JP2018523977A - 移植を改善するためのcrispr/cas関連方法および組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2015年6月9日に出願された米国仮特許出願第62/173,321号明細書;および2016年2月12日に出願された米国仮特許出願第62/294,493号明細書の優先権を主張するものであり、これら各々の内容全体は、本明細書に参照により明示的に援用される。
本出願は、ASCIIフォーマットで電子的に提出された配列表を含み、これは、その内容全体が、本明細書に参照により援用される。前記ASCIIコピーは、2016年6月9日に作製され、2016−06−09_126454−01420_EM052PCT1_ST25.txtと命名され、サイズは227KBである。
レシピエント対象由来ではない細胞(例えば、造血幹細胞(HSC若しくはHSPC)および/またはT細胞)の移植を成功させるために、ドナー細胞が、1つまたは複数の免疫原性遺伝子の遺伝子座で対立遺伝子の高いおよび/または有意なマッチング度を呈示するようなドナーを見出さなければならない。残念ながら、ヒト集団におけるハプロタイプ異質性のために、1つまたは複数の免疫原性遺伝子座でマッチする対立遺伝子を有する好適なドナー細胞の入手可能性は限られている。従って、好適なドナーセルを同定することができないために、最終的に、患者は必要な移植を受けることができないか、または医者が、ミスマッチドナー細胞を使用せざるを得なくなり、これが最終的に免疫拒絶を引き起こし得る。例えば、ヒト白血球抗原遺伝子(HLA)は、早期骨髄造血幹/前駆細胞移植(HSCT)臨床治療中に初めて同定された免疫原性遺伝子である。骨髄HSPCドナーとレシピエント対象との間のHLAのミスマッチは、免疫反応を引き起こす恐れがあり、その場合、ドナー移植片から発生するリンパ球が、宿主組織に対して免疫応答を開始する。この病状、すなわち移植片対宿主病(GVHD)を引き起こすドナーT細胞同種抗原反応は、皮膚、消化管(GI)、および肝臓に集中する。GVHDは、非再発罹患率および死亡率の主な原因であり、同種異系HSCT対象の約50%に影響を与える(Bhatia S.Expert Rev Hematol.2011;4(4):437−452;Garnett C,et al.Ther Adv Hematol.4(6):366−78(2013))。反対に、レシピエントT細胞は、同種異系HSPC細胞表面上に発現若しくは提示されたHLAタンパク質またはドナー特異的抗原を認識することによって、入来したドナー同種異系HSPCを外来のものとして認識する可能性があり、最終的に移植片拒絶を引き起こす。
「標的ノックアウト位置」は、本明細書の用法では、例えばNHEJ媒介性改変によって、改変されると、遺伝子または遺伝子座の不活性化、例えば、切断を引き起こす、遺伝子または遺伝子座、例えば、本明細書に記載される遺伝子または遺伝子座、例えば、ヒト白血球抗原(HLA)遺伝子または遺伝子座内の位置を指す。
移植片対宿主病(GVHD)に関連するリスクおよび潜在的に生命を脅かす合併症のために、後天性、悪性、および遺伝性血液疾患の治療のための移植(例えば、アロ−HSCT)の有用性が制限されている。アフリカ系統の人は、骨髄および臍帯血HSPCバンクの両方で少数しか存在せず、しかも、独特のハプロタイプとMHC遺伝子座での特異なヘテロ接合型を有するために、その民族共同体(例えば、SCD)に高い頻度で発生する疾患の治療のために、ライフ・キュアリング(life−curing)アロ−HSCTを利用することが制限され得る。本明細書に記載される通り、CRISPR/Cas9関連の方法および組成物の使用によって、ドナー細胞が、対象(レシピエント)HLA遺伝子座と好適にまたは十分にマッチし、これにより、そうでなければHLAがマッチするドナーがいない対象の疾患の治療を目的とする移植(例えば、アロ−HSCT)のための好適なドナーを生み出すように、免疫原性遺伝子適合(例えば、HLA適合)を増大するためのドナー細胞(例えば、HSPC)における1つまたは複数の免疫原性遺伝子遺伝子座(例えば、HLA遺伝子座)の改変が可能になる。
マッチする非血縁ドナー(MUD)からの移植(例えば、HSCT)は、ドナーとレシピエントのマイナー組織適合性抗原(MiHA)間の反応性のために、依然としてGVHDを招き得る。ドナーとレシピエントが、6つのHLA抗原(HLA−A、−B、−DR遺伝子座の両対立遺伝子によりコードされる)のうちの1つでミスマッチであれば、急性GVHDの発生は65%であり、こうした対象における死亡率は、50%である。さらに、MHC遺伝子座での1つのミスマッチが、GVHDのリスクを大幅に増加し得る。白血病対象におけるアロ−HSCTの研究では、1抗原ミスマッチ血縁ドナー細胞(MMRD)の移植後のアロ−HSCT後の臨床結果(無病生存期間および全生存期間)は、マッチ非血縁ドナー(MUD)アロ−HSCTからの結果と同等であるとみなされた(Valcarcel D,et al.Biol.Blood Marrow Transplant.2011;17(5):640−648)。MUD HSPCを移植した対象は、より高い慢性(c)GVHDの発生率を有し、これは、クオリティオブライフに全体的にマイナスの影響をもたらす。別の研究では、ミスマッチ非血縁ドナーHSPC(クラスI対立遺伝子でミスマッチ)のレシピエントは、より高いGVHD発生率および移植片関連死亡率を有した(Hauzenberger D,et al.Tissue Antigens.2008;72(6):549−558)。
マッチする同胞ドナーを有する対象の確率は、3%前後であり、マッチする非同胞マッチ家族メンバーを有する対象の確率は、10%近い(Ottinger H,et al.Bone Marrow Transplant.1994;14 Suppl 4:S34−38)。骨髄および臍帯血バンクにおけるMUDの同定は70%近く、MUDを用いたときGVHDを発生するリスクは80%であり、こうした対象の50%近くがグレードIII〜IVのGVHDを発生するが、それは致命的であり得る。非白色人種対象の場合、7/8〜8/8マッチドナーを見出す確率は、ヨーロッパ系アメリカ人(例えば、白色人種)系統の人と比較して低い。全米骨髄バンク(National Marrow Donor Program)は、MUDが、白色人種の90%について同定され得るが、アジアまたはアフリカ系統の対象の場合には、7/8〜8/8MUDを見出す確率は、それぞれ70%〜60%に減少する(Pidala J,et al.Blood.2013;122(22):3651−3658)と推定する。アフリカ人系統(例えば、アフリカ系アメリカ人)の対象に関しては、血液学的健全性、疾患およびアンメットメディカルニーズは、骨髄および臍帯血バンク登録簿においてマッチするドナーを同定する確率が低いためであり、この集団における鎌状赤血球症(SCD)の比較的高い発生率がさらに悪化させている。SCDは、米国において500人に1人または計1000人のアフリカ系アメリカ人誕生に発生し、この疾患には、100,000人のアメリカ人が罹患している(www.cdc.gov)。中央および西部アフリカにおいて、SCDの発生率がより高い。例えば、ナイジェリアでは、毎年45,000〜90,000人の誕生にSCDが発生した(www.SickleCellDisease.org)。SCDは、鎌状赤血球突然変異が存在しないマッチドナー(血縁もしくは非血縁)からの骨髄HSCTまたはUCTを用いて治癒させることができる。従って、生命を脅かす異常ヘモグロビン症障害の比較的高い発生率と、この疾患および他の血液系疾患を治療するために用いることができる好適なドナー細胞(例えば、HSPC)を同定する課題の組合せが、アフリカ系統の対象におけるアンメットメディカルニーズを増大している(Dew A,et al.Biol.Blood Marrow Transplant.2008;14(8):938−941)。
MHC遺伝子がハプロタイプとして遺伝されること、ならびにMHC遺伝子座での高い多型度を考慮すると、共通するハプロタイプも、全く異なる系統のヒトの間で変動すると考えられる。全米骨髄バンク(National Marrow Donor Program)(NMDP)登録簿に記録されたドナー(Dehn J,et al.Biol.Blood Marrow Transplant.2015;21(1):137−141)によれば、歴史的に、ヨーロッパ系アメリカ人は、8/8マッチ移植片の最も高い割合を有するのに対し、アフリカ系アメリカ人は、最も低い割合を有する。NMDPに登録した8百万人のうち、わずか7%がアフリカ系統である。さらに、混合遺伝子バックグラウンドを有する人は、さらにマッチするのが難しい。例えば、混合系統の対象は、アフリカ系アメリカ人に共通する父系ハプロタイプと、ヨーロッパ系アメリカ人に共通する母系ハプロタイプを保有し得る。双方の系統関連ハプロタイプを有するマッチ非血縁ドナーを見出すことはさらに困難である。NMDPによれば、より多様なバックグラウンドからのドナー候補の登録を奨励する目的で、供与方法に関して共同体に知らせるためのさらなる教育が必要とされる。今日まで、HLA多型に関するほとんどの研究は、限定的な遺伝子混合を有する集団に向けられていた。しかし、HLA多様性は、他の大陸からの継続的な移入により、北アメリカの方が顕著である。ある研究では、白人種(例えば、ヨーロッパ系アメリカ人)、アジア系、ネイティブアメリカン、アフリカ系アメリカ人、およびラテンアメリカ人(例えば、ヒスパニック系)をはじめとする、米国に住んでいる様々な非近交系群に関連する主要ハプロタイプを特性決定することが試みられた(Cao K,et al.Hum.Immunol.2001;62(9):1009−1030)。試験された群の間で、アフリカ系アメリカ人は、他の集団試験と比較して、全クラスI遺伝子座で最大の異型接合性を示し、しかも、HLA−AおよびHLA−B対立遺伝子間の関連が弱いか、または存在しなかった。さらに、アフリカ系統に関連する最も一般的なハプロタイプは、白人種系統に関連する最も一般的なハプロタイプとは異なった。これらの知見から、異なる民族間でのHLAマッチは、対象が非白人種の場合、好適なマッチまたはハプロが同一のドナーを同定する上で課題を呈することがわかる。近年、NMDPは、米国における様々な系統群に検出された最も頻度の高い対立遺伝子およびハプロタイプの最新記録を提供した(bioinformatics.bethematchclinical.org)Maiers et al.,Hum.Immunol.2007;68(9):779−788からの論文の延長。これらの群には以下:ヨーロッパ系アメリカ人、アフリカ系アメリカ人、アジア系パシフィックアイランダー、およびヒスパニック系が含まれた。さらにユダヤ系統の人の共通対立遺伝子およびハプロタイプならびに以前の刊行物(Klitz et al.,2001,Tissue Antigens,76(6):442−58)からの最新版も入手可能である(bioinformatics.bethematchclinical.org)。
本明細書に記載される方法、組成物、および細胞を用いて、例えば、生着を高める、GVHDおよび移植片拒絶を予防する、前処置および免疫抑制の必要性を低減する、またはこれらの組合せによって、移植の結果(例えば、造血幹細胞移植)を改善することができる。例えば、本明細書に記載される方法、組成物、および細胞は、GVHDおよび/もしくは移植片拒絶を予防または治療する治療法、例えば、1回療法または複数回投与療法を提供する。
1つまたは複数の免疫原性遺伝子もしくは遺伝子座、例えば、HLA遺伝子もしくは遺伝子座、例えば、HLA対立遺伝子、ハプロタイプ、もしくは遺伝子座は、本明細書に記載される方法によって改変することができる。
ヒト対象への移植のためのHLAマッチ細胞(例えば、本明細書に記載される細胞、例えば、CD34+HSPC)は、複数ステップ(例えば、2ステップ)プロセスにより、マッチしない、部分的にマッチする、またはハプロタイプが同一のドナー細胞(例えば、HPSC)から作製することができる。
現在まで記録されたHLA対立遺伝子変異体を含む一般に入手可能なデータセット(hla.alleles.org)を用いて、HLA−A、−B、−C、DRB1、−DRB3/4/5、および−DQB1遺伝子座について報告されている個別の対立遺伝子に高度に特異的なgRNA配列を含むデータベースが構築および確立され、これは、全ての対立遺伝子を、これらの個々の対立遺伝子が提示されるヒト対象の系統、人種、または民族バックグラウンドと相互参照する(Marsh,S.G.E.(2015),Nomenclature for factors of the HLA system,update March 2015.Tissue Antigens.doi:10.1111/tan.12581;Maiers M,et al.Hum.Immunol.2007;68(9):779−788)(対立遺伝子特異的gRNA例および詳細なデータベース設計については、「gRNA」および「実施例」のセクションを参照されたい)。下記の数の対立遺伝子変異体が、データベースに含まれた:HLA−A(3094対立遺伝子)、HLA−B(3865対立遺伝子)、HLA−C(2618)、HLA−DRB1(1719)、HLA−DR3/4/5(95)、HLA−DQB1(777対立遺伝子)。データベースを用いて、データベースに示される数千の対立遺伝子変異体のうちの1つに特異的なgRNAを選択することができる。さらに、本明細書に記載されるデータベースは、1つまたは複数のgRNAにより両アレル破壊を可能にする対立遺伝子特異性なしで、個別のHLA遺伝子座を標的化するgRNAを同定し、階層化することもできる。対立遺伝子変異体、gRNA、および系統を既存の臍帯血および骨髄ドナー登録と関連付けることによって、レシピエント対象でマッチするアロ−HSCTのために後に修飾することができる部分的にマッチするドナーを相互参照し、同定することができる。
1遺伝子座の1対立遺伝子(母系もしくは父系のいずれか)が、ドナー細胞とレシピエント対象の間でマッチしない場合、対立遺伝子特異的gRNA分子をCRISPR−Cas9システムと一緒に用いて、対立遺伝子特異的遺伝子産物の発現をノックアウトまたはノックダウンすることができる。さらに、細胞ドナーとレシピエント対象がマッチしないか、またはハプロタイプが同一である場合、単一の染色体上の複数のHLA遺伝子座(例えば、HLA−A、−B、−C、および−DRB1)で個別の対立遺伝子の多重ノックアウトまたはノックダウンを、ドナー細胞中のミスマッチ(マッチしない)ハプロタイプを標的化する対立遺伝子特異的gRNA分子の共送達、続いてレシピエントマッチハプロタイプの供給によって、適用することができる。この多重ゲノム編集の例は、ドナーとレシピエント間のマッチングをそれぞれ3/6または4/8から6/6または8/8に増大し、これによって、ハプロタイプ同一のマッチドナー(例えば、染色体6の1コピーではHLA−A、−B、−C、−DRB1ミスマッチで、第2コピーは染色体6上でマッチ)を完全にマッチするドナーに変換し得る。しかし、1遺伝子座の双方の対立遺伝子(母系および父系)が、ドナーとレシピエントの間でミスマッチである(例えば、HLA−Aの両対立遺伝子)場合には、遺伝子特異的であるが、非対立遺伝子特異的gRNAを、遺伝子座の両アレル破壊のために、CRISPR/Cas9と一緒に用いることができる。いずれのシナリオでも、ノックアウトまたはノックダウンされる遺伝子をレシピエント特異的対立遺伝子で置換することにより、ドナーとレシピエント間のHLAマッチングを高めて、対象におけるHLA多様性を保持することができる。
1つまたは複数のHLA対立遺伝子がCRISPR/Cas9活性により不活性化されたことを検証するために、従来の方法(例えば、対立遺伝子特異的PCR、qRT−PCR、またはフローサイトメトリーの1つまたは複数)を用いて、標的化前および標的化後のドナー細胞を、対立遺伝子配列または対立遺伝子の発現の改変についてアッセイすることができる。一実施形態では、ゲノム編集を含むまたは含まないドナー細胞をNK細胞と一緒に共培養することができ、ドナー細胞に向けられた細胞傷害活性を定量して、HLA発現の下方制御を決定する。検証後に、不活性化された1つまたは複数のミスマッチドナーHLA対立遺伝子および/または導入された1つまたは複数のマッチレシピエントHLA対立遺伝子を有する細胞を未修飾細胞から、従来の選別方法により、富化、単離、または精製することができる。
マッチレシピエントHLA対立遺伝子をコードする核酸を従来のウイルスまたは非ウイルス送達方法によりドナー細胞に導入することができる。一実施形態では、核酸は、cDNA、例えば、レシピエントmRNAから逆転写されたcDNAである。別の実施形態では、核酸は、ゲノムDNA配列である。一実施形態では、複数のマッチレシピエントHLA対立遺伝子をコードする核酸を導入する。一実施形態では、1つまたは複数のマッチレシピエントHLA対立遺伝子をそれぞれコードする複数の核酸を導入する。
本明細書には、遺伝子または遺伝子座、例えば、HLA遺伝子または遺伝子座における標的位置(例えば、標的ノックアウト位置、標的ノックダウン位置、もしくは標的ノックイン位置)を改変する方法が開示される。標的位置の改変は、例えば、遺伝子における1つまたは複数の遺伝子座もしくは対立遺伝子変異体を改変することによって達成することができる。このアプローチでは、ミスマッチ対立遺伝子が1つまたは複数の特定の対立遺伝子変異体とマッチするように、これらの遺伝子を修飾する。例えば、ドナー細胞(例えば、HSPC)は、レシピエント対象に関連する1つまたは複数のHLA対立遺伝子とマッチするように修飾することができる。本明細書に記載される遺伝子の対立遺伝子変異体の改変は、ドナーとレシピエントの対象細胞間のHLAマッチングの程度を高める。本明細書に記載される方法は、あらゆる細胞型、例えば、本明細書に記載の細胞型で実施することができる。
(1)遺伝子のノックアウト:
(a)遺伝子中の1つまたは複数のヌクレオチドの挿入もしくは欠失(例えば、NHEJ媒介性挿入もしくは欠失)、または
(b)遺伝子の少なくとも一部を含む遺伝子配列の欠失(例えば、NHEJ媒介性欠失)、あるいは、
(2)遺伝子のプロモーター領域を標的化することによって、酵素的に不活性なCas9(eiCas9)分子またはeiCas9融合タンパク質(例えば、転写レプレッサー)により媒介される遺伝子のノックダウン、
(3)遺伝子へのノックイン(例えば、HDRによる)
によって達成することができる。
一実施形態では、本方法は、遺伝子座、例えば、HLA遺伝子座、例えば、HLA遺伝子座のコード領域(例えば、HLA−A、HLA−B、HLA−C、HLA−DRB1、HLA−DR3/4/5、HLA−DQ、例えば、DQB1、もしくはHLA−DP)内での1つまたは複数のヌクレオチドの挿入または欠失を導入するステップを含む。本明細書に記載される通り、一実施形態では、本方法は、HLA遺伝子座、例えば、HLA遺伝子座のコード領域(例えば、HLA−A、HLA−B、HLA−C、HLA−DRB1、HLA−DR3/4/5、HLA−DQ、例えば、DQB1、もしくはHLA−DP)内での1つまたは複数の切断(例えば、一本鎖切断もしくは二本鎖切断)の導入を含む。切断のNHEJ媒介性修復によって、HLA遺伝子座、例えば、HLA遺伝子座のコード領域(例えば、HLA−A、HLA−B、HLA−C、HLA−DRB1、HLA−DR3/4/5、HLA−DQ、例えば、DQB1、もしくはHLA−DP)内でのインデルのNHEJ媒介性導入が可能になる。
標的化ノックダウンアプローチは、機能性遺伝子産物、例えば、機能性HLA遺伝子産物(例えば、HLA−A、HLA−B、HLA−C、HLA−DRB1、HLA−DR3/4/5、HLA−DQ、例えば、DQB1、もしくはHLA−DP)の発現を低減または排除する。本明細書に記載される通り、一実施形態では、標的化ノックダウンは、酵素的に不活性なCas9(eiCas9)分子または転写レプレッサードメインもしくはクロマチン修飾タンパク質と融合したeiCas9を標的化して、HLA遺伝子の転写を改変する、例えば、その転写を遮断、抑制、または低減することによって媒介される。
本明細書には、遺伝子または遺伝子座、例えば、本明細書に記載の遺伝子または遺伝子座における標的位置(例えば、標的ノックイン位置)を改変する方法が開示される。一実施形態では、本方法は、標的化組み込みを含む。一実施形態では、本方法は、1つまたは複数のミスマッチHLA対立遺伝子が位置する本来の位置に1つまたは複数のマッチレシピエントHLA対立遺伝子を送達するステップを含む。一実施形態では、本方法は、「セーフ・ハーバー」遺伝子座に1つまたは複数のマッチレシピエントHLA対立遺伝子を挿入するステップを含む。一実施形態では、本方法は、遺伝子中の生体内選択のための化学療法耐性遺伝子を導入するステップをさらに含んでもよい。標的位置の改変は、例えば、遺伝子配列、例えば本明細書に記載の遺伝子配列(例えば、本明細書に記載の遺伝子の少なくとも1部分をコードするcDNA)を、例えばHDRにより、ノックインすることによって達成することができる。本明細書に記載の遺伝子配列のノックインは、レシピエントマッチHLA対立遺伝子の発現をもたらす。
1つまたは複数の同じ細胞における2つ以上の遺伝子もしくは遺伝子座の改変は、本明細書では「多重化」と呼ぶ。多重化は、1つまたは複数の同じ細胞における少なくとも2つの遺伝子もしくは遺伝子座(例えば、HLA遺伝子もしくは遺伝子座)の修飾を構成する。2つ以上の遺伝子または遺伝子座(例えば、HLA−A、HLA−B、HLA−C、HLA−DRB1、HLA−DRB3/4/5、HLA−DQ、HLA−DP、MiHA、およびいずれか他のMHCクラスIもしくはクラスII遺伝子または遺伝子座)を改変のために標的化する場合、2つ以上の遺伝子または遺伝子座を順次もしくは同時に改変することができる。一実施形態では、HLA遺伝子または遺伝子座の改変は、別のHLA遺伝子または遺伝子座の改変前もしくは改変後に行う。一実施形態では、HLA遺伝子または遺伝子座の改変は、別のHLA遺伝子または遺伝子座の改変と同時に行う。一実施形態では、2つ以上のHLA遺伝子または遺伝子座(例えば、HLA−AおよびHLA−DRB1)は、2つの標的位置に関与するゲノム再編集(例えば、転位)を導入する確率を低下させるために、順次改変する。一実施形態では、改変は、片アレルである。別の実施形態では、改変は、両アレルである。一実施形態では、改変の効果は、相乗的である。HLA遺伝子または遺伝子座の多重改変は、移植(例えば、HSCT)を必要とする対象に好適なドナーを提供し、GVHDの重症度および発生率を低減する、より高い尤度を達成する。
本明細書に記載される細胞、例えば、標的細胞は、例えば、生体外もしくは生体内で、最適化または操作することができる。標的細胞の最適化または操作によって、CRISPR/Cas9媒介性遺伝子編集または調節の維持、拡大、持続、もしくは調節が可能になる。例えば、標的細胞、例えば造血幹/前駆細胞(HSPC)などの最適化または操作によって、細胞適合性、機能性、自己再生、もしくは増殖能力を保持するか、またはオートファジー、アポトーシス、壊死、もしくは細胞老化による細胞死を阻止することができる。
細胞表面抗原または選択マーカーを発現する修飾標的細胞の精製は、CRISPR/Cas構成要素、例えば、Cas9分子、gRNA分子、またはその両方、および任意選択的に供与体テンプレート核酸が、細胞に、例えば、生体外で送達されたことを保証する手段を提供し得る。また、標的化細胞による細胞表面抗原の発現は、修飾標的細胞を生体内で追跡することも可能にする。
本明細書に記載される方法は、所望の特性を有する修飾標的細胞を選択もしくは拡大することができるか、または不要な特性(例えば、白血病性形質転換)を有する修飾標的細胞を排除することができるように、標的細胞の調節を生体内または生体外で可能にする。
ウイルス−宿主共進化の間に、mRNAのキャッピングを模倣するウイルスRNAキャッピングは進化して、ウイルスRNAが、細胞の自然免疫系からの検出を免れることを可能にした(Delcroy et al.,2012,Nature Reviews Microbiology 10:51−65)。幹細胞(例えば、HSPC)内のトール様受容体は、自然免疫応答、細胞老化、およびプログラム細胞死を引き起こし得る外来の一本鎖および二本鎖RNAの存在を感知する(Kajaste−Rudnitski and Naldini(2015)Human Gene Therapy 26:201−209)。初期実験の結果から、GFPmRNA単独で電気穿孔された細胞と比較して、非修飾(例えば、5’キャップもしくは3’ポリA−テールなしで合成されたgRNA)gRNA分子およびCas9mRNAと共に電気穿孔されたヒトHSPCは、細胞寿命、増殖能、または複能性の低減(例えば、赤血球分化能の喪失および歪んだ骨髄系分化能)を招くことが立証された。この課題に取り組むために、細胞の老化およびアポトーシスは、外来核酸の標的細胞感知および自然免疫応答の誘導、ならびにこれに続くプログラム細胞死の誘導および増殖および分化能の喪失によるものであった可能性があると仮定された。外来核酸に対する細胞の自然免疫応答を回避するために、mRNAを模倣するようにgRNA分子を修飾すること(例えば、5’キャップおよび3’ポリAテールの付加)によって、細胞における自然免疫応答、細胞におけるインターフェロン応答、細胞老化、または外来核酸の感知により起こるプログラム細胞死を阻止することができる。
本明細書に記載される方法および組成物は、疾患、例えば、本明細書に記載の疾患を治療または予防する治療法、例えば、1回療法または複数回投与療法を提供する。一部の実施形態では、疾患を治療または予防する方法は、細胞、例えば、本明細書に記載される細胞を例えば、生体外または生体内で改変する。疾患に関連するあらゆる型の細胞を本明細書に記載の方法で改変することができる。例えば、細胞は、循環血球、動員血球、骨髄細胞、骨髄前駆細胞、リンパ球前駆細胞、造血幹/前駆細胞(HSPC)、複能性前駆細胞、系列特異的前駆細胞、内皮細胞、または間葉系間質細胞である。別の実施形態では、疾患を治療または予防する方法は、遺伝子、例えば、本明細書に記載される遺伝子を、例えばCRISPR/Cas媒介性遺伝子編集によって改変する。細胞または遺伝子の改変(例えば、修正、ノックアウト、ノックイン、ノックダウン、または活性化)は、疾患の発症前または疾患の発症後に実施することができる。本明細書に記載される方法により治療または予防することができる例示的な疾患として、限定はしないが、表16に列記する疾患が挙げられる。本明細書に記載される方法により改変することができる例示的な遺伝子として、限定はしないが、表16に列記する遺伝子が挙げられる。
遺伝性血液遺伝疾患(例えば、鎌状赤血球症)または悪性疾患(例えば、白血病)を患う対象へのドナー同種異系HSCの移植は、レシピエント患者に置換機能性造血系を提供し得る。部分的にマッチするドナー候補と、移植片を必要とするレシピエント対象との間のHLAマッチングを増大するために、ドナー細胞が遺伝子修飾される場合。このシナリオでは、次善最適HLAマッチング(例えば、6遺伝子座のうち3である、ドナー候補とレシピエント対象間のマッチング)に基づいて、好適なドナーとして通常除外されるはずのドナー候補が、1つまたは複数のHLA遺伝子座の遺伝子編集後(例えば、3/6から4/6、5/6、または6/6までマッチングを増加)にドナーとして適格となり得る。しかし、1つまたは複数のHLA遺伝子座の1つまたは複数のHLA対立遺伝子の遺伝子編集は、ミスマッチを低減し得るため、HSC移植を必要とする患者に対するHSCドナーとして適格となるのに好適なレベルのHLAマッチングをもたらす(例えば、HLA遺伝子座で4/6、5/6、または6/6マッチング)。マッチングを高めるためのドナーHSCの遺伝子編集がなければ、レシピエントは、好適なドナーを得られなくなる(例えば、HLA遺伝子座で3/6マッチング)。治療を目的として、レシピエントについて部分的にマッチするドナー(例えば、3/6)を同定し、データベースに入力すると、これは、1つまたは複数のミスマッチHLA対立遺伝子の欠失を標的化するために使用することができるgRNAを出力する。遺伝子編集のための最善の戦略(最も低いオフターゲットプロフィール、最も高いオンターゲットプロフィールを有し、多重化の場合には、対向染色体での標的化対立遺伝子編集を促進するgRNA)、ならびに最も好適なドナー候補(例えば、HLAマッチ対立遺伝子で同型接合、miHAで最大のマッチング度、より近い系統バックグラウンド)が選択される。遺伝子編集の効率は、ドナーT細胞で試験される(末梢血T細胞と比較して供給が限定される、ドナーHSCの修飾前)。ドナーHSCは、マッチングを増加するように遺伝子編集された後、修飾HSCをレシピエント患者に移植することもできる。手短には、HSCをドナーから収集し、生体外でゲノム編集して、ミスマッチHLAを欠失または破壊した後、免疫磁気ビーズ戦略(例えば、CliniMACもしくはProdigy)を用いて選別することにより、HLA対立遺伝子陰性画分(例えば、陰性選択のための磁気ビーズに共役したHLA対立遺伝子特異的抗体を含む)を富化する。次に、レシピエントに対するミスマッチが低減したHSCを患者に注入する。しかし、1つの遺伝子座の2つの異なる対立遺伝子を編集する必要がある場合、もう1つの戦略は、HDRアプローチによる対立遺伝子置換である。HSC生着の後、HSCは、HSC子孫(例えば、血液系列、例えば、骨髄細胞、リンパ球、ミクログリア)が低いGVHDのリスクを有するように、血液系列を再構成することができる。
同種異系HSC移植を受けている対象は、移植直後の期間に日和見感染のリスクがある。対象は、HSC移植の準備のために骨髄破壊的前処置レジメンを受けるが、これは、感染を予防する働きをするT細胞をさらに欠失させる。免疫再構成は、対象において数ヵ月を要し得る。この期間中、ドナー由来のHSCは、T細胞に分化し、胸腺に移動し、抗原に曝露されて、適応免疫を再構成し始める。
角膜移植拒絶率を低減するためのドナー角膜における1、2もしくは3つのHLA−A、HLA−Bおよび/またはHLA−DRB1対立遺伝子の生体外破壊(例えば、ノックアウト)
角膜移植は、米国および世界中で一般的な処置である。毎年米国では、40,000人を超える患者が角膜移植を受けている。(Eye Bank Association of America 2014 Eye Banking Statistical Report.Available at http://www.restoresight.org/wp−content/uploads/2015/03/2014_Statistical_Report−FINAL.pdf.Accessed:June 16, 2015)。角膜移植は、角膜の混濁および視力障害を引き起こす角膜ジストロフィー、感染症および外傷について適用される。
gRNA分子は、この用語の本明細書の用法では、標的核酸へのgRNA分子/Cas9分子複合体の特異的ターゲティングまたはホーミングを促進する核酸である。gRNA分子は、本明細書では「キメラ」gRNA、もしくはモジュラー(2つ以上、典型的には2つの個別のRNA分子を含む)と呼ぶことがある単分子(単一のRNA分子を有する)であってよい。本明細書に提供されるgRNA分子は、特定の遺伝子座、例えば、HLA−A、HLA−B、HLA−C、HLA−DRB1、HLA−DRB3/4/5、もしくはHLA−DQB1の対立遺伝子変異体の配列内またはその付近の標的核酸配列と完全もしくは部分的に相補的な核酸配列を含むか、それから構成されるか、またはほぼ構成される標的化ドメインを含む。特定の実施形態では、gRNA分子は、例えば、第1の相補性ドメイン、結合ドメイン、第2の相補性ドメイン、隣接ドメイン、テールドメイン、および5’伸長ドメインをはじめとする1つまたは複数の追加ドメインをさらに含む。これらのドメインの各々については、以下にさらに詳しく述べる。特定の実施形態では、gRNA分子中の1つまたは複数のドメインは、例えば、S.ピオゲネス(S.pyogenes)、S.アウレウス(S.aureus)またはS.サーモフィルス(S.thermophilus)に由来する天然に存在する配列と同一の、またはそれと配列相同性を有するアミノ酸配列を含む。
標的化ドメイン(あるいは、ガイド配列または相補性領域と呼ばれることもある)は、特定の遺伝子座、例えば、HLA−A、HLA−B、HLA−C、HLA−DRB1、HLA−DRB3/4/5、もしくはHLA−DQB1の対立遺伝子変異体の配列内もしくはその付近の核酸配列と相補的であるか、または部分的に相補的な核酸配列を含むか、これから構成されるか、またはほぼこれから構成される。標的化ドメインの全部もしくは一部が相補的であるか、または部分的に相補的である、特定の遺伝子座、例えば、HLA−A、HLA−B、HLA−C、HLA−DRB1、HLA−DRB3/4/5、もしくはHLA−DQB1の対立遺伝子変異体の配列内もしくはその付近の核酸配列は、本明細書では標的ドメインと呼ぶ。特定の実施形態では、標的ドメインは、標的位置を含む。他の実施形態では、標的位置は、標的ドメインの外部(すなわち、その上流もしくは下流)にある。
第1および第2の相補性(それぞれ、crRNA由来のヘアピン配列およびtracrRNA由来のヘアピン配列と呼ばれることもある)ドメインは、互いに完全または部分的に相補的である。特定の実施形態では、相補性の程度は、2つのドメインが少なくともいくつかの生理学的条件下で二本鎖領域を形成するのに十分である。特定の実施形態では、第1および第2の相補性ドメイン同士の相補性の程度は、gRNAの他の特性と共に、Cas9分子の標的核酸への標的化を可能にする上で十分である。第1および第2の相補性ドメインの例は、図1A〜1Gに示す。
単分子またはキメラgRNA中では、連結ドメインは、第1および第2の相補性ドメインの間に配置されて、これらを結合する働きをする。図1B〜1Eは、結合ドメインの例を提供する。特定の実施形態では、連結ドメインの一部は、crRNA由来領域から、別の部分は、tracrRNA由来領域からのものである。
一実施形態では、本明細書に開示されるモジュラーgRNAは、5’伸長ドメイン、すなわち、第2の相補性ドメインの5’側に1つまたは複数の追加ヌクレオチドを含む(例えば、図1Aを参照)。特定の実施形態では、5’伸長ドメインは、2〜10以上、2〜9、2〜8、2〜7、2〜6、2〜5、または2〜4ヌクレオチド長であり、これらの実施形態のいくつかでは、5’伸長ドメインは、2、3、4、5、6、7、8、9、または10ヌクレオチド長以上である。
図1A〜1Gは、隣接ドメインの例を提供する。特定の実施形態では、隣接ドメインは、5〜20ヌクレオチド長、例えば、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、または26ヌクレオチド長である。これらの実施形態のいくつかでは、隣接ドメインは、6+/−2、7+/−2、8+/−2、9+/−2、10+/−2、11+/−2、12+/−2、13+/−2、14+/−2、14+/−2、16+/−2、17+/−2、18+/−2、19+/−2、または20+/−2ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、隣接ドメインは、5〜20、7〜18、9〜16、または10〜14ヌクレオチド長である。
多様なテールドメインが、本明細書に開示されるgRNA分子での使用に好適である。図1Aおよび図1C〜1Gは、そのようなテールドメインの例を提供する。
T7RNAポリメラーゼが、転写を開始するためにGを必要とすることを考慮すれば、T7プロモーターは、プロモーター下流のgRNA配列全体の転写を確実にするために、典型的にはその3’末端に2つのGを有する(例えば、
特定の実施形態では、本明細書に開示される単分子またはキメラgRNAは、5’[標的化ドメイン]−[第1の相補性ドメイン]−[連結ドメイン]−[第2の相補性ドメイン]−[隣接ドメイン]−[テールドメイン]−3’の構造を有し、
式中、
標的化ドメインは、コアドメインおよび任意選択的に二次ドメインを含み、10〜50ヌクレオチド長であり;
第1の相補性ドメインは、5〜25ヌクレオチド長であり、特定の実施形態では、本明細書で開示される参照の第1の相補性ドメインと、少なくとも50、60、70、80、85、90、または95%の相同性を有し;
連結ドメインは、1〜5ヌクレオチド長であり;
第2の相補性ドメインは、5〜27ヌクレオチド長であり、特定の実施形態では、本明細書で開示される参照の第2の相補性ドメインと、少なくとも50、60、70、80、85、90、または95%の相同性を有し;
隣接ドメインは、5〜20ヌクレオチド長であり、特定の実施形態では、本明細書で開示される参照隣接相補性ドメインと、少なくとも50、60、70、80、85、90、または95%の相同性を有し;
および
テールドメインは非存在であり、またはヌクレオチド配列は、1〜50ヌクレオチド長であり、特定の実施形態では、本明細書で開示される参照テールドメインと、少なくとも50、60、70、80、85、90、または95%の相同性を有する。
式中、
(a)隣接およびテールドメインは、一緒になって、少なくとも15、18、20、25、30、31、35、40、45、49、50、もしくは53ヌクレオチドを含み;
(b)第2の相補性ドメインの最後のヌクレオチドの3’側に少なくとも15、18、20、25、30、31、35、40、45、49、50、もしくは53ヌクレオチドがあり;または
(c)第1の相補性ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な第2の相補性ドメインの最後のヌクレオチドの3’側に、少なくとも16、19、21、26、31、32、36、41、46、50、51、または54ヌクレオチドがある。
特定の実施形態では、本明細書に開示されるモジュラーgRNAは、好ましくは、5’から3方向に以下;例えば、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、または26ヌクレオチドを含む標的化ドメイン;第1の相補性ドメインを含む第1鎖と;好ましくは、5’から3方向に以下:任意選択的に5’伸長ドメイン;第2の相補性ドメイン;隣接ドメイン;およびテールドメインを含む第2鎖とを含み、
式中、
(a)隣接およびテールドメインは、一緒になって、少なくとも15、18、20、25、30、31、35、40、45、49、50、もしくは53ヌクレオチドを含み;
(b)第2の相補性ドメインの最後のヌクレオチドの3’側に少なくとも15、18、20、25、30、31、35、40、45、49、50、もしくは53ヌクレオチドがあり;または
(c)第1の相補性ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な第2の相補性ドメインの最後のヌクレオチドの3’側に、少なくとも16、19、21、26、31、32、36、41、46、50、51、または54ヌクレオチドがある。
本明細書に提供される方法の特定の実施形態では、本方法は、本明細書に記載される1つまたは複数(例えば、2つ、3つ、もしくは4つ)のgRNA分子の送達を含む。これらの実施形態のいくつかでは、gRNA分子は、肝臓内注射、肝臓への実質内注射、肺への実質内注射、門脈への静脈内注射、静脈内注射、筋肉内注射、皮下注射、または吸入により送達される。
標的ドメインを選択し、デザインし、検証する方法をはじめとする、gRNAをデザインする方法が本明細書に記載される。例示的な標的化ドメインもまた、本明細書で提供される。本明細書で考察される標的化ドメインは、本明細書に記載されるgRNAに組み込むことができる。
gRNA対は、DNA上で、PAM上が外側を向き、D10A Cas9ニッカーゼによる切断が、5’オーバーハングをもたらすような配向であるべきである。
多様な生物種のCas9分子が、本明細書に記載される方法および組成物で使用され得る。S.ピオゲネス(S.pyogenes)およびS.アウレウス(S.aureus)Cas9分子が、本明細書の開示の多くの対象である一方で、本明細書で列挙されるその他の生物種からの、それに由来する、またはそのCas9タンパク質をベースとする、Cas9分子もまた使用され得る。これらは、例えば、アシドボラクス・アベナエ(Acidovorax avenae)、アクチノバチルス・プルロニューモニアエ(Actinobacillus pleuropneumoniae)、アクチノバチルス・サクシノゲネス(Actinobacillus succinogenes)、アクチノバチルス・スイス(Actinobacillus suis)、アクチノミセス属(Actinomyces)種、アリシクリフィルス・デニトリフィカンス(cycliphilus denitrificans)、アミノモナス・パウシボランス(Aminomonas paucivorans)、バチルス・セレウス(Bacillus cereus)、バチルス・スミシイ(Bacillus smithii)、バチルス・チューリンギエンシス(Bacillus thuringiensis)、バクテロイデス属(Bacteroides)種、ブラストピレルラ・マリナ(Blastopirellula marina)、ブラディリゾビウム属(Bradyrhizobium)種、ブレビバチルス・ラテロスポラス(Brevibacillus laterosporus)、カンピロバクター・コリ(Campylobacter coli)、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)、カンピロバクター・ラリ(Campylobacter lari)、カンジダツス・プニセイスピリルム(Candidatus Puniceispirillum)、クロストリジウム・セルロリチカム(Clostridium cellulolyticum)、クロストリジウム・パーフリンゲンス(Clostridium perfringens)、コリネバクテリウム・アクコレンス(Corynebacterium accolens)、コリネバクテリウム・ジフテリア(Corynebacterium diphtheria)、コリネバクテリウム・マトルコチイ(Corynebacterium matruchotii)、ディノロセオバクター・シバエ(Dinoroseobacter shibae)、ユウバクテリウム・ドリクム(Eubacterium dolichum)、ガンマプロテオバクテリア綱(gammaproteobacterium)、グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィクス(Gluconacetobacter diazotrophicus)、ヘモフィルス・パラインフルエンザエ(Haemophilus parainfluenzae)、ヘモフィルス・スプトラム(Haemophilus sputorum)、ヘリコバクター・カナデンシス(Helicobacter canadensis)、ヘリコバクター・シナエディ(Helicobacter cinaedi)、ヘリコバクター・ムステラエ(Helicobacter mustelae)、イリオバクター・ポリトロパス(Ilyobacter polytropus)、キンゲラ・キンガエ(Kingella kingae)、ラクトバチルス・クリスパータス(Lactobacillus crispatus)、リステリア・イバノビイ(Listeria ivanovii)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、リステリア科(Listeriaceae)細菌、メチロシスチス科(Methylocystis)種、メチロシナス・トリコスポリウム(Methylosinus trichosporium)、モビルンカス・ムリエリス(Mobiluncus mulieris)、ナイセリア・バシリフォルミス(Neisseria bacilliformis)、ナイセリア・シネレア(Neisseria cinerea)、ナイセリア・フラベッセンス(Neisseria flavescens)、ナイセリア・ラクタミカ(Neisseria lactamica)、ナイセリア属(Neisseria)種、ナイセリア・ワズワーシイ(Neisseria wadsworthii)、ニトロソモナス属(Nitrosomonas)種、パルビバクラム・ラバメンチボランス(Parvibaculum lavamentivorans)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、ファスコラークトバクテリウム・スクシナテュテンス(Phascolarctobacterium succinatutens)、ラルストニア・シジジイ(Ralstonia syzygii)、ロドシュードモナス・パルストリス(Rhodopseudomonas palustris)、ロドブラム属(Rhodovulum)種、シモンシエラ・ムエレリ(Simonsiella muelleri)、スフィンゴモナス属(Sphingomonas)種、スポロラクトバチルス・ビネア(Sporolactobacillus vineae)、スタフィロコッカス・ルグドゥネンシス(Staphylococcus lugdunensis)、ストレプトコッカス属(Streptococcus)種、サブドリグラヌルム属(Subdoligranulum)種、チストレラ・モビリス(Tistrella mobilis)、トレポネーマ属(Treponema)種、またはベルミネフロバクター・エイセニア(Verminephrobacter eiseniae)からのCas9分子を含む。
2つの異なる天然細菌Cas9分子について、結晶構造が決定されている。非結合状態のS.ピオゲネス(S.pyogenes)Cas9の結晶構造が、Jinek et al.,Science,2014 Mar 14;343(6176):1247997に記載されている。単一のgRNAを有する複合体におけるS.ピオゲネス(S.pyogenes)Cas9の結晶構造は、Jiang et al.;Science.2015 Jun 26;348(6242):1477−81に開示されている。単一のgRNAとの複合体としてのS.ピオゲネス(S.pyogenes)Cas9の結晶構造(例えば、crRNAとtracrRNAの合成融合物)とその標的DNAは、Nishimasu et al.,Cell,2014 Feb 27;156(5):935−49;Anders et al.,Nature.2014 Sep 25;513(7519):569−73に記載されている。単一のガイドRNA(sgRNA)との複合体としてのS.アウレウス(S.aureus)Cas9の結晶構造とその二本鎖DNA標的は、Nishimasu et al.,Cell,2015 Aug 27;162(5):1113−26に開示されている。
特定の実施形態では、Cas9分子またはCas9ポリペプチドは、HNH様ドメインおよびRuvC様ドメインを含み、これらの特定の実施形態では、切断活性は、RuvC様ドメインおよびHNH様ドメインに依存する。Cas9分子またはCas9ポリペプチドは、RuvC様ドメインおよびHNH様ドメインのドメインの1つまたは複数を含み得る。特定の実施形態では、Cas9分子またはCas9ポリペプチドは、例えば、以下に記載されるRuvC様ドメイン、および/または例えば、以下に記載されるHNH様ドメインなどのHNH様ドメインなどのRuvC様ドメインを含む。
特定の実施形態では、RuvC様ドメインは、例えば、標的核酸分子の非相補鎖などの一本鎖を切断する。Cas9分子またはCas9ポリペプチドは、2つ以上のRuvC様ドメイン(例えば、1、2、3つ以上のRuvC様ドメイン)を含み得る。特定の実施形態では、RuvC様ドメインは、少なくとも5、6、7、8アミノ酸長であるが、20、19、18、17、16または15アミノ酸長以下である。特定の実施形態では、Cas9分子またはCas9ポリペプチドは、例えば、約15アミノ酸長などの約10〜20個のアミノ酸のN末端RuvC様ドメインを含む。
いくつかの天然Cas9分子は、2つ以上のRuvC様ドメインを含み、切断はN末端RuvC様ドメインに依存する。したがって、Cas9分子またはCas9ポリペプチドは、N末端RuvC様ドメインを含み得る。代表的なN末端RuvC様ドメインは、以下に記載される。
D−X1−G−X2−X3−X4−X5−G−X6−X7−X8−X9(配列番号20)
のアミノ酸配列を含む、N末端RuvC様ドメインを含み、
式中、
X1は、I、V、M、L、およびTから選択され(例えば、I、V、およびLから選択され);
X2は、T、I、V、S、N、Y、E、およびLから選択され(例えば、T、V、およびIから選択され);
X3は、N、S、G、A、D、T、R、M、およびF(例えば、AまたはN)から選択され;
X4は、S、Y、N、およびF(例えば、S)から選択され;
X5は、V、I、L、C、T、およびFから選択され(例えば、V、I、およびLから選択され);
X6は、W、F、V、Y、S、およびL(例えば、W)から選択され;
X7は、A、S、C、V、およびGから選択され(例えば、AおよびSから選択され);
X8は、V、I、L、A、M、およびHから選択され(例えば、V、I、M、およびLから選択され);
X9は、任意のアミノ酸から選択され、または不在である(例えば、T、V、I、L、Δ、F、S、A、Y、M、およびRから選択され、または、例えば、T、V、I、L、およびΔから選択される)。
D−X1−G−X2−X3−S−X5−G−X6−X7−X8−X9(配列番号21)
のアミノ酸配列を含む、N末端RuvC様ドメインを含み、
式中、
X1は、I、V、M、LおよびTから選択され(例えば、I、V、およびLから選択され);
X2は、T、I、V、S、N、Y、E、およびLから選択され(例えば、T、V、およびIから選択され);
X3は、N、S、G、A、D、T、R、M、およびF(例えば、AまたはN)から選択され;
X5は、V、I、L、C、T、およびFから選択され(例えば、V、IおよびLから選択され);
X6は、W、F、V、Y、SおよびL(例えば、W)から選択され;
X7は、A、S、C、VおよびGから選択され(例えば、AおよびSから選択され);
X8は、V、I、L、A、MおよびHから選択され(例えば、V、I、MおよびLから選択され);
X9は、任意のアミノ酸から選択されるか、または非存在である(例えば、T、V、I、L、Δ、F、S、A、Y、MおよびRから選択されるか、または例えば、T、V、I、L、およびΔから選択される)。
D−I−G−X2−X3−S−V−G−W−A−X8−X9(配列番号22)
のアミノ酸配列を含み、
式中、
X2は、T、I、V、S、N、Y、E、およびLから選択され(例えば、T、V、およびIから選択され);
X3は、N、S、G、A、D、T、R、M、およびF(例えば、AまたはN)から選択され;
X8は、V、I、L、A、MおよびHから選択され(例えば、V、I、MおよびLから選択され);
X9は、任意のアミノ酸から選択されるか、または非存在であり(例えば、T、V、I、L、Δ、F、S、A、Y、MおよびRから選択されるか、または例えば、T、V、I、L、およびΔから選択される)。
D−I−G−T−N−S−V−G−W−A−V−X(配列番号23)
のアミノ酸配列を含んでなり、
式中、
Xは、非極性アルキルアミノ酸またはヒドロキシルアミノ酸であり、例えば、Xは、V、I、L、およびTから選択される(例えば、Cas9分子は、図2A〜2Gに示されるN末端RuvC様ドメインを含み得る(Yとして示される))。
N末端RuvC様ドメインに加えて、Cas9分子またはCas9ポリペプチドは、1つまたは複数の追加的RuvC様ドメインを含み得る。特定の実施形態では、Cas9分子またはCas9ポリペプチドは、2つの追加的RuvC様ドメインを含み得る。好ましくは、追加的RuvC様ドメインは、例えば、15未満のアミノ酸長、例えば、5〜10アミノ酸長、例えば、8アミノ酸長などの少なくとも5アミノ酸長である。
I−X1−X2−E−X3−A−R−E(配列番号15)
のアミノ酸配列を含んでよく、
式中、
X1は、VまたはHであり;
X2は、I、LまたはV(例えば、IまたはV)であり;
X3は、MまたはTである。
I−V−X2−E−M−A−R−E(配列番号16)
のアミノ酸配列を含んでなり、
式中、
X2は、I、LまたはV(例えば、IまたはV)である(例えば、Cas9分子またはCas9ポリペプチドは、図2A〜2Gに示される、追加的RuvC様ドメインを含み得る(Bとして示される))。
H−H−A−X1−D−A−X2−X3(配列番号17)
のアミノ酸配列を含んでもよく、
式中、
X1は、HまたはLであり;
X2は、RまたはVであり;
X3は、EまたはVである。
H−H−A−H−D−A−Y−L(配列番号18)
のアミノ酸配列を含む。
式中、
X1’は、KおよびPから選択され、
X2’はV、L、I、およびF(例えばV、I、およびL)から選択され;
X3’は、G、A、およびS(例えば、G)から選択され;
X4’はL、I、V、およびF(例えば、L)から選択され;
X9’は、D、E、N、およびQから選択され;
Zは、例えば、上述されるような、例えば、5〜12アミノ酸を有するN末端RuvC様ドメインである。
一実施形態では、HNH様ドメインは、例えば、二本鎖核酸分子の相補鎖などの一本鎖相補的ドメインを切断する。特定の実施形態では、HNH様ドメインは、少なくとも15、20、または25アミノ酸長であるが、40、35または30以下のアミノ酸長であり、例えば、20〜35アミノ酸長、例えば、25〜30アミノ酸長である。代表的なHNH様ドメインは、以下に記載される。
式中、
X1は、D、E、Q、およびN(例えば、DおよびE)から選択され;
X2は、L、I、R、Q、V、M、およびKから選択され;
X3は、DおよびEから選択され;
X4は、I、V、T、A、およびL(例えば、A、I、およびV)から選択され;
X5は、V、Y、I、L、F、およびW(例えば、V、I、およびL)から選択され;
X6は、Q、H、R、K、Y、I、L、F、およびWから選択され;
X7は、S、A、D、T、およびK(例えば、SおよびA)から選択され;
X8は、F、L、V、K、Y、M、I、R、A、E、D、およびQ(例えば、F)から選択され;
X9は、L、R、T、I、V、S、C、Y、K、F、およびGから選択され;
X10は、K、Q、Y、T、F、L、W、M、A、E、G、およびSから選択され;
X11は、D、S、N、R、L、およびT(例えば、D)から選択され;
X12は、D、N、およびSから選択され;
X13は、S、A、T、G、およびR(例えば、S)から選択され;
X14は、I、L、F、S、R、Y、Q、W、D、K、およびH(例えば、I、L、およびF)から選択され;
X15は、D、S、I、N、E、A、H、F、L、Q、M、G、Y、およびVから選択され;
X16は、K、L、R、M、T、およびF(例えば、L、R、およびK)から選択され;
X17は、V、L、I、A、およびTから選択され;
X18は、L、I、V、およびA(例えば、LおよびI)から選択され;
X19は、T、V、C、E、S、およびA(例えば、TおよびV)から選択され;
X20は、R、F、T、W、E、L、N、C、K、V、S、Q、I、Y、H、およびAから選択され;
X21は、S、P、R、K、N、A、H、Q、G、およびLから選択され;
X22は、D、G、T、N、S、K、A、I、E、L、Q、R、およびYから選択され;
X23は、K、V、A、E、Y、I、C、L、S、T、G、K、M、D、およびFから選択される。
X1−X2−X3−H−X4−X5−P−X6−S−X8−X9−X10−D−D−S−X14−X15−N−K−V−L−X19−X20−X21−X22−X23−N(配列番号26)
のアミノ酸配列を含むHNH様ドメインを含み、
式中、
X1は、DおよびEから選択され;
X2は、L、I、R、Q、V、M、およびKから選択され;
X3は、DおよびEから選択され;
X4は、I、V、T、A、およびL(例えば、A、I、およびV)から選択され;
X5は、V、Y、I、L、F、およびW(例えば、V、I、およびL)から選択され;
X6は、Q、H、R、K、Y、I、L、F、およびWから選択され;
X8は、F、L、V、K、Y、M、I、R、A、E、D、およびQ(例えば、F)から選択され;
X9は、L、R、T、I、V、S、C、Y、K、F、およびGから選択され;
X10は、K、Q、Y、T、F、L、W、M、A、E、G、およびSから選択され;
X14は、I、L、F、S、R、Y、Q、W、D、K、およびH(例えば、I、L、およびF)から選択され;
X15は、D、S、I、N、E、A、H、F、L、Q、M、G、Y、およびVから選択され;
X19は、T、V、C、E、S、およびA(例えば、TおよびV)から選択され;
X20は、R、F、T、W、E、L、N、C、K、V、S、Q、I、Y、H、およびAから選択され;
X21は、S、P、R、K、N、A、H、Q、G、およびLから選択され;
X22は、D、G、T、N、S、K、A、I、E、L、Q、R、およびYから選択され;
X23は、K、V、A、E、Y、I、C、L、S、T、G、K、M、D、およびFから選択される。
X1−V−X3−H−I−V−P−X6−S−X8−X9−X10−D−D−S−X14−X15−N−K−V−L−T−X20−X21−X22−X23−N(配列番号27)のアミノ酸配列を含むHNH様ドメインを含む。
式中、
X1は、DおよびEから選択され;
X3は、DおよびEから選択され;
X6は、Q、H、R、K、Y、I、L、およびWから選択され;
X8は、F、L、V、K、Y、M、I、R、A、E、D、およびQ(例えば、F)から選択され;
X9は、L、R、T、I、V、S、C、Y、K、F、およびGから選択され;
X10は、K、Q、Y、T、F、L、W、M、A、E、G、およびSから選択され;
X14は、I、L、F、S、R、Y、Q、W、D、K、およびH(例えば、I、L、およびF)から選択され;
X15は、D、S、I、N、E、A、H、F、L、Q、M、G、Y、およびVから選択され;
X20は、R、F、T、W、E、L、N、C、K、V、S、Q、I、Y、H、およびAから選択され;
X21は、S、P、R、K、N、A、H、Q、G、およびLから選択され;
X22は、D、G、T、N、S、K、A、I、E、L、Q、R、およびYから選択され;
X23は、K、V、A、E、Y、I、C、L、S、T、G、K、M、D、およびFから選択される。
のアミノ酸配列を有するHNH様ドメインを含む。
式中、
X2は、IおよびVから選択され;
X5は、IおよびVから選択され;
X7は、AおよびSから選択され;
X9は、IおよびLから選択され;
X10は、KおよびTから選択され;
X12は、DおよびNから選択され;
X16は、R、K、およびLから選択され;X19は、TおよびVから選択され;
X20は、SおよびRから選択され;
X22は、K、D、およびAから選択され;
X23は、E、K、G、およびNから選択される(例えば、eaCas9分子またはeaCas9ポリペプチドは、本明細書に記載されるようなHNH様ドメインを含み得る)。
L−Y−Y−L−Q−N−G−X1’−D−M−Y−X2’−X3’−X4’−X5’−L−D−I−X6’−X7’−L−S−X8’−Y−Z−N−R−X9’−K−X10’−D−X11’−V−P(配列番号24)
のアミノ酸配列を含む。
式中、
X1’は、KおよびRから選択され;
X2’は、VおよびTから選択され;
X3’は、GおよびDから選択され;
X4’は、E、Q、およびDから選択され;
X5’は、EおよびDから選択され;
X6’は、D、N、およびHから選択され;
X7’は、Y、R、およびNから選択され;
X8’は、Q、D、およびNから選択され;X9’は、GおよびEから選択され;
X10’は、SおよびGから選択され;
X11’は、DおよびNから選択され;および
Zは、例えば、上述されるようなHNH様ドメインである。
いくつかの実施形態では、国際公開第15/089427号および同第14/018423号パンフレット(その各々の全内容を参照により本明細書に明示的に組み込む)にさらに詳述されているように、Cas9融合分子は、分断Cas9分子を含む。分断Cas9分子については以下に簡単にまとめる。
特定の実施形態では、Cas9分子またはCas9ポリペプチドは、標的核酸分子を切断する能力がある。典型的に野性型Cas9分子は、標的核酸分子の双方の鎖を切断する。Cas9分子およびCas9ポリペプチドを遺伝子操作して、ヌクレアーゼ切断(またはその他の性質)を改変して、例えば、ニッカーゼである、または標的核酸を切断する能力を欠く、Cas9分子またはCas9ポリペプチドを提供し得る。標的核酸分子を切断する能力があるCas9分子またはCas9ポリペプチドは、本明細書でeaCas9分子(酵素的に活性なCas9)またはeaCas9ポリペプチドと称される。
ニッカーゼ活性、すなわち、例えば、核酸分子の非相補鎖または相補鎖などの一本鎖を切断する能力;
特定の実施形態では2つのニッカーゼ活性の存在である、二本鎖ヌクレアーゼ活性、すなわち、二本鎖核酸の双方の鎖を切断して、二本鎖切断を生成する能力;
エンドヌクレアーゼ活性;
エキソヌクレアーゼ活性;および
ヘリカーゼ活性、すなわち、二本鎖核酸のらせん構造を巻き戻す能力。
Cas9分子またはCas9ポリペプチドはgRNA分子と相互作用することができ、gRNA分子と協調して、標的ドメイン、および特定の実施形態では、aPAM配列を含む部位に局在する。
配列番号1、2、4〜6、または12と、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の相同性を有し;
比較すると、2、5、10、15、20、30、または40%以下のアミノ酸残基が異なり;
少なくとも1、2、5、10または20個のアミノ酸であるが、100、80、70、60、50、40または30個以下のアミノ酸が異なり;または
本明細書に記載される任意のCas9分子配列、または例えば、本明細書で列挙され、または生物種に由来するCas9分子などの天然Cas9分子配列と同一であるアミノ酸配列を含む(例えば、配列番号1〜4あるいはChylinski 2013に記載される)。一実施形態では、Cas9分子またはCas9ポリペプチドは、以下の機能の1つまたは複数を含む:ニッカーゼ活性;二本鎖切断活性(例えば、エンドヌクレアーゼおよび/またはエキソヌクレアーゼ活性);ヘリカーゼ活性;またはgRNA分子と一緒に、標的核酸に局在する能力。
領域1(残基1〜180、または領域1の場合は残基120〜180)
領域2(残基360〜480);
領域3(残基660〜720);
領域4(残基817〜900);および
領域5(残基900〜960)。
S.ピオゲネス(S.pyogenes)のCas9のアミノ酸配列のアミノ酸1〜180と、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%または99%の相同性を有し(番号付与は図2のモチーフ配列に準拠する;図2A〜2Gの4つのCas9配列中の残基の52%が保存されている);
S.ピオゲネス(S.pyogenes)、S.サーモフィルス(S.thermophilus)、S.ミュータンス(S.mutans)、またはリステリア・イノキュア(Listeria innocua)のCas9のアミノ酸配列のアミノ酸1〜180と、少なくとも1、2、5、10または20個のアミノ酸、但し90、80、70、60、50、40または30個以下のアミノ酸が異なり;または
S.ピオゲネス(S.pyogenes)、S.サーモフィルス(S.thermophilus)、S.ミュータンス(S.mutans)、またはL.イノキュア(L.innocua)のCas9のアミノ酸配列のアミノ酸1〜180と同一である。
S.ピオゲネス(S.pyogenes)、S.サーモフィルス(S.thermophilus)、S.ミュータンス(S.mutans)、またはL.イノキュア(L.innocua)のCas9のアミノ酸配列のアミノ酸120〜180と55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%または99%の相同性を有し(図2の4つのCas9配列中の残基の55%が保存されている);
S.ピオゲネス(S.pyogenes)、S.サーモフィルス(S.thermophilus)、S.ミュータンス(S.mutans)、または、L.イノキュア(L.innocua)のCas9のアミノ酸配列のアミノ酸120〜180と、少なくとも1、2、または5個のアミノ酸、但し35、30、25、20または10個以下のアミノ酸が異なり;あるいは、
S.ピオゲネス(S.pyogenes)、S.サーモフィルス(S.thermophilus)、S.ミュータンス(S.mutans)、またはL.イノキュア(L.innocua)のCas9のアミノ酸配列の120〜180と同一である。
S.ピオゲネス(S.pyogenes)、S.サーモフィルス(S.thermophilus)、S.ミュータンス(S.mutans)、またはL.イノキュア(L.innocua)のCas9のアミノ酸配列のアミノ酸360〜480と50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%または99%の相同性を有し(図2の4つのCas9配列中の残基の52%が保存されている);
S.ピオゲネス(S.pyogenes)、S.サーモフィルス(S.thermophilus)、S.ミュータンス(S.mutans)、または、L.イノキュア(L.innocua)のCas9のアミノ酸配列のアミノ酸360〜480と、少なくとも1、2、または5個のアミノ酸、但し35、30、25、20または10個以下のアミノ酸が異なり;あるいは、
S.ピオゲネス(S.pyogenes)、S.サーモフィルス(S.thermophilus)、S.ミュータンス(S.mutans)、またはL.イノキュア(L.innocua)のCas9のアミノ酸配列の360〜480と同一である。
S.ピオゲネス(S.pyogenes)、S.サーモフィルス(S.thermophilus)、S.ミュータンス(S.mutans)またはL.イノキュア(L.innocua)のCas9のアミノ酸配列のアミノ酸660〜720と55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%または99%の相同性を有し(図2の4つのCas9配列中の残基の56%が保存されている);
S.ピオゲネス(S.pyogenes)、S.サーモフィルス(S.thermophilus)、S.ミュータンス(S.mutans)または、L.イノキュア(L.innocua)のCas9のアミノ酸配列のアミノ酸660〜720と、少なくとも1、2、または5個のアミノ酸、但し35、30、25、20または10個以下のアミノ酸が異なり;あるいは、
S.ピオゲネス(S.pyogenes)、S.サーモフィルス(S.thermophilus)、S.ミュータンス(S.mutans)またはL.イノキュア(L.innocua)のCas9のアミノ酸配列のアミノ酸660〜720と同一である。
S.ピオゲネス(S.pyogenes)、S.サーモフィルス(S.thermophilus)、S.ミュータンス(S.mutans)、またはL.イノキュア(L.innocua)のCas9のアミノ酸配列のアミノ酸817〜900と50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の相同性を有し(図2A〜2Gの4つのCas9配列中の残基の55%が保存されている);
S.ピオゲネス(S.pyogenes)、S.サーモフィルス(S.thermophilus)、S.ミュータンス(S.mutans)、または、L.イノキュア(L.innocua)のCas9のアミノ酸配列のアミノ酸817〜900と、少なくとも1、2、または5個のアミノ酸、但し35、30、25、20または10個以下のアミノ酸が異なり;あるいは、
S.ピオゲネス(S.pyogenes)、S.サーモフィルス(S.thermophilus)、S.ミュータンス(S.mutans)、またはL.イノキュア(L.innocua)のCas9のアミノ酸配列のアミノ酸817〜900と同一である。
S.ピオゲネス(S.pyogenes)、S.サーモフィルス(S.thermophilus)、S.ミュータンス(S.mutans)、またはL.イノキュア(L.innocua)のCas9のアミノ酸配列のアミノ酸900〜960と50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%または99%の相同性を有し(図2A〜2Gの4つのCas9配列中の残基の60%が保存されている);
S.ピオゲネス(S.pyogenes)、S.サーモフィルス(S.thermophilus)、S.ミュータンス(S.mutans)、またはL.イノキュア(L.innocua)のCas9のアミノ酸配列のアミノ酸900〜960と、少なくとも1、2、または5個のアミノ酸、但し35、30、25、20または10個以下のアミノ酸が異なり;あるいは、
S.ピオゲネス(S.pyogenes)、S.サーモフィルス(S.thermophilus)、S.ミュータンス(S.mutans)、またはL.イノキュア(L.innocua)のCas9のアミノ酸配列のアミノ酸900〜960と同一である。
本明細書に記載されるCas9分子およびCas9ポリペプチドは、ヌクレアーゼ活性(例えば、エンドヌクレアーゼおよび/またはエキソヌクレアーゼ活性);ヘリカーゼ活性;gRNA分子と機能的に結合する能力;および核酸上の部位を標的化する(またはそれに局在する)能力(例えば、PAM認識および特異性)をはじめとするいくつかの性質のいずれかを有し得る。特定の実施形態では、Cas9分子またはCas9ポリペプチドは、これらの性質の全てまたは一部を含み得る。典型的な実施形態では、Cas9分子またはCas9ポリペプチドは、gRNA分子と相互作用し、gRNA分子と協調して核酸中の部位に局在する能力を有する。例えば、PAM特異性、切断活性、またはヘリカーゼ活性などのその他機能は、Cas9分子およびCas9ポリペプチド中でより幅広く変動し得る。
一実施形態では、Cas9分子またはCas9ポリペプチドは、天然Cas9分子と異なる切断特性を含み、例えば、それは最も近い相同性を有する天然Cas9分子と異なる。例えば、Cas9分子またはCas9ポリペプチドは、S.ピオゲネス(S.pyogenes)Cas9分子などの天然Cas9分子と、例えば、次のように異なり得る:例えば、天然Cas9分子(例えば、S.ピオゲネス(S.pyogenes)のCas9分子)と比較して二本鎖核酸切断(エンドヌクレアーゼおよび/またはエキソヌクレアーゼ活性)の低下または増大を調節するその能力;例えば、天然Cas9分子(例えば、S.ピオゲネス(S.pyogenes)のCas9分子)と比較して、核酸分子の非相補鎖または核酸分子の相補鎖などの核酸の一本鎖切断(ニッカーゼ活性)の低下または増大を調節するその能力;または例えば、二本鎖または一本鎖核酸分子などの核酸分子を切断する能力が、除去され得る。
図2A〜2Gに開示されるコンセンサス配列の固定配列に対応する配列が、図2A〜2Gで開示されるコンセンサス配列中の固定残基と1、2、3、4、5、10、15、または20%以下異なり;
図2A〜2Gに開示されるコンセンサス配列中の「*」によって同定される残基に対応する配列が、例えば、S.ピオゲネス(S.pyogenes)、S.サーモフィルス(S.thermophilus)、S.ミュータンス(S.mutans)、または、L.イノキュア(L.innocua)Cas9分子などの天然Cas9分子の対応する配列からの「*」残基と、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、または40%以下異なる、配列を含んでなる。
天然起源Cas9分子は、例えば、S.ピオゲネス(S.pyogenes)、S.サーモフィルス(S.thermophilus)、S.ミュータンス(S.mutans)、およびS.アウレウス(S.aureus)について、上に記載されるPAM認識配列などの特定のPAM配列を認識し得る。
本明細書に記載される遺伝子操作Cas9分子および遺伝子操作Cas9ポリペプチドとしては、例えば、本質的に天然立体配座、Cas9ヌクレアーゼ活性、および/または標的核酸分子認識などの所望のCas9特性をなおも保つ一方で、分子サイズを低下させる欠失を含む、Cas9分子またはCas9ポリペプチドが挙げられる。本明細書で提供されるのは、1つまたは複数の欠失および任意選択的に1つまたは複数のリンカーを含む、Cas9分子またはCas9ポリペプチドであり、リンカーは、欠失側面に位置するアミノ酸残基間に配置される。参照Cas9分子中の適切な欠失を同定する方法、欠失およびリンカーがあるCas9分子を生成する方法、およびこのようなCas9分子を使用する方法は、この文献を検討することにより当業者には明らかであろう。
ニッカーゼ活性、すなわち、例えば、核酸分子の非相補鎖または相補鎖などの一本鎖を切断する能力;二本鎖ヌクレアーゼ活性、すなわち、二本鎖核酸の双方の鎖を切断して、二本鎖切断を生成する能力で、一実施形態では、2つのニッカーゼ活性の存在である;エンドヌクレアーゼ活性;エキソヌクレアーゼ活性;ヘリカーゼ活性、すなわち、二本鎖核酸のらせん構造を巻き戻す能力;ならびに例えば、標的核酸またはgRNAなどの核酸分子の認識活性。
Cas9分子の欠失に適する領域は、多様な方法によって同定され得る。様々な細菌種に由来する天然オルソロガスCas9分子は、S.ピオゲネス(S.pyogenes)Cas9の結晶構造にモデル化され得て(Nishimasu 2014)、タンパク質の三次元立体構造と比較して、選択されたCas9オルソログ全域の保存レベルが調べられる。例えば、標的核酸分子および/またはgRNAとの境界面などのCas9活性に関与する領域から空間的に遠位に位置する、低保存または非保存領域は、Cas9活性に実質的に影響を及ぼさずまたは低下させない欠失の候補領域またはドメインに相当する。
例えば、eaCas9分子またはeaCas9ポリペプチドなどのCas9分子またはCas9ポリペプチドをコードする核酸は、本明細書で提供される。代表的Cas9分子をコードする核酸またはCas9ポリペプチドは、上述されている(例えば、Cong 2013;Wang 2013;Mali 2013;Jinek 2012を参照されたい)。
本明細書で開示される方法を実施するために、様々なタイプのCas分子またはCasポリペプチドが使用され得る。いくつかの実施形態では、II型CasシステムのCas分子が使用される。その他の実施形態では、その他のCasシステムのCas分子が使用される。例えば、I型またはIII型Cas分子が使用されてもよい。代表的なCas分子(およびCasシステム)は、上述されている(例えば、Haft 2005およびMakarova 2011を参照されたい)。代表的なCas分子(およびCasシステム)は、表17にもまた示される。
本明細書に開示される教示内容を用いて当業者には理解されるように、gRNA分子を選択し、デザインするための本明細書に記載の方法およびデータベーススキーマは、Cpf1システム、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)システム、およびジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)システムなどの他のシステムのために使用することもできる。例えば、Cpf1は、クラス2CRISPR−Casシステム(Zetsche et al.,2015,Cell 163,1−13を参照)の単一RNA誘導エンドヌクレアーゼである。転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)システムは、ザントモナス(Xanthomonas)種由来のTALEと制限エンドヌクレアーゼ、FokIの融合物である。TALEのアミノ酸反復配列を修飾することにより、当業者は標的DNAに特異的に結合して、TAL結合部位の間に切断を導入するように、TALENシステムをカスタマイズすることができる。同様に、ジンクフィンガーヌクレアーゼシステムは、DNA切断ドメインとしてFokIヌクレアーゼを使用し、特定のジンクフィンガーが、異なるヌクレオチドトリプレットを認識して、FokIヌクレアーゼを二量体化することにより、2つの異なるジンクフィンガー結合部位の間に二本鎖切断の導入を達成する。
候補Cas9分子、候補gRNA分子、候補Cas9分子/gRNA分子複合体は、当該技術分野で周知の方法によって、または本明細書に記載されるように評価することができる。例えば、Cas9分子のエンドヌクレアーゼ活性を評価する代表的な方法は、例えば、Jinek et al.,SCIENCE 2012,337(6096):816−821に記載されている。
Cas9分子/gRNA分子複合体が、標的核酸を結合および切断する能力は、プラスミド切断アッセイで評価され得る。このアッセイでは、合成または生体外転写gRNA分子が、95℃に加熱して緩慢に室温に冷却することで、反応に先だってプレアニールされる。天然または制限消化直線化プラスミドDNA(300ng(約8nM))が、10mMのMgCl2存在下または不在下において、Cas9プラスミド切断緩衝液(20mMのHEPES pH7.5、150mMのKCl、0.5mMのDTT、0.1mMのEDTA)中の精製Cas9タンパク質分子(50〜500nM)およびgRNA(50〜500nM、1:1)と共に、37℃で60分間インキュベートされる。反応は、5×DNAローディングバッファー(30%グリセロール、1.2%SDS、250mMのEDTA)によって停止され、0.8または1%アガロースゲル電気泳動法によって分離され、臭化エチジウム染色によって視覚化される。得られた分解産物は、Cas9分子が、双方のDNA鎖を切断するか、または二本鎖の1本のみを切断するかどうかを示す。例えば、直鎖DNA生成物は、双方のDNA鎖の切断を示す。ニックの入った開環状生成物は、二本鎖の1本のみが切断されていることを示す。
Cas9分子の標的DNAへの結合を評価する代表的な方法は、例えば、Jinek et.al.,Science 2012;337(6096):816−821に記載されている。
Cas9−gRNAリボ核タンパク質(RNP)複合体の熱安定性は、示差走査型蛍光定量法(DSF)およびその他の技術によって検知することができる。タンパク質の熱安定性は、例えば、gRNAなどの結合RNA分子の添加などの好ましい条件下で増大され得る。従って、Cas9/gRNA複合体の熱安定性に関する情報は、複合体が安定しているかどうかを決定する上で有用である。
DSFは、タンパク質の熱安定性を測定するために用いることができる技術である。このアッセイは、いくつかの方法で適用することができる。例示的なプロトコルとして、限定はしないが、RNP形成のための所望の溶液条件を判定するプロトコル(アッセイ1、以下を参照)、gRNA:Cas9タンパク質の最良の化学量論比を試験するプロトコル(アッセイ2、以下を参照)、Cas9分子、例えば、野生型もしくは突然変異型Cas9分子について有効なgRNA分子をスクリーニングするプロトコル(アッセイ3、以下を参照)、ならびに標的DNAの存在下でRNP形成を調べるプロトコル(アッセイ4)が挙げられる。
RNP複合体を形成するための最良の溶液を判定するために、Cas9の2μM水溶液と10×SYPRO Orange(登録商標)(Life Techonologiesカタログ番号S−6650)が384ウェルプレート内に分注される。次に、様々なpHの溶液中で希釈された等モル量のgRNA、および塩が添加される。室温で10分間インキュベートし、2000rpmで遠心分離してあらゆる気泡を除去いた後、 Bio−Rad CFX Manager ソフトウェアと共に、Bio−Rad CFX384(商標)Real−Time System C1000 Touch(商標)サーマルサイクラーを使用して、10秒毎に1℃の温度増大で20℃から90℃への勾配が実行される。
第2のアッセイは、上記アッセイ1からの最適緩衝液中で、様々な濃度のgRNA分子と2uM Cas9を混合して、384ウェルプレート内で、室温で10分間インキュベートすることを含む。等容積の最適緩衝液と10×SYPRO Orange(登録商標)(Life Techonologiesカタログ番号S−6650)が添加され、プレートはMicroseal(登録商標)B粘着剤(MSB−1001)で密封される。あらゆる気泡を除去するための2000rpmでの遠心分離に続いて、Bio−Rad CFX Managerソフトウェアと共に、Bio−Rad CFX384(商標)Real−Time System C1000 Touch(商標)サーマルサイクラーを使用して、10秒毎に1℃の温度増大で20℃から90℃への勾配が実行される。
第3のアッセイでは、対象Cas9分子(例えば、Cas9タンパク質、例えば、Cas9変異タンパク質)を精製する。変異gRNA分子のライブラリーを合成し、20μMの濃度まで再懸濁させる。5×SYPRO Orange(登録商標)(Life Techonologiesカタログ番号S−6650)の存在下で予定緩衝液中に各々1μMの最終濃度で、Cas9分子をgRNA分子と一緒にインキュベートする。室温で10分間インキュベートしてから、2000rpmで2分間の遠心分離により気泡を全て除去した後、Bio−Rad CFX Managerソフトウェアと共に、Bio−Rad CFX384(商標)Real−Time System C1000 Touch(商標)サーマルサイクラーを使用して、10秒毎に1℃ずつ昇温しながら、20℃から90℃への勾配を実行する。
第4のアッセイでは、次のサンプル:Cas9タンパク質単独、Cas9タンパク質とgRNA、Cas9タンパク質とgRNAおよび標的DNA、ならびにCas9タンパク質と標的DNAを用いて、DSF実験を実施する。構成要素を混合する順序は、反応溶液、Cas9タンパク質、gRNA、DNA、およびSYPRO Orangeの順である。反応溶液は、MgCl2の非存在または存在下で、10mM HEPES pH7.5、100mM NaClを含有する。2000rpmで2分間の遠心分離により気泡を全て除去した後、Bio−Rad CFX Managerソフトウェアと共に、Bio−Rad CFX384(商標)Real−Time System C1000 Touch(商標)サーマルサイクラーを使用して、10秒毎に1℃ずつ昇温しながら、20℃から90℃への勾配を実行する。
例えば、本明細書に記載される遺伝子などの遺伝子の突然変異は、本明細書で考察されるアプローチの1つを用いて修正することができる。一実施形態では、遺伝子中の突然変異は、細胞外供給テンプレート核酸を用いた相同組換え修復(HDR)により修正される(以下を参照)。別の実施形態では、遺伝子中の突然変異は、細胞外供給テンプレート核酸を用いずに、相同組換え修復(HDR)により修正される(以下を参照)。
本明細書に記載されるように、ヌクレアーゼ誘導相同組換え修復(HDR)を使用して、ゲノム中の標的配列を改変し、突然変異を修正(例えば、修復もしくは編集)することができる。標的配列の改変は、細胞外供給ドナーテンプレートまたはテンプレート核酸を用いた相同組換え修復(HDR)によって起こる。例えば、供与体テンプレートまたはテンプレート核酸は、標的配列の改変を可能にする。プラスミド供与体は、相同組換えのためのテンプレートとして使用できると考えられる。さらに、一本鎖供与体テンプレートは、標的配列と供与体テンプレートとの間の相同組換え修復の代替(alternate)方法(例えば、一本鎖アニーリング)による標的配列の改変のためのテンプレートとして使用できることも考えられる。供与体テンプレートを用いて実施される標的配列の改変は、Cas9分子による切断に依存する。Cas9による切断は、二本鎖切断または2つの一本鎖切断を含み得る。本明細書に記載されるように、ヌクレアーゼ誘導相同組換え修復(HDR)を使用して、細胞外供給ドナーテンプレートまたはテンプレート核酸なしで、標的配列を改変し、ゲノム中の突然変異を修正(例えば、修復もしくは編集)することができる。標的配列の改変は、細胞外供給ドナー配列を用いた相同組換え修復(HDR)によって起こる。例えば、内在性ゲノム供与体配列は、標的配列の改変を可能にする。一実施形態では、内在性ゲノム供与体配列を、標的配列と同じ染色体上に位置させることが検討される。さらに、別の実施形態では、内在性ゲノム供与体配列は、標的配列とは異なる染色体上に位置させることが検討される。内在性ゲノム供与体配列による標的配列の改変は、Cas9分子による切断に依存する。Cas9による切断は、二本鎖切断または2つの一本鎖切断を含み得る。
一実施形態では、二本鎖切断は、HNH様ドメインに関連する切断活性と、RuvC様ドメイン、例えば、N末端RuvC様ドメインに関連する切断活性を有するCas9分子、例えば、野生型Cas9によって実施される。このような実施形態は、単一のgRNAを必要とする。
いくつかの実施形態では、1つの一本鎖切断、またはニックは、ニッカーゼ活性を有するCas9分子、例えば、本明細書に記載されるようなCas9ニッカーゼによって実施される。ニック標的核酸は、alt−HDR用の基質となり得る。
鎖の一方における二本鎖切断または一本鎖切断は、改変が所望の領域内で生じる、例えば、突然変異の修正が起こるように、標的位置に十分接近させるべきである。一実施形態では、距離は、50、100、200、300、350もしくは400ヌクレオチド以下である。標的位置が、末端切除中にエキソヌクレアーゼ媒介性除去を受ける領域内にあるように、切除は標的位置に十分接近させるべきであると考えられる。標的位置と切断の間の距離が大きすぎると、改変しようとする突然変異体または他の配列が末端切除に包含されず、従って、修正されない場合がある。というのは、供与体配列(細胞外供給供与体配列または内在性ゲノム供与体配列のいずれも)は、いくつかの実施形態では、末端切除領域内の配列を修正するためだけに使用されるからである。
一実施形態では、二本鎖切断は、下で考察されるように、第2のgRNA分子によって配置される追加的二本鎖切断を伴い得る。
相同性アームは、例えば、切除された一本鎖オーバーハングが、供与体テンプレート内の相補的領域を見出すことができるように、末端切除が起こり得る領域と少なくとも同じくらい遠くまで延在すべきである。その全長は、プラスミドサイズまたはウイルスパッケージング限界などのパラメーターによって限定され得る。一実施形態では、相同性アームは、反復エレメント、例えば、Alu反復配列またはLINE反復配列中に延在しない。
[5’相同性アーム]−[置換配列]−[3’相同性アーム]
を含む。
一実施形態では、核酸テンプレート系は、二本鎖である。一実施形態では、核酸テンプレート系は、一本鎖である。一実施形態では、核酸テンプレート系は、一本鎖部分と二本鎖部分を含む。一実施形態では、テンプレート核酸は、ニックおよび/または置換配列の両側に、約50〜100、例えば、55〜95、60〜90、65〜85、または70〜80塩基対の相同性を含む。一実施形態では、テンプレート核酸は、ニックもしくは置換配列の5’側、ニックもしくは置換配列の3’側、またはニックもしくは置換配列の5’および3’側の双方に約50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、または100塩基対の相同性を含む。
一実施形態では、テンプレート核酸は、一本鎖核酸である。別の実施形態では、テンプレート核酸は、二本鎖核酸である。いくつかの実施形態では、テンプレート核酸は、1つまたは複数のヌクレオチドのヌクレオチド配列を含み、これは、標的核酸に付加されるか、または標的核酸中の変化をテンプレートする。他の実施形態では、テンプレート核酸は、標的位置を改変するのに用いられ得るヌクレオチド配列を含む。他の実施形態では、テンプレート核酸は、例えば標的位置などの標的核酸の野生型配列に対応する、例えば1つまたは複数のヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む。
本明細書に記載されるように、ヌクレアーゼ誘導非相同末端結合(NHEJ)を使用して、標的遺伝子特異的破壊(例えば、ノックアウト)を標的化することができる。ヌクレアーゼ誘導NHEJはまた、対象遺伝子中の配列を除去する(例えば、欠失させる)のにも使用することができる。
NHEJ媒介インデルを誘導する目的で、gRNAおよびCas9ヌクレアーゼが二本鎖切断を生じる一実施形態では、例えば、単分子(またはキメラ)またはモジュラーgRNA分子などのgRNAが、1つの二本鎖切断を標的位置のヌクレオチド近傍に配置させるように構成される。一実施形態では、切断部位は、標的位置から0〜30bp(例えば、標的位置から30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2または1bp未満)離れている。
遺伝子をDNAレベルで変異させることで発現を恒久的に排除するCRISPR/Cas媒介遺伝子ノックアウトとは異なり、CRISPR/Casノックダウンは、人工転写因子の使用を通じて、一時的な遺伝子発現低下を可能にする。Cas9タンパク質の双方のDNA切断ドメインで重要な残基を変異させることは(例えば、D10AおよびH840A変異)、触媒能のないCas9(死滅Cas9またはdCas9分子としてもまた知られているeiCas9)の生成をもたらす。触媒能のないCas9はgRNAと複合体形成して、gRNAの標的化ドメインによって特定化されたDNA配列に局在するが、それは標的DNAを切断しない。dCas9と、例えば、転写抑制ドメインなどのエフェクタードメインとの融合は、gRNAによって特定化された任意のDNA部位へのエフェクターの動員を可能にする。酵素的に活性な(eiCas9)Cas9分子それ自体は、コード配列中の早期領域に動員された場合に、転写をブロックすることができるが、より堅固な抑制は、転写抑制ドメイン(例えばKRAB、SIDまたはERD)をCas9に融合させて、転写抑制ドメインを、標的ノックダウン位置、例えば、開始コドンの配列3’の1000塩基対または遺伝子の開始コドンのプロモーター領域5’の500塩基対内に動員することによって達成され得る。プロモーターのDNAseI高感受性領域(DHS)は、Cas9タンパク質にアクセスできる可能性が高く、また内在性転写因子のための部位を保有する可能性も高いので、これらの領域を標的化することで、恐らくより効率的な遺伝子抑制または活性化がもたらされ得る。特に遺伝子抑制については、内在性転写因子の結合部位をブロックすることで、遺伝子発現の下方制御を助けることが、本明細書で検討される。一実施形態では、1つまたは複数の内在性転写因子の結合をブロックするために、1つまたは複数のeiCas9分子を用いてもよい。別の実施形態では、eiCas9分子をクロマチン改変タンパク質に融合させてもよい。改変クロマチン状態は、標的遺伝子の発現低下をもたらし得る。クロマチン状態を改変するために、1つまたは複数のクロマチン改変タンパク質に融合した1つまたは複数のeiCas9分子を用いてもよい。
一本鎖アニーリング(SSA)は、標的核酸中に存在する2つの反復配列間の二本鎖切断を修復する、別のDNA修復プロセスである。SSA経路によって使用される反復配列は、一般に30ヌクレオチド長を超える。切断末端に切除が生じて、標的核酸の双方の鎖上の反復配列が示される。切除後、反復配列を含有する一本鎖オーバーハングをRPAタンパク質で被覆して、反復配列が、例えばそれ自体などと不適切にアニーリングするのを妨げる。RAD52は、オーバーハング上の反復配列のそれぞれと結合し、配列を整列させて、相補的反復配列のアニーリングを可能にする。アニーリング後、オーバーハングの一本鎖フラップは切断される。新しいDNA合成があらゆるギャップを充填し、ライゲーションがDNA二本鎖を回復させる。プロセッシングの結果として、2つの反復間のDNA配列が欠失する。欠失の長さは、使用される2つの反復の位置、および切除の経路または処理能力をはじめとする、多くの要素に左右され得る。
SSBR(一本鎖切断修復)
ゲノム内の一本鎖切断(SSB)は、上で論じたDSB修復機序とは別個の機序であるSSBR経路によって修復される。SSBR経路は、SSB検出、DNA末端プロセッシング、DNAギャップ充填、およびDNAライゲーションの4つの主要な段階を有する。より詳細な説明は、Caldecott,Nature Reviews Genetics 9,619−631(August 2008)に記載され、概要は本明細書に記載される。
細胞は、MMR、BER、およびNERの3つの切除修復経路を包含する:切除修復経路は、典型的に、DNAの1本鎖上の損傷を認識して、次にエキソ/エンドヌクレアーゼが損傷を除去し、DNAポリメラーゼによって順次充填され、最終的にリガーゼによってシールされる、1〜30ヌクレオチドのギャップを残すという共通の特徴を有する。より詳細な全体像は、Li,Cell Research(2008)18:85−98に記載され、概要は、本明細書で提供される。
塩基切除修復(BER)経路は、細胞周期全体を通じて活性であり;それは、ゲノムからの小型非らせん歪み塩基損傷を除去する主な原因となる。対照的に、関連ヌクレオチド切除修復経路(次のセクションで考察される)は、嵩高いらせん歪み損傷を修復する。より詳細な説明は、Caldecott,Nature Reviews Genetics 9,619−631(August 2008)に記載され、概要は本明細書に記載される。
ヌクレオチド切除修復(NER)は、DNAから嵩高いらせん歪み損傷を除去する重要な切除機序である。NERに関する加的な詳細は、Marteijn et al.,Nature Reviews Molecular Cell Biology 15,465−481(2014)にあり、概要は本明細書に記載される。広域経路NERは、2つのより小型の経路である、全ゲノムNER(GG−NER)と、転写と共役する修復NER(TC−NER)とを包含する。GG−NERおよびTC−NERは、DNA損傷を認識するために異なる要素を使用する。しかし、それらは、損傷切開、修復、およびライゲーションのための同一機構を利用する。
ICL修復経路と称される専用経路が、鎖間架橋を修復する。異なるDNA鎖中の塩基間の鎖間架橋、または共有結合架橋が、複製または転写中に起こり得る。ICL修復は、具体的には、核酸分解活性、損傷乗り越え合成(TLS)、およびHDRである、複数の修復プロセスの協調を伴う。ヌクレアーゼが、架橋塩基のどちらかの側のICLを切除するように動員される一方で、TLSおよびHDRは、協調して切断された鎖を修復する。ICL修復は、以下の要素を伴い得る:例えば、XPFおよびRAD51Cなどのエンドヌクレアーゼ、RAD51などのエンドヌクレアーゼ、例えば、DNAポリメラーゼζおよびRev1などの損傷乗り越えポリメラーゼ、および例えば、FancJなどのファンコーニ貧血(FA)タンパク質。
哺乳類には、いくつかのその他のDNA修復経路が存在する。
Cas9分子、gRNA分子(例えば、Cas9分子/gRNA分子複合体など)および任意選択的にドナーテンプレート核酸を使用して、例えば、多種多様な細胞内で標的核酸を編集するなど、細胞を操作することができる。
例えば、Cas9分子、gRNA分子(例えば、Cas9分子/gRNA分子複合体)などの構成要素、ならびに供与体テンプレート核酸、または3つ全ては、多様な形態で送達、製剤化、または投与することができ、例えば、表19および20を参照されたい。一実施形態では、1つのCas9分子と2つ以上(例えば、2、3、4、またはそれ以上)の異なるgRNA分子は、例えば、AAVベクターによって送達される。一実施形態では、Cas9分子をコードする配列と、2つ以上(例えば、2、3、4、またはそれ以上)の異なるgRNA分子をコードする配列は、同じ核酸分子、例えば、AAVベクター上に存在する。Cas9分子またはgRNA構成要素が送達され、DNAにコードされる場合、このDNAは、典型的に、発現を実施するための制御領域(例えば、プロモーターを含む)を含むであろう。Cas9分子配列に有用なプロモーターとしては、例えば、CMV、SFFV、EFS、EF−1a、PGK、CAG、およびCBHプロモーターが挙げられる。一実施形態では、プロモーターは、構成的プロモーターである。別の実施形態では、プロモーターは、組織特異的プロモーターである。gRNAの有用なプロモーターとしては、H1、EF−1a、U6、およびtRNAプロモーターが挙げられる。同様のまたは異なる強度を有するプロモーターを選択して、構成要素の発現を調整することができる。Cas9分子をコードする配列は、例えば、SV40NLSなどの核局在化シグナル(NLS)を含んでもよい。一実施形態では、Cas9分子をコードする配列は、少なくとも2つの核局在化シグナルを含む。一実施形態では、Cas9分子またはgRNA分子のプロモーターは、独立して、誘導性、組織特異的、または細胞特異的であってもよい。
Cas9分子(例えば、eaCas9分子)、gRNA分子をコードする核酸、供与体テンプレート核酸、またはそれら(例えば、2つもしくは全て)の任意の組み合わせは、当該技術分野で周知の方法によって、または本明細書に記載されるようにして、対象に、または細胞内に送達することができる。例えば、Cas9をコードするおよび/またはgRNAをコードするDNA、ならびに供与体テンプレート核酸は、例えば、ベクター(例えば、ウイルスまたは非ウイルスベクター)、非ベクターベースの方法(例えば、裸のDNAまたはDNA複合体を使用して)、またはそれらの組み合わせによって、送達することができる。
Cas9分子(例えば、eaCas9分子またはeiCas9分子)をコードするRNAおよび/またはgRNA分子は、当該技術分野で周知の方法によって、または本明細書に記載される通りに、例えば、本明細書に記載される標的細胞などの細胞内に送達することができる。例えば、Cas9をコードするおよび/またはgRNAをコードするRNAは、例えば、マイクロインジェクション、電気穿孔、一過性細胞圧縮または圧搾(例えば、Lee,et al.,2012,Nano Lett 12:6322−27に記載される通り)、脂質媒介形質移入、ペプチド媒介送達、またはそれらの組み合わせによって送達され得る。Cas9をコードするおよび/またはgRNAをコードするRNAは、標的細胞(例えば、本明細書に記載される標的細胞)による取り込みを促進する分子)と共役させることができる。
Cas9分子(例えば、eaCas9分子またはeiCas9分子)は、当該技術分野で周知の方法によって、または本明細書に記載される通りに、細胞内に送達することができる。例えば、Cas9タンパク質分子は、例えば、マイクロインジェクション、電気穿孔、一過性細胞圧縮または圧搾(例えば、Lee,et al.2012;Nano Lett 12:6322−27に記載される通り)、脂質媒介形質移入、ペプチド媒介送達、またはそれらの組み合わせによって送達することができる。送達は、gRNAをコードするDNA、またはgRNAを伴い得る。Cas9タンパク質は、標的細胞(例えば、本明細書に記載される標的細胞)による取り込みを促進する分子と共役させることができる。
全身投与方法としては、経口および非経口経路が挙げられる。非経口経路として、例えば、静脈内、動脈内、筋肉内、皮内、皮下、鼻内、および腹腔内経路が挙げられる。全身投与される構成要素は、肝細胞、肝臓オーバル細胞、マクロファージまたは単球を標的化するように、修飾または製剤化することもできる。
Casシステムの構成要素、例えば、Cas9分子構成要素およびgRNA分子構成要素の個別の送達、より具体的には、差次的モードによる構成要素の送達は、例えば、組織特異性および安全性を改善することによって、性能を高めることができる。
いくつかの実施形態では、表19に記載される構成要素を細胞に導入した後、これらの細胞を対象に導入する。構成要素を導入する方法は、表20に記載される送達方法のいずれかを含み得る。
修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドは、例えば、特にgRNAなどの核酸中に存在し得るが、例えば、mRNA、RNAi、またはsiRNAなどのその他の形態のRNAにもまた存在し得る。本明細書に記載される「ヌクレオシド」は、5つの炭素砂糖分子(ペントースまたはリボース)またはその誘導体と、1つの有機塩基、プリンまたはピリミジン、またはその誘導体とを含有する化合物と定義される。本明細書に記載される「ヌクレオチド」は、リン酸基をさらに含むヌクレオシドと定義される。
(i)例えば、リン酸ジエステル骨格結合中の非結合リン酸酸素の片方または双方および/または結合リン酸酸素の1つまたは複数の置換などの改変;
(ii)例えば、リボース糖上の2’ヒドロキシルなどのリボース糖の構成要素の置換などの改変;
(iii)リン酸部分の「デホスホ」リンカーによる徹底的な置換;
(iv)天然起源核酸塩基の修飾または置換;
(v)リボースリン酸骨格の置換または修飾;
(vi)例えば、末端リン酸基の除去、修飾または置換または部分のコンジュゲーションなどのオリゴヌクレオチドの3’末端または5’末端の修飾;および
(vii)糖の修飾。
本明細書の用法では、「アルキル」は、直鎖または分枝鎖の飽和炭化水素基を指すことが意図される。アルキル基の例としては、メチル(Me)、エチル(Et)、プロピル(例えば、n−プロピルおよびイソプロピル)、ブチル(例えば、n−ブチル、イソブチル、t−ブチル)、ペンチル(例えば、n−ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル)などが挙げられる。アルキル基は、1〜約20個、2〜約20個、1〜約12個、1〜約8個、1〜約6個、1〜約4個、または1〜約3個の炭素原子を含有し得る。
リン酸基
一実施形態では、修飾ヌクレオチドのリン酸基は、異なる置換基による、1つまたは複数の酸素の置換によって修飾され得る。さらに、例えば、内修飾核酸に存在する修飾ヌクレオチドなどの修飾ヌクレオチドは、本明細書に記載されるような修飾リン酸塩による、未修飾リン酸部分の徹底的な置換を含み得る。一実施形態では、リン酸骨格の修飾は、非荷電リンカーまたは非相称の電荷分布がある荷電リンカーのどちらかをもたらす改変を含み得る。
リン酸基は、リン非含有コネクターによって置換され得る。一実施形態では、荷電リン酸基は、中性部分によって置換され得る。
核酸を模倣し得るスキャフォールドもまた構築され得て、その中では、リン酸リンカーおよびリボース糖が、ヌクレアーゼ耐性ヌクレオシドまたはヌクレオチドサロゲートによって置換される。一実施形態では、核酸塩基は、サロゲート骨格によって係留され得る。例としては、制限なしに、モルホリノ、シクロブチル、ピロリジン、およびペプチド核酸(PNA)ヌクレオシドサロゲートが挙げられる。
修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドは、糖類に1つまたは複数の修飾を含み得る。例えば、2’ヒドロキシル基(OH)は、いくつかの異なる「オキシ」または「デオキシ」置換基で、修飾または置換され得る。一実施形態では、2’ヒドロキシル基の修飾は核酸の安定性を高め得るが、それは、ヒドロキシルが、もはや脱プロトン化して、2’−アルコキシドイオンを形成し得ないためである。2’−アルコキシドは、リンカーリン原子上の分子内求核攻撃によって、分解を触媒し得る。
修飾核酸に組み込まれ得る、本明細書に記載される修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドは、修飾核酸塩基を含み得る。核酸塩基の例としては、アデニン(A)、グアニン(G)、シトシン(C)、およびウラシル(U)が挙げられるが、これに限定されるものではない。これらの核酸塩基は、修飾または完全に置換されて、修飾核酸に組み込まれ得る、修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドを提供し得る。ヌクレオチドの核酸塩基は、プリン、ピリミジン、プリンまたはピリミジンアナログから独立して選択され得る。一実施形態では、核酸塩基としては、例えば、天然に存在する塩基の合成誘導体が挙げられる。
一実施形態では、修飾核酸塩基は、修飾ウラシルである。修飾ウラシルを有する代表的な核酸塩基およびヌクレオシドとしては、制限なしに、プソイドウリジン(ψ)、ピリジン−4−オンリボヌクレオシド、5−アザ−ウリジン、6−アザ−ウリジン、2−チオ−5−アザ−ウリジン、2−チオ−ウリジン(s2U)、4−チオ−ウリジン(s4U)、4−チオ−プソイドウリジン、2−チオ−プソイドウリジン、5−ヒドロキシ−ウリジン(ho5U)、5−アミノアリル−ウリジン、5−ハロ−ウリジン(例えば、5−ヨード−ウリジンまたは5−ブロモ−ウリジン)、3−メチル−ウリジン(m3U)、5−メトキシ−ウリジン(mo5U)、ウリジン5−オキシ酢酸(cmo5U)、ウリジン5−オキシ酢酸メチルエステル(mcmo5U)、5−カルボキシメチル−ウリジン(cm5U)、1−カルボキシメチル−プソイドウリジン、5−カルボキシヒドロキシメチル−ウリジン(chm5U)、5−カルボキシヒドロキシメチル−ウリジンメチルエステル(mchm5U)、5−メトキシカルボニルメチル−ウリジン(mcm5U)、5−メトキシカルボニルメチル−2−チオ−ウリジン(mcm5s2U)、5−アミノメチル−2−チオ−ウリジン(nm5s2U)、5−メチルアミノメチル−ウリジン(mnm5U)、5−メチルアミノメチル−2−チオ−ウリジン(mnm5s2U)、5−メチルアミノメチル−2−セレン含有−ウリジン(mnm5se2U)、5−カルバモイルメチル−ウリジン(ncm5U)、5−カルボキシメチルアミノメチル−ウリジン(cmnm5U)、5−カルボキシメチルアミノメチル−2−チオ−ウリジン(cmnm5s2U)、5−プロピニル−ウリジン、1−プロピニル−プソイドウリジン、5−タウリノメチル−ウリジン(τcm5U)、1−タウリノメチル−プソイドウリジン、5−タウリノメチル−2−チオ−ウリジン(τm5s2U)、1−タウリノメチル−4−チオ−プソイドウリジン、5−メチル−ウリジン(m5U、すなわち、核酸塩基デオキシチミジン(deoxythymine)を有する)、1−メチル−プソイドウリジン(m1ψ)、5−メチル−2−チオ−ウリジン(m5s2U)、1−メチル−4−チオ−プソイドウリジン(m1s4ψ)、4−チオ−1−メチル−プソイドウリジン、3−メチル−プソイドウリジン(m3ψ)、2−チオ−1−メチル−プソイドウリジン、1−メチル−1−デアザ−プソイドウリジン、2−チオ−1−メチル−1−デアザ−プソイドウリジン、ジヒドロウリジン(D)、ジヒドロプソイドウリジン、5,6−ジヒドロウリジン、5−メチル−ジヒドロウリジン(m5D)、2−チオ−ジヒドロウリジン、2−チオ−ジヒドロプソイドウリジン、2−メトキシ−ウリジン、2−メトキシ−4−チオ−ウリジン、4−メトキシ−プソイドウリジン、4−メトキシ−2−チオ−プソイドウリジン、N1−メチル−プソイドウリジン、3−(3−アミノ−3−カルボキシプロピル)ウリジン(acp3U)、1−メチル−3−(3−アミノ−3−カルボキシプロピル)プソイドウリジン(acp3ψ)、5−(イソペンテニルアミノメチル)ウリジン(inm5U)、5−(イソペンテニルアミノメチル)−2−チオ−ウリジン(inm5s2U)、α−チオ−ウリジン、2’−O−メチル−ウリジン(Um)、5,2’−O−ジメチル−ウリジン(m5Um)、2’−O−メチル−プソイドウリジン(ψm)、2−チオ−2’−O−メチル−ウリジン(s2Um)、5−メトキシカルボニルメチル−2’−O−メチル−ウリジン(mcm5Um)、5−カルバモイルメチル−2’−O−メチル−ウリジン(ncm5Um)、5−カルボキシメチルアミノメチル−2’−O−メチル−ウリジン(cmnm5Um)、3,2’−O−ジメチル−ウリジン(m3Um)、5−(イソペンテニルアミノメチル)−2’−O−メチル−ウリジン(inm5Um)、1−チオ−ウリジン、デオキシチミジン、2’−F−アラ−ウリジン、2’−F−ウリジン、2’−OH−アラ−ウリジン、5−(2−カルボメトキシビニル)ウリジン、5−[3−(1−E−プロペニルアミノ)ウリジン、ピラゾロ[3,4−d]ピリミジン、キサンチン、およびヒポキサンチンが挙げられる。
一実施形態では、修飾核酸塩基は、修飾シトシンである。修飾シトシンを有する代表的な核酸塩基およびヌクレオシドとしては、制限なしに、5−アザ−シチジン、6−アザ−シチジン、プソイドイソシチジン、3−メチル−シチジン(m3C)、N4−アセチル−シチジン(act)、5−ホルミル−シチジン(f5C)、N4−メチル−シチジン(m4C)、5−メチル−シチジン(m5C)、5−ハロ−シチジン(例えば、5−ヨード−シチジン)、5−ヒドロキシメチル−シチジン(hm5C)、1−メチル−プソイドイソシチジン、ピロロ−シチジン、ピロロ−プソイドイソシチジン、2−チオ−シチジン(s2C)、2−チオ−5−メチル−シチジン、4−チオ−プソイドイソシチジン、4−チオ−1−メチル−プソイドイソシチジン、4−チオ−1−メチル−1−デアザ−プソイドイソシチジン、1−メチル−1−デアザ−プソイドイソシチジン、ゼブラリン、5−アザ−ゼブラリン、5−メチル−ゼブラリン、5−アザ−2−チオ−ゼブラリン、2−チオ−ゼブラリン、2−メトキシ−シチジン、2−メトキシ−5−メチル−シチジン、4−メトキシ−プソイドイソシチジン、4−メトキシ−1−メチル−プソイドイソシチジン、リシジン(k2C)、α−チオ−シチジン、2’−O−メチル−シチジン(Cm)、5,2’−O−ジメチル−シチジン(m5Cm)、N4−アセチル−2’−O−メチル−シチジン(ac4Cm)、N4,2’−O−ジメチル−シチジン(m4Cm)、5−ホルミル−2’−O−メチル−シチジン(f5Cm)、N4,N4,2’−O−トリメチル−シチジン(m4 2Cm)、1−チオ−シチジン、2’−F−アラ−シチジン、2’−F−シチジン、および2’−OH−アラ−シチジンが挙げられる。
一実施形態では、修飾核酸塩基は、修飾アデニンである。修飾アデニンを有する代表的な核酸塩基およびヌクレオシドとしては、制限なしに、2−アミノ−プリン、2,6−ジアミノプリン、2−アミノ−6−ハロ−プリン(例えば、2−アミノ−6−クロロ−プリン)、6−ハロ−プリン(例えば、6−クロロ−プリン)、2−アミノ−6−メチル−プリン、8−アジド−アデノシン、7−デアザ−アデノシン、7−デアザ−8−アザ−アデノシン、7−デアザ−2−アミノ−プリン、7−デアザ−8−アザ−2−アミノ−プリン、7−デアザ−2,6−ジアミノプリン、7−デアザ−8−アザ−2,6−ジアミノプリン、1−メチル−アデノシン(m1A)、2−メチル−アデノシン(m2A)、N6−メチル−アデノシン(m6A)、2−メチルチオ−N6−メチル−アデノシン(ms2m6A)、N6−イソペンテニル−アデノシン(i6A)、2−メチルチオ−N6−イソペンテニル−アデノシン(ms2i6A)、N6−(シス−ヒドロキシイソペンテニル)アデノシン(io6A)、2−メチルチオ−N6−(シス−ヒドロキシイソペンテニル)アデノシン(ms2io6A)、N6−グリシジルカルバモイル(glycinylcarbamoyl)−アデノシン(g6A)、N6−スレオニルカルバモイル−アデノシン(t6A)、N6−メチル−N6−スレオニルカルバモイル−アデノシン(m6t6A)、2−メチルチオ−N6−スレオニルカルバモイル−アデノシン(ms2g6A)、N6,N6−ジメチル−アデノシン(m6 2A)、N6−ヒドロキシノルバリルカルバモイル−アデノシン(hn6A)、2−メチルチオ−N6−ヒドロキシノルバリルカルバモイル−アデノシン(ms2hn6A)、N6−アセチル−アデノシン(ac6A)、7−メチル−アデノシン、2−メチルチオ−アデノシン、2−メトキシ−アデノシン、α−チオ−アデノシン、2’−O−メチル−アデノシン(Am)、N6,2’−O−ジメチル−アデノシン(m6Am)、N6−メチル−2’−デオキシアデノシン、N6,N6,2’−O−トリメチル−アデノシン(m6 2Am)、1,2’−O−ジメチル−アデノシン(m1Am)、2’−O−リボシルアデノシン(リン酸塩)(Ar(p))、2−アミノ−N6−メチル−プリン、1−チオ−アデノシン、8−アジド−アデノシン、2’−F−アラ−アデノシン、2’−F−アデノシン、2’−OH−アラ−アデノシン、およびN6−(19−アミノ−ペンタオキサノンアデシル)−アデノシンが挙げられる。
一実施形態では、修飾核酸塩基は、修飾グアニンである。修飾グアニンを有する代表的な核酸塩基およびヌクレオシドとしては、制限なしに、イノシン(I)、1−メチル−イノシン(m1I)、ワイオシン(imG)、メチルワイオシン(mimG)、4−デメチル−ワイオシン(imG−14)、イソワイオシン(imG2)、ウィブトシン(yW)、ペルオキシウィブトシン(o2yW)、ヒドロキシウィブトシン(OHyW)、低修飾ヒドロキシウィブトシン(OHyW*)、7−デアザ−グアノシン、クエオシン(Q)、エポキシクエオシン(oQ)、ガラクトシル−クエオシン(galQ)、マンノシル−クエオシン(manQ)、7−シアノ−7−デアザ−グアノシン(preQ0)、7−アミノメチル−7−デアザ−グアノシン(preQ1)、アルカエオシン(G+)、7−デアザ−8−アザ−グアノシン、6−チオ−グアノシン、6−チオ−7−デアザ−グアノシン、6−チオ−7−デアザ−8−アザ−グアノシン、7−メチル−グアノシン(m7G)、6−チオ−7−メチル−グアノシン、7−メチル−イノシン、6−メトキシ−グアノシン、1−メチル−グアノシン(m’G)、N2−メチル−グアノシン(m2G)、N2,N2−ジメチル−グアノシン(m2 2G)、N2,7−ジメチル−グアノシン(m2,7G)、N2、N2,7−ジメチル−グアノシン(m2,2,7G)、8−オキソ−グアノシン、7−メチル−8−オキソ−グアノシン、1−メチル−6−チオ−グアノシン、N2−メチル−6−チオ−グアノシン、N2,N2−ジメチル−6−チオ−グアノシン、α−チオ−グアノシン、2’−O−メチル−グアノシン(Gm)、N2−メチル−2’−O−メチル−グアノシン(m2Gm)、N2,N2−ジメチル−2’−O−メチル−グアノシン(m2 2Gm)、1−メチル−2’−O−メチル−グアノシン(m’Gm)、N2,7−ジメチル−2’−O−メチル−グアノシン(m2,7Gm)、2’−O−メチル−イノシン(Im)、1,2’−O−ジメチル−イノシン(m’Im)、O6−フェニル−2’−デオキシイノシン、2’−O−リボシルグアノシン(リン酸塩)(Gr(p))、1−チオ−グアノシン、O6−メチル−グアノシン、O6−メチル−2’−デオキシグアノシン、2’−F−アラ−グアノシン、および2’−F−グアノシンが挙げられる。
いくつかの実施形態では、修飾核酸は修飾gRNAであり得る。本明細書に記載されるgRNAのいずれでも、このセクションに従って修飾され得るものと理解される。本明細書で考察されるように、一過性発現核酸または送達された核酸は、例えば、細胞ヌクレアーゼによる分解を被りやすい。従って、一態様では、本明細書に記載される修飾gRNAは、ヌクレアーゼに対する安定性を導入する1つまたは複数の修飾ヌクレオシドもしくはヌクレオチドを含んでもよい。本明細書に記載されるこれらの、またはその他の修飾gRNAは、特定の細胞型(例えば、T細胞などの循環細胞)について増強された安定性を呈示し、それが、認められる改善の原因ではないかと考えられる。
B1およびB1’の各々は、独立して
各R1は、独立して、任意選択的にフェニルもしくは6員ヘテロアリールにより置換されたC1〜4アルキルであり;
R2、R2’、およびR3’の各々は、独立して、H、F、OH、もしくはO−C1〜4アルキルであり;
X、YおよびZの各々は、独立して、OまたはSであり;
X’およびY’の各々は、独立して、OまたはCH2である)
を有する。
B1およびB1’の各々は、独立して
各R1は、独立して、任意選択的にフェニルもしくは6員ヘテロアリールにより置換されたC1〜4アルキルであり;
R2、R2’、およびR3’の各々は、独立して、H、F、OH、もしくはO−C1〜4アルキルであり;
W、X、Y、およびZの各々は、独立して、OまたはSであり;
X’、Y’、およびZ’の各々は、独立して、OまたはCH2である)
を有する。
B1およびB1’の各々は、独立して
各R1は、独立して、任意選択的にフェニルもしくは6員ヘテロアリールにより置換されたC1〜4アルキルであり;
R2、R2’、およびR3’の各々は、独立して、H、F、OH、もしくはO−C1〜4アルキルであり;
V、W、X、Y、およびZの各々は、独立して、OまたはSであり;
W’、X’、Y’、およびZ’の各々は、独立して、OまたはCH2である)
を有する。
マイクロRNA(またはmiRNAs)は、天然細胞性19〜25ヌクレオチド長の非コードRNAである。それらは、例えば、mRNAの3’UTRなどで、適切なmiRNA結合部位を有する核酸分子に結合し、遺伝子発現を下方制御する。下方制御は、核酸分子安定性の低下または翻訳阻害のどちらかである。例えば、Cas9をコードするmRNAなどの本明細書で開示されるRNA種は、例えば、その3’UTRなどに、miRNA結合部位を含み得る。miRNA結合部位は、選択された細胞型内の発現(expression is)の下方制御を促進するように選択され得る。一例として、肝臓に豊富なマイクロRNAであるmiR−122に対する結合部位の組み込みは、肝臓における対象遺伝子の発現を阻害し得る。
本明細書には、CRISPR/Cas9システムを用いて、対立遺伝子の編集用のgRNAを同定するためのシステム、方法およびコンピューター可読媒体が記載される。さらに、CRISPR/Cas9システムを用いて、対立遺伝子の編集用のgRNAを同定するデータベーススキーマを実行もしくは作成するためのシステム、方法およびコンピューター可読媒体が本明細書に記載される。gRNA同定システムは、ユーザー(例えば、医師もしくは医療専門家、臨床コーディネーター、医師、または対立遺伝子配列決定検査技師)が、特定の対立遺伝子を編集するのに好適なgRNAを同定することを可能にする。本明細書に記載されるように、ユーザーは、標的化移植片レシピエントと標的化移植片ドナー間の対立遺伝子マッチの数を増加するために、対立遺伝子を編集することを望む場合がある。gRNA同定システムは、レシピエント由来の対立遺伝子およびドナー候補由来の対立遺伝子に関するデータを受信し、入力からミスマッチ対立遺伝子を同定する。次に、gRNA同定システムは、データに問い合わせて、ドナー候補由来の対立遺伝子を編集するのに好適なgRNAのリストを作成する。1つまたは複数の基準に基づいてgRNAのリストをランク付けする。gRNA同定システムはまた、例えば、対立遺伝子、gRNA、ハプロタイプ、および系統情報に関するデータを保存する様々なテーブルを含むデータベーススキーマの実行も包含する。
候補gRNAの適合性は、本実施例に記載されるように評価され得る。キメラgRNAについて記載されるが、アプローチはまた、モジュラーgRNAを評価するのにも使用され得る。
各gRNA毎に、1対の重複オリゴヌクレオチドが設計されて入手される。オリゴヌクレオチドは、アニールされて、長いキメラgRNAの上流U6プロモーターおよび残りの配列を含有する、消化ベクター骨格にライゲートされる。プラスミドは配列確認されて、十分な量の形質移入品質のDNAを生成するために準備される。交互の(Alternate)プロモーターを使用して、生体内転写(例えば、H1プロモーター)または生体外転写(例えば、T7プロモーター)が駆動されてもよい。
各gRNA毎に、単一オリゴヌクレオチドが設計されて入手される。U6プロモーターおよびgRNAスキャフォールド(例えば、第1の相補的ドメイン;連結ドメイン;第2の相補的ドメイン;隣接ドメイン;およびテールドメインをはじめとする、crRNAおよびtracrRNAに由来する配列をはじめとする、標的化ドメイン以外の全てを含む)は、別々にPCR増幅されて、dsDNA分子として精製される。gRNA特異的オリゴヌクレオチドがPCR反応で使用されて、オリゴヌクレオチド中で特定化された標的化ドメインによって連結する、U6およびgRNAスキャフォールドを縫い合わせる。結果として生じるdsDNA分子(STITCHR生成物)は、形質移入のために精製される。交互の(Alternate)プロモーターを使用して、生体内転写(例えば、H1プロモーター)または生体外転写(例えば、T7プロモーター)が駆動されてもよい。任意のgRNAスキャフォールドを使用して、任意の細菌種に由来するCas9と適合性のgRNAが生成されてもよい。
試験される各gRNAは、プラスミド発現Cas9および小量のGFP発現プラスミドと共に、ヒト細胞に形質移入される。予備実験では、これらの細胞は、93T、K562またはU2OSなどの不死化ヒト細胞株であり得る。代案としては、初代ヒト細胞が使用されてもよい。この場合、細胞は、最終的な治療細胞標的(例えば、赤血球系細胞)に関連があってもよい。可能な治療標的細胞集団と類似した初代細胞の使用は、内在性クロマチンおよび遺伝子発現の文脈で、遺伝子標的化比率に関する重要な情報を提供してもよい。
遺伝子標的化効率のさらなる評価のために、最初の試験で最大レベルのNHEJを誘導するgRNAが選択され得る。この場合、細胞は疾病対象に由来し、したがって関連変異を有する。
遺伝子標的化効率のさらなる評価のために、最初の試験で最大レベルのNHEJを誘導するgRNAを選択することができる。この場合、細胞は疾病対象に由来し、したがって関連変異を有する。
野生型CCR5遺伝子産物の発現を阻止するように遺伝子修飾されたオートロガスCD34+造血幹/前駆細胞(HSPC)は、通常、HIV感染を受けやすいHIVウイルスHSPC子孫(例えば、マクロファージおよびCD4Tリンパ球)の侵入を阻止する。臨床的に、CCR5ケモカイン受容体のコード配列に遺伝子変異を含むHSPCの移植は、HIV感染を長期間制御することが証明されている(Huetter.et al.,New England Journal Of Medicine,2009;360(7):692−698)。CRISPR/Cas9プラットフォームを用いたゲノム編集は、例えば、編集された遺伝子座での遺伝子発現の阻害をもたらし得る標的化切断部位にインデルを生成することによって、内在性遺伝子標的を正確に改変する。この実施例では、セクションII(gRNAをデザインする方法)に記載される基準に基づいて選択された11のS.アウレウス(S.aureus)Cas9gRNA(表23)を用いた遺伝子編集。
ウイルス−宿主共進化の間に、mRNAのキャッピングを模倣するウイルスRNAキャッピングは進化して、ウイルスRNAが、細胞の自然免疫系からの検出を免れることを可能にした(Delcroy et al.,2012,Nature Reviews Microbiology 10:51−65)。造血幹/前駆細胞中のトール様受容体は、自然免疫応答、細胞老化、およびプログラム細胞死を引き起こし得る外来の一本鎖および二本鎖RNAの存在を感知する(Kajaste−Rudnitski and Naldini,2015,Human Gene Therapy,26:201−209)。初期実験の結果から、GFPmRNA単独を用いて電気穿孔された細胞と比較して、非修飾標的特異的gRNAおよびCas9mRNAを用いて電気穿孔されたヒト造血幹/前駆細胞は、細胞寿命、増殖能、複能性の低減(例えば、赤血球分化能の喪失および歪んだ骨髄系分化)を招くことが立証された。この課題に取り組むために、細胞の老化およびアポトーシスは、外来核酸の標的細胞感知および自然免疫応答の誘導、さらにはこれに続くプログラム細胞死の誘導ならびに増殖能および分化能の喪失に起因すると仮定された。
この実施例では、アフリカ系アメリカ人レシピエント対象がHSCTを必要とする。レシピエントのHLAタイピングを従来の方法(例えば、DNA配列決定)により行った後、骨髄および臍帯血ドナー登録簿で利用可能なドナー遺伝子型と比較する。完全にマッチするドナーは、全米骨髄バンク(National Marrow Donor Program)登録簿、全米臍帯血バンク(National Cord Blood Program)登録簿、またはその他の幹細胞もしくは臍帯血バンク登録簿でも見出すことができない。しかし、部分的にマッチする臍帯血ヨーロッパ系アメリカ人(白色人種)ドナーが同定されており、その場合、アロ−UCTの要件を満たす臍帯血(CB)マッチングのために、遺伝子座の6対立遺伝子の5つが要求される(すなわち、HLA−A、HLA−B、HLA−DRB1)(図16A〜16B)。ドナー候補とレシピエント間のマッチングのレベルを高める目的で、A*02:01:01対立遺伝子に特異的なCas9および1つまたは複数のgRNAを、その特定の対立遺伝子の標的化破壊(片アレル遺伝子編集)のために、ドナー臍帯血HSPCに送達する。1つまたは複数の恐らく修飾された(例えば、キャップ/テール付加)gRNAを、破壊しようとする特定のHLA−A対立遺伝子のために作製された上位階層gRNAから選択する(表24)。Cas9/gRNAで対立遺伝子を破壊した後、T7E1アッセイおよびDNA配列解析によって、対立遺伝子の破壊を確認する。HLA−Alo、例えば、HLA−A+/−、例えば、HLA−A*02:01:01:01陰性細胞(例えば、HLA−A*02:01:01:01片アレル破壊が成功している細胞)を選別により精製する。ミスマッチレシピエントHLA−A対立遺伝子(例えば、A*01:01:01:01)DNA配列(例えば、cDNA、図17A〜17B)を作製し、レンチウイルスベクターにクローン化する。レシピエント細胞におけるこの対立遺伝子を調節する内在性プロモーター配列を配列決定し、さらに、A*01:01:01:01cDNA配列上流のレンチウイルスベクターにクローン化する。次に、このHLA−Aトランスジーン発現カセット(例えば、マッチHLA対立遺伝子を調節するHLAプロモーター)をレンチウイルスベクター粒子にパッケージする。選別されたドナーHLA−Alo、例えば、HLA−A+/−、例えば、HLA−A*02:01:01:01陰性細胞をレンチウイルスベクター粒子と接触させて、細胞中にA*01:01:01:01トランスジーン発現カセットを遺伝子移入する。次に、形質導入された細胞を、細胞表面上のHLA−Aの発現増大(形質導入されていないHLA−Alo細胞と比較して)に基づいて選別する。HLA−A片アレル遺伝子置換の後、HLA修飾臍帯血ドナーHSPCは、6HLA遺伝子座の6つがレシピエント対象とマッチする。マッチするドナー臍帯血HSPCを従来の臍帯血移植片臨床プロトコルに従って、レシピエント対象に移植する。
この実施例では、ヒスパニック系(ラテンアメリカ人)レシピエント対象がHSCTを必要とする。レシピエントのHLAタイピングを従来の方法(例えば、DNA配列決定)により行った後、骨髄および臍帯血ドナー登録簿で利用可能なドナー遺伝子型と比較する。完全にマッチするドナーは、全米骨髄バンク(National Marrow Donor Program)登録簿、全米臍帯血バンク(National Cord Blood Program)登録簿、またはその他の幹細胞もしくは臍帯血バンク登録簿でも見出すことができない。しかし、部分的にマッチする臍帯血ヨーロッパ系アメリカ人(白色人種)ドナーが同定されており、その場合、アロ−UCTの要件を満たす臍帯血(CB)マッチングのために、遺伝子座の6対立遺伝子の4つが要求される(すなわち、HLA−A、HLA−B、HLA−DRB1)(図18A〜18B)。ドナー候補とレシピエント間のマッチングのレベルを高める目的で、HLA−A遺伝子座を標的化する(例えば、ドナー細胞中の両方のHLA−A対立遺伝子に共通の配列を標的化する)Cas9および1つまたは複数のgRNAを、その遺伝子の標的化破壊(両アレル遺伝子編集)のために、ドナー臍帯血HSPCに送達する。1つまたは複数のgRNA(恐らく修飾されたgRNA、例えば、キャップ/テール付加)を、遺伝子座で破壊しようとするHLA−A対立遺伝子のために作製された上位階層gRNAから選択する(表25)。Cas9/gRNAによる遺伝子座の両アレル破壊後、T7E1アッセイおよびDNA配列解析によって、対立遺伝子の破壊を確認する。HLA−A−/−、例えば、HLA−A*02:01:01:01およびA*29:02:01:01陰性細胞(例えば、両アレル破壊が成功している細胞)を選別により精製する。初めドナー細胞中に存在しなかったレシピエント対象同一HLA−A対立遺伝子のDNA配列)(例えば、cDNA)(例えば、A*01:01:01:01およびA*23:01:01を作製し、レンチウイルスベクターにクローン化する。レシピエント対象細胞中のこれらの対立遺伝子を調節する内在性プロモーター配列を配列決定し、さらに、A*01:01:01:01およびA*23:01:01cDNA配列上流の1つまたは複数のレンチウイルスベクターに、対立遺伝子を調節する各々のプロモーター(対象細胞中のプロモーター/対立遺伝子組合せに対応する)を用いて、クローン化する。このHLA−Aトランスジーン発現カセットをレンチウイルスベクター粒子にパッケージする。選別されたドナーHLA−A−/−、例えば、HLA−A*02:01:01:01およびA*29:02:01:01陰性細胞(例えば、両アレル破壊が成功している細胞)をレンチウイルスベクター粒子と接触させて、レシピエント細胞中にA*01:01:01:01およびA*23:01:01トランスジーン発現カセットの両方を遺伝子移入する。次に、形質導入された細胞を、細胞表面上のHLA−Aの発現増大(形質導入されていないHLA−A−/−細胞と比較して)に基づいて選別する。HLA−A両アレル遺伝子置換の後、HLA修飾臍帯血ドナーHSPCは、6HLA遺伝子座の6つがレシピエント対象とマッチする。マッチしたドナー臍帯血HSPCを従来の臍帯血移植片臨床プロトコルに従って、レシピエント対象に移植する。
この実施例では、ヒスパニック系(ラテンアメリカ人)レシピエント対象がHSCTを必要とする。レシピエントのHLAタイピングを従来の方法(例えば、DNA配列決定)により行った後、骨髄および臍帯血ドナー登録簿で利用可能なドナー遺伝子型と比較する。完全にマッチするドナーは、全米骨髄バンク(National Marrow Donor Program)登録簿、全米臍帯血バンク(National Cord Blood Program)登録簿、またはその他の幹細胞もしくは臍帯血バンク登録簿でも見出すことができない。しかし、ハプロタイプ同一の臍帯血ヨーロッパ系アメリカ人(白色人種)ドナーが同定されており、その場合、アロ−UCTの要件を満たす臍帯血(CB)マッチングのために、遺伝子座(例えば、ハプロタイプ同一の)の6対立遺伝子の3つが要求される(すなわち、HLA−A、HLA−B、HLA−DRB1)(図18A〜18B)。ドナー候補とレシピエント間のマッチングのレベルを高める目的で、ドナーHSPCにおいてマッチしないハプロタイプ中の対立遺伝子(例えば、A*02:01:01:01、B*08:01:01、およびDRB1*03:01:01)を標的化する、Cas9および複数のgRNA(例えば、恐らく修飾されたgRNA、例えば、キャップ/テール付加gRNA)を、複数の遺伝子座の標的化片アレル破壊(例えば、HLA−A、HLA−B、HLA−DRB1の多重遺伝子編集)のために、ドナー臍帯血HSPCに送達する。1つまたは複数の恐らく修飾されたgRNA(例えば、キャップ/テール付加)を、上記の特定の遺伝子座で破壊しようとするHLA−A、HLA−B、およびHLA−DRB1ドナー特異的対立遺伝子(レシピエントとマッチしない)のために作製された上位階層gRNAから選択する(表26)。Cas9/gRNAによる遺伝子座の標的化片アレル破壊後、T7E1アッセイおよびDNA配列解析によって、対立遺伝子の破壊を確認する。HLA−A+/−、例えば、HLA−A*02:01:01:01陰性;HLA−B+/−、例えば、B*08:01:01陰性;およびHLA−DRB1+/−、例えば、DRB1*03:01:01:01陰性細胞(例えば、3つの遺伝子座で片アレル破壊が成功している細胞)を選別により精製する。初めハプロタイプ同一ドナー細胞中に存在しなかったミスマッチレシピエント対象HLA−A対立遺伝子(例えば、A*03:01:01:01、B*07:02:01、DRB1*15:01:01:01)を配列決定してから、DNA配列(例えば、cDNA)は、レシピエント細胞中のこれらの対立遺伝子に隣接するDNAを配列決定することによって決定されたそれらの内在性プロモーター上流の1つまたは複数のレンチウイルスベクターにクローン化する。HLA−A、−B、および−DRB1トランスジーン発現カセットをレンチウイルスベクター粒子にパッケージする。選別されたドナーHLA−A+/−、HLA−B+/−、HLA−DRB1+/−細胞、例えば、(例えば、HLA−A、−B、−DRB1の多重片アレル破壊が成功している細胞)をレンチウイルスベクター粒子と接触させて、レシピエント細胞中にHLA−A、−B、および−DRB1トランスジーン発現カセットを遺伝子移入する。次に、形質導入された細胞を、細胞表面上のHLA−A、−B、および−DRB1の発現増大(形質導入されていないHLA−A+/−、HLA−B+/−、HLA−DRB1+/−細胞と比較して)に基づいて選別する。HLA−A、−B、および−DRB1遺伝子置換の後、HLA修飾臍帯血ドナーHSPCは、6HLA遺伝子座の6つがレシピエント対象とマッチする。マッチするドナー臍帯血HSPCを従来の臍帯血移植片臨床プロトコルに従って、レシピエント対象に移植する。
レシピエントに対して6対立遺伝子でのHLAマッチングが不適レベル(3遺伝子座、3/6ミスマッチHLA対立遺伝子)であるドナー候補とのマッチングのレベルを高めるために、本明細書に記載のデータベースを用い、Cas9および特異的に同定されたgRNAを使用して、標的化対立遺伝子特異的遺伝子編集を実施した。その結果、ミスマッチドナー(表27、患者1)からの細胞同士のHLAマッチングのレベルが、遺伝子破壊(表28)によって、レシピエント患者候補(表27、患者2)への移入に好適となった(HLAミスマッチを2/6ミスマッチHLA対立遺伝子に低減することにより)。
レシピエントに対して6対立遺伝子でのマッチングが不適レベル(3遺伝子座、4/6ミスマッチHLA対立遺伝子)であるドナー候補とのマッチングのレベルを高めるために、本明細書に記載のデータベースを用い、Cas9および特異的に同定されたgRNAを使用して、ミスマッチ対立遺伝子HLA−B 51:01およびHLA−DRB1 04:02の多重遺伝子破壊(表30)を実施した。その結果、ミスマッチドナー(表30、患者3)からの細胞同士のHLAマッチングのレベルが、レシピエント患者候補(表30、患者2)への移入に好適となった(HLAミスマッチを2/6ミスマッチHLA対立遺伝子に低減)。
レシピエントに対して6対立遺伝子でのHLAマッチングが不適レベル(3遺伝子座、4/6ミスマッチHLA対立遺伝子)のドナー候補とのマッチングのレベルを高めるために、本明細書に記載のデータベースを用い、Cas9および特異的に同定されたgRNAを使用して、HLA−A 02:01およびHLA−DRB1 04:02のミスマッチ対立遺伝子の多重遺伝子破壊(表33)を実施した。その結果、ミスマッチドナー(表33、患者3)からの細胞同士のHLAマッチングのレベルが、レシピエント患者候補(表33、患者1)への移入に好適となった(HLAミスマッチを2/6ミスマッチHLA対立遺伝子に低減することにより)。
移植されたHLA遺伝子ミスマッチ同種異系細胞(例えば、HSC)の拒絶の尤度を低減するために、移植を必要とするレシピエント対象を6つのHLA対立遺伝子(HLA−A、HLA−B、HLA−DRB1で各々2つずつの対立遺伝子)でHLAタイピングする(例えば、HLA−A、HLA−B、HLA−DRB1多型を決定する)。理想的には、6/6HLA対立遺伝子マッチは、移植後にGVHDを発生するリスクが低いことから、レシピエント遺伝子型は、同じ6/6HLA対立遺伝子を有するドナーとマッチする。6/6HLA対立遺伝子を有するドナーは利用可能ではない(例えば、骨髄もしくは臍帯血HSCドナー登録簿、または近縁の家族メンバーから)が、5/6、4/6、3/6もしくは2/6HLA対立遺伝子マッチを有する部分的にマッチするドナーが利用可能である場合、本明細書に記載の方法を用いて、部分的マッチドナーとレシピエント間のミスマッチを低減することができる。必要に応じて、本明細書に記載される遺伝子編集方法を用いて単一対立遺伝子または複数の対立遺伝子(2つ、3つ、4つ、5つ、もしくは6つの対立遺伝子)を破壊して、移植レシピエントにおけるGVHD発生のリスクおよび/または疾患の重症度を低減することができる。以下の実施例におけるドナーとレシピエント間のHLA遺伝子マッチングを記載する全ての事例において、分子はマッチ対立遺伝子の数を示し、分母は発現された対立遺伝子の数を示す。
(a)単一対立遺伝子(例えば、HLA−A*0301g、HLA−B*0702、HLA−DRB1*1501)の破壊(例えば、ノックアウト)による4/6マッチの生成。
(b)2つの対立遺伝子(例えば、HLA−A*0301gとHLA−B*0702、HLA−A*0301gとHLA−DRB1*1501、HLA−B*0702とHLA−DRB1*1501)の多重破壊(例えば、ノックアウト)による5/6マッチの生成。
(c)3つの対立遺伝子(例えば、HLA−A*0301g、HLA−B*0702、HLA−DRB1*1501)の多重破壊(例えば、ノックアウト)による6/6マッチの生成。
(a)単一対立遺伝子(例えば、HLA−A*0101g、HLA−B*0801gまたはHLA−DRB1*0301)の破壊(例えば、ノックアウト)による4/6HLAマッチの生成。
(b)2つの対立遺伝子(例えば、HLA−A*0101gとHLA−B*0801g、HLA−A*0101gとHLA−DRB1*0301、HLA−B*0801gとHLA−DRB1*0301)の多重破壊(例えば、ノックアウト)による5/6マッチの生成。
(c)3つの対立遺伝子(例えば、HLA−A*0101g、HLA−B*0801gおよびHLA−DRB1*0301)の多重破壊(例えば、ノックアウト)による6/6マッチの生成。
(a)単一対立遺伝子(例えば、HLA−A*0207g、HLA−B*4601またはHLA−DRB1*0901)の破壊(例えば、ノックアウト)による4/6HLAマッチの生成。
(b)2つの対立遺伝子(例えば、HLA−A*0207gとHLA−B*4601、HLA−A*0207gとHLA−DRB1*0901、HLA−B*4601とHLA−DRB1*0901)の多重破壊(例えば、ノックアウト)による5/6マッチの生成。
(c)3つの対立遺伝子(例えば、HLA−A*0207g、HLA−B*4601、およびHLA−DRB1*0901)の多重破壊(例えば、ノックアウト)による6/6マッチの生成。
(a)単一対立遺伝子(例えば、HLA−A*0101g、HLA−B*0801gまたはHLA−DRB1*0301)の破壊(例えば、ノックアウト)による4/6HLAマッチの生成。
(b)2つの対立遺伝子(例えば、HLA−A*0101gとHLA−B*0801g、HLA−A*0101gとHLA−DRB1*0301、HLA−B*0801gとHLA−DRB1*0301)の多重破壊(例えば、ノックアウト)による5/6マッチの生成。
(c)3つの対立遺伝子(例えば、HLA−A*0207g、HLA−B*4601、およびHLA−DRB1*0301)の多重破壊(例えば、ノックアウト)による6/6マッチの生成。
(a)単一対立遺伝子(例えば、HLA−B*0801gまたはHLA−DRB1*0301)の破壊(例えば、ノックアウト)による5/6マッチの生成。
(b)2つの対立遺伝子(例えば、HLA−B*0801gとHLA−DRB1*0301)のT多重破壊(例えば、ノックアウト)による6/6マッチの生成。
(a)単一対立遺伝子(例えば、HLA−DRB1*0301)の破壊(例えば、ノックアウト)による6/6マッチの生成。
以下の記述および表は、ドナー組織またはHSCTを必要とするレシピエントで最も一般的にマッチしないHLAハプロタイプにおいて向上したHLAマッチを生成するための、ドナー細胞中の1、2もしくは3HLA遺伝子座のノックアウトを説明する。
(a)ドナー細胞の単一対立遺伝子(例えば、HLA−A、HLA−BもしくはHLA−DRB1)を破壊(例えば、ノックアウト)して、外来抗原認識に関して有効な4/6マッチのために)、3/6HLA対立遺伝子(1/6ドナー対立遺伝子は発現されない)でレシピエントに対するドナーのHLAマッチを生成する。単一HLAドナー対立遺伝子の破壊は、4/6マッチを有効に生成し、これは、レシピエントにおけるGVHDの発生リスクおよび/またはその重症度を低減し得る。
(b)ドナー細胞の2つの対立遺伝子(例えば、HLA−A対立遺伝子とHLA−B対立遺伝子、HLA−A対立遺伝子とHLA−DRB1対立遺伝子、もしくはHLA−B対立遺伝子とHLA−DRB1対立遺伝子)を破壊(例えば、ノックアウト)して、外来抗原認識に関して有効な5/6マッチのために、3/6HLA対立遺伝子(2/6ドナー対立遺伝子は発現されない)でレシピエントに対するドナーのHLAマッチを生成する。2つのHLAドナー対立遺伝子の破壊は、5/6マッチを有効に生成し、これは、レシピエントにおけるGVHDの発生リスクおよび/またはその重症度を低減し得る。
(c)ドナー細胞の3つの対立遺伝子(例えば、HLA−A対立遺伝子、HLA−B対立遺伝子、およびHLA−DRB1対立遺伝子)を破壊(例えば、ノックアウト)して、外来抗原認識に関して有効な6/6マッチのために、3/6HLA対立遺伝子(3/6ドナー対立遺伝子は発現されない)でレシピエントに対するドナーのHLAマッチを生成する。3つのHLAドナー対立遺伝子の破壊は、6/6マッチを有効に生成し、これは、レシピエントにおけるGVHDの発生リスクおよび/またはその重症度を低減し得る。
(a)ドナー細胞の単一対立遺伝子(例えば、HLA−A、HLA−BもしくはHLA−DRB1)を破壊(例えば、ノックアウト)して、外来抗原認識に関して有効な5/6マッチのために)、4/6HLA対立遺伝子(1/6ドナー対立遺伝子は発現されない)でレシピエントに対するドナーのHLAマッチを生成する。単一HLAドナー対立遺伝子の破壊は、5/6マッチを有効に生成し、これは、レシピエントにおけるGVHDの発生リスクおよび/またはその重症度を低減し得る。
(b)ドナー細胞の2つの対立遺伝子(例えば、HLA−A対立遺伝子とHLA−B対立遺伝子、HLA−A対立遺伝子とHLA−DRB1対立遺伝子、もしくはHLA−B対立遺伝子とHLA−DRB1対立遺伝子)を破壊(例えば、ノックアウト)して、外来抗原認識に関して有効な6/6マッチのために、4/6HLA対立遺伝子(2/6ドナー対立遺伝子は発現されない)でレシピエントに対するドナーのHLAマッチを生成する。2つのHLAドナー対立遺伝子の破壊は、6/6マッチを有効に生成し、これは、レシピエントにおけるGVHDの発生リスクおよび/またはその重症度を低減し得る。
(c)ドナー細胞の単一対立遺伝子(例えば、HLA−A、HLA−BもしくはHLA−DRB1)を破壊(例えば、ノックアウト)して、外来抗原認識に関して有効な6/6マッチのために)、5/6HLA対立遺伝子(1/6ドナー対立遺伝子は発現されない)でレシピエントに対するドナーのHLAマッチを生成する。単一HLAドナー対立遺伝子の破壊は、6/6マッチを有効に生成し、これは、レシピエントにおけるGVHDの発生リスクおよび/またはその重症度を低減し得る。
本明細書で言及される全ての出版物、特許、および特許出願は、あたかも個々の出版物、特許または特許出願が、具体的にそして個別に、参照により援用されると示されるかのように、その内容全体を参照により本明細書に援用する。矛盾する場合は、本明細書のあらゆる定義を含め、本出願が優先される。
当業者は、単に通例の実験法を使用して、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態の多くの同等物を認識し、または見極めることができるであろう。このような同等物は、以下の特許請求の範囲に包含されることが意図される。
Claims (102)
- 免疫適合性血球を生成する方法であって、以下:
第1の対立遺伝子特異的修飾gRNA分子およびCas9分子と血球を接触させて、前記第1対立遺伝子特異的修飾gRNA分子および前記Cas9分子を、内在性免疫原性遺伝子の第1の対立遺伝子と結合させ、
これにより、前記内在性免疫原性遺伝子の第1の対立遺伝子を修飾して、前記免疫適合性血球を生成するステップ
を含む方法。 - 血球中の内在性免疫原性遺伝子を修飾する方法であって、以下:
データベーススキーマを用いて、第1の対立遺伝子特異的gRNA分子を選択するステップ、ならびに
前記第1の対立遺伝子特異的gRNA分子およびCas9分子と前記血球を接触させて、前記対立遺伝子特異的gRNA分子および前記Cas9分子を、内在性免疫原性遺伝子の第1の対立遺伝子と結合させ、これにより、前記内在性免疫原性遺伝子の第1の対立遺伝子を修飾するステップ
を含む方法。 - 血球中の内在性免疫原性遺伝子の第1の対立遺伝子の前記細胞表面発現を低減する方法であって、以下:
第1の対立遺伝子特異的gRNA分子およびCas9分子と前記血球を接触させて、前記対立遺伝子特異的gRNA分子および前記Cas9分子を、前記内在性免疫原性遺伝子の第1対立遺伝子と結合させ、
これにより、前記内在性免疫原性遺伝子の第1の対立遺伝子の前記細胞表面発現を低減するステップ
を含む方法。 - ハプロタイプ修飾血球を対象に移植する方法であって、以下:
内在性免疫原性遺伝子に第1ハプロタイプを有する第1の対象から血球を単離するステップ、
第1対立遺伝子特異的gRNA分子およびCas9分子と前記血球を接触させて、前記第1対立遺伝子特異的gRNA分子を、内在性免疫原性遺伝子の第1対立遺伝子と結合させ、これにより、前記内在性免疫原性遺伝子の第1の対立遺伝子を修飾するステップ、ならびに
内在性免疫原性遺伝子に第2ハプロタイプを有する第2の対象に前記血球を移入するステップ
を含む方法。 - 対立遺伝子特異的遺伝子修飾を有する細胞の集団を含む組成物を製造する生体外の方法であって、以下:
対立遺伝子特異的gRNA分子およびCas9分子と細胞の集団を接触させて、前記対立遺伝子特異的gRNA分子および前記Cas9分子を、同定可能な遺伝子産物をコードする遺伝子の単一対立遺伝子と結合させるステップ;ならびに
前記同定可能な遺伝子産物を発現するが、前記第1対立遺伝子は発現しない細胞を富化するステップ
を含む方法。 - 前記細胞の集団が、血球の集団である、請求項5に記載の方法。
- 前記血球が、造血幹/前駆細胞(HSC)である、請求項6に記載の方法。
- 前記細胞の集団が、循環血球の集団、動員血球の集団、骨髄細胞の集団、骨髄系前駆細胞の集団、リンパ球系前駆細胞の集団、リンパ球の集団、複能性前駆細胞の集団、系列特異的前駆細胞の集団、内皮細胞の集団、もしくは間葉系間質細胞の集団、またはこれらの組合せからなる群から選択される、請求項5〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記血球が、幹細胞である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記幹細胞が、造血幹/前駆細胞(HSC)である、請求項4に記載の方法。
- 前記細胞が、循環血球、動員血球、骨髄細胞、骨髄系前駆細胞、リンパ球系前駆細胞、リンパ球、複能性前駆細胞、系列特異的前駆細胞、内皮細胞、または間葉系間質細胞からなる群から選択される、請求項1〜4、9および10のいずれか1項に記載の方法。
- 前記gRNA分子が、修飾gRNA分子である、請求項2〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 前記gRNA分子が、ヒト白血球抗原(HLA)遺伝子中の標的ドメインと相補的である標的化ドメインを含む、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
- 前記HLA遺伝子が、HLA−A、HLA−B、HLA−C、HLA−DRB1、HLA−DRB3/4/5、HLA−DQ、およびHLA−DPからなる群から選択される、請求項13に記載の方法。
- 前記細胞、または細胞の集団を、第2のgRNA分子と接触させるステップをさらに含み、ここで、前記第2のgRNA分子は、表16に記載される遺伝子を標的化する、請求項1〜14のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第2のgRNA分子が、修飾gRNA分子である、請求項15に記載の方法。
- 前記細胞を第2のCas9分子と接触させるステップをさらに含む、請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法。
- 前記Cas9分子が、酵素的に活性なCas9(eaCas9)分子である、請求項1〜17のいずれか1項に記載の方法。
- 前記eaCas9分子が、前記内在性免疫原性遺伝子内に一本鎖切断を生成する、請求項18に記載の方法。
- 前記eaCas9分子が、前記内在性免疫原性遺伝子内に二本鎖切断を生成する、請求項15に記載の方法。
- 前記Cas9分子が、野生型Cas9、Cas9ニッカーゼ、不活性型Cas9(dCas9)、分割型Cas9、および誘導性Cas9からなる群から選択される、請求項1〜20のいずれか1項に記載の方法。
- 前記Cas9分子が、N末端RuvC様ドメイン切断活性を含むが、HNH様ドメイン切断活性は含まない、請求項1〜18のいずれか1項に記載の方法。
- 前記Cas9分子が、ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)Cas9のアミノ酸位置N863に対応するアミノ酸位置にアミノ酸突然変異を含む、請求項22に記載の方法。
- 前記Cas9分子が、HNH様ドメイン切断活性を含むが、N末端RuvC様ドメイン切断活性を含まない、請求項1〜18のいずれか1項に記載の方法。
- 前記Cas9分子が、ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)Cas9のアミノ酸位置D10に対応するアミノ酸位置にアミノ酸突然変異を含む、請求項24に記載の方法。
- 前記Cas9分子が、Cas9ポリペプチドである、請求項1〜25のいずれか1項に記載の方法。
- 前記Cas9ポリペプチドが、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)Cas9ポリペプチドである、請求項26に記載の方法。
- 前記Cas9ポリペプチドが、ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)Cas9ポリペプチドである、請求項26に記載の方法。
- 前記gRNA分子と前記Cas9ポリペプチドが、事前に形成されたリボヌクレオチド複合体中で結合されている、請求項26〜28のいずれか1項に記載の方法。
- 前記Cas9分子が、Cas9ポリペプチドをコードする核酸である、請求項1〜25のいずれか1項に記載の方法。
- 前記修飾gRNA分子が、5’末端キャップ構造を含む、請求項1または12〜30のいずれか1項に記載の方法。
- 前記5’末端キャップ構造が、3’−O−Me−m7G(5’)ppp(5’)G抗リバースキャップアナログ(ARCA)である、請求項31に記載の方法。
- 前記修飾gRNA分子が、3’末端ポリ−Aテールを含む、請求項1または12〜32のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞、または前記細胞の集団をテンプレート核酸と接触させるステップをさらに含む、請求項1〜33のいずれか1項に記載の方法。
- 前記テンプレート核酸が、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド(ssODN)である、請求項34に記載の方法。
- 前記テンプレート核酸が、アデノ関連ウイルス(AAV)または組込み欠陥レンチウイルス(ILDV)を用いて、細胞、または細胞の集団に送達される、請求項35に記載の方法。
- 前記ssODNが、5’ホスホロチオエート修飾を含む、請求項35に記載の方法。
- 前記ssODNが、3’ホスホロチオエート修飾を含む、請求項35に記載の方法。
- 前記ssODNが、5’ホスホロチオエート修飾と3’ホスホロチオエート修飾を含む、請求項35に記載の方法。
- 前記細胞、または前記細胞の集団をトランスジーンと接触させるステップをさらに含み、ここで、前記接触ステップは、前記トランスジーンが、前記細胞の前記ゲノム、または前記細胞の集団の細胞に組み込まれることを可能にする条件下で行う、請求項1〜39のいずれか1項に記載の方法。
- 前記トランスジーンが、免疫同一ヒト白血球抗原(HLA)をコードする遺伝子、化学療法選択マーカー、細胞表面抗原、または自殺遺伝子である遺伝子である、請求項40に記載の方法。
- 前記トランスジーンが、HLA遺伝子またはその断片である、請求項41に記載の方法。
- 前記HLA遺伝子が、HLA−A、HLA−B、HLA−C、HLA−DRB1、HLA−DRB3/4/5、HLA−DQ、およびHLA−DPからなる群から選択される、請求項39に記載の方法。
- 前記細胞、または前記細胞の集団をeiCas9分子と接触させるステップをさらに含む、請求項1〜43のいずれか1項に記載の方法。
- 前記eiCas9を転写レプレッサーまたは転写アクチベーターと融合させる、請求項44に記載の方法。
- 前記細胞が、細胞の集団を含む、請求項1〜4、および5〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記対立遺伝子特異的抗体を用いて、前記細胞の集団を選別することにより、1遺伝子の特定の対立遺伝子を発現する細胞を選択するステップをさらに含む、請求項46に記載の方法。
- 前記遺伝子が、免疫原性遺伝子である、請求項47に記載の方法。
- 前記細胞の集団が、蛍光活性化細胞選別(FACS)または免疫原性マイクロビーズ媒介性細胞選別によって選別される、請求項47または請求項48に記載の方法。
- 前記内在性免疫原性遺伝子に第1ハプロタイプを有する第1の対象から前記血球を単離するステップをさらに含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記接触ステップ後に、前記内在性免疫原性遺伝子に第2ハプロタイプを有する第2の対象に前記血球を移入するステップをさらに含む、請求項1〜4または50のいずれか1項に記載の方法。
- 前記接触ステップ後に、生体外で前記細胞または細胞の集団を拡大するステップをさらに含む、請求項1〜51のいずれか1項に記載の方法。
- T細胞補充療法をさらに含む、請求項1〜52のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ハプロタイプ修飾血球が、ドナーとレシピエントの細胞間のマッチングの増大に基づく第2の対象による拒絶の低い尤度、ならびに混合リンパ球または白血球反応アッセイにより決定される低い免疫原性を有する、請求項4に記載の方法。
- 前記ハプロタイプ修飾血球が、前記第2の対象により拒絶されない、請求項4に記載の方法。
- 前記遺伝子を発現するが、前記第1対立遺伝子は発現しない細胞を富化する前記ステップが、フローサイトメトリーによって前記細胞を選別するステップを含む、請求項5に記載の方法。
- 前記遺伝子を発現するが、前記第1対立遺伝子は発現しない細胞を富化する前記ステップが、前記遺伝子の第1対立遺伝子によりコードされる前記同定可能な遺伝子産物の第1変異体と特異的に結合する第1抗体および前記同定可能な産物の第2変異体と結合する第2抗体と、前記複数の細胞の各々を接触させるステップを含む、請求項56に記載の方法。
- 前記同定可能な遺伝子産物が、細胞表面マーカーである、請求項5、56、または57のいずれか1項に記載の方法。
- 前記同定可能な遺伝子産物が、ヒト白血球抗原(HLA)である、請求項58に記載の方法。
- 前記遺伝子の第1対立遺伝子が、前記同定可能な遺伝子産物の非機能性変異体をコードする、請求項59に記載の方法。
- 前記遺伝子を発現するが、前記第1対立遺伝子は発現しない細胞を富化する前記ステップが、前記複数の細胞の各細胞において、前記同定可能な遺伝子産物の機能性変異体と結合した物質またはシグナルを検出するステップを含む、請求項56に記載の方法。
- 前記細胞または細胞の集団が、一次血球または一次血球の集団である、請求項1〜61のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1〜62のいずれか1項に記載の方法により製造される組成物。
- 薬剤として使用するための請求項63に記載の組成物。
- 移植に使用するための請求項63に記載の組成物。
- 請求項1〜62のいずれか1項に記載の方法により改変される細胞または細胞の集団。
- 請求項66に記載の細胞または細胞の集団を含む医薬組成物。
- 対象の疾患を治療または予防する方法であって、修飾細胞または請求項1〜62のいずれか1項に記載の方法により改変された細胞を前記対象に投与するステップを含む方法。
- 内在性免疫原性遺伝子の第1対立遺伝子に修飾を含む血球であって、前記血球が、第1対立遺伝子特異的修飾gRNA分子およびCas9分子と接触している血球。
- 内在性免疫原性遺伝子の第1対立遺伝子に修飾を含む血球の集団であって、前記血球の集団が、第1対立遺伝子特異的修飾gRNA分子およびCas9分子と接触している血球の集団。
- 前記免疫原性遺伝子が、ヒト白血球抗原(HLA)遺伝子である、請求項69に記載の血球、または請求項70に記載の血球の集団。
- データベーススキーマを用いて、第1対立遺伝子特異的gRNA分子を選択するステップをさらに含む、請求項1または3〜5のいずれか1項に記載の方法。
- データベーススキーマを用いて、前記第1対立遺伝子特異的gRNA分子を選択するステップが、以下:
コンピューターシステムのインターフェースを介して、第1の対象の前記内在性免疫原性遺伝子の第1の複数の対立遺伝子の一覧を受信するステップ;
前記コンピューターシステムのインターフェースを介して、第2の対象の前記内在性免疫原性遺伝子の第2の複数の対立遺伝子の一覧を受信するステップ;
前記第1および第2の複数の対立遺伝子の一覧を処理して、前記第1の複数の対立遺伝子と第2の複数の対立遺伝子との間で1つまたは複数のミスマッチ対立遺伝子を同定するステップ;
1つまたは複数のgRNA分子が、前記第2の複数の対立遺伝子の前記1つまたは複数のミスマッチ対立遺伝子を編集するのに好適であるか否かを決定するためにデータベースに問い合わせるステップ;
前記データベースからの1つまたは複数のgRNA分子が、前記1つまたは複数のミスマッチ対立遺伝子を編集するのに好適であるという決定に応じて、好適であることが判明した前記1つまたは複数のgRNA分子を同定するgRNA分子のリストを作成するステップ;
gRNA分子のリストをランク付けするステップ;ならびに
前記gRNA分子のランク付けリストを表示するステップ
を含む、請求項2または請求項72に記載の方法。 - データベーススキーマをインプリメントするための処理装置による実行の命令を保存する非一時的コンピューター可読記憶媒体であって、前記データスキーマが、以下:
主要HLA対立遺伝子に関するデータを保存する対立遺伝子テーブル;
gRNAに関するデータを保存するgRNAテーブル;
前記対立遺伝子テーブルの記録と前記gRNAテーブルの記録とのリレーションシップを保存する対立遺伝子−gRNA−リレーションテーブルであって、ここで、前記対立遺伝子テーブルは、前記対立遺伝子−gRNA−リレーションテーブルと1対多のリレーションシップを有し、前記gRNAテーブルは、前記対立遺伝子−gRNA−リレーションテーブルと1対多のリレーションシップを有する、テーブル;
ハプロタイプに関するデータを保存するハプロタイプテーブルであって、ここで、前記対立遺伝子テーブルは、前記ハプロタイプテーブルと1対多のリレーションシップを有する、テーブル;
複数の系統内で発生するハプロタイプの頻度に関するデータを保存するハプロタイプ−頻度テーブルであって、ここで、前記ハプロタイプテーブルは、前記ハプロタイプ−頻度テーブルと1対1のリレーションシップを有する、テーブル;
系統に関するデータを保存する系統テーブル;
前記ハプロタイプ−頻度テーブルの記録と前記系統テーブルの記録とのリレーションシップを保存する系統−ハプロタイプ−リレーションテーブルであって、ここで、前記ハプロタイプ−頻度テーブルは、前記系統−ハプロタイプ−リレーションテーブルと1対多のリレーションシップを有し、前記系統テーブルは、前記系統−ハプロタイプ−リレーションテーブルと1対多のリレーションシップを有する、テーブル;
複数の系統内で発生する対立遺伝子の頻度に関するデータを保存する対立遺伝子頻度テーブルであって、ここで、前記対立遺伝子テーブルは、前記対立遺伝子頻度テーブルと1対1のリレーションシップを有する、テーブル;ならびに
前記対立遺伝子頻度テーブルの記録と前記系統テーブルの記録とのリレーションシップを保存する対立遺伝子系統リレーションテーブルであって、ここで、前記対立遺伝子頻度テーブルは、前記対立遺伝子−系統−リレーションテーブルと1対多のリレーションシップを有し、前記系統テーブルは、前記対立遺伝子−系統−リレーションテーブルと1対多のリレーションシップを有するテーブル
を含む、非一時的コンピューター可読記憶媒体。 - 前記データスキーマが、以下:
マイナー組織適合性抗原に関するデータを保存するマイナー−抗原テーブル;および
マイナー組織適合性抗原に対するHLA制限に関するデータを保存する主要−マイナー−制限テーブルをさらに含み、前記マイナー−抗原テーブルは、前記主要−マイナー−制限テーブルと1対多のリレーションシップを有し、前記対立遺伝子テーブルは、前記主要−マイナー−制限テーブルと1対多のリレーションシップを有する、請求項74に記載の非一時的コンピューター可読記憶媒体。 - 前記対立遺伝子テーブルが、対立遺伝子idキー、対立遺伝子属性、遺伝子名属性、および対立遺伝子配列属性を含む、請求項74に記載の非一時的コンピューター可読記憶媒体。
- 前記gRNAテーブルが、gRNAidキー、Cas変異体属性、gRNA配列(PAMを含む)属性、gRNA配列(PAMを含まない)属性、鎖属性、直交性スコア属性、およびオフターゲットリスト情報属性を含む、請求項74に記載の非一時的コンピューター可読記憶媒体。
- 前記対立遺伝子−ガイド−リレーションテーブルが、リレーションidキー、前記対立遺伝子テーブルの対立遺伝子idキーに対応する対立遺伝子id属性、および前記gRNAテーブルのgRNAidキーに対応するgRNAid属性を含む、請求項74に記載の非一時的コンピューター可読記憶媒体。
- 前記ハプロタイプテーブルが、ハプロタイプidキー、HLA−A−対立遺伝子属性、HLA−B対立遺伝子属性、HLA−C対立遺伝子属性、HLA−DRB1遺伝子座属性、HLA−DRB3/DRB4/DRB5遺伝子座属性、HLA−DQB1対立遺伝子遺伝子座属性を含む、請求項74に記載の非一時的コンピューター可読記憶媒体。
- 前記ハプロタイプ−頻度テーブルが、ハプロタイプ頻度idキー、前記ハプロタイプテーブルのハプロタイプidキーに対応するハプロタイプid属性、ヨーロッパ系統群におけるハプロタイプの発生頻度の属性、ヨーロッパ系統群におけるハプロタイプ発生のランクの属性、アフリカ系アメリカ人系統群におけるハプロタイプの発生頻度の属性、アフリカ系アメリカ人系統群におけるハプロタイプ発生のランクの属性、アジア系統群におけるハプロタイプの発生頻度の属性、アジア系統群におけるハプロタイプ発生のランクの属性、ヒスパニック系統群におけるハプロタイプの発生頻度の属性、ヒスパニック系統群におけるハプロタイプ発生のランクの属性、ユダヤ人系統群におけるハプロタイプの発生頻度の属性、およびユダヤ人系統群におけるハプロタイプ発生のランクの属性を含む、請求項74に記載の非一時的コンピューター可読記憶媒体。
- 前記対立遺伝子−頻度テーブルが、対立遺伝子頻度idキー、前記対立遺伝子テーブルの対立遺伝子idキーに対応する対立遺伝子id属性、ヨーロッパ系統群における対立遺伝子の発生頻度の属性、ヨーロッパ系統群における対立遺伝子発生のランクの属性、アフリカ系アメリカ人系統群における対立遺伝子の発生頻度の属性、アフリカ系アメリカ人系統群における対立遺伝子発生のランクの属性、アジア系統群における対立遺伝子の発生頻度の属性、アジア系統群における対立遺伝子発生のランクの属性、ヒスパニック系統群における対立遺伝子の発生頻度の属性、ヒスパニック系統群における対立遺伝子発生のランクの属性、ユダヤ人系統群における対立遺伝子の発生頻度の属性、およびユダヤ人系統群における対立遺伝子発生のランクの属性を含む、請求項74に記載の非一時的コンピューター可読記憶媒体。
- 前記対立遺伝子−頻度テーブルが、前記対立遺伝子テーブルと依存リレーションシップを有し、前記対立遺伝子テーブルに完全に依存的である、請求項74に記載の非一時的コンピューター可読記憶媒体。
- 前記ハプロタイプ−頻度テーブルが、ハプロタイプテーブルと依存リレーションシップを有し、前記ハプロタイプテーブルに完全に依存的である、請求項74に記載の非一時的コンピューター可読記憶媒体。
- 前記gRNAが、HLA対立遺伝子を編集するために設計される、請求項74に記載の非一時的コンピューター可読記憶媒体。
- 前記ハプロタイプが、異なるHLA遺伝子の対立遺伝子群である、請求項74に記載の非一時的コンピューター可読記憶媒体。
- 1つまたは複数の対立遺伝子を編集するためのgRNAを同定するコンピューターシステムを用いて実施される方法であって、以下:
前記コンピューターシステムのインターフェースを介して、標的化移植片レシピエントの第1の複数の対立遺伝子の一覧を受信するステップ;
前記コンピューターシステムのインターフェースを介して、標的化移植片ドナーの第2の複数の対立遺伝子の一覧を受信するステップ;
前記第1および第2の複数の対立遺伝子の一覧を処理して、前記第1の複数の対立遺伝子と前記第2の複数の対立遺伝子との間で1つまたは複数のミスマッチ対立遺伝子を同定するステップ;
1つまたは複数のgRNA分子が、前記第2の複数の対立遺伝子の前記1つまたは複数のミスマッチ対立遺伝子を編集するのに好適であるか否かを決定するためにデータベースに問い合わせるステップ;
前記データベースからの1つまたは複数のgRNAが、前記1つまたは複数のミスマッチ対立遺伝子を編集するのに好適であるという決定に応じて、好適であることが判明した前記1つまたは複数のgRNAを同定するgRNAのリストを作成するステップ;
前記gRNAのリストをランク付けするステップ;ならびに
前記gRNAのランク付けリストを表示するステップ
を含む方法。 - 前記gRNAのリストからのgRNAが、前記標的化移植片ドナーの前記第2の複数の対立遺伝子からのミスマッチ対立遺伝子を編集して、前記第1の複数の対立遺伝子と前記第2の複数の対立遺伝子間でマッチする対立遺伝子の数を増加させることができる、請求項86に記載の方法。
- 前記gRNAのリストからのgRNAが、1つまたは複数のミスマッチ対立遺伝子を編集して、標的化移植片レシピエントに移植片対宿主病(GVHD)が発生する尤度を低減することができる、請求項86に記載の方法。
- 前記第1の複数の対立遺伝子の各々について前記DNA配列を表示するステップをさらに含む、請求項86に記載の方法。
- 前記データベースが、1つの人種群に発生する対立遺伝子の尤度を示す数を保存する、請求項86に記載の方法。
- 1系統内の前記第1の複数の対立遺伝子の各々の発生頻度を表示するステップをさらに含む、請求項86に記載の方法。
- 前記第1の複数の対立遺伝子の各々とマイナー組織適合性抗原との制限リレーションシップを表示するステップをさらに含む、請求項86に記載の方法。
- 前記第1の複数の対立遺伝子が、前記標的化移植片レシピエントの母系遺伝性主要HLAハプロタイプであり、前記第2の複数の対立遺伝子が、前記標的化移植片ドナーの母系遺伝性主要HLAハプロタイプである、請求項86に記載の方法。
- 前記第1の複数の対立遺伝子の一覧が、1つの対立遺伝子、2つの対立遺伝子、3つの対立遺伝子、4つの対立遺伝子、5つの対立遺伝子、6つの対立遺伝子、7つの対立遺伝子、または8つの対立遺伝子を含む、請求項86に記載の方法。
- 前記第2の複数の対立遺伝子の一覧が、1つの対立遺伝子、2つの対立遺伝子、3つの対立遺伝子、4つの対立遺伝子、5つの対立遺伝子、6つの対立遺伝子、7つの対立遺伝子、または8つの対立遺伝子を含む、請求項86に記載の方法。
- 前記gRNAのリストが、1つのミスマッチ対立遺伝子を編集するための1つのgRNAを同定する、請求項86に記載の方法。
- 前記gRNAのリストが、2つ以上のミスマッチ対立遺伝子を編集するための2つ以上のgRNAを同定する、請求項86に記載の方法。
- 前記gRNAのリストが、2つ以上のミスマッチ対立遺伝子を編集するための1つのgRNAを同定する、請求項86に記載の方法。
- 前記データベースが、請求項74に記載のデータベーススキーマを用いてインプリメントされる、請求項86に記載の方法。
- データベーススキーマをインプリメントするためのシステムであって、前記システムが、以下:
プロセッサー;および
データベーススキーマを保存するメモリーを含み、このデータスキーマは、以下:
HLA対立遺伝子に関するデータを保存する対立遺伝子テーブル;
gRNAに関するデータを保存するgRNAテーブル;
前記対立遺伝子テーブルの記録と前記gRNAテーブルの記録とのリレーションシップを保存する対立遺伝子gRNAリレーションテーブルであって、ここで、前記対立遺伝子テーブルは、前記対立遺伝子gRNAリレーションテーブルと1対多のリレーションシップを有し、前記gRNAテーブルは、対立遺伝子gRNAリレーションテーブルと1対多のリレーションシップを有するテーブル;
ハプロタイプに関するデータを保存するハプロタイプテーブルであって、ここで、前記対立遺伝子テーブルは、前記ハプロタイプテーブルと1対多のリレーションシップを有する、テーブル;
系統情報に関するデータを保存する系統テーブル;
前記ハプロタイプテーブルの記録と前記系統テーブルの記録とのリレーションシップを保存する系統ハプロタイプリレーションテーブルであって、ここで、前記ハプロタイプテーブルは、前記系統ハプロタイプリレーションテーブルと1対多のリレーションシップを有し、前記系統テーブルは、前記系統ハプロタイプリレーションテーブルと1対多のリレーションシップを有する、テーブル;
複数の系統内に発生する対立遺伝子の頻度に関するデータを保存する対立遺伝子頻度テーブルであって、ここで、前記対立遺伝子テーブルは、前記対立遺伝子頻度テーブルと1対多のリレーションシップを有する、テーブル;ならびに
前記対立遺伝子頻度テーブルの記録と前記系統テーブルの記録とのリレーションシップを保存する対立遺伝子系統リレーションテーブルであって、ここで、前記対立遺伝子頻度テーブルは、前記対立遺伝子系統リレーションテーブルと1対多のリレーションシップを有し、前記系統テーブルは、前記対立遺伝子系統リレーションテーブルと1対多のリレーションシップを有する、テーブル
を含むシステム。 - 1つまたは複数の対立遺伝子を編集するためのgRNAを同定するシステムであって、前記システムが、以下:
プロセッサー;および
命令を保存するメモリーを含み、これらの命令は、実行されると以下:
標的化移植片レシピエントの第1の複数の対立遺伝子の一覧を受信すること;
標的化移植片ドナーの第2の複数の対立遺伝子の一覧を受信すること;
前記第1および第2の複数の対立遺伝子の一覧を処理して、前記第1の複数の対立遺伝子と前記第2の複数の対立遺伝子との間で1つまたは複数のミスマッチ対立遺伝子を同定すること;
データベースに問い合わせて、1つまたは複数のgRNA分子が、前記第2の複数の対立遺伝子の1つまたは複数のミスマッチ対立遺伝子を編集するのに好適であるか否かを決定すること;
前記データベースからの1つまたは複数のgRNAが、1つまたは複数のミスマッチ対立遺伝子を編集するのに好適であるという決定に応じて、好適であることが判明した1つまたは複数のgRNAを同定するgRNAのリストを作成すること;
gRNAのリストをランク付けすること;ならびに
gRNAの前記ランク付けリストを表示すること
を前記プロセッサーに行わせるシステム。 - 処理装置による実行の命令を保存する非一時的コンピューター可読記憶媒体であって、前記命令の実行によって、前記処理装置は、
前記スキーマに従いデータベースを作成し、前記スキーマは、以下:
HLA対立遺伝子に関するデータを保存する対立遺伝子テーブル;
gRNAに関するデータを保存するgRNAテーブル;
前記対立遺伝子テーブルの記録と前記gRNAテーブルの記録とのリレーションシップを保存する対立遺伝子gRNAリレーションテーブルであって、ここで、前記対立遺伝子テーブルは、前記対立遺伝子gRNAリレーションテーブルと1対多のリレーションシップを有し、前記gRNAテーブルは、前記対立遺伝子gRNAリレーションテーブルと1対多のリレーションシップを有する、テーブル;
ハプロタイプに関するデータを保存するハプロタイプテーブルであって、ここで、前記対立遺伝子テーブルは、前記ハプロタイプテーブルと1対多のリレーションシップを有する、テーブル;
系統情報に関するデータを保存する系統テーブル;
前記ハプロタイプテーブルの記録と前記系統テーブルの記録とのリレーションシップの記録を保存する系統ハプロタイプリレーションテーブルであって、ここで、前記ハプロタイプテーブルは、前記系統ハプロタイプリレーションテーブルと1対多のリレーションシップを有し、前記系統テーブルは、前記系統ハプロタイプリレーションテーブルと1対多のリレーションシップを有する、テーブル;
複数の系統内に発生する対立遺伝子の頻度に関するデータを保存する対立遺伝子頻度テーブルであって、ここで、前記対立遺伝子テーブルは、前記対立遺伝子頻度テーブルと1対多のリレーションシップを有する、テーブル;ならびに
前記対立遺伝子頻度テーブルの記録と前記系統テーブルの記録とのリレーションシップを保存する対立遺伝子系統リレーションテーブルであって、ここで、前記対立遺伝子頻度テーブルは、前記対立遺伝子系統リレーションテーブルと1対多のリレーションシップを有し、前記系統テーブルは、前記対立遺伝子系統リレーションテーブルと1対多のリレーションシップを有する、テーブル
を規定する、非一時的コンピューター可読記憶媒体。
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