JP2019141047A - 生体分子解析方法及び生体分子解析キット - Google Patents

生体分子解析方法及び生体分子解析キット Download PDF

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Abstract

【課題】迅速に、かつ、定量的な生体分子の解析を可能にすることができ、反応性を向上することができる生体分子解析キット及び生体分子解析方法を提供する。【解決手段】試料中に含まれる生体分子を解析する方法であって、複数の微小空間のアレイを有する反応容器に、前記試料と、検出反応試薬と、を含む溶液を送液する試薬送液工程と、前記反応容器に封止液を送液し、前記封止液が複数の前記微小空間を覆うことによって複数の独立した反応室を形成する封止工程と、前記封止工程によって独立した反応室内で等温反応による検出反応を行いシグナルを検出するシグナル検出工程と、を順に行う、生体分子解析方法。【選択図】なし

Description

本発明は、生体分子解析方法及び生体分子解析キットに関する。本願は、２０１４年１月３１日に日本に出願された特願２０１４−０１７９４２号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
生体分子を解析することによって疾患や体質診断を行うことが知られている。たとえば、一塩基多型（Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ：ＳＮＰ）解析による体質診断、体細胞変異解析による抗がん剤の投与判断、ウイルスのタンパク質やＤＮＡの解析による感染症対策などがある。
近時、世界的なヒトゲノム解析により、その約３１億個の塩基対の配列が明らかにされ、ヒトの遺伝子の数が約３〜４万個であることが明らかとなった。ヒトには、個体間で塩基配列の違いが存在し、特定の集団人口の１％以上の頻度で存在する塩基配列の違いを遺伝子多型と呼んでいる。その中でも、ＳＮＰは、種々の疾患と関連性があることが示唆されている。
例えば、ヒトの遺伝子病は、一つの遺伝子中のＳＮＰが病気の原因となると考えられている。また、生活習慣病やガンなどは、複数の遺伝子におけるＳＮＰが影響していると考えられている。したがって、ＳＮＰの解析は、創薬ターゲットの探索または副作用の予見などの医薬品の開発において、極めて有効であると考えられる。このため、ＳＮＰの解析は世界的な巨大プロジェクトとして押し進められている。
薬物の効果や副作用の程度に個人差があることの原因の一つとして、個々人の薬物代謝に関わる酵素群の違いが挙げられる。その違いも、ＳＮＰなど遺伝子上のわずかな違いによることが最近明らかにされつつある。
近年、あらかじめ患者の遺伝子を解析することによって、最適な薬剤を選択し患者に投与する方法が考えられている。さらに、単一遺伝子疾患のみならず多因子疾患についても、遺伝子診断の意義が急速に高まりつつある。また、病原細菌やウイルスを標的とした薬物の効果は、同一種であっても、個体毎に異なることがあり、これらは個体毎の遺伝子の微細な違いによることが多い。このような外来因子である病原細菌やウイルスの遺伝子診断も、今後は検査対象が確実に増加することが予想される。
このように、ポストゲノム時代の医療においては、ヒトや病原微生物の遺伝子の微細な違い、とりわけＳＮＰを解析できることは重要であり、今後もその重要性が増すと予想される。
従来、塩基配列における微細な違い、とりわけＳＮＰを解析する方法が種々検討されている（非特許文献１〜２参照）。実用レベルでの解析を行うためには、低コスト、方法の簡便性、シグナル検出時間の短さ、検出結果の正確さなどの点がいずれも優れていることが要求される。しかしながら、現在までのところ、上記要求をすべて満たす方法は知られていない。
ＳＮＰを解析する場合、目的とする遺伝子断片は試料中にわずかしか含まれていないのが一般的である。この場合、目的とする遺伝子を、何らかの方法によって予め増幅させておくことが必要となる。ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法は、迅速かつ再現性の高い遺伝子増幅法として従来からよく知られている。
一般的に、目的の遺伝子の一塩基の違いを検出するためには、ＰＣＲ法などを使った遺伝子増幅の段階と、増幅させた遺伝子の一塩基の違いを調べる段階との二段階の工程を必要とする（非特許文献３参照）。しかしながら、二段階の工程を必要とする方法は、工程が複数あるため、処理が煩雑となる。さらに、ＰＣＲ法には、温度昇降を行うことが必要であるため、装置が大型化し、耐熱性の反応容器および反応液が蒸発しない工夫が必要となる。
二段階反応を必要としないＳＮＰ検出方法として、インベーダー法がある。インベーダー法はＰＣＲの増幅を必要とせず、等温で反応を進めることができるため、装置が小型化できる。しかし、インベーダー法では、遺伝子の増幅工程を含まないので、シグナル増幅が遅く、検出判定を行うためには数時間の反応時間を要する。インベーダー法は、酵素反応を用いた検出方法である。その中でも、酵素を用いたシグナル増幅において、シグナルの濃度が飽和する時間を短縮する方法として、微小空間内で反応させる方法が考えられる。
微小空間においてインベーダー反応を行うと、１ウェルに含まれる解析対象の分子が１つ以下になるようにでき、解析対象分子が見かけ上濃縮された状態になるため、シグナルが飽和する時間を短縮することができる。また、１ウェルに入る検出分子を１つ以下にしているため、シグナルが得られたウェルをカウントすることで、検出分子の濃度を正確に調べることが可能である。
たとえば特許文献１では、１ｐｌ以下の容積を有する微小空間内で酵素反応を行うことで遺伝子検査が可能であることが示されている。
特開２００４−３０９４０５号公報
Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓｆｏｒ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、１９９６年 Ａｈｍａｄｉａｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、第３２巻、第１１２２〜１１３７頁、２００２年 Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｍｅｔｈｏｄ、第７０巻、第５０、２００７年、７８９〜７９５頁
すなわち、ＳＮＰ解析においてＰＣＲを利用すれば短時間での検出が可能であるが、機器構成が複雑になったり手順が煩雑になる。また、ＰＣＲを利用しない等温反応ではＳＮＰ解析完了までに要する時間が長く反応性が低い。そのため、これらの従来の方法は実用的でない。
本発明は、上記の問題を鑑みてなされたもので、迅速に、かつ、定量的な生体分子の解析を可能にすることができ、反応性を向上することができる生体分子解析キット及び生体分子解析方法を提供することを目的とする。
本発明の第一態様に係る生体分子解析キットは、酵素反応を行うための反応容器を有し、前記反応容器は、容器形状部を有する基体部と、前記容器形状部の少なくとも内面に設けられ、前記酵素反応における解析対象となる試料と前記酵素反応のための試薬との少なくとも一方の吸着率が前記基体部の吸着率よりも低い低吸着構造部と、を有し、前記反応容器内において酵素反応が行われたときに、前記酵素反応によるシグナルを検出するように構成されている。
前記低吸着構造部は、前記試料の吸着率が前記基体部よりも低く、前記基体部が前記反応容器内に露出している場合と比較して、前記シグナル検出におけるバックグラウンドが低くてもよい。
前記低吸着構造部は、前記試薬の吸着率が前記基体部よりも低く、前記基体部が前記反応容器内に露出している場合と比較して、前記シグナル検出におけるシグナル強度が高くてもよい。
前記反応容器は、前記容器形状部の内面において前記吸着率を前記基体部より下げるために前記基体部の表面が改質された改質部をさらに有し、前記容器形状部は、直径５マイクロメートル以下の略円形を有する開口部を有する有底円柱形状であってもよい。
前記反応容器は、前記容器形状部の内面において前記吸着率を前記基体部より下げるために前記基体部に積層された低吸着物質層をさらに有し、前記容器形状部は、直径５マイクロメートル以下の略円形を有する開口部を有する有底円柱形状であってもよい。
本発明の第二態様に係る生体分子解析キットは、解析対象となる試料を供給可能な容器形状部及び前記容器形状部が形成された基体部を有し、酵素反応を行うための反応容器と、前記反応容器に供給可能であって前記酵素反応に使用される試薬と、を有し、前記試薬は、前記試料と前記試薬との少なくとも一方の前記基体部への吸着率を低減するための吸着防止剤を含有し、前記反応容器内において前記酵素反応が行われたときに、前記酵素反応によるシグナルを検出するように構成されている。
前記酵素反応が等温反応であってもよい。
解析対象となる前記試料が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、タンパク質のいずれか１つを含み、解析対象物質がＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、タンパク質のいずれか１つであってもよい。
解析対象物質が核酸であり、前記酵素反応がインベーダー反応であってもよい。
前記試薬は、蛍光、発光、ｐＨ、吸光、電位のいずれか１つによりシグナルを発してもよい。
前記吸着防止剤が界面活性剤であってもよい。
前記界面活性剤が非イオン性界面活性剤であってもよい。
前記非イオン性界面活性剤がＴｗｅｅｎ２０であってもよい。
前記非イオン性界面活性剤がＴｒｉｔｏｎ−１００であってもよい。
前記界面活性剤の濃度が０．０００５％以上５％以下であってもよい。
本発明の第三態様に係る生体分子解析方法は、上記第一態様又は第二態様に係る生体分子解析キットを用いる。
本発明の第四態様に係る生体分子解析キットは、流路を通じて試料を供給可能な容器形状部と、前記容器形状部が形成された基体部と、を有する酵素反応を行うための反応容器と、前記反応容器に供給可能であって前記酵素反応に使用される試薬と、を有し、前記試薬は、前記試薬の表面張力を低減するための界面活性剤を含有し、前記反応容器内において酵素反応が行われたときに、前記酵素反応による蛍光若しくは発色シグナルを検出するように構成されている。
本発明の第五態様に係る生体分子解析方法は、流路及び複数の容器形状部を有する反応容器において、前記流路に試薬を送液し、前記複数のウェルに前記試薬を充填し、前記流路に油性封止液を送液し、前記複数のウェル内の前記試薬を前記油性封止液により封止することにより前記複数のウェルを複数の独立した核酸検出反応容器を形成すること、を有し、前記試薬、及び前記油性封止液のうちいずれか１つに界面活性剤が含まれる。
本発明の第五態様に係る生体分子解析方法は、前記複数のウェルに前記試薬を充填する前に、前記流路を通じて前記複数の容器形状部に洗浄用のバッファーを充填する工程をさらに有していてもよい。
本発明の第六態様に係る生体分子解析方法は、上記第一態様、第二態様、または第四態様に係る生体分子解析キットを用いた生体分子解析方法であって、前記容器形状部に洗浄用のバッファーを供給した後に、前記容器形状部に前記試薬を供給する。
本発明の上記態様によれば、迅速に、かつ、定量的な生体分子の解析を可能にすることができ、反応性を向上することができる生体分子解析方法及び生体分子解析キットを提供できる。
本発明の第一実施形態に係る生体分子解析方法を適用する生体分子解析キットの断面図である。 本発明の第一実施形態に係る生体分子解析方法のフローチャートである。 本発明の第一実施例における蛍光量測定試験の結果を示す蛍光画像図である。 本発明の第一実施例における蛍光強度測定試験の結果を示すグラフである。 本発明の第一実施例における反応時間測定試験の結果を示す表である。 本発明の第二実施形態に係る生体分子解析方法を適用する生体分子解析キットの断面図である。 本発明の第二実施形態に係る生体分子解析方法を適用する生体分子解析キットの断面図である。 本発明の第二実施形態に係る生体分子解析方法を適用する生体分子解析キットの断面図である。 本発明の第二実施形態に係る生体分子解析方法を示すフローチャートである。 本発明の第二実施例におけるウェルを示す顕微鏡写真である。 本発明の第二実施例において、Ｔｗｅｅｎ２０の濃度が０％、加熱時間１０分の条件における蛍光量測定試験の結果を示す蛍光画像図である。 本発明の第二実施例において、Ｔｗｅｅｎ２０の濃度が０．０００５％、加熱時間１０分の条件における蛍光量測定試験の結果を示す蛍光画像図である。 本発明の第二実施例において、Ｔｗｅｅｎ２０の濃度が０．００１％、加熱時間１０分の条件における蛍光量測定試験の結果を示す蛍光画像図である。 本発明の第二実施例において、Ｔｗｅｅｎ２０の濃度が０．００５％、加熱時間１０分の条件における蛍光量測定試験の結果を示す蛍光画像図である。 本発明の第二実施例において、Ｔｗｅｅｎ２０の濃度が０．０５％、加熱時間１０分の条件における蛍光量測定試験の結果を示す蛍光画像図である。 本発明の第二実施例において、Ｔｗｅｅｎ２０の濃度が０．５％、加熱時間１０分の条件における蛍光量測定試験の結果を示す蛍光画像図である。 本発明の第二実施例において、Ｔｗｅｅｎ２０の濃度が５％、加熱時間１０分の条件における蛍光量測定試験の結果を示す蛍光画像図である。 本発明の第二実施例において、Ｔｗｅｅｎ２０の濃度が０．０００５％、加熱時間２０分の条件における蛍光量測定試験の結果を示す蛍光画像図である。 本発明の第二実施例において、Ｔｗｅｅｎ２０の濃度が０．００１％、加熱時間２０分の条件における蛍光量測定試験の結果を示す蛍光画像図である。 本発明の第二実施例において、Ｔｗｅｅｎ２０の濃度が０．００５％、加熱時間２０分の条件における蛍光量測定試験の結果を示す蛍光画像図である。 本発明の第二実施例において、Ｔｗｅｅｎ２０の濃度が０．０５％、加熱時間２０分の条件における蛍光量測定試験の結果を示す蛍光画像図である。 本発明の第二実施例において、Ｔｗｅｅｎ２０の濃度が０．５％、加熱時間２０分の条件における蛍光量測定試験の結果を示す蛍光画像図である。 本発明の第二実施例において、Ｔｗｅｅｎ２０の濃度が５％、加熱時間２０分の条件における蛍光量測定試験の結果を示す蛍光画像図である。 本発明の第二実施例における蛍光強度測定試験の結果を示すグラフである。 本発明の第二実施形態に係る生体分子解析方法の作用効果を説明するための図である。 本発明の第三実施例におけるサンプル１の蛍光量測定試験の結果を示す蛍光画像図である。 本発明の第三実施例におけるサンプル２の蛍光量測定試験の結果を示す蛍光画像図である。 本発明の第三実施例におけるサンプル３の蛍光量測定試験の結果を示す蛍光画像図である。 本発明の第三実施例におけるサンプル４の蛍光量測定試験の結果を示す蛍光画像図である。 本発明の第三実施例におけるサンプル５の蛍光量測定試験の結果を示す蛍光画像図である。 本発明の第三実施例におけるサンプル６の蛍光量測定試験の結果を示す蛍光画像図である。
（第一実施形態）
以下、本発明の第一実施形態に係る生体分子解析キット及び生体分子解析方法を、図１及び図２を参照しながら説明する。
図１は、本実施形態に係る生体分子解析方法を適用可能な生体分子解析キットの断面図である。本実施形態に係る生体分子解析キットでは、解析する生体分子として、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ（以下、ＲＮＡ類と言うことがある。）、タンパク質のいずれかが選ばれる。
図１に示すように、生体分子解析キット１００は、反応容器１０を構成する軟性平板１２及びガラス基板１４と、反応容器１０を密封可能なカバーガラス１３と、を備える。
反応容器１０は、一端が開口された有底円柱形状の微小空間１１（容器形状部）を有するように成形された基体部２と、基体部２の表面に配された低吸着構造部３と、を有する。
ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ（ｐｏｌｙｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘａｎｅ））製の軟性平板１２に対してインプリントにより微小空間１１が作製されることによって、反応容器１０が形成される。
反応容器１０を構成する微小空間１１は、一端に開口部を有する有底円柱形状の空間である。微小空間１１は、例えば、５μｍの直径Ｌ１、及び５μｍの深さＬ２を有する。たとえば、微小空間１１の容量は約１００フェムトリットル（ｆｌ）である。反応容器１０には、複数の微小空間１１のアレイが形成されている。すなわち、微小空間１１は、反応容器１０において整列配置されている。
たとえば、微小空間１１は、軟性平板１２において縦横５ｍｍの長方形を有する表面に対して、その各辺に沿った格子状に配列される。各微小空間１１の間の隙間の大きさは、各微小空間１１において独立してシグナル検出ができる分解能に応じて設定される。
微小空間１１の容積は適宜設定されてよいが、微小空間１１の容積が小さい方がシグナル検出可能となるまでの反応時間を短縮可能である。一例として、微小空間１１の容積は、１００ピコリットル（ｐｌ）またはそれ以下である。
具体的には、シグナルを飽和させて十分なシグナルを発生させるのにかかる時間を短縮する目的がある場合には、解析対象の分子が１ウェルに１つ以下となる液量に基づいて、微小空間１１の容積が設定される。
軟性平板１２は、たとえばガラス基板１４上に形成される。ガラス基板１４の厚さは、軟性平板１２を材料としてインプリントによって複数の微小空間１１を形成する過程で十分な強度を有する点を考慮して適宜設定される。
本実施形態において、低吸着構造部３は、たとえば以下の構成を有する。
（構成例１）
低吸着構造部３は、基体部２の表面のうち反応容器１０の微小空間１１の内面に位置する領域が疎水性を有する。たとえば、低吸着構造部３は、基体部２の表面が疎水性となるように改質することで形成される改質部４を有する。
（構成例２）
低吸着構造部３は、基体部２の表面のうち反応容器１０の内面に位置する領域に低吸着物質層４Ａを有する。低吸着物質層４Ａは、本実施形態の生体分子解析キット１００を用いた解析の対象となる試料あるいはその解析試薬の吸着率が低い材料から形成される。たとえば、低吸着物質層４Ａは、疎水性の被膜である。
また、低吸着物質層４Ａの他の例として、蛍光物質が透過不能な分子構造を有する高分子被膜を挙げることができる。この高分子被膜は、上記のＰＤＭＳと比較して密な分子構造を有することが好ましく、蛍光物質の透過を抑制することによってシグナル強度の低下を防止する効果を奏する。なお、ＰＤＭＳ以外に対しても、基体部２の材料となる物質の分子構造に基づいて、試薬の透過を防止可能な分子構造を有する高分子被膜が選択されてもよい。これらの高分子被膜はシグナル強度の低下を抑制する。
なお、低吸着構造部３における高分子被膜は、蛍光物質の透過を抑制する被膜に限られず、酵素反応に関わる物質の透過を抑制する被膜が、使用される試薬に応じて適宜選択されてよい。
次に、本実施形態に係る生体分子解析キット１００に好適に適用可能な試薬の組成について説明する。
本実施形態では、各試薬に吸着防止剤が含まれていることで、生体分子解析キット１００の反応容器１０の内面に対して試薬の構成成分が吸着されるのを防止することができる。
吸着防止剤の組成は、たとえば、界面活性剤、リン酸脂質、その他の高分子化合物のうちの少なくとも１種を含んだ組成であり、任意の材料を混合して用いても良い。例を挙げると、界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤が挙げられる。非イオン性界面活性剤としては、Ｔｗｅｅｎやｇｌｙｃｅｒоｌ、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００等が挙げられる。また、高分子化合物としては、Ｐоｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃоｌ（ＰＥＧ），ＤＮＡ，蛋白質が挙げられる。
また、２種以上の材料が混合された吸着防止剤として、例えば、リン酸脂質とＰＥＧとを混合した吸着防止剤が挙げられる。
界面活性剤として非イオン性界面活性剤を用いる場合、試薬に含まれる非イオン性界面活性剤の濃度は５％以下であることが好ましい。Ｔｗｅｅｎ２０を用いる場合、試薬に含まれるＴｗｅｅｎ２０の濃度は０．０００５％以上５％以下の範囲であることが好ましく、０．００１％以上０．５％以下の範囲であることが特に好ましい。Ｔｗｅｅｎ２０の濃度が０．０００５％以上であると、複数の微小空間１１における反応を独立して検出することができ、微小空間１１の蛍光を正しく計測できる。Ｔｗｅｅｎ２０の濃度が５％以下であると、十分な酵素反応が得られる。
これらの吸着防止剤は、反応容器１０における微小空間１１の内面に吸着される物質でも構わない。吸着防止剤が含まれた試薬が反応容器１０内に供給されることにより、吸着防止剤が反応容器１０の内面に吸着される。その結果、反応容器１０の内面は、吸着防止剤が含まれていない場合と比較して、酵素反応に用いられる酵素、解析対象となる核酸やタンパク質、及びシグナル検出に利用される標識物質等が吸着されにくい状態となる。
また、微小空間１１にオイルを入れる場合、オイルに上記の吸着防止剤を入れて用いても良い。
酵素反応に用いられる酵素、解析対象となる核酸やタンパク質、及びシグナル検出に利用される標識物質等のうちの少なくとも１つが最初に反応容器１０の内部に供給される前から、シグナル検出が終了するまでの間に反応容器１０の内部に接する試薬の少なくともいずれか１つに吸着防止剤が含まれていることが好ましい。たとえば、吸着防止剤は、試薬を所定濃度に希釈するための緩衝液等の溶媒に混合されていてもよい。
酵素反応に用いられる酵素、解析対象となる核酸やタンパク質、及びシグナル検出に利用される標識物質等のうちの少なくとも１つが最初に反応容器１０の内部に供給される前から、シグナル検出が終了するまでの間に反応容器１０の内部に接する試薬のすべてに吸着剤が含まれていても良い。
なお、吸着防止剤は、酵素反応やシグナル増幅反応を阻害しない物質であることが好ましい。
次に、本実施形態に係る生体分子解析キット１００を用いた生体分子解析方法について説明する。図２は、本実施形態に係る生体分子解析方法を示すフローチャートである。
まず、反応容器１０の微小空間１１に、解析対象となる物質（本実施形態ではたとえばＤＮＡ）を含んだ試薬が滴下される（図２に示すステップＳ１０１）。具体的には、本実施形態において滴下される試薬は、インベーダー反応試薬（１μＭ アレルプローブ、０．４μＭ インベーダーオリゴ、１μＭ ＦＡＭ標識アーム、２０ｍＭ ＭＯＰＳ ｐＨ７．５、１５ｍＭ ＮａＣｌ、６．２５ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０Ｕ／μＬ クリベース）及びＤＮＡを含んでいる。
反応容器１０の微小空間１１に滴下される試薬の液量は、微小空間１１の数に応じて適宜設定されてよい。また、反応容器１０の微小空間１１に滴下される試薬の液量及びその濃度は、１つの微小空間１１に１つのＤＮＡが入るように調整される。たとえば、本実施形態では、反応容器１０の微小空間１１に滴下される試薬の液量は、全体で０．５μＬであり、０．５μＬの液体が複数の微小空間１１に配分される。
続いて、反応容器１０の微小空間１１がカバーガラス１３によって覆われる（図２に示すステップＳ１０２）。これにより、各微小空間１１は、インベーダー反応試薬及びＤＮＡが封入された独立した反応室となる。
そして、インベーダー反応試薬及びＤＮＡが微小空間１１に封入された反応容器１０が、例えば、６２℃のオーブンにてインキュベートされる（図２に示すステップＳ１０３）。このインキュベートによって、インベーダー反応において等温で行われるシグナル増幅が好適に進行する。
続いて、インベーダー反応試薬及びＤＮＡが各微小空間１１に封入された反応容器１０が、あらかじめ定められた時間の後に取り出され、蛍光を有するウェル数およびその蛍光量が計測される（図２に示すステップＳ１０４）。
なお、本実施形態において、蛍光の検出以外に、可視光の発光、発色、ｐＨの変化、電位変化などをシグナルとして検出する検出系を適用してもよい。また、タンパク質を解析するために本実施形態の構成を適用することも可能である。
（第二実施形態）
以下、本発明の第二実施形態に係る生体分子解析キット及び生体分子解析方法を、図６を参照しながら説明する。本実施形態に係る生体分子解析キット１００Ａは、核酸定量用アレイデバイス２０と試薬と油性封止液とを含む。
図６は本実施形態に係る核酸定量用アレイデバイス２０の断面図である。本実施形態に係る生体分子解析キットでは、解析する生体分子として、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ（以下、ＲＮＡ類と言うことがある。）、及びタンパク質のいずれかが選ばれる。
図６に示すように、核酸定量用アレイデバイス２０は、反応容器３０と、カバー部２７と、注入口部（不図示）と、排出口部（不図示）と、を備える。反応容器３０は、基体部２３と流路３１とを有する。基体部２３には、複数のウェル（容器形状部）２６と、基板２４と、微小孔アレイ層２５と、が形成される。
微小孔アレイは、基板２４に直接形成されていてもよいし、微小孔アレイが形成された部材が基板２４に、接着、溶着等の手段で固定して設けられてもよい。
基板２４は、実質的に透明な材料からなる板状部材である。基板２４の材質は、たとえば樹脂やガラスである。具体的には、基板２４は、ポリスチレンやポリプロピレンから形成されていてもよい。基板２４は、核酸定量用アレイデバイス２０を搬送する装置や作業者の手作業による取扱い時に破損しない程度の剛性を持ったものであればよい。
微小孔アレイ層２５は、複数の貫通孔２５ａが並べて形成された層である。微小孔アレイ層２５の層厚は３μｍで、微小孔アレイ層２５とカバー部２７との間には１００μｍの間隔が空けられている。貫通孔２５ａは、一端に開口部を有する有底円柱形状の空間である。貫通孔２５ａは、直径が５μｍ、中心線方向の長さが３μｍの円柱形状である）。たとえば、貫通孔２５ａの容積は約６０フェムトリットル（ｆｌ）である。
各貫通孔２５ａの容積は適宜設定されてよいが、貫通孔２５ａの容積が小さい方がシグナル検出可能となるまでの反応時間を短縮可能である。
一例としては、各貫通孔２５ａの容積は、１００ピコリットルまたはそれ以下である。
なお、本実施形態において、蛍光の検出以外に、可視光の発光、発色、ｐＨの変化、電位変化などをシグナルとして検出する検出系を適用してもよい。また、タンパク質を解析するために本実施形態の構成を適用することも可能である。
各貫通孔２５ａ同士の中心線間の距離（ピッチ）は、各貫通孔２５ａの直径よりも大きければよい。
各貫通孔２５ａの間隔（隙間）の大きさは、各貫通孔２５ａにおいて独立してシグナル検出ができる分解能に応じて設定される。
各貫通孔２５ａは微小孔アレイ層２５に対して三角格子状をなして配列されている。
なお、各貫通孔２５ａの配列のされ方は特に限定されない。微小孔アレイ層２５に形成された貫通孔２５ａと、基板２４の表面２４ａとによって、基板２４を底面部２６ａとする有底筒状の微小なウェル２６（容器形状部）が基体部２３には形成されている。
具体的には、シグナルを飽和させて十分なシグナルを発生させるのにかかる時間を短縮する目的がある場合には、解析対象の分子が１ウェルに１つ以下となる液量に基づいて、ウェル２６の容積が設定される。
微小孔アレイ層２５の材質は、樹脂やガラス等であってよい。微小孔アレイ層２５の材質は、基板２４の材質と同じでもよいし基板２４の材質と異なっていてもよい。また、微小孔アレイ層２５は基板２４と同じ材料で一体化されていてもよい。また、微小孔アレイ層２５は基板２４と同じ材料で一体成型されていてもよい。樹脂からなる微小孔アレイ層２５の材質の例としては、シクロオレフィンポリマーや、シリコン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリ酢酸ビニル、フッ素樹脂、アモルファスフッ素樹脂などが挙げられる。なお、微小孔アレイ層２５の例として示されたこれらの材質はあくまでも例であり、微小孔アレイ層２５の材質はこれらには限られない。
また、微小孔アレイ層２５は着色されていてもよい。微小孔アレイ層２５が着色されていると、ウェル２６内で蛍光、発光、吸光度等の光の測定をする場合に、測定対象となるウェル２６に近接する他のウェル２６からの光の影響が軽減される。
微小孔アレイ層２５は、基板２４上に積層された疎水性膜のベタパターンに対してエッチング，エンボス形成，あるいは切削等の加工が施されることによって貫通孔２５ａが形成される。また、微小孔アレイ層２５が基板２４と一体成型される場合は、基板２４にエッチング，エンボス形成、あるいは切削等の加工が施されることによって、微小孔アレイ層２５の貫通孔２５ａに相当する部分が形成される。これによって、疎水部及び親水部を有するパターンを基板に形成することができる。
カバー部２７は、基体部２３との間に隙間を有して複数のウェル２６の開口部分を覆うように基体部２３に重ねられている。基体部２３とカバー部２７との間は、各種の液体が流れる流路３１となる。本実施形態では、基体部２３とカバー部２７との間を、注入口部から排出口部へ向かって各種の液体が流れる。
次に、本実施形態に係る生体分子解析キット１００Ａに好適に適用可能な試薬の組成について説明する。
図７及び図８に示すように、検出反応試薬２１は、基体部２３とカバー部２７との間に注入口部から送液可能な溶液である。検出反応試薬２１は、解析対象物質に対する酵素反応などの生化学的反応を行うための試薬である。
解析対象物質に対する生化学的反応は、たとえば、ＤＮＡ（核酸）が解析対象物質の場合、核酸が存在する条件下でシグナル増幅が起こるような反応である。検出反応試薬２１は、たとえば核酸を検出可能な方法に応じて選択される。たとえば、インベーダー（登録商標）法や、ＬＡＭＰ法（商標登録）、ＴａｑＭａｎ（登録商標）法または、蛍光プローブ法やその他の方法に使用される試薬が本実施形態の検出反応試薬２１に含まれる。
本実施形態では、解析対象物質が核酸のときに、従来のようなＰＣＲ法での核酸の増幅工程を行わずに検出可能であるが、必要に応じてＰＣＲ法等を使って解析対象核酸を増幅したものをサンプルとして用いても良い。
また、解析対象物質が核酸以外でも、本実施形態に適用できるように、必要な前処理を適宜行ってから本実施形態を適用することができる。
本実施形態では、各試薬の少なくとも１つに吸着防止剤が含まれていることで、生体分子解析キット１００Ａのウェル２６の内面に対して試薬の構成成分が吸着されるのを防止することができる。各試薬全てに吸着防止剤が含まれていても良い。
試薬の例としては、バッファー、検出反応試薬、サンプル（解析対象物：ＤＮＡ、ＲＮＡ類、タンパク質等）溶液、封止液、試薬やサンプルの希釈用溶媒が挙げられる。
吸着防止剤の組成は、たとえば、界面活性剤、リン酸脂質、その他の高分子化合物のうちの少なくとも１種を含んだ組成であり、任意の材料を混合して用いても良い。例を挙げると、界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤が挙げられる。非イオン性界面活性剤としては、Ｔｗｅｅｎやｇｌｙｃｅｒоｌ、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００等が挙げられる。また、高分子化合物としては、Ｐоｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃоｌ（ＰＥＧ）や，ＤＮＡ， 蛋白質が挙げられる。
また、２種以上の材料が混合された吸着防止剤として、例えば、リン酸脂質とＰＥＧとを混合した吸着防止剤が挙げられる。
界面活性剤として非イオン性界面活性剤を用いる場合、試薬に含まれる非イオン性界面活性剤の濃度は５％以下であることが好ましい。Ｔｗｅｅｎ２０を用いる場合、試薬に含まれるＴｗｅｅｎ２０の濃度は０．０００５％以上５％以下の範囲であることが好ましく、０．００１％以上０．５％以下の範囲であることが特に好ましい。Ｔｗｅｅｎ２０の濃度が０．０００５％以上であると、複数のウェル２６における反応を独立して検出することができウェル２６の蛍光を正しく計測できる。Ｔｗｅｅｎ２０の濃度が５％以下であると、十分な酵素反応が得られる。
界面活性剤は非イオン性に限られない。界面活性剤として、イオン性界面活性剤（陰イオン、陽イオン、両性イオン）が用いられても良い。イオン性界面活性剤同士の混合物や、イオン性界面活性剤と非イオン性界面活性剤との混合物を用いても良い。
また、界面活性剤と高分子化合物との混合物を、吸着防止剤として使用することも可能である。
次に、本実施形態に係る生体分子解析キット１００Ａに好適に適用可能な油性封止液２２の組成について説明する。
本実施形態では、生体分子解析キット１００Ａのウェル２６の内面に対して試薬の構成成分が吸着されるのを防止する目的で、油性封止液２２に吸着防止剤が含まれていていてもよい。
油性封止液２２（図８参照）は、基体部２３とカバー部２７との間に注入口部から送液可能な溶液である。油性封止液２２は、解析対象物質を含む試料と混合しない材料から選ぶことができる。油性封止液２２としてはミネラルオイルやフッ素系液体のＦＣ４０等を用いることができる。
また、本実施形態では、生体分子解析キット１００Ａのウェル２６の内面に対して試薬の構成成分が吸着されるのを防止する目的で、試薬を送液する前にウェル洗浄用のバッファーを送液してもよい。バッファーには吸着防止剤が含まれていてもよい。
これらの吸着防止剤は、反応容器３０におけるウェル２６の内面に吸着される物質でも構わない。吸着防止剤が含まれた試薬が反応容器３０内に供給されることにより、吸着防止剤が反応容器３０の内面に吸着される。その結果、反応容器３０の内面は、吸着防止剤が含まれていない場合と比較して、酵素反応に用いられる酵素、解析対象となる核酸やタンパク質、及びシグナル検出に利用される標識物質等が吸着されにくい状態となる。
洗浄用のバッファーに含まれる吸着防止剤は非イオン性界面活性剤であってもよい。非イオン性界面活性剤としては、Ｔｗｅｅｎやｇｌｙｃｅｒоｌ、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００等が挙げられる。また、洗浄用のバッファーが試薬の一部を構成していてもよい。
酵素反応に用いられる酵素、解析対象となる核酸やタンパク質、及びシグナル検出に利用される標識物質等のうちの少なくとも１つが最初に反応容器３０の内部に供給される前から、シグナル検出が終了するまでの間に反応容器３０の内部に接する試薬の少なくとも１つに吸着防止剤が含まれていることが好ましい。たとえば、吸着防止剤は、試薬を所定濃度に希釈するための緩衝液等の溶媒に混合されていてもよい。
また、酵素反応に用いられる酵素、解析対象となる核酸やタンパク質、及びシグナル検出に利用される標識物質等のうちの少なくとも１つが最初に反応容器１０の内部に供給される前から、シグナル検出が終了するまでの間に反応容器１０の内部に接する試薬のすべてに吸着剤が含まれていても良い。
なお、吸着防止剤は、酵素反応やシグナル増幅反応を阻害しない物質であることが好ましい。
次に、本実施形態に係る生体分子解析キット１００Ａを用いた生体分子解析方法について説明する。図９は、本実施形態に係る生体分子解析方法を示すフローチャートである。
まず、不図示の注入口部及び排出口部が開放され、吸着防止剤を含む洗浄用のバッファー３３が注入口部を通じて基体部２３とカバー部２７との間の隙間へと、たとえば分注ピペット等によって送液される（図９に示すステップＳ２０１）。バッファー３３は、複数のウェル２６の全てを覆うように、基体部２３とカバー部２７との間の隙間内で広がる（図６参照）。これによって、基体部２３の表面のうち貫通孔２５ａの内面に位置する領域及び隣り合うウェルの間に位置する領域３４に低吸着物質層３５を有する低吸着構造部３２が形成される。
バッファー３３を送液するのではなく、反応容器３０中にバッファー３３が予め満たされていてもよい。この場合、注入口部、排出口部をフィルムなどで封止してバッファー３３を反応容器３０中に封止しておいてもよい。
次に、解析対象となる物質（本実施形態ではたとえばＤＮＡ）を含んだ試薬が注入口部を通じて基体部２３とカバー部２７との間の隙間へと、たとえば分注ピペット等によって送液される（図９に示すステップＳ２０２）。具体的には、本実施形態において充填される試薬は、インベーダー反応試薬（検出反応試薬２１）（１μＭ アレルプローブ、１μＭ インベーダーオリゴ、１μＭ ＦＡＭ標識アーム、１０ｍＭ ＭＯＰＳ ｐＨ７．５、６．２５ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０Ｕ／μＬ クリベース、Ｔｗｅｅｎ ２０）及び解析対象物質であるＤＮＡを含んでいる。試薬は、複数のウェル２６の全てを覆うように、基体部２３とカバー部２７との間の隙間内で広がる（図７参照）。また、試薬が基体部２３とカバー部２７との間の隙間に送液されることにより、バッファー３３は排出口部から排出される。なお、このとき、試薬がバッファー３３と異なる色であると、試薬が基体部２３とカバー部２７との間のどの部分に送液されたかを容易に把握できる。
図６に示すように、基体部２３とカバー部２７とによって形成される流路３１には、基板２４と微小孔アレイ層２５とによって形成された複数のウェル２６が配置されている。複数のウェル２６内に満たされたバッファー３３は、試薬を流し入れることで順次ウェル内でバッファー３３から試薬に置き換わっていく。
しかしバッファー３３がウェル２６の内面に保持された状態で維持されるウェル２６も存在する。この場合、試薬は複数のウェル２６内に満たされたバッファー３３と置き換わることなく、バッファー３３に試薬が重層された状態となる。しかしながら、バッファー３３と試薬とは互いに容易に混合されるので、バッファー３３に試薬が重層された状態となった後、試薬中の溶質はバッファー３３へと拡散する。このため、バッファーと試薬が置き換わったウェルと、バッファー３３と試薬とが重層されたウェルでの反応は実質的に同じである。
ウェル２６に充填される液量は、貫通孔２５ａの数に応じて適宜設定されてよい。また、ウェル２６に滴下される液量及びその濃度は、１つのウェル２６に１つのＤＮＡが入るように調整される。たとえば、本実施形態では、ウェル２６に充填される液量は、反応容器全体で０．５μＬであり、０．５μＬの液体が複数のウェル２６に配分される。
次に、図８に示すように、基体部２３とカバー部２７とによって形成される流路３１内に、注入口部から油性封止液２２を送液する。油性封止液２２は、試薬がバッファーに拡散した状態で複数のウェル２６内の液体を封止することにより、複数のウェル２６を複数の独立した反応室（核酸検出反応容器）３６とする。すなわち、本実施形態では、油性封止剤２２が各ウェル２６を覆うことによって、第一実施形態に開示された微小空間と同様に、各ウェル２６が独立した状態となる。また、油性封止液２２は、基体部２３とカバー部２７との間の隙間内で複数のウェル２６の外部にある液体を排出口部から押し出す（図９に示すステップＳ２０３）。
そして、インベーダー反応試薬及びＤＮＡが各ウェル２６に充填されたアレイデバイス２０が、例えば、６２℃のオーブンにてインキュベートされる（図９に示すステップＳ２０４）。このインキュベートによって、インベーダー反応において等温で行われるシグナル増幅が好適に進行する。
続いて、インベーダー反応試薬及びＤＮＡが各ウェル２６に充填されたアレイデバイス２０が、あらかじめ定められた時間の後に取り出され、蛍光を有するウェル数およびその蛍光量が計測される（図９に示すステップＳ２０５）。
つまり、本実施形態に係る生体分子解析キット１００Ａを用いた生体分子解析方法は、流路及び複数の容器形状部を有する反応容器において、流路に試薬を送液し、複数のウェルに試薬を充填する工程（試薬送液工程）と、試薬送液工程の後に、油性封止液を流路に送液し、複数のウェル内の試薬を油性封止液により封止することにより複数のウェルを複数の独立した核酸検出反応容器とする工程（封止工程）と、を有する。
なお、本実施形態において、蛍光の検出以外に、可視光の発光、発色、ｐＨの変化、電位変化などをシグナルとして検出する検出系を適用してもよい。また、タンパク質を解析するために本実施形態の構成を適用することも可能である。
なお、本実施形態において、各試薬に吸着防止剤が含まれていることで、生体分子解析キット１００Ａの反応容器３０の内面に対して試薬の構成成分が吸着されるのを防止することができる。吸着防止剤は、全ての試薬に含まれていてもよいし、試薬の一部に含まれていてもよい。
また、このような吸着防止剤に代えて、試薬の構成成分の表面張力を低下させる物質を試薬が含んでいてもよい。例えば界面活性剤は試薬の表面張力を低下させる。そのため、各ウェルへ試薬を充填するためにも、試薬に界面活性剤を含むことは有効である。
（第一実施例）
次に、本発明の第一実施形態に係る生体分子解析方法の作用効果を確認するために行った実施例について説明する。図３は、本実施例における蛍光量測定試験の結果を示す蛍光画像図である。図４は、本実施例における蛍光強度測定試験の結果を示すグラフである。なお、図４における横軸は反応時間を示し、図４における縦軸は蛍光強度を示している。図５は、本実施例における反応時間測定試験の結果を示す表である。なお、図５において、「良」は定量性が良好であることを示し、「劣」は定量性において本実施例に劣ることを示す。
＜蛍光を発するウェル数の計測試験＞
まず、反応容器１０の微小空間１１内に、インベーダー反応試薬とともに、３種類の人工合成ＤＮＡを封入した。ここで、それぞれの人工合成ＤＮＡの濃度は、１ウェルに１分子が入る３０ｐＭと、１ウェルに１６６６分子が入る５０ｎＭと、１ウェルに１分子も入らない０Ｍと、に設定した。
そして、反応容器１０を、６２℃のオーブンにてそれぞれインキュベートし、０分（０ｍｉｎ）、１０分（１０ｍｉｎ）、１５分（１５ｍｉｎ）後の状態を確認した。
図３に示すように、ＤＮＡ濃度が３０ｐＭ以上であれば、０Ｍである場合のバックグラウンドに対してほぼすべての微小空間１１において蛍光量に差が生じ、ＤＮＡが存在していることがわかる。
＜蛍光強度の計測試験＞
次に、上述の設定の人工合成ＤＮＡが封入された反応容器１０を、６２℃のオーブンにてインキュベートし、０分、１０分、１５分後の状態を確認するため、ＤＮＡ濃度ごとに５ウェルの画像を選び、各画像における２１ピクセルの蛍光量の平均値を求めた。ここでは、反応後のウェルは、蛍光顕微鏡（ツァイス社、ＡＸ１０）、対物レンズ（ＥＣ Ｐｌａｎ−Ｎｅｏｆｌｕａｒ ４０× ｏｉｌ ＮＡ１．３）、光源（ＬＥＪ社、ＦｌｕｏＡｒｃ００１．２６Ａ Ｕｓａｂｌｅ ｗｉｔｈ ＨＢＯ １０）、センサー（浜松ホトニクス社、ＥＭ−ＣＣＤ Ｃ９１００）、フィルター（オリンパス社、Ｕ−ＭＮＩＢＡ２）、及び解析ソフト（浜松ホトニクス社、ＡＱＵＡＣＯＳＭＯＳ ２．６：露光時間 ６４．３ｍｓ、ＥＭゲイン １８０、オフセット ０、ビニング ×１）を用いて計測された。
図４に示すように、１つの微小空間１１に１分子が収容される濃度である３０ｐＭにおいて、０Ｍの場合と比較して区別可能な強度の蛍光が検出された。
＜反応時間測定試験＞
続いて、従来の解析方法と本発明の解析方法とにおける反応時間の比較をした。反応時間の測定試験には、本発明との比較対象として、１ナノリットル（ｎｌ）×多ウェルの試薬量でデジタルＰＣＲ反応を行う方法（比較例１）、２０マイクロリットル（μｌ）の試薬量でＰＣＲ反応を行う方法（比較例２）、２０μｌの試薬量でＰＣＲ＋インベーダー反応を行う方法（比較例３）、２０μｌの試薬量でインベーダー反応を行う方法（比較例４）、及び１００フェムトリットル（ｆｌ）×多ウェルの試薬量でデジタルＥＬＩＳＡ反応を行う方法（比較例５）を採用した。
図５に示すように、反応時間の測定試験により明らかなように、１ｎｌ×多ウェルの試薬量でデジタルＰＣＲ反応を行った比較例１では、６０分の反応時間を必要とし、温調が変温であり、定量性は良好であった。２０μｌの試薬量でＰＣＲ反応を行った比較例２では、６０分の反応時間を必要とし、温調が変温であり、定量性は良好ではなかった。２０μｌの試薬量でＰＣＲ＋インベーダー反応を行った比較例３では、６０分の反応時間を必要とし、温調が変温であり、定量性は良好ではなかった。
２０μｌの試薬量でインベーダー反応を行った比較例４では、１２０分の反応時間を必要とし、温調が等温であるものの、定量性は良好ではなかった。１００ｆｌ×多ウェルの試薬量でデジタルＥＬＩＳＡ反応を行った比較例５では、１５分の反応時間を必要とし、温調が等温であり、定量性は良好であった。
これらに対し、１００ｆｌ×多ウェルの試薬量でデジタルインベーダー反応を行った本実施例では、１０分の反応時間だけであり、温調が等温であり、定量性は良好であった。これによって、本実施例が、１００ｆｌ×多ウェルの試薬量でデジタルインベーダー反応を行ったからであることが判明する。
（第二実施例）
次に、本発明の第二実施形態に係る生体分子解析方法の作用効果を確認するために行った実施例について説明する。図１０は、本実施例におけるウェルを示す蛍光画像図である。図１１Ａから図１１Ｍは、本実施例における蛍光量測定試験の結果を示す蛍光画像図である。図１２は、本実施例における蛍光強度測定試験の結果を示すグラフである。なお、図１２における横軸はＴｗｅｅｎ２０の濃度を示し、図１２における縦軸は蛍光強度を示している。
＜核酸定量用アレイデバイスの作製＞
０．５ｍｍ厚のガラス製の基板にＣＹＴＯＰ（登録商標）（旭硝子製）をスピンコートした後、１８０℃で１時間ベークした。形成されたＣＹＴＯＰの厚みは３μｍだった。ＣＹＴＯＰを基板にスピンコートによってコートした後、ポジティブフォトレジストをコートし、フォトマスクを用いてパターンを形成した。その後、Ｏ２プラズマによってＣＹＴＯＰをドライエッチングした。表面に残ったフォトレジストを除去するためにアセトンとエタノールにより表面を洗浄、リンスした。
図１０に示すようにＣＹＴＯＰによって形成されたウェル（微小空間）の直径は５μｍであり、インベーダー反応によるシグナル検出が数分で可能な体積を有する。１つの基体部には１００ブロックのウェルアレイが設けられた。また、各々のブロックは１０，０００個のウェルを有した。そのため、合計１００万個のウェルが形成された。図６に示すように、送液ポート（注入口部：不図示）を有するガラス製の板と基体部とを、５０μｍの厚みを有し流路形状に加工された両面テープを用いて接着した。
＜試料と検出反応試薬との混合液の送液＞
界面活性剤であるＴｗｅｅｎ２０の濃度による液滴の形成しやすさを確かめた。
まず、界面活性剤を含む洗浄バッファーを送液ポートを通じて核酸定量用アレイデバイスに送液した。その後、インベーダー反応試薬（検出反応試薬２１：１μＭ アレルプローブ、１μＭ インベーダーオリゴ、１μＭ ＦＡＭ標識アーム、１０ｍＭ ＭＯＰＳ ｐＨ７．５、６．２５ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０Ｕ／μＬ クリベース、Ｔｗｅｅｎ ２０）２２μｌ及び解析対象物質であるＤＮＡを送液ポートを通じて核酸定量用アレイデバイスに送液した。
その後、フッ素系液体であるＦＣ４０（油性封止液２２）を送液ポートを通じて８０μｌ送液することで各ウェル内に試薬を分割して封入した。これを６３℃のホットプレート上で加熱し、インベーダー反応を実施した。
次に、蛍光顕微鏡（オリンパス製）を使用し、６３℃１０分、２０分経過時の各ウェルの蛍光を検出した。露光時間は、明視野：１００ｍｓｅｃ、ＮＩＢＡ ：２０００ｍｓｅｃ、ｍＣｈｅｒｒｙ：２０００ｍｓｅｃとした。
１０分加熱後の各ウェルを顕微鏡で観察した結果を図１１Ａから図１１Ｇに示す。２０分加熱後の各ウェルを顕微鏡で観察した結果を図１１Ｈから図１１Ｍに示す。
Ｔｗｅｅｎ２０の濃度が０％のときは、隣り合うウェルの間に位置する領域でも蛍光が検出されたため正しくデジタル計測ができなかった。この理由として、隣り合うウェルの反応溶液の液滴同士が結合しているため、隣り合うウェルの間に位置する領域で試料が反応したと考えられる。その他に、隣り合うウェルの反応溶液の液滴同士は結合していないが、隣り合うウェルの間に位置する基体部の表面に残存した試料が反応したと考えられる。一方、Ｔｗｅｅｎ２０が０．０００５％以上含まれていれば、反応溶液の液滴が個々に分離していることが確かめられた。
また、２０分加熱後のウェルにおいて、Ｔｗｅｅｎ２０が０．００１％以上含まれていれば、反応溶液の液滴が個々に分離していることが確かめられた。つまり、長時間加熱した場合、Ｔｗｅｅｎ２０が０．００１％以上含まれていれば、短時間加熱した場合よりも再現性が高くなると考えられる。
図１２はＴｅｅｅｎ２０の濃度に応じた蛍光強度の値を示すグラフである。Ｔｅｅｅｎ２０の濃度が高くなるにつれ、蛍光強度が弱くなった。すなわち、Ｔｗｅｅｎ２０の濃度が増えることで反応を阻害している挙動が確認された。そのため、Ｔｗｅｅｎ２０の最適な濃度は５％程度までと推察される。また、コストの観点から、Ｔｗｅｅｎ２０の濃度は０．５％以下がより好ましいと考えられる。
また、同様の試薬１０μｌを９６ウェルプレートに分注し、１０μｌの体積での反応性をライトサイクラーＬＣ４８０（ロシュ製）を用いて検出した。ライトサイクラーの温調条件は、６３℃一定とした。ライトサイクラーで同様の組成で反応を確かめた結果、Ｔｗｅｅｎ２０の濃度によらずインベーダー反応の蛍光シグナル増加は一定であった。このことから界面活性剤は酵素の反応性を高めるためではなく液滴の安定性に寄与していることが分かった。
界面活性剤は、試薬に含まれる検出対象物質がＣＹＴＯＰやガラスなどに吸着するのを防ぐことができる濃度を添加すればよい。Ｔｒｉｒｏｎ−Ｘ１００などのほかの界面活性剤の場合には最適な濃度が異なっていてもよいが、Ｔｗｅｅｎ２０の例を考慮できる。
（第三実施例）
次に、本発明の第二実施形態に係る生体分子解析方法の作用効果を確認するために行ったさらなる実施例について説明する。図１３は、本発明の第二実施形態に係る生体分子解析方法の作用効果を説明するための図である。図１４Ａから図１４Ｆは本実施例における蛍光量測定試験の結果を示す蛍光画像図である。図１３において、反応性の欄の「良」とは、反応性が良好であったことを示す。図１３において、液滴の欄の「○」とは、は隣り合う２つのウェルの間に蛍光が観察されなかったことを示す。図１３において、液滴の欄の「△」とは、は隣り合う２つのウェルの間に蛍光が観察されたが、濃度測定には影響がない程度であったことを示す。図１３において、液滴の欄の「×」とは、隣り合う２つのウェルの間に蛍光が観察されたことにより、隣り合う２つのウェルの間の領域を用いたときは正しくデジタル計測ができない場合があったことを示す。
本実施例では第二実施例で用いられたインベーダー反応試薬及びＤＮＡを用いて、図１３に示すように、洗浄の有無、洗浄用バッファーへの界面活性剤の添加の有無、及び反応試薬への界面活性剤の添加の有無について条件を変えて反応を行い、得られた蛍光画像から液滴の状態及び反応性を確認した。界面活性剤として、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を洗浄用バッファー又は反応試薬に添加した。その他の条件については第二実施例と同様である。
サンプル１及びサンプル２に対しては洗浄用のバッファーに界面活性剤を添加して洗浄を行った。サンプル３及びサンプル４に対しては洗浄用のバッファーに界面活性剤を添加せずに洗浄を行った。サンプル５及び６に対しては洗浄を行わなかった。さらに、サンプル１、３、及び５の反応試薬には界面活性剤を添加した。一方、サンプル２、４、及び６の反応試薬には界面活性剤を添加しなかった。いずれのサンプルにおいても反応性は良好であった。さらに、サンプル２が示すように、反応試薬に界面活性剤が含まれていない場合でも、洗浄用のバッファーに界面活性剤が含まれていれば、液滴が良好に形成され、反応性も良好であることがわかった。
以上説明したように、本発明の第一実施形態に係る生体分子解析方法及び生体分子解析キット１００，及び第二実施形態に係る生体分子解析方法及び生体分子解析キット１００Ａによれば、微小空間１１又はウェル２６内で酵素反応を行うことで、迅速に、かつ、定量的な生体分子の解析を行うことができる。
また、本発明の第一実施形態に係る生体分子解析方法及び生体分子解析キット１００，及び第二実施形態に係る生体分子解析方法及び生体分子解析キット１００Ａによれば、酵素反応としてインベーダー法を用いることにより、ＰＣＲ増幅を必要とせずに、等温反応が可能なために、機器構成および解析手順を単純化できる。
また、本発明の第一実施形態に係る生体分子解析方法及び生体分子解析キット１００，及び第二実施形態に係る生体分子解析方法及び生体分子解析キット１００Ａによれば、解析対象１分子が収容される大きさの微小空間１１内又はウェル２６内で反応をさせるため、シグナルが飽和するまでにかかる時間を短縮できる。
また、本発明の第一実施形態に係る生体分子解析方法及び生体分子解析キット１００，及び第二実施形態に係る生体分子解析方法及び生体分子解析キット１００Ａによれば、従来に比して反応時間が短くＳＮ比が高い。
また、本発明の第一実施形態に係る生体分子解析方法及び生体分子解析キット１００，及び第二実施形態に係る生体分子解析方法及び生体分子解析キット１００Ａによれば、酵素反応が、等温反応であるために、変温反応と比べて、安定した酵素反応を得ることができ、再現性が高い。
また、本発明の第一実施形態に係る生体分子解析方法及び生体分子解析キット１００，及び第二実施形態に係る生体分子解析方法及び生体分子解析キット１００Ａによれば、酵素反応が、インベーダー反応であるために、ＰＣＲを要する手順と比較してシグナルの検出判定を行うための時間を短縮することができる。
また、本発明の第一実施形態に係る生体分子解析方法及び生体分子解析キット１００，及び第二実施形態に係る生体分子解析方法及び生体分子解析キット１００Ａによれば、微小空間１１又はウェル２６が、１００ピコリットル以下であるために、解析のために消費される試薬の量を削減できる。
なお、上記実施形態では、低吸着構造部と吸着防止剤とが併用される例が開示されている。しかしながら、低吸着構造部と吸着防止剤との少なくともいずれかが採用されていれば、低吸着構造部と吸着防止剤とのいずれも採用されていない場合と比較して迅速に、かつ、定量的に解析をすることができる。
１００，１００Ａ 生体分子解析キット
２，２３ 基体部
３，３２ 低吸着構造部
４ 改質部
４Ａ，３５ 低吸着物質層
１０，３０ 反応容器
１１ 微小空間（容器形状部）
１２ 軟性平板
１３ カバーガラス
１４ ガラス基板
２１ 検出反応試薬
２２ 油性封止液
２４ 基板
２６ ウェル（容器形状部）
３１ 流路
３３ バッファー

Claims (12)

  1. 試料中に含まれる生体分子を解析する方法であって、
    複数の微小空間のアレイを有する反応容器に、前記試料と、検出反応試薬と、を含む溶液を送液する試薬送液工程と、
    前記反応容器に封止液を送液し、前記封止液が複数の前記微小空間を覆うことによって複数の独立した反応室を形成する封止工程と、
    前記封止工程によって独立した反応室内で等温反応による検出反応を行いシグナルを検出するシグナル検出工程と、
    を順に行う、生体分子解析方法。
  2. 前記封止液が疎水性である、請求項１に記載の生体分子解析方法。
  3. 前記封止液の比重が、前記溶液の比重よりも重い、請求項１又は２に記載の生体分子解析方法。
  4. 前記溶液を、前記アレイに供給するための流路を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の生体分子解析方法。
  5. 前記検出反応を、前記生体分子を担体に固定することなく行う、請求項１〜４のいずれか一項に記載の生体分子解析方法。
  6. 前記溶液が吸着防止剤を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の生体分子解析方法。
  7. 前記微小空間の大きさが６０ｆＬ以上１００ｐＬ以下である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の生体分子解析方法。
  8. 前記生体分子は核酸であり、前記シグナル検出工程において、前記核酸を増幅することなくシグナルを検出する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の生体分子解析方法。
  9. 前記検出反応がインベーダー反応である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の生体分子解析方法。
  10. 前記生体分子は核酸又はタンパク質である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の生体分子解析方法。
  11. 前記シグナル検出工程の後に、シグナルが検出された前記反応室の数をカウントし、前記生体分子を定量する定量工程を更に行う、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の生体分子解析方法。
  12. 前記検出反応試薬と、前記反応容器の少なくともいずれかを含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の生体分子解析方法を行うための生体分子解析キット。
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