JP2018522538A5 - - Google Patents
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Description
本開示の主題は、神経変性障害を処置するための医薬の製造における、本明細書に記載されている分化細胞集団の使用をさらに提供する。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目1)
多能性細胞を分化させるためのin vitro方法であって、複数の多能性細胞を、(a)TGFβ/アクチビン−Nodalシグナル伝達の少なくとも1種の阻害剤、
(b)ソニックヘッジホッグ(SHH)シグナル伝達の少なくとも1種の活性化剤、および
(c)ウィングレス(Wnt)シグナル伝達の少なくとも1種の活性化剤
と接触させるステップを含み、
前記複数の多能性細胞に接触させる、Wntシグナル伝達の前記少なくとも1種の活性化剤の濃度を、Wntシグナル伝達の前記少なくとも1種の活性化剤を前記複数の多能性細胞に最初に接触させてから約2日から約6日の間の後に増加させ、その結果、複数の前記細胞が分化して、フォークヘッドボックスタンパク質A2(FOXA2)およびLIMホメオボックス転写因子1アルファ(LMX1A)を発現する、in vitro方法。
(項目2)
前記細胞を、骨形成タンパク質(BMP)およびSmall Mothers Against Decapentaplegic(SMAD)シグナル伝達の少なくとも1種の阻害剤と接触させる、項目1に記載の方法。
(項目3)
TGFβ/アクチビン−Nodalシグナル伝達の前記少なくとも1種の阻害剤、BMP/SMADシグナル伝達の前記少なくとも1種の阻害剤、ソニックヘッジホッグ(SHH)シグナル伝達の前記少なくとも1種の活性化剤を、約4日間から約10日間の間、前記複数の多能性細胞に接触させる、項目2に記載の方法。
(項目4)
TGFβ/アクチビン−Nodalシグナル伝達の前記少なくとも1種の阻害剤、BMP/SMADシグナル伝達の前記少なくとも1種の阻害剤、ソニックヘッジホッグ(SHH)シグナル伝達の前記少なくとも1種の活性化剤を、最長約7日間まで、または少なくとも約7日間にわたり、前記複数の多能性細胞に接触させる、項目2に記載の方法。
(項目5)
ウィングレス(Wnt)シグナル伝達の前記少なくとも1種の活性化剤を、約8日間から約15日間の間、前記複数の多能性細胞に接触させる、項目2に記載の方法。
(項目6)
ウィングレス(Wnt)シグナル伝達の前記少なくとも1種の活性化剤を、約12日間にわたり、最長約12日間まで、または少なくとも約12日間にわたり、前記複数の多能性細胞に接触させる、項目2に記載の方法。
(項目7)
Wntシグナル伝達の前記少なくとも1種の活性化剤の濃度を、Wntシグナル伝達の前記少なくとも1種の活性化剤を前記複数の多能性細胞に最初に接触させてから約4日後に増加させる、前記項目のいずれかに記載の方法。
(項目8)
Wntシグナル伝達の前記少なくとも1種の活性化剤の濃度における増加が、前記複数の細胞に接触させた、Wntシグナル伝達の前記少なくとも1種の活性化剤の最初の濃度の約400%〜1450%である、前記項目のいずれかに記載の方法。
(項目9)
Wntシグナル伝達の前記少なくとも1種の活性化剤の濃度における増加が、前記複数の細胞に接触させた、Wntシグナル伝達の前記少なくとも1種の活性化剤の最初の濃度の約700%〜1050%である、前記項目のいずれかに記載の方法。
(項目10)
Wntシグナル伝達の前記少なくとも1種の活性化剤の濃度における増加が、約3から10μMの間の濃度までの増加である、前記項目のいずれかに記載の方法。
(項目11)
Wntシグナル伝達の前記少なくとも1種の活性化剤の濃度における増加が、約3μMの濃度までの増加である、前記項目のいずれかに記載の方法。
(項目12)
Wntシグナル伝達の前記少なくとも1種の活性化剤の濃度における増加が、約7.5μMの濃度までの増加である、前記項目のいずれかに記載の方法。
(項目13)
前記複数の細胞が、チロシンヒドロキシラーゼ(TH)、engrailed−1(EN−1)、および核受容体関連1タンパク質(NURR1)の1種または複数を発現する、前記項目のいずれかに記載の方法。
(項目14)
前記複数の細胞が、検出可能なレベルのペアードボックスタンパク質(PAX6)および/またはKi67を発現しない、前記項目のいずれかに記載の方法。
(項目15)
分化細胞の集団を、前記細胞のドーパミンニューロンへの成熟に好ましい条件に供するステップをさらに含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
(項目16)
前記細胞のドーパミンニューロンへの成熟に好ましい前記条件が、前記細胞を、脳由来神経栄養因子(BDNF)、グリア細胞由来神経栄養因子(GDNF)、サイクリックアデノシン一リン酸(cAMP)、形質転換成長因子ベータ3(TGFβ3)、アスコルビン酸(AA)、および/またはDAPTと接触させることを含む、項目15に記載の方法。
(項目17)
前記多能性細胞が、ヒト、非ヒト霊長類またはげっ歯類の非胚性幹細胞、ヒト、非ヒト霊長類またはげっ歯類の胚性幹細胞、ヒト、非ヒト霊長類またはげっ歯類の人工多能性幹細胞、ヒト、非ヒト霊長類またはげっ歯類の組換え多能性細胞からなる群より選択される、前記項目のいずれかに記載の方法。
(項目18)
TGFβ/アクチビン−Nodalシグナル伝達の前記少なくとも1種の阻害剤が、4−[4−(1,3−ベンゾジオキソール−5−イル)−5−(2−ピリジニル)−1H−イミダゾール−2−イル]ベンズアミド(SB431542)を含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
(項目19)
BMPおよびSMADシグナル伝達の前記少なくとも1種の阻害剤が、4−(6−(4−(ピペラジン−1−イル)フェニル)ピラゾロ[1,5−a]ピリミジン−3−イル)キノリン(LDN193189)を含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
(項目20)
ソニックヘッジホッグ(SHH)シグナル伝達の前記少なくとも1種の活性化剤が、パルモルファミン、組換えSHH、精製SHH、および/またはSmoothenedアゴニストを含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
(項目21)
ウィングレス(Wnt)シグナル伝達の前記少なくとも1種の活性化剤が、CHIR99021、Wnt3A、および/またはWnt1を含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
(項目22)
前記多能性細胞が、TGFβ/アクチビン−Nodalシグナル伝達の前記少なくとも1種の阻害剤、SHHシグナル伝達の前記少なくとも1種の活性化剤、およびWntシグナル伝達の前記少なくとも1種の活性化剤との接触の開始後、22〜27日以内に、中脳ドーパミンニューロンに分化する、前記項目のいずれかに記載の方法。
(項目23)
前記複数の細胞が、検出可能なレベルのCD142を発現し、前記方法が、CD142を発現する中脳ドーパミンニューロンの集団を選択するステップをさらに含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
(項目24)
前記項目のいずれかに記載の方法に従って分化させた中脳ドーパミンニューロン、またはその前駆体。
(項目25)
前記細胞を、ポリシアリルトランスフェラーゼと接触させる、項目24に記載の中脳ドーパミンニューロン、またはその前駆体。
(項目26)
項目24に記載の中脳ドーパミンニューロン、またはその前駆体を含むキット。
(項目27)
被験体における神経変性障害を処置する方法であって、項目24に記載の中脳ドーパミンニューロン、またはその前駆体をそれを必要とする被験体に投与するステップを含む方法。
(項目28)
前記神経変性障害が、パーキンソン病であり、前記中脳ドーパミンニューロン、またはその前駆体が、パーキンソン病の1つまたは複数の症状を減少させるのに有効な量で投与される、項目27に記載の方法。
(項目29)
検出可能なマーカーを発現する組換え細胞である、項目24に記載の中脳ドーパミンニューロン、またはその前駆体。
(項目30)
生体適合性スキャホールドに含まれる、項目24に記載の中脳ドーパミンニューロン、またはその前駆体。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目1)
多能性細胞を分化させるためのin vitro方法であって、複数の多能性細胞を、(a)TGFβ/アクチビン−Nodalシグナル伝達の少なくとも1種の阻害剤、
(b)ソニックヘッジホッグ(SHH)シグナル伝達の少なくとも1種の活性化剤、および
(c)ウィングレス(Wnt)シグナル伝達の少なくとも1種の活性化剤
と接触させるステップを含み、
前記複数の多能性細胞に接触させる、Wntシグナル伝達の前記少なくとも1種の活性化剤の濃度を、Wntシグナル伝達の前記少なくとも1種の活性化剤を前記複数の多能性細胞に最初に接触させてから約2日から約6日の間の後に増加させ、その結果、複数の前記細胞が分化して、フォークヘッドボックスタンパク質A2(FOXA2)およびLIMホメオボックス転写因子1アルファ(LMX1A)を発現する、in vitro方法。
(項目2)
前記細胞を、骨形成タンパク質(BMP)およびSmall Mothers Against Decapentaplegic(SMAD)シグナル伝達の少なくとも1種の阻害剤と接触させる、項目1に記載の方法。
(項目3)
TGFβ/アクチビン−Nodalシグナル伝達の前記少なくとも1種の阻害剤、BMP/SMADシグナル伝達の前記少なくとも1種の阻害剤、ソニックヘッジホッグ(SHH)シグナル伝達の前記少なくとも1種の活性化剤を、約4日間から約10日間の間、前記複数の多能性細胞に接触させる、項目2に記載の方法。
(項目4)
TGFβ/アクチビン−Nodalシグナル伝達の前記少なくとも1種の阻害剤、BMP/SMADシグナル伝達の前記少なくとも1種の阻害剤、ソニックヘッジホッグ(SHH)シグナル伝達の前記少なくとも1種の活性化剤を、最長約7日間まで、または少なくとも約7日間にわたり、前記複数の多能性細胞に接触させる、項目2に記載の方法。
(項目5)
ウィングレス(Wnt)シグナル伝達の前記少なくとも1種の活性化剤を、約8日間から約15日間の間、前記複数の多能性細胞に接触させる、項目2に記載の方法。
(項目6)
ウィングレス(Wnt)シグナル伝達の前記少なくとも1種の活性化剤を、約12日間にわたり、最長約12日間まで、または少なくとも約12日間にわたり、前記複数の多能性細胞に接触させる、項目2に記載の方法。
(項目7)
Wntシグナル伝達の前記少なくとも1種の活性化剤の濃度を、Wntシグナル伝達の前記少なくとも1種の活性化剤を前記複数の多能性細胞に最初に接触させてから約4日後に増加させる、前記項目のいずれかに記載の方法。
(項目8)
Wntシグナル伝達の前記少なくとも1種の活性化剤の濃度における増加が、前記複数の細胞に接触させた、Wntシグナル伝達の前記少なくとも1種の活性化剤の最初の濃度の約400%〜1450%である、前記項目のいずれかに記載の方法。
(項目9)
Wntシグナル伝達の前記少なくとも1種の活性化剤の濃度における増加が、前記複数の細胞に接触させた、Wntシグナル伝達の前記少なくとも1種の活性化剤の最初の濃度の約700%〜1050%である、前記項目のいずれかに記載の方法。
(項目10)
Wntシグナル伝達の前記少なくとも1種の活性化剤の濃度における増加が、約3から10μMの間の濃度までの増加である、前記項目のいずれかに記載の方法。
(項目11)
Wntシグナル伝達の前記少なくとも1種の活性化剤の濃度における増加が、約3μMの濃度までの増加である、前記項目のいずれかに記載の方法。
(項目12)
Wntシグナル伝達の前記少なくとも1種の活性化剤の濃度における増加が、約7.5μMの濃度までの増加である、前記項目のいずれかに記載の方法。
(項目13)
前記複数の細胞が、チロシンヒドロキシラーゼ(TH)、engrailed−1(EN−1)、および核受容体関連1タンパク質(NURR1)の1種または複数を発現する、前記項目のいずれかに記載の方法。
(項目14)
前記複数の細胞が、検出可能なレベルのペアードボックスタンパク質(PAX6)および/またはKi67を発現しない、前記項目のいずれかに記載の方法。
(項目15)
分化細胞の集団を、前記細胞のドーパミンニューロンへの成熟に好ましい条件に供するステップをさらに含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
(項目16)
前記細胞のドーパミンニューロンへの成熟に好ましい前記条件が、前記細胞を、脳由来神経栄養因子(BDNF)、グリア細胞由来神経栄養因子(GDNF)、サイクリックアデノシン一リン酸(cAMP)、形質転換成長因子ベータ3(TGFβ3)、アスコルビン酸(AA)、および/またはDAPTと接触させることを含む、項目15に記載の方法。
(項目17)
前記多能性細胞が、ヒト、非ヒト霊長類またはげっ歯類の非胚性幹細胞、ヒト、非ヒト霊長類またはげっ歯類の胚性幹細胞、ヒト、非ヒト霊長類またはげっ歯類の人工多能性幹細胞、ヒト、非ヒト霊長類またはげっ歯類の組換え多能性細胞からなる群より選択される、前記項目のいずれかに記載の方法。
(項目18)
TGFβ/アクチビン−Nodalシグナル伝達の前記少なくとも1種の阻害剤が、4−[4−(1,3−ベンゾジオキソール−5−イル)−5−(2−ピリジニル)−1H−イミダゾール−2−イル]ベンズアミド(SB431542)を含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
(項目19)
BMPおよびSMADシグナル伝達の前記少なくとも1種の阻害剤が、4−(6−(4−(ピペラジン−1−イル)フェニル)ピラゾロ[1,5−a]ピリミジン−3−イル)キノリン(LDN193189)を含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
(項目20)
ソニックヘッジホッグ(SHH)シグナル伝達の前記少なくとも1種の活性化剤が、パルモルファミン、組換えSHH、精製SHH、および/またはSmoothenedアゴニストを含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
(項目21)
ウィングレス(Wnt)シグナル伝達の前記少なくとも1種の活性化剤が、CHIR99021、Wnt3A、および/またはWnt1を含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
(項目22)
前記多能性細胞が、TGFβ/アクチビン−Nodalシグナル伝達の前記少なくとも1種の阻害剤、SHHシグナル伝達の前記少なくとも1種の活性化剤、およびWntシグナル伝達の前記少なくとも1種の活性化剤との接触の開始後、22〜27日以内に、中脳ドーパミンニューロンに分化する、前記項目のいずれかに記載の方法。
(項目23)
前記複数の細胞が、検出可能なレベルのCD142を発現し、前記方法が、CD142を発現する中脳ドーパミンニューロンの集団を選択するステップをさらに含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
(項目24)
前記項目のいずれかに記載の方法に従って分化させた中脳ドーパミンニューロン、またはその前駆体。
(項目25)
前記細胞を、ポリシアリルトランスフェラーゼと接触させる、項目24に記載の中脳ドーパミンニューロン、またはその前駆体。
(項目26)
項目24に記載の中脳ドーパミンニューロン、またはその前駆体を含むキット。
(項目27)
被験体における神経変性障害を処置する方法であって、項目24に記載の中脳ドーパミンニューロン、またはその前駆体をそれを必要とする被験体に投与するステップを含む方法。
(項目28)
前記神経変性障害が、パーキンソン病であり、前記中脳ドーパミンニューロン、またはその前駆体が、パーキンソン病の1つまたは複数の症状を減少させるのに有効な量で投与される、項目27に記載の方法。
(項目29)
検出可能なマーカーを発現する組換え細胞である、項目24に記載の中脳ドーパミンニューロン、またはその前駆体。
(項目30)
生体適合性スキャホールドに含まれる、項目24に記載の中脳ドーパミンニューロン、またはその前駆体。
Claims (36)
- 多能性幹細胞を分化させるためのin vitro方法であって、前記方法は、
(a)複数の多能性幹細胞を、TGFβ/アクチビン−Nodalシグナル伝達の少なくとも1種の阻害剤と接触させるステップと、
(b)前記細胞を、ソニックヘッジホッグ(SHH)シグナル伝達の少なくとも1種の活性化剤、およびウィングレス(Wnt)シグナル伝達の少なくとも1種の活性化剤と接触させるステップを含み、
前記細胞に接触させる、Wntシグナル伝達の前記少なくとも1種の活性化剤の濃度を、Wntシグナル伝達の前記少なくとも1種の活性化剤との前記細胞の最初の接触から約2日から約6日の間に増加させ、フォークヘッドボックスタンパク質A2(FOXA2)およびLIMホメオボックス転写因子1アルファ(LMX1A)を発現する分化細胞の集団を得る、in vitro方法。 - 前記細胞を、骨形成タンパク質(BMP)およびSmall Mothers Against Decapentaplegic(SMAD)シグナル伝達の少なくとも1種の阻害剤と接触させるステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞を、TGFβ/アクチビン−Nodalシグナル伝達の前記少なくとも1種の阻害剤、BMP/SMADシグナル伝達の前記少なくとも1種の阻害剤、およびソニックヘッジホッグ(SHH)シグナル伝達の前記少なくとも1種の活性化剤と、約4日間から約10日間の間接触させる、請求項2に記載の方法。
- 前記細胞を、TGFβ/アクチビン−Nodalシグナル伝達の前記少なくとも1種の阻害剤、BMP/SMADシグナル伝達の前記少なくとも1種の阻害剤、およびソニックヘッジホッグ(SHH)シグナル伝達の前記少なくとも1種の活性化剤と、最長約7日間まで、または少なくとも約7日間にわたり接触させる、請求項2または3に記載の方法。
- 前記細胞を、ウィングレス(Wnt)シグナル伝達の前記少なくとも1種の活性化剤と、約8日間から約15日間の間接触させる、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞を、ウィングレス(Wnt)シグナル伝達の前記少なくとも1種の活性化剤と、最長約12日間まで、または少なくとも約12日間にわたり接触させる、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- Wntシグナル伝達の前記少なくとも1種の活性化剤の濃度を、Wntシグナル伝達の前記少なくとも1種の活性化剤との前記細胞の最初の接触から約4日後に増加させる、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- Wntシグナル伝達の前記少なくとも1種の活性化剤の濃度における増加が、前記細胞に接触させた、Wntシグナル伝達の前記少なくとも1種の活性化剤の最初の濃度の約400%〜1450%である、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- Wntシグナル伝達の前記少なくとも1種の活性化剤の濃度における増加が、前記細胞に接触させた、Wntシグナル伝達の前記少なくとも1種の活性化剤の最初の濃度の約700%〜1050%である、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- Wntシグナル伝達の前記少なくとも1種の活性化剤の濃度における増加が、約3から10μMの間の濃度までの増加である、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- Wntシグナル伝達の前記少なくとも1種の活性化剤の濃度における増加が、約3μMの濃度までの増加である、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- Wntシグナル伝達の前記少なくとも1種の活性化剤の濃度における増加が、約7.5μMの濃度までの増加である、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記分化細胞が、チロシンヒドロキシラーゼ(TH)、engrailed−1(EN−1)、および核受容体関連1タンパク質(NURR1)の1種または複数を発現する、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記分化細胞が、検出可能なレベルのペアードボックスタンパク質(PAX6)および/またはKi67を発現しない、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 分化細胞の集団を、前記細胞のドーパミンニューロンへの成熟に好ましい条件に供するステップをさらに含む、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞のドーパミンニューロンへの成熟に好ましい前記条件が、前記細胞を、脳由来神経栄養因子(BDNF)、グリア細胞由来神経栄養因子(GDNF)、サイクリックアデノシン一リン酸(cAMP)、形質転換成長因子ベータ3(TGFβ3)、アスコルビン酸(AA)、および/またはDAPTと接触させることを含む、請求項15に記載の方法。
- 前記多能性細胞が、ヒト、非ヒト霊長類またはげっ歯類の非胚性幹細胞、ヒト、非ヒト霊長類またはげっ歯類の胚性幹細胞、ヒト、非ヒト霊長類またはげっ歯類の人工多能性幹細胞、およびヒト、非ヒト霊長類またはげっ歯類の組換え多能性細胞からなる群より選択される、請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法。
- TGFβ/アクチビン−Nodalシグナル伝達の前記少なくとも1種の阻害剤が、TGFβ受容体の阻害剤を含む、請求項1〜17のいずれか一項に記載の方法。
- TGFβ受容体の阻害剤が、4−[4−(1,3−ベンゾジオキソール−5−イル)−5−(2−ピリジニル)−1H−イミダゾール−2−イル]ベンズアミド(SB431542)を含む、請求項18に記載の方法。
- BMPおよびSMADシグナル伝達の前記少なくとも1種の阻害剤が、4−(6−(4−(ピペラジン−1−イル)フェニル)ピラゾロ[1,5−a]ピリミジン−3−イル)キノリン(LDN193189)、ノギン、または上記の組合せを含む、請求項2〜19のいずれか一項に記載の方法。
- ソニックヘッジホッグ(SHH)シグナル伝達の前記少なくとも1種の活性化剤が、SHHタンパク質、Smoothenedアゴニスト、または上記の組合せを含む、請求項1〜20のいずれか一項に記載の方法。
- 前記SHHタンパク質が、組換えSHH、精製SHH、または上記の組合せを含む、請求項21に記載の方法。
- 前記組換えSHHが、SHH C25IIを含む、請求項22に記載の方法。
- 前記Smoothenedアゴニストが、パルモルファミンを含む、請求項21に記載の方法。
- ウィングレス(Wnt)シグナル伝達の前記少なくとも1種の活性化剤が、CHIR99021、Wnt3A、Wnt1、または上記の組合せを含む、請求項1〜24のいずれか一項に記載の方法。
- FOXA2およびLMX1Aを発現する分化細胞が、中脳ドーパミンニューロンである、請求項1〜25のいずれか一項に記載の方法。
- 前記多能性幹細胞が、TGFβ/アクチビン−Nodalシグナル伝達の前記少なくとも1種の阻害剤との前記多能性幹細胞の最初の接触から約22〜27日以内に、FOXA2およびLMX1Aを発現する分化細胞に分化する、請求項1〜26のいずれか一項に記載の方法。
- 前記分化細胞が、検出可能なレベルのCD142を発現する、請求項1〜27のいずれか一項に記載の方法。
- CD142を発現する細胞を選択するステップをさらに含む、請求項28に記載の方法。
- 請求項1〜29のいずれか一項に記載の方法に従って分化させた中脳ドーパミンニューロン、またはその前駆体。
- 前記細胞を、ポリシアリルトランスフェラーゼと接触させる、請求項30に記載の中脳ドーパミンニューロン、またはその前駆体。
- 前記中脳ドーパミンニューロン、またはその前駆体が、検出可能なマーカーを発現する組換え細胞である、請求項30または31に記載の中脳ドーパミンニューロン、またはその前駆体。
- 前記中脳ドーパミンニューロン、またはその前駆体が、生体適合性スキャフォールドに含まれる、請求項30〜32のいずれか一項に記載の中脳ドーパミンニューロン、またはその前駆体。
- 請求項30〜33のいずれか一項に記載の中脳ドーパミンニューロン、またはその前駆体を含むキット。
- 被験体における神経変性障害の処置における使用のための、請求項30〜33のいずれか一項に記載の中脳ドーパミンニューロン、またはその前駆体を含む組成物。
- 前記神経変性障害が、パーキンソン病である、請求項35に記載の組成物。
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