ES2910032T3 - Métodos de diferenciación in vitro de neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo (mDA) - Google Patents

Métodos de diferenciación in vitro de neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo (mDA) Download PDF

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Abstract

Un método in vitro para diferenciar células madre pluripotenciales que comprende: (a) poner en contacto una pluralidad de células madre pluripotenciales con al menos un inhibidor de la señalización de TGFβ/Activina-Nodal; y (b) poner en contacto las células con al menos un activador de la señalización de Sonic hedgehog (SHH) y al menos un activador de la señalización de wingless (Wnt), en donde la concentración del al menos un activador de la señalización de Wnt se incrementa (i) entre 2 días y 6 días después de su contacto inicial con las células y (ii) entre un 250% y un 1800% de su concentración inicial puesta en contacto con las células, para obtener una población de células diferenciadas que expresan la proteína de caja forkhead A2 (FOXA2) y el factor de transcripción de caja homeótica LIM 1 alfa (LMX1A).

Description

DESCRIPCIÓN
Métodos de diferenciación in vitro de neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo (mDA)
1. Introducción
El objeto descrito en la presente memoria se refiere a neuronas dopaminérgicas (DA) del mesencéfalo y a precursores de las mismas, obtenidos a partir de células madre humanas, y a usos de los mismos para un tratamiento basado en células de trastornos neurológicos.
2. Antecedentes de la invención
Anteriormente, las células madre embrionarias y somáticas se usaban como agentes terapéuticos y sistemas modelo para enfermedades neurodegenerativas. Se ha llevado a cabo una investigación y desarrollos tecnológicos relacionados con la diferenciación dirigida de células madre embrionarias y somáticas, en el campo de las enfermedades del sistema nervioso central (SNC), como la enfermedad de Huntington, la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson y la esclerosis múltiple. Sin embargo, los resultados de esos estudios mostraban poca capacidad in vivo para restaurar la función neuronal y, a menudo, daban como resultado el crecimiento de tumores no deseados en los pacientes.
Por lo tanto, existe una necesidad de composiciones y métodos para diferenciar las células progenitoras neuronales para usarlas en el tratamiento de trastornos neurodegenerativos tales como la enfermedad de Parkinson.
El documento WO2015034012A1 describe métodos para preparar células precursoras neurales productoras de dopamina a partir de células madre pluripotenciales.
Kriks, S. et al. (Nature 480, 547-551 (2011). https://doi.org/10.1038/nature10648) describen que las neuronas dopaminérgicas obtenidas a partir de células madre humanas son injertables en modelos animales de la enfermedad de Parkinson. Arenas et al. (Development 2015 142: 1918-1936; doi: 10.1242/dev.097394) es un artículo de revisión que analiza métodos para producir neuronas dopaminérgicas en el mesencéfalo.
Chambers et al. (Nat Biotechnol 27, 275-280 (2009). https://doi.org/10.1038/nbt.1529) describen la conversión neuronal de células madre humanas mediante una inhibición doble de la señalización de SMAD.
Fasano et al. (Cell Stem Cell (2010), vol. 6, n24, doi:10.1016/j.stem.2010.03.001, ISSN 1934-5909, páginas 336 - 347) describen una diferenciación de las células madre humanas a células de la placa del suelo. El documento WO2013067362A1 describe métodos para diferenciar células madre (p. ej., células madre humanas) en precursores de la placa del suelo del mesencéfalo y neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo injertables.
3. Compendio de la invención
Según un primer aspecto de la presente invención, se proporciona un método in vitro para diferenciar células madre pluripotenciales de acuerdo con la reivindicación 1 del presente documento.
El objeto de la presente descripción se refiere a neuronas dopaminérgicas (DA) del mesencéfalo (mDA), y a sus precursores, obtenidas a partir de células madre humanas al menos en parte, mediante diferenciación in vitro.
El objeto de la presente descripción se refiere al descubrimiento de que las neuronas dopaminérgicas (DA) del mesencéfalo y sus precursores pueden diferenciarse de las células madre humanas mediante una inhibición doble de la señalización de SMAD (por ejemplo, mediante la inhibición de la señalización de TGFp/Activina-Nodal y la señalización de BMP), junto con la activación de la señalización de Sonic Hedgehog (SHH) y la activación de la señalización de wingless (Wnt), en donde la concentración de un compuesto activador de Wnt aumenta aproximadamente 4 días después del contacto inicial de las células con los inhibidores de SMAD, el activador de SHH y el activador de Wnt. En ciertas realizaciones, los métodos descritos en el presente documento proporcionan ventajas sobre los métodos de diferenciación de células madre en células DA del mesencéfalo que no comprenden un aumento de un compuesto activador de Wnt, por ejemplo, mediante la reducción de la expresión de marcadores de células progenitoras inmaduras, por ejemplo, PAX6, y células productoras que se diferencian en células mDA que expresan tirosina hidroxilasa funcional después del injerto.
En ciertas realizaciones, las células se ponen en contacto adicionalmente con activadores e inhibidores del linaje de neuronas DA, por ejemplo, el factor neurotrófico obtenido a partir del cerebro (BDNF), factor neurotrófico obtenido a partir de células gliales (GDNF), monofosfato de adenosina cíclico (AMPc), factor de crecimiento transformante beta (TGFp, por ejemplo, TGFp3), ácido ascórbico (AA) y DAPT (que también se conoce como 1, 1 -dimetiletil éster de N-[(3,5-difluorofenil)acetil]-L-alanil-2-fenil]glicina, LY-374973, t-butil éster de N-[N-(3,5-difluorofenacetil)-L-alanil]-S-fenilglicina o t-butil éster de N-[N-(3,5-difluorofenacetil)-L-alanil]-S-fenilglicina).
En ciertas realizaciones, el objeto de la presente descripción proporciona métodos in vitro para inducir la diferenciación de células madre humanas en precursores de DA del mesencéfalo que comprenden poner en contacto una población o una pluralidad de células madre humanas con uno o varios inhibidores de la señalización de TGFp/Activina-Nodal (es decir, un primer inhibidor de SMAD), uno o varios inhibidores de la señalización de BMP (es decir, un segundo inhibidor de SMAD), uno o varios activadores de la señalización wingless (Wnt) y uno o varios activadores de la señalización de Sonic Hedgehog (SHH). En ciertas realizaciones, los inhibidores y los activadores se ponen en contacto con las células al mismo tiempo. En determinadas realizaciones, la concentración del activador de la señalización de Wnt aumenta al menos aproximadamente 2, 3, 4, 5 o 6 días después de que las células se pongan en contacto inicialmente con el activador de Wnt. En determinadas realizaciones, las células se ponen en contacto con la concentración incrementada del activador de Wnt durante al menos aproximadamente 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 días o más.
En determinadas realizaciones, las células se ponen en contacto con los agentes anteriores en cantidades eficaces para aumentar los niveles detectables de expresión de uno o varios marcadores de neuronas DA del mesencéfalo, o precursores de las mismas, por ejemplo, pero sin limitarse a, engrailed-1 (EN-1), caja homeótica “orthodenticle” 2 (OTX2), tirosina hidroxilasa (TH), proteína relacionada con el receptor nuclear 1 (NURR1), proteína de caja “forkhead” A2 (FOXA2) y factor de transcripción de caja homeótica LIM 1 alfa (LMX1A).
En determinadas realizaciones, las células se ponen en contacto con los agentes anteriores en cantidades eficaces para aumentar los niveles detectables de expresión de uno o varios entre beta-tubulina de clase III específica de neuronas (Tuj 1), familia del factor “Trefoil” 3 (TTF3), homeodominio de tipo emparejado 3 (PITX3), complejo achaetescute (ASCL), factor 1 de linfocito B temprano (EBF-1), factor 3 de linfocito B temprano (EBF-3), transtirretina (TTR), sinapsina, transportador de dopamina (DAT) y canal de potasio rectificador interno, acoplado a proteína G (Kir3.2/GIRK2), CD142, DCSM1, CD63 y/o CD99.
La presente descripción también proporciona una población de células diferenciadas in vitro que expresan uno o varios marcadores de células DA del mesencéfalo, o precursores de las mismas, preparada de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento. En ciertas realizaciones, la población de células diferenciadas se obtiene a partir de una población de células madre humanas. El objeto de la presente descripción proporciona además composiciones que comprenden esa población celular diferenciada.
En determinadas realizaciones, las células se cultivan con los agentes anteriores en cantidades eficaces para disminuir los niveles detectables de expresión de la proteína de caja emparejada (PAX6) y/o Ki67. En ciertas realizaciones, las células no expresan niveles detectables de PAX6 y/o Ki67.
En determinadas realizaciones, las células preparadas según los métodos descritos en el presente documento se pueden clasificar, seleccionar y aislar en función de la expresión de CD142 y/o la expresión del receptor colinérgico (CHRNB3), por ejemplo, mediante citometría de flujo.
En ciertas realizaciones, las células preparadas de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento pueden ponerse en contacto adicionalmente con una polisialiltransferasa, por ejemplo, una polisialiltransferasa bacteriana, tal como una polisialiltransferasa de Neisseria meningitidis (PSTNm). En ciertas realizaciones, las células son células recombinantes que expresan una polisialiltransferasa recombinante.
Además, el objeto de la presente descripción proporciona kits para inducir la diferenciación de células madre.
En determinadas realizaciones, el kit comprende (a) uno o varios inhibidores de la señalización del factor de crecimiento transformante beta (TGFp)/Activina-Nodal (es decir, un primer inhibidor de SMAD), (b) uno o varios inhibidores de la señalización de las proteínas morfogenéticas óseas (BMP) (es decir, un segundo inhibidor de SMAD), (c) uno o varios activadores de la señalización de wingless (Wnt), (d) uno o varios activadores de la señalización de Sonic Hedgehog (SHH), y (e) instrucciones para inducir la diferenciación de células madre en una población de células diferenciadas que expresan uno o varios marcadores de neuronas DA del mesencéfalo, o precursores de las mismas.
En ciertas realizaciones, la presente descripción proporciona kits que comprenden precursores obtenidos a partir de células madre preparados de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento. En ciertas realizaciones, las células obtenidas a partir de células madre son células maduras diferenciadas, por ejemplo, células DA del mesencéfalo.
En ciertas realizaciones, dicho uno o varios inhibidores de la señalización de TGFp/Activina-Nodal es una molécula pequeña seleccionada a partir del grupo que consiste en SB431542, derivados de la misma y mezclas de la misma. En ciertas realizaciones, dicho uno o varios inhibidores de la señalización de BMP es una molécula pequeña seleccionada a partir del grupo que consiste en LDN193189, derivados de la misma y mezclas de la misma. En determinadas realizaciones, dicho uno o varios activadores de la señalización de Wnt reducen la glucógeno sintasa cinasa 3p (GSK3p) para la activación de la señalización de Wnt. En ciertas realizaciones, dicho uno o varios activadores de la señalización de Wnt es una molécula pequeña seleccionada a partir del grupo que consiste en CHIR99021, WNT3A, derivados de la misma y mezclas de la misma. En ciertas realizaciones, el activador de la señalización de SHH se selecciona a partir del grupo que consiste en SHH recombinante, SHH purificado, C25II y agonistas del receptor “smoothened” (SMO) como la molécula pequeña purmorfamina, derivados de los mismos y mezclas de los mismos.
En ciertas realizaciones, dichas células madre humanas se seleccionan a partir del grupo que consiste en células madre embrionarias humanas, células madre pluripotenciales inducidas humanas, células madre partenogenéticas humanas, células madre pluripotenciales similares a células germinales primordiales, células madre epiblásticas y células madre pluripotenciales de clase F. Las células madre pluripotenciales inducidas humanas (iPSC) son células preparadas a partir de células más diferenciadas, por ejemplo, una célula somática diferenciada, formada por la introducción de genes embrionarios (tales como, pero sin limitarse a, los transgenes OCT4, SOX2, cMyc y KLF4) en la célula somática (véase, por ejemplo, Takahashi y Yamanaka, Cell 126, 663-676 (2006)).
En ciertas realizaciones, el método comprende además someter dicha población de células diferenciadas a condiciones que favorecen la maduración de dichas células diferenciadas en una población de neuronas DA del mesencéfalo.
El objeto de la presente descripción proporciona además métodos para tratar un trastorno neurodegenerativo en un sujeto, por ejemplo, la enfermedad de Parkinson. En determinadas realizaciones, el método comprende administrar una cantidad eficaz de la población de células diferenciadas descrita en el presente documento, a un sujeto que padece un trastorno neurodegenerativo.
El objeto de la presente descripción proporciona además una población de células diferenciadas descrita en el presente documento para tratar un trastorno neurodegenerativo.
El objeto de la presente descripción proporciona además usos de la población celular diferenciada descrita en el presente documento en la preparación de un medicamento para tratar un trastorno neurodegenerativo.
Con lo anterior se ha esbozado bastante ampliamente las características y ventajas técnicas de la presente solicitud para que la descripción detallada que sigue a continuación pueda entenderse mejor. A continuación se describirán características y ventajas adicionales de la solicitud que forman el objeto de las reivindicaciones de la solicitud. Los expertos en la técnica deberán apreciar que la concepción y la realización específica, descritas pueden utilizarse fácilmente como base para modificar o diseñar otras estructuras para llevar a cabo los mismos fines de la presente solicitud. Los expertos en la técnica también deberán darse cuenta de que esas construcciones equivalentes no se apartan del espíritu y del alcance de la solicitud, tal y como se establece en las reivindicaciones adjuntas. Las características novedosas que se cree que son características de la solicitud, tanto en su organización como en su método de funcionamiento, junto con otros objetos y ventajas, se entenderán mejor a partir de la siguiente descripción.
4. Breve descripción de las Figuras
La Figura 1 muestra que la diferenciación de hESCs durante 10 días, de acuerdo con el método descrito por Kriks et al., Nature. 6 de noviembre de 2011; 480 (7378): 547-51, en medio Ks R (sin GMP) o en medio E8/NB/N2/E6 (GMP VI) sin un aumento de Wnt, producía neuronas DA del mesencéfalo así como neuronas de otras regiones del cerebro. El cultivo de hESCs en medios E8/NB/N2/E6 de acuerdo con los métodos del Ejemplo 1 utilizando un aumento a Wnt 7,5 pM (o 5-10 pM) los días D4-D10, era específico para producir células DA del mesencéfalo.
La Figura 2 muestra la expresión de PAX6, TH, NURR1, FOXA2 y LMX1A en hESCs diferenciadas entre 22 y 27 días según el método descrito por Kriks et al., Nature. 6 de noviembre de 2011; 480 (7378): 547-51, en medios KSR (sin GMP) o en medio E8/NB/N2/E6 (GMP VI) sin un aumento de Wnt. Las células se recogieron y se analizaron mediante qRT-PCR de los genes indicados (n = entre 3 y 14 por condición). Los datos se representan como valores de cT normalizados, en donde los números más bajos indican una mayor expresión génica.
La Figura 3 muestra la expresión de PAX6, TH, NURR1, FOXA2, LMX1A y En-1 en hESCs diferenciadas entre 22 y 27 días según el método descrito por Kriks et al., Nature. 6 de noviembre de 2011; 480 (7378): 547-51, en medio KSR (sin GMP) o en medio E8/NB/N2/E6 (GMP VI) sin un aumento de Wnt, y de acuerdo con los métodos descritos en el Ejemplo 1, lo que incluye cultivar las hESCs en medio E8/NB/N2/E6 con un aumento a Wnt 3 pM (GMP V2A) o 7,5 pM (GMP V2B). Las células se recogieron y se analizaron mediante qRT-PCR de los genes indicados (n = entre 3 y 14 por condición). Los datos se representan como valores de cT normalizados, en donde los números más bajos indican una mayor expresión génica. Las células cultivadas según GMP V2A y GMP V2B expresaban niveles más altos de En-1.
La Figura 4 muestra marcadores de DA del mesencéfalo que se pueden utilizar para identificar células DA del mesencéfalo diferenciadas.
La Figura 5 muestra que las hESCs que se mantuvieron en condiciones de E8/matrigel y luego se diferenciaron durante 25 días de acuerdo con el método descrito por Kriks et al., Nature. 6 de noviembre de 2011; 480 (7378): 547-51, en medio NB/N2 con Wnt 0,7 pM, sin un aumento de Wnt, muestran áreas de proliferación in vivo. Después de la diferenciación, las células se trasplantaron a ratones inmunocomprometidos no lesionados y los injertos se recogieron después de 4 semanas. Las secciones fueron analizadas mediante ICC para analizar NCAM, FOXA2 y TH humanos. Aunque se observaron muchas células TH+ que expresaban FOXA2, también se detectaron grupos de células hNCAM+ dentro del núcleo del injerto. Esos parches también expresaban PAX6, lo que indicaba un estado de progenitor neural.
La Figura 6A-B muestra (A) que las hESCs mantenidas en condiciones de E8/matrigel y que luego se diferenciaban durante 25 días en medio NB/N2 de acuerdo con métodos de cultivo de GMP V2A (aumento a Wnt 3 pM en presencia de un fondo de Wnt 0,7 pM) y GMP V2B (aumento a Wnt 7,5 pM en presencia de un fondo de Wnt 0,7 pM), descritos en el Ejemplo 1, inducían la diferenciación de células DA del mesencéfalo que expresaban altos niveles de EN-1 y TH.
Las neuronas DA del mesencéfalo se fijaron y tiñeron para analizar TH y EN-1 in vitro (paneles superiores) y NURR1 y LMX1A (panel inferior). (B) Se trasplantaron células DA de mesencéfalo diferenciadas según el protocolo de GMP V2B en el cuerpo estriado de ratones inmunocomprometidos no lesionados, y mostraban un mayor crecimiento de fibra y expresión de hNCAM y TH 3 semanas después del injerto.
La Figura 7 muestra que las hESCs mantenidas en condiciones de E8/matrigel y luego diferenciadas durante 25 días en medio NB/N2 de acuerdo con el método de cultivo de GMP V2B (aumento a Wnt 7,5 pM en presencia de un fondo Wnt 0,7 pM) descrito en el Ejemplo 1, eliminaba las células con expresión de PAX6 mientras que conservaba las células que expresaban FOXA2. Las células se recogieron y se analizaron mediante citometría de flujo para detectar la presencia de FOXA2 y PAX6.
La Figura 8 muestra que las neuronas DA del mesencéfalo crioconservadas se comportaban de manera similar in vivo en comparación con las células "frescas" o de nuevo aporte. Se comparó la expresión de Hncam y TH en injertos de 3 semanas de células "frescas" y de 4 semanas de células "congeladas" trasplantadas a ratones. Ambos injertos mostraban signos tempranos de crecimiento de fibras, tal y como se destaca en los paneles insertados a la derecha.
La Figura 9A-B muestra (A) una clasificación celular de las células DA del mesencéfalo que expresaban CD142 usando citometría de flujo MACS. Se muestra la preclasificación ("antes"), el flujo continuo (fracción negativa) y la fracción positiva del Día 24, de neuronas mDA clasificadas con CD142. La ficoeritrina se conjugó con CD142 y se usaron perlas anti-PE para el aislamiento y visualizar los resultados. (B) Muestra la consistencia a lo largo de los 6 experimentos.
La Figura 10A-B muestra que las neuronas mDA sobreviven en ratones no lesionados y monos parkinsonianos. (A) Las células mA clasificadas con CD142 sobreviven in vivo. Las neuronas mDA preparadas en KSR según el método descrito por Kriks et al., se clasificaron con FACS a través de CD142 y se trasplantaron a ratones. Los injertos se recogieron 30 días después del trasplante y se analizaron para determinar la expresión de TH y hNCAM. (B) Las neuronas mDA obtenidas a partir del protocolo de KSR (Kriks et al.) sobreviven 1 año en primates no humanos (NHPs). El Día 25 se injertaron neuronas mDA en monos parkinsonianos y los injertos se recogieron 12 meses después del injerto. Las secciones se tiñeron con anticuerpos que detectaban el citoplasma humano (SC121) y TH. La mitad superior muestra las imágenes regulares e invertidas, mientras que la mitad inferior muestra aumentos con mayor potencia. Los datos indican que las células clasificadas mediante MACS mostraban una supervivencia comparable a las células mDA clasificadas mediante CD142 injertadas en ratones.
La Figura 11A-D muestra el efecto de un tratamiento con polisialiltransferasa (polisialiltransferasa de Neisseria meningitidis (PSTNm)) de neuronas mDA in vitro. (A) Muestra los efectos de la crioconservación sobre los niveles de polisialilación (PSA). Las células mDA se trataron con PSTNm o se dejaron sin modificar. La mitad de las células se fijaron mientras que la otra mitad se crioconservó. Las células congeladas se descongelaron 1 semana más tarde y también se fijaron. Las células se inmunotiñeron para analizar PSA y se analizaron mediante citometría de flujo. Las líneas negras indican células frescas, sin teñir. La tinción de PSA inducido con PSTNm es idéntica en las células congeladas y no congeladas. La línea azul representa células no tratadas analizadas frescas, y las líneas roja y verde son células tratadas con PSTNm analizadas frescas (roja) o después del almacenamiento criogénico (verde). (B) Muestra los efectos del tratamiento con PSTNm sobre células clasificadas con células CD142. Imágenes representativas de la tinción de TAU-1 después de 1 día en un cultivo de las células clasificadas con CD142 que no fueron tratadas (izquierda) o tratadas con PSTNm (derecha). (C) Muestra que las células clasificadas con CD142 tratadas con PSTNm mostraban una longitud axonal mejorada. Las células se analizaron el Día 1 o el Día 4 y las imágenes se cuantificaron utilizando el programa informático ImageJ de NIH. (D) Muestra que los niveles de PSA persisten in vivo. Se trasplantaron neuronas mDA tratadas con PSTNm en el cuerpo estriado de ratones y se visualizaron los niveles de PSA, 2 semanas después del injerto. Se muestran dos campos de visión (FOV 1 y FOV 2) por cada condición. El gráfico de la derecha resume los resultados.
La Figura 12 muestra el comportamiento rotacional de ratas lesionadas, trasplantadas con precursores de mDA diferenciados como se describe en el Ejemplo 2 y crioconservados el día 16, en comparación con ratas trasplantadas de forma simulada. Las ratas se sometieron a ensayo antes del trasplante y 1,2, 3, 4 y 5 meses después del trasplante. El comportamiento rotacional se inducía por la administración de anfetaminas. Las ratas lesionadas que habían recibido trasplantes, mostraban una reducción estadísticamente significativa del comportamiento de rotación, en comparación con las ratas trasplantadas de forma simulada, cuatro meses después del trasplante.
Figura 13 muestra la expresión in vivo de hNCAM, TH y GIRK2 en ratas lesionadas, trasplantadas con precursores de mDA diferenciados como se describe en el Ejemplo 2 y crioconservados el día 16. Los injertos trasplantados se examinaron cinco meses después del trasplante. La tinción con TH mostraba una morfología típica de mDA. Las neuronas positivas para TH también eran positivas para GIRK2.
La Figura 14 muestra que los precursores de mDA diferenciados según el Ejemplo 2 y crioconservados el día 16, sobrevivían durante 6 semanas, después de la descongelación y el trasplante en primates no humanos. Los injertos trasplantados mostraban un fuerte crecimiento de fibras desde el núcleo del injerto y también mostraban una morfología típica de mDA.
5. Descripción detallada de la invención
El objeto de la presente descripción se refiere a métodos para inducir la diferenciación de células madre humanas en células que expresan uno o varios marcadores de células dopaminérgicas del mesencéfalo (mDA) o precursores de las mismas, composiciones de células que expresan tales marcadores y métodos para tratar trastornos neurodegenerativos.
Para fines de claridad de la descripción y no como limitación, la descripción detallada se divide en las siguientes subsecciones:
5.1. Definiciones;
5.2. Método de diferenciación de células madre;
5.3. Método de tratamiento de trastornos neurodegenerativos; y
5.4. Kits
5.1 Definiciones
Los términos usados en esta memoria descriptiva generalmente tienen sus significados ordinarios en la técnica, dentro del contexto de esta descripción y en el contexto específico en el que se usa cada término. Ciertos términos se explican a continuación, o en otra parte de la memoria descriptiva, para proporcionar una orientación adicional al profesional en la descripción de las composiciones y métodos y cómo prepararlos y usarlos.
La expresión "alrededor de" o "aproximadamente" significa dentro de un intervalo de error aceptable para el valor particular determinado por un experto en la materia, que dependerá en parte de cómo se mide o determina el valor, es decir, las limitaciones del sistema de medición. Por ejemplo, "aproximadamente" puede significar dentro de 3 o más de 3 desviaciones estándar, según la práctica en la técnica. Alternativamente, "aproximadamente" puede significar un intervalo de hasta el 20%, por ejemplo, hasta el 10%, hasta el 5% o hasta el 1% de un valor dado. Alternativamente, en particular con respecto a sistemas o procedimientos biológicos, el término puede significar dentro de un orden de magnitud, por ejemplo, dentro de 5 veces o dentro de 2 veces, de un valor.
Tal y como se usa en el presente documento, el término "señalización" en referencia a una "proteína de transducción de señales", se refiere a una proteína que se activa o se ve afectada de otro modo por la unión de un ligando a una proteína receptora de membrana o algún otro estímulo. Ejemplos de una proteína de transducción de señales incluyen, pero no limitados a, SMAD, una proteína del complejo wingless (Wnt), que incluye beta-catenina, NOTCH, factor de crecimiento transformante beta (TGFp), Activina, Nodal, proteínas de glucógeno sintasa cinasa 3p (GSK3P), proteínas morfogenéticas óseas (BMP) y factores de crecimiento de fibroblastos (FGF). Para muchos receptores de la superficie celular o proteínas receptoras internas, las interacciones ligando-receptor no están directamente relacionadas con la respuesta de la célula. El receptor activado por un ligando puede interaccionar primero con otras proteínas dentro de la célula antes de que se produzca el efecto fisiológico final del ligando sobre el comportamiento de la célula. A menudo, el comportamiento en cadena de varias proteínas celulares que interaccionan, se altera después de la activación o la inhibición del receptor. El conjunto completo de cambios celulares inducidos por la activación de un receptor, se denomina mecanismo de transducción de señales o vía de señalización.
Tal y como se usa en este documento, el término "señales" se refiere a factores internos y externos que controlan cambios en la estructura y función celular. Pueden ser de naturaleza química o física.
Tal y como se usa en el presente documento, el término "ligandos" se refiere a moléculas y proteínas que se unen a receptores, por ejemplo, factor de crecimiento transformante beta (TFGp), Activina, Nodal, proteínas morfogénicas óseas (BMPs), etc.
"Inhibidor", tal y como se usa en este documento, se refiere a un compuesto o molécula (p. ej., molécula pequeña, péptido, peptidomimético, compuesto natural, ARNsi, ácido nucleico antisentido, aptámero o anticuerpo) que interfiere con (p. ej., reduce, disminuye, suprime, elimina o bloquea) la función o la vía de señalización de la molécula. Un inhibidor puede ser cualquier compuesto o molécula que cambia cualquier actividad de una proteína mencionada (molécula de señalización, cualquier molécula involucrada con la molécula de señalización mencionada, una molécula asociada mencionada, tal como una glucógeno sintasa cinasa 3p (GSK3p)) (p. ej., que incluye, pero no se limita a, las moléculas de señalización descritas en este documento), por ejemplo, mediante un contacto directo con la señalización de SMAD, el contacto con el ARNm de SMAD, la generación de cambios conformacionales de SMAD, la disminución de los niveles de proteína de SMAD o una interferencia con las interacciones de SMAD con los agentes asociados de la señalización (p. ej., incluyendo aquellos descritos en este documento), y que afecta a la expresión de los genes diana de SMAD (p. ej., los descritos en este documento). Los inhibidores también incluyen moléculas que regulan indirectamente la actividad biológica, por ejemplo, la actividad biológica de SMAD, al interceptar moléculas señalizadoras aguas arriba (p. ej., dentro del dominio extracelular, los ejemplos de una molécula señalizadora y un efecto incluyen: Nogina, que secuestra proteínas morfogénicas óseas, inhibiendo la activación de receptores de ALK 1,2, 3 y 6, lo que evita la activación de SMAD aguas abajo. Del mismo modo, cordina, cerberus, foliestatina, secuestran de manera similar los activadores extracelulares de la señalización de SMAD. Bambi, una proteína transmembranal, también actúa como un seudorreceptor para secuestrar las moléculas de señalización de TGFb extracelulares). Se contempla el uso de anticuerpos que bloquean proteínas aguas arriba o aguas abajo, para neutralizar activadores extracelulares de la señalización de proteínas y similares. Los inhibidores se describen en términos de inhibición competitiva (se unen al sitio activo, de manera que excluyen o reducen la unión de otro compuesto conocido que se une) e inhibición alostérica (se unen a una proteína de manera que cambia la conformación de la proteína de una manera que interfiere con la unión de un compuesto al sitio activo de esa proteína), además de la inhibición inducida por la unión y que afecta a una molécula aguas arriba de la molécula de señalización mencionada lo que, a su vez, provoca la inhibición de la molécula mencionada. Un inhibidor puede ser un "inhibidor directo" que inhibe una diana de señalización o una ruta de señalización diana que se pone realmente en contacto con la diana de señalización.
"Activadores", tal y como se usa en este documento, se refiere a compuestos que aumentan, inducen, estimulan, activan, facilitan o mejoran la activación de la función de señalización de la molécula o la vía, por ejemplo, señalización de Wnt, señalización de SHH, etc.
Tal y como se usa en este documento, el término "derivado" se refiere a un compuesto químico con una estructura central similar.
Tal y como se usa en el presente documento, la expresión "una población de células" o "una población celular" se refiere a un grupo de al menos dos células. En ejemplos no limitativos, una población celular puede incluir al menos aproximadamente 10, al menos aproximadamente 100, al menos aproximadamente 200, al menos aproximadamente 300, al menos aproximadamente 400, al menos aproximadamente 500, al menos aproximadamente 600, al menos aproximadamente 700, al menos aproximadamente 800, al menos aproximadamente 900, al menos aproximadamente 1000 células. La población puede ser una población pura que comprende un tipo de célula, tal como una población de precursores de DA del mesencéfalo, o una población de células madre no diferenciadas. Alternativamente, la población puede comprender más de un tipo celular, por ejemplo, una población celular mixta.
Tal y como se usa en el presente documento, la expresión "célula madre" se refiere a una célula con la capacidad de dividirse durante períodos indefinidos, en un cultivo y dar lugar a células especializadas.
Tal y como se usa en este documento, la expresión "célula madre embrionaria" y "ESC" se refieren a una célula primitiva (no diferenciada) que se obtiene a partir de un embrión en estadio de preimplantación, capaz de dividirse sin diferenciarse durante un período prolongado en cultivo, y que se sabe que se convierte en células y tejidos de las tres capas germinales primarias. Una célula madre embrionaria humana se refiere a una célula madre embrionaria que proviene de un embrión humano. Tal y como se usa en el presente documento, la expresión "célula madre embrionaria humana" o "hESC" se refiere a un tipo de células madre pluripotenciales obtenidas a partir de embriones humanos en estadio temprano, hasta e incluyendo el estadio de blastocisto, que es capaz de dividirse sin diferenciarse durante un período prolongado en cultivo, y que se sabe que se convierte en células y tejidos de las tres capas germinales primarias.
Tal y como se usa en este documento, la expresión "línea de células madre embrionarias", se refiere a una población de células madre embrionarias que han sido cultivadas en condiciones in vitro que permiten una proliferación sin diferenciación durante días, meses o años.
Tal y como se usa en el presente documento, el término "totipotencial", se refiere a la capacidad de dar lugar a todos los tipos de células corporales, más todos los tipos de células que forman los tejidos extraembrionarios tales como la placenta.
Tal y como se usa en el presente documento, el término "multipotencial", se refiere a la capacidad de convertirse en más de un tipo de célula corporal.
Tal y como se usa en el presente documento, el término "pluripotencial", se refiere a la capacidad de convertirse en las tres capas germinales del desarrollo de un organismo que incluyen endodermo, mesodermo y ectodermo.
Tal y como se usa en el presente documento, la expresión "célula madre pluripotencial inducida" o "iPSC", se refiere a un tipo de célula madre pluripotencial formada por la introducción de ciertos genes embrionarios (tales como, pero sin limitarse a, los transgenes OCT4, SOX2 y KLF4) (véase, por ejemplo, Takahashi y Yamanaka Cell 126, 663-676 (2006)) en una célula somática.
Tal y como se usa en este documento, la expresión "célula somática", se refiere a cualquier célula del cuerpo distinta de los gametos (óvulo o esperma); a veces denominadas células "adultas".
Tal y como se usa en el presente documento, la expresión "célula madre somática (adulta)", se refiere a una célula indiferenciada relativamente rara que se encuentra en muchos órganos y tejidos diferenciados con una capacidad limitada tanto para la autorrenovación (en laboratorio) como para la diferenciación.
Tal y como se usa en este documento, el término "neurona" se refiere a una célula nerviosa, las principales unidades funcionales del sistema nervioso. Una neurona consiste en un cuerpo celular y sus prolongaciones: un axón y una o varias dendritas. Las neuronas transmiten información a otras neuronas o células mediante la liberación de neurotransmisores en las sinapsis.
Tal y como se usa en el presente documento, el término "proliferación" se refiere a un aumento en el número de células.
Tal y como se usa en el presente documento, el término "indiferenciada" se refiere a una célula que aún no se ha desarrollado en un tipo de célula especializada.
Tal y como se usa en el presente documento, el término "diferenciación" se refiere a un proceso mediante el cual una célula embrionaria no especializada adquiere las características de una célula especializada, tal como una neurona, célula del corazón, hígado o muscular. La diferenciación está controlada mediante la interacción de los genes de una célula con las condiciones físicas y químicas fuera de la célula, generalmente a través de vías de señalización que involucran proteínas incluidas en la superficie celular.
Tal y como se usa en el presente documento, la expresión "diferenciación dirigida" se refiere a una manipulación de las condiciones de cultivo de células madre para inducir una diferenciación en un tipo de célula particular (por ejemplo, deseada), como precursores neurales, de la cresta neural, de la placoda craneal y del ectodermo no neural.
Tal y como se usa en el presente documento, la expresión "diferenciación dirigida" haciendo referencia a una célula madre, se refiere al uso de moléculas pequeñas, proteínas de un factor de crecimiento y otras condiciones de crecimiento para promover la transición de una célula madre desde el estado pluripotencial a un estado más maduro o un destino celular especializado.
Tal y como se usa en el presente documento, la expresión "que induce la diferenciación" haciendo referencia a una célula, se refiere a cambiar el tipo de célula predeterminado (genotipo y/o fenotipo) a un tipo de célula no predeterminado (genotipo y/o fenotipo). Por lo tanto, "que induce la diferenciación en una célula madre" se refiere a inducir a la célula madre (p. ej., una célula madre humana) a dividirse en células de progenie con características diferentes a las de la célula madre, como el genotipo (p. ej., cambio en la expresión génica determinada mediante análisis genético, tal como una micromatriz) y/o fenotipo (p. ej., cambio en la expresión de un marcador proteico de células DA del mesencéfalo, o sus precursores, tales como EN-1, OTX2, TH, NURR1, FOXA2 y LLMX1A).
Tal y como se usa en este documento, la expresión "cultivo celular" se refiere a un crecimiento de células in vitro en un medio artificial para una investigación o un tratamiento médico.
Tal y como se usa en este documento, la expresión "medio de cultivo", se refiere a un líquido que cubre las células en un recipiente de cultivo, como una placa de Petri, una placa de pocillos múltiples y similares, y contiene nutrientes para nutrir y mantener a las células. El medio de cultivo también puede incluir factores de crecimiento añadidos para producir cambios deseados en las células.
Tal y como se usa en el presente documento, la expresión "poner en contacto" una célula o células con un compuesto (p. ej., uno o varios inhibidores, activadores y/o inductores), se refiere a proporcionar un compuesto en una ubicación que permite que la célula o células accedan al compuesto. La puesta en contacto se puede lograr utilizando cualquier método adecuado. Por ejemplo, la puesta en contacto se puede lograr añadiendo el compuesto, en forma concentrada, a una célula o población de células, por ejemplo, en el contexto de un cultivo celular, para lograr la concentración deseada. La puesta en contacto también puede lograrse incluyendo el compuesto como componente de un medio de cultivo formulado.
Tal y como se usa en este documento, la expresión ”in vitro", se refiere a un entorno artificial y a los procesos o reacciones que ocurren dentro de un entorno artificial. Entornos in vitro se ejemplifican, pero no se limitan a, tubos de ensayo y cultivos celulares.
Tal y como se usa en este documento, la expresión ”in vivo", se refiere al entorno natural (por ejemplo, un animal o una célula) y a los procesos o reacciones que ocurren dentro de un entorno natural, como el desarrollo embrionario, la diferenciación celular, la formación del tubo neural, etc.
Tal y como se usa en el presente documento, el término "expresar" en relación con un gen o una proteína, se refiere a producir un ARNm o una proteína que se puede observar usando ensayos tales como ensayos con micromatrices, ensayos de tinción de anticuerpos y similares.
Tal y como se usa en el presente documento, el término "marcador" o la expresión "marcador celular", se refiere a un gen o una proteína que identifica una célula o un tipo de célula particular. Un marcador para una célula puede no estar limitado a un marcador, los marcadores pueden referirse a un "patrón" de marcadores, de modo que un grupo designado de marcadores puede identificar una célula o un tipo de célula, a partir de otra célula u otro tipo de célula.
Tal y como se usa en el presente documento, la expresión "obtenido a partir de" o "establecido a partir de" o "diferenciado a partir de", cuando se hace referencia a cualquier célula descrita en el presente documento, se refiere a una célula que se ha obtenido a partir de (p. ej., aislada, purificada, etc.) una célula original final en una línea celular, un tejido (como un embrión disociado) o fluidos usando cualquier manipulación como, pero sin limitarse a, aislamiento de células individuales, cultivo in vitro, tratamiento y/o mutagénesis usando, por ejemplo, proteínas, productos químicos, radiación, infección con virus, transfección con secuencias de ADN, como con un morfógeno, etc., selección (como por cultivo en serie) de cualquier célula que esté contenida en células originales cultivadas. Una célula derivada se puede seleccionar a partir de una población mixta en virtud de la respuesta frente a un factor de crecimiento, citocina, progresión seleccionada de tratamientos con citocina, adhesividad, falta de adhesividad, procedimiento de clasificación y similares.
Un "individuo" o "sujeto" en el presente documento es un vertebrado, tal como un ser humano o un animal no humano, por ejemplo, un mamífero. Los mamíferos incluyen, pero no se limitan a, seres humanos, primates no humanos, animales de granja, animales para deporte, roedores y mascotas. Ejemplos no limitantes de sujetos animales no humanos incluyen roedores, tales como ratones, ratas, hámsteres y cobayas; conejos; perros; gatos; ovejas; cerdos; cabras; vacas; caballos; y primates no humanos tales como simios y monos.
Tal y como se usa en este documento, el término "enfermedad" se refiere a cualquier estado o trastorno que daña o interfiere con la función normal de una célula, tejido u órgano.
Tal y como se usa en este documento, el término "tratar" o "tratamiento" se refiere a una intervención clínica en un intento de alterar el curso de una enfermedad del individuo o la célula que se está tratando, y se puede realizar como una profilaxis o durante el curso de una patología clínica. Los efectos terapéuticos de un tratamiento incluyen, pero sin limitarse a, la prevención de la aparición o recurrencia de una enfermedad, el alivio de los síntomas, la disminución de cualquier consecuencia patológica directa o indirecta de la enfermedad, la prevención de metástasis, la disminución de la tasa de progresión de la enfermedad, la mejora o paliación del estado de la enfermedad, y la remisión o el pronóstico mejorado. Al prevenir la progresión de una enfermedad o un trastorno, un tratamiento puede evitar el deterioro debido a un trastorno en un sujeto afectado o diagnosticado o en un sujeto sospechoso de padecer el trastorno, pero también un tratamiento puede prevenir la aparición del trastorno o un síntoma del trastorno en un sujeto que tiene riesgo de padecer el trastorno o que es sospechoso de tener el trastorno.
5.2 Método de diferenciación de las células madre
El objeto de la presente descripción se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de que las neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo (mDA), y sus precursores, pueden diferenciarse de las células madre humanas mediante una inhibición doble de la señalización de SMAD (por ejemplo, mediante la inhibición de la señalización de TGFp/Activina-Nodal y la señalización de BMP), junto con la activación de la señalización de Sonic Hedgehog (SHH) y la activación de la señalización de wingless (Wnt), en donde la concentración de un compuesto activador de Wnt aumenta aproximadamente 4 días después del contacto inicial de las células con los inhibidores de SMAD, el activador de SHH y el activador de Wnt. En ciertas realizaciones no limitantes, dicho aumento en la concentración del compuesto activador de Wnt puede ser de aproximadamente un 400% a un 1000% de la concentración del compuesto activador de Wnt antes de dicho aumento. En ciertas realizaciones no limitantes, dicha concentración más alta de activador de Wnt puede mantenerse durante al menos aproximadamente 7 u 8 días. En determinadas realizaciones no limitantes, el aumento de la activación de Wnt se consigue añadiendo un segundo o más activadores de Wnt. Las células pueden ponerse en contacto adicionalmente con activadores e inhibidores específicos del linaje de DA del mesencéfalo, por ejemplo, BDNF, GDNF, AMPc, TGFp, AA y DAPT. En determinadas realizaciones no limitantes, una cantidad eficaz de la concentración de activador de Wnt incrementada es aquella concentración que reduce el nivel detectable de expresión de PAX6 en una población de células puestas en contacto con el activador de Wnt. En ciertas realizaciones no limitantes, la expresión de PAX6 no es detectable en la población de células.
El objeto de la presente descripción proporciona métodos in vitro para inducir una diferenciación de las células madre (por ejemplo, células madre humanas). Ejemplos no limitantes de células madre humanas incluyen células madre embrionarias humanas (hESC), células madre pluripotenciales humanas (hPSC), células madre pluripotenciales inducidas humanas (hiPSC), células madre partenogenéticas humanas, células madre pluripotenciales similares a células germinales primordiales, células madre epiblásticas, células madre pluripotenciales de clase F, células madre somáticas, células madre cancerosas o cualquier otra célula capaz de una diferenciación específica de linaje. En ciertas realizaciones, la célula madre humana es una célula madre embrionaria humana (hESC). En ciertas realizaciones, la célula madre humana es una célula madre pluripotencial inducida humana (hiPSC).
Ejemplos no limitantes de células madre que pueden usarse de acuerdo con los métodos descritos por la presente solicitud también incluyen células madre no embrionarias humanas, de primate no humano o de roedor, células madre embrionarias, células pluripotenciales no embrionarias inducidas y células pluripotenciales modificadas genéticamente.
En ciertas realizaciones no limitantes, la célula madre o una célula de su progenie contiene un ácido nucleico heterólogo introducido, en donde dicho ácido nucleico puede codificar un producto proteico o de ácido nucleico deseado o tener valor informativo (véase, por ejemplo, el documento de patente estadounidense n° 6.312.911). Ejemplos no limitativos de productos proteicos deseados incluyen marcadores detectables a través de estudios de formación de imágenes in vivo, por ejemplo, receptores u otras proteínas de la membrana celular tales como, pero sin limitarse a, el cotransportador de yodo y sodio humano.
Ejemplos no limitantes de marcadores incluyen además proteínas fluorescentes (como la proteína fluorescente verde (GFP), la proteína fluorescente azul (EBFP, EBFP2, Azurita, mKalamal), la proteína fluorescente cian (ECFP, Cerulean, CyPet, mTurquoise2) y derivados de la proteína fluorescente amarilla (YFP, Citrina, Venus, YPet, EYFP)), p-galactosidasa (LacZ), cloranfenicol acetiltransferasa (cat), neomicina fosfotransferasa (neo), enzimas (como oxidasas y peroxidasas) y moléculas antigénicas. Tal y como se usa en el presente documento, las expresiones "gen informador" o "estructura artificial informadora" se refieren a estructuras artificiales genéticas que comprenden un ácido nucleico que codifica una proteína que es fácilmente detectable o fácilmente analizable, tal como una proteína coloreada, una proteína fluorescente como GFP o una enzima como beta-galactosidasa (gen lacZ). En ciertas realizaciones, el informador puede estar impulsado por un promotor recombinante de un gen marcador de mDA, por ejemplo, TH y/o En-1.
En ciertas realizaciones, un método de diferenciación descrito en este documento comprende poner en contacto una población de células madre humanas con uno o varios inhibidores de la señalización del factor de crecimiento transformante beta (TGFp)/Activina-Nodal, lo que da como resultado una inhibición de la señalización de “Small Mothers Against Decapentaplegic” (SMAD). En determinadas realizaciones, el inhibidor de la señalización de TGFp/Activina-Nodal neutraliza los ligandos, incluidos los TGFps, las proteínas morfogenéticas óseas (BMPs), Nodal y las activinas, o bloquea sus vías de señalización bloqueando los receptores y los efectores aguas abajo. Ejemplos no limitantes de inhibidores de la señalización de TGFp/Activina-Nodal se describen en los documentos WO/2010/096496, WO/2011/149762, WO/2013/067362, WO/2014/176606, WO/2015/077648, Chambers et al., Nat Biotechnol. 2009 marzo; 27(3):275-80, Kriks et al., Nature. 6 de noviembre de 2011; 480 (7378): 547-51, y Chambers et al., Nat Biotechnol. 1 de julio de 2012; 30 (7): 715-20 (2012). En ciertas realizaciones, uno o varios inhibidores de la señalización de TGFp/Activina-Nodal es una molécula pequeña seleccionada a partir del grupo que consiste en SB431542, sus derivados y sus mezclas. "SB431542" se refiere a una molécula con un número CAS 301836-41-9, una fórmula molecular de C22H18N4O3 , y denominada 4-[4-(1,3-benzodioxol-5-il)-5-(2-piridinil)-1 H-imidazol-2-il]-benzamida, por ejemplo, véase la estructura a continuación:
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Un método de diferenciación descrito actualmente comprende además poner en contacto las células madre humanas con uno o varios inhibidores de la señalización de BMP, lo que da como resultado la inhibición de la señalización de SMAD. Ejemplos no limitantes de inhibidores de la señalización de SMAD se describen en el documento WO2011/149762, Chambers et al., Nat Biotechnol. 2009 marzo; 27(3):275-80, Kriks et al., Nature, 6 de noviembre de 2011; 480 (7378): 547-51, y Chambers et al., Nat Biotechnol, 1 de julio de 2012; 30 (7): 715-20. En ciertas realizaciones, uno o varios inhibidores de la señalización de BMP/SMAD es una molécula pequeña seleccionada a partir del grupo que consiste en LDN193189, sus derivados y sus mezclas. "LDN193189" se refiere a una molécula pequeña DM-3189, con nombre IUPAC 4-(6-(4-(piperazin-1-il)fenil)pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-il)quinolina, con una fórmula química de C25H22N6 con la siguiente fórmula.
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LDN193189 es capaz de actuar como un inhibidor de la señalización de SMAD. LDN193189 también es un inhibidor de molécula pequeña muy potente de ALK2, ALK3 y ALK6, proteínas tirosina cinasas (PTK), que inhibe la señalización de miembros de las familias ALK1 y ALK3 de receptores de TGFp de tipo I, lo que da como resultado la inhibición de la transmisión de múltiples señales biológicas, incluyendo las proteínas morfogenéticas óseas (BMP) BMP2, BMP4, BMP6, BMP7 y señales de citocinas de Activina y, posteriormente, la fosforilación con SMAD de Smad1, Smad5 y Smad8 (Yu et al. (2008) Nat Med 14:1363-1369; Cuny et al. (2008) Bioorg. Med. Chem. Lett. 18: 4388-4392).
Un método de diferenciación descrito actualmente comprende además poner en contacto las células madre humanas con uno o varios activadores de la señalización de Wnt. Tal y como se usa en este documento, el término "WNT" o "wingless" haciendo referencia a un ligando, se refiere a un grupo de proteínas secretadas (es decir, Intl (integración 1) en humanos) capaces de interaccionar con un receptor de WNT, tal como un receptor de la familia de receptores Frizzled y LRPDerailed/RYK. Tal y como se usa en el presente documento, el término "WNT" o "wingless" haciendo referencia a una vía de señalización, se refiere a una vía de señalización compuesta por ligandos de la familia de Wnt y receptores de la familia de Wnt, tales como los receptores Frizzled y LRPDerailed/RYK, mediada con o sin pcatenina. Para los fines descritos en el presente documento, una ruta de señalización de WNT preferida incluye la mediación con p-catenina, por ejemplo, WNT / -catenina.
En determinadas realizaciones, uno o varios activadores de la señalización de Wnt reducen GSK3p para la activación de la señalización de Wnt. Por lo tanto, el activador de la señalización de Wnt puede ser un inhibidor de GSK3p. Un inhibidor de GSK3p es capaz de activar una vía de señalización de WNT, véase, por ejemplo, Cadigan et al., J Cell Sci. 2006; 119:395-402; Kikuchi, et al., Cell Signaling. 2007; 19:659-671. Tal y como se usa en el presente documento, la expresión "inhibidor de la glucógeno sintasa cinasa 3p" se refiere a un compuesto que inhibe una enzima de la glucógeno sintasa cinasa 3p, por ejemplo, véase, Doble et al., J Cell Sci. 2003; 116:1175-1186.
Ejemplos no limitantes de activadores de la señalización de Wnt o inhibidores de GSK3p se describen en los documentos WO2011/149762, WO13/067362, Chambers et al., Nat Biotechnol. 1 de julio de 2012; 30 (7): 715-20, Kriks et al., Nature. 6 de noviembre de 2011; 480 (7378): 547-51 y Calder et al., J. Neurosci. 19 de agosto de 2015; 35 (33): 11462-81. En ciertas realizaciones, uno o varios activadores de la señalización de Wnt es una molécula pequeña seleccionada a partir del grupo que consiste en CHIR99021, sus derivados y sus mezclas. "CHIR99021" (también conocida como "aminopirimidina" o "3-[3-(2-carboxietil)-4-metilpirrol-2-metilidenil]-2-indolinona") se refiere al nombre IUPAC 6-(2-(4-(2,4-diclorofenil)-5-(4-metil-1H-imidazol-2-il)pirimidin-2-ilamino)etilamino)nicotinonitrilo con la siguiente fórmula.
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CHIR99021 es muy selectiva y muestra una selectividad multiplicada por casi mil veces frente a un panel de cinasas relacionadas y no relacionadas, con una CI50=6,7 nM frente a GSK3p humana y valores de CI50 nanomolares frente a homólogos de GSK3p de roedor.
En ciertas realizaciones no limitantes, la población de células descritas en el presente documento se pone en contacto con una concentración inicial de CHIR99021 con una concentración de entre aproximadamente 0,001 y 2 pM, o entre aproximadamente 0,01 y 1,5 pM, o entre aproximadamente 0,1 y 1 pM, o entre aproximadamente 0,5 y 0,8 pM, o de aproximadamente 0,7 pM, en donde la concentración de CHIR99021 aumenta, como se describe en el presente documento, por ejemplo, aproximadamente 4 días después del contacto inicial de las células con CHIR99021, entre aproximadamente 2 y 15 pM, o entre aproximadamente 3 y 14 pM, o entre aproximadamente 4 y 13 pM, o entre aproximadamente 5 y 12 pM, o entre aproximadamente 6 y 11 pM, o entre aproximadamente 7 y 10 pM, o entre aproximadamente 8 y 9 pM, o entre aproximadamente 3 y 10 pM, o entre aproximadamente 5 y 10 pM, o a aproximadamente 3 pM, o a aproximadamente 7,5 pM.
Un método de diferenciación descrito actualmente comprende además poner en contacto las células madre humanas con uno o varios activadores de la señalización de SHH. Tal y como se usa en este documento, la expresión "Sonic hedgehog", "SHH" o "Shh" se refiere a una proteína que es una de al menos tres proteínas en la familia de vías de señalización de mamíferos llamada “hedgehog”, otra es desert hedgehog (DHH), mientras que una tercera es Indian hedgehog (IHH). Shh interacciona con al menos dos proteínas transmembranales al interaccionar con las moléculas transmembranales Patched (PTC) y Smoothened (SMO). Shh generalmente se une a PTC, lo que luego permite la activación de SMO como transductor de señales. En ausencia de SHH, PTC normalmente inhibe a SMO, lo que a su vez activa un represor transcripcional, de modo que no se produce la transcripción de ciertos genes. Cuando Shh está presente y se une a PTC, PTC no puede interferir con el funcionamiento de SMO. Con SMO desinhibida, ciertas proteínas pueden entrar en el núcleo y actuar como factores de transcripción que permiten que se activen ciertos genes (véase, Gilbert, 2000 Developmental Biology (Sunderland, Mass., Sinauer Associates, Inc., Publishers). En determinadas realizaciones, un activador de la señalización de Sonic hedgehog (SHH) se refiere a cualquier molécula o compuesto que activa una ruta de señalización de SHH, incluida una molécula o un compuesto que se une a PTC o a un agonista de Smoothened y similares. Ejemplos no limitantes de activadores de la señalización de Wnt o inhibidores de GSK3p se describen en los documentos WO10/096496, WO13/067362, Chambers et al., Nat Biotechnol. 2009 marzo; 27(3):275-80, y Kriks et al., Nature. 6 de noviembre de 2011; 480 (7378): 547-51. Ejemplos de tales compuestos son SHH recombinante, SHH purificada, una proteína Sonic hedgehog (SHH) C25II (es decir, un fragmento N-terminal recombinante de una proteína sonic hedgehog murina de longitud completa, capaz de unirse al receptor de SHH para activar SHH, por ejemplo, número de catálogo de R and D Systems: 464-5H-025/CF) y un agonista de Smoothened de molécula pequeña, tal como, por ejemplo, purmorfamina.
En determinadas realizaciones, los inhibidores y los activadores descritos anteriormente se añaden a un medio de cultivo celular que comprende las células madre. Los medios de cultivo celular adecuados incluyen, pero no se limitan a, medio de reemplazamiento de suero Knockout® ("KSR"), medio Neurobasal® (NB), medio n 2, medio B-27 y medio Essential 8® /Essential 6® ("E8/E6") y combinaciones de los mismos. El medio KSR, el medio NB, el medio N2, el medio B-27 y el medio E8/E6 están disponibles comercialmente. El medio KSR es una formulación definida, sin suero, optimizada para cultivar y mantener células hESC indiferenciadas en cultivo.
En ciertas realizaciones, el medio de cultivo celular es un medio KSR. Los componentes de un medio KSR se describen en el documento WO2011/149762. En ciertas realizaciones, un medio KSR comprende DMEM Knockout, reemplazamiento de suero Knockout, L-Glutamina, Pen/Strep, MEM y 13-mercaptoetanol. En determinadas realizaciones, 1 litro de medio KSR comprende 820 mL de DMEM Knockout, 150 mL de reemplazamiento de suero Knockout, 10 mL de L-glutamina 200 mM, 10 mL de Pen/Strep, 10 mL de Me M 10 mM y 55 pM de 13-mercaptoetanol.
En ciertas realizaciones, las células madre se ponen en contacto con uno o varios inhibidores de la señalización de TGFp/Activina-Nodal, uno o varios inhibidores de la señalización de BMP/SMAD, uno o varios activadores de la señalización de Wnt y uno o varios activadores de la señalización de SHH. En determinadas realizaciones, se añaden uno o varios inhibidores de la señalización de TGFp/Activina-Nodal, uno o varios inhibidores de la señalización de SMAD, uno o varios activadores de la señalización de Wnt y uno o varios activadores de la señalización de SHH, a un medio de cultivo celular que comprende células madre.
En ciertas realizaciones, el medio de cultivo celular es un medio E8/E6. El medio E8/E6 es un medio sin nutrientes ni xeno (sin componentes ajenos a los humanos) que favorece el crecimiento y la expansión de las células madre pluripotenciales humanas. Se ha mostrado que el medio E8/E6 apoya la reprogramación de células somáticas. Además, el medio E8/E6 se puede utilizar como base para la formulación de medios personalizados para el cultivo de PSCs. Un ejemplo de medio E8/E6 se describe en Chen et al., Nat Methods, mayo 2011; 8(5):424-9. Un ejemplo de medio E8/E6 se describe en el documento WO15/077648. En ciertas realizaciones, un medio de cultivo de células E8/E6 comprende DMEM/F12, ácido ascórbico, selenio, insulina, NaHCO3, transferrina, FGF2 y TGFp. El medio E8/E6 difiere de un medio KSR en que el medio E8/E6 no incluye un ingrediente activo de BMP o Wnt. Por lo tanto, en ciertas realizaciones, cuando se usa un medio E8/E6 para cultivar la población de células madre descrita actualmente para diferenciarla en una población de propioceptores, no se requiere que uno o varios inhibidores de la señalización de SMAD (por ejemplo, aquellos que inhiben BMP) sean añadido al medio E8/E6. En ciertas realizaciones, las células madre se ponen en contacto con uno o varios inhibidores de la señalización de TGFp/Activina-Nodal, uno o varios activadores de la señalización de Wnt y uno o varios activadores de la señalización de SHH. En ciertas realizaciones, las células madre puestas en contacto con uno o varios inhibidores de la señalización de TGFp/Activina-Nodal, uno o varios activadores de la señalización de Wnt y uno o varios activadores de la señalización de SHH, se añaden a un medio de cultivo celular que comprende las células madre En ciertas realizaciones, BMP se puede añadir adicionalmente al medio.
En ciertas realizaciones, el objeto de la presente descripción proporciona métodos in vitro para inducir la diferenciación de células madre humanas en neuronas DA del mesencéfalo, o precursores de las mismas. En determinadas realizaciones, las células madre se ponen en contacto con uno o varios inhibidores de la señalización de TGFp/Activina-Nodal, uno o varios inhibidores de la señalización de BMP/SMAD, uno o varios activadores de la señalización de Wnt y uno o varios activadores de la señalización de SHH al mismo tiempo, por ejemplo, añadiendo esos inhibidores a un medio de cultivo celular que comprende las células madre el mismo día. En determinadas realizaciones, la concentración de uno o varios activadores de la señalización de Wnt aumenta al menos aproximadamente 2, 3, 4, 5 o 6 días después de que las células se pongan en contacto inicialmente con el activador de Wnt.
En ciertas realizaciones, uno o varios inhibidores de la señalización de TGFp/Activina-Nodal se ponen en contacto con las células durante al menos aproximadamente 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más días, por ejemplo, entre aproximadamente 4 y 10 días, o entre aproximadamente 5 y 9 días, o entre aproximadamente 6 y 8 días. En ciertas realizaciones, uno o varios inhibidores de la señalización de TGFp/Activina-Nodal se ponen en contacto con las células durante aproximadamente 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más días. En ciertas realizaciones, el uno o varios inhibidores de la señalización de TGFp/Activina-Nodal se ponen en contacto con las células durante aproximadamente 7 días. En ciertas realizaciones, uno o varios inhibidores de la señalización de TGFp/Activina-Nodal se añaden todos los días o cada dos días a un medio de cultivo celular que comprende las células madre desde el día 0 hasta el día 10 (p. ej., se añade el día 0, el día 2, el día 4, el día 6, el día 8 y el día 10). En ciertas realizaciones, uno o varios inhibidores de la señalización de TGFp/Activina-Nodal se añaden los días 0, 1, 3, 4 y 6.
En determinadas realizaciones, el uno o varios inhibidores de la señalización de TGFp/Activina-Nodal se ponen en contacto con las células con una concentración de entre aproximadamente 1 y 20 pM, o entre aproximadamente 2 y 19 pM, o entre aproximadamente 3 y 18 pM, o entre aproximadamente 4 y 17 pM, o entre aproximadamente 5 y 16 pM, o entre aproximadamente 6 y 15 pM, o entre aproximadamente 7 y 14 pM, o entre aproximadamente 8 y 13 pM, o entre aproximadamente 9 y 12 pM, o entre aproximadamente 10 y 11 pM, y valores intermedios. En ciertas realizaciones, uno o varios inhibidores de la señalización de TGFp/Activina-Nodal se ponen en contacto con las células con una concentración de aproximadamente 7, 8, 9, 10, 11, 12 o 13 pM. En ciertas realizaciones, uno o varios inhibidores de la señalización de TGFp/Activina-Nodal se ponen en contacto con las células con una concentración de aproximadamente 10,8 pM.
En ciertas realizaciones, el uno o varios inhibidores de la señalización de BMP/SMAD se ponen en contacto con las células durante al menos aproximadamente 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más días, por ejemplo, entre aproximadamente 4 y 10 días, o entre aproximadamente 5 y 9 días, o entre aproximadamente 6 y 8 días. En ciertas realizaciones, el uno o varios inhibidores de la señalización de BMP/SMAD se ponen en contacto con las células durante aproximadamente 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más días. En determinadas realizaciones, el uno o varios inhibidores de la señalización de BMP/SMAD se ponen en contacto con las células durante aproximadamente 7 días. En ciertas realizaciones, el uno o varios inhibidores de la señalización de BMP/SMAD se añaden todos los días o cada dos días a un medio de cultivo celular que comprende las células madre desde el día 0 hasta el día 10 (p. ej., se añade el día 0, el día 2, el día 4, el día 6, el día 8 y el día 10). En ciertas realizaciones, el uno o varios inhibidores se añaden los días 0, 1,3, 4 y 6.
En determinadas realizaciones, el uno o varios inhibidores de la señalización de BMP/SMAD se ponen en contacto con las células con una concentración de entre aproximadamente 50 y 500 nM, o entre aproximadamente 75 y 475 nM, o entre aproximadamente 100 y 450 nM, o entre aproximadamente 125 y 425 nM, o entre aproximadamente 150 y 400 nM, o entre aproximadamente 175 y 375 nM, o entre aproximadamente 200 y 350 nM, o entre aproximadamente 225 y 325 nM, o entre aproximadamente 250 y 300 nM, y valores intermedios. En determinadas realizaciones, el uno o varios inhibidores de la señalización de BMP/SMAD se ponen en contacto con las células con una concentración de aproximadamente 150, 200, 250, 300 o 350 nM. En determinadas realizaciones, el uno o varios inhibidores de la señalización de BMP/SMAD se ponen en contacto con las células con una concentración de aproximadamente 250 nM.
En ciertas realizaciones, el uno o varios activadores de la señalización de SHH se ponen en contacto con las células durante al menos aproximadamente 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más días, por ejemplo, entre aproximadamente 4 y 10 días, o entre aproximadamente 5 y 9 días, o entre aproximadamente 6 y 8 días. En ciertas realizaciones, el uno o varios activadores de la señalización de SHH se ponen en contacto con las células durante aproximadamente 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más días. En ciertas realizaciones, el uno o varios activadores de la señalización de SHH se ponen en contacto con las células durante aproximadamente 7 días. En ciertas realizaciones, el uno o varios activadores de la señalización de SHH se añaden todos los días o cada dos días a un medio de cultivo celular que comprende las células madre desde el día 0 hasta el día 10 (por ejemplo, se añade el día 0, el día 2, el día 4, el día 6, el día 8 y el día 10). En ciertas realizaciones, el uno o varios inhibidores se añaden los días 0, 1, 3, 4 y 6.
En determinadas realizaciones, el uno o varios activadores de la señalización de SHH se ponen en contacto con las células con una concentración de entre aproximadamente 50 y 1000 ng/mL, o entre aproximadamente 100 y 950 ng/mL, o entre aproximadamente 150 y 900 ng/mL, o entre aproximadamente 200 y 850 ng/mL, o entre aproximadamente 250 y 800 ng/mL, o entre aproximadamente 300 y 750 ng/mL, o entre aproximadamente 350 y 700 ng/mL, o entre aproximadamente 400 y 650 ng/mL, o entre aproximadamente 450 y 600 ng/mL, o entre aproximadamente 500 y 550 ng/mL, y valores intermedios. En determinadas realizaciones, el uno o varios activadores de la señalización de SHH se ponen en contacto con las células con una concentración de aproximadamente 400, 450, 500, 550 o 600 ng/mL. En determinadas realizaciones, el uno o varios activadores de la señalización de SHH se ponen en contacto con las células con una concentración de aproximadamente 500 ng/mL.
En ciertas realizaciones, el uno o varios activadores de la señalización de Wnt se ponen en contacto con las células durante al menos aproximadamente 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18,19, o 20 o más días, por ejemplo, entre aproximadamente 4 y 20 días, o entre aproximadamente 4 y 19 días, o entre aproximadamente 4 y 18 días, o entre aproximadamente 4 y 17 días, o entre aproximadamente 4 y 16 días , o entre aproximadamente 4 y 15 días, o entre aproximadamente 4 y 14 días, o entre aproximadamente 4 y 13 días, o entre aproximadamente 4 y 12 días, o entre aproximadamente 4 y 11 días, o entre aproximadamente 4 y 10 días, o entre aproximadamente 4 y 9 días, o entre aproximadamente 4 y 8 días, o entre aproximadamente 4 y 7 días, o entre aproximadamente 4 y 6 días, o entre aproximadamente 5 y 19 días, o entre aproximadamente 6 y 17 días, o entre aproximadamente 7 y 16 días, o entre aproximadamente 8 y 15 días, o entre aproximadamente 9 y 14 días, o entre aproximadamente 10 y 13 días. En ciertas realizaciones, el uno o varios activadores de la señalización de Wnt se ponen en contacto con las células durante aproximadamente 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 o más días. En ciertas realizaciones, el uno o varios activadores de la señalización de Wnt se ponen en contacto con las células durante aproximadamente 12 días. En ciertas realizaciones, el uno o varios activadores de la señalización de SHH se añaden todos los días o cada dos días a un medio de cultivo celular que comprende las células madre desde el día 0 hasta el día 12 (p. ej., se añade el día 0, el día 2, el día 4, el día 6, el día 8, el día 10 y el día 12). En ciertas realizaciones, el uno o varios inhibidores se añaden los días 0, 1, 3, 4, 6, 7, 9, 10 y 11.
En determinadas realizaciones, el uno o varios activadores de la señalización de Wnt se ponen en contacto con las células con una concentración de entre aproximadamente 0,05 y 15 pM, o entre aproximadamente 0,1 y 14 pM, o entre aproximadamente 0,5 y 13 pM, o entre aproximadamente 1 y 12 pM, o entre aproximadamente 1,5 y 11 pM, o entre aproximadamente 2 y 10 pM, o entre aproximadamente 2,5 y 9,5 pM, o entre aproximadamente 3 y 9 pM, o entre aproximadamente 3,5 y 8,5 pM, o entre aproximadamente 4 y 8 pM, o entre aproximadamente 4,5 y 7,5 pM, o entre aproximadamente 5 y 7 pM, o entre aproximadamente 5,5 y 6,5 pM, y valores intermedios. En determinadas realizaciones, el uno o varios activadores de la señalización de Wnt se ponen en contacto con las células con una concentración de aproximadamente 0,1,0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 o 1 pM. En determinadas realizaciones, el uno o varios activadores de la señalización de Wnt se ponen en contacto con las células con una concentración de aproximadamente 0,7 pM.
En determinadas realizaciones, la concentración del activador de la señalización de Wnt se aumenta al menos aproximadamente 2, 3, 4, 5 o 6 días después de que las células se pongan en contacto inicialmente con el activador de Wnt, por ejemplo, entre aproximadamente 2 y 10 días, o entre aproximadamente 3 y 9 días, o entre aproximadamente 4 y 8 días, o entre aproximadamente 5 y 7 días. En determinadas realizaciones, la concentración del activador de la señalización de Wnt aumenta hasta aproximadamente 2, 3, 4, 5 o 6 días después de que las células se pongan en contacto inicialmente con el activador de Wnt. En determinadas realizaciones, las células se ponen en contacto con la concentración aumentada del activador de Wnt durante al menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 días o más, por ejemplo, entre aproximadamente 4 y 20 días, o entre aproximadamente 5 y 19 días, o entre aproximadamente 6 y 18 días, o entre aproximadamente 7 y 17 días, o entre aproximadamente 8 y 16 días, o entre aproximadamente 9 y 15 días, o entre aproximadamente 8 y 14 días, o entre aproximadamente 9 y 13 días, o entre aproximadamente 10 y 12 días. En determinadas realizaciones, las células se ponen en contacto con la concentración aumentada del activador de Wnt durante hasta aproximadamente 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 días o más. En determinadas realizaciones, las células se ponen en contacto con la concentración aumentada del activador de Wnt durante aproximadamente 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11 días. En determinadas realizaciones, las células se ponen en contacto con la concentración aumentada del activador de Wnt durante aproximadamente 8 días.
En ciertas realizaciones, la concentración del activador de la señalización de Wnt se incrementa hasta una concentración de entre aproximadamente 2 y 15 pM, o entre aproximadamente 3 y 14 pM, o entre aproximadamente 4 y 13 pM, o entre aproximadamente 5 y 12 pM, o entre aproximadamente 6 y 11 pM, o entre aproximadamente 7 y 10 pM, o entre aproximadamente 8 y 9 pM. En determinadas realizaciones, la concentración del activador de la señalización de Wnt se incrementa hasta una concentración de entre aproximadamente 3 y 10 pM, o entre aproximadamente 5 y 10 pM. En ciertas realizaciones, la concentración del activador de la señalización de Wnt se incrementa hasta una concentración de aproximadamente 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5 o 10 pM. En determinadas realizaciones, la concentración del activador de la señalización de Wnt se aumenta hasta una concentración de aproximadamente 3 pM. En determinadas realizaciones, la concentración del activador de la señalización de Wnt se aumenta hasta una concentración de aproximadamente 7,5 pM.
En determinadas realizaciones, la concentración del activador de la señalización de Wnt se incrementa desde la concentración inicial en contacto con las células entre aproximadamente 50 y 2000%, o entre aproximadamente 100 y 1950%, o entre aproximadamente 150 y 1900%, o entre aproximadamente 200 y 1850%, o entre aproximadamente 250 y 1800%, o entre aproximadamente 300 y 1750%, o entre aproximadamente 350 y 1700%, o entre aproximadamente 400 y 1650%, o entre aproximadamente 450 y 1600%, o entre aproximadamente 500 y 1550%, o entre aproximadamente 550 y 1500%, o entre aproximadamente 600 y 1450%, o entre aproximadamente 650 y 1400%, o entre aproximadamente 700 y 1350%, o entre aproximadamente 750 y 1300%, o entre aproximadamente 800 y 1250%, o entre aproximadamente 850 y 1200%, o entre aproximadamente 900 y 1150%, o entre aproximadamente 950 y 1100%, o entre aproximadamente 1000 y 1050%, y valores intermedios. En ciertas realizaciones, la concentración del activador de la señalización de Wnt se incrementa desde la concentración inicial puesta en contacto con las células entre aproximadamente 400 y 1450%, o entre aproximadamente 700 y 1050%, y valores intermedios.
En determinadas realizaciones, la concentración del activador de la señalización de Wnt aumenta desde la concentración inicial que se pone en contacto con las células en aproximadamente un 400%, 450%, 500%, 550%, 600%. 650%, 700%, 750%, 800%, 850%, 900%, 950%, 1000%, 1050% o 1100% o más.
En una realización específica no limitante, las células se ponen en contacto con uno o varios inhibidores de la señalización de TGFp/Activina-Nodal (es decir, un primer inhibidor de SMAD), por ejemplo, SB431542, con una concentración de aproximadamente 10,8 pM; uno o varios inhibidores de la señalización de BMP (es decir, un segundo inhibidor de SMAD), por ejemplo, LDN193189, con una concentración de aproximadamente 250 nM; uno o varios activadores de la señalización de Wnt, por ejemplo, CHIR99021, con una concentración de aproximadamente 0,7 pM; y uno o varios activadores de la señalización de SHH con una concentración de aproximadamente 500 ng/mL; en donde las células se ponen en contacto con los inhibidores durante aproximadamente 7 días (es decir, del Día 0 al Día 6 de cultivo), en donde la concentración de CHIR99021 aumenta a 3 pM o a 7,5 pM el Día 4 del cultivo celular.
En ciertas realizaciones, las células se ponen en contacto con uno o varios activadores de la señalización de Wnt durante aproximadamente 11 días (es decir, del Día 0 al Día 11 de cultivo), en donde las células se ponen en contacto con 7,5 pM de CHIR99021 desde el día 4 hasta el día 11 de cultivo celular; o en donde las células se ponen en contacto con 7,5 pM de CHIR99021 desde el día 4 hasta el día 9 de cultivo, y luego con 3 pM de CHIR99021 desde el día 10 hasta el día 11 de cultivo celular.
En determinadas realizaciones, las células se ponen en contacto con los activadores e inhibidores descritos en el presente documento con una concentración y durante un tiempo que son eficaces para aumentar un nivel detectable de expresión de uno o varios entre engrailed-1 (EN-1), caja homeótica orthodenticle 2 (OTX2), tirosina hidroxilasa (TH), proteína relacionada con el receptor nuclear 1 (NURR1), proteína de caja forkhead A2 (FOXA2) y factor de transcripción de caja homeótica 1 alfa LIM (LMX1A).
En determinadas realizaciones, las células se ponen en contacto con los activadores e inhibidores descritos en el presente documento con una concentración y durante un tiempo que son eficaces para aumentar un nivel detectable de expresión de uno o varios entre beta-tubulina de clase III específica de neuronas (Tuj 1), familia de factor de Trefoil 3 (TTF3), homeodominio de tipo emparejado 3 (PITX3), complejo achaete-scute (ASCL), factor 1 de linfocito B temprano (EBF-1), factor 3 de linfocito B temprano (EBF-3), transtirretina (TTR), sinapsina, transportador de dopamina (DAT) y canal de potasio rectificador interno acoplado a proteína G (Kir3.2/GIRK2), CD142, DCSM1, CD63 y/o CD99.
En determinadas realizaciones, las células se ponen en contacto con los activadores e inhibidores descritos en el presente documento con una concentración y durante un tiempo que son eficaces para aumentar un nivel detectable de expresión de uno o varios marcadores de una neurona DA, por ejemplo, CD142, o en donde las células son células neuronales de tipo A9.
En ciertas realizaciones, las células se ponen en contacto con los activadores e inhibidores descritos en el presente documento con una concentración y tiempo que son eficaces para disminuir la expresión de la proteína de caja emparejada (PAX6) y Ki67.
En ciertas realizaciones, las células se ponen en contacto adicionalmente con activadores e inhibidores específicos del linaje de neuronas DA, por ejemplo, L-glutamina, factor neurotrófico obtenido a partir del cerebro (BDNF), factor neurotrófico obtenido a partir de células gliales (GDNF), monofosfato de adenosina cíclico (AMPc), factor de crecimiento transformante beta (TGFp, por ejemplo, TGFp3), ácido ascórbico (AA) y DAPT (que también se conoce como 1, 1 -dimetiletil éster de N-[(3,5-difluorofenil)acetil]-L-alanil-2-fenil]glicina, LY-374973, t-butil éster de N-[N-(3,5-difluorofenacetil)-L-alanil]-S-fenilglicina o t-butil éster de N-[N-(3,5-difluorofenacetil)-L-alanil]-S-fenilglicina). En ciertas realizaciones, las células se ponen en contacto con los activadores e inhibidores específicos del linaje de neuronas DA anteriores durante al menos aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más días, por ejemplo, entre aproximadamente 2 y 20 días, entre aproximadamente 3 y 19 días, entre aproximadamente 4 y 18 días, entre aproximadamente 5 y 17 días, entre aproximadamente 6 y 16 días, entre aproximadamente 7 y 15 días, entre aproximadamente 8 y 15 días, entre aproximadamente 9 y 14 días, o entre aproximadamente 10 y 13 días. En ciertas realizaciones, las células se ponen en contacto con los activadores e inhibidores específicos del linaje de neuronas DA anteriores hasta durante aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más días. En ciertas realizaciones, las células se ponen en contacto con los activadores e inhibidores específicos del linaje de neuronas DA anteriores durante aproximadamente 4, 5, 6, 7 u 8 días.
En determinadas realizaciones, las células se ponen en contacto con L-glutamina con una concentración de entre aproximadamente 0,5 y 5 mM, o entre aproximadamente 1 y 4 mM, o entre aproximadamente 1,5 y 3 mM. En determinadas realizaciones, las células se ponen en contacto con L-glutamina con una concentración de aproximadamente 2 mM.
En determinadas realizaciones, las células se ponen en contacto con BDNF con una concentración de entre aproximadamente 5 y 50 ng/mL, o entre aproximadamente 10 y 40 ng/mL, o entre aproximadamente 15 y 30 ng/mL, o entre aproximadamente 18 y 25 ng /mL. En determinadas realizaciones, las células se ponen en contacto con BDNF con una concentración de aproximadamente 20 ng/mL.
En ciertas realizaciones, las células se ponen en contacto con AA con una concentración de entre aproximadamente 50 y 500 nM, o entre aproximadamente 100 y 400 nM, o entre aproximadamente 150 y 300 nM, o entre aproximadamente 180 y 250 nM. En determinadas realizaciones, las células se ponen en contacto con AA con una concentración de aproximadamente 200 nM.
En determinadas realizaciones, las células se ponen en contacto con GDNF con una concentración de entre aproximadamente 5 y 50 ng/mL, o entre aproximadamente 10 y 40 ng/mL, o entre aproximadamente 15 y 30 ng/mL, o entre aproximadamente 18 y 25 ng/mL. En determinadas realizaciones, las células se ponen en contacto con GDNF con una concentración de aproximadamente 20 ng/mL.
En ciertas realizaciones, las células se ponen en contacto con AMPc con una concentración de entre aproximadamente 200 y 800 nM, o entre aproximadamente 250 y 750 nM, o entre aproximadamente 300 y 700 nM, o entre aproximadamente 350 y 650 nM, o entre aproximadamente 400 y 600 nM, o entre aproximadamente 450 y 550 nM. En determinadas realizaciones, las células se ponen en contacto con AMPc con una concentración de aproximadamente 500 nM.
En determinadas realizaciones, las células se ponen en contacto con TGFp3 con una concentración de entre aproximadamente 0,01 y 5 ng/mL, o entre aproximadamente 0,05 y 4 ng/mL, o entre aproximadamente 0,1 y 3 ng/mL, o entre aproximadamente 0,5 y 2 ng/mL. En determinadas realizaciones, las células se ponen en contacto con TGFp3 con una concentración de aproximadamente 1 ng/mL.
En ciertas realizaciones, los precursores de DA del mesencéfalo diferenciados se cultivan adicionalmente como se describe en el documento de publicación estadounidense n° 2015/0010514.
En determinadas realizaciones, las células preparadas según los métodos descritos en el presente documento se pueden clasificar, seleccionar y aislar en función de la expresión de CD142 o la expresión del receptor colinérgico (CHRNB3), por ejemplo, mediante citometría de flujo.
En ciertas realizaciones, las células preparadas de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento pueden ponerse en contacto adicionalmente con una polisialiltransferasa, por ejemplo, una polisialiltransferasa bacteriana, tal como polisialiltransferasa de Neisseria meningitidis (PSTNm). En ciertas realizaciones, las células son células recombinantes que expresan una polisialiltransferasa recombinante.
5.3 Método de tratamiento de trastornos neurodegenerativos
Las células diferenciadas in vitro que expresan uno o varios marcadores de una neurona DA del mesencéfalo, o un precursor de la misma (también denominados "precursores de DA del mesencéfalo obtenidos a partir de células madre" o precursores de "mDA") pueden usarse para tratar un trastorno neurodegenerativo. El objeto de la presente descripción proporciona métodos para tratar un trastorno neurodegenerativo que comprende administrar una cantidad eficaz de los precursores obtenidos a partir de células madre descritos actualmente a un sujeto que padece un trastorno neurodegenerativo.
Ejemplos no limitativos de trastornos neurodegenerativos incluyen la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Huntington, la enfermedad de Alzheimer y la esclerosis múltiple.
En ciertas realizaciones, la enfermedad neurodegenerativa es la enfermedad de Parkinson. Los signos motores primarios de la enfermedad de Parkinson incluyen, por ejemplo, pero no están limitados a, temblor de manos, brazos, piernas, mandíbula y cara, bradicinesia o lentitud de movimientos, rigidez o inflexibilidad de las extremidades y el tronco e inestabilidad postural o alteración del equilibrio y la coordinación.
En determinadas realizaciones, la enfermedad neurodegenerativa es una enfermedad de tipo Parkinson, que se refiere a enfermedades que están ligadas a una insuficiencia de dopamina en los ganglios basales, que es una parte del cerebro que controla el movimiento. Los síntomas incluyen temblor, bradicinesia (lentitud extrema de los movimientos), postura flexionada, inestabilidad postural y rigidez. Ejemplos no limitantes de enfermedades de tipo Parkinson incluyen degeneración corticobasal, demencia con cuerpos de Lewy, sistematrofia múltiple y parálisis supranuclear progresiva.
Los precursores obtenidos a partir de células madre descritos en la presente memoria pueden administrarse o proporcionarse sistémicamente o directamente a un sujeto, para tratar o prevenir un trastorno neurodegenerativo. En ciertas realizaciones, los precursores obtenidos a partir de células madre descritos actualmente se inyectan directamente en un órgano de interés (p. ej., el sistema nervioso central (SNC) o el sistema nervioso periférico (SNP)). En ciertas realizaciones, los precursores obtenidos a partir de células madre actualmente descritos se inyectan directamente en el cuerpo estriado.
Los precursores obtenidos a partir de células madre descritos en la presente memoria pueden administrarse en cualquier vehículo fisiológicamente aceptable. También se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden los precursores obtenidos a partir de células madre descritos en la presente memoria y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los precursores obtenidos a partir de células madre descritos actualmente y las composiciones farmacéuticas que comprenden dichas células, pueden administrarse mediante inyección localizada, inyección ortotópica (OT), inyección sistémica, inyección intravenosa o administración parenteral. En determinadas realizaciones, los precursores obtenidos a partir de células madre descritos en la presente memoria se administran a un sujeto que padece un trastorno neurodegenerativo mediante inyección ortotópica (OT).
Los precursores obtenidos a partir de células madre y las composiciones farmacéuticas que comprenden dichas células se pueden proporcionar convenientemente como preparaciones líquidas estériles, por ejemplo, soluciones acuosas isotónicas, suspensiones, emulsiones, dispersiones o composiciones viscosas, que se pueden tamponar a un pH seleccionado. Las preparaciones líquidas normalmente son más fáciles de preparar que los geles, otras composiciones viscosas y las composiciones sólidas. Además, las composiciones líquidas son algo más cómodas de administrar, especialmente mediante inyección. Las composiciones viscosas, por otro lado, se pueden formular dentro del intervalo de viscosidad apropiado para proporcionar períodos de contacto más prolongados con tejidos específicos. Las composiciones líquidas o viscosas pueden comprender vehículos, que pueden ser un disolvente o un medio dispersante que contenga, por ejemplo, agua, solución salina, solución salina tamponada con fosfato, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, polietilenglicol líquido y similares) y mezclas adecuadas de los mismos. Las soluciones inyectables estériles se pueden preparar incorporando las composiciones del objeto de la presente descripción, p. ej., una composición que comprende los precursores obtenidos a partir de células madre descritos actualmente, en la cantidad requerida de disolvente apropiado, con varias cantidades de los otros ingredientes, según se desee. Esas composiciones pueden mezclarse por adición con un vehículo, diluyente o excipiente adecuado, tal como agua estéril, solución salina fisiológica, glucosa, dextrosa o similares. Las composiciones también se pueden liofilizar. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes, dispersantes o emulsionantes (p. ej., metilcelulosa), agentes tamponadores del pH, gelificantes o aditivos que mejoran la viscosidad, conservantes, agentes aromatizantes, colorantes y similares, dependiendo de la vía de administración y de la preparación deseada. Textos convencionales, "REMlNGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCE", 17a edición, 1985, pueden ser consultados para preparar preparaciones adecuadas, sin una experimentación indebida.
Pueden añadirse diversos aditivos que mejoran la estabilidad y esterilidad de las composiciones, incluyendo conservantes antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes y tampones. Una prevención de la acción de los microorganismos puede garantizarse mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico y similares. Una absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable puede lograrse mediante el uso de agentes que retardan la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina. Sin embargo, de acuerdo con el objeto de la presente descripción, cualquier vehículo, diluyente o aditivo utilizado tendría que ser compatible con los precursores obtenidos a partir de células madre descritos actualmente.
La viscosidad de las composiciones, si se desea, se puede mantener en el nivel seleccionado utilizando un agente espesante farmacéuticamente aceptable. Se puede usar metilcelulosa porque está a disposición de forma fácil y económica y es fácil trabajar con ella. Otros agentes espesantes adecuados incluyen, por ejemplo, goma de xantano, carboximetilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, carbómero y similares. La concentración del espesante puede depender del agente seleccionado. La característica importante es usar una cantidad que logre la viscosidad seleccionada. La elección de vehículos adecuados y otros aditivos dependerá de la vía exacta de administración y la naturaleza de la forma de dosificación particular, p. ej., forma de dosificación líquida (p. ej., si la composición se va a formular como una solución, suspensión, gel u otra forma líquida, tal como una forma de liberación prolongada o una forma rellena de líquido).
Los expertos en la técnica reconocerán que los componentes de las composiciones deben seleccionarse para que sean químicamente inertes y no afecten a la viabilidad o eficacia de los precursores obtenidos a partir de células madre, descritos en la presente memoria. Esto no presentará ningún problema para los expertos en principios químicos y farmacéuticos, o los problemas pueden evitarse fácilmente haciendo referencia a textos convencionales o mediante experimentos simples (que no impliquen una experimentación indebida), a partir de esta descripción y los documentos citados en este documento.
En ciertas realizaciones no limitantes, las células y los precursores descritos en el presente documento están comprendidos en una composición que comprende además un armazón o matriz biocompatible, por ejemplo, un armazón tridimensional biocompatible que facilita la regeneración de tejido cuando las células se implantan o se injertan en un sujeto. En ciertas realizaciones no limitantes, el armazón biocompatible comprende material de una matriz extracelular, polímeros sintéticos, citocinas, colágeno, polipéptidos o proteínas, polisacáridos que incluyen fibronectina, laminina, queratina, fibrina, fibrinógeno, ácido hialurónico, sulfato de heparina, sulfato de condroitina, agarosa o gelatina y/o hidrogel. (Véanse, por ejemplo, los documentos de publicaciones de EE.UU. n° 2015/0159135, 2011/0296542, 2009/0123433 y 2008/0268019). En determinadas realizaciones, la composición comprende además factores de crecimiento para favorecer la maduración de las células implantadas/injertadas en células DA del mesencéfalo.
Una consideración relativa al uso terapéutico de los precursores obtenidos a partir de células madre descritos actualmente, es la cantidad de células necesarias para lograr un efecto óptimo. Un efecto óptimo incluye, pero no se limita a, la repoblación de las regiones del SNC y/o SNP de un sujeto que padece un trastorno neurodegenerativo y/o la función mejorada del SNC y/o SNP del sujeto.
Una "cantidad eficaz" (o "cantidad terapéuticamente eficaz") es una cantidad suficiente para producir un resultado clínico beneficioso o deseado tras el tratamiento. Se puede administrar una cantidad eficaz a un sujeto en una o varias dosis. En términos de tratamiento, una cantidad eficaz es una cantidad que es suficiente para paliar, mejorar, estabilizar, revertir o retardar la progresión del trastorno neurodegenerativo o trastorno pituitario, o reducir de otro modo las consecuencias patológicas del trastorno neurodegenerativo. La cantidad eficaz generalmente la determina el médico caso por caso y está dentro de la experiencia de un experto en la materia. Por lo general, se tienen en cuenta varios factores cuando se va a determinar una dosis adecuada para lograr una cantidad eficaz. Esos factores incluyen la edad, el sexo y el peso del sujeto, la afección que se está tratando, la gravedad de la afección y la forma y la concentración eficaz de las células administradas.
En determinadas realizaciones, una cantidad eficaz de los precursores obtenidos a partir de células madre descritos en la presente memoria, es una cantidad que es suficiente para repoblar las regiones del SNC y/o SNP de un sujeto que padece un trastorno neurodegenerativo. En determinadas realizaciones, una cantidad eficaz de los precursores obtenidos a partir de células madre descritos en la presente memoria, es una cantidad que es suficiente para mejorar la función del SNC y/o SNP de un sujeto que padece un trastorno neurodegenerativo, por ejemplo, la función mejorada puede ser aproximadamente 1%, aproximadamente un 5%, aproximadamente un 10%, aproximadamente 20%, aproximadamente 30%, aproximadamente 40%, aproximadamente 50%, aproximadamente 60%, aproximadamente 70%, aproximadamente 80%, aproximadamente 90%, aproximadamente 95%, aproximadamente 98%, aproximadamente 99% o aproximadamente 100% de la función del SNC y/o SNP de una persona normal.
La cantidad de células que se va a administrar variará según el sujeto que se esté tratando. En ciertas realizaciones, desde aproximadamente 1 x 104 a aproximadamente 1 x 1010, desde aproximadamente 1 x 104 a aproximadamente 1 x 105, desde aproximadamente 1 x 105 a aproximadamente 1 x 109, desde aproximadamente 1 x 105 a aproximadamente 1 x 106, desde aproximadamente 1 x 105 a aproximadamente 1 x 107, desde aproximadamente 1 x 106 a aproximadamente 1 x 107, desde aproximadamente 1 x 106 a aproximadamente 1 x 108, desde aproximadamente 1 x 107 a aproximadamente 1 x 108, desde aproximadamente 1 x 108 a aproximadamente 1 x 109, desde aproximadamente 1 x 108 a aproximadamente 1 x 1010, o desde aproximadamente 1 x 109 a aproximadamente 1 x 1010 de los precursores obtenidos a partir de células madre actualmente descritos se administran a un sujeto. En ciertas realizaciones, desde aproximadamente 1 x 105 a aproximadamente 1 x 107 de los precursores obtenidos a partir de células madre actualmente descritos se administran a un sujeto que padece un trastorno neurodegenerativo. En ciertas realizaciones, desde aproximadamente 1 x 106 a aproximadamente 1 x 107 de los precursores obtenidos a partir de células madre actualmente descritos se administran a un sujeto que padece un trastorno neurodegenerativo. En ciertas realizaciones, desde aproximadamente 1 x 106 a aproximadamente 4 x 106 de los precursores obtenidos a partir de células madre actualmente descritos se administran a un sujeto que padece un trastorno neurodegenerativo. La determinación precisa de lo que se consideraría una dosis eficaz puede basarse en factores individuales de cada sujeto, incluyendo su tamaño, edad, sexo, peso y afección del sujeto en particular. Los expertos en la técnica pueden determinar fácilmente las dosis a partir de esta descripción y el conocimiento de la técnica.
En determinadas realizaciones, las células que se administran a un sujeto que padece un trastorno neurodegenerativo para tratar un trastorno neurodegenerativo son una población de neuronas que se diferencian/maduran a partir de los precursores de DA del mesencéfalo obtenidos a partir de células madre actualmente descritos.
5.4 Kits
El objeto de la presente descripción proporciona kits para inducir una diferenciación de las células madre. En determinadas realizaciones, el kit comprende (a) uno o varios inhibidores de la señalización del factor de crecimiento transformante beta (TGFp)/Activina-Nodal, (b) uno o varios inhibidores de la señalización de BMP/SMAD, (c) uno o varios activadores de la señalización de Wnt, (d) uno o varios activadores de la señalización de SHH y (e) instrucciones para inducir la diferenciación de las células madre en una población de células diferenciadas que expresan uno o varios marcadores de una neurona DA del mesencéfalo, o su precursor.
En determinadas realizaciones, el kit no comprende uno o varios inhibidores de la señalización de BMP/SMAD.
En determinadas realizaciones, el kit comprende además uno o varios activadores de la señalización de BMP.
En ciertas realizaciones, las instrucciones comprenden poner en contacto las células madre con el o los inhibidores, activadores y moléculas en una secuencia específica. La secuencia de contacto del (de los) inhibidor(es), activador(es) y molécula(s) puede determinarse mediante el medio de cultivo celular usado para cultivar las células madre.
En ciertas realizaciones, las instrucciones comprenden poner en contacto las células madre con el (los) inhibidor(es), activador(es) y molécula(s) tal y como se describe mediante los métodos de la presente descripción (véase, más arriba, Sección 5.2).
En determinadas realizaciones, la presente descripción proporciona kits que comprenden una cantidad eficaz de una población de los precursores obtenidos a partir de células madre descritos actualmente o una composición que comprende dichos precursores en forma de dosificación unitaria. En ciertas realizaciones, las células obtenidas a partir de células madre son células diferenciadas maduras, por ejemplo, neuronas DA del mesencéfalo. En determinadas realizaciones, el kit comprende un recipiente estéril que contiene la composición terapéutica; esos recipientes pueden ser cajas, ampollas, botellas, viales, tubos, bolsas, saquitos, blísteres u otras formas de recipiente adecuadas conocidas en la técnica. Esos recipientes pueden estar fabricados a base de plástico, vidrio, papel laminado, hoja de metal u otros materiales adecuados para contener medicamentos.
En ciertas realizaciones, el kit comprende instrucciones para administrar una población de los precursores obtenidos a partir de células madre actualmente descritos o una composición que los comprende, a un sujeto que padece un trastorno neurodegenerativo. Las instrucciones pueden comprender información sobre el uso de las células o la composición para tratar o prevenir un trastorno neurodegenerativo. En ciertas realizaciones, las instrucciones comprenden al menos uno de los siguientes: descripción del agente terapéutico; pauta de dosificación y administración para tratar o prevenir un trastorno neurodegenerativo o síntomas del mismo; precauciones; advertencias; indicaciones; contraindicaciones; información sobre la dosificación; reacciones adversas; farmacología animal; estudios clínicos; y/o referencias. Las instrucciones pueden estar imprimidas directamente sobre el envase (cuando está presente), o estar en forma de una etiqueta sujeta al envase, o como una hoja separada, folleto, tarjeta o prospecto suministrados en o con el envase.
6. Ejemplos
El objeto de la presente descripción se entenderá mejor haciendo referencia a los siguientes Ejemplos, que se proporcionan como ejemplos del objeto de la presente descripción, y no a modo de limitación.
6.1 Ejemplo de referencia 1: Métodos para preparar células progenitoras dopaminérgicas (DA) del mesencéfalo obtenidas a partir de células madre.
Resumen
Las células madre embrionarias humanas (hESC) pueden dar lugar potencialmente a cualquier tipo de célula del organismo. Un objetivo a largo plazo es el desarrollo de estrategias para recrear el árbol del linaje humano completo in vitro. El presente ejemplo describe una estrategia para diferenciar hESC en células precursoras de neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo, en donde las células se diferenciaron en medio neurobasal (NB)/N2 (que opcionalmente puede incluir medio E6) complementado con SB431542 (inhibidor de la señalización de TGFp/Activinanodal), LDN193189 (inhibidor de la señalización de BMP/SMAD), Sonic Hedgehog (SHH) y CHIR99021 (inhibidor de GSK3p que aumenta la señalización de wingless (Wnt)), en donde se incrementaba la concentración de CHIR99021 ("aumento") después de que las células se habían cultivado inicialmente con los factores de crecimiento durante cuatro o cinco días. Las células se cultivaron con la concentración incrementada de CHIR99021 durante siete u ocho días. Luego, las células se cultivaron con factor neurotrófico obtenido a partir del cerebro (BDNF), factor neurotrófico obtenido a partir de células gliales (GDNF), monofosfato de adenosina cíclico (AMPc), factor de crecimiento transformante beta 3 (TGFp, por ejemplo, TGFp3), ácido ascórbico (AA) y DAPT para producir los precursores DA del mesencéfalo.
Métodos
Las hESCs se mantuvieron en medio E8/matrigel antes de la diferenciación. Las células se diferenciaron en medio NB/N2 complementado con factores de crecimiento de acuerdo con la siguiente estrategia de cultivo, en donde las células se cultivaron con un aumento a 3 pM el día cuatro o un aumento a 7,5 pM el día cinco.
Protocolo de aumento a 3 pM (GMP V2A)
• Día 0 (D0): Las hESCs se transfirieron de un medio E8/matrigel a medio de diferenciación que comprendía medio neurobasal (NB)/N2 complementado con factores de diferenciación de la siguiente manera (el medio D0 también incluía inhibidor de Y-27632 ROCK 10 pM (bobina enrollada que contiene proteína cinasa asociada a Rho) para mejorar la supervivencia de las células. Las células tenían una concentración de aproximadamente 2 millones de células/mL:
o LDN193189250 nM
o SB431542 10 pM
o 500 ng/ml de SHH
o CHIR99021 0,7 pM
• D1: El medio de diferenciación se cambió por un medio de diferenciación de nuevo aporte que no contenía Y-27632.
• D2: Sin cambio de medio.
• D3: Medio cambiado como se describe para D1.
• D4: El medio de diferenciación se cambió por medio de diferenciación de nuevo aporte que comprendía CHIR99021 3 pM (y no comprendía Y-27632).
• D5: Sin cambio de medio.
• D6: Medio cambiado como se describe para D4.
• D7: El medio de diferenciación se cambió por medio de nuevo aporte que comprendía NB/N2 complementado con CHIR99021 3 pM (y sin LDN193189, SB431542, SHH o Y-27632).
• D8: Sin cambio de medio.
• D9: Medio cambiados como se describe para D7.
• D10: El medio se cambió con medio NB/B27 de nuevo aporte que comprendía CHIR99021 3 pM, BDNF, GDNF, AMPc, TGFp3 y AA.
• D11: Medio cambiado como se describe para D10.
• D12: Medio cambiado como se describe para D10, excepto que el medio comprendía además DAPT y no incluía CHIR99021.
• D13-D19: Medio cambiado como se describe para D12. (El período de cultivo puede ser hasta D27 o más, e incluir al menos un pase en D17 o D18).
• D20: Medio aspirado de las células y células lavadas y suspendidas en medio NB y luego sembradas en placa.
• A continuación, las células se analizaron para determinar la expresión de las combinaciones tempranas de marcadores DA del mesencéfalo: 1) OTX2/EN/LMX1A y 2) PAX6/FOXA2/EN/ y NKX2.2 o NKX6.1; o combinaciones tardías del marcador DA del mesencéfalo: 1) TH/EN/FOXA2 y 2) LMX1A/OTX2/NURR1. • Las células se sometieron a crioconservación o a trasplante en ratones.
• Para el trasplante en ratones, las células se suspendieron en HBSS HEPPES con una concentración de 150.000/microlitro, en donde se injertaron 5-6 millones de células en ratones inmunodeficientes.
Protocolo de aumento a 7,5 gM (GMP V2B)
• Día 0 (D0): Las hESCs se transfirieron de medio E8/matrigel a medio de diferenciación que comprendía medio neurobasal (NB)/N2 complementado con factores de diferenciación de la siguiente manera (el medio D0 también incluía inhibidor de Y-27632 ROCK 10 gM (bobina enrollada que contiene proteína cinasa asociada a Rho) para mejorar la supervivencia de las células). Las células tenían una concentración de aproximadamente 2 millones de células/mL:
o LDN193189250 nM
o SB431542 10 gM
o 500 ng/ml de SHH
o CHIR99021 0,7 gM
• D1: El medio de diferenciación se cambió por medio de diferenciación de nuevo aporte que no contenía Y-27632.
• D2: Sin cambio de medio.
• D3: Medio cambiado como se describe para D1.
• D4: Sin cambio de medio.
• D5: El medio de diferenciación se cambió por medio de diferenciación de nuevo aporte que comprendía CHIR99021 7,5 gM (y no comprendía Y-27632).
• D6: Sin cambio de medio.
• D7: El medio de diferenciación se cambió por medio de nuevo aporte que comprendía NB/N2 complementado con CHIR99021 7,5 gM (y sin LDN193189, SB431542, SHH o Y-27632).
• D8: Sin cambio de medio.
• D9: Medio cambiado como se describe para D7.
• D10: Medio cambiado con medio NB/B27 de nuevo aporte que comprendía CHIR99021 3 gM, BDNF, GDNF, AMPc, TGFp3 y AA.
• D11: Medio cambiado como se describe para D10.
• D12: Medio cambiado como se describe para D10, excepto que el medio comprendía además DAPT y no comprendía CHIR99021,
• D13-D19: Medio cambiado como se describe para D12. (El período de cultivo puede ser de hasta D27 o más, e incluir al menos un pase en D17 o D18).
• D20: Medio aspirado de las células y células lavadas y suspendidas en medio NB y luego sembradas en placa.
• Las células se analizaron para determinar la expresión de las combinaciones tempranas de marcadores DA del mesencéfalo: 1) OTX2/EN/LMX1A y 2) PAX6/FOXA2/EN/ y NKX2.2 o NKX6.1; o las combinaciones tardías de marcadores DA del mesencéfalo: 1) TH/EN/FOXA2 y 2) LMX1A/OTX2/NURR1.
• Las células se sometieron a crioconservación o a trasplante en ratones.
• Para el trasplante en ratones, las células se suspendieron en HBSS HEPPES con una concentración de 150.000/microlitro, en donde se injertaron 5-6 millones de células en ratones inmunodeficientes.
Resultados
Kriks et al., Nature. 6 de noviembre de 2011; 480 (7378): 547-51, describen un protocolo para la diferenciación de hESCs en células DA del mesencéfalo, cultivando las células en medio KSR que comprendía una inhibición doble de SMAD, activación de SHH y activación de Wnt (sin un "aumento" como se describe a continuación). Sin embargo, el medio KSR no está definido y las células producidas con el protocolo de diferenciación funcionan mal in vivo después del trasplante. Las células diferenciadas según el presente ejemplo utilizan un protocolo de cultivo que incluye una inhibición doble de SMAD (a través de SB431542 y LDN193189), activación de SHH y activación de Wnt en medio NB/N2, en donde la concentración de Wnt aumenta entre 5 y 10 pM a partir de una concentración de referencia de 0,7 pM en D4 o D5 de cultivo (es decir, un "aumento" de Wnt).
Como se muestra en la Figura 1, la diferenciación de hESCs según el método descrito por Kriks et al. en medio KSR (sin GMP) o en medio E8/NB/N2 (GMP VI), producía neuronas DA del mesencéfalo; sin embargo, también se producían neuronas de otras regiones del cerebro. Cuando las células se cultivaron en medio E8/NB/N2/E6 de acuerdo con los métodos del presente ejemplo, utilizando un aumento a 7,5 pM (o 5-10 pM) de Wnt el D4-D10, se producían específicamente células DA del mesencéfalo.
Como se muestra en la Figura 2, la diferenciación de hESCs según el método descrito por Kriks et al. en medio KSR (sin GMP) o en medio E8/NB/N2 (GMP VI), ambos producían células que expresaban niveles similares de PAX6, TH, NURR1, FOXA2 y LMX1A. Sin embargo, las células producidas con cualquiera de los dos medios mostraban una escasa supervivencia cuando se trasplantaban a roedores.
Cuando las hESCs se diferenciaban usando medio E8/NB/N2 y un aumento de Wnt a 3 pM (GMP V2A) o a 7,5 pM (GMP V2B), las células también expresaban niveles similares de PAX6, TH, NURR1, FOXA2 y LMX1A como los del protocolo de Kriks. et al. usando KSR (sin GMP) o E8/NB/N2 (GMP VI). Sin embargo, las células diferenciadas según los protocolos GMP V2A o GMP V2B expresaban niveles más altos del marcador DA del mesencéfalo, EN-1 (Figura 3). La Figura 4 describe otros marcadores DA del mesencéfalo que pueden usarse para identificar células diferenciadas.
Las hESCs diferenciadas usando el protocolo de Kriks et al. en medio E8/NB/N2, a veces daban como resultado una buena supervivencia de las células DA que expresaban Hncam, FOXA2 y TH in vivo después de la diferenciación durante 25 días y el trasplante a ratones inmunocomprometidos sin lesiones. Los injertos se examinaron 4 semanas después del trasplante. Sin embargo, las células mostraban parches densos de expresión de Hncam, que también eran positivos para PAX6, lo que indicaba un estado de progenitor neuronal (Figura 5). Las hESCs cultivadas de acuerdo con GMP V2A (aumento a 3 pM ) o GMP V2B (aumento a 7,5 pM) producían células DA que expresaban niveles aumentados de NURR1, LMX1A, EN-1 y TH in vitro (Figura 6A), y no expresaban PAX6 (Figura 7). Además, las células DA del mesencéfalo diferenciadas mediante el protocolo GMP V2B (aumento s 7,5 pM) que se trasplantaron al cuerpo estriado de ratones inmunocomprometidos no lesionados, mostraban un mayor crecimiento de fibra y expresión de hNCAM y TH, 3 semanas después del injerto, sin parches de Hncam (Figura 6B). Además, cuando las células se crioconservaban antes del trasplante, las células mostraban un crecimiento de fibra similar al crecimiento de fibra de las células injertadas en ratones que no se habían crioconservado previamente (Figura 8).
Como se muestra en la Figura 9A-B, las células preparadas de acuerdo con los protocolos GMP V2A o GMP V2B se pueden clasificar con éxito en función de la expresión de CD142. Además, las células DA del mesencéfalo cultivadas según los métodos descritos por Kriks et al. en medio KSR, y clasificadas según la expresión de CD142, se injertaron en ratones y primates no humanos. Como se muestra en la Figura 10A-B, esas células sobreviven a corto plazo cuando se trasplantan a ratones (30 días después del trasplante) y primates no humanos (1 año después del trasplante) y contienen muchas neuronas que expresan TH.
Además, el aumento de los niveles de polisialilación debido a un tratamiento con polisialiltransferasa (polisialiltransferasa de Neisseria meningitidis (PSTNm)) de las células DA diferenciadas del mesencéfalo se mantenía estable después de un ciclo de congelación y descongelación y después del trasplante en ratones in vivo. Además, la clasificación de las células con CD142 no se vio afectada por el tratamiento con polisialiltransferasa (Figura 11A, B y D). Además, mientras que las células no tratadas tienen aproximadamente un 10% de las neuronas sin crecimiento notable in vivo después del trasplante a ratones, ninguna de las células tratadas con polisialiltransferasa tenía axones con una longitud inferior a 100 pm, 2 semanas después del injerto de las células mDA en el cuerpo estriado de los ratones (Figura 11C).
6.2 Ejemplo 2: Métodos para preparar células progenitoras dopaminérgicas (DA) del mesencéfalo obtenidas a partir de células madre.
Resumen
El presente ejemplo proporciona una versión modificada del protocolo de diferenciación GMP V2A descrito en el Ejemplo 1.
Las hESCs se mantuvieron en medio E8/matrigel antes de la diferenciación. Las células se diferenciaron en medio NB/N2/B27 complementado con factores de crecimiento de acuerdo con la siguiente estrategia de cultivo, en donde las células se cultivaron con un aumento a 7,5 pM el día cuatro.
Protocolo de aumento a 7,5 |uM (Modificación de GMP V2B)
• Día 0 (D0): Las hESCs se transfirieron de medio E8/matrigel a medio de diferenciación que comprendía medio neurobasal (NB)/N2/B27 complementado con factores de diferenciación de la siguiente manera (el medio D0 también incluía inhibidor Y-27632 ROCK 10 |uM (bobina enrollada que contiene proteína cinasa asociada a Rho) para mejorar la supervivencia de las células). Las células tenían una concentración de aproximadamente 750 millones de células/L:
° L-glutamina 2 mM
o LDN193189250 nM
o SB431542 10,8 |uM
o 500 ng/ml de SHH
o CHIR99021 0,7 |uM
• D1: El medio de diferenciación se cambió por medio de diferenciación de nuevo aporte que no contenía Y-27632.
• D2: Sin cambio de medio.
• D3: Medio cambiado como se describe para D1.
• D4: El medio de diferenciación se cambió por medio de diferenciación de nuevo aporte que comprendía CHIR99021 7,5 |uM (y no comprendía Y-27632).
• D5: Sin cambio de medio.
• D6: Medio cambiado como se describe para D4.
• D7: El medio de diferenciación se cambió por medio de nuevo aporte que comprendía NB/N2/B27 complementado con L-glutamina 2 mM y CHIR99021 7,5 |uM (y sin LDN193189, SB431542, SHH o Y-27632).
• D8: Sin cambio de medio.
• D9: Medio cambiado como se describe para D7.
• D10: El medio se cambió por medio NB/B27 de nuevo aporte que comprendía L-glutamina 2 mM, CHIR99021 3 mM, 20 ng/mL de BDNF, 20 ng/mL de GDNF, AMPc 500 nM, 1 ng/ml de TGFp3 y AA 200 nM.
• D11: El pase de células y el medio cambiaron como se describe para D10 para lograr una concentración de 1500 millones de células/L.
• D12: El medio se cambió como se describe para D10, excepto que el medio comprendía además DAPT 10 mM y no incluía CHIR99021.
• D13-D15: Medio de maduración. El medio cambió como se describe para D12.
• D16: Células recogidas y crioconservadas en NB.
Métodos
5.0 Reactivos y materiales
5.1 Toallitas presaturadas estériles TechniSat Texwipe (Fisher, n° de catálogo 19-003-239) o equivalentes 5.2 Tubos para centrífuga (Fisher, n° de catálogo 05-538-51 para 15 mL; Fisher, n° de catálogo 05-538-49 para 50 mL) o equivalentes
5.3 Placas de cultivo de tejidos (Fisher, n° de catálogo 08-772-24 para 15 cm) o equivalentes
5.4 Matraces de cultivo de tejidos (Fisher, n° de catálogo 13-680-65 para 75 cm2; Fisher, n° de catálogo 12­ 565-221 para 225 cm2) o equivalentes
5.5 Pipetas serológicas de poliestireno estériles (Fisher, n° de catálogo 13-675-47 para 2 mL; Fisher, n° de catálogo 13-678-1ID para 5 mL; Fisher, n° de catálogo 13-678-1IE para 10 mL; Fisher, n° de catálogo 13­ 678-11 para 25 mL; Fisher, n° de catálogo 13-678-1IF; Fisher, n° de catálogo 13-675-73 para 100 mL) o equivalentes
5.6 Pipetas de aspiración estériles (Fisher, n° de catálogo 13-678-20D) o equivalentes
5.7 Portaobjetos de recuento Cellometer (Nexcelom, n° de catálogo CHT4-PD-100-003) o equivalentes 5.8 Puntas de pipeta estériles (Fisher, n° de catálogo 21-403-00 para 20 pL; Fisher, n° de catálogo 21-403­ 01 para 200 pL; Fisher, n° de catálogo 21-403-02 para 1000 pL) o equivalentes
5.9 Crioviales (Fisher, n° de catálogo 12-565-164N) o equivalentes
5.10 Insertos de tapa con código CryoColor (Fisher, n° de catálogo 12-565-242 para blanco; Fisher, n° de catálogo 12-565-180 para surtido de colores) o equivalentes
5.11 Colador de células (Fisher, n° de catálogo 08-771-1 para 40 pM) o equivalente
5.12 AOPI (Nexcelom, n° de catálogo CS2-0106-5 ml)
5.13 DMEM/F-12 (Life Technologies, n° de catálogo 11320)
5.14 Solución de desprendimiento de células Accutase® (Innovative Cell Technology, n° de catálogo AT104) 5.15 Factor de crecimiento reducido sin LDEV Geltrex™ (Life Technologies, n° de catálogo A14132-01) 5.16 DPBS CTS™ (Cell Therapy Systems) sin cloruro de calcio sin cloruro de magnesio (Life Technologies, n° de catálogo A1285601)
5.17 B27 (con/sin vitamina A) (Life Technologies, n° de catálogo 12587-010)
5.18 Suplemento B N2 (Stem Cell Technologies, n° de catálogo 07156)
5.19 Medio neurobasal (Life Technologies, n° de catálogo 21103049)
5.20 50 mg/ml de gentamicina [opcional] (Life Technologies, n° de catálogo 15750078)
5.21 LDN 500 pM 193189 (SSCRF-RP-011)
5.22 SB431542 10,8 mM (SSCRF-RP-013)
5.23 100 pg/mL de Shh (SSCRF-RP-014)
5.24 CHIR99021 15 mM (SSCRF-RP-004)
5.25 10 pg/mL de BDNF (SSCRF-RP-003)
5.26 Y-27632 10 mM (SSCRF-RP-016)
5.27 Ácido ascórbico 100 mM (SSCRF-RP-002)
5.28 10 pg/mL de GDNF (SSCRF-RP-007)
5.29 dbAMPc 100 mM (SSCRF-RP-006)
5.30 2 pg/mL de TGF-beta 3 (SSCRF-RP-015)
5.31 DAPT 10 mM (SSCRF-RP-005)
5.32 HCl 4 mM (SSCRF-RP-008)
5.33 15 mg/mL de poli-L-ornitina (SSCRF-RP-012)
5.34 1 mg/mL de fibronectina humana (SSCRF-RP-001)
5.35 1 mg/mL de Laminina I de ratón Cultrex (SSCRF-RP-010)
5.36 Medio Essential 8™ (SSCRF-FR-002)
5.37 L-Glutamina 200 mM (SSCRF-RP-009)
ipamiento
6.1 Pipetas ajustables Gilson (Pipetman-p1000, p200, p20, p10, p2) o equivalentes
6.2 Dispositivo Integra Pipetteboy Pro Pipetaid o equivalente
6.3 Sistema de visión Cellometer®
6.4 Incubadora de CO2 (incubadora Nuaire IR Autoflow CO2 water-jacked) o equivalente
6.5 Centrífuga Sorvall Legend XTR (Thermo Scientific, n° de catálogo 75004520) o equivalente
6.6 Congelador de velocidad controlada CryoMed (Thermo Scientific, n° de catálogo 7450) o equivalente 6.7 Microscopio invertido (Olympus CK2) o equivalente
6.8 Cabina de seguridad biológica (Baker SterileGARD Clase II) o equivalente
7.0 Procedimiento
7.1 Día antes del inicio de la diferenciación: descongelación de Geltrex
7.1.1 Descongelación de viales de 6 x 5 mL de Geltrex™ congelados a 4°C durante la noche o hasta que no queden cristales de hielo.
7.2 Día 0: Alimentación de hESCs y recubrimiento con Geltrex
7.2.1 Reponer todos los cultivos WA09 de hESCs con medio E8 de nuevo aporte.
7.2.2 Marcar matraces 48 x T75 con el número de registro de lote y un número ascendente. Realizar cada tarea de aquí en adelante secuencialmente.
7.2.3 Preparar una mezcla 1:30 de Geltrex™: DMEM/F12.
7.2.3.1 Añadir 870 mL de DMEM/F 12 frío a una botella de 1 L.
7.2.3.2 Añadir con cuidado 30 mL de Geltrex™. Lavar cada vial de Geltrex™ una vez con DMEM/F 12 desde la botella para recuperar la mayor parte del producto.
7.2.3.3 Una vez hecho esto, tapar bien e invertir para mezclar Geltrex con el medio. Agitar con cuidado de vez en cuando entre los usos para evitar que se deposite.
7.2.4 Registrar el tiempo desde que comenzó el recubrimiento con Geltrex™.
7.2.5 Recubrir secuencialmente cada recipiente T75 con 15 mL de Geltrex™.
7.2.6 Registrar el tiempo desde que comenzó la incubación con Geltrex™.
7.2.7 Incubar bajo una campana a temperatura ambiente durante 2-3 horas.
7.2.8 Registrar la hora en la que comienza la aspiración.
7.2.9 Después de la incubación, aspirar el Geltrex™ y añadir 15 mL de Neurobasal simple. Dejar los recipientes a temperatura ambiente hasta que las células estén listas para la placa.
7.2.10 Registrar el tiempo desde que Geltrex™ fue retirado de los recipientes.
7.3 Día 0: Configuración de las células e inducción
NOTA: 7.3 puede ser realizado simultáneamente por 2 operadores independientes en cada combinación de producción. Dos combinaciones se pueden procesar simultáneamente para reducir el tiempo de procesamiento. El producto debe combinarse antes de la siembra para garantizar la homogeneidad.
NOTA: Si el rendimiento es superior al requerido, solo se pueden sembrar 48 matraces. Si el rendimiento es inferior a 48 matraces, se cancela la ejecución.
7.3.1 Antes de comenzar, Accutase® un solo recipiente para usar para OCT4+ QC (SSCRF-SOP-107) y producción de ADNc (SSCRF-SOP-109) y evaluar el rendimiento.
7.3.1.1 Encontrar una placa representativa basándose en la densidad, el tamaño de la colonia y la distribución de las colonias en la superficie.
7.3.1.2 Aspirar el medio de las células y añadir Accutase®.
7.3.1.2.1 15 mL por cada matraz T225
7.3.1.2.2 10 mL por cada placa de 15 cm
7.3.1.3 Incubar las células a 37°C durante 20-30 minutos.
7.3.1.4 Usar una pipeta de 10 mL, retirar y triturar las células en una suspensión homogénea.
7.3.1.5 Pipetear en un tubo cónico de 50 mL y añadir 10 mL de medio E8 (20 mL en total). 7.3.1.6 Centrifugar a 200 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente.
7.3.1.7 Aspirar el medio y añadir 5 mL de medio E8.
7.3.1.8 Realizar un recuento de células (véase 7.3.20)
7.3.1.9 Tomar una parte alícuota de 3 x106 células en un criotubo etiquetado como SSCRF-SOP-109 (producción de ADNc para control de calidad).
7.3.1.10 Tomar una parte alícuota de 3 x106 células en un criotubo etiquetado como SSCRF-SOP-107 (medición de OCT4).
7.3.1.11 Entregar los tubos de control de calidad a otro operador para que los lleve al laboratorio de control de calidad.
7.3.2 Preparar 2,5 L de NB/N2/B27 que contenga L-glut 2 mM, LDN193189250 nM, SB431542 10,8 pM, 500 ng/mL de Shh, CHIR 0,7 pM y Y-27632 10 pM.
7.3.3 Registrar la entrada WA09# (n° de lote) y los datos asociados en el registro del lote.
7.3.4 Operar secuencialmente y uno por uno en lotes de 12 recipientes.
NOTA: Esto es para cada operador.
7.3.5 Registrar la hora en que comenzó la aspiración.
7.3.6 Retirar 12 recipientes de WA09 hESCs de la incubadora, aspirar el medio de las células y añadir Accutase®:
7.3.6.1 15 mL por cada matraz T225
7.3.6.2 10 mL por cada placa de 15 cm
7.3.7 Incubar las células a 37°C durante 20-30 minutos.
7.3.8 Registrar la hora de inicio de la incubación con Accutase® en el registro del lote.
7.3.9 Comenzar a ensamblar 12 [T225] o 6 [15 cm] tubos cónicos de 50 mL.
7.3.10 Registrar la hora de finalización de la incubación con Accutase® en el registro del lote.
7.3.11 Usar una pipeta de 10 mL, lavar la Accutase® sobre la superficie de cada recipiente ~ 5-10 veces para desprender y triturar las células hasta que no se vean grumos.
7.3.12 Transferir las células disociadas en Accutase® a tubos cónicos de 50 mL.
7.3.13 Lavar la superficie de un recipiente seco con medio E8 de nuevo aporte (usando un volumen igual a Accutase®) para recuperar las células restantes y añadir a tubos cónicos con células-Accutase®.
NOTA: Por ejemplo, un matraz T225 que tenía 15 mL de Accutase® se transfiere a un tubo cónico. Luego, el matraz seco se lava con 15 mL de medio E8 y las células E8 recuperadas se añaden al tubo cónico que contiene 15 mL de Accutase®-células (total 30 mL). Una placa de 15 cm que contiene 10 mL de Accutase® se transfiere a un matraz cónico, luego se lava con 10 mL de E8 de nuevo aporte (20 mL en total). Se pueden combinar dos placas de 15 cm en un solo tubo cónico (40 mL en total).
NOTA: Si es posible, también se debe crioconservar una muestra viva para fines de archivo. Las muestras vivas se pueden congelar como células individuales utilizando FreSR-S y el protocolo de crioconservación en un laboratorio de control de calidad "USER1".
7.3.14 Centrifugar las células durante 5 minutos a 200 x g a temperatura ambiente.
7.3.15 Aspirar el medio y resuspender suavemente cada sedimento en 10 mL con Neurobasal simple de nuevo aporte.
7.3.16 Combinar 3 tubos en un tubo cónico nuevo de 50 mL (proporcionando un total de 2 tubos cónicos de 50 mL por lote).
7.3.17 Centrifugar las células durante 5 minutos a 200 x g a temperatura ambiente.
7.3.18 Aspirar el medio y resuspender suavemente usando un total de 5 mL de NB/N2/B27 que contiene L-glut 2 mM, LDN193189 250 nM, SB431542 10,8 pM, 500 ng/mL de Shh, CHIR 0,7 pM y Y-27632 10 pM. Colocar a 4°C hasta que se hayan procesado todos los recipientes.
7.3.19 Una vez que se hayan procesado todos los recipientes, combinar todas las células y llevar hasta 200 mL.
7.3.20 Contar las células agrupadas:
7.3.20.1 Preparar una dilución conocida de células en Neurobasal simple (sin factores de crecimiento).
7.3.20.2 Mezclar 20 pL de células diluidas con 20 pL de AOPI.
7.3.20.3 Cargar 20 pL de mezcla de células/AOPI en un portaobjetos de Cellometer®.
7.3.20.4 Introducir el portaobjetos en la ranura.
7.3.20.5 Elegir el archivo de programa 'hES Cells AOPI'
7.3.20.6 Proporcionar un nombre de archivo con el siguiente formato "DA01 Lot#MMDDYY d0" 7.3.20.7 Introducir el valor de dilución.
7.3.20.8 Usar el canal F1, enfocar las células usando la perilla en el lado derecho del aparato. 7.3.20.9 Una vez enfocadas, presionar 'Contar'
7.3.21 Registrar el número total de células viables y no viables/mL, el número total de células y el % de viabilidad.
7.3.22 Tomar una parte alícuota de 3 x 106 células en un criotubo etiquetado como MICR-CULT-SOP-1634 (esterilidad). Tomar una parte alícuota de 3 x 106 células en un criotubo etiquetado como PT-OP-7020 (micoplasma). Rellenar cada uno hasta 1 mL antes de entregarlos y enviarlos con un operador distinto para el procesamiento.
7.3.23 Ajustar la concentración de las células a 750 millones de células por 1 L (se necesitan 2 L en total).
7.3.23.1 Calcular el volumen necesario para conseguir 750 millones de células.
7.3.23.2 Retirar el volumen calculado de cada botella de 1 L de NB/N2/B27 que contiene L-glut 2 mM, LDN193189250 nM, SB431542 10,8 pM, 500 ng/mL de Shh, CHIR 0,7 pM e Y-27632 10 pM.
7.3.23.3 Añadir el volumen calculado que contiene 750 millones de células a cada botella de 1 L.
7.3.24 Manipular secuencialmente cada matraz T75, uno cada vez.
7.3.25 Aspirar el medio Neurobasal simple desde el matraz recubierto con Geltrex™.
7.3.26 Añadir con cuidado 40 mL de suspensión celular a cada T75.
NOTA: Asegurarse de suspender cuidadosamente las células antes de pipetear.
7.3.27 Mover suavemente el matraz para cubrir uniformemente la superficie con células.
NOTA: La distribución de las células se puede verificar en un microscopio.
7.3.28 Dejar reposar durante 10-15 minutos bajo la campana sin interferencias.
7.3.29 Trasladar cuidadosamente los matraces a la incubadora.
7.3.30 Incubar durante la noche a 37°C con 5% de CO2.
7.4 Día 1: Alimentación (CHIR 0,7 pM)
7.4.1 Punto de control: Comprobar la confluencia de los matraces indicados en BR. Los cultivos deben ser 100% confluentes. Anotar la confluencia de los matraces indicados.
7.4.2 Manipular secuencialmente cada matraz T75, uno cada la vez.
7.4.3 Aspirar el medio existente y añadir suavemente 40 mL por medio T75 NB/N2/B27 que contiene L-glut 2 mM, LDN193189250 nM y SB431542 10,8 pM, 500 ng/mL de SHH y CHIR99021 0,7 pM.
7.5 Día 2: Sin cambio de medio
7.6 Día 3: Alimentación (CHIR 0,7 pM)
7.6.1 Manipular secuencialmente cada matraz T75, uno cada vez.
7.6.2 Aspirar el medio existente y añadir suavemente 40 mL de medio NB/N2/B27 que contiene L-glut 2 mM, LDN193189250 nM y SB431542 10,8 pM, 500 ng/mL de SHH y CHIR99021 0,7 pM.
7.7 Día 4: Alimentación (aumento a CHIR 7,5 pM)
7.7.1 Manipular secuencialmente cada matraz T75, uno cada vez.
7.7.2 Aspirar el medio existente y añadir suavemente 40 mL de medio NB/N2/B27/ que contiene L-glut 2 mM, LDN193189250 nM y SB431542 10,8 pM, 500 ng/mL de SHH y CHIR 7,5 pM.
7.8 Día 5: Sin cambio de medio
7.9 Día 6: Alimentación (CHIR 7,5 pM)
7.9.1 Manipular secuencialmente cada matraz T75, uno cada vez.
7.9.2 Aspirar el medio existente y añadir suavemente 40 mL de medio NB/N2/B27 que contiene L-glut 2 mM, LDN193189250 nM y SB431542 10,8 pM, 500 ng/mL de SHH y CHIR99021 7,5 pM.
7.10 Día 7: Retirar LDN, SB y SHH
7.10.1 Manipular secuencialmente cada matraz T75, uno cada vez.
7.10.2 Aspirar el medio existente y añadir suavemente 40 mL de medio NB/N2/B27 que contiene L-glut 2 mM y CHIR99021 7,5 pM.
7.11 Día 8: Sin cambio de medio
7.12 Día 9: Alimentación (CHIR 7,5 pM) y recubrimiento de PO
7.12.1 Alimentar con CHIR 7,5 pM:
7.12.1.1 Manipular secuencialmente cada matraz T75, uno cada vez.
7.12.1.2 Aspirar el medio existente y añadir suavemente40 mL de medio NB/N2/B27 que contiene L-glut 2 mM y CHIR99021 7,5 pM.
7.12.2 Recubrimiento de PO:
7.12.2.1 Etiquetar cada matraz T75 con el número de registro de lote y un número creciente. Realizar cada tarea secuencialmente.
7.12.2.2 Recubrir 48 x T75s con 15 mL por matraz con 15 pg/mL de poli-L-ornitina en DPBS.
NOTA: Se requieren 720 mL, pero preparar 800 mL para tener excedentes.
7.12.2.3 Incubar a 37°C con 5% de CO2 durante la noche.
7.13 Día 10: Alimentación (CHIR 3 pM sin DAPT) y recubrimiento con F/L
7.13.1 Alimentar las placas con CHIR 3 pM.
7.13.1.1 Manipular secuencialmente cada matraz T75, uno cada vez.
7.13.1.2 Aspirar el medio existente y añadir suavemente40 mL de medio NB/B27 que contiene L-glut 2 mM, 20 ng/mL de BDNF, AA 200 nM, 20 ng/mL de GDNF, AMPc 500 nM, 1 ng/mL de TGFp3 y CHIR99021 3 pM.
7.13.2 Recubrimiento con F/L:
7.13.2.1 Los matraces se pueden procesar en lotes de 4.
7.13.2.2 Aspirar, luego añadir 15 mL de DPBS.
7.13.2.3 Mover suavemente para lavar, luego repetir dos veces más hasta un total de 3 lavados con DPBS.
7.13.2.4 Aspirar, luego añadir 15 mL de 2 pg/mL de fibronectina/laminina en DPBS.
NOTA: Se requieren 720 mL, pero preparar 800 mL para tener excedentes.
7.13.2.5 Incubar las placas a 37°C con 5% de CO2 durante la noche.
7.14 Día 11: Pase
NOTA: 7.14 puede ser realizado simultáneamente por 2 operadores independientes por cada combinación de producción. Dos combinaciones pueden procesar matraces simultáneamente para reducir el tiempo de procesamiento. El producto debe combinarse antes de la siembra para garantizar la homogeneidad.
NOTA: Si el rendimiento es superior al requerido, solo se pueden realizar pases de 48 matraces. Si el rendimiento es inferior a 1 x 109 células totales, el lote se puede cancelar.
7.14.1 Preparar 2,5 L de medio NB/B27 que contiene L-glut 2 mM, 20 ng/mL de BDNF, AA 200 nM, 20 ng/mL de GDNF, AMPc 500 nM, 1 ng/mL de TGFp3 y CHIR99021 3 pM.
7.14.2 Procesar secuencialmente y uno por uno en lotes de 12 recipientes.
7.14.3 Retirar con cuidado los matraces de la campana, colocarlos secuencialmente y registrar cuándo comienzan las aspiraciones.
7.14.4 Aspirar el medio existente y añadir 5 mL de Accutase® a cada T75.
7.14.5 Registrar la hora de inicio de la incubación después de la última adición de Accutase®.
7.14.6 Incubar a 37°C durante 30-40 minutos.
7.14.7 Aspirar el recubrimiento de fibronectina/laminina para secar los pocillos lo más posible y dejar los matraces abiertos bajo la campana hasta que se sequen.
7.14.8 Etiquetar secuencialmente tubos cónicos de 50 mL para que coincidan con los matraces T75 en los que se están realizando los pases.
7.14.9 Bajo la campana, utilizando una técnica estéril cuidadosa, establecer un filtro azul de células de 40 pm en uno de los tubos cónicos de 50 mL etiquetados en cada matraz.
7.14.10 Una vez transcurrido el tiempo de incubación, registrar el tiempo de detención de la incubación. 7.14.11 Retirar las placas de la incubadora.
7.14.12 Usando una pipeta de 10 mL, pipetear las células ~5-10 veces con fuerza para romper las agrupaciones.
7.14.13 Pipetear las células trituradas con cuidado a través del filtro de 40 pM.
7.14.14 Añadir 15 mL de medio Neurobasal simple al matraz seco para recuperar las células que quedaron.
7.14.15 Añadir el medio Neurobasal que contiene las células recuperadas a un filtro de 40 pM.
NOTA: Dos recipientes se pueden procesar en el mismo tubo en esta etapa.
7.14.16 Retirar con cuidado el filtro y desecharlo. Tubo con tapa.
7.14.17 Repetir el procedimiento para cada matraz T75.
7.14.18 Centrifugar las células durante 5 minutos a 200 x g a temperatura ambiente.
7.14.19 Aspirar el medio y suspender de nuevo cada sedimento en 10 mL de Neurobasal simple.
7.14.20 Combinar los sedimentos de no más de 4 tubos en un tubo cónico de 50 mL.
7.14.21 Centrifugar las células durante 5 minutos a 200 x g a temperatura ambiente.
7.14.22 Aspirar el medio y resuspender cada sedimento en 10 mL de medio NB/B27 que contiene L-glut 2 mM, 20 ng/mL de BDNF, AA 200 nM, 20 ng/mL de GDNF, AMPc 500 nM, 1 ng/mL de TGFp3 y CHIR99021 3 pM.
NOTA: Las células se pueden almacenar a 4°C si es necesario procesar más recipientes.
7.14.23 Una vez que se hayan procesado todos los recipientes, agrupar todas las células y aumentar el volumen final a 200 mL usando medio NB/B27 que contiene L-glut 2 mM, 20 ng/mL de BDn F, AA 200 nM, 20 ng/mL de GDNF, AMPc 500 nM, 1 ng/mL de TGFp3 y CHIR99021 3 pM.
7.14.23.1 Hacer una dilución conocida de las células en medio Neurobasal simple.
7.14.23.2 Mezclar 20 uL de células diluidas con 20 uL de AOPI.
7.14.23.3 Cargar 20 ul de mezcla de células/AOPI en un portaobjetos de Cellometer®.
7.14.23.4 Insertar el portaobjetos en el Cellometer®.
7.14.23.5 Elegir el archivo de programa 'mDA Neurons AOPI'
7.14.23.6 Proporcionar un nombre de archivo con el siguiente formato "DA01 Lot#MMDDYY d11". 7.14.23.7 Introducir el valor de la dilución.
7.14.23.8 Usar el canal F1, enfocar las células usando la perilla en el lado derecho del aparato. 7.14.23.9 Una vez enfocadas, presione 'Contar'.
7.14.24 Registrar el número total de células/mL viables y no viables, el número total de células y el % de viabilidad.
7.14.25 Tomar una parte alícuota de 3 x106 células en un criotubo etiquetado como SSCRF-SOP-109 (producción de ADNc para control de calidad).
7.14.26 Tomar una parte alícuota de 3 x106 células en un criotubo etiquetado como PT-OP-7020 (micoplasma). Aumentar hasta 1 mL antes del envío.
7.14.27 Tomar una parte alícuota de 3 x106 células en un criotubo etiquetado como MICR-CULT-SOP-1634 (esterilidad). Aumentar hasta 1 mL antes del envío.
NOTA: Si es posible, también se debe enviar una muestra para crioconservar una muestra viva para el archivo. Las muestras vivas se pueden congelar como células individuales usando Stem-Cellbanker® y el protocolo de crioconservación "USER1" en un laboratorio de control de calidad.
7.14.28 Enviar todos los tubos de control de calidad con un operador distinto para su procesamiento de acuerdo con los SOPs asociados.
7.14.29 Ajustar la concentración celular a 1,5 mil millones de células por 1 L (se necesitan 2 L en total). 7.14.29.1 Calcular el volumen necesario para lograr 1.500 millones de células.
7.14.29.2 Retirar el volumen calculado de cada botella de 1 L de medio NB/B27 que contiene L-glut 2 mM, 20 ng/mL de BDNF, AA 200 nM, 20 ng/mL de GDNF, AMPc 500 nM, 1 ng/mL de TGFp3 y CHIR99021 3 pM 7.14.29.3 Añadir el volumen calculado que contiene 1500 millones de células a cada botella de 1 L. NOTA: Si el rendimiento celular es inferior a 3x109 pero mayor que 1 x109, calcular la cantidad de mL necesarios para llevar las células hasta una concentración final de 1,5 x 106 células/mL y sembrar tantos matraces como sea posible.
7.14.30 Añadir 40 mL de suspensión celular a cada T75 (60 x 106 células totales).
NOTA: Asegurarse de suspender cuidadosamente las células antes de pipetear.
7.14.31 Agitar cuidadosamente las placas para asegurar una suspensión uniforme de las células.
7.14.32 Dejar que las placas se incuben a temperatura ambiente durante 10 minutos.
7.14.33 Trasladar cuidadosamente los matraces a la incubadora.
NOTA: Comprobar los matraces en un microscopio para garantizar un recubrimiento uniforme.
7.14.34 Incubar las placas a 37°C con 5% de CO2 durante la noche.
7.15 Alimentación Día 12 (retirada de CHIR, adición de DAPT) [Medio de maduración])
7.15.1 Punto de control: Verificar al azar la confluencia de los matraces y registre en BR. Los cultivos deben ser 100% confluentes. Anotar la confluencia de los matraces indicados.
NOTA: El medio de maduración se puede utilizar al día siguiente en caso de que no se alcance el número máximo de matraces durante los pases.
7.15.2 Manipular secuencialmente cada matraz T75, uno cada vez.
7.15.3 Aspirar el medio existente y añadir suavemente medio NB/B27 que contiene L-glut 2 mM, 20 ng/mL de BDNF, a A 200 nM, 20 ng/mL de GDNF, AMPc 500 nM, 1 ng/mL de TGFp3 y DAPT 10 gM a cada matraz T75.
7.16 Día 13 (Medio de maduración)
7.16.1 Manipular secuencialmente cada matraz T75, uno cada vez.
7.16.2 Aspirar el medio existente y añadir suavemente medio NB/B27 que contiene L-glut 2 mM, 20 ng/mL de BDNF, a A 200 nM, 20 ng/mL de Gd NF, AMPc 500 nM, 1 ng/mL de TGFp3 y DAPT 10 gM a cada matraz T75.
7.17 Día 14 (Medio de maduración)
7.17.1 Manipular secuencialmente cada matraz T75, uno cada vez.
7.17.2 Aspirar el medio existente y añadir suavemente medio NB/B27 que contiene L-glut 2 mM, 20 ng/mL de BDNF, a A 200 nM, 20 ng/mL de Gd NF, AMPc 500 nM, 1 ng/mL de TGFp3 y DAPT 10 |uM a cada matraz T75 7.18 Día 15 (Medio de maduración)
7.18.1 Manipular secuencialmente cada matraz T75, uno cada vez.
7.18.2 Aspirar el medio existente y añadir suavemente medio NB/B27 que contiene L-glut 2 mM, 20 ng/mL de BDNF, a A 200 nM, 20 ng/mL de Gd NF, AMPc 500 nM, 1 ng/mL de TGFp3 y DAPT 10 |uM a cada matraz T75.
7.19 Día 16: Recoger las células y crioconservar
NOTA: 7.14 puede ser realizado simultáneamente por 2 operadores independientes para cada combinación de producción. Dos combinaciones pueden procesar matraces simultáneamente para reducir el tiempo de procesamiento. El producto debe agruparse antes de la siembra para garantizar la homogeneidad.
7.19.1 Etiquetar secuencialmente y enfriar todos los criotubos a 4°C.
7.19.2 Etiquetar secuencialmente las cajas con el número de lote y el intervalo de los tubos.
7.19.3 Anotar el tiempo antes de comenzar la aspiración.
7.19.4 Preparar secuencialmente lotes de 12, aspirar el medio existente de los matraces y añadir 5 mL de Accutase® a cada T75.
7.19.5 Registrar la hora de inicio de la incubación.
7.19.6 Incubar a 37°C durante 30-40 minutos.
7.19.7 En la campana, establecer un filtro azul de células de 40 gm en un tubo cónico de 50 mL (1 tubo cónico por cada 2 matraces T75).
7.19.8 Retirar el matraz de la incubadora después de la incubación, registrar el tiempo en el registro de lotes.
7.19.9 Usar una pipeta de 10 mL, pipetear ~5-10 veces hasta que las agrupaciones ya no sean visibles. 7.19.10 Transferir la suspensión celular con cuidado a través de un filtro de 40 gM.
7.19.11 Añadir 15 mL de medio Neurobasal al matraz seco para recuperar las células.
7.19.12 Transferir el medio Neurobasal con las células recuperadas a través del mismo filtro de 40 gM. 7.19.13 Repetir secuencialmente para cada matraz.
7.19.14 Centrifugar las células durante 5 minutos a 200 x g a temperatura ambiente.
7.19.15 Aspirar el medio y resuspender cada sedimento en 5 mL de medio Neurobasal.
NOTA: Almacenar los tubos cónicos a 4°C hasta que se procesan todos los recipientes.
7.19.16 Una vez que se hayan procesado todos los recipientes, agrupar todas las células y aumentar el volumen hasta un total de 200 mL.
7.19.17 Realizar un recuento de células:
7.19.17.1 Preparar una dilución conocida de células en medio Neurobasal simple.
7.19.17.2 Mezclar 20 uL de células diluidas con 20 uL de AOPI.
7.19.17.3 Cargar 20 ul de mezcla de células/AOPI en un portaobjetos de Cellometer®.
7.19.17.4 Insertar el portaobjetos en el Cellometer®.
7.19.17.5 Elegir el archivo de programa 'mDA Neurons AOPI'
7.19.17.6 Proporcionar un nombre de archivo con el siguiente formato "DA01 Lot#MMDDYY d16 cryo".
7.19.17.7 Introducir el valor de dilución.
7.19.17.8 Usar el canal F1, enfocar las células usando la perilla en el lado derecho del aparato. 7.19.17.9 Una vez enfocadas, presionar 'Contar'
7.19.18 Registrar el número total de células/mL viables y no viables, el número total de células y el % de viabilidad.
7.19.19 Tomar una parte alícuota de 3 x106 células en un criotubo etiquetado como SSCRF-SOP-109 (producción de ADNc para control de calidad).
7.19.20 Tomar una parte alícuota de 3 x106 células en un criotubo etiquetado como PT-OP-7020 (micoplasma). Aumentar el volumen hasta 1 mL con Neurobasal simple.
7.19.21 Tomar una parte alícuota de 3 x106 células en un criotubo etiquetado como MICR-CULT-SOP-1634 (esterilidad). Aumentar el volumen hasta 1 mL con Neurobasal simple.
7.19.22 Enviar los tubos con un operador independiente para su procesamiento de acuerdo con los SOPs asociados.
7.19.23 Crioconservar las células restantes de acuerdo con SOP-SSCRF-105 (Crioconservación del producto final del Día 16).
7.19.24 Una vez hecho esto, retirar rápidamente las células del congelador y colocarlas en cajas preetiquetadas y cargarlas en el expedidor.
7.19.25 Transferir las cajas a nitrógeno líquido.
7.19.26 Registrar la información en el registro por lotes.
Las células que se crioconservaron el día 16 se descongelaron y se trasplantaron a ratas lesionadas (NIH nude, Taconic Biosciences, Inc.) (es decir, un modelo de rata parkinsoniana). Se examinó el comportamiento de rotación inducido por anfetaminas en las ratas trasplantadas y en las ratas trasplantadas de forma simulada, antes del trasplante y 1,2, 3, 4 y 5 meses después del trasplante. La expresión in vivo de hNCAM y los marcadores de mDA TH (tirosina hidroxilasa) y GIRK2 (canal 2 de potasio rectificador interno activado por proteína G) se examinó cinco meses después del trasplante.
Las células que se crioconservaron el día 16 se descongelaron y se trasplantaron a primates no humanos. El crecimiento de fibra desde los injertos trasplantados y la morfología celular se examinaron seis semanas después del trasplante. Resultados
Como se muestra en la Figura 12, cuatro meses después del trasplante de los precursores de mDA en ratas lesionadas, las ratas que habían recibido los trasplantes mostraban menos rotaciones por minuto en comparación con las ratas tratadas de forma simulada. Cinco meses después del trasplante, el análisis inmunocitoquímico de los injertos trasplantados mostraba que los injertos tenían una tinción de TH típica de la morfología mDA, en donde las neuronas positivas para TH también eran positivas para la expresión de GIRK2 (Figura 13).
La morfología de los injertos de precursores de mDA trasplantados en primates no humanos se examinó seis semanas después del trasplante. El injerto mostraba un fuerte crecimiento de fibras desde el núcleo del injerto y también mostraba una morfología típica de mDA (Figura 14).

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Un método in vitro para diferenciar células madre pluripotenciales que comprende:
(a) poner en contacto una pluralidad de células madre pluripotenciales con al menos un inhibidor de la señalización de TGFp/Activina-Nodal; y
(b) poner en contacto las células con al menos un activador de la señalización de Sonic hedgehog (SHH) y al menos un activador de la señalización de wingless (Wnt),
en donde la concentración del al menos un activador de la señalización de Wnt se incrementa (i) entre 2 días y 6 días después de su contacto inicial con las células y (ii) entre un 250% y un 1800% de su concentración inicial puesta en contacto con las células, para obtener una población de células diferenciadas que expresan la proteína de caja forkhead A2 (FOXA2) y el factor de transcripción de caja homeótica LIM 1 alfa (LMX1 A).
2. El método según la reivindicación 1, que comprende además poner en contacto las células con al menos un inhibidor de la señalización de la proteína morfogenética ósea (BMP) y de la señalización de Small Mothers Against Decapentaplegic (SMAD).
3. El método según la reivindicación 2, en el que las células se ponen en contacto con el al menos un inhibidor de la señalización de TGFp/Activina-Nodal, el al menos un inhibidor de la señalización de BMP/SMAD y el al menos un activador de la señalización de Sonic hedgehog (SHH) durante entre 4 días y 10 días, o hasta 7 días, o durante al menos 7 días.
4. El método según la reivindicación 2, en el que las células se ponen en contacto con el al menos un activador de la señalización de Wnt durante entre 8 y 15 días, o hasta 12 días, o durante al menos 12 días.
5. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que la concentración del al menos un activador de la señalización de Wnt se incrementa 4 días después de su contacto inicial con las células.
6. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que el aumento en la concentración del al menos un activador de la señalización de Wnt es de un 400% a un 1450% de la concentración inicial del al menos un activador de la señalización de Wnt puesto en contacto con las células, o un 700% a un 1050% de la concentración inicial del al menos un activador de la señalización de Wnt puesto en contacto con las células.
7. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 -6, en el que el aumento en la concentración del al menos un activador de la señalización de Wnt es un incremento hasta una concentración entre 3 pM y 10 pM, o 3 pM, o 7,5 pM.
8. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que las células diferenciadas expresan una o varias entre tirosina hidroxilasa (TH), engrailed-1 (EN-1) y proteína relacionada con el receptor nuclear 1 (NURR1), opcionalmente en donde las células diferenciadas no expresan niveles detectables de proteína de caja emparejada (PAX6) y/o Ki67.
9. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde el método comprende además someter la población de células diferenciadas a condiciones que favorecen la maduración de las células en neuronas dopaminérgicas, opcionalmente en donde las condiciones comprenden poner en contacto las células con factor neurotrófico obtenido a partir de cerebro (BDNF), factor neurotrófico obtenido a partir de células gliales (GDNF), monofosfato de adenosina cíclico (AMPc), factor de crecimiento transformante beta 3 (TGFp3), ácido ascórbico (AA) y/o DAPT.
10. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que las células pluripotenciales se seleccionan a partir del grupo que consiste en células madre no embrionarias humanas, células madre no embrionarias de primate, células madre no embrionarias de roedor, células madre embrionarias humanas, células madre embrionarias de primate, células madre embrionarias de roedor, células madre pluripotenciales inducidas humanas, células madre pluripotenciales inducidas de primate, células madre pluripotenciales inducidas de roedor, células pluripotenciales recombinantes humanas, células pluripotenciales recombinantes de primate y células pluripotenciales recombinantes de roedor.
11. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 2-10, en el que
(a) el al menos un inhibidor de la señalización de TGFp/Activina-Nodal comprende un inhibidor del receptor de TGFp, en donde opcionalmente el inhibidor del receptor de TGFp comprende 4-[4-(1,3-benzodioxol-5-il)-5-(2-piridinil)-1 H-imidazol-2-il]benzamida (SB431542); y/o
(b) el al menos un inhibidor de la señalización de BMP y SMAD comprende 4-(6-(4-(piperazin-1-il)fenil)pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-il)quinolina (LDN193189), una Nogina, una combinación de los anteriores; y/o
(c) el al menos un activador de la señalización de SHH comprende una proteína SHH, un agonista de Smoothened o una combinación de los anteriores, opcionalmente (i) en donde la proteína SHH comprende una SHH recombinante, una SHH purificada o una combinación de las anteriores y/o (ii) en donde la SHH recombinante comprende SHH C25II, y/o (iii) en donde el agonista de Smoothened comprende purmorfamina; y/o
(d) el al menos un activador de la señalización de Wnt comprende CHIR99021, Wnt3A, Wnt1 o una combinación de los anteriores.
12. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en el que las células diferenciadas que expresan FOXA2 y LMX1A son neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo o precursores de las mismas.
13. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en el que las células madre pluripotenciales se diferencian en células diferenciadas que expresan FOXA2 y LMX1A a más tardar entre 22 días y 27 días después de su contacto inicial con al menos un inhibidor de la señalización de TGFp/Activina-Nodal.
14. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 -13, en donde las células diferenciadas expresan un nivel detectable de CD142, opcionalmente en donde el método comprende además seleccionar una población de células que expresan CD142.
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