NO: 60 PR-15977 (attB2_Dmd9_I)
SEQ ID NO: 61 PR-15978 (attB1_Phd9_D)
SEQ ID NO: 62 PR-15979 (attB2_Phd9_I)
SEQ ID NO: 63 PR-15980 (attB1_Rcd9_D)
SEQ ID NO: 64 PR-15981 (attB1_Rcd9_I)
SEQ ID NO: 65 A11 desaturasa de Choristoneura rosaceana.
SEQ ID NO: 66 - A11 desaturasa de Choristoneura parallela
SEQ ID NO: 67 - secuencia de nucleótidos con codones optimizados para Y. lipolytica de A11 desaturasa de Amyelois transitella
Se Q ID NO: 68 - A11 desaturasa de Amyelois transitella
SEQ ID NO: 69 - secuencia de nucleótidos con codones optimizados para Y. lipolytica de acil graso reductasa de Helicoverpa armigera
SEQ ID NO: 70 - secuencia de nucleótidos con codones optimizados para S. cerevisiae de acil graso reductasa de Heliothis subflexa
SEQ ID NO: 71: Secuencia de FAS2 (tipo salvaje)
SEQ ID NO: 72: Secuencia de LIP2 de Yarrowia lipolytica.
SEQ ID NO: 73: Secuencia de LIP7 de Y. lipolytica
SEQ ID NO: 74: Secuencia de LIP8 de Y. lipolytica
REFERENCIAS
Alfaro, Navarro-Llopis, Primo, 2009. Optimization of pheromone dispenser density for managing the rice striped stem borer, Chilo suppressalis (Walker), by mating disruption. Crop Protection. 28:567-572.
Bari, 2003. Development of pheromone mating disruption strategies for the suppression of the artichoke plume moth in artichokes grown on the central coast of California. ISHS Acta Horticulturae 660: V International Congress on Artichoke. doi: 10. 17660/ActaHortic.2004.660.80
Eizaguirre, Sans, López, Albajes. 2002. Effects of mating disruption against the Mediterranean corn borer, Sesamia nonagrioides, on the European corn borer Ostrinia nubilalis. Use of pheromones and other semiochemicals in integrated production IOBC wprs Bulletin.
Ferrell, Yao, 1972. Reductive and oxidative synthesis of saturated and unsaturated fatty aldehydes, J Lipid Res.
13(1):23-6.).
Gietz RD, Schiestl RH. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nat Protoc. 2007;2(1):31-4.
Hagstrom, Á.K., Wang, HL., Liénard, M.A., Lassance, J.M., Johansson, T, Lofstedt, C (2013) A moth pheromone brewery: production of (Z)-11-hexadecenol by heterologous co-expression of two biosynthetic genes from a noctuid moth in a yeast cell factory. Microb Cell Fact 12, 125
Jessop-Fabre MM, Jakociunas T, Stovicek V, Dai Z, Jensen MK, Keasling JD, Borodina I. EasyClone-MarkerFree: A vector toolkit for marker-less integration of genes into Saccharomyces cerevisiae via CRISPR-Cas9. Biotechnol J. 2016 ago;11(8):1110-7.
Jensen, Strucko, Kildegaard, David, Maury, Mortensen, Forster, Nielsen, Borodina, 2014. EasyClone: method for iterative chromosomal integration of multiple genes in Saccharomyces cerevisiae, FEMS Yeast Res.
14(2):238-48
Kehat, Dunkelblum, 1993. Sex Pheromones: achievements in monitoring and mating disruption of cotton pests in Israel, Achieves of Insect Biochemistry and Physiology. 22:425-431.
Li, Zhang, 2009. An environmentally benign TEMPO-catalyzed efficient alcohol oxidation system with a recyclable hypervalent iodine(III) reagent andilts facile preparation. Synthesis, 1163-1169a.
Meyer, Schreiber, 1994. Acceleration of the Dess-Martin oxidation by water J. Org. Chem., 59, 7549-7552;
Mitchell y McLaughlin (1982), "Suppression of Mating and Oviposition by Fall Armyworm and Mating by Corn Earworm in Corn, Using the Air Permeation Technique", Journal of Economic Entomology, 75(2):270-274
Okada, Asawa, Sugiyama, Kirihara, Iwai, Kimura, 2014. Sodium hypochlorite pentahydrate (NaOCl5H2O) crystals as an extraordinary oxidant for primary and secondary alcohols. Synlett, 25, 596-598.
Schneiter, R., Tatzer, V., Gogg, G., Leitner, E., Kohlwein, S.D., 2000. Elo1p-dependent carboxy-terminal elongation of C14:A9 to C16:A11 fatty acids in Saccharomyces cerevisiae. J. Bacteriol. 182, 3655-3660.
Steves J.E. y Stahl S.S., 2013. Copper(I)/ABNO-catalyzed aerobic alcohol oxidation: alleviating steric and electronic constraints of Cu/TEMPO catalyst systems. J. Am. Chem. Soc., 135, 15742-15745
Stovicek V, Borja GM, Forster J, Borodina I. EasyClone 2.0: expanded toolkit of integrative vectors for stable gene expression in industrial Saccharomyces cerevisiae strains. J Ind Microbiol Biotechnol. 2015 nov;42(11):1519-31.
Tamura, Aoyama, Takido, Kodomari, 2012. Novel [4-Hydroxy-TEMPO NaCl]/SiO2 as a reusable catalyst for aerobic oxidation of alcohols to carbonyls. Synlett, 23, 1397-1407.
Wu, Zhang, Yao, Xu, Wang y Zhang, 2012. Management of diamondback moth, Plutella xylostella (Lepidoptera: Plutellidae) by mating disruption. Insect Science 19 (6), 643-648.
Yadav, Reddy, Basak, Narsaiah, 2004. Recyclable 2nd generation ionic liquids as green solvents for the oxidation of alcohols with hypervalent iodine reagents, Tetrahedron, 60, 2131-2135.

Claims (12)

REIVINDICACIONES
1. Una célula de levadura capaz de producir un alcohol graso desaturado y, opcionalmente, un acetato de alcohol graso desaturado, expresando dicha célula de levadura:
i) al menos una acil graso-CoA desaturasa heteróloga capaz de introducir al menos un enlace doble en una acil graso-CoA que tiene una longitud de cadena de carbonos de 14, en donde dicha desaturasa es una A9 desaturasa que tiene al menos un 80 % de homología con la A9 desaturasa de Drosophila melanogaster como se muestra en la SEQ ID NO: 10 y tiene una mayor especificidad hacia tetradecanoil-CoA que hacia hexadecanoil-CoA; y
ii) al menos una acil graso-CoA reductasa (FAR) heteróloga (EC 1.2.1.84), capaz de convertir al menos parte de dicha acil graso-CoA desaturada en un alcohol graso desaturado, opcionalmente en donde la FAR tiene una mayor especificidad hacia tetradecanoil-CoA desaturada que hacia hexadecanoil-CoA desaturada; y iii) opcionalmente, una acetiltransferasa (EC 2.3.1.84) capaz de convertir al menos parte de dicho alcohol graso desaturado en un acetato de alcohol graso desaturado.
2. La célula de levadura según la reivindicación 1, en donde la acil graso-CoA reductasa (FAR) se selecciona de:
i) un FAR que tiene al menos un 80 % de homología con la FAR de Helicoverpa armigera como se muestra en la SEQ ID NO: 25 o SEQ ID NO: 27;
ii) una FAR que tiene al menos un 80 % de homología con la FAR de Helicoverpa assulta como se muestra en la SEQ ID NO: 29 o SEQ ID NO: 31;
iii) una FAR que tiene al menos un 80 % de homología con la FAR de Heliothis subflexa como se muestra en la SEQ ID NO: 33 o SEQ ID NO: 35; y
iv) una FAR que tiene al menos un 80 % de homología con la FAR de Bicyclus anynana como se muestra en la SEQ ID NO: 45.
3. La célula de levadura según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la acetiltransferasa es una acetiltransferasa heteróloga expresada a partir de dicha célula de levadura o una acetiltransferasa nativa sobreexpresada a partir de dicha célula de levadura, preferiblemente la acetiltransferasa tiene al menos un 75 % de homología con la acetiltransferasa Atf1 de Saccharomyces cerevisiae como se muestra en la SEQ ID NO: 21.
4. La célula de levadura según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la levadura es de un género seleccionado de Saccharomyces, Pichia, Yarrowia, Kluyveromyces, Candida, Rhodotorula, Rhodosporidium, Cryptococcus, Trichosporon y Lipomyces, preferiblemente el género es Saccharomyces o Yarrowia, preferiblemente la levadura es de una especie seleccionada de Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Kluyveromyces marxianus, Cryptococcus albidus, Lipomyces lipofera, Lipomyces starkeyi, Rhodosporidium toruloides, Rhodotorula glutinis, Trichosporon pullulan y Yarrowia lipolytica, preferiblemente la célula de levadura es una célula de Saccharomyces cerevisiae o una célula de Yarrowia lipolytica, lo más preferiblemente la célula de levadura es una célula de Yarrowia lipolytica.
5. La célula de levadura de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la célula de levadura expresa o sobreexpresa además una tioesterasa, preferiblemente la tioesterasa tiene al menos un 60 % de homología con la tioesterasa de Cinnamomum camphora como se muestra en la SEQ ID NO: 40, o con la tioesterasa de Escherichia coli como se muestra en la SEQ ID NO: 42.
6. La célula de levadura de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la célula de levadura expresa además una variante de acil graso sintasa que tiene un dominio de cetona sintasa modificado, por lo que la célula de levadura sintetiza una mayor proporción de acil graso-CoA C14 que una célula de levadura que expresa una acil graso sintasa nativa en las mismas condiciones.
7. La célula de levadura según la reivindicación 6, en donde la célula de levadura es una célula de Yarrowia lipolytica y en donde la variante de acil graso sintasa es una ácido graso sintasa que comprende una mutación en FAS2 como se muestra en la SEQ ID NO: 71, preferiblemente en donde la mutación en FAS2 es una mutación en la posición 1220, 1217 o 1226 de FAS2 como se muestra en la SEQ ID NO: 71, tal como una mutación I1220F, una mutación I1220Y, una mutación I1220H y/o una mutación M1217F, una mutación M1217W, una mutación M1217Y o una mutación M1217H.
8. Un método para la producción de un alcohol graso desaturado y, opcionalmente, un acetato de alcohol graso desaturado en una célula de levadura, comprendiendo dicho método las etapas de proporcionar una célula de levadura e incubar dicha célula de levadura en un medio, en donde la célula de levadura expresa:
i) al menos una acil graso-CoA desaturasa heteróloga capaz de introducir al menos un enlace doble en una acil graso-CoA que tiene una longitud de cadena de carbonos de 14, en donde dicha desaturasa es una A9 desaturasa que tiene al menos un 80 % de homología con la A9 desaturasa de Drosophila melanogaster como se muestra en la SEQ ID NO: 10 y tiene una mayor especificidad hacia tetradecanoil-CoA que hacia hexadecanoil-CoA, convirtiendo de esta manera al menos parte de dicha acil graso-CoA en una acil graso-CoA desaturada; y
ii) al menos una acil graso-CoA reductasa heteróloga (EC 1.2.1.84), capaz de convertir al menos parte de dicha acil graso-CoA desaturada en un alcohol graso desaturado, opcionalmente en donde la FAR tiene una mayor especificidad hacia tetradecanoil-CoA desaturada que hacia hexadecanoil-CoA desaturada, produciendo de esta manera dicho alcohol graso desaturado; y
iii) opcionalmente, una acetiltransferasa (EC 2.3.1.84) capaz de convertir al menos parte de dicho alcohol graso desaturado en un acetato de alcohol graso desaturado, produciendo de esta manera dicho acetato de alcohol graso desaturado.
9. El método según la reivindicación 8, en donde la célula de levadura es como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
10. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 9, en donde el método rinde un alcohol graso desaturado que tiene una longitud de cadena de 14 con una titulación de al menos 1 mg/L, tal como al menos 1,5 mg/L, tal como al menos 5 mg/L, tal como al menos 10 mg/L, tal como al menos 25 mg/L, tal como al menos 50 mg/L, tal como al menos 100 mg/L, tal como al menos 250 mg/L, tal como al menos 500 mg/L, tal como al menos 750 mg/L, tal como al menos 1 g/L, tal como al menos 2 g/L, tal como al menos 3 g/L, tal como al menos 4 g/L, tal como al menos 5 g/L, o más.
11. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, que comprende además la etapa de recuperar dicho alcohol graso desaturado y/o acetato de alcohol graso desaturado y, opcionalmente, comprende además la etapa de formular el alcohol graso desaturado y/o acetato de alcohol graso desaturado recuperado en una composición de feromonas.
12. Un kit de partes que comprende una célula de levadura según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 e instrucciones de uso.
ES17825466T 2016-12-16 2017-12-15 Producción de alcoholes grasos desaturados y acetatos de acilo grasos desaturados en levaduras Active ES2930358T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP16204783 2016-12-16
PCT/EP2017/083030 WO2018109167A1 (en) 2016-12-16 2017-12-15 Production of desaturated fatty alcohols and desaturated fatty acyl acetates in yeast

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2930358T3 true ES2930358T3 (es) 2022-12-09

Family

ID=57777401

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES17825466T Active ES2930358T3 (es) 2016-12-16 2017-12-15 Producción de alcoholes grasos desaturados y acetatos de acilo grasos desaturados en levaduras

Country Status (14)

Country Link
US (2) US11434506B2 (es)
EP (2) EP3555269B1 (es)
CN (1) CN110291193B (es)
BR (1) BR112019012276B1 (es)
DE (1) DE17825466T1 (es)
DK (1) DK3555269T3 (es)
ES (1) ES2930358T3 (es)
HR (1) HRP20221360T1 (es)
HU (1) HUE060726T2 (es)
MX (2) MX2019007048A (es)
PL (1) PL3555269T3 (es)
RS (1) RS63726B1 (es)
WO (1) WO2018109167A1 (es)
ZA (1) ZA201903482B (es)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3868890A1 (en) 2015-11-18 2021-08-25 Provivi, Inc. Microorganisms for the production of insect pheromones and related compounds
JP7216018B2 (ja) 2017-05-17 2023-01-31 プロヴィヴィ インコーポレイテッド 昆虫フェロモンの生成のための微生物及び関連する化合物
IL292002B2 (en) 2019-10-22 2023-10-01 Biophero Aps Improved methods for the production, recovery and secretion of hydrophobic compounds in culture
WO2021119548A1 (en) * 2019-12-11 2021-06-17 Provivi, Inc. Biosynthesis of insect pheromones and precursors thereof
IL293960A (en) * 2019-12-20 2022-08-01 Biophero Aps Yeast cells and methods for the production of e10,e8-dodecadienyl coenzyme a, codelmon and its derivatives
EP4337781A1 (en) 2021-05-10 2024-03-20 FMC Agricultural Solutions A/S Improved methods and cells for increasing enzyme activity and production of insect pheromones
CA3222768A1 (en) * 2021-07-02 2023-01-05 Carina HOLKENBRINK Methods and yeast cells for production of desaturated compounds
EP4363562A1 (en) 2021-07-02 2024-05-08 FMC Agricultural Solutions A/S Methods and yeast cells for production of desaturated compounds
MX2024001309A (es) 2021-08-06 2024-05-17 Fmc Agricultural Solutions As Metodo para producir aldehidos grasos y derivados de los mismos.

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5876994A (en) 1995-11-16 1999-03-02 Cornell Research Foundation, Inc. Pheromone desaturases
US6593299B1 (en) 1999-04-21 2003-07-15 University Of Florida Research Foundation, Inc. Compositions and methods for controlling pests
DE10208812A1 (de) 2002-03-01 2003-09-11 Basf Plant Science Gmbh Verfahren zur Herstellung von ungesättigten Fettsäuren
ES2204328B1 (es) 2002-10-04 2005-09-01 Consejo Sup. De Invest. Cientificas Procedimiento de produccion de acidos grasos polinsaturados con levaduras por incorporacion de sustratos olefinicos o acetilenicos.
WO2009046231A1 (en) 2007-10-03 2009-04-09 E. I. Du Pont De Nemours And Company Optimized strains of yarrowia lipolytica for high eicosapentaenoic acid production
US20120164686A1 (en) 2010-12-23 2012-06-28 Codexis, Inc. Yeast promoters
US9157103B2 (en) 2010-12-23 2015-10-13 Shell Oil Company Gene disruptants producing fatty acyl-CoA derivatives
US20140357727A1 (en) 2011-12-20 2014-12-04 Codexis, Inc. Fatty alcohol forming acyl reductase (far) variants and methods of use
CN102795997A (zh) 2012-08-21 2012-11-28 昆明博鸿生物科技有限公司 小菜蛾性信息素化合物的合成方法
WO2015013674A2 (en) 2013-07-25 2015-01-29 The Regents Of The University Of California A yeast cell modified to overproduce fatty acid and fatty acid-derived compounds
DK3058078T3 (da) 2013-10-18 2019-11-18 Biopetrolia Ab Manipulation af carbonhydridmetabolisme i gær
DK3167070T3 (da) 2014-05-06 2022-11-07 Per Hofvander Fremstilling af insektpheromonforløbere i planter
EP3313997B1 (en) 2015-06-26 2020-02-05 Danmarks Tekniske Universitet Method for production of moth pheromones in yeast
EP3868890A1 (en) 2015-11-18 2021-08-25 Provivi, Inc. Microorganisms for the production of insect pheromones and related compounds

Also Published As

Publication number Publication date
DK3555269T3 (da) 2022-11-28
WO2018109167A1 (en) 2018-06-21
HRP20221360T1 (hr) 2023-01-06
EP3555269A1 (en) 2019-10-23
ZA201903482B (en) 2022-12-21
US20230135852A1 (en) 2023-05-04
BR112019012276B1 (pt) 2022-08-02
BR112019012276A2 (pt) 2019-11-26
EP3555269B1 (en) 2022-08-31
CN110291193B (zh) 2024-03-08
MX2022015233A (es) 2023-01-11
PL3555269T3 (pl) 2022-12-19
US20200102582A1 (en) 2020-04-02
CN110291193A (zh) 2019-09-27
EP4159850A1 (en) 2023-04-05
HUE060726T2 (hu) 2023-04-28
US11434506B2 (en) 2022-09-06
DE17825466T1 (de) 2019-12-12
RS63726B1 (sr) 2022-12-30
MX2019007048A (es) 2019-08-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2930358T3 (es) Producción de alcoholes grasos desaturados y acetatos de acilo grasos desaturados en levaduras
ES2888232T3 (es) Procedimientos para la producción de alcoholes grasos y sus derivados en levadura
US11844353B2 (en) Microorganisms for the production of insect pheromones and related compounds
EP3313997B1 (en) Method for production of moth pheromones in yeast
US20240327874A1 (en) Yeast cells and methods for production of E8,E10-dodecadienyl coenzyme A, codlemone and derivatives thereof
JP2024521047A (ja) 酵素活性の増加及び昆虫フェロモンの生成のための改善された方法及び細胞
US20240287555A1 (en) Methods and yeast cells for production of desaturated compounds