BR112019012276B1 - Célula de levedura, método para produção de um álcool graxo dessaturado e opcionalmente um acetato de álcool graxo dessaturado, e, kit de partes - Google Patents

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Abstract

A presente invenção refere-se à produção de compostos compreendidos em feromônios, em particular feromônios de traça, tais como álcoois graxos dessaturados e acetatos de acila graxos dessaturados e derivados dos mesmos, a partir de uma célula de levedura.

Description

Campo Técnico
[001] A presente invenção refere-se à produção de compostos compreendidos em feromônios, em particular feromônios de traça, tais como álcoois graxos dessaturados e acetatos de álcool graxos dessaturados e derivados dos mesmos, a partir de uma célula de levedura.
Fundamentos
[002] Desde o advento do DDT mais do que 50 anos atrás, inseticidas neurotóxicos de amplo espectro têm provido os meios principais para o controle de insetos economicamente importantes na agricultura e programas de saúde pública. Apesar de que o uso de inseticidas sintéticos inicialmente resultasse em aumentos espetaculares nos rendimentos de safra e a supressão de alguns vetores de doença humana e animal importantes, o desenvolvimento de resistência a inseticida em populações de praga de inseto e o dano ambiental causado pelos inseticidas tem se tornado amplamente reconhecido como sérias desvantagens para o seu uso. Entre os problemas ambientais mais significantes associados com a fabricação e uso de inseticidas são 1) a sua toxicidade direta para os organismos não alvos (incluindo seres humanos); 2) a sua persistência na bioesfera onde eles podem acumular e causar efeitos desenvolvimentais e reprodutivos adversos em organismos superiores; 3) poluição de fonte pontual significante associada com a sua fabricação e distribuição; 4) a sua dispersão no mundo todo.
[003] Feromônios podem ser usados como controle de praga ao invés de inseticidas. (Z)19-14:OAc por exemplo foi descoberto interromper a eficiência de acasalamento da lagarta do cartucho do milho com 86% de eficiência quando aplicado sozinho, isto é, sem outros componentes de feromônio (Mitchell & McLaughlin, 1992). O uso comercial de feromônios para controlar pragas de inseto pela interrupção do acasalamento tem diversas vantagens em relação aos inseticidas convencionais. Os feromônios são: 1) não tóxicos e ambientalmente benignos; 2) específicos para uma espécie alvo e não afetam adversamente insetos benéficos não alvo, tornando-os extremamente bem apropriados para o uso nos programas de controle de praga integrados; e 3) muito menos provável (e nunca foi mostrado) produzir resistência no inseto alvo. Ao contrário da síntese de feromônio na natureza, métodos correntes para produção comercial de feromônios utilizam vias químicas sintéticas tradicionais. Porque os feromônios requerem pureza muito alta para evocar uma resposta do inseto, estes métodos de síntese são caros e difíceis, e geram grandes quantidades de resíduos orgânicos que requerem tratamento.
[004] Assim o principal obstáculo que se encontra no caminho de usar feromônios sexuais permanece no custo de produção. Como um resultado, uma parte muito grande de terra agrícola global utiliza feromônios (estimado a menos do que 0,05%). A produção de feromônio a partir de uma fábrica de célula é esperado diminuir significantemente os custos de produção de feromônios.
Sumário da Invenção
[005] A invenção é como definida nas reivindicações.
[006] É aqui provida uma célula de levedura capaz de produzir um álcool graxo dessaturado e opcionalmente um acetato de álcool graxo dessaturado, a dita célula de levedura expressando: i) pelo menos uma dessaturase heteróloga capaz de introduzir pelo menos uma ligação dupla em uma acil-CoA graxa tendo um comprimento de cadeia carbônica de 14; e ii) pelo menos uma acil-CoA graxa redutase heteróloga (FAR), capaz de converter pelo menos parte da dita acil-CoA graxa dessaturada para um álcool graxo dessaturado; e iii) opcionalmente uma acetiltransferase capaz de converter pelo menos parte do dito álcool graxo dessaturado para um acetato de álcool graxo dessaturado; em que a dessaturase tem uma especificidade mais alta para tetradecanoil-CoA do que para hexadecanoil-CoA e/ou em que a acil-CoA graxa redutase tem uma especificidade mais alta para a tetradecanoil-CoA dessaturada do que para a hexadecanoil-CoA dessaturada.
[007] Também são providos métodos para produção de uma ácido graxo dessaturada e opcionalmente um acetato de álcool graxo dessaturado em uma célula de levedura, o dito método compreendendo as etapas de prover uma célula de levedura e incubar a dita célula de levedura em um meio, em que a célula de levedura expressa: i) pelo menos uma dessaturase heteróloga capaz de introduzir pelo menos uma ligação dupla em uma acil-CoA graxa tendo um comprimento de cadeia carbônica de 14, convertendo deste modo pelo menos parte da dita acil-CoA graxa para uma acil-CoA graxa dessaturada; e ii) pelo menos uma acil-CoA graxa redutase heteróloga, capaz de converter pelo menos parte da dita acil-CoA graxa dessaturada para um álcool graxo dessaturado, produzindo deste modo o dito álcool graxo dessaturado; e iii) opcionalmente uma acetiltransferase capaz de converter pelo menos parte do dito álcool graxo dessaturado para um acetato de álcool graxo dessaturado, produzindo deste modo o dito acetato de álcool graxo dessaturado; em que a dessaturase tem uma especificidade mais alta para a tetradecanoil-CoA do que para a hexadecanoil-CoA e/ou em que a acil-CoA graxa redutase tem uma especificidade mais alta para a tetradecanoil-CoA dessaturada do que para a hexadecanoil-CoA dessaturada.
[008] Também são aqui providas construções de ácido nucleico para modificar uma célula de levedura, as ditas construções compreendendo: i) um primeiro polinucleotídeo codificando pelo menos uma dessaturase heteróloga capaz de introduzir pelo menos uma ligação dupla em uma acil-CoA graxa tendo um comprimento de cadeia carbônica de 14; e ii) um segundo polinucleotídeo codificando pelo menos uma acil-CoA graxa redutase heteróloga (FAR), capaz de converter pelo menos parte da dita acil-CoA graxa dessaturada para um álcool graxo dessaturado; e iii) opcionalmente um terceiro polinucleotídeo codificando uma acetiltransferase capaz de converter pelo menos parte do dito álcool graxo dessaturado para um acetato de álcool graxo dessaturado, em que opcionalmente o primeiro polinucleotídeo, o segundo polinucleotídeo e/ou o terceiro polinucleotídeo estão sob o controle de um promotor.
[009] Também é provido um kit de partes compreendendo: i) a célula de levedura como aqui divulgada e instruções para o uso; e/ ou ii) uma construção de ácido nucleico como aqui divulgada, em que a dita construção é para modificar uma célula de levedura, e iii) opcionalmente a célula de levedura a ser modificada.
[0010] Também é provido um álcool graxo dessaturado obtenível pelos métodos aqui divulgados.
[0011] Também é provido um acetato de álcool graxo dessaturado obtenível pelos métodos aqui divulgados.
[0012] Também é provido o uso de um álcool graxo dessaturado como aqui divulgado.
[0013] Também é provido o uso de um acetato de álcool graxo dessaturado como aqui divulgado.
Descrição dos desenhos
[0014] Figura 1: caminho para a Z9-C14:OAc. (1) tetradecanoil-CoA (miristoil-CoA), 14:CoA (2) (Z)9-tetradecen-1-il-CoA, Z9-14:CoA, (3) (Z)9- tetradecen-1-ol, Z9-14:OH, (4) acetato de (Z)9-tetradecen-1-ila, Z9-14:OAc, (5) (Z)9-tetradecenal, Z9-14:Ald. Δ9 FAD - Z9-acila graxa dessaturase, FAR - acil-CoA graxa redutase, AcT - acetil-CoA transferase.
[0015] Figura 2: cassetes de expressão. A: cassete de expressão de Dmd9 e HarFAR (codificadas no plasmídeo pCfB6969). B: Cassete de expressão de Atf1 (codificada no plasmídeo pCfB7600). C: Cassetes de expressão de LIP2, LIP7, ou LIP8. “Term.” Significa terminador; “prom.” Significa promotor. D: Cassete de expressão de Atf1 e Dmd9 (pCfB7235). E: Cassete de expressão de Dmd9 (pCfB7239). F: Cassete de expressão de SliDes11 (pCfB7240). G: Cassete de expressão de TesA(LL)/CcFATB1 e Dmd9 (pCfB7251/pCfB7253).
[0016] Figura 3: A deleção de genes da lipase em Y. lipolitica aumenta os títulos de álcool graxo.
Descrição detalhada da invenção Definições
[0017] Biopesticida: o termo “biopesticida” é uma contração de “pesticida biológico” e refere-se a diversos tipos de intervenção de controle de praga: através das relações predatórias, parasíticas, ou químicas. Na EU, os biopesticidas foram definidos como “uma forma de pesticida com base em micro-organismos ou produtos naturais”. Nos EUA, eles são definidos pelo EPA como “incluindo substâncias que ocorrem naturalmente que controlam pragas (pesticidas bioquímicos), microorganismos que controlam pragas (pesticidas microbianos), e substâncias pesticidas produzidas pelas plantas contendo material genético adicionado (protetores incorporados em planta) ou PIPs”. A presente divulgação refere-se mais particularmente aos biopesticidas compreendendo produtos naturais ou substâncias que ocorrem naturalmente. Eles são tipicamente criados pelo cultivo e concentrando organismos que ocorrem naturalmente e/ou seus metabólitos incluindo bactérias e outros micróbios, fungos, nematóides, proteínas, etc. Eles são frequentemente considerados ser componentes importantes de programas de controle de praga integrados (IPM), e receberam muita atenção prática como substitutos para os produtos de proteção de planta química sintética (PPPs). O Manual of Biocontrol Agents (2009: antigamente o Biopesticide Manual) dá uma revisão dos produtos inseticidas biológicos disponíveis (e outro controle com base na biologia).
[0018] Dessaturado: o termo “dessaturado” será aqui usado intercambiavelmente com o termo “insaturado” e refere-se a um composto contendo uma ou mais ligações duplas ou triplas de carbono-carbono.
[0019] Derivado de: o termo quando da alusão a um polipeptídeo ou um polinucleotídeo derivado de um organismo significa que o dito polipeptídeo ou polinucleotídeo são nativos para o dito organismo.
[0020] Ácido graxo: o termo “ácido graxo” refere-se a um ácido carboxílico tendo uma cadeia alifática longa, isto é uma cadeia alifática entre 4 e 28 átomos de carbono, tal como 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 ou 28 átomos de carbono. A maioria dos ácidos graxos que ocorrem naturalmente são não ramificados. Eles podem ser saturados, ou dessaturados.
[0021] Acetato de álcool graxo: o termo será aqui usado intercambiável com “acetato graxo” e refere-se a um acetato tendo uma cadeia carbônica graxa, isto é uma cadeia alifática entre 4 e 28 átomos de carbono, tais como 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 ou 28 átomos de carbono. Os acetatos de álcool graxos podem ser saturados ou dessaturados.
[0022] Acil-CoA graxa: o termo será aqui usado intercambiável com “éster de acil-CoA graxa”, e refere-se a compostos da fórmula geral R-CO- SCoA, onde R é uma cadeia carbônica graxa tendo um comprimento de cadeia carbônica de 4 a 28 átomos de carbono, tal como 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 ou 28 átomos de carbono. A cadeia carbônica graxa é unida ao grupo -SH da coenzima A por uma ligação de tioéster. As acil-CoA graxas podem ser saturadas ou dessaturadas, dependendo se o ácido graxo que é derivado de é saturado ou dessaturado.
[0023] Álcool graxo: o termo “álcool graxo” refere-se aqui a um álcool derivado de uma acil-CoA graxa, tendo um comprimento de cadeia carbônica de 4 a 28 átomos de carbono, tais como 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 ou 28 átomos de carbono. Os álcoois graxos podem ser saturados ou dessaturados.
[0024] Aldeído graxo: o termo refere-se aqui a um aldeído derivado de uma acil-CoA graxa, tendo um comprimento de cadeia carbônica de 4 a 28 átomos de carbono, tal como 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 ou 28 átomos de carbono. Os aldeídos graxos podem ser saturados ou dessaturados.
[0025] Heterólogo: o termo “heterólogo” quando da alusão a um polipeptídeo, tal como uma proteína ou uma enzima, ou a um polinucleotídeo, deve ser aqui interpretado referir-se a um polipeptídeo ou um polinucleotídeo que não está naturalmente presente em uma célula do tipo selvagem. Por exemplo, o termo “Δ9 dessaturase heteróloga” quando aplicada à Saccharomyces cerevisae refere-se a uma Δ9 dessaturase que não está naturalmente presente em uma célula de S. cerevisae tipo selvagem, por exemplo uma Δ9 dessaturase derivada de Drosophila melanogaster.
[0026] Nativo: o termo “nativo” quando da alusão a um polipeptídeo, tal como uma proteína ou uma enzima, ou a um polinucleotídeo, deve ser aqui interpretado referir-se a um polipeptídeo ou um polinucleotídeo que estejam naturalmente presentes em uma célula do tipo selvagem.
[0027] Praga: como aqui usado, o termo “praga” deve referir-se a um organismo, em particular um animal, nocivo aos seres humanos ou interesses humanos, em particular no contexto de produção agrícola ou de criação. Uma praga é qualquer organismo vivo que é invasivo ou prolífico, nocivo, incômodo, pernicioso, destrutivo, um transtorno para as plantas ou animais, seres humanos ou interesses humanos, animais de criação, estruturas humanas, ecossistema selvagem etc. O termo frequentemente sobrepõe com os termos relacionados vermina, erva daninha, parasitas e patógenos vegetais e animais. É possível para um organismo ser uma praga em um cenário mais benéfico, domesticado ou aceitável em um outro.
[0028] Feromônio: feromônios são compostos que ocorrem naturalmente. Os feromônios de Lepidópteros são designados por uma cadeia alifática não ramificada (entre 9 e 18 carbonos, tais como 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 ou 18 átomos de carbono)) terminando em um grupo funcional álcool, aldeído ou acetato e contendo até 3 ligações duplas na cadeia principal alifática. As composições de feromônio podem ser produzidas química ou bioquimicamente, por exemplo como aqui descrito. Feromônios assim compreendem álcoois graxos dessaturados, aldeídos graxos e/ou acetatos de álcool graxos, tais como podem ser obtidos pelos métodos e células aqui descritos.
[0029] Saturado: o termo “saturado” refere-se a um composto que é destituído de ligações de carbono-carbono duplas ou triplas.
[0030] Especificidade: a especificidade de uma enzima para um dado substrato é a preferência exibida por esta enzima para catalisar uma reação partindo do dito substrato. Na presente divulgação, uma dessaturase e/ou uma acil-CoA graxa redutase tendo uma especificidade mais alta para a tetradecanoil-CoA (miristoil-CoA) do que para a hexadecanoil-CoA (palmitoil-CoA) preferivelmente catalisa uma reação com tetradecanoil-CoA do que com a hexadecanoil-CoA como um substrato. Os métodos para determinar a especificidade de uma dessaturase ou uma acil-CoA graxa redutase são conhecidos na técnica. Por exemplo, a especificidade de uma dada dessaturase pode ser determinada incubando-se as células que expressam a dita dessaturase em uma solução compreendendo miristato de metila durante até 48 horas, seguida pela extração e esterificação dos produtos com metanol. Os perfis dos ésteres metílicos de ácido graxo resultantes podem ser depois determinados pela GC-MS. As dessaturases com especificidade mais alta para a miristoil-CoA e baixa especificidade para a palmitoil-CoA resultará em concentração mais alta de (Z)9-C14:Me do que (Z)9-C16:Me. Por exemplo, a especificidade de uma dada redutase pode ser determinada incubando-se células que expressam a dita redutase em uma solução compreendendo o éster de metílico do (Z)9-miristato durante até 48 horas, seguido pela extração e análise dos álcoois graxos resultantes pela GC-MS. As redutases com especificidade mais alta para a (Z)9-C14:CoA e baixa especificidade para a (Z)9-C16:CoA resultará em concentração mais alta de (Z)9-C14:OH do que (Z)9-C16:OH.
Dessaturase
[0031] Na presente divulgação, os termos “acil-CoA graxa dessaturase”, “dessaturase”, “acila graxa dessaturase” e “FAD” serão usados intercambiavelmente. O termo geralmente refere-se a uma enzima capaz de introduzir pelo menos uma ligação dupla nas confirmações E/Z em uma acil- CoA tendo um comprimento de cadeia de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ou 22 átomos de carbono. A ligação dupla pode ser introduzida em qualquer posição. Por exemplo, uma dessaturase introduzindo uma ligação dupla na posição 3 é chamada Δ3 dessaturase. Uma dessaturase introduzindo uma ligação dupla na posição 5 é chamada Δ5 dessaturase. Uma dessaturase introduzindo uma ligação dupla na posição 6 é chamada Δ6 dessaturase. Uma dessaturase introduzindo uma ligação dupla na posição 7 é chamada Δ7 dessaturase. Uma dessaturase introduzindo uma ligação dupla na posição 8 é chamada Δ8 dessaturase. Uma dessaturase introduzindo uma ligação dupla na posição 9 é chamada Δ9 dessaturase. Uma dessaturase introduzindo uma ligação dupla na posição 10 é chamada Δ10 dessaturase. Uma dessaturase introduzindo uma ligação dupla na posição 11 é chamada Δ11 dessaturase. Uma dessaturase introduzindo uma ligação dupla na posição 12 é chamada Δ12 dessaturase. Uma dessaturase introduzindo uma ligação dupla na posição 13 é chamada Δ13 dessaturase. Uma dessaturase introduzindo uma ligação dupla na posição 14 é chamada Δ14 dessaturase. Uma dessaturase introduzindo uma ligação dupla na posição 15 é chamada Δ15 dessaturase. Uma dessaturase introduzindo uma ligação dupla na posição 16 é chamada Δ16 dessaturase. Uma dessaturase introduzindo uma ligação dupla na posição 17 é chamada Δ17 dessaturase. Uma dessaturase introduzindo uma ligação dupla na posição 18 é chamada Δ18 dessaturase. Uma dessaturase introduzindo uma ligação dupla na posição 19 é chamada Δ19 dessaturase. Uma dessaturase introduzindo uma ligação dupla na posição 20 é chamada Δ20 dessaturase.
[0032] As dessaturases catalisam a reação (figura 1):Acil-CoA graxa + 2 ferrocitocromo b5 + O(2) + 2 H(+) <=> acil-CoA graxa dessaturada + 2 ferricitocromo b5 + 2 H(2)O
[0033] Para o propósito da presente divulgação, a dessaturase é capaz de introduzir pelo menos uma ligação dupla em uma acil-CoA graxa tendo um comprimento de cadeia carbônica de 14.
[0034] A célula de levedura aqui divulgada expressa uma dessaturase tendo uma especificidade mais alta para a tetradecanoil-CoA do que para a hexadecanoil-CoA e/ou uma acil-CoA redutase tendo uma especificidade mais alta para a tetradecanoil-CoA dessaturada do que para a hexadecanoil- CoA dessaturada. Em outras palavras, a dessaturase é mais específica para os substratos tendo um comprimento de cadeia carbônica de 14 do que para substratos tendo um comprimento de cadeia de 16. Métodos para determinar a especificidade de uma dessaturase ou uma acil-CoA graxa redutase são conhecidos na técnica. Por exemplo, a especificidade de uma dada dessaturase pode ser determinada incubando-se as células que expressam a dita dessaturase em uma solução compreendendo miristato de metila durante até 48 horas, seguido pela extração e esterificação dos produtos com metanol. Os perfis dos ésteres metílicos de ácido graxo resultantes podem ser depois determinados pela GC-MS. As dessaturases com especificidade mais alta para a miristoil-CoA e baixa especificidade para a palmitoil-CoA resultará em concentração mais alta de (Z)9-C14:Me do que (Z)9-C16:Me. Por exemplo, a especificidade de uma dada redutase pode ser determinada incubando-se as células que expressam a dita redutase em uma solução compreendendo éster metílico de (Z)9-miristato durante até 48 horas, seguido pela extração e análise dos álcoois graxos resultantes pela GC-MS. As redutases com especificidade mais alta para a (Z)9-C14:CoA e especificidade baixa para a (Z)9-C16:CoA resultará em concentração mais alta de (Z)9-C14:OH do que (Z)9-C16:OH.
[0035] Em uma modalidade, a célula é capaz de expressar pelo menos uma Δ5 dessaturase heteróloga. Em uma outra modalidade, a célula é capaz de expressar pelo menos uma Δ6 dessaturase heteróloga. Em uma outra modalidade, a célula é capaz de expressar pelo menos uma Δ7 dessaturase heteróloga. Em uma outra modalidade, a célula é capaz de expressar pelo menos uma Δ8 dessaturase heteróloga. Em uma outra modalidade, a célula é capaz de expressar pelo menos uma Δ9 dessaturase heteróloga. Em uma outra modalidade, a célula é capaz de expressar pelo menos uma Δ10 dessaturase heteróloga. Em uma outra modalidade, a célula é capaz de expressar pelo menos uma Δ11 dessaturase heteróloga. Em uma outra modalidade, a célula é capaz de expressar pelo menos uma Δ12 dessaturase heteróloga. Em uma outra modalidade, a célula é capaz de expressar pelo menos uma Δ13 dessaturase heteróloga. O gene codificando a dessaturase heteróloga pode ser otimizado no códon para a célula de levedura, como é conhecido na técnica.
[0036] A pessoa versada saberá, dependendo de qual álcool graxo dessaturado é desejado, que tipo de dessaturase usar. Por exemplo, para produção de um álcool graxo dessaturado na posição 11, uma Δ11 dessaturase é preferivelmente usada. Se um álcool graxo dessaturado na posição 9 é desejado, uma Δ9 dessaturase pode ser usada, tal como uma Δ9 dessaturase tendo pelo menos 60% de homologia com a Δ9 dessaturase de Drosophila melanogaster como apresentada na SEQ ID NO: 10 ou uma Δ9 dessaturase tendo pelo menos 60% de homologia com a Δ9 dessaturase de Spodoptera litura como apresentada na SEQ ID NO: 12.
[0037] Em uma modalidade, a pelo menos uma dessaturase heteróloga é uma Δ9 dessaturase tendo pelo menos 60% de homologia com a Δ9 dessaturase de Drosophila melanogaster como apresentada na SEQ ID NO: 10, tal como pelo menos 61% de homologia, tal como pelo menos 62% de homologia, tal como pelo menos 63% de homologia, tal como pelo menos 64% de homologia, tal como pelo menos 65% de homologia, tal como pelo menos 66% de homologia, tal como pelo menos 67% de homologia, tal como pelo menos 68% de homologia, tal como pelo menos 69% de homologia, tal como pelo menos 70% de homologia, tal como pelo menos 71% de homologia, tal como pelo menos 72%, tal como pelo menos 73%, tal como pelo menos 74%, tal como pelo menos 75%, tal como pelo menos 76%, tal como pelo menos 77%, tal como pelo menos 78%, tal como pelo menos 79%, tal como pelo menos 80%, tal como pelo menos 81%, tal como pelo menos 82%, tal como pelo menos 83%, tal como pelo menos 84%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 86%, tal como pelo menos 87%, tal como pelo menos 88%, tal como pelo menos 89%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 91%, tal como pelo menos 92%, tal como pelo menos 93%, tal como pelo menos 94%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, tal como pelo menos 97%, tal como pelo menos 98%, tal como pelo menos 99%, tal como 100% de homologia com a Δ9 dessaturase de Drosophila melanogaster como apresentada na SEQ ID NO: 10.
[0038] Em uma outra modalidade, a pelo menos uma dessaturase heteróloga é uma Δ9 dessaturase tendo pelo menos 60% de homologia com a Δ9 dessaturase de Spodoptera litura como apresentada na SEQ ID NO: 12, tal como pelo menos 61% de homologia, tal como pelo menos 62% de homologia, tal como pelo menos 63% de homologia, tal como pelo menos 64% de homologia, tal como pelo menos 65% de homologia, tal como pelo menos 66% de homologia, tal como pelo menos 67% de homologia, tal como pelo menos 68% de homologia, tal como pelo menos 69% de homologia, tal como pelo menos 70% de homologia, tal como pelo menos 71% de homologia, tal como pelo menos 72%, tal como pelo menos 73%, tal como pelo menos 74%, tal como pelo menos 75%, tal como pelo menos 76%, tal como pelo menos 77%, tal como pelo menos 78%, tal como pelo menos 79%, tal como pelo menos 80%, tal como pelo menos 81%, tal como pelo menos 82%, tal como pelo menos 83%, tal como pelo menos 84%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 86%, tal como pelo menos 87%, tal como pelo menos 88%, tal como pelo menos 89%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 91%, tal como pelo menos 92%, tal como pelo menos 93%, tal como pelo menos 94%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, tal como pelo menos 97%, tal como pelo menos 98%, tal como pelo menos 99%, tal como 100% de homologia com a Δ9 dessaturase de Spodoptera litura como apresentada na SEQ ID NO: 12.
[0039] Em uma modalidade, a dessaturase heteróloga é derivada de Pelargonium hortorum. Em uma outra modalidade, a dessaturase heteróloga é derivada de Chauliognathus lugubris. Em algumas modalidades, a dessaturase heteróloga é derivada de Drosophila melanogaster.
[0040] A dessaturase heteróloga pode ser derivada de um organismo pertencente à ordem das Lepidoptera. Assim em uma modalidade, a dessaturase heteróloga é derivada de Spodoptera litura. Em uma outra modalidade, a dessaturase heteróloga é derivada de Choristoneura rosaceana. Em uma outra modalidade, a dessaturase heteróloga é derivada de Choristoneura parallela.
[0041] Uma dessaturase heteróloga pode ser expressa a partir de um ácido nucleico introduzido na célula, por exemplo em um vetor tal como um plasmídeo, ou pela integração genômica. O ácido nucleico pode ser otimizado no códon como é conhecido na técnica para a célula de levedura específica usada.
[0042] Em uma modalidade, a pelo menos uma dessaturase heteróloga é codificada por um ácido nucleico tendo pelo menos 60% de homologia com o ácido nucleico codificando a Δ9 dessaturase de Drosophila melanogaster como apresentada na SEQ ID NO: 9, tal como pelo menos 61% de homologia, tal como pelo menos 62% de homologia, tal como pelo menos 63% de homologia, tal como pelo menos 64% de homologia, tal como pelo menos 65% de homologia, tal como pelo menos 66% de homologia, tal como pelo menos 67% de homologia, tal como pelo menos 68% de homologia, tal como pelo menos 69% de homologia, tal como pelo menos 70% de homologia, tal como pelo menos 71% de homologia, tal como pelo menos 72%, tal como pelo menos 73%, tal como pelo menos 74%, tal como pelo menos 75%, tal como pelo menos 76%, tal como pelo menos 77%, tal como pelo menos 78%, tal como pelo menos 79%, tal como pelo menos 80%, tal como pelo menos 81%, tal como pelo menos 82%, tal como pelo menos 83%, tal como pelo menos 84%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 86%, tal como pelo menos 87%, tal como pelo menos 88%, tal como pelo menos 89%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 91%, tal como pelo menos 92%, tal como pelo menos 93%, tal como pelo menos 94%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, tal como pelo menos 97%, tal como pelo menos 98%, tal como pelo menos 99%, tal como 100% de homologia com o ácido nucleico codificando a Δ9 dessaturase de Drosophila melanogaster como apresentada na SEQ ID NO: 9.
[0043] Em uma outra modalidade, a pelo menos uma dessaturase heteróloga é codificada por um ácido nucleico tendo pelo menos 60% de homologia com o ácido nucleico codificando a Δ9 dessaturase de Drosophila melanogaster como apresentada na SEQ ID NO: 36, tal como pelo menos 61% de homologia, tal como pelo menos 62% de homologia, tal como pelo menos 63% de homologia, tal como pelo menos 64% de homologia, tal como pelo menos 65% de homologia, tal como pelo menos 66% de homologia, tal como pelo menos 67% de homologia, tal como pelo menos 68% de homologia, tal como pelo menos 69% de homologia, tal como pelo menos 70% de homologia, tal como pelo menos 71% de homologia, tal como pelo menos 72%, tal como pelo menos 73%, tal como pelo menos 74%, tal como pelo menos 75%, tal como pelo menos 76%, tal como pelo menos 77%, tal como pelo menos 78%, tal como pelo menos 79%, tal como pelo menos 80%, tal como pelo menos 81%, tal como pelo menos 82%, tal como pelo menos 83%, tal como pelo menos 84%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 86%, tal como pelo menos 87%, tal como pelo menos 88%, tal como pelo menos 89%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 91%, tal como pelo menos 92%, tal como pelo menos 93%, tal como pelo menos 94%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, tal como pelo menos 97%, tal como pelo menos 98%, tal como pelo menos 99%, tal como 100% de homologia com o ácido nucleico codificando a Δ9 dessaturase de Drosophila melanogaster como apresentada na SEQ ID NO: 36.
[0044] Em uma outra modalidade, a pelo menos uma dessaturase heteróloga é codificada por um ácido nucleico tendo pelo menos 60% de homologia com o ácido nucleico codificando a Δ9 dessaturase de Spodoptera litura como apresentada na SEQ ID NO: 11, tal como pelo menos 61% de homologia, tal como pelo menos 62% de homologia, tal como pelo menos 63% de homologia, tal como pelo menos 64% de homologia, tal como pelo menos 65% de homologia, tal como pelo menos 66% de homologia, tal como pelo menos 67% de homologia, tal como pelo menos 68% de homologia, tal como pelo menos 69% de homologia, tal como pelo menos 70% de homologia, tal como pelo menos 71% de homologia, tal como pelo menos 72%, tal como pelo menos 73%, tal como pelo menos 74%, tal como pelo menos 75%, tal como pelo menos 76%, tal como pelo menos 77%, tal como pelo menos 78%, tal como pelo menos 79%, tal como pelo menos 80%, tal como pelo menos 81%, tal como pelo menos 82%, tal como pelo menos 83%, tal como pelo menos 84%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 86%, tal como pelo menos 87%, tal como pelo menos 88%, tal como pelo menos 89%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 91%, tal como pelo menos 92%, tal como pelo menos 93%, tal como pelo menos 94%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, tal como pelo menos 97%, tal como pelo menos 98%, tal como pelo menos 99%, tal como 100% de homologia com o ácido nucleico codificando a Δ9 dessaturase de Spodoptera litura como apresentada na SEQ ID NO: 11.
[0045] Em algumas modalidades, a pelo menos uma dessaturase heteróloga é pelo menos duas dessaturases heterólogas, por exemplo duas dessaturases heterólogas. Em algumas modalidades, as duas dessaturases heterólogas são a Δ9 dessaturase de Drosophila melanogaster Dmd9 e a Δ11 dessaturase de Amyelois transitella, como apresentadas na SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 68, respectivamente.
[0046] A célula de levedura a ser modificada pode expressar uma dessaturase nativa, que pode ter um impacto negativo sobre a produção de álcool graxo dessaturado e/ou acetato de álcool graxo dessaturado. Consequentemente, se a célula de levedura a ser modificada expressa uma tal dessaturase nativa, a célula pode preferivelmente ser modificada de modo que a atividade da dessaturase nativa seja reduzida ou ausente.
[0047] Para garantir a falta de atividade de uma dessaturase nativa, os métodos conhecidos na técnica podem ser utilizados. O gene codificando a dessaturase nativa pode ser deletado ou parcialmente deletado de modo a garantir que a dessaturase nativa não seja expressa. Alternativamente, o gene pode ser mutado de modo que a dessaturase nativa seja expressa, mas falte atividade, por exemplo pela mutação do sítio catalítico da enzima. Alternativamente, a tradução de mRNA para uma proteína ativa pode ser prevenida pelos métodos tais como RNA silenciador ou siRNA. Alternativamente, a célula de levedura pode ser incubada em um meio compreendendo um inibidor que iniba a atividade da dessaturase nativa. Um composto inibindo a transcrição do gene codificando a dessaturase nativa também pode ser provido de modo que a transcrição seja inativada quando o dito composto estiver presente.
[0048] A inativação da dessaturase nativa pode assim ser permanente ou de longa duração, isto é a célula de levedura modificada exibe atividade reduzida ou nenhuma atividade da dessaturase nativa em uma maneira estável, ou pode ser transitória, isto é a célula de levedura modificada pode exibir atividade da dessaturase nativa durante períodos de tempo, mas esta atividade pode ser suprimida durante outros períodos de tempo.
Acil-CoA graxa redutase que forma álcool (EC 1.2.1.84)
[0049] Os termos “acil-CoA graxa redutase que forma álcool”, “acil- CoA graxa redutase” e “FAR” serão aqui usados intercambiavelmente. O termo “FAR heterólogo” refere-se a uma FAR que não é naturalmente expressa pela célula de levedura. FARs catalisam a reação de duas etapas (figura 1) acil-CoA + 2 NADPH <=> CoA + álcool + 2 NADP(+)
[0050] em que em uma primeira etapa, a acil-CoA graxa é reduzida para um aldeído graxo, antes que o aldeído graxo seja reduzido ainda para um álcool graxo em uma segunda etapa. A acil-CoA graxa pode ser uma acil- CoA graxa dessaturada.
[0051] As FARs capazes de catalisar tal reação são acil-CoA graxa redutase que forma álcoois com um número EC 1.2.1.84.
[0052] Em algumas modalidades, a FAR é selecionada a partir do grupo que consiste em Har_FAR (SEQ ID NO: 25, FAR de Helicoverpa armigera) ou uma variante da mesma, tal como a Har_FAR modificada como apresentada na SEQ ID NO: 27, Has_FAR (SEQ ID NO 29, FAR de Helicoverpa assulta) ou uma variante da mesma, tal como a Has_FAR modificada como apresentada na SEQ ID NO: 31, Hs_FAR (SEQ ID: 33, FAR de Heliothis subflexa) ou uma variante da mesma, tal como a Hs_FAR modificada como apresentada na SEQ ID NO: 35, e uma Ban_FAR (SEQ ID NO: 45, FAR de Bicyclus anynana). Em modalidades específicas, a FAR é Har_FAR como apresentada na SEQ ID NO: 25 ou uma variante da mesma, tal como a Har_FAR modificada como apresentada na SEQ ID NO: 27.
[0053] Em uma modalidade, a FAR é Har_FAR (SEQ ID NO: 25, FAR de Helicoverpa armigera) ou uma variante da mesma tendo pelo menos 75% de homologia com a Har_FAR, tal como pelo menos 76%, tal como pelo menos 77%, tal como pelo menos 78%, tal como pelo menos 79%, tal como pelo menos 80%, tal como pelo menos 81%, tal como pelo menos 82%, tal como pelo menos 83%, tal como pelo menos 84%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 86%, tal como pelo menos 87%, tal como pelo menos 88%, tal como pelo menos 89%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 91%, tal como pelo menos 92%, tal como pelo menos 93%, tal como pelo menos 94%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, tal como pelo menos 97%, tal como pelo menos 98%, tal como pelo menos 99%, tal como 100% de homologia com a Har_FAR (SEQ ID NO: 25).
[0054] Em uma outra modalidade, a FAR é uma Har_FAR modificada (SEQ ID NO: 27, FAR de Helicoverpa armigera em que o peptídeo de sinal foi modificado para HDEL) ou uma variante da mesma tendo pelo menos 75% de homologia com estas, tal como pelo menos 76%, tal como pelo menos 77%, tal como pelo menos 78%, tal como pelo menos 79%, tal como pelo menos 80%, tal como pelo menos 81%, tal como pelo menos 82%, tal como pelo menos 83%, tal como pelo menos 84%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 86%, tal como pelo menos 87%, tal como pelo menos 88%, tal como pelo menos 89%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 91%, tal como pelo menos 92%, tal como pelo menos 93%, tal como pelo menos 94%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, tal como pelo menos 97%, tal como pelo menos 98%, tal como pelo menos 99%, tal como 100% de homologia com a Har_FAR modificada como apresentada na SEQ ID NO: 27.
[0055] Em uma outra modalidade, a FAR é Has_FAR (SEQ ID NO: 29, FAR de Helicoverpa assulta) ou uma variante da mesma tendo pelo menos 75% de homologia com a Has_FAR, tal como pelo menos 76%, tal como pelo menos 77%, tal como pelo menos 78%, tal como pelo menos 79%, tal como pelo menos 80%, tal como pelo menos 81%, tal como pelo menos 82%, tal como pelo menos 83%, tal como pelo menos 84%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 86%, tal como pelo menos 87%, tal como pelo menos 88%, tal como pelo menos 89%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 91%, tal como pelo menos 92%, tal como pelo menos 93%, tal como pelo menos 94%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, tal como pelo menos 97%, tal como pelo menos 98%, tal como pelo menos 99%, tal como 100% de homologia com a Has_FAR (SEQ ID NO: 29).
[0056] Em uma outra modalidade, a FAR é uma Has_FAR modificada (SEQ ID NO: 31, FAR de Helicoverpa assulta em que o peptídeo de sinal foi modificado para HDEL) ou uma variante da mesma tendo pelo menos 75% de homologia com estas, tal como pelo menos 76%, tal como pelo menos 77%, tal como pelo menos 78%, tal como pelo menos 79%, tal como pelo menos 80%, tal como pelo menos 81%, tal como pelo menos 82%, tal como pelo menos 83%, tal como pelo menos 84%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 86%, tal como pelo menos 87%, tal como pelo menos 88%, tal como pelo menos 89%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 91%, tal como pelo menos 92%, tal como pelo menos 93%, tal como pelo menos 94%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, tal como pelo menos 97%, tal como pelo menos 98%, tal como pelo menos 99%, tal como 100% de homologia com a Has_FAR modificada como apresentada na SEQ ID NO: 31.
[0057] Em uma outra modalidade, a FAR é Hs_FAR (SEQ ID NO: 33, FAR de Heliothis subflexa) ou uma variante da mesma tendo pelo menos 75% de homologia com a Hs_FAR, tal como pelo menos 76%, tal como pelo menos 77%, tal como pelo menos 78%, tal como pelo menos 79%, tal como pelo menos 80%, tal como pelo menos 81%, tal como pelo menos 82%, tal como pelo menos 83%, tal como pelo menos 84%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 86%, tal como pelo menos 87%, tal como pelo menos 88%, tal como pelo menos 89%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 91%, tal como pelo menos 92%, tal como pelo menos 93%, tal como pelo menos 94%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, tal como pelo menos 97%, tal como pelo menos 98%, tal como pelo menos 99%, tal como 100% de homologia com a Hs_FAR (SEQ ID NO: 33).
[0058] Em uma outra modalidade, a FAR é uma Hs_FAR modificada (SEQ ID NO: 35, FAR de Heliothis subflexa em que o peptídeo de sinal foi modificado para HDEL) ou uma variante da mesma tendo pelo menos 75% de homologia com estas, tal como pelo menos 76%, tal como pelo menos 77%, tal como pelo menos 78%, tal como pelo menos 79%, tal como pelo menos 80%, tal como pelo menos 81%, tal como pelo menos 82%, tal como pelo menos 83%, tal como pelo menos 84%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 86%, tal como pelo menos 87%, tal como pelo menos 88%, tal como pelo menos 89%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 91%, tal como pelo menos 92%, tal como pelo menos 93%, tal como pelo menos 94%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, tal como pelo menos 97%, tal como pelo menos 98%, tal como pelo menos 99%, tal como 100% de homologia com a Hs_FAR modificada como apresentada na SEQ ID NO: 35.
[0059] Em uma outra modalidade, a FAR é Ban_FAR (SEQ ID NO: 45, FAR de Bicyclus anynana) ou uma variante da mesma tendo pelo menos 75% de homologia com a Hs_FAR, tal como pelo menos 76%, tal como pelo menos 77%, tal como pelo menos 78%, tal como pelo menos 79%, tal como pelo menos 80%, tal como pelo menos 81%, tal como pelo menos 82%, tal como pelo menos 83%, tal como pelo menos 84%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 86%, tal como pelo menos 87%, tal como pelo menos 88%, tal como pelo menos 89%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 91%, tal como pelo menos 92%, tal como pelo menos 93%, tal como pelo menos 94%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, tal como pelo menos 97%, tal como pelo menos 98%, tal como pelo menos 99%, tal como 100% de homologia com a Ban_FAR (SEQ ID NO: 45).
[0060] Em uma modalidade, a FAR é selecionada dentre uma FAR tendo pelo menos 60% de homologia com a SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35 ou SEQ ID NO: 45. Em uma outra modalidade, a FAR é selecionada dentre uma FAR tendo pelo menos 60% de homologia com a SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33 ou SEQ ID NO: 35. Em uma outra modalidade, a FAR é selecionada dentre uma FAR tendo pelo menos 60% de homologia com a SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35 ou SEQ ID NO: 45. Em uma outra modalidade, a FAR é selecionada dentre uma FAR tendo pelo menos 60% de homologia com a SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35 ou SEQ ID NO: 45. Em uma outra modalidade, a FAR é selecionada dentre uma FAR tendo pelo menos 60% de homologia com a SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31 ou SEQ ID NO: 45.
[0061] Em algumas modalidades, expressão da dessaturase e/ou da FAR pode ser induzida, por exemplo se os genes codificando estas enzimas estiverem sob o controle de promotores indutíveis, como é conhecido na técnica. A célula de levedura é incubada sob condições adequadas, tais como em um meio apropriado e em uma temperatura apropriada como é conhecido por uma pessoa versada na técnica. Os meios adequados que sustentam o crescimento da levedura são conhecidos na técnica e incluem, mas não são limitados a: meio indefinido, completo tal como YEPD (ou YPD, Extrato de Levedura Peptona Dextrose); meio definido, completo tal como SC (Completo sintético); meio definido, de desprendimento tal como SD (Dextrose Sintética) faltando um ou mais elementos tais como um aminoácido ou um indutor; ou meio mineral, consistindo de sais, vitaminas e uma fonte de carbono, e outros.
[0062] Uma acil-CoA graxa redutase heteróloga pode ser expressa a partir de um ácido nucleico introduzido na célula, por exemplo em um vetor tal como um plasmídeo, ou pela integração genômica. O ácido nucleico pode ser otimizado no códon como é conhecido na técnica para a célula de levedura específica usada.
[0063] Em algumas modalidades, a célula de levedura pode expressar pelo menos duas, tal como duas, redutases heterólogas. Em uma modalidade específica, a célula de levedura expressa a redutase de H. armigera e a redutase de H. subflexa, ou variantes das mesmas como aqui descritas.
Acetiltransferase (EC 2.3.1.84)
[0064] O termo “acetiltransferase” refere-se às enzimas de número EC 2.3.1.84 e também pode ser chamada de “álcool-O-acetiltransferase” ou “AcT”. A enzima atua sobre álcoois alifáticos, e catalisa a reação (figura 1):Acetil-CoA + um álcool <=> CoA + um éster acetílico.
[0065] A célula de levedura da presente divulgação preferivelmente superexpressa uma acetiltransferase. A acetiltransferase pode ser uma acetiltransferase nativa que a célula a ser modificada já é capaz de expressar, ou a mesma pode ser uma acetiltransferase heteróloga. Se a célula de levedura expressa uma acetiltransferase nativa, a célula de levedura é preferivelmente modificada de modo que a expressão da acetiltransferase nativa seja aumentada. Isto pode ser feito pelos métodos conhecidos na técnica, tais como, mas não limitados à introdução de cópias adicionais do ácido nucleico codificando a acetiltransferase no genoma ou em um vetor, modificação do promotor para um promotor constitutivo com um alto nível de expressão, ou para um promotor indutível que na indução leva a altos níveis de expressão.
[0066] Se a célula de levedura não expressa uma acetiltransferase nativa ou se a atividade da acetiltransferase nativa for insuficiente, que resulta em títulos baixos, um ácido nucleico codificando uma acetiltransferase heteróloga pode ser introduzido na célula, em uma localização genômica ou em um vetor, para permitir a expressão da acetiltransferase. Preferivelmente, a acetiltransferase é expressa em um nível alto, por exemplo pela introdução de cópias múltiplas do ácido nucleico codificando a acetiltransferase, ou levando-se vantagem de um promotor constitutivo com um alto nível de expressão, ou de um promotor indutível que na indução leva a altos níveis de expressão. A acetiltransferase pode ser expressa a partir de um ácido nucleico introduzido na célula, por exemplo em um vetor tal como um plasmídeo, ou pela integração genômica. O ácido nucleico pode ser otimizado no códon como é conhecido na técnica para a célula de levedura específica usada.
[0067] O termo “superexpressa” refere-se assim à superexpressão de uma acetiltransferase em uma célula de levedura quando comparado a uma célula de levedura que não foi modificada para superexpressar a acetiltransferase, isto é a cepa precursora.
[0068] Em algumas modalidades, a acetiltransferase é a AcT da SEQ ID NO: 21 (Atf1, a AcT da S. cerevisiae) ou uma variante da mesma tendo pelo menos 75% de homologia com a Sc_Atf1, tal como pelo menos 76%, tal como pelo menos 77%, tal como pelo menos 78%, tal como pelo menos 79%, tal como pelo menos 80%, tal como pelo menos 81%, tal como pelo menos 82%, tal como pelo menos 83%, tal como pelo menos 84%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 86%, tal como pelo menos 87%, tal como pelo menos 88%, tal como pelo menos 89%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 91%, tal como pelo menos 92%, tal como pelo menos 93%, tal como pelo menos 94%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, tal como pelo menos 97%, tal como pelo menos 98%, tal como pelo menos 99%, tal como 100% de homologia com a SEQ ID NO: 21.
[0069] Em outras modalidades, a conversão de pelo menos parte dos álcoois graxos dessaturados produzidos pelas presentes células de levedura para os acetatos de álcool graxos dessaturados é feita quimicamente, como é conhecido pela pessoa versada. Por exemplo, o cloreto de acetila pode ser adicionado ao álcool graxo e a mistura incubada na temperatura ambiente depois de misturar.
Produção de um álcool graxo dessaturado
[0070] As células de levedura da presente divulgação podem ser usadas para produção de um álcool graxo dessaturado e opcionalmente um acetato de álcool graxo dessaturado. A célula de levedura preferivelmente expressa: i) pelo menos uma dessaturase heteróloga capaz de introduzir pelo menos uma ligação dupla em uma acil-CoA graxa tendo um comprimento de cadeia carbônica de 14; e ii) pelo menos uma acil-CoA graxa redutase heteróloga (FAR), capaz de converter pelo menos parte da dita acil-CoA graxa dessaturada para um álcool graxo dessaturado; e iii) opcionalmente uma acetiltransferase capaz de converter pelo menos parte do dito álcool graxo dessaturado para um acetato de álcool graxo dessaturado; em que a dessaturase tem uma especificidade mais alta para a tetradecanoil-CoA do que para a hexadecanoil-CoA e/ou em que a acil-CoA graxa redutase tem uma especificidade mais alta para a tetradecanoil-CoA dessaturada do que para a hexadecanoil-CoA dessaturada.
[0071] A célula de levedura, a dessaturase, a acil-CoA graxa redutase e a acetiltransferase podem todas ser como descritas acima.
[0072] A célula de levedura da presente divulgação pode ser assim usada para produção de uma faixa de álcoois graxos dessaturados, tais como: (Z)-Δ5 álcoois graxos dessaturados tendo um comprimento de cadeia carbônica de 14; (E)-Δ5 álcoois graxos dessaturados tendo um comprimento de cadeia carbônica de 14; (Z)-Δ6 álcoois graxos dessaturados tendo um comprimento de cadeia carbônica de 14; (E)-Δ6 álcoois graxos dessaturados tendo um comprimento de cadeia carbônica de 14; (Z)-Δ7 álcoois graxos dessaturados tendo um comprimento de cadeia carbônica de 14; (E)-Δ7 álcoois graxos dessaturados tendo um comprimento de cadeia carbônica de 14; (Z)-Δ8 álcoois graxos dessaturados tendo um comprimento de cadeia carbônica de 14; (E)-Δ8 álcoois graxos dessaturados tendo um comprimento de cadeia carbônica de 14; (Z)-Δ9 álcoois graxos dessaturados tendo um comprimento de cadeia carbônica de 14; (E)-Δ9 álcoois graxos dessaturados tendo um comprimento de cadeia carbônica de 14; (Z)-Δ10 álcoois graxos dessaturados tendo um comprimento de cadeia carbônica de 14; (E)-Δ10 álcoois graxos dessaturados tendo um comprimento de cadeia carbônica de 14; (Z)-Δ11 álcoois graxos dessaturados tendo um comprimento de cadeia carbônica de 14; (E)-Δ11 álcoois graxos dessaturados tendo um comprimento de cadeia carbônica de 14; (Z)-Δ12 álcoois graxos dessaturados tendo um comprimento de cadeia carbônica de 14; (E)-Δ12 álcoois graxos dessaturados tendo um comprimento de cadeia carbônica de 14; (Z)-Δ13 álcoois graxos dessaturados tendo um comprimento de cadeia carbônica de 14; e (E)-Δ13 álcoois graxos dessaturados tendo um comprimento de cadeia carbônica de 14.
[0073] A célula de levedura aqui divulgada pode assim expressar uma Δ9 dessaturase heteróloga e uma acil-CoA graxa redutase, e ser usada para produzir (Z)9-C14:OH, isto é um álcool graxo tendo um comprimento de cadeia carbônica de 14 abrigando uma dessaturação na conformação Z na posição 9. Este álcool graxo é um precursor de (Z)9-C14:OAc, que é um componente importante de feromônios derivados de várias espécies, por exemplo a lagarta-do-cartucho-do-milho Spodoptera frugiperda.
[0074] Em outras modalidades, a célula de levedura expressa uma Δ11 dessaturase heteróloga e uma acil-CoA graxa redutase, e pode ser usada para produzir (Z)11-C14:OH, isto é um álcool graxo tendo um comprimento de cadeia carbônica de 14 abrigando uma dessaturação na conformação Z na posição 11. Este álcool graxo é um precursor de (Z)11-C14:OAc, que é um componente importante de feromônios derivados de várias espécies, por exemplo o furador do milho Europeu Ostrinia nubilalis e o enrolador de folha da faixa vermelha Argyrotaenia velutinana.
[0075] Em outras modalidades, a célula de levedura expressa uma Δ11 dessaturase heteróloga e uma acil-CoA graxa redutase, e pode ser usada para produzir (E)11-C14:OH, isto é um álcool graxo tendo um comprimento de cadeia carbônica de 14 abrigando uma dessaturação na conformação E na posição 11. Este álcool graxo é um precursor de (E)11-C14:OAc, que é um componente importante de feromônios derivados de várias espécies, por exemplo a traça da maçã marrom claro Epiphyas postvittana.
[0076] Os álcoois graxos dessaturados produzido pela presente célula de levedura podem ser dessaturados em mais do que uma posição. Os álcoois graxos dessaturados podem ser dessaturados em pelo menos duas posições, tais como pelo menos três posições, tais como quatro posições.
[0077] Por exemplo, os álcoois graxos dessaturados (E)7, (Z)9 podem ser produzidos tendo um comprimento de cadeia carbônica de 14. Os álcoois graxos dessaturados (E)3, (Z)8, (Z)11 podem ser produzidos tendo um comprimento de cadeia carbônica de 14. Os álcoois graxos dessaturados (Z)9, (E)11, (E)13 podem ser produzidos tendo um comprimento de cadeia carbônica de 14.
[0078] Os álcoois graxos dessaturados assim produzidos podem ser modificados ainda como é conhecido na técnica, por exemplo pelo encurtamento da cadeia carbônica, de modo a se obter álcoois graxos dessaturados tendo uma cadeia carbônica de menos do que 14, tal como 12, 10, 8, 6 ou 4. Assim, os álcoois graxos dessaturados (E)7, (Z)9 podem ser produzidos tendo um comprimento de cadeia carbônica de 12, os álcoois graxos dessaturados (E)3, (Z)8, (Z)11 pode ser produzidos tendo um comprimento de cadeia carbônica de 12, e os álcoois graxos dessaturados (Z)9, (E)11, (E)13 podem ser produzidos tendo um comprimento de cadeia carbônica de 12.
[0079] De modo a aumentar ainda mais a produção de álcoois graxos dessaturados, pode ser benéfico mutar um ou mais genes codificando uma lipase de modo que a lipase correspondente tenha perda parcial ou total de atividade. Consequentemente, em algumas modalidades, a célula de levedura pode ser como aqui descrita e adicionalmente carregar uma ou mais mutações que resultem na perda total ou parcial de atividade de uma ou mais lipases.
[0080] É conhecido na técnica que existem numerosos genes codificando lipases. A sua expressão e/ou atividade podem ser uma função do meio no qual a célula de levedura é cultivada. Consequentemente, a escolha do meio pode ajudar a escolher qual gene de lipase deve ser deletado ou mutado de modo que a lipase correspondente tenha atividade reduzida ou perda total de atividade no dito meio.
[0081] Diversas lipases podem ser ativas em um meio ao mesmo tempo. Assim, em algumas modalidades, a célula de levedura tem diversas mutações, que resultam na perda total ou parcial de atividade de diversas lipases. De modo a limitar a degradação do acetato de álcool graxo, em algumas modalidades a célula de levedura tem diversas mutações que resultam na perda total ou parcial de atividade de todas as lipases conhecidas serem ou suspeitas de serem ativas em um dado meio.
[0082] Por via de exemplo, a lipase 2, lipase 5 e lipase 8 são as lipases principais ativas em Yarrowia lipolitica quando as células são cultivadas em glicose. Consequentemente, se um meio com base em glicose é utilizado, a perda total ou parcial de atividade de uma, duas ou todas das lipase 2, lipase 5 e lipase 8 pode ser considerada.
[0083] Em algumas modalidades, a lipase tem pelo menos 60% de homologia com a lipase 2 de Y. lipolitica como apresentada na SEQ ID NO: 72, tal como pelo menos 61% de homologia, tal como pelo menos 62% de homologia, tal como pelo menos 63% de homologia, tal como pelo menos 64% de homologia, tal como pelo menos 65% de homologia, tal como pelo menos 66% de homologia, tal como pelo menos 67% de homologia, tal como pelo menos 68% de homologia, tal como pelo menos 69% de homologia, tal como pelo menos 70% de homologia, tal como pelo menos 71% de homologia, tal como pelo menos 72%, tal como pelo menos 73%, tal como pelo menos 74%, tal como pelo menos 75%, tal como pelo menos 76%, tal como pelo menos 77%, tal como pelo menos 78%, tal como pelo menos 79%, tal como pelo menos 80%, tal como pelo menos 81%, tal como pelo menos 82%, tal como pelo menos 83%, tal como pelo menos 84%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 86%, tal como pelo menos 87%, tal como pelo menos 88%, tal como pelo menos 89%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 91%, tal como pelo menos 92%, tal como pelo menos 93%, tal como pelo menos 94%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, tal como pelo menos 97%, tal como pelo menos 98%, tal como pelo menos 99%, tal como 100% de homologia. Em outras modalidades, a lipase tem pelo menos 60% de homologia com a lipase 7 de Y. lipolitica como apresentada na SEQ ID NO: 73, tal como pelo menos 61% de homologia, tal como pelo menos 62% de homologia, tal como pelo menos 63% de homologia, tal como pelo menos 64% de homologia, tal como pelo menos 65% de homologia, tal como pelo menos 66% de homologia, tal como pelo menos 67% de homologia, tal como pelo menos 68% de homologia, tal como pelo menos 69% de homologia, tal como pelo menos 70% de homologia, tal como pelo menos 71% de homologia, tal como pelo menos 72%, tal como pelo menos 73%, tal como pelo menos 74%, tal como pelo menos 75%, tal como pelo menos 76%, tal como pelo menos 77%, tal como pelo menos 78%, tal como pelo menos 79%, tal como pelo menos 80%, tal como pelo menos 81%, tal como pelo menos 82%, tal como pelo menos 83%, tal como pelo menos 84%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 86%, tal como pelo menos 87%, tal como pelo menos 88%, tal como pelo menos 89%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 91%, tal como pelo menos 92%, tal como pelo menos 93%, tal como pelo menos 94%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, tal como pelo menos 97%, tal como pelo menos 98%, tal como pelo menos 99%, tal como 100% de homologia. Em outras modalidades, a lipase tem pelo menos 60% de homologia com a lipase 8 de Y. lipolitica como apresentada na SEQ ID NO: 74, tal como pelo menos 61% de homologia, tal como pelo menos 62% de homologia, tal como pelo menos 63% de homologia, tal como pelo menos 64% de homologia, tal como pelo menos 65% de homologia, tal como pelo menos 66% de homologia, tal como pelo menos 67% de homologia, tal como pelo menos 68% de homologia, tal como pelo menos 69% de homologia, tal como pelo menos 70% de homologia, tal como pelo menos 71% de homologia, tal como pelo menos 72%, tal como pelo menos 73%, tal como pelo menos 74%, tal como pelo menos 75%, tal como pelo menos 76%, tal como pelo menos 77%, tal como pelo menos 78%, tal como pelo menos 79%, tal como pelo menos 80%, tal como pelo menos 81%, tal como pelo menos 82%, tal como pelo menos 83%, tal como pelo menos 84%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 86%, tal como pelo menos 87%, tal como pelo menos 88%, tal como pelo menos 89%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 91%, tal como pelo menos 92%, tal como pelo menos 93%, tal como pelo menos 94%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, tal como pelo menos 97%, tal como pelo menos 98%, tal como pelo menos 99%, tal como 100% de homologia.
[0084] Em algumas modalidades, a célula de levedura tem: uma mutação que resulte na perda total ou parcial de atividade de uma lipase tendo pelo menos 60% de homologia com a lipase 2 de Y. lipolitica como apresentada na SEQ ID NO: 72; e uma mutação que resulte na perda total ou parcial de atividade de uma lipase tendo pelo menos 60% de homologia com a lipase 7 de Y. lipolitica como apresentada na SEQ ID NO: 73.
[0085] Em outras modalidades, a célula de levedura tem: uma mutação que resulte na perda total ou parcial de atividade de uma lipase tendo pelo menos 60% de homologia com a lipase 2 de Y. lipolitica como apresentada na SEQ ID NO: 72; e uma mutação que resulte na perda total ou parcial de atividade de uma lipase tendo pelo menos 60% de homologia com a lipase 8 de Y. lipolitica como apresentada na SEQ ID NO: 74.
[0086] Em outras modalidades, a célula de levedura tem: uma mutação que resulte na perda total ou parcial de atividade de uma lipase tendo pelo menos 60% de homologia com a lipase 7 de Y. lipolitica como apresentada na SEQ ID NO: 73; e uma mutação que resulte na perda total ou parcial de atividade de uma lipase tendo pelo menos 60% de homologia com a lipase 8 de Y. lipolitica como apresentada na SEQ ID NO: 74.
[0087] Em algumas modalidades, a célula de levedura tem: uma mutação que resulte na perda total ou parcial de atividade de uma lipase tendo pelo menos 60% de homologia com a lipase 2 de Y. lipolitica como apresentada na SEQ ID NO: 72; e uma mutação que resulte na perda total ou parcial de atividade de uma lipase tendo pelo menos 60% de homologia com a lipase 7 de Y. lipolitica como apresentada na SEQ ID NO: 73; e uma mutação que resulte na perda total ou parcial de atividade de uma lipase tendo pelo menos 60% de homologia com a lipase 8 de Y. lipolitica como apresentada na SEQ ID NO: 74.
Produção de um acetato de álcool graxo dessaturado
[0088] A célula de levedura da presente divulgação pode opcionalmente expressar ou superexpressar uma acetiltransferase nativa ou uma heteróloga capaz de converter pelo menos parte dos álcoois graxos dessaturados produzidos pela célula em acetatos de álcool graxos dessaturados, e pode assim ser usada para produção de uma faixa de acetatos de álcool graxos dessaturados, tais como: (Z)-Δ5 dessaturada acetatos graxos tendo um comprimento de cadeia carbônica de 14; (E)-Δ5 dessaturada acetatos graxos tendo um comprimento de cadeia carbônica de 14; (Z)-Δ6 dessaturada acetatos graxos tendo um comprimento de cadeia carbônica de 14; (E)-Δ6 dessaturada acetatos graxos tendo um comprimento de cadeia carbônica de 14; (Z)-Δ7 dessaturada acetatos graxos tendo um comprimento de cadeia carbônica de 14; (E)-Δ7 dessaturada acetatos graxos tendo um comprimento de cadeia carbônica de 14; (Z)-Δ8 dessaturada acetatos graxos tendo um comprimento de cadeia carbônica de 14; (E)-Δ8 dessaturada acetatos graxos tendo um comprimento de cadeia carbônica de 14; (Z)-Δ9 dessaturada acetatos graxos tendo um comprimento de cadeia carbônica de 14; (E)-Δ9 dessaturada acetatos graxos tendo um comprimento de cadeia carbônica de 14; (Z)-Δ10 dessaturada acetatos graxos tendo um comprimento de cadeia carbônica de 14; (E)-Δ10 dessaturada acetatos graxos tendo um comprimento de cadeia carbônica de 14; (Z)-Δ11 dessaturada acetatos graxos tendo um comprimento de cadeia carbônica de 14; (E)-Δ11 dessaturada acetatos graxos tendo um comprimento de cadeia carbônica de 14; (Z)-Δ12 dessaturada acetatos graxos tendo um comprimento de cadeia carbônica de 14; (E)-Δ12 dessaturada acetatos graxos tendo um comprimento de cadeia carbônica de 14; (Z)-Δ13 dessaturada acetatos graxos tendo um comprimento de cadeia carbônica de 14; e (E)-Δ13 dessaturada acetatos graxos tendo um comprimento de cadeia carbônica de 14.
[0089] Consequentemente, em uma modalidade, a célula de levedura expressa uma Δ9 dessaturase heteróloga, uma FAR heteróloga e uma acetiltransferase e pode ser usada para se obter (Z)9-C14:OAc, isto é um acetato de álcool graxo tendo um comprimento de cadeia carbônica de 14 abrigando uma dessaturação na conformação Z na posição 9. Este acetato de álcool graxo é um componente importante de feromônios derivados de várias espécies, por exemplo da lagarta-do-cartucho-do-milho Spodoptera frugiperda.
[0090] Em outras modalidades, a célula de levedura expressa uma Δ11 dessaturase heteróloga, uma FAR heteróloga e uma acetiltransferase, e pode ser usada para produzir (Z)11-C14:OAc, isto é um acetato de álcool graxo tendo um comprimento de cadeia carbônica de 14 abrigando uma dessaturação na conformação Z na posição 11. Este acetato de álcool graxo é um componente importante de feromônios derivados de várias espécies, por exemplo o furador do milho europeu Ostrinia nubilalis e o enrolador de folha de faixa vermelha Argyrotaenia velutinana.
[0091] Em outras modalidades, a célula de levedura expressa uma Δ11 dessaturase heteróloga, uma FAR heteróloga e uma acetiltransferase, e pode ser usada para produzir (E)11-C14:OAc, isto é um acetato de álcool graxo tendo um comprimento de cadeia carbônica de 14 abrigando uma dessaturação na conformação E na posição 11. Este acetato de álcool graxo é um componente importante de feromônios derivados de várias espécies, por exemplo a traça da maçã marrom claro Epiphyas postvittana.
[0092] Os acetatos graxos dessaturados produzidos pela presente célula de levedura podem ser dessaturados em mais do que uma posição. Os acetatos graxos dessaturados podem ser dessaturados em pelo menos duas posições, tal como pelo menos três posições, tal como quatro posições.
[0093] Por exemplo, acetatos graxos dessaturados (E)7, (Z)9 podem ser produzidos tendo um comprimento de cadeia carbônica de 14. Os acetatos graxos dessaturados (E)3, (Z)8, (Z)11 podem ser produzidos tendo um comprimento de cadeia carbônica de 14. Os acetatos graxos dessaturados (Z)9, (E)11, (E)13 podem ser produzidos tendo um comprimento de cadeia carbônica de 14.
[0094] Os acetatos graxos dessaturados assim produzidos podem ser modificados ainda como é conhecido na técnica, por exemplo pelo encurtamento da cadeia carbônica, de modo a se obter acetatos graxos dessaturados tendo uma cadeia carbônica de menos do que 14, tal como 12, 10, 8, 6 ou 4. Assim, os acetatos graxos dessaturados (E)7, (Z)9 podem ser produzidos tendo um comprimento de cadeia carbônica de 12, os acetatos graxos dessaturados (E)3, (Z)8, (Z)11 podem ser produzidos tendo um comprimento de cadeia carbônica de 12, e os acetatos graxos dessaturados (Z)9, (E)11, (E)13 podem ser produzidos tendo um comprimento de cadeia carbônica de 12.
Produção de um aldeído graxo dessaturado
[0095] Embora a presente divulgação proveja métodos para produzir álcoois graxos dessaturados e acetatos de álcool graxos dessaturados, pode ser de interesse converter ainda os ditos álcoois graxos para os aldeídos correspondentes. Assim em algumas modalidades, o método pode compreender ainda a etapa de converter pelo menos parte dos álcoois graxos para aldeídos graxos, produzindo deste modo aldeídos graxos. Isto pode ser obtido pelos métodos químicos ou engenheirando-se ainda a célula de levedura.
[0096] Em algumas modalidades, a etapa de converter pelo menos parte dos álcoois graxos para os aldeídos correspondentes é uma etapa de conversão química. A conversão química está fundamentada com base na oxidação de álcoois graxos aos aldeídos correspondentes. Os métodos para realizar esta conversão são conhecidos na técnica. Os métodos preferidos são ecológicos e minimizam a quantidade de resíduo nocivo.
[0097] Assim em algumas modalidades, a conversão química pode ser livre de metal, evitando reagentes com base em metal pesado tóxico tal como óxidos de manganês, óxidos de cromo (Jones ox. PDC, PCC) ou compostos de rutênio (TPAP, Ley-Griffith ox.). Em algumas modalidades, a conversão não envolve reações com sulfóxido de dimetila ativado tal como a oxidação de Swern ou o tipo Pfitzner-Moffat. Tais reações podem envolver a formação estereotípica de traços de compostos de enxofre orgânico que cheiram intensivamente tais como sulfeto de dimetila que pode ser difícil de remover do produto alvo.
[0098] Em algumas modalidades, o método compreende uma reação de Dess-Martin (Yadav et al., 2004, Meyer et al., 1994). Em algumas modalidades, o método compreende uma reação de oxidação de álcool aeróbica catalisada por Cobre(I)/ABNO (Steves & Stahl, 2013).
[0099] Em outras modalidades, a conversão química compreende a oxidação com hipoclorito de sódio sob condições de duas fases aquosa/orgânica (Okada et al., 2014; Tamura et al., 2012; Li et al., 2009). Em algumas modalidades, a oxidação química pode ser realizada com 1- clorobenzotriazol em um meio de cloreto de metileno contendo 25% de piridina (Ferrell e Yao, 1972).
[00100] Alternativamente, a oxidação de um álcool graxo para o aldeído graxo correspondente pode ser realizada enzimaticamente pelas álcool desidrogenases. A pessoa versada saberá como realizar a oxidação enzimática. Por exemplo, a oxidação enzimática pode ser realizada contatando-se enzimas purificadas, extratos celulares ou células inteiras, com o álcool graxo.
[00101] Os álcoois graxos obteníveis pelas células e métodos aqui descritos podem ser convertidos ainda em aldeídos graxos pela introdução de um gene codificando uma acil-CoA graxa redutase que forma o aldeído EC 1.2.1.50 (FAR”). Deste modo, pelo menos parte da acil-CoA graxa dessaturada pode ser convertida para o aldeído graxo correspondente por uma acil-CoA graxa redutase que forma aldeído (FAR”). As enzimas capazes de catalisar esta conversão podem catalisar uma reação de redução, onde a acil- CoA graxa é reduzida para um aldeído graxo. Tais enzimas são acil-CoA graxa redutases que formam aldeído, aqui também aludidas como FAR” ou “FAR” que forma aldeído “, com um número EC 1.2.1.50. Elas catalisam a seguinte reação:Acil-CoA graxa + NADPH = aldeído graxo + NADP+ + coenzima A.
[00102] Em algumas modalidades, a expressão da FAR” que forma aldeído pode ser induzida, por exemplo se o gene codificando esta enzima estiver sob o controle de promotores indutíveis, como é conhecido na técnica. A célula de levedura é incubada sob condições adequadas, tais como em um meio apropriado e em uma temperatura apropriada como é conhecido por uma pessoa versada na técnica. Os meios adequados que sustentam o crescimento da levedura são conhecidos na técnica e incluem, mas não são limitados a: meio indefinido, completo tal como YEPD (ou YPD, Extrato de Levedura Peptona Dextrose), meio definido, completo tal como SC (Completo sintético), ou meio definido, de desprendimento tal como SD (Dextrose Sintética) faltando um ou mais elementos tais como um aminoácido ou um indutor.
[00103] Assim, os seguintes aldeídos podem ser obtidos: (Z)-Δ5 aldeídos graxos dessaturados tendo um comprimento de cadeia carbônica de 14; (E)-Δ5 aldeídos graxos dessaturados tendo um comprimento de cadeia carbônica de 14; (Z)-Δ6 aldeídos graxos dessaturados tendo um comprimento de cadeia carbônica de 14; (E)-Δ6 aldeídos graxos dessaturados tendo um comprimento de cadeia carbônica de 14; (Z)-Δ7 aldeídos graxos dessaturados tendo um comprimento de cadeia carbônica de 14; (E)-Δ7 aldeídos graxos dessaturados tendo um comprimento de cadeia carbônica de 14; (Z)-Δ8 aldeídos graxos dessaturados tendo um comprimento de cadeia carbônica de 14; (E)-Δ8 aldeídos graxos dessaturados tendo um comprimento de cadeia carbônica de 14; (Z)-Δ9 aldeídos graxos dessaturados tendo um comprimento de cadeia carbônica de 14; (E)-Δ9 aldeídos graxos dessaturados tendo um comprimento de cadeia carbônica de 14; (Z)-Δ10 aldeídos graxos dessaturados tendo um comprimento de cadeia carbônica de 14; (E)-Δ10 aldeídos graxos dessaturados tendo um comprimento de cadeia carbônica de 14; (Z)-Δ11 aldeídos graxos dessaturados tendo um comprimento de cadeia carbônica de 14; (E)-Δ11 aldeídos graxos dessaturados tendo um comprimento de cadeia carbônica de 14; (Z)-Δ12 aldeídos graxos dessaturados tendo um comprimento de cadeia carbônica de 14; (E)-Δ12 aldeídos graxos dessaturados tendo um comprimento de cadeia carbônica de 14; (Z)-Δ13 aldeídos graxos dessaturados tendo um comprimento de cadeia carbônica de 14; e (E)-Δ13 aldeídos graxos dessaturados tendo um comprimento de cadeia carbônica de 14.
[00104] Os aldeídos graxos dessaturados produzidos pela presente célula de levedura pode ser dessaturada em mais do que uma posição. Os aldeídos graxos dessaturados podem ser dessaturados em pelo menos duas posições, tal como pelo menos três posições, tal como quatro posições.
[00105] Por exemplo, aldeídos graxos dessaturados (E)7, (Z)9 podem ser produzidos tendo um comprimento de cadeia carbônica de 14. Os aldeídos graxos dessaturados (E)3, (Z)8, (Z)11 podem ser produzidos tendo um comprimento de cadeia carbônica de 14. Os aldeídos graxos dessaturados (Z)9, (E)11, (E)13 podem ser produzidos tendo um comprimento de cadeia carbônica de 14.
[00106] Os aldeídos graxos dessaturados assim produzidos podem ser modificados ainda como é conhecido na técnica, por exemplo pelo encurtamento da cadeia carbônica, de modo a se obter aldeídos graxos dessaturados tendo uma cadeia carbônica de menos do que 14, tal como 12, 10, 8, 6 ou 4. Assim, os aldeídos graxos dessaturados (E)7, (Z)9 podem ser produzidos tendo um comprimento de cadeia carbônica de 12, os aldeídos graxos dessaturados (E)3, (Z)8, (Z)11 podem ser produzidos tendo um comprimento de cadeia carbônica de 12, e os aldeídos graxos dessaturados (Z)9, (E)11, (E)13 podem ser produzidos tendo um comprimento de cadeia carbônica de 12.
Acil-CoA graxa
[00107] De modo que a célula de levedura produza álcoois graxos dessaturados e acetatos de álcool graxos dessaturados como aqui descrito, a célula de levedura precisa ser provida com acil-CoA graxas como um substrato. Preferivelmente, a acil-CoA graxa tem um comprimento de cadeia carbônica de 14 e é miristoil-CoA.
[00108] Tal acil-CoA graxa pode ser provida no meio em que a célula de levedura é incubada, ou a célula de levedura pode ser naturalmente capaz de produzir tal acil-CoA graxa, ou a célula de levedura pode ser engenheirada de modo a produzir ou a aumentar a produção de tal acil-CoA graxa. Preferivelmente, a célula de levedura é provida com ou é capaz de produzir miristoil-CoA.
[00109] Em algumas modalidades, a célula de levedura não é naturalmente capaz de produzir uma acil-CoA graxa tendo um comprimento de cadeia carbônica de 14. A célula de levedura pode neste caso ser engenheirada como é conhecido na técnica, por exemplo pela introdução de uma tioesterase heteróloga. Assim em algumas modalidades, um ácido nucleico codificando uma tioesterase é introduzido na célula de levedura, em um vetor ou pela integração genômica. O gene da tioesterase pode estar sob o controle de um promotor indutível, ou sob o controle de um promotor constitutivo. O ácido nucleico codificando uma tioesterase pode ser otimizada no códon para a célula de levedura, como é conhecido na técnica. Em particular, o ácido nucleico pode ser otimizado no códon para uma célula de Yarrowia, tal como uma célula de Yarrowia lipolitica.
[00110] Em algumas modalidades, a tioesterase é derivada de um organismo selecionado dentre Cuphea palustris, Cuphea hookeriana, Cinnamomum camphora, ou de Escherichia coli. Em modalidades preferidas, a tioesterase é derivada de Escherichia coli ou Cinnamomum camphora. Em algumas modalidades, a tioesterase tem pelo menos 60% de homologia para uma tioesterase selecionada da tioesterase derivada de Cuphea palustris como apresentado na SEQ ID NO: 23, a tioesterase derivada de Cuphea hookeriana como apresentada na SEQ ID NO: 38, a tioesterase derivada de Cinnamomum camphora como apresentada na SEQ ID NO: 40, e a tioesterase derivada de Escherichia coli como apresentada na SEQ ID NO: 42. Preferivelmente, a tioesterase tem pelo menos 60% de homologia com a tioesterase derivada de Cinnamomum camphora como apresentada na SEQ ID NO: 40 ou de Escherichia coli como apresentada na SEQ ID NO: 42. Em uma modalidade, a tioesterase tem pelo menos 60% de homologia com a tioesterase derivada de Cinnamomum camphora como apresentada na SEQ ID NO: 40. Em uma outra modalidade a tioesterase tem pelo menos 60% de homologia com a tioesterase derivada de Escherichia coli como apresentada na SEQ ID NO: 42.
[00111] Em uma outra modalidade, a tioesterase tem pelo menos 60% de homologia com a tioesterase derivada de Cinnamomum camphora como apresentada na SEQ ID NO: 40, tal como pelo menos 61% de homologia, tal como pelo menos 62% de homologia, tal como pelo menos 63% de homologia, tal como pelo menos 64% de homologia, tal como pelo menos 65% de homologia, tal como pelo menos 66% de homologia, tal como pelo menos 67% de homologia, tal como pelo menos 68% de homologia, tal como pelo menos 69% de homologia, tal como pelo menos 70% de homologia, tal como pelo menos 71% de homologia, tal como pelo menos 72%, tal como pelo menos 73%, tal como pelo menos 74%, tal como pelo menos 75%, tal como pelo menos 76%, tal como pelo menos 77%, tal como pelo menos 78%, tal como pelo menos 79%, tal como pelo menos 80%, tal como pelo menos 81%, tal como pelo menos 82%, tal como pelo menos 83%, tal como pelo menos 84%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 86%, tal como pelo menos 87%, tal como pelo menos 88%, tal como pelo menos 89%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 91%, tal como pelo menos 92%, tal como pelo menos 93%, tal como pelo menos 94%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, tal como pelo menos 97%, tal como pelo menos 98%, tal como pelo menos 99%, tal como 100% de homologia com a tioesterase derivada de Cinnamomum camphora como apresentada na SEQ ID NO: 40.
[00112] Em uma outra modalidade, a tioesterase tem pelo menos 60% de homologia com a tioesterase derivada de Escherichia coli como apresentada na SEQ ID NO: 42, tal como pelo menos 61% de homologia, tal como pelo menos 62% de homologia, tal como pelo menos 63% de homologia, tal como pelo menos 64% de homologia, tal como pelo menos 65% de homologia, tal como pelo menos 66% de homologia, tal como pelo menos 67% de homologia, tal como pelo menos 68% de homologia, tal como pelo menos 69% de homologia, tal como pelo menos 70% de homologia, tal como pelo menos 71% de homologia, tal como pelo menos 72%, tal como pelo menos 73%, tal como pelo menos 74%, tal como pelo menos 75%, tal como pelo menos 76%, tal como pelo menos 77%, tal como pelo menos 78%, tal como pelo menos 79%, tal como pelo menos 80%, tal como pelo menos 81%, tal como pelo menos 82%, tal como pelo menos 83%, tal como pelo menos 84%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 86%, tal como pelo menos 87%, tal como pelo menos 88%, tal como pelo menos 89%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 91%, tal como pelo menos 92%, tal como pelo menos 93%, tal como pelo menos 94%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, tal como pelo menos 97%, tal como pelo menos 98%, tal como pelo menos 99%, tal como 100% de homologia com a tioesterase derivada de Escherichia coli como apresentada na SEQ ID NO: 42.
[00113] O ácido nucleico codificando uma tioesterase pode ser otimizada no códon como é conhecido na técnica. Em uma modalidade, a célula de levedura é uma célula de Yarrowia, preferivelmente uma célula de Yarrowia lipolitica, e o ácido nucleico é otimizado no códon consequentemente.
[00114] Em uma modalidade, a pelo menos uma tioesterase é codificada por um ácido nucleico tendo pelo menos 60% de homologia com o ácido nucleico codificando a tioesterase derivada de Cinnamomum camphora como apresentada na SEQ ID NO: 39, tal como pelo menos 61% de homologia, tal como pelo menos 62% de homologia, tal como pelo menos 63% de homologia, tal como pelo menos 64% de homologia, tal como pelo menos 65% de homologia, tal como pelo menos 66% de homologia, tal como pelo menos 67% de homologia, tal como pelo menos 68% de homologia, tal como pelo menos 69% de homologia, tal como pelo menos 70% de homologia, tal como pelo menos 71% de homologia, tal como pelo menos 72%, tal como pelo menos 73%, tal como pelo menos 74%, tal como pelo menos 75%, tal como pelo menos 76%, tal como pelo menos 77%, tal como pelo menos 78%, tal como pelo menos 79%, tal como pelo menos 80%, tal como pelo menos 81%, tal como pelo menos 82%, tal como pelo menos 83%, tal como pelo menos 84%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 86%, tal como pelo menos 87%, tal como pelo menos 88%, tal como pelo menos 89%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 91%, tal como pelo menos 92%, tal como pelo menos 93%, tal como pelo menos 94%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, tal como pelo menos 97%, tal como pelo menos 98%, tal como pelo menos 99%, tal como 100% de homologia com o ácido nucleico codificando a tioesterase de Cinnamomum camphora como apresentada na SEQ ID NO: 39.
[00115] Em uma modalidade, a pelo menos uma tioesterase é codificada por um ácido nucleico tendo pelo menos 60% de homologia com o ácido nucleico codificando a tioesterase derivada de Escherichia coli como apresentada na SEQ ID NO: 41, tal como pelo menos 61% de homologia, tal como pelo menos 62% de homologia, tal como pelo menos 63% de homologia, tal como pelo menos 64% de homologia, tal como pelo menos 65% de homologia, tal como pelo menos 66% de homologia, tal como pelo menos 67% de homologia, tal como pelo menos 68% de homologia, tal como pelo menos 69% de homologia, tal como pelo menos 70% de homologia, tal como pelo menos 71% de homologia, tal como pelo menos 72%, tal como pelo menos 73%, tal como pelo menos 74%, tal como pelo menos 75%, tal como pelo menos 76%, tal como pelo menos 77%, tal como pelo menos 78%, tal como pelo menos 79%, tal como pelo menos 80%, tal como pelo menos 81%, tal como pelo menos 82%, tal como pelo menos 83%, tal como pelo menos 84%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 86%, tal como pelo menos 87%, tal como pelo menos 88%, tal como pelo menos 89%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 91%, tal como pelo menos 92%, tal como pelo menos 93%, tal como pelo menos 94%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, tal como pelo menos 97%, tal como pelo menos 98%, tal como pelo menos 99%, tal como 100% de homologia com o ácido nucleico codificando a tioesterase de Escherichia coli como apresentada na SEQ ID NO: 41.
[00116] Em algumas modalidades, a disponibilidade de ácido graxos tendo um comprimento de cadeia de 14 pode ser aumentada ou aumentada ainda mais. Por exemplo, o complexo da ácido graxo sintase pode ser engenheirado de modo que a formação de C14-acil-CoA graxa seja aumentada. O complexo da ácido graxo sintase (EC 2.3.1.86) consiste de duas subunidades, Fas1 (subunidade beta) e Fas2 (subunidade alfa). A subunidade alfa compreende um domínio da cetoacila sintase (uma “bolsa de ligação”) que é presumida estar envolvida na determinação do comprimento dos ácidos graxos sintetizados. Na Yarrowia lipolityca, a FAS2 nativa (tipo selvagem) é como apresentada na SEQ ID NO: 71.
[00117] Consequentemente, de modo a direcionar o fluxo metabólico para produção de álcoois graxos, acetatos ou aldeídos dessaturados tendo um comprimento de cadeia de 14 C, a célula de levedura pode expressar ainda uma variante da acila graxa sintase tendo um domínio da cetona sintase modificado. Sem estar ligado pela teoria, é presumido que o domínio da cetona sintase modificado resulte em uma bolsa de ligação modificada, que assim mais facilmente acomoda substratos de meio comprimento tais como substratos C14, produzindo deste modo uma proporção mais alta de produtos C14.
[00118] Em uma modalidade, a célula de levedura é uma célula Yarrowia lipolitica como aqui descrito, em que a célula expressa ainda um complexo da ácido graxo sintase modificado. Em uma modalidade, o complexo da ácido graxo sintase é modificado mutando-se o gene codificando a subunidade alfa do complexo. Em algumas modalidades, a mutação está no gene codificando FAS2. A mutação pode resultar na modificação de um ou mais de resíduo 1220 (I1220), resíduo 1217 (M1217) ou resíduo 1226 (M1226) da SEQ ID NO: 71, resultando em uma variante FAS2. A pessoa versada saberá como planejar tais mutações.
[00119] Preferivelmente, a mutação resulta em uma variante I1220F, uma variante I1220W, uma variante I1220Y ou uma variante I1220H. Em um modalidade específica, a mutação resulta em uma variante I1220F. Em algumas modalidades, a mutação resulta em uma variante M1217F, uma variante M1217W, uma variante M1217Y ou uma variante M1217H. Em outras modalidades, a mutação resulta em uma variante M1226F, uma variante M1226W, uma variante M1226Y ou uma variante M1226H. As células de levedura com mais do que uma das mutações acima também são consideradas, tais como duas mutações ou três mutações nos resíduos I1220, M1217 ou M1226.
Célula de levedura
[00120] A presente divulgação provê uma célula de levedura que tenha sido modificada para produzir um álcool graxo dessaturado, e opcionalmente um acetato de álcool graxo dessaturado. Álcoois graxos dessaturados e acetatos de álcool graxos dessaturados são componentes de feromônios, em particular de feromônios de traça. A célula de levedura aqui divulgada provê assim uma plataforma para produção de feromônio de traça ecológico.
[00121] A célula de levedura pode ser uma célula de levedura que não ocorre naturalmente, por exemplo uma célula de levedura que foi engenheirada para produzir álcoois graxos dessaturados e acetatos de álcool graxos dessaturados.
[00122] Em algumas modalidades, a célula foi modificada ao nível genômico, por exemplo pela edição de gene no genoma. A célula também pode ser modificada pela inserção de pelo menos uma construção de ácido nucleico tal como pelo menos um vetor. O vetor pode ser planejado tal como conhecido pela pessoa versada para permitir a integração das sequências de ácido nucleico no genoma, ou para permitir a expressão de um polipeptídeo codificado por uma sequência de ácido nucleico compreendida no vetor sem integração no genoma.
[00123] A célula de levedura pode ser de um gênero selecionado dentre Saccharomyces, Pichia, Yarrowia, Kluyveromyces, Candida, Rhodotorula, Rhodosporidium, Cryptococcus, Trichosporon e Lipomyces. Em uma modalidade preferida, o gênero é Saccharomyces ou Yarrowia, mais preferivelmente o gênero é Yarrowia.
[00124] A célula de levedura pode ser de uma espécie selecionada dentre Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Kluyveromyces marxianus, Cryptococcus albidus, Lipomyces lipofera, Lipomyces starkeyi, Rhodosporidium toruloides, Rhodotorula glutinis, Trichosporon pullulan e Yarrowia lipolitica. Em modalidades preferidas, a célula de levedura é uma célula de Saccharomyces cerevisiae ou uma célula de Yarrowia lipolitica, mais preferivelmente a célula de levedura é uma célula de Yarrowia lipolitica.
[00125] A célula de levedura a ser modificada, que também será aludida como a célula hospedeira, pode expressar enzimas nativas que sejam da mesma classe do que as enzimas que são necessárias para produção de álcoois graxos dessaturados e acetatos de álcool graxos dessaturados. Em alguns casos, entretanto, tais enzimas nativas podem ter um impacto negativo sobre o título de álcoois graxos dessaturados e/ou acetatos de álcool graxos dessaturados que podem ser obtidos; as enzimas nativas podem assim ser inativadas pelos métodos conhecidos na técnica, tais como edição de gene. Por exemplo, os genes codificando as enzimas nativas tendo um impacto negativo sobre o título podem ser deletados ou mutados de modo a levar à perda total ou parcial de atividade da enzima nativa.
[00126] A célula de levedura da presente divulgação expressa pelo menos uma dessaturase heteróloga capaz de introduzir pelo menos uma ligação dupla em uma acil-CoA graxa tendo um comprimento de cadeia carbônica de 14 como aqui descrita, pelo menos uma acil-CoA graxa redutase heteróloga capaz de converter pelo menos parte da dita acil-CoA graxa dessaturada para um álcool graxo dessaturado como aqui descrito, e opcionalmente uma acetiltransferase capaz de converter pelo menos parte do dito álcool graxo dessaturado para um acetato de álcool graxo dessaturado, em que a dessaturase tem uma especificidade mais alta para a tetradecanoil- CoA do que para a hexadecanoil-CoA e/ou em que a acil-CoA graxa redutase tem uma especificidade mais alta para a tetradecanoil-CoA dessaturada do que para a hexadecanoil-CoA dessaturada. Em algumas modalidades, a levedura também expressa uma acetiltransferase. Em algumas modalidades, a levedura também expressa uma tioesterase.
[00127] Em uma modalidade, a célula de levedura expressa: i) pelo menos uma Δ3 dessaturase heteróloga; e ii) pelo menos uma FAR heteróloga; e iii) opcionalmente superexpressa uma acetiltransferase, e iv) opcionalmente superexpressa uma tioesterase, em que a Δ3 dessaturase tem uma especificidade mais alta para a tetradecanoil-CoA do que para a hexadecanoil-CoA e/ou em que a acil-CoA graxa redutase tem uma especificidade mais alta para a tetradecanoil-CoA dessaturada do que para a hexadecanoil-CoA dessaturada, por meio das quais a célula de levedura produz um álcool graxo tendo um comprimento de cadeia carbônica de 14 e dessaturada na posição 3. A acetiltransferase pode ser a AcT da SEQ ID NO: 21 (Atf1, a AcT de S. cerevisiae) ou uma variante da mesma tendo pelo menos 75% de homologia com a Sc_Atf1, tal como pelo menos 76%, tal como pelo menos 77%, tal como pelo menos 78%, tal como pelo menos 79%, tal como pelo menos 80%, tal como pelo menos 81%, tal como pelo menos 82%, tal como pelo menos 83%, tal como pelo menos 84%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 86%, tal como pelo menos 87%, tal como pelo menos 88%, tal como pelo menos 89%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 91%, tal como pelo menos 92%, tal como pelo menos 93%, tal como pelo menos 94%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, tal como pelo menos 97%, tal como pelo menos 98%, tal como pelo menos 99%, tal como 100% de homologia com a SEQ ID NO: 21. Em algumas modalidades, a tioesterase tem pelo menos 60% de homologia para uma tioesterase selecionada da tioesterase derivada de Cuphea palustris como apresentada na SEQ ID NO: 23, a tioesterase de Cuphea hookeriana como apresentada na SEQ ID NO: 38, a tioesterase de Cinnamomum camphora como apresentada na SEQ ID NO: 40, e a tioesterase de Escherichia coli como apresentada na SEQ ID NO: 42. Preferivelmente, a tioesterase é derivada de Cinnamomum camphora como apresentada na SEQ ID NO: 40 ou de Escherichia coli como apresentada na SEQ ID NO: 42. Em uma modalidade, a tioesterase tem pelo menos 60% de homologia com a tioesterase derivada de Cinnamomum camphora como apresentada na SEQ ID NO: 40. Em uma outra modalidade a tioesterase tem pelo menos 60% de homologia com a tioesterase derivada de Escherichia coli como apresentada na SEQ ID NO: 42.
[00128] Em uma modalidade, a célula de levedura expressa: i) pelo menos uma Δ5 dessaturase heteróloga; e ii) pelo menos uma FAR heteróloga; e iii) opcionalmente superexpressa uma acetiltransferase, e iv) opcionalmente superexpressa uma tioesterase, em que a Δ5 dessaturase tem uma especificidade mais alta para a tetradecanoil-CoA do que para a hexadecanoil-CoA e/ou em que a acil-CoA graxa redutase tem uma especificidade mais alta para a tetradecanoil-CoA dessaturada do que para a hexadecanoil-CoA dessaturada, por meio da qual a célula de levedura produz um álcool graxo tendo um comprimento de cadeia carbônica de 14 e dessaturada na posição 5. A acetiltransferase pode ser a AcT da SEQ ID NO: 21 (Atf1, a AcT de S. cerevisiae) ou uma variante da mesma tendo pelo menos 75% de homologia com a Sc_Atf1, tal como pelo menos 76%, tal como pelo menos 77%, tal como pelo menos 78%, tal como pelo menos 79%, tal como pelo menos 80%, tal como pelo menos 81%, tal como pelo menos 82%, tal como pelo menos 83%, tal como pelo menos 84%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 86%, tal como pelo menos 87%, tal como pelo menos 88%, tal como pelo menos 89%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 91%, tal como pelo menos 92%, tal como pelo menos 93%, tal como pelo menos 94%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, tal como pelo menos 97%, tal como pelo menos 98%, tal como pelo menos 99%, tal como 100% de homologia com a SEQ ID NO: 21. Em algumas modalidades, a tioesterase tem pelo menos 60% de homologia para uma tioesterase selecionada da tioesterase derivada de Cuphea palustris como apresentada na SEQ ID NO: 23, a tioesterase de Cuphea hookeriana como apresentada na SEQ ID NO: 38, a tioesterase de Cinnamomum camphora como apresentada na SEQ ID NO: 40, e a tioesterase de Escherichia coli como apresentada na SEQ ID NO: 42. Preferivelmente, a tioesterase tem pelo menos 60% de homologia com a tioesterase derivada de Cinnamomum camphora como apresentada na SEQ ID NO: 40 ou de Escherichia coli como apresentada na SEQ ID NO: 42. Em uma modalidade, a tioesterase tem pelo menos 60% de homologia com a tioesterase derivada de Cinnamomum camphora como apresentada na SEQ ID NO: 40. Em uma outra modalidade a tioesterase tem pelo menos 60% de homologia com a tioesterase derivada de Escherichia coli como apresentada na SEQ ID NO: 42.
[00129] Em uma modalidade, a célula de levedura expressa: i) pelo menos uma Δ6 dessaturase heteróloga; e ii) pelo menos uma FAR heteróloga; e iii) opcionalmente superexpressa uma acetiltransferase, e iv) opcionalmente superexpressa uma tioesterase, em que a Δ6 dessaturase tem uma especificidade mais alta para a tetradecanoil-CoA do que para a hexadecanoil-CoA e/ou em que a acil-CoA graxa redutase tem uma especificidade mais alta para a tetradecanoil-CoA dessaturada do que para a hexadecanoil-CoA dessaturada, por meio da qual a célula de levedura produz um álcool graxo tendo um comprimento de cadeia carbônica de 14 e dessaturada na posição 6. A acetiltransferase pode ser a AcT da SEQ ID NO: 21 (Atf1, a AcT de S. cerevisiae) ou uma variante da mesma tendo pelo menos 75% de homologia com a Sc_Atf1, tal como pelo menos 76%, tal como pelo menos 77%, tal como pelo menos 78%, tal como pelo menos 79%, tal como pelo menos 80%, tal como pelo menos 81%, tal como pelo menos 82%, tal como pelo menos 83%, tal como pelo menos 84%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 86%, tal como pelo menos 87%, tal como pelo menos 88%, tal como pelo menos 89%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 91%, tal como pelo menos 92%, tal como pelo menos 93%, tal como pelo menos 94%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, tal como pelo menos 97%, tal como pelo menos 98%, tal como pelo menos 99%, tal como 100% de homologia com a SEQ ID NO: 21. Em algumas modalidades, a tioesterase tem pelo menos 60% de homologia para uma tioesterase selecionada da tioesterase derivada de Cuphea palustris como apresentada na SEQ ID NO: 23, a tioesterase de Cuphea hookeriana como apresentada na SEQ ID NO: 38, a tioesterase de Cinnamomum camphora como apresentada na SEQ ID NO: 40, e a tioesterase de Escherichia coli como apresentada na SEQ ID NO: 42. Preferivelmente, a tioesterase tem pelo menos 60% de homologia com a tioesterase derivada de Cinnamomum camphora como apresentada na SEQ ID NO: 40 ou de Escherichia coli como apresentada na SEQ ID NO: 42. Em uma modalidade, a tioesterase tem pelo menos 60% de homologia com a tioesterase derivada de Cinnamomum camphora como apresentada na SEQ ID NO: 40. Em uma outra modalidade a tioesterase tem pelo menos 60% de homologia com a tioesterase derivada de Escherichia coli como apresentada na SEQ ID NO: 42.
[00130] Em uma modalidade, a célula de levedura expressa: i) pelo menos uma Δ7 dessaturase heteróloga; e ii) pelo menos uma FAR heteróloga; e iii) opcionalmente superexpressa uma acetiltransferase, e iv) opcionalmente superexpressa uma tioesterase, em que a Δ7 dessaturase tem uma especificidade mais alta para a tetradecanoil-CoA do que para a hexadecanoil-CoA e/ou em que a acil-CoA graxa redutase tem uma especificidade mais alta para a tetradecanoil-CoA dessaturada do que para a hexadecanoil-CoA dessaturada, por meio da qual a célula de levedura produz um álcool graxo tendo um comprimento de cadeia carbônica de 14 e dessaturada na posição 7. A acetiltransferase pode ser a AcT da SEQ ID NO: 21 (Atf1, a AcT de S. cerevisiae) ou uma variante da mesma tendo pelo menos 75% de homologia com a Sc_Atf1, tal como pelo menos 76%, tal como pelo menos 77%, tal como pelo menos 78%, tal como pelo menos 79%, tal como pelo menos 80%, tal como pelo menos 81%, tal como pelo menos 82%, tal como pelo menos 83%, tal como pelo menos 84%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 86%, tal como pelo menos 87%, tal como pelo menos 88%, tal como pelo menos 89%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 91%, tal como pelo menos 92%, tal como pelo menos 93%, tal como pelo menos 94%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, tal como pelo menos 97%, tal como pelo menos 98%, tal como pelo menos 99%, tal como 100% de homologia com a SEQ ID NO: 21. Em algumas modalidades, a tioesterase tem pelo menos 60% de homologia para uma tioesterase selecionada da tioesterase derivada de Cuphea palustris como apresentada na SEQ ID NO: 23, a tioesterase de Cuphea hookeriana como apresentada na SEQ ID NO: 38, a tioesterase de Cinnamomum camphora como apresentada na SEQ ID NO: 40, e a tioesterase de Escherichia coli como apresentada na SEQ ID NO: 42. Preferivelmente, a tioesterase tem pelo menos 60% de homologia com a tioesterase derivada de Cinnamomum camphora como apresentada na SEQ ID NO: 40 ou de Escherichia coli como apresentada na SEQ ID NO: 42. Em uma modalidade, a tioesterase tem pelo menos 60% de homologia com a tioesterase derivada de Cinnamomum camphora como apresentada na SEQ ID NO: 40. Em uma outra modalidade a tioesterase tem pelo menos 60% de homologia com a tioesterase derivada de Escherichia coli como apresentada na SEQ ID NO: 42.
[00131] Em uma modalidade, a célula de levedura expressa: i) pelo menos uma Δ8 dessaturase heteróloga; e ii) pelo menos uma FAR heteróloga; e iii) opcionalmente superexpressa uma acetiltransferase, e iv) opcionalmente superexpressa uma tioesterase, em que a Δ8 dessaturase tem uma especificidade mais alta para a tetradecanoil-CoA do que para a hexadecanoil-CoA e/ou em que a acil-CoA graxa redutase tem uma especificidade mais alta para a tetradecanoil-CoA dessaturada do que para a hexadecanoil-CoA dessaturada, por meio da qual a célula de levedura produz um álcool graxo tendo um comprimento de cadeia carbônica de 14 e dessaturada na posição 8. A acetiltransferase pode ser a AcT da SEQ ID NO: 21 (Atf1, a AcT de S. cerevisiae) ou uma variante da mesma tendo pelo menos 75% de homologia com a Sc_Atf1, tal como pelo menos 76%, tal como pelo menos 77%, tal como pelo menos 78%, tal como pelo menos 79%, tal como pelo menos 80%, tal como pelo menos 81%, tal como pelo menos 82%, tal como pelo menos 83%, tal como pelo menos 84%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 86%, tal como pelo menos 87%, tal como pelo menos 88%, tal como pelo menos 89%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 91%, tal como pelo menos 92%, tal como pelo menos 93%, tal como pelo menos 94%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, tal como pelo menos 97%, tal como pelo menos 98%, tal como pelo menos 99%, tal como 100% de homologia com a SEQ ID NO: 21. Em algumas modalidades, a tioesterase tem pelo menos 60% de homologia para uma tioesterase selecionada da tioesterase derivada de Cuphea palustris como apresentada na SEQ ID NO: 23, a tioesterase de Cuphea hookeriana como apresentada na SEQ ID NO: 38, a tioesterase de Cinnamomum camphora como apresentada na SEQ ID NO: 40, e a tioesterase de Escherichia coli como apresentada na SEQ ID NO: 42. Preferivelmente, a tioesterase tem pelo menos 60% de homologia com a tioesterase derivada de Cinnamomum camphora como apresentada na SEQ ID NO: 40 ou de Escherichia coli como apresentada na SEQ ID NO: 42. Em uma modalidade, a tioesterase tem pelo menos 60% de homologia com a tioesterase derivada de Cinnamomum camphora como apresentada na SEQ ID NO: 40. Em uma outra modalidade a tioesterase tem pelo menos 60% de homologia com a tioesterase derivada de Escherichia coli como apresentada na SEQ ID NO: 42.
[00132] Em uma modalidade, a célula de levedura expressa: i) pelo menos uma Δ9 dessaturase heteróloga; e ii) pelo menos uma FAR heteróloga; e iii) opcionalmente superexpressa uma acetiltransferase, e iv) opcionalmente superexpressa uma tioesterase, em que a Δ9 dessaturase tem uma especificidade mais alta para a tetradecanoil-CoA do que para a hexadecanoil-CoA e/ou em que a acil-CoA graxa redutase tem uma especificidade mais alta para a tetradecanoil-CoA dessaturada do que para a hexadecanoil-CoA dessaturada, por meio da qual a célula de levedura produz um álcool graxo tendo um comprimento de cadeia carbônica de 14 e dessaturada na posição 9. A acetiltransferase pode ser a AcT da SEQ ID NO: 21 (Atf1, a AcT de S. cerevisiae) ou uma variante da mesma tendo pelo menos 75% de homologia com a Sc_Atf1, tal como pelo menos 76%, tal como pelo menos 77%, tal como pelo menos 78%, tal como pelo menos 79%, tal como pelo menos 80%, tal como pelo menos 81%, tal como pelo menos 82%, tal como pelo menos 83%, tal como pelo menos 84%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 86%, tal como pelo menos 87%, tal como pelo menos 88%, tal como pelo menos 89%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 91%, tal como pelo menos 92%, tal como pelo menos 93%, tal como pelo menos 94%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, tal como pelo menos 97%, tal como pelo menos 98%, tal como pelo menos 99%, tal como 100% de homologia com a SEQ ID NO: 21. Em algumas modalidades, a tioesterase tem pelo menos 60% de homologia para uma tioesterase selecionada da tioesterase derivada de Cuphea palustris como apresentada na SEQ ID NO: 23, a tioesterase de Cuphea hookeriana como apresentada na SEQ ID NO: 38, a tioesterase de Cinnamomum camphora como apresentada na SEQ ID NO: 40, e a tioesterase de Escherichia coli como apresentada na SEQ ID NO: 42. Preferivelmente, a tioesterase tem pelo menos 60% de homologia com a tioesterase derivada de Cinnamomum camphora como apresentada na SEQ ID NO: 40 ou de Escherichia coli como apresentada na SEQ ID NO: 42. Em uma modalidade, a tioesterase tem pelo menos 60% de homologia com a tioesterase derivada de Cinnamomum camphora como apresentada na SEQ ID NO: 40. Em uma outra modalidade a tioesterase tem pelo menos 60% de homologia com a tioesterase derivada de Escherichia coli como apresentada na SEQ ID NO: 42.
[00133] Em uma modalidade particular, a célula de levedura expressa: uma Δ9 dessaturase tendo pelo menos 60% de homologia com a Δ9 dessaturase de Drosophila melanogaster como apresentada na SEQ ID NO: 10, tal como pelo menos 61% de homologia, tal como pelo menos 62% de homologia, tal como pelo menos 63% de homologia, tal como pelo menos 64% de homologia, tal como pelo menos 65% de homologia, tal como pelo menos 66% de homologia, tal como pelo menos 67% de homologia, tal como pelo menos 68% de homologia, tal como pelo menos 69% de homologia, tal como pelo menos 70% de homologia, tal como pelo menos 71% de homologia, tal como pelo menos 72%, tal como pelo menos 73%, tal como pelo menos 74%, tal como pelo menos 75%, tal como pelo menos 76%, tal como pelo menos 77%, tal como pelo menos 78%, tal como pelo menos 79%, tal como pelo menos 80%, tal como pelo menos 81%, tal como pelo menos 82%, tal como pelo menos 83%, tal como pelo menos 84%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 86%, tal como pelo menos 87%, tal como pelo menos 88%, tal como pelo menos 89%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 91%, tal como pelo menos 92%, tal como pelo menos 93%, tal como pelo menos 94%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, tal como pelo menos 97%, tal como pelo menos 98%, tal como pelo menos 99%, tal como 100% de homologia com a Δ9 dessaturase de Drosophila melanogaster como apresentada na SEQ ID NO: 10; e uma FAR tendo pelo menos 75% de homologia com a Har_FAR como apresentada na SEQ ID NO: 25 ou SEQ ID NO: 27, tal como pelo menos 76%, tal como pelo menos 77%, tal como pelo menos 78%, tal como pelo menos 79%, tal como pelo menos 80%, tal como pelo menos 81%, tal como pelo menos 82%, tal como pelo menos 83%, tal como pelo menos 84%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 86%, tal como pelo menos 87%, tal como pelo menos 88%, tal como pelo menos 89%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 91%, tal como pelo menos 92%, tal como pelo menos 93%, tal como pelo menos 94%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, tal como pelo menos 97%, tal como pelo menos 98%, tal como pelo menos 99%, tal como 100% de homologia com a Har_FAR como apresentada na SEQ ID NO: 25 ou SEQ ID NO: 27; e opcionalmente expressa ou superexpressa uma acetiltransferase e/ou uma tioesterase. Preferivelmente, a tioesterase tem pelo menos 60% de homologia com a tioesterase derivada de Cinnamomum camphora como apresentada na SEQ ID NO: 40 ou de Escherichia coli como apresentada na SEQ ID NO: 42. Em uma modalidade, a tioesterase tem pelo menos 60% de homologia com a tioesterase derivada de Cinnamomum camphora como apresentada na SEQ ID NO: 40. Em uma outra modalidade a tioesterase tem pelo menos 60% de homologia com a tioesterase derivada de Escherichia coli como apresentada na SEQ ID NO: 42.
[00134] Em uma outra modalidade particular, a célula de levedura expressa: uma Δ9 dessaturase tendo pelo menos 60% de homologia com a Δ9 dessaturase de Drosophila melanogaster como apresentada na SEQ ID NO: 10, tal como pelo menos 61% de homologia, tal como pelo menos 62% de homologia, tal como pelo menos 63% de homologia, tal como pelo menos 64% de homologia, tal como pelo menos 65% de homologia, tal como pelo menos 66% de homologia, tal como pelo menos 67% de homologia, tal como pelo menos 68% de homologia, tal como pelo menos 69% de homologia, tal como pelo menos 70% de homologia, tal como pelo menos 71% de homologia, tal como pelo menos 72%, tal como pelo menos 73%, tal como pelo menos 74%, tal como pelo menos 75%, tal como pelo menos 76%, tal como pelo menos 77%, tal como pelo menos 78%, tal como pelo menos 79%, tal como pelo menos 80%, tal como pelo menos 81%, tal como pelo menos 82%, tal como pelo menos 83%, tal como pelo menos 84%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 86%, tal como pelo menos 87%, tal como pelo menos 88%, tal como pelo menos 89%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 91%, tal como pelo menos 92%, tal como pelo menos 93%, tal como pelo menos 94%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, tal como pelo menos 97%, tal como pelo menos 98%, tal como pelo menos 99%, tal como 100% de homologia com a Δ9 dessaturase de Drosophila melanogaster como apresentada na SEQ ID NO: 10; e uma FAR tendo pelo menos 75% de homologia com a Has_FAR como apresentada na SEQ ID NO: 29 ou SEQ ID NO: 31, tal como pelo menos 76%, tal como pelo menos 77%, tal como pelo menos 78%, tal como pelo menos 79%, tal como pelo menos 80%, tal como pelo menos 81%, tal como pelo menos 82%, tal como pelo menos 83%, tal como pelo menos 84%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 86%, tal como pelo menos 87%, tal como pelo menos 88%, tal como pelo menos 89%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 91%, tal como pelo menos 92%, tal como pelo menos 93%, tal como pelo menos 94%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, tal como pelo menos 97%, tal como pelo menos 98%, tal como pelo menos 99%, tal como 100% de homologia com a Has_FAR como apresentada na SEQ ID NO: 29 ou SEQ ID NO: 31; e opcionalmente expressa ou superexpressa uma acetiltransferase e/ou uma tioesterase. Preferivelmente, a tioesterase tem pelo menos 60% de homologia com a tioesterase derivada de Cinnamomum camphora como apresentada na SEQ ID NO: 40 ou de Escherichia coli como apresentada na SEQ ID NO: 42. Em uma modalidade, a tioesterase tem pelo menos 60% de homologia com a tioesterase derivada de Cinnamomum camphora como apresentada na SEQ ID NO: 40. Em uma outra modalidade a tioesterase tem pelo menos 60% de homologia com a tioesterase derivada de Escherichia coli como apresentada na SEQ ID NO: 42.
[00135] Em uma outra modalidade particular, a célula de levedura expressa: uma Δ9 dessaturase tendo pelo menos 60% de homologia com a Δ9 dessaturase de Drosophila melanogaster como apresentada na SEQ ID NO: 10, tal como pelo menos 61% de homologia, tal como pelo menos 62% de homologia, tal como pelo menos 63% de homologia, tal como pelo menos 64% de homologia, tal como pelo menos 65% de homologia, tal como pelo menos 66% de homologia, tal como pelo menos 67% de homologia, tal como pelo menos 68% de homologia, tal como pelo menos 69% de homologia, tal como pelo menos 70% de homologia, tal como pelo menos 71% de homologia, tal como pelo menos 72%, tal como pelo menos 73%, tal como pelo menos 74%, tal como pelo menos 75%, tal como pelo menos 76%, tal como pelo menos 77%, tal como pelo menos 78%, tal como pelo menos 79%, tal como pelo menos 80%, tal como pelo menos 81%, tal como pelo menos 82%, tal como pelo menos 83%, tal como pelo menos 84%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 86%, tal como pelo menos 87%, tal como pelo menos 88%, tal como pelo menos 89%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 91%, tal como pelo menos 92%, tal como pelo menos 93%, tal como pelo menos 94%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, tal como pelo menos 97%, tal como pelo menos 98%, tal como pelo menos 99%, tal como 100% de homologia com a Δ9 dessaturase de Drosophila melanogaster como apresentada na SEQ ID NO: 10; e uma FAR tendo pelo menos 75% de homologia com a Hs_FAR como apresentada na SEQ ID NO: 33 ou SEQ ID NO: 35, tal como pelo menos 76%, tal como pelo menos 77%, tal como pelo menos 78%, tal como pelo menos 79%, tal como pelo menos 80%, tal como pelo menos 81%, tal como pelo menos 82%, tal como pelo menos 83%, tal como pelo menos 84%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 86%, tal como pelo menos 87%, tal como pelo menos 88%, tal como pelo menos 89%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 91%, tal como pelo menos 92%, tal como pelo menos 93%, tal como pelo menos 94%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, tal como pelo menos 97%, tal como pelo menos 98%, tal como pelo menos 99%, tal como 100% de homologia com a Hs_FAR como apresentada na SEQ ID NO: 33 ou SEQ ID NO: 35; e opcionalmente expressa ou superexpressa uma acetiltransferase e/ou uma tioesterase. Preferivelmente, a tioesterase tem pelo menos 60% de homologia com a tioesterase derivada de Cinnamomum camphora como apresentada na SEQ ID NO: 40 ou de Escherichia coli como apresentada na SEQ ID NO: 42. Em uma modalidade, a tioesterase tem pelo menos 60% de homologia com a tioesterase derivada de Cinnamomum camphora como apresentada na SEQ ID NO: 40. Em uma outra modalidade a tioesterase tem pelo menos 60% de homologia com a tioesterase derivada de Escherichia coli como apresentada na SEQ ID NO: 42.
[00136] Em uma outra modalidade particular, a célula de levedura expressa: uma Δ9 dessaturase tendo pelo menos 60% de homologia com a Δ9 dessaturase de Drosophila melanogaster como apresentada na SEQ ID NO: 10, tal como pelo menos 61% de homologia, tal como pelo menos 62% de homologia, tal como pelo menos 63% de homologia, tal como pelo menos 64% de homologia, tal como pelo menos 65% de homologia, tal como pelo menos 66% de homologia, tal como pelo menos 67% de homologia, tal como pelo menos 68% de homologia, tal como pelo menos 69% de homologia, tal como pelo menos 70% de homologia, tal como pelo menos 71% de homologia, tal como pelo menos 72%, tal como pelo menos 73%, tal como pelo menos 74%, tal como pelo menos 75%, tal como pelo menos 76%, tal como pelo menos 77%, tal como pelo menos 78%, tal como pelo menos 79%, tal como pelo menos 80%, tal como pelo menos 81%, tal como pelo menos 82%, tal como pelo menos 83%, tal como pelo menos 84%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 86%, tal como pelo menos 87%, tal como pelo menos 88%, tal como pelo menos 89%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 91%, tal como pelo menos 92%, tal como pelo menos 93%, tal como pelo menos 94%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, tal como pelo menos 97%, tal como pelo menos 98%, tal como pelo menos 99%, tal como 100% de homologia com a Δ9 dessaturase de Drosophila melanogaster como apresentada na SEQ ID NO: 10; e uma FAR tendo pelo menos 75% de homologia com a Ban_FAR como apresentada na SEQ ID NO: 45, tal como pelo menos 76%, tal como pelo menos 77%, tal como pelo menos 78%, tal como pelo menos 79%, tal como pelo menos 80%, tal como pelo menos 81%, tal como pelo menos 82%, tal como pelo menos 83%, tal como pelo menos 84%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 86%, tal como pelo menos 87%, tal como pelo menos 88%, tal como pelo menos 89%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 91%, tal como pelo menos 92%, tal como pelo menos 93%, tal como pelo menos 94%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, tal como pelo menos 97%, tal como pelo menos 98%, tal como pelo menos 99%, tal como 100% de homologia com a Ban_FAR como apresentada na SEQ ID NO: 45; e opcionalmente expressa ou superexpressa uma acetiltransferase e/ou uma tioesterase. Preferivelmente, a tioesterase tem pelo menos 60% de homologia com a tioesterase derivada de Cinnamomum camphora como apresentada na SEQ ID NO: 40 ou de Escherichia coli como apresentada na SEQ ID NO: 42. Em uma modalidade, a tioesterase tem pelo menos 60% de homologia com a tioesterase derivada de Cinnamomum camphora como apresentada na SEQ ID NO: 40. Em uma outra modalidade a tioesterase tem pelo menos 60% de homologia com a tioesterase derivada de Escherichia coli como apresentada na SEQ ID NO: 42.
[00137] Em uma modalidade particular, a célula de levedura expressa: uma Δ9 dessaturase tendo pelo menos 60% de homologia com a Δ9 dessaturase de Spodoptera litura como apresentada na SEQ ID NO: 12, tal como pelo menos 61% de homologia, tal como pelo menos 62% de homologia, tal como pelo menos 63% de homologia, tal como pelo menos 64% de homologia, tal como pelo menos 65% de homologia, tal como pelo menos 66% de homologia, tal como pelo menos 67% de homologia, tal como pelo menos 68% de homologia, tal como pelo menos 69% de homologia, tal como pelo menos 70% de homologia, tal como pelo menos 71% de homologia, tal como pelo menos 72%, tal como pelo menos 73%, tal como pelo menos 74%, tal como pelo menos 75%, tal como pelo menos 76%, tal como pelo menos 77%, tal como pelo menos 78%, tal como pelo menos 79%, tal como pelo menos 80%, tal como pelo menos 81%, tal como pelo menos 82%, tal como pelo menos 83%, tal como pelo menos 84%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 86%, tal como pelo menos 87%, tal como pelo menos 88%, tal como pelo menos 89%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 91%, tal como pelo menos 92%, tal como pelo menos 93%, tal como pelo menos 94%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, tal como pelo menos 97%, tal como pelo menos 98%, tal como pelo menos 99%, tal como 100% de homologia com a Δ9 dessaturase de Spodoptera litura como apresentada na SEQ ID NO: 12; e
[00138] - uma FAR tendo pelo menos 75% de homologia com a Har_FAR como apresentada na SEQ ID NO: 25 ou SEQ ID NO: 27, tal como pelo menos 76%, tal como pelo menos 77%, tal como pelo menos 78%, tal como pelo menos 79%, tal como pelo menos 80%, tal como pelo menos 81%, tal como pelo menos 82%, tal como pelo menos 83%, tal como pelo menos 84%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 86%, tal como pelo menos 87%, tal como pelo menos 88%, tal como pelo menos 89%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 91%, tal como pelo menos 92%, tal como pelo menos 93%, tal como pelo menos 94%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, tal como pelo menos 97%, tal como pelo menos 98%, tal como pelo menos 99%, tal como 100% de homologia com a Har_FAR como apresentada na SEQ ID NO: 25 ou SEQ ID NO: 27; e opcionalmente expressa ou superexpressa uma acetiltransferase e/ou uma tioesterase. Preferivelmente, a tioesterase tem pelo menos 60% de homologia com a tioesterase derivada de Cinnamomum camphora como apresentada na SEQ ID NO: 40 ou de Escherichia coli como apresentada na SEQ ID NO: 42. Em uma modalidade, a tioesterase tem pelo menos 60% de homologia com a tioesterase derivada de Cinnamomum camphora como apresentada na SEQ ID NO: 40. Em uma outra modalidade a tioesterase tem pelo menos 60% de homologia com a tioesterase derivada de Escherichia coli como apresentada na SEQ ID NO: 42.
[00139] Em uma outra modalidade particular, a célula de levedura expressa: uma Δ9 dessaturase tendo pelo menos 60% de homologia com a Δ9 dessaturase de Spodoptera litura como apresentada na SEQ ID NO: 12, tal como pelo menos 61% de homologia, tal como pelo menos 62% de homologia, tal como pelo menos 63% de homologia, tal como pelo menos 64% de homologia, tal como pelo menos 65% de homologia, tal como pelo menos 66% de homologia, tal como pelo menos 67% de homologia, tal como pelo menos 68% de homologia, tal como pelo menos 69% de homologia, tal como pelo menos 70% de homologia, tal como pelo menos 71% de homologia, tal como pelo menos 72%, tal como pelo menos 73%, tal como pelo menos 74%, tal como pelo menos 75%, tal como pelo menos 76%, tal como pelo menos 77%, tal como pelo menos 78%, tal como pelo menos 79%, tal como pelo menos 80%, tal como pelo menos 81%, tal como pelo menos 82%, tal como pelo menos 83%, tal como pelo menos 84%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 86%, tal como pelo menos 87%, tal como pelo menos 88%, tal como pelo menos 89%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 91%, tal como pelo menos 92%, tal como pelo menos 93%, tal como pelo menos 94%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, tal como pelo menos 97%, tal como pelo menos 98%, tal como pelo menos 99%, tal como 100% de homologia com a Δ9 dessaturase de Spodoptera litura como apresentada na SEQ ID NO: 12; e uma FAR tendo pelo menos 75% de homologia com a Has_FAR como apresentada na SEQ ID NO: 29 ou SEQ ID NO: 31, tal como pelo menos 76%, tal como pelo menos 77%, tal como pelo menos 78%, tal como pelo menos 79%, tal como pelo menos 80%, tal como pelo menos 81%, tal como pelo menos 82%, tal como pelo menos 83%, tal como pelo menos 84%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 86%, tal como pelo menos 87%, tal como pelo menos 88%, tal como pelo menos 89%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 91%, tal como pelo menos 92%, tal como pelo menos 93%, tal como pelo menos 94%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, tal como pelo menos 97%, tal como pelo menos 98%, tal como pelo menos 99%, tal como 100% de homologia com a Has_FAR como apresentada na SEQ ID NO: 29 ou SEQ ID NO: 31; e opcionalmente expressa ou superexpressa uma acetiltransferase e/ou uma tioesterase. Preferivelmente, a tioesterase tem pelo menos 60% de homologia com a tioesterase derivada de Cinnamomum camphora como apresentada na SEQ ID NO: 40 ou de Escherichia coli como apresentada na SEQ ID NO: 42. Em uma modalidade, a tioesterase tem pelo menos 60% de homologia com a tioesterase derivada de Cinnamomum camphora como apresentada na SEQ ID NO: 40. Em uma outra modalidade a tioesterase tem pelo menos 60% de homologia com a tioesterase derivada de Escherichia coli como apresentada na SEQ ID NO: 42.
[00140] Em uma outra modalidade particular, a célula de levedura expressa: uma Δ9 dessaturase tendo pelo menos 60% de homologia com a Δ9 dessaturase de Spodoptera litura como apresentada na SEQ ID NO: 12, tal como pelo menos 61% de homologia, tal como pelo menos 62% de homologia, tal como pelo menos 63% de homologia, tal como pelo menos 64% de homologia, tal como pelo menos 65% de homologia, tal como pelo menos 66% de homologia, tal como pelo menos 67% de homologia, tal como pelo menos 68% de homologia, tal como pelo menos 69% de homologia, tal como pelo menos 70% de homologia, tal como pelo menos 71% de homologia, tal como pelo menos 72%, tal como pelo menos 73%, tal como pelo menos 74%, tal como pelo menos 75%, tal como pelo menos 76%, tal como pelo menos 77%, tal como pelo menos 78%, tal como pelo menos 79%, tal como pelo menos 80%, tal como pelo menos 81%, tal como pelo menos 82%, tal como pelo menos 83%, tal como pelo menos 84%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 86%, tal como pelo menos 87%, tal como pelo menos 88%, tal como pelo menos 89%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 91%, tal como pelo menos 92%, tal como pelo menos 93%, tal como pelo menos 94%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, tal como pelo menos 97%, tal como pelo menos 98%, tal como pelo menos 99%, tal como 100% de homologia com a Δ9 dessaturase de Spodoptera litura como apresentada na SEQ ID NO: 12; e uma FAR tendo pelo menos 75% de homologia com a Hs_FAR como apresentada na SEQ ID NO: 33 ou SEQ ID NO: 35, tal como pelo menos 76%, tal como pelo menos 77%, tal como pelo menos 78%, tal como pelo menos 79%, tal como pelo menos 80%, tal como pelo menos 81%, tal como pelo menos 82%, tal como pelo menos 83%, tal como pelo menos 84%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 86%, tal como pelo menos 87%, tal como pelo menos 88%, tal como pelo menos 89%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 91%, tal como pelo menos 92%, tal como pelo menos 93%, tal como pelo menos 94%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, tal como pelo menos 97%, tal como pelo menos 98%, tal como pelo menos 99%, tal como 100% de homologia com a Hs_FAR como apresentada na SEQ ID NO: 33 ou SEQ ID NO: 35; e opcionalmente expressa ou superexpressa uma acetiltransferase e/ou uma tioesterase. Preferivelmente, a tioesterase tem pelo menos 60% de homologia com a tioesterase derivada de Cinnamomum camphora como apresentada na SEQ ID NO: 40 ou de Escherichia coli como apresentada na SEQ ID NO: 42. Em uma modalidade, a tioesterase tem pelo menos 60% de homologia com a tioesterase derivada de Cinnamomum camphora como apresentada na SEQ ID NO: 40. Em uma outra modalidade a tioesterase tem pelo menos 60% de homologia com a tioesterase derivada de Escherichia coli como apresentada na SEQ ID NO: 42.
[00141] Em uma outra modalidade particular, a célula de levedura expressa: uma Δ9 dessaturase tendo pelo menos 60% de homologia com a Δ9 dessaturase de Spodoptera litura como apresentada na SEQ ID NO: 12, tal como pelo menos 61% de homologia, tal como pelo menos 62% de homologia, tal como pelo menos 63% de homologia, tal como pelo menos 64% de homologia, tal como pelo menos 65% de homologia, tal como pelo menos 66% de homologia, tal como pelo menos 67% de homologia, tal como pelo menos 68% de homologia, tal como pelo menos 69% de homologia, tal como pelo menos 70% de homologia, tal como pelo menos 71% de homologia, tal como pelo menos 72%, tal como pelo menos 73%, tal como pelo menos 74%, tal como pelo menos 75%, tal como pelo menos 76%, tal como pelo menos 77%, tal como pelo menos 78%, tal como pelo menos 79%, tal como pelo menos 80%, tal como pelo menos 81%, tal como pelo menos 82%, tal como pelo menos 83%, tal como pelo menos 84%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 86%, tal como pelo menos 87%, tal como pelo menos 88%, tal como pelo menos 89%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 91%, tal como pelo menos 92%, tal como pelo menos 93%, tal como pelo menos 94%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, tal como pelo menos 97%, tal como pelo menos 98%, tal como pelo menos 99%, tal como 100% de homologia com a Δ9 dessaturase de Spodoptera litura como apresentada na SEQ ID NO: 12; e uma FAR tendo pelo menos 75% de homologia com a Ban_FAR como apresentada na SEQ ID NO: 45, tal como pelo menos 76%, tal como pelo menos 77%, tal como pelo menos 78%, tal como pelo menos 79%, tal como pelo menos 80%, tal como pelo menos 81%, tal como pelo menos 82%, tal como pelo menos 83%, tal como pelo menos 84%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 86%, tal como pelo menos 87%, tal como pelo menos 88%, tal como pelo menos 89%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 91%, tal como pelo menos 92%, tal como pelo menos 93%, tal como pelo menos 94%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, tal como pelo menos 97%, tal como pelo menos 98%, tal como pelo menos 99%, tal como 100% de homologia com a Ban_FAR como apresentada na SEQ ID NO: 45; e opcionalmente expressa ou superexpressa uma acetiltransferase e/ou uma tioesterase. Preferivelmente, a tioesterase tem pelo menos 60% de homologia com a tioesterase derivada de Cinnamomum camphora como apresentada na SEQ ID NO: 40 ou de Escherichia coli como apresentada na SEQ ID NO: 42. Em uma modalidade, a tioesterase tem pelo menos 60% de homologia com a tioesterase derivada de Cinnamomum camphora como apresentada na SEQ ID NO: 40. Em uma outra modalidade a tioesterase tem pelo menos 60% de homologia com a tioesterase derivada de Escherichia coli como apresentada na SEQ ID NO: 42.
[00142] Em uma modalidade, a célula de levedura expressa: i) pelo menos uma Δ10 dessaturase heteróloga; e ii) pelo menos uma FAR heteróloga; e iii) opcionalmente superexpressa uma acetiltransferase, e iv) opcionalmente superexpressa uma tioesterase, em que a Δ10 dessaturase tem uma especificidade mais alta para a tetradecanoil-CoA do que para a hexadecanoil-CoA e/ou em que a acil- CoA graxa redutase tem uma especificidade mais alta para a tetradecanoil- CoA dessaturada do que para a hexadecanoil-CoA dessaturada, por meio da qual célula de levedura produz um álcool graxo tendo um comprimento de cadeia carbônica de 14 e dessaturada na posição 10. A acetiltransferase pode ser a AcT da SEQ ID NO: 21 (Atf1, a AcT de S. cerevisiae) ou uma variante da mesma tendo pelo menos 75% de homologia com a Sc_Atf1, tal como pelo menos 76%, tal como pelo menos 77%, tal como pelo menos 78%, tal como pelo menos 79%, tal como pelo menos 80%, tal como pelo menos 81%, tal como pelo menos 82%, tal como pelo menos 83%, tal como pelo menos 84%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 86%, tal como pelo menos 87%, tal como pelo menos 88%, tal como pelo menos 89%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 91%, tal como pelo menos 92%, tal como pelo menos 93%, tal como pelo menos 94%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, tal como pelo menos 97%, tal como pelo menos 98%, tal como pelo menos 99%, tal como 100% de homologia com a SEQ ID NO: 21. Em algumas modalidades, a tioesterase tem pelo menos 60% de homologia para uma tioesterase selecionada da tioesterase derivada de Cuphea palustris como apresentada na SEQ ID NO: 23, a tioesterase de Cuphea hookeriana como apresentada na SEQ ID NO: 38, a tioesterase de Cinnamomum camphora como apresentada na SEQ ID NO: 40, e a tioesterase de Escherichia coli como apresentada na SEQ ID NO: 42. Preferivelmente, a tioesterase tem pelo menos 60% de homologia com a tioesterase derivada de Cinnamomum camphora como apresentada na SEQ ID NO: 40 ou de Escherichia coli como apresentada na SEQ ID NO: 42. Em uma modalidade, a tioesterase tem pelo menos 60% de homologia com a tioesterase derivada de Cinnamomum camphora como apresentada na SEQ ID NO: 40. Em uma outra modalidade a tioesterase tem pelo menos 60% de homologia com a tioesterase derivada de Escherichia coli como apresentada na SEQ ID NO: 42.
[00143] Em uma modalidade, a célula de levedura expressa: i) pelo menos uma Δ11 dessaturase heteróloga; e ii) pelo menos uma FAR heteróloga; e iii) opcionalmente superexpressa uma acetiltransferase, e iv) opcionalmente superexpressa uma tioesterase, em que a Δ11 dessaturase tem uma especificidade mais alta para a tetradecanoil-CoA do que para a hexadecanoil-CoA e/ou em que a acil- CoA graxa redutase tem uma especificidade mais alta para a tetradecanoil- CoA dessaturada do que para a hexadecanoil-CoA dessaturada, por meio da qual célula de levedura produz um álcool graxo tendo um comprimento de cadeia carbônica de 14 e dessaturada na posição 11. A acetiltransferase pode ser a AcT da SEQ ID NO: 21 (Atf1, a AcT de S. cerevisiae) ou uma variante da mesma tendo pelo menos 75% de homologia com a Sc_Atf1, tal como pelo menos 76%, tal como pelo menos 77%, tal como pelo menos 78%, tal como pelo menos 79%, tal como pelo menos 80%, tal como pelo menos 81%, tal como pelo menos 82%, tal como pelo menos 83%, tal como pelo menos 84%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 86%, tal como pelo menos 87%, tal como pelo menos 88%, tal como pelo menos 89%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 91%, tal como pelo menos 92%, tal como pelo menos 93%, tal como pelo menos 94%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, tal como pelo menos 97%, tal como pelo menos 98%, tal como pelo menos 99%, tal como 100% de homologia com a SEQ ID NO: 21. Em algumas modalidades, a tioesterase tem pelo menos 60% de homologia para uma tioesterase selecionada da tioesterase derivada de Cuphea palustris como apresentada na SEQ ID NO: 23, a tioesterase de Cuphea hookeriana como apresentada na SEQ ID NO: 38, a tioesterase de Cinnamomum camphora como apresentada na SEQ ID NO: 40, e a tioesterase de Escherichia coli como apresentada na SEQ ID NO: 42. Preferivelmente, a tioesterase tem pelo menos 60% de homologia com a tioesterase derivada de Cinnamomum camphora como apresentada na SEQ ID NO: 40 ou de Escherichia coli como apresentada na SEQ ID NO: 42. Em uma modalidade, a tioesterase tem pelo menos 60% de homologia com a tioesterase derivada de Cinnamomum camphora como apresentada na SEQ ID NO: 40. Em uma outra modalidade a tioesterase tem pelo menos 60% de homologia com a tioesterase derivada de Escherichia coli como apresentada na SEQ ID NO: 42.
[00144] Em uma modalidade, a célula de levedura expressa: i) pelo menos uma heteróloga Δ12 dessaturase; e ii) pelo menos uma FAR heteróloga; e iii) opcionalmente superexpressa uma acetiltransferase, e iv) opcionalmente superexpressa uma tioesterase, em que a Δ12 dessaturase tem uma especificidade mais alta para a tetradecanoil-CoA do que para a hexadecanoil-CoA e/ou em que a acil- CoA graxa redutase tem uma especificidade mais alta para a tetradecanoil- CoA dessaturada do que para a hexadecanoil-CoA dessaturada, por meio da qual célula de levedura produz um álcool graxo tendo um comprimento de cadeia carbônica de 14 e dessaturada na posição 12. A acetiltransferase pode ser a AcT da SEQ ID NO: 21 (Atf1, a AcT de S. cerevisiae) ou uma variante da mesma tendo pelo menos 75% de homologia com a Sc_Atf1, tal como pelo menos 76%, tal como pelo menos 77%, tal como pelo menos 78%, tal como pelo menos 79%, tal como pelo menos 80%, tal como pelo menos 81%, tal como pelo menos 82%, tal como pelo menos 83%, tal como pelo menos 84%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 86%, tal como pelo menos 87%, tal como pelo menos 88%, tal como pelo menos 89%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 91%, tal como pelo menos 92%, tal como pelo menos 93%, tal como pelo menos 94%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, tal como pelo menos 97%, tal como pelo menos 98%, tal como pelo menos 99%, tal como 100% de homologia com a SEQ ID NO: 21. Em algumas modalidades, a tioesterase tem pelo menos 60% de homologia para uma tioesterase selecionada da tioesterase derivada de Cuphea palustris como apresentada na SEQ ID NO: 23, a tioesterase de Cuphea hookeriana como apresentada na SEQ ID NO: 38, a tioesterase de Cinnamomum camphora como apresentada na SEQ ID NO: 40, e a tioesterase de Escherichia coli como apresentada na SEQ ID NO: 42. Preferivelmente, a tioesterase tem pelo menos 60% de homologia com a tioesterase derivada de Cinnamomum camphora como apresentada na SEQ ID NO: 40 ou de Escherichia coli como apresentada na SEQ ID NO: 42. Em uma modalidade, a tioesterase tem pelo menos 60% de homologia com a tioesterase derivada de Cinnamomum camphora como apresentada na SEQ ID NO: 40. Em uma outra modalidade a tioesterase tem pelo menos 60% de homologia com a tioesterase derivada de Escherichia coli como apresentada na SEQ ID NO: 42.
[00145] Em uma modalidade, a célula de levedura expressa: i) pelo menos uma heteróloga Δ13 dessaturase; e ii) pelo menos uma FAR heteróloga; e iii) opcionalmente superexpressa uma acetiltransferase, e iv) opcionalmente superexpressa uma tioesterase, em que a Δ13 dessaturase tem uma especificidade mais alta para a tetradecanoil-CoA do que para a hexadecanoil-CoA e/ou em que a acil- CoA graxa redutase tem uma especificidade mais alta para a tetradecanoil- CoA dessaturada do que para a hexadecanoil-CoA dessaturada, por meio da qual célula de levedura produz um álcool graxo tendo um comprimento de cadeia carbônica de 14 e dessaturada na posição 13. A acetiltransferase pode ser a AcT da SEQ ID NO: 21 (Atf1, a AcT de S. cerevisiae) ou uma variante da mesma tendo pelo menos 75% de homologia com a Sc_Atf1, tal como pelo menos 76%, tal como pelo menos 77%, tal como pelo menos 78%, tal como pelo menos 79%, tal como pelo menos 80%, tal como pelo menos 81%, tal como pelo menos 82%, tal como pelo menos 83%, tal como pelo menos 84%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 86%, tal como pelo menos 87%, tal como pelo menos 88%, tal como pelo menos 89%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 91%, tal como pelo menos 92%, tal como pelo menos 93%, tal como pelo menos 94%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, tal como pelo menos 97%, tal como pelo menos 98%, tal como pelo menos 99%, tal como 100% de homologia com a SEQ ID NO: 21. Em algumas modalidades, a tioesterase tem pelo menos 60% de homologia para uma tioesterase selecionada da tioesterase derivada de Cuphea palustris como apresentada na SEQ ID NO: 23, a tioesterase de Cuphea hookeriana como apresentada na SEQ ID NO: 38, a tioesterase de Cinnamomum camphora como apresentada na SEQ ID NO: 40, e a tioesterase de Escherichia coli como apresentada na SEQ ID NO: 42. Preferivelmente, a tioesterase tem pelo menos 60% de homologia com a tioesterase derivada de Cinnamomum camphora como apresentada na SEQ ID NO: 40 ou de Escherichia coli como apresentada na SEQ ID NO: 42. Em uma modalidade, a tioesterase tem pelo menos 60% de homologia com a tioesterase derivada de Cinnamomum camphora como apresentada na SEQ ID NO: 40. Em uma outra modalidade a tioesterase tem pelo menos 60% de homologia com a tioesterase derivada de Escherichia coli como apresentada na SEQ ID NO: 42.
[00146] Em algumas modalidades, a célula de levedura tem ainda uma ou mais mutações resultantes em uma perda parcial ou total de atividade de uma ou mais lipases, como detalhado aqui acima. Em algumas modalidades, a célula de levedura tem ainda uma mutação que resulte na modificação de uma ou mais subunidades do complexo da acila graxa sintase; particularmente mutações que resultem nas modificações do domínio da cetona sintase, como detalhado aqui acima, são consideradas.
[00147] Em algumas modalidades, a célula de levedura tem ainda uma ou mais mutações resultantes em uma perda parcial ou total de atividade de uma ou mais lipases e uma mutação em uma ou mais modificações de uma ou mais subunidades do complexo da acila graxa sintase, particularmente mutações que resultem nas modificações do domínio da cetona sintase, como aqui descrito acima.
Ácido nucleicos
[00148] Será entendido que por toda a presente divulgação, o termo “ácido nucleico codificando uma atividade” deve referir-se a uma molécula de ácido nucleico capaz de codificar um peptídeo, uma proteína ou um fragmento dos mesmos tendo a dita atividade. Tais moléculas de ácido nucleico podem ser matrizes de leitura aberta ou genes ou fragmentos dos mesmos. A construção de ácido nucleico também pode ser um grupo de moléculas de ácido nucleico, que juntas podem codificar diversos peptídeos, proteínas ou fragmentos dos mesmos tendo uma atividade de interesse. O termo “atividade” ou “atividade de interesse” refere-se a uma das seguintes atividades: uma atividade de dessaturase como aqui descrita, uma de acil-CoA graxa redutase, uma de acil-CoA graxa redutase que forma aldeído, uma de tioesterase e/ou uma de acetiltransferase. A natureza da um ou mais atividades de interesse dependerá da natureza do produto desejado que se deseja se obter com os presentes métodos.
[00149] Em algumas modalidades dos presentes métodos, cada um dos ácidos nucleicos codificando cada uma das presentes atividades, isto é uma dessaturase como aqui descrita, uma acil-CoA graxa redutase, uma acil-CoA graxa redutase que forma aldeído, uma tioesterase e/ou uma acetiltransferase, pode ser compreendida dentro do genoma da célula de levedura ou dentro de um vetor compreendidos dentro da célula de levedura.
[00150] Em algumas modalidades, cada um dos ácidos nucleicos codificando cada uma das presentes atividades podem estar presentes no genoma da dita célula de levedura, porque o ácido nucleico codifica uma proteína nativa, ou porque o mesmo foi integrado nela pelo engenheiramento do genoma ou edição de genoma ou pelo cruzamento de células de levedura de tipos de combinação diferentes. Os métodos para integrar um ácido nucleico são bem conhecidos na técnica. Assim em algumas modalidades a atividade de interesse é codificada pela introdução de um ácido nucleico heterólogo na célula de levedura. O ácido nucleico heterólogo codificando a dita atividade pode ser otimizada no códon, ou pode compreender traços que podem ajudar a melhorar a atividade. Por exemplo, o ácido nucleico heterólogo pode ser modificado de modo a codificar uma proteína modificada. Tais modificações incluem, mas não são limitadas à introdução de sinais de localização, mutações de ganho de função ou perda de função, fusão da proteína para um marcador ou um rótulo tal como rótulo fluorescente, inserção de um promotor indutível, introdução de modificações conferindo estabilidade e/ou meia-vida aumentadas.
[00151] A introdução do ácido nucleico heterólogo codificando a atividade de interesse pode ser realizada pelos métodos conhecidos na técnica. A pessoa versada reconhecerá que tais métodos incluem, mas não são limitados a: métodos com base em clonagem e recombinação homóloga. Os métodos de clonagem podem envolver o planejamento e construção de um plasmídeo em um organismo tal como Escherichia coli. O plasmídeo pode ser um vetor integrativo ou um não integrativo. Os métodos livres de clonagem compreendem métodos com base na recombinação homóloga tais como PCR mediada por adaptâmeros ou de reparo de intervalo. Tais métodos frequentemente resultam na integração do ácido nucleico heterólogo no genoma da célula de levedura.
[00152] Os ácidos nucleicos codificando as atividades de interesse podem estar presentes em alto número de cópia.
Métodos para produção de álcoois graxos dessaturados e/ou acetatos de álcool graxos dessaturados
[00153] É aqui provido um método para produção de um ácido graxo dessaturado e opcionalmente um acetato de álcool graxo dessaturado em uma célula de levedura, o dito método compreendendo as etapas de prover uma célula de levedura e incubar a dita célula de levedura em um meio, em que a célula de levedura expressa: i) pelo menos uma dessaturase heteróloga capaz de introduzir pelo menos uma ligação dupla em uma acil-CoA graxa tendo um comprimento de cadeia carbônica de 14, convertendo deste modo pelo menos parte da dita acil-CoA graxa para uma acil-CoA graxa dessaturada; e ii) pelo menos uma acil-CoA graxa redutase heteróloga, capaz de converter pelo menos parte da dita acil-CoA graxa dessaturada para um álcool graxo dessaturado, produzindo deste modo o dito álcool graxo dessaturado; e iii) opcionalmente uma acetiltransferase capaz de converter pelo menos parte do dito álcool graxo dessaturado para um acetato de álcool graxo dessaturado, produzindo deste modo o dito acetato de álcool graxo dessaturado; em que a dessaturase tem uma especificidade mais alta para a tetradecanoil-CoA do que para a hexadecanoil-CoA e/ou em que a acil-CoA graxa redutase tem uma especificidade mais alta para a tetradecanoil-CoA dessaturada do que para a hexadecanoil-CoA dessaturada.
[00154] A célula de levedura pode ser capaz de sintetizar tetradecanoil- CoA naturalmente ou pode ser engenheirada para sintetizar tetradecanoil-CoA ou tetradecanoil-CoA pode ser provido no meio no qual a célula é incubada, como descrito na seção “acil-CoA graxa”. A pelo menos uma dessaturase heteróloga e pelo menos uma acil-CoA graxa redutase heteróloga podem ser como aqui descrito em outro lugar. A célula de levedura pode ser como descrita acima.
[00155] As células de levedura aqui descritas podem ser usadas em um método para produzir um álcool graxo dessaturado e/ou um acetato de álcool graxo dessaturado tendo um comprimento de cadeia de 14 com títulos sem precedentes.
[00156] Em particular, em algumas modalidades, a razão de tetradecanoil-CoA dessaturada para hexadecanoil-CoA dessaturada é de pelo menos 0,1, tal como pelo menos 0,2, tal como pelo menos 0,3, tal como pelo menos 0,4, tal como pelo menos 0,5, tal como pelo menos 0,75, tal como pelo menos 1, tal como pelo menos 2, tal como pelo menos 3, tal como pelo menos 4, tal como pelo menos 5, tal como pelo menos 6, tal como pelo menos 7, tal como pelo menos 8, tal como pelo menos 9, tal como pelo menos 10, tal como pelo menos 12,5, tal como pelo menos 15, ou mais.
[00157] Em algumas modalidades, o método produz um título de álcoois graxos dessaturados de pelo menos 1 mg/L, tal como pelo menos 1,5 mg/L, tal como pelo menos 5 mg/L, tal como pelo menos 10 mg/L, tal como pelo menos 25 mg/L, tal como pelo menos 50 mg/L, tal como pelo menos 100 mg/L, tal como pelo menos 250 mg/L, tal como pelo menos 500 mg/L, tal como pelo menos 750 mg/L, tal como pelo menos 1 g/L, tal como pelo menos 2 g/L, tal como pelo menos 3 g/L, tal como pelo menos 4 g/L, tal como pelo menos 5 g/L, ou mais.
[00158] Em algumas modalidades, o método produz um título de álcool graxo dessaturado tendo um comprimento de cadeia de 14 de pelo menos 1 mg/L, tal como pelo menos 1,5 mg/L, tal como pelo menos 5 mg/L, tal como pelo menos 10 mg/L, tal como pelo menos 25 mg/L, tal como pelo menos 50 mg/L, tal como pelo menos 100 mg/L, tal como pelo menos 250 mg/L, tal como pelo menos 500 mg/L, tal como pelo menos 750 mg/L, tal como pelo menos 1 g/L, tal como pelo menos 2 g/L, tal como pelo menos 3 g/L, tal como pelo menos 4 g/L, tal como pelo menos 5 g/L, ou mais.
[00159] Em algumas modalidades, o método produz álcoois graxos dessaturados compreendendo pelo menos 1% de um álcool graxo dessaturado tendo um comprimento de cadeia de 14, tal como pelo menos 1,5%, tal como pelo menos 2%, tal como pelo menos 2,5%, tal como pelo menos 3%, tal como pelo menos 3,5%, tal como pelo menos 4%, tal como pelo menos 4,5%, tal como pelo menos 5%, tal como pelo menos 7,5%, tal como pelo menos 10%, ou mais.
[00160] Em algumas modalidades, o método produz um título de acetatos graxos dessaturados de pelo menos 1 mg/L, tal como pelo menos 1,5 mg/L, tal como pelo menos 5 mg/L, tal como pelo menos 10 mg/L, tal como pelo menos 25 mg/L, tal como pelo menos 50 mg/L, tal como pelo menos 100 mg/L, tal como pelo menos 250 mg/L, tal como pelo menos 500 mg/L, tal como pelo menos 750 mg/L, tal como pelo menos 1 g/L, tal como pelo menos 2 g/L, tal como pelo menos 3 g/L, tal como pelo menos 4 g/L, tal como pelo menos 5 g/L, ou mais.
[00161] Em algumas modalidades, o método produz um título de acetato graxo dessaturado tendo um comprimento de cadeia de 14 de pelo menos 1 mg/L, tal como pelo menos 1,5 mg/L, tal como pelo menos 5 mg/L, tal como pelo menos 10 mg/L, tal como pelo menos 25 mg/L, tal como pelo menos 50 mg/L, tal como pelo menos 100 mg/L, tal como pelo menos 250 mg/L, tal como pelo menos 500 mg/L, tal como pelo menos 750 mg/L, tal como pelo menos 1 g/L, tal como pelo menos 2 g/L, tal como pelo menos 3 g/L, tal como pelo menos 4 g/L, tal como pelo menos 5 g/L, ou mais.
[00162] Em algumas modalidades, o método produz acetatos graxos dessaturados compreendendo pelo menos 1% de um acetato graxo dessaturado tendo um comprimento de cadeia de 14, tal como pelo menos 1,5%, tal como pelo menos 2%, tal como pelo menos 2,5%, tal como pelo menos 3%, tal como pelo menos 3,5%, tal como pelo menos 4%, tal como pelo menos 4,5%, tal como pelo menos 5%, tal como pelo menos 7,5%, tal como pelo menos 10%.
[00163] Em algumas modalidades, a célula de levedura pode expressar ainda uma acil-CoA graxa redutase que forma aldeído EC 1.2.1.50 (FAR”) como aqui descrita acima.
Recuperação
[00164] Pode ser desejável recuperar os produtos obtidos pelos métodos aqui divulgados. Assim os presentes métodos podem compreender uma etapa adicional de recuperar o álcool graxo dessaturado e/ou o acetato de álcool graxo dessaturado produzido pela presente célula de levedura.
[00165] Em algumas modalidades, o método compreende uma etapa de recuperar os álcoois graxos dessaturados. Em uma modalidade particular, o método compreende uma etapa de recuperar os álcoois graxos dessaturados tendo um comprimento de cadeia carbônica de 14. Em outras modalidades, o método compreende uma etapa de recuperar os acetatos de álcool graxos. Em uma modalidade particular, o método compreende uma etapa de recuperar os acetatos de álcool graxos tendo um comprimento de cadeia carbônica de 14.
[00166] Os métodos para recuperar os produtos obtidos pela presente invenção são conhecidos na técnica e podem compreender uma extração com um solvente hidrofóbico tal como decano, hexano ou um óleo vegetal.
[00167] Os produtos recuperados podem ser modificados ainda mais, por exemplo os álcoois graxos dessaturados podem ser convertidos para os aldeídos graxos dessaturados correspondentes como aqui descrito acima.
[00168] Os produtos recuperados, isto é, os álcoois graxos dessaturados e/ou acetatos de álcool graxos desnaturados, também podem ser formulados dentro de uma composição de feromônio. A composição pode compreender ainda um ou mais compostos adicionais tais como um carreador ou substrato líquidos ou sólidos. Os aldeídos graxos obtidos a partir dos ditos álcoois graxos dessaturados também podem estar compreendidos em tais composições.
Kit
[00169] É aqui provido um kit de partes para realizar os presentes métodos. O kit de partes pode compreender uma célula de levedura “pronta para o uso” como aqui descrito. Em uma modalidade, a célula de levedura é uma célula de Yarrowia, tal como uma célula de Yarrowia lipolitica.
[00170] Em uma outra modalidade, o kit de partes compreende uma construção de ácido nucleico codificando as atividades de interesse a serem introduzidas na célula de levedura. A construção de ácido nucleico pode ser provida como uma pluralidade de construções de ácido nucleico, tal como uma pluralidade de vetores, em que cada vetor codifica uma ou diversas das atividades desejadas.
[00171] O kit de partes pode opcionalmente compreender a célula de levedura a ser modificada.
[00172] Em algumas modalidades, o kit de partes compreende todos os acima.
Composição de feromônio
[00173] A presente divulgação provê assim compostos, em particular álcoois graxos e acetatos de álcool graxos, assim como derivados dos mesmos, e seu uso. Em particular, os compostos obteníveis usando as presentes células e métodos são úteis como componentes de composições de feromônio. Tais composições de feromônio podem ser úteis para o controle de praga integrado. Eles podem ser usados como é conhecido na técnica para por exemplo interromper o acasalamento.
[00174] Os álcoois graxos dessaturados e acetatos de álcool graxos dessaturados obteníveis pelos presentes métodos ou usando as presentes células de levedura podem ser formulados em uma composição de feromônio.
[00175] Tais composições de feromônio podem ser usadas como produtos de controle de praga integrados, que podem ser usados em um método de monitorar a presença de praga ou em um método de interromper o acasalamento da praga.
[00176] As composições de feromônio como aqui divulgadas podem ser usadas como biopesticidas. Tais composições podem ser pulverizadas ou dispensadas em uma cultura, em um campo ou em um pomar. Elas também podem, como é conhecido na técnica, ser embebidas por exemplo em um septo de borracha, ou misturadas com outros componentes. Isto pode resultar na interrupção do acasalamento, prevenindo deste modo a reprodução de praga, ou a mesma pode ser usada em combinação com um dispositivo de aprisionamento para aprisionar as pragas. Os exemplos não limitantes de pragas contra as quais as presentes composições de feromônio podem ser usadas são: lagartas da cápsula do algodão (Helicoverpa armigera), furador da haste listrada (Chilo suppressalis), traça do dorso de diamante (Plutella xilostella), traça do repolho (Mamestra brassicae), lagarta do coração do repolho grande (Crocidolomia binotalis), furador da haste do milho europeu (Sesamia nonagrioides), asas claras da groselha (Synanthedon tipuliformis) e traça emplumada da alcachofra (Platyptilia carduidactilal). Consequentemente, o uso das presentes composições em uma cultura pode levar ao rendimento de safra aumentada, substancialmente sem nenhum impacto ambiental.
[00177] As quantidades relativas de álcoois graxos e acetatos de álcool graxos nas presentes composições de feromônio podem variar dependendo da natureza da safra e/ou da praga a ser controlada; variações geográficas também podem existir. A determinação das quantidades relativas opcionais pode assim requerer otimização de rotina. As composições de feromônio também podem compreender aldeídos graxos.
[00178] Os exemplos de composições usadas como repelentes podem ser encontrados em Kehat & Dunkelblum, 1993, para H. armigera, em Alfaro et al., 2009, para C. suppressalis, em Eizaguirre et al., 2002, para S. nonagrioides; em Wu et al., 2012, para P. xilostella; em Bari et al., 2003, para P. carduidactila.
[00179] Em algumas modalidades, a composição de feromônio pode compreender ainda um ou mais compostos adicionais tais como um líquido ou carreador ou substrato sólido. Por exemplo, os carreadores ou substratos adequados incluem óleos vegetais, óleos minerais refinados ou frações dos mesmos, borracha, plásticos, sílica, terra diatomácea, matriz serosa e pó de celulose.
[00180] A composição de feromônio pode ser formulada como é conhecido na técnica. Por exemplo, a mesma pode estar na forma de uma solução, um gel, um pó. A composição de feromônio pode ser formulada de modo que a mesma possa ser facilmente dispensada, como é conhecido na técnica.
Exemplos Exemplo 1: Construção de plasmídeos e cepas
[00181] Os genes codificando dessaturases de Pelargonium hortorum (SEQ ID NO: 1) e Ricinus communis (SEQ ID NO: 3) foram sintetizados pela GeneArt (Life Technologies) nas versões otimizadas pelo códon para Y. lipolitica. Os genes codificando dessaturases de Amyelois transitella (SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 7), de Drosophila melanogaster (SEQ ID NO: 9), e OLE1 de S. cerevisiae foram sintetizados pela GeneArt na versão otimizada no códon para S. cerevisiae. Os genes sintéticos codificando Amyelois transitella dessaturase e S. cerevisiae dessaturase OLE1 tiveram os sítios attB1-attB2 incorporados, o que permitiu clonar estes genes dentro do vetor pDONR 221 por intermédio do sistema de clonagem Gateway (Invitrogen: Gateway® Technology Manual.[http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/gatewayman.pdf]. O gene codificando a álcool acetiltransferase ATF1 (SEQ ID NO: 19) foi amplificado a partir do DNA genômico de preparação da cepa CEN.PK102-5B de S. cerevisiae. Um gene codificando a acil redutase graxa de Helicoverpa armigera foi modificado de modo que o seu sinal nativo putativo KKSYE fosse substituído com o sinal HDEL de S. cerevisiae e este gene também foi sintetizado pela GeneArt (Life Technologies) na versão otimizada no códon para S. cerevisiae. Todos os genes foram amplificados pela PCR para se obter os fragmentos para clonar em vetores de expressão de levedura. Os iniciadores estão listados na Tabela 1 e os fragmentos de DNA resultantes estão listados na Tabela 2. Os produtos de PCR foram separados em um gel de agarose a 1% contendo RedSafe® (iNtRON Biotechnology). Os produtos de PCR do tamanho correto foram excisados do gel e purificados usando o kit Nucleospin® Gel e PCR Clean-up (Macherey-Nagel). Tabela 1: Iniciadores.
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Tabela 2: Fragmentos de DNA obtidos pela PCR usando o padrão e iniciadores indicados.
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Exemplo 2: Clonagem de vetores pYEX-CHT-Dmd9, pYEX-CHT-Phd9, pYEX-CHT-Rcd9, pYEX-CHT-Atrd1432, pYEX-CHT-Atrd236 e pYEX- CHT-OLE1
[00182] Os fragmentos de DNA BB1870, BB1871, e BB1872 foram amplificados respectivamente dos plasmídeos pCfB5316, pCfB4584 e pCfB4585 usando-se o Maxima Hot Start Green PCR Master Mix (2X) (ThermoFisher Scientific) de acordo com o protocolo do fabricante. A mistura de PCR conteve 20 μl de água, 25 μl de Maxima Hot Start Green PCR Master Mix, 2,5 μl de iniciador avançado (10 μM), 2,5 μl de iniciador reverso (10 μM) e 5 ng de DNA padrão e o seguinte programa de PCR foi usado: 94°C durante 2 min, 35 ciclos de [94°C durante 15 s, 55°C durante 30 s, 72°C durante 2 min 30 s], 72°C durante 7 min. Os produtos de PCR foram separados em um gel de agarose a 1%. Os produtos de PCR do tamanho correto foram excisados do gel e purificado usando os kits Nucleospin® Gel e PCR Clean-up (Macherey-Nagel).
[00183] Os fragmentos de DNA resultantes (BB1870, BB1871 e BB1872) foram clonados no vetor pDONR 221 pela tecnologia de clonagem Gateway criando os chamados “clones de entrada” (ThermoFisher Scientific). A reação BP foi realizada misturando-se 100 ng de genes sintéticos, 100 ng de pDONR 221 e 1 μL de BP clonase (Life Technologies). A reação foi incubada na temperatura ambiente durante 1 hora. A mistura de reação foi transformada em células HB101 competentes na E. coli (Life Technologies) pelo choque térmico e as células foram plaqueadas sobre placas de ágar com Caldo de Lisogenia (LB) com 50 mg/L de canamicina e incubadas durante a noite a 37°C. As colônias únicas foram inoculadas em 5 ml de LB líquido com 50 mg/L de canamicina em tubos estéreis de 13 ml e cultivadas com agitação durante a noite. Os plasmídeos foram purificados a partir de culturas noturnas de E. coli e sequenciados para confirmar a clonagem correta. Os genes foram transportados dos clones de entrada para o vetor de expressão de levedura de destinação pYEX-CHT-DEST (Ding BJ, Carraher C, Lofstedt C. 2016. Sequence variation determining stereochemistry of a Δ11 dessaturase active in moth sex pheromone biosynthesis. Insect Biochem Mol Biol. 74: 6875. doi: 10.1016/j.ibmb,2016,05,002.) misturando-se 100 ng dos clones de entrada com 100 ng de vetor de destinação pYEX-CHT-DEST e 1 μL de LR clonase (Invitrogen). A reação foi incubada na temperatura ambiente durante 1 hora, seguida pela transformação nas células HB101 competentes na E. coli pelo choque térmico. As células foram plaqueadas sobre placas de ágar com Caldo de Lisogenia (LB) com 100 mg/L de ampicilina. Os plasmídeos foram purificados a partir de culturas noturnas de E. coli e a clonagem correta foi confirmada pelo sequenciamento.
Exemplo 3: Clonagem de vetores pCfB5316, pCfB4584, pCfB4585, pCfB4580
[00184] Os biobricks de DNA BB0410, BB1696, BB0301, BB1420, BB0301, BB1421, BB0464, BB0915 e BB1422 foram amplificados pela PCR como a seguir. A mistura de PCR conteve 32 μl de água, 10 μl de tampão de polimerase de alta fidelidade Phusion® (5x), 1 μl de dNTPs (10 mM), 1 μl de Phusion U polimerase, 2,5 μl de iniciador avançado (10 μM), 2,5 μl de iniciador reverso (10 μM) e 1 μl de DNA padrão e o seguinte programa de PCR foi usado: 94°C durante 2 min, 30 ciclos de [94°C durante 15 s, 52°C durante 20 s, 68°C durante 1 min 30 s], 68°C durante 2 min, pausa em 10°C.
[00185] O vetor integrativo EasyClone 2.0 pCfB2909 (XII-5- MarkerFree) é descrito em Jessop-Fabre et al., 2016 e pCfB2190 é descrito em Stovicek et al., 2015. O plasmídeo pCfB2912 foi construído pela fusão de USER de fragmentos de DNA BB0593 (contém a cadeia principal do vetor pCfB387) e BB0598 (contém o cassete de resistência à nourseotricina), como descrito em Stovicek et al, 2015. Todos os vetores integrativos foram linearizados com FastDigest® AsiSI (Fermentas) durante 2 horas a 37°C e depois cortado com Nb.BsmI (New England Biolabs) durante 1 hora a 65°C. Os vetores resultantes contendo extremidades adesivas foram separados pela eletroforese em gel, excisados e purificados em gel usando os kits Nucleospin® Gel e PCR Clean-up (Macherey-Nagel). Os fragmentos de DNA foram clonados nos vetores assim preparados pela clonagem USER por intermédio do seguinte protocolo: 1 μl de plasmídeo linearizado, 1 μl de fragmento de promotor, 1,5 μl de fragmento de gene, 1 μl de tampão de polimerase de alta fidelidade Phusion® (5x), e 0,5 μl de enzima USER (New England Biolabs) foram misturados e incubados a 37°C durante 25 min e a 25°C durante 25 min. A reação foi transformada nas células DHalfa da E. coli quimicamente competentes e as células foram plaqueadas sobre placas de ágar com Caldo de Lisogenia (LB) com 100 mg/L de ampicilina. As placas foram incubadas durante a noite a 37°C e as colônias resultantes foram triadas pela PCR de colônia. Os plasmídeos foram purificados a partir de culturas noturnas de E. coli e a clonagem correta foi confirmada pelo sequenciamento. Os vetores construídos estão listados na Tabela 3.Tabela 3: Vetores de Expressão.
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Exemplo 4: Construção de cepas
[00186] Os vetores de expressão recombinantes derivados de pYEX- CHT contendo os genes da dessaturase diferentes foram introduzidos na S. cerevisiae deficiente tanto para OLE1 quanto para ELO1 (MATa elo1::HIS3 ole1::LEU2 ade2 his3 leu2 ura3; (Schneiter et al., 2000)), usando o kit de transformação fácil de levedura S.c. (Life Technologies). Para a seleção de clones prototróficos de uracila e leucina, as células de levedura transformadas foram plaqueadas no meio composto de 0,7% de YNB (sem aminoácido, com sulfato de amônio), 1,546% de mistura drop-out faltando uracila e leucina (Formeio® LTD, Norwich, Inglaterra), 2% de glicose, 1% de tergitol (tipo Nonidet NP-40, Sigma-Aldrich Suécia AB, Stockholm, Suécia), 0,01% de adenina (Sigma), e 0,5 mM de ácido oléico (Sigma). As cepas de levedura construídas estão listadas na Tabela 4.
[00187] Os vetores de expressão integrativa pCfB4580 e pCfB5316 foram linearizados com FastDigest® NotI (Fermentas). pCfB4580 foi transformado em S. cerevisiae CEN.PK102-5B usando protocolo de acetato de lítio (Gietz & Schiestl, 2007) levando à cepa ST4854. Os transformantes positivos foram selecionados nas placas de drop-out sntética de levedura sem leucina (Sigma-Aldrich). A integração correta das construções de expressão no genoma de S. cerevisiae foi confirmada pela PCR de colônia. A cepa ST5290 foi construída integrando-se pCfB5316 em ST4854 usando um método descrito em (Jessop-Fabre et al., 2016). As cepas construídas estão listadas na Tabela 5.
Exemplo 5: Atividades e especificidades de Δ9 dessaturases
[00188] As atividades e especificidades das dessaturases foram testados em uma cepa da S. cerevisiae com deleções dos genes OLE1 e ELO1, codificando a Δ9^cido graxo dessaturase e a acil elongase de meia cadeia respectivamente (Schneiter et al., 2000).
[00189] Três colônias individuais de cepas ST_Atr1432, ST_Atr236, ST_Phd9, ST_Rcd9, ST_ScOLE1 e ST_DmeD9 foram inoculadas em 1 mL de meio seletivo (SC-Ura-Leu) e incubada a 30°C e 300 rpm durante 48 h. As culturas foram diluídas para uma OD600 de 0,4 em 5 mL de meio seletivo suplementado com CuSO4 2 mM e o miristato de metila a 0,5 mM (14:Me) (Larodan Fine Chemicals, Suécia). A solução de estoque de miristato de metila foi preparada para uma concentração de 100 mM em 96% de etanol. As culturas de levedura foram incubadas a 30°C a 300 rpm durante 48 horas.
[00190] 1 mL de cultura foi amostrado e 3,12 μg de éster metílico do ácido nonadecílico foi adicionado como padrão interno. Os lipídeos totais foram extraídos usando 3,75 mL de metanol/clorofórmio (2:1, v/v), em um frasco de vidro. Um mL de ácido acético (0,15 M) e 1,25 mL de água foram adicionados ao tubo. Os tubos foram turbilhonados vigorosamente e centrifugados a 2.000xg durante 2 min. A fase de clorofórmio de fundo, cerca de 1 mL, contendo os lipídeos totais, foi transferida para um novo frasco de vidro e o solvente foi evaporado até a secura. Os ésteres metílicos de ácido graxo (FAMEs) foram fabricados a partir deste extrato de lipídeo total pela metanólise ácida. Um mL de ácido sulfúrico a 2% em metanol (v/v) foi adicionado ao tubo, vigorosamente turbilhonado, e incubado a 90°C durante 1 h. Depois da incubação, 1 mL de água foi adicionado e bem misturado, e depois 1 mL de hexano foi usado para extrair os FAMEs.
[00191] As amostras de éster metílico foram submetidas às analyses pela GC-MS em um Hewlett Packard 6890 GC acoplado a um detector seletivo de massa HP 5973. O GC foi equipado com uma coluna INNOWax (30 mx0,25 mmx0,25 μm), e hélio foi usado como o gás carreador (velocidade média: 33 cm/s). O MS foi operado no modo de impacto de elétron (70 eV), e o injetor foi configurado no modo sem divisão a 220°C. A temperatura da estufa foi ajustada para 80°C durante 1 min, depois aumentada em uma taxa de 10°C/min até 210°C, seguido por uma contensão a 210°C durante 15 min, e depois aumentada em uma taxa de 10°C/min até 230°C seguido por uma contensão a 230°C durante 20 min. Os produtos de ácido graxo monoinsaturados foram identificados comparando-se os seus tempos de retenção e os espectros de massa com aqueles de padrões sintéticos. Os dados foram analisados pelo software ChemStation (Agilent, Technologies, USA).
[00192] As concentrações medidas de Z9-14:Me e Z9-16:Me (Tabela 4) mostram que a cepa ST_DmeD9, expressando a dessaturase de D. melanogaster, resultou na concentração mais alta de Z9-14:Me (3,67 mg/L) e na razão máxima de Z9-14:Me e Z9-16:Me. Isto indica que entre as dessaturases testadas, a D. melanogaster dessaturase tem a atividade e especificidade mais altas para o substrato C14-CoA. Tabela 4: Atividade e especificidade de dessaturases heterólogas em levedura.
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Exemplo 6: Produção de acetato de (Z)9-tetradecen-1-ila
[00193] As cepas para produção de feromônio foram criadas com base na S. cerevisiae CEN.PK102-5B, que teve genes OLE1 e ELO1 ativos. As cepas obtidas estão listadas na Tabela 5.
[00194] As cepas ST4854 e ST5290 foram inoculadas em 5 ml de meio sintético completo (faltando histidina, leucina, triptofabo suplementado com 20 mg/L de uracila e 76 mg/L de histidina) e cultivadas em tubos de vidro de 12 ml (Duran, Wertheim, Alemanha) com tampas labocap metálicas (Lüdiswiss, Flawil, Suíça) durante a noite a 30°C com agitação a 250 rpm. No dia seguinte a cultura noturna foi centrifugada, o sobrenadante foi descartado e o grânulo foi recolocado em suspensão em 2 ml de meio mineral, que teve a composição como descrita em (Jensen et al, 2014). O meio foi suplementado com 76 mg/L de histidina e 20 mg/L de uracila. As culturas foram incubadas a 30°C com agitação a 250 rpm durante 48 horas.
[00195] 1 mL da amostra de cultura foi transferido para um frasco de vidro de 4 mL e 10 μL de estoque de padrão interno (1 μg/μl de éster metílico de (Z)10-heptan-1-ílico em 100% de etanol) foram adicionados. Os frascos foram cobertos com pedaços pequenos de folha de alumínio e nós usamos uma agulha para perfurar furos pequenos nas coberturas de folha metálica. As amostras foram turbilhonadas e colocadas a -80°C para armazenagem até a análise. As amostras foram secadas por congelamento (bandejas secadoras Freezone6 e Stoppening, Labconco, Kansas City, USA) a -40°C, depois 1 mL de clorofórmio:metanol 2:1 foi adicionado para romper as células. A mistura foi turbilhonada durante 45 s e deixada na temperatura ambiente durante 4 horas. Os solventes orgânicos foram evaporados lentamente sob uma corrente de nitrogênio. 1 ml de hexano foi adicionado, as amostras foram turbilhonadas durante 10 s, centrifugadas e 200 μl foram transferidos para um novo frasco de vidro. A análise de GC-MS foi realizada como descrita no Exemplo 5. A concentração de acetato de (Z)-9-tetradecen-1-ila foi calculada com base no padrão interno.
[00196] Como evidente a partir dos resultados, a superexpressão de D. melanogaster dessaturase aumentou o título de Z9:14:OAc mais do que 5 vezes. Além disso, a fração de produto dos acetatos de álcool graxa totais aumentou de 2 para 10%.Tabela 5: Produção de acetato de (Z)-9-tetradecen-1-ila pela levedura
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Exemplo 7: Método para produzir Z11-C14:OAc
[00197] Um gene, codificando uma Δ11 dessaturase que preferivelmente produz Z11-C14:CoA é superexpresso em uma cepa de levedura junto com HarFAR e Atf1. A cepa resultante é cultivada em meio de cultivo e produz Z11-14:OAc. O gene codifica por exemplo a Δ11 dessaturase da traça enroladora de folha de faixa obliqua Choristoneura rosaceana (SEQ ID NO: 65). O feromônio é recuperado do caldo e formulado no produto de rompimento do acasalamento para controlar pragas, como por exemplo, o furador do milho europeu Ostrinia nubilalis.
Exemplo 8: Método para produzir E11-C14:OAc
[00198] Um gene, codificando uma Δ11 dessaturase que preferencialmente produz E11-C14:CoA é superexpressa em uma cepa de levedura junto com HarFAR e Atf1. A cepa resultante é cultivada no meio de cultivo e produz E11-14:OAc. O gene codifica por exemplo a Δ11 dessaturase da traça de verme de fogo pintado Choristoneura parallela (SEQ ID NO: 66). O feromônio é recuperado do caldo e formulado no produto de rompimento do acasalamento para controlar pragas, como por exemplo, traça da maçã marrom clara Epiphyas postvittana.
Exemplo 9: Construção de plasmídeos e cepas de Yarrowia lipolitica
[00199] Os genes codificando dessaturases de Amyelois transitella (SEQ ID NO: 68), Spodoptera litura (SEQ ID NO: 12) e Drosophila melanogaster (Dmd9; SEQ ID NO: 10), a acil redutase graxa de Helicoverpa armigera (HarFAR; SEQ ID NO: 25), as tioesterases de Escherichia coli (SEQ ID NO: 42) e de Cinnamomum camphora (SEQ ID NO: 40) e a álcool acetiltransferase de Saccharomyces cerevisiae (Atf1; SEQ ID NO: 21) foram sintetizados pela GeneArt (Life Technologies) na versão otimizada nos códons para Y. lipolitica. A acil redutase graxa de Heliothis subflexa foi sintetizada pela GeneArt (Life technologies) na versão otimizada no códon para Saccharomyces cerevisiae (SEQ ID NO: 70).
[00200] Na cepa ST6629 a matriz de leitura aberta de genes HFD4 (YALI0B01298g), HFD3 (YALI0A17875), HFD2 (YALI0E15400) e HFD1 (YALI0F23793g), assim como nucleotídeos -1130 a - 100 a montante da sequência codificadora de GPAT (YALI0C00209g) foram deletados. Um códon de parada e de mudança de matriz prematura foi introduzido dentro da Pex10 (YALI0C01023g) e FAO1 (YALI0B14014g) que resulta nos genes não funcionais.
[00201] A cepa ST7394 está fundamentada na ST6629 e expressa Dmd9, HarFAR e Atf1 como descrito em pCfB6969 e pCfB7600 (Fig. 2) das regiões intergênicas nos cromossomas C (nucleotídeos 2192680-2193710) e D (nucleotídeos 1842294-1843343).
[00202] Na cepa ST6365, as matrizes de leitura aberta de HfD1, HFD4, PEX10, e FAO1 foram substituídas com cassetes marcadores de seleção. ST6365 expressa a Δ11 dessaturase de A. transitella e a acil redutase graxa de Heliothis subflexa.
[00203] A cepa ST6357 expressa Atf1 e HarFAR de uma região intergênica no cromossoma E (nucleotídeos 1722042-1723055) como descrito em pCfB7235 (Fig. 2).
[00204] A cepa ST6359 expressa Atf1 e HarFAR de uma região intergênica no cromossoma E (nucleotídeos 1722042-1723055) como descrito em pCfB7235 (Fig. 2) e Dmd9 de uma região intergênica no cromossoma E (2881519-2882566) como descrito em pCfB7239 (Fig. 2).
[00205] A cepa ST6360 expressa Atf1 e HarFAR de uma região intergênica no cromossoma E (nucleotídeos 1722042-1723055) como descrito em pCfB7235 e SliDes11 de uma região intergênica no cromossoma E (2881519-2882566) como descrito em pCfB7240 (Fig. 2).
[00206] A cepa ST6373 expressa Atf1 e HarFAR de uma região intergênica no cromossoma E (nucleotídeos 1722042-1723055) como descrito em pCfB7235 e Dmd9 e TesA(LL) de uma região intergênica no cromossoma E (2881519-2882566) como descrito em pCfB7251 (Fig. 2).
[00207] A cepa ST6375 expressa Atf1 e HarFAR de uma região intergênica no cromossoma E (nucleotídeos 1722042-1723055) como descrito em pCfB7235 e Dmd9 e CcFATB1 de uma região intergênica no cromossoma E (2881519-2882566) como descrito em pCfB7253 (Fig. 2).
[00208] Na cepa ST7010 os nucleotídeos 3658-3660 (ATC) do gene da acila graxa sintetase 2 nativa da Y. lipolitica (YALI19382) foram substituídos pelo TTC.
[00209] Na cepa ST7895 e ST7944 as matrizes de leitura aberta dos genes LIP2 e LIP2 LIP8 foram deletadas, respectivamente.
Exemplo 10: Método para aumentar a produção de (Z)9-14:OH e (Z)9-14:Ac em Yarrowia lipolitica pela expressão heteróloga de tioesterases
[00210] As cepas na Tabela 9 foram inoculadas em 2 mL de meio YPG (20 g/L de peptona, 10 g/L de extrato de levedura e 70 g/L de glicerol) para uma densidade óptica (600 nm) de 1 e cultivada em tubos de vidro de 12 ml (Duran, Wertheim, Alemanha) com tampas metálicas labocap (Lüdiswiss, Flawil, Suíça) durante 48 horas a 30°C agitados a 250 rpm. Se indicado o meio foi suplementado com 1 g/L de miristato de metila.
[00211] Para a extração do álcool graxo, 1 mL de cultura foi transferido para um frasco de vidro de 4 mL e 10 μL de solução de padrão interno (2 μg/μL de éster (Z)-10-heptan-1-il metílico em 100% de etanol) foram adicionados. Os frascos foram cobertos com pedaços pequenos de folha de alumínio e uma agulha foi usada para perfurar pequenos furos nas coberturas de folha de alumínio. As amostras foram turbilhonadas e colocadas a -80°C para armazenagem até análise. As amostras foram secadas por congelamento em um sistema de secagem por congelamento (bandejas secadoras Freezone6 e Stoppening, Labconco, Kansas City, USA) a -40°C, depois 1 mL de clorofórmio:metanol 2:1 foi adicionado para romper as células. A mistura foi turbilhonada durante 45 s e deixada na temperatura ambiente durante 4 horas. Os solventes orgânicos foram evaporados lentamente sob uma corrente de nitrogênio. 1 ml de hexano foi adicionado, as amostras foram turbilhonadas durante 10 s, centrifugadas e 200 μl foram transferidos para um novo frasco de vidro. A quantificação foi realizada com um SCION TQ GC-MS (Bruker), equipado com uma coluna INNOWax 30 m x 0,25 mm x 0,25 μm, com hélio como o gás carreador. O injetor foi configurado no modo não dividido a 250°C, a temperatura da estufa foi ajustada para 80°C durante 1 min, depois aumentada a uma razão de 10°C/min até 210°C, seguida por uma contensão a 210°C durante 10 min, e depois aumentada a uma razão de 10°C/min a 230°C seguida por uma contensão a 230°C durante 5 min. A MS foi operada no modo de impacto de elétron (70eV), varrendo entre m/z 30 e 350. Os compostos foram identificados pela comparação de tempos de retenção e espectros de massa com aqueles de compostos de referência. Os compostos foram quantificados pela Corrente de Íon Total (TIC) registrada. Os dados foram analisados pelo software BrukerMSWorkstation. As concentrações de álcoois graxos foram calculadas com base nos padrões internos (Tabela 9).
[00212] O exemplo mostra a produção de (Z)9-14:OH e (Z)9-14:OAc na levedura Y. lipolitica. A expressão adicional de tioesterase da E. coli ou C. camphora aumentou a produção dos compostos em 20% e 25%, respectivamente.Tabela 9. Produção aumentada de (Z)9-14:OH e (Z)9-14:OAc em Yarrowia lipolitica pela expressão heteróloga de tioesterases. Nas duas colunas da direita, a linha superior indica produtos em C14, a linha inferior produtos em C16. N.A.: não disponível.
Figure img0008
Exemplo 11: Método para aumentar a produção de (Z)9-14:OH em Yarrowia lipolitica pela introdução de mutação pontual na acila graxa sintetase de Yarrowia lipolitica (FAS2)
[00213] A cepas na Tabela 10 foram cultivadas como descrito no exemplo 10, mas o meio não foi suplementado.
[00214] Pela introdução de uma mutação pontual (I1220F) a produção da acila graxa sintetase nativa (FAS2) de (Z)9-14:OH aumentou aproximadamente 15 vezes.Tabela 10
Figure img0009
Exemplo 12: Método para aumentar a produção de (Z)9-14:Ac em Yarrowia lipolitica pela deleção de genes da lipase da Yarrowia lipolitica
[00215] As cepas na Tabela 11 foram cultivadas como descrito no Exemplo 10. O meio foi suplementado com 1 g/L de miristato de metila. A deleção da lipase 2 sozinha ou lipase 2 e lipase 8 juntas resultou em títulos aumentados de álcool graxo, como pode ser observado na fig. 3.Tabela 11
Figure img0010
Sequências Vista geral
[00216] SEQ ID NO: 1 - Sequência de nucleotídeo de Y. lipolitica otimizada no códon de Δ9 dessaturase de Pelargonium hortorum SEQ ID NO: 2 - Δ9 dessaturase de Pelargonium hortorum SEQ ID NO: 3 - Sequência de nucleotídeo de Y. lipolitica otimizada no códon de Δ9 dessaturase de Ricinus communis SEQ ID NO: 4 - Δ9 dessaturase de Ricinus communis SEQ ID NO: 5 - Sequência de nucleotídeo de S. cerevisiae otimizada no códon de Δ9 dessaturase de Amyelois transitella Atr236 SEQ ID NO: 6 - Δ9 dessaturase de Amyelois transitella Atr236 SEQ ID NO: 7 - sequência de nucleotídeo de S. cerevisiae otimizada no códon de Δ9 dessaturase de Amyelois transitella Atr1432 SEQ ID NO: 8 - Δ9 dessaturase de Amyelois transitella Atr1432 SEQ ID NO: 9 - Sequência de nucleotídeo de S. cerevisiae otimizada no códon de Δ9 dessaturase de Drosophila melanogaster Dmd9 SEQ ID NO: 10 - Δ9 dessaturase de Drosophila melanogaster Dmd9 SEQ ID NO: 11 - Sequência de nucleotídeo de Y. lipolitica otimizada no códon de Δ9 dessaturase de Spodoptera litura Des11 SEQ ID NO: 12 - Δ9 dessaturase de Spodoptera litura Des11 SEQ ID NO: 13 - Sequência de nucleotídeo de Y. lipolitica otimizada no códon de Δ9 dessaturase de Chauliognathus lugubris Cld9 SEQ ID NO: 14 - Δ9 dessaturase de Chauliognathus lugubris Cld9 SEQ ID NO: 15 - Sequência de nucleotídeo de Y. lipolitica otimizada no códon de dessaturase de Tribolium castaneum D6 SEQ ID NO: 16 - dessaturase de Tribolium castaneum D6 SEQ ID NO: 17 - Sequência de nucleotídeo de Y. lipolitica otimizada no códon de dessaturase de Tribolium castaneum D8 SEQ ID NO: 18 - dessaturase de Tribolium castaneum D8 SEQ ID NO: 19 - sequência de ATF1 DNA de Saccharomyces cerevisiae; sequência codificadora de DNA. SEQ ID NO: 20 - Sequência de nucleotídeo de Y. lipolitica otimizada no códon de álcool acetiltransferase de S. cerevisiae ATF1 SEQ ID NO: 21 - Sequência de aminoácido ATF1p de Saccharomyces cerevisiae SEQ ID NO: 22 - Sequência de nucleotídeo de Y. lipolitica otimizada no códon da tioesterase de Cuphea palustris CpFATB2 SEQ ID NO: 23 - Sequência de proteína da tioesterase de Cuphea palustris CpFATB2 SEQ ID NO: 24 - Sequência de nucleotídeo de S. cerevisiae otimizada no códon da acil redutase graxa de Helicoverpa armigera; sequência codificadora de mRNA SEQ ID NO: 25 - Acil redutase graxa de H. armigera SEQ ID NO: 26 - Sequência de nucleotídeo de S. cerevisiae otimizada no códon da acil redutase graxa de H. armigera com peptídeo de sinal trocado para HDEL; sequência codificadora de DNA. SEQ ID NO: 27 - Acil redutase graxa de H. armigera com peptídeo de sinal trocado para HDEL SEQ ID NO: 28 - Sequência de nucleotídeo de S. cerevisiae otimizada no códon da acil redutase graxa de H. assulta; sequência codificadora de mRNA. SEQ ID NO: 29 - Sequência de aminoácido da acil redutase graxa de H. assulta SEQ ID NO: 30 - Sequência de nucleotídeo de S. cerevisiae otimizada no códon da acil redutase graxa de Helicoverpa assulta com peptídeo de sinal trocado para HDEL; Sequência codificadora de mRNA SEQ ID NO: 31 - Sequência de aminoácido da acil redutase graxa de H. assulta com peptídeo de sinal trocado para HDEL SEQ ID NO: 32 - Sequência de nucleotídeo da S. cerevisiae otimizada no códon da acil redutase graxa de Heliothis subflexa; sequência codificadora de mRNA. SEQ ID NO: 33 - Sequência de aminoácido da acil redutase graxa de H. subflexa SEQ ID NO: 34 - Sequência de nucleotídeo da S. cerevisiae otimizada no códon da acil redutase graxa de H. subflexa com peptídeo de sinal trocado para HDEL; sequência codificadora de mRNA SEQ ID NO: 35 - Sequência de aminoácido da acil redutase graxa de H. subflexa com peptídeo de sinal trocado para HDEL SEQ ID NO: 36 - Sequência de nucleotídeo de Y. lipolitica otimizada no códon de Δ9 dessaturase de Drosophila melanogaster Dmd9 SEQ ID NO: 37 - Sequência de nucleotídeo de Y. lipolitica otimizada no códon da tioesterase de Cuphea hookeriana ChFatB3 SEQ ID NO: 38 - Sequência de aminoácido da tioesterase de Cuphea hookeriana ChFatB3 SEQ ID NO: 39 - Sequência de nucleotídeo de Y. lipolitica otimizada no códon da tioesterase de Cinnamomum camphora CcFatB1 SEQ ID NO: 40 - Sequência de aminoácido da tioesterase de Cinnamomum camphora CcFatB1 SEQ ID NO: 41 - Sequência de nucleotídeo de Y. lipolitica otimizada no códon da tioesterase de Escherichia coli TesA, sem a sequência líder, denominada TesA(LL) SEQ ID NO: 42 - Sequência de proteína da tioesterase de Escherichia coli TesA, sem a sequência líder, denominada TesA(LL) SEQ ID NO: 43 - Sequência de nucleotídeo de Y. lipolitica otimizada no códon da acil redutase graxa de H. armigera Har_FAR SEQ ID NO: 44 - Sequência de nucleotídeo de Y. lipolitica otimizada no códon da acil redutase graxa de Bicyclus anynana Ban-wFAR2 SEQ ID NO: 45 - Sequência de proteína da acil redutase graxa de Bicyclus anynana Ban-wFAR2 SEQ ID NO: 46 - PR-1852 (PTDH3_fw) SEQ ID NO: 47 PR-1853 (PTDH3_rv) SEQ ID NO: 48 PR-1565 (PTEF1) SEQ ID NO: 49 PR-8332 (Har_FAR_U1_fw) SEQ ID NO: 50 PR-10739 (Har_FAR_HDEL_U1_rev) SEQ ID NO: 51 PR-14318 (Phd9_U2_fw) SEQ ID NO: 52 PR-14276 (Phd9_U2_rev) SEQ ID NO: 53 PR-14319 (RCd9_U2_fw) SEQ ID NO: 54 PR-14278 (RCd9_U2_rev) SEQ ID NO: 55 PR-14320 (Atf1_U2_fw) SEQ ID NO: 56 PR-14321 (Atf1_U2_rev) SEQ ID NO: 57 PR-15974 (Dmd9_U1_fw) SEQ ID NO: 58 PR-15975 (Dmd9_U1_rev) SEQ ID NO: 59 PR-15976 (attB1_Dmd9_F) SEQ ID NO: 60 PR-15977 (attB2_Dmd9_R) SEQ ID NO: 61 PR-15978 (attB1_Phd9_F) SEQ ID NO: 62 PR-15979 (attB2_Phd9_R) SEQ ID NO: 63 PR-15980 (attB1_Rcd9_F) SEQ ID NO: 64 PR-15981 (attB1_Rcd9_R) SEQ ID NO: 65 Δ11 dessaturase de Choristoneura rosaceana. SEQ ID NO: 66 - Δ11 dessaturase de Choristoneura parallela SEQ ID NO: 67 - Sequência de nucleotídeo de Y. lipolitica otimizada no códon de Amyelois transitella Δ11 dessaturase SEQ ID NO: 68 - Δ11 dessaturase de Amyelois transitella SEQ ID NO: 69 - Sequência de nucleotídeo de Y. lipolitica otimizada no códon da acil redutase graxa de Helicoverpa armigera SEQ ID NO: 70 - Sequência de nucleotídeo de S. cerevisiae otimizada no códon da acil redutase graxa de Heliothis subflexa SEQ ID NO: 71: Sequência FAS2 (tipo selvagem) SEQ ID NO: 72: Sequência de LIP2 de Yarrowia lipolitica. SEQ ID NO: 73: Sequência de LIP7 de Y. lipolitica SEQ ID NO: 74: Sequência de LIP8 de Y. lipolitica
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Itens
[00232] 1. Uma célula de levedura capaz de produzir um álcool graxo dessaturado e opcionalmente um acetato de álcool graxo dessaturado, a dita célula de levedura expressando: i) pelo menos uma dessaturase heteróloga capaz de introduzir pelo menos uma ligação dupla em uma acil-CoA graxa tendo um comprimento de cadeia carbônica de 14; e ii) pelo menos uma acil-CoA graxa redutase heteróloga (FAR), capaz de converter pelo menos parte da dita acil-CoA graxa dessaturada para um álcool graxo dessaturado; e iii) opcionalmente uma acetiltransferase capaz de converter pelo menos parte do dito álcool graxo dessaturado para um acetato de álcool graxo dessaturado; em que a dessaturase tem uma especificidade mais alta para a tetradecanoil-CoA do que para a hexadecanoil-CoA e/ou em que a acil-CoA graxa redutase tem uma especificidade mais alta para a tetradecanoil-CoA dessaturada do que para a hexadecanoil-CoA dessaturada.
[00233] 2. A célula de levedura de acordo com o item 1, em que a pelo menos uma dessaturase heteróloga é selecionada a partir do grupo que consiste em uma Δ3 dessaturase, uma Δ5 dessaturase, uma Δ6 dessaturase, uma Δ7 dessaturase, uma Δ8 dessaturase, uma Δ9 dessaturase, uma Δ10 dessaturase, uma Δ11 dessaturase, uma Δ12 dessaturase e uma Δ13 dessaturase.
[00234] 3. A célula de levedura de acordo com qualquer um dos itens precedentes, em que a dessaturase é capaz de introduzir pelo menos uma ligação dupla na posição 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou 13.
[00235] 4. A célula de levedura de acordo com qualquer um dos itens precedentes, em que a dessaturase é derivada de um organismo selecionado dentre Pelargonium hortorum, Ricinus communis, Drosophila melanogaster, Spodoptera litura e Tribolium castaneum, preferivelmente a dessaturase é derivada de Drosophila melanogaster.
[00236] 5. A célula de levedura de acordo com qualquer um dos itens precedentes, em que a pelo menos uma dessaturase heteróloga é selecionada a partir do grupo que consiste em: i) uma Δ9 dessaturase tendo pelo menos 60% de homologia com a Δ9 dessaturase de Pelargonium hortorum como apresentada na SEQ ID NO: 2; ii) uma Δ9 dessaturase tendo pelo menos 60% de homologia com a Δ9 dessaturase de Ricinus communis como apresentada na SEQ ID NO: 4; iii) uma Δ9 dessaturase tendo pelo menos 60% de homologia com a Δ9 dessaturase de Drosophila melanogaster como apresentada na SEQ ID NO: 10; iv) uma Δ9 dessaturase tendo pelo menos 60% de homologia com a Δ9 dessaturase de Spodoptera litura como apresentada na SEQ ID NO: 12; v) uma Δ9 dessaturase tendo pelo menos 60% de homologia com a Δ9 dessaturase de Chauliognathus lugubris como apresentada na SEQ ID NO: 14; vi) uma dessaturase tendo pelo menos 60% de homologia com a dessaturase de Tribolium castaneum como apresentada na SEQ ID NO: 16; e vii) uma dessaturase tendo pelo menos 60% de homologia com a dessaturase de Tribolium castaneum como apresentada na SEQ ID NO: 18; viii) uma Δ11 dessaturase tendo pelo menos 60% de homologia com a dessaturase de Choristoneura rosaceana como apresentada na SEQ ID NO: 65; ix) uma Δ11 dessaturase tendo pelo menos 60% de homologia com a dessaturase de Choristoneura parallela como apresentada na SEQ ID NO: 66, preferivelmente a dessaturase é uma Δ9 dessaturase tendo pelo menos 60% de homologia com a Δ9 dessaturase de Drosophila melanogaster como apresentada na SEQ ID NO: 10 ou uma Δ9 dessaturase tendo pelo menos 60% de homologia com a Δ9 dessaturase de Spodoptera litura como apresentada na SEQ ID NO: 12.
[00237] 6. A célula de levedura de acordo com qualquer um dos itens precedentes, em que a pelo menos uma dessaturase heteróloga é selecionada a partir do grupo que consiste em: i) uma Δ9 dessaturase tendo pelo menos 60% de homologia com a Δ9 dessaturase de Drosophila melanogaster como apresentada na SEQ ID NO: 10; ii) uma Δ9 dessaturase tendo pelo menos 60% de homologia com a Δ9 dessaturase de Spodoptera litura como apresentada na SEQ ID NO: 12; iii) uma Δ9 dessaturase tendo pelo menos 60% de homologia com a Δ9 dessaturase de Chauliognathus lugubris como apresentada na SEQ ID NO: 14; iv) uma dessaturase tendo pelo menos 60% de homologia com a dessaturase de Tribolium castaneum como apresentada na SEQ ID NO: 16; e v) uma dessaturase tendo pelo menos 60% de homologia com a dessaturase de Tribolium castaneum como apresentada na SEQ ID NO: 18; vi) uma Δ11 dessaturase tendo pelo menos 60% de homologia com a dessaturase de Choristoneura rosaceana como apresentada na SEQ ID NO: 65; vii) uma Δ11 dessaturase tendo pelo menos 60% de homologia com a dessaturase de Choristoneura parallela como apresentada na SEQ ID NO: 66.
[00238] 7. A célula de levedura de acordo com qualquer um dos itens precedentes, em que a acil-CoA graxa redutase (FAR) é selecionada dentre: i) uma FAR tendo pelo menos 80% de homologia com a FAR de Helicoverpa armigera como apresentada na SEQ ID NO: 25 ou SEQ ID NO: 27; ii) uma FAR tendo pelo menos 80% de homologia com a FAR de Helicoverpa assulta como apresentada na SEQ ID NO: 29 ou SEQ ID NO: 31; iii) uma FAR tendo pelo menos 80% de homologia com a FAR de Heliothis subflexa como apresentada na SEQ ID NO: 33 ou SEQ ID NO: 35; e iv) uma FAR tendo pelo menos 80% de homologia com a FAR de Bicyclus anynana como apresentada na SEQ ID NO: 45, preferivelmente a FAR é uma FAR tendo pelo menos 80% de homologia com a FAR de Helicoverpa armigera como apresentada na SEQ ID NO: 25 ou SEQ ID NO: 27.
[00239] 8. A célula de levedura de acordo com qualquer um dos itens precedentes, em que a acetiltransferase é uma acetiltransferase heteróloga expressa a partir da dita célula de levedura ou uma acetiltransferase nativa superexpressa a partir da dita célula de levedura.
[00240] 9. A célula de levedura de acordo com qualquer um dos itens precedentes, em que a acetiltransferase tem pelo menos 75% de homologia com a acetiltransferase Atf1 de Saccharomyces cerevisiae como apresentada na SEQ ID NO: 21.
[00241] 10. A célula de levedura de acordo com qualquer um dos itens precedentes, em que a levedura é de um gênero selecionado dentre Saccharomyces, Pichia, Yarrowia, Kluyveromyces, Candida, Rhodotorula, Rhodosporidium, Cryptococcus, Trichosporon e Lipomyces, preferivelmente o gênero é Saccharomyces ou Yarrowia, o mais preferivelmente o gênero é Yarrowia.
[00242] 11. A célula de levedura de acordo com qualquer um dos itens precedentes, caracterizado pelo fato de que a levedura é de uma espécie selecionada dentre Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Kluyveromyces marxianus, Cryptococcus albidus, Lipomyces lipofera, Lipomyces starkeyi, Rhodosporidium toruloides, Rhodotorula glutinis, Trichosporon pullulan e Yarrowia lipolitica, preferivelmente a célula de levedura é uma célula de Saccharomyces cerevisiae ou uma célula de Yarrowia lipolitica, mais preferivelmente a célula de levedura é uma célula de Yarrowia lipolitica.
[00243] 12. A célula de levedura de acordo com qualquer um dos itens precedentes, em que a célula: i) expressa uma Δ9 dessaturase idêntica à ou tendo pelo menos 60% de homologia com a Δ9 dessaturase de Drosophila melanogaster como apresentada na SEQ ID NO: 10; e ii) expressa uma acil-CoA graxa redutase idêntica à ou tendo pelo menos 80% de homologia com a acil-CoA graxa redutase de Helicoverpa armigera como apresentada na SEQ ID NO: 25; e iii) expressa ou superexpressa uma acetiltransferase idêntica à ou tendo pelo menos 75% de homologia com a acetiltransferase de Saccharomyces cerevisiae como apresentada na SEQ ID NO: 21.
[00244] 13. A célula de levedura de acordo com qualquer um dos itens precedentes, caracterizado pelo fato de que a acetiltransferase é superexpressa comparada a uma célula do tipo selvagem de levedura.
[00245] 14. A célula de levedura de qualquer um dos itens precedentes, em que os genes codificando a dessaturase, a acil-CoA graxa redutase, ou a acetiltransferase estão compreendidos dentro do genoma da dita célula de levedura ou dentro de um ou mais vetores compreendidos dentro da dita célula de levedura.
[00246] 15. A célula de levedura de qualquer um dos itens precedentes, em que a célula de levedura expressa ou superexpressa ainda uma tioesterase.
[00247] 16. A célula de levedura de qualquer um dos itens precedentes,em que a tioesterase tem pelo menos 60% de homologia com a tioesterase de Cuphea palustris como apresentada na SEQ ID NO: 23, com a tioesterase de Cuphea hookeriana como apresentada na SEQ ID NO: 38, com a tioesterase de Cinnamomum camphora como apresentada na SEQ ID NO: 40, ou com a tioesterase de Escherichia coli como apresentada na SEQ ID NO: 42, preferivelmente a tioesterase tem pelo menos 60% de homologia com a tioesterase de Cinnamomum camphora como apresentada na SEQ ID NO: 40, ou com a tioesterase de Escherichia coli como apresentada na SEQ ID NO: 42.
[00248] 17. A célula de levedura de qualquer um dos itens precedentes, em que a célula de levedura expressa ainda uma variante da acila graxa sintase tendo um domínio modificado da cetona sintase, por meio do qual a variante preferivelmente liga ácido graxos mais curtos.
[00249] 18. A célula de levedura de qualquer um dos itens precedentes,a dita célula de levedura tendo ainda uma mutação que resulta na perda parcial ou total de atividade de uma ou mais lipases.
[00250] 19. A célula de levedura de acordo com o item 18, em que a uma ou mais lipases tem pelo menos 60% de homologia com a lipase 2 de Yarrowia lipolitica como apresentada na SEQ ID NO: 72, lipase 7 de Yarrowia lipolitica como apresentada na SEQ ID NO: 73, ou lipase 8 de Yarrowia lipolitica como apresentada na SEQ ID NO: 74.
[00251] 20. A célula de levedura de acordo com qualquer um dos itens de 18 a 19, caracterizado pelo fato de que a célula de levedura é Yarrowia lipolityca e a uma ou mais lipases são selecionadas a partir do grupo que consiste em lipase 2 como apresentada na SEQ ID NO: 72, lipase 7 como apresentada na SEQ ID NO: 73 e lipase 8 como apresentada na SEQ ID NO: 74.
[00252] 21. A célula de levedura de qualquer um dos itens precedentes, em que pelo menos um dos genes codificando a dessaturase, a acil-CoA graxa redutase, a acetiltransferase ou a tioesterase está presente em alto número de cópia.
[00253] 22. A célula de levedura de qualquer um dos itens precedentes,em que pelo menos um dos genes codificando a dessaturase, a acil-CoA graxa redutase, a acetiltransferase ou a tioesterase está sob o controle de um promotor indutível.
[00254] 23. A célula de levedura de qualquer um dos itens precedentes,em que pelo menos um dos genes codificando a dessaturase, a acil-CoA graxa redutase, a acetiltransferase ou a tioesterase é otimizada no códon para a dita célula de levedura.
[00255] 24. Método para produção de um ácido graxo dessaturado e opcionalmente um acetato de álcool graxo dessaturado em uma célula de levedura, o dito método compreendendo as etapas de prover uma célula de levedura e incubar a dita célula de levedura em um meio, em que a célula de levedura expressa: i) pelo menos uma dessaturase heteróloga capaz de introduzir pelo menos uma ligação dupla em uma acil-CoA graxa tendo um comprimento de cadeia carbônica de 14, convertendo deste modo pelo menos parte da dita acil-CoA graxa para uma acil-CoA graxa dessaturada; e ii) pelo menos uma acil-CoA graxa redutase heteróloga, capaz de converter pelo menos parte da dita acil-CoA graxa dessaturada para um álcool graxo dessaturado, produzindo deste modo o dito álcool graxo dessaturado; e iii) opcionalmente uma acetiltransferase capaz de converter pelo menos parte do dito álcool graxo dessaturado para um acetato de álcool graxo dessaturado, produzindo deste modo o dito acetato de álcool graxo dessaturado; em que a dessaturase tem uma especificidade mais alta para a tetradecanoil-CoA do que para a hexadecanoil-CoA e/ou em que a acil-CoA graxa redutase tem uma especificidade mais alta para a tetradecanoil-CoA dessaturada do que para a hexadecanoil-CoA dessaturada.
[00256] 25. O método de acordo com o item 24, em que a célula de levedura é como definida em qualquer um dos itens de 1 a 23.
[00257] 26. O método de acordo com qualquer um dos itens de 24 a 25, em que a razão de tetradecanoil-CoA dessaturada para hexadecanoil-CoA dessaturada é de pelo menos 0,1, tal como pelo menos 0,2, tal como pelo menos 0,3, tal como pelo menos 0,4, tal como pelo menos 0,5, tal como pelo menos 0,75, tal como pelo menos 1, tal como pelo menos 2, tal como pelo menos 3, tal como pelo menos 4, tal como pelo menos 5, tal como pelo menos 6, tal como pelo menos 7, tal como pelo menos 8, tal como pelo menos 9, tal como pelo menos 10, tal como pelo menos 12,5, tal como pelo menos 15.
[00258] 27. O método de acordo com qualquer um dos itens de 25 a 26,caracterizado pelo fato de que o método produz álcoois graxos dessaturados com um título de pelo menos 1 mg/L, tal como pelo menos 1,5 mg/L, tal como pelo menos 5 mg/L, tal como pelo menos 10 mg/L, tal como pelo menos 25 mg/L, tal como pelo menos 50 mg/L, tal como pelo menos 100 mg/L, tal como pelo menos 250 mg/L, tal como pelo menos 500 mg/L, tal como pelo menos 750 mg/L, tal como pelo menos 1 g/L, tal como pelo menos 2 g/L, tal como pelo menos 3 g/L, tal como pelo menos 4 g/L, tal como pelo menos 5 g/L, ou mais.
[00259] 28. O método de acordo com qualquer um dos itens de 25 a 27, em que o método produz um álcool graxo dessaturado tendo um comprimento de cadeia de 14 com um título de pelo menos 1 mg/L, tal como pelo menos 1,5 mg/L, tal como pelo menos 5 mg/L, tal como pelo menos 10 mg/L, tal como pelo menos 25 mg/L, tal como pelo menos 50 mg/L, tal como pelo menos 100 mg/L, tal como pelo menos 250 mg/L, tal como pelo menos 500 mg/L, tal como pelo menos 750 mg/L, tal como pelo menos 1 g/L, tal como pelo menos 2 g/L, tal como pelo menos 3 g/L, tal como pelo menos 4 g/L, tal como pelo menos 5 g/L, ou mais.
[00260] 29. O método de acordo com qualquer um dos itens de 25 a 28, em que o método produz acetatos de álcool graxos dessaturados com um título de pelo menos 1 mg/L, tal como pelo menos 1,5 mg/L, tal como pelo menos 5 mg/L, tal como pelo menos 10 mg/L, tal como pelo menos 25 mg/L, tal como pelo menos 50 mg/L, tal como pelo menos 100 mg/L, tal como pelo menos 250 mg/L, tal como pelo menos 500 mg/L, tal como pelo menos 750 mg/L, tal como pelo menos 1 g/L, tal como pelo menos 2 g/L, tal como pelo menos 3 g/L, tal como pelo menos 4 g/L, tal como pelo menos 5 g/L, ou mais.
[00261] 30. O método de acordo com qualquer um dos itens de 25 a 29,em que o método produz um acetato de álcool graxo dessaturado tendo um comprimento de cadeia de 14 com um título de pelo menos 1 mg/L, tal como pelo menos 1,5 mg/L, tal como pelo menos 5 mg/L, tal como pelo menos 10 mg/L, tal como pelo menos 25 mg/L, tal como pelo menos 50 mg/L, tal como pelo menos 100 mg/L, tal como pelo menos 250 mg/L, tal como pelo menos 500 mg/L, tal como pelo menos 750 mg/L, tal como pelo menos 1 g/L, tal como pelo menos 2 g/L, tal como pelo menos 3 g/L, tal como pelo menos 4 g/L, tal como pelo menos 5 g/L, ou mais.
[00262] 31. O método de acordo com qualquer um dos itens de 25 a 30,em que os acetatos de álcool graxos dessaturados compreendem pelo menos 1% de um acetato de álcool graxo dessaturado tendo um comprimento de cadeia de 14, tal como pelo menos 1,5%, tal como pelo menos 2%, tal como pelo menos 2,5%, tal como pelo menos 3%, tal como pelo menos 3,5%, tal como pelo menos 4%, tal como pelo menos 4,5%, tal como pelo menos 5%, tal como pelo menos 7,5%, tal como pelo menos 10%.
[00263] 32. O método de acordo com qualquer um dos itens de 25 a 31, em que a célula de levedura é capaz de expressar ainda uma tioesterase.
[00264] 33. O método de acordo com qualquer um dos itens de 25 a 32, em que a tioesterase tem pelo menos 60% de homologia com a tioesterase de Cuphea palustris como apresentada na SEQ ID NO: 23, com a tioesterase de Cuphea hookeriana como apresentada na SEQ ID NO: 38, com a tioesterase de Cinnamomum camphora como apresentada na SEQ ID NO: 40, ou com a tioesterase de Escherichia coli como apresentada na SEQ ID NO: 42.
[00265] 34. O método de acordo com qualquer um dos itens de 25 a 33,compreendendo ainda a etapa de recuperar o dito álcool graxo dessaturado e/ou acetato de álcool graxo dessaturado.
[00266] 35. O método de acordo com qualquer um dos itens de 25 a 34, compreendendo ainda a etapa de formular o álcool graxo dessaturado e/ou acetato de álcool graxo dessaturado recuperados em uma composição de feromônio.
[00267] 36. O método de acordo com qualquer um dos itens de 25 a 35, em que a composição de feromônio compreende ainda um ou mais compostos adicionais tais como um carreador ou substrato líquido ou sólido.
[00268] 37. Uma construção de ácido nucleico para modificar uma célula de levedura, a dita construção compreendendo: i) um primeiro polinucleotídeo codificando pelo menos uma dessaturase heteróloga capaz de introduzir pelo menos uma ligação dupla em uma acil-CoA graxa tendo um comprimento de cadeia carbônica de 14; e ii) um segundo polinucleotídeo codificando pelo menos uma acil-CoA graxa redutase heteróloga (FAR), capaz de converter pelo menos parte da dita acil-CoA graxa dessaturada para um álcool graxo dessaturado; e iii) opcionalmente um terceiro polinucleotídeo codificando uma acetiltransferase capaz de converter pelo menos parte do dito álcool graxo dessaturado para um acetato de álcool graxo dessaturado, em que opcionalmente o primeiro polinucleotídeo, o segundo polinucleotídeo e/ou o terceiro polinucleotídeo estão sob o controle de um promotor.
[00269] 38. Kit de partes compreendendo: a) a célula de levedura de acordo com qualquer um dos itens de 1 a 24 e instruções para o uso; e/ou b) uma construção de ácido nucleico de acordo com o item 37, em que a dita construção é para modificar uma célula de levedura, e c) opcionalmente a célula de levedura a ser modificada.
[00270] 39. Um álcool graxo dessaturado obtenível pelo método de acordo com qualquer um dos itens de 25 a 36.
[00271] 40. Um acetato de álcool graxo dessaturado obtenível pelo método de acordo com qualquer um dos itens de 35 a 36.
[00272] 41. Uso de um álcool graxo dessaturado de acordo com qualquer um dos itens de 1 a 24 ou 39.
[00273] 42. Uso de um acetato de álcool graxo dessaturado de acordo com qualquer um dos itens de 1 a 24 ou 40.

Claims (18)

1. Célula de levedura capaz de produzir um álcool graxo dessaturado e opcionalmente um acetato de álcool graxo dessaturado, em que a célula de levedura é de um gênero selecionado dentre Saccharomyces, Pichia, Yarrowia, Kluyveromyces, Candida, Rhodotorula, Rhodosporidium, Cryptococcus, Trichosporon e Lipomyces, de preferência o gênero é Saccharomyces ou Yarrowia, a referida célula de levedura expressando: i) pelo menos uma dessaturase heteróloga capaz de introduzir pelo menos uma ligação dupla em uma acil-CoA graxa tendo um comprimento de cadeia carbônica de 14, em que a dita dessaturase é selecionada do grupo que consiste em uma Δ9 dessaturase e uma Δ11 dessaturase; e ii) pelo menos uma acil-CoA graxa redutase heteróloga (FAR), capaz de converter pelo menos parte da dita acil-CoA graxa dessaturada para um álcool graxo dessaturado; e iii) opcionalmente uma acetiltransferase capaz de converter pelo menos parte do dito álcool graxo dessaturado para um acetato de álcool graxo dessaturado; caracterizado pelo fato de que a dessaturase é selecionada a partir do grupo que consiste em: i) a Δ9 dessaturase de Drosophila melanogaster como apresentada na SEQ ID NO: 10; ii) a Δ9 dessaturase de Spodoptera litura como apresentada na SEQ ID NO: 12; iii) a Δ11 dessaturase de Choristoneura parallela como apresentada na SEQ ID NO: 66; iv) a Δ11 dessaturase de Choristoneura rosaceana como apresentada na SEQ ID NO: 65, opcionalmente em que a acil-CoA graxa redutase tem uma especificidade mais alta para a tetradecanoil-CoA dessaturada do que para a hexadecanoil-CoA dessaturada.
2. Célula de levedura de acordo com a reivindicação precedente, caracterizada pelo fato de que a dessaturase é derivada de Drosophila melanogaster.
3. Célula de levedura de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que a acil-CoA graxa redutase (FAR) é selecionada dentre: i) a FAR de Helicoverpa armigera como apresentada na SEQ ID NO: 25 ou SEQ ID NO: 27; ii) a FAR de Helicoverpa assulta como apresentada na SEQ ID NO: 29 ou SEQ ID NO: 31; iii) a FAR de Heliothis subflexa como apresentada na SEQ ID NO: 33 ou SEQ ID NO: 35; e iv) a FAR de Bicyclus anynana como apresentada na SEQ ID NO: 45.
4. Célula de levedura de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que a acetiltransferase é uma acetiltransferase heteróloga expressa a partir da dita célula de levedura ou uma acetiltransferase nativa superexpressa a partir da dita célula de levedura, em que a acetiltransferase é Atf1 de Saccharomyces cerevisiae como apresentada na SEQ ID NO: 21.
5. Célula de levedura de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que a levedura é de uma espécie selecionada dentre Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Kluyveromyces marxianus, Cryptococcus albidus, Lipomyces lipofera, Lipomyces starkeyi, Rhodosporidium toruloides, Rhodotorula glutinis, Trichosporon pullulan e Yarrowia lipolitica, mais preferivelmente a célula de levedura é uma célula de Yarrowia lipolitica.
6. Célula de levedura de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que a célula de levedura expressa ou superexpressa a tioesterase de Cinnamomum camphora como apresentada na SEQ ID NO: 40, ou a tioesterase de Escherichia coli como apresentada na SEQ ID NO: 42.
7. Célula de levedura de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que a célula de levedura expressa ainda uma variante da acila graxa sintase tendo um domínio da cetona sintase modificada, por meio da qual a célula de levedura sintetiza uma proporção mais alta de ácidos graxos C14 do que uma célula de levedura expressando uma acila graxa sintase nativa nas mesmas condições, em que a variante da acila graxa sintase é uma sintase de ácido graxo que compreende uma mutação em FAS2 como apresentada na SEQ ID NO: 71, preferencialmente em que a mutação em FAS2 é uma mutação na posição 1220, 1217 ou 1226 de FAS2 como apresentada na SEQ ID NO: 71, tal como uma mutação I1220F, uma mutação I1220Y, uma mutação I1220H e/ou uma mutação M1217F, uma mutação M1217W, uma mutação M1217Y ou uma mutação M1217H.
8. Método para produção de um álcool graxo dessaturado e opcionalmente um acetato de álcool graxo dessaturado em uma célula de levedura, o dito método compreendendo as etapas de prover uma célula de levedura e incubar a dita célula de levedura em um meio, em que a célula de levedura é do gênero selecionado dentre Saccharomyces, Pichia, Yarrowia, Kluyveromyces, Candida, Rhodotorula, Rhodosporidium, Cryptococcus, Trichosporon e Lipomyces, de preferência o gênero é Saccharomyces ou Yarrowia, expressando: i) pelo menos uma dessaturase heteróloga capaz de introduzir pelo menos uma ligação dupla em uma acil-CoA graxa tendo um comprimento de cadeia carbônica de 14, em que a dita dessaturase é selecionada do grupo que consiste em uma Δ9 dessaturase e uma Δ11 dessaturase, convertendo deste modo pelo menos parte da dita acil-CoA graxa para uma acil-CoA graxa dessaturada; e ii) pelo menos uma acil-CoA graxa redutase heteróloga, capaz de converter pelo menos parte da dita acil-CoA graxa dessaturada para um álcool graxo dessaturado, produzindo deste modo o dito álcool graxo dessaturado; e iii) opcionalmente uma acetiltransferase capaz de converter pelo menos parte do dito álcool graxo dessaturado para um acetato de álcool graxo dessaturado, produzindo deste modo o dito acetato de álcool graxo dessaturado; caracterizado pelo fato de que a dessaturase é selecionada a partir do grupo que consiste em: i) a Δ9 dessaturase de Drosophila melanogaster como apresentada na SEQ ID NO: 10; ii) a Δ9 dessaturase de Spodoptera litura como apresentada na SEQ ID NO: 12; iii) a Δ11 dessaturase de Choristoneura parallela como apresentada na SEQ ID NO: 66; iv) a Δ11 dessaturase de Choristoneura rosaceana como apresentada na SEQ ID NO: 65, opcionalmente em que a acil-CoA graxa redutase tem uma especificidade mais alta para a tetradecanoil-CoA dessaturada do que para a hexadecanoil-CoA dessaturada.
9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma dessaturase heteróloga é selecionada a partir do grupo que consiste em: i) a Δ9 dessaturase de Drosophila melanogaster conforme estabelecido na SEQ ID NO: 10; ii) a Δ9 dessaturase de Spodoptera litura conforme estabelecido na SEQ ID NO: 12; iii) a Δ11 dessaturase de Choristoneura parallela conforme estabelecido na SEQ ID NO: 66; iv) a Δ11 dessaturase de Choristoneura rosaceana conforme estabelecido na SEQ ID NO: 65.
10. Método de acordo com a reivindicação 8 ou 9, caracterizado pelo fato de que a acil-CoA graxa redutase (FAR) é selecionada dentre: i) a FAR de Helicoverpa armigera como apresentada na SEQ ID NO: 25 ou SEQ ID NO: 27; ii) a FAR de Helicoverpa assulta como apresentada na SEQ ID NO: 29 ou SEQ ID NO: 31; iii) a FAR de Heliothis subflexa como apresentada na SEQ ID NO: 33 ou SEQ ID NO: 35; e iv) a FAR de Bicyclus anynana como apresentada na SEQ ID NO: 45.
11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 10, caracterizado pelo fato de que a acetiltransferase é uma acetiltransferase heteróloga expressa a partir da referida célula de levedura ou uma acetiltransferase nativa superexpressada da referida célula de levedura, em que a acetiltransferase é Atf1 de Saccharomyces cerevisiae conforme estabelecido na SEQ ID NO: 21.
12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 11, caracterizado pelo fato de que a célula de levedura expressa ou superexpressa ainda a tioesterase de Cinnamomum camphora conforme estabelecido na SEQ ID NO: 40, ou a tioesterase de Escherichia coli conforme estabelecido na SEQ ID NO : 42.
13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 12, caracterizado pelo fato de que a célula de levedura expressa ainda uma variante de acil sintase graxa com um domínio de cetona sintetase modificada, em que a célula de levedura sintetiza uma proporção maior de ácidos graxos C14 do que uma célula de levedura que expressa uma acil sintase graxo nativa nas mesmas condições, em que a variante de acil sintase graxo é um ácido graxo sintase compreendendo uma mutação em FAS2 conforme estabelecido na SEQ ID NO: 71, de preferência em que a mutação em FAS2 é uma mutação na posição 1220, 1217 ou 1226 de FAS2 conforme estabelecido na SEQ ID NO: 71, tal como uma mutação I1220F, uma mutação I1220Y, uma mutação I1220H e/ou uma mutação M1217F, uma mutação M1217W, uma mutação M1217Y ou uma mutação M1217H.
14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 13, caracterizado pelo fato de que o método produz um álcool graxo dessaturado tendo um comprimento de cadeia de 14 com um título de pelo menos 1 mg/L.
15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 14, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente a etapa de converter o dito álcool graxo dessaturado em um acetato de álcool graxo dessaturado, em que a conversão é uma conversão química ou em que a célula de levedura expressa adicionlmente uma acetiltransferase capaz de converter o dito álcool graxo dessaturado em um acetato de álcool graxo dessaturado.
16. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 15, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente a etapa de recuperar o álcool graxo dessaturado e/ou o acetato de álcool graxo dessaturado.
17. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 16, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente a etapa de formular o álcool graxo dessaturado recuperado e/ou o acetato de álcool graxo dessaturado em uma composição de feromônio.
18. Kit de partes, caracterizado pelo fato de que compreende: a) a célula de levedura como definida em qualquer uma das reivindicações de 1 a 7 e instruções para o uso; e b) opcionalmente a célula de levedura a ser modificada.
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