JP2018510750A - カテコール基及び酸化されたカテコール基が導入されて架橋されたキトサンでコーティングされた無出血注射針 - Google Patents

Abstract

本発明はカテコール基及び酸化されたカテコール基が導入され、架橋されたキトサンでコーティングされた無出血注射針に関するもので、本発明による無出血注射針は注射の時に発生する出血を抑制することができ、糖尿病患者、抗癌治療患者、血友病患者など止血能力が劣る患者だけではなく、血液拒否反応を示す患者、子供の注射にも有用に使用することができる効果がある。

Description

本発明はカテコール基及び酸化されたカテコール基が導入されて架橋されたキトサンでコーティングされた無出血注射針に関するものである。

既存の止血剤及び接着剤製品の開発は外科手術での使用に焦点を合わせてきた。代表的な医療用の止血剤及び接着剤ではＦＤＡ承認を受けたシアノアクリレート系の接着剤と生体内の血液凝固の蛋白質を利用したフィブリン糊がある。しかしながら、このような止血剤や接着剤の製品は、接着強度と塗布した後の持続性、毒性、人体内での免疫反応などをすべて満足させない。したがって、止血剤の開発において優れた組織接着性を有しながら生体適合性を有する材料の開発が重要な課題になってきた。

一方、キトサン（ｃｈｉｔｏｓａｎ）は止血能力が優れた生体高分子として広く知られているが、中性溶液に対する溶解度が顕著に劣って、酸性溶液にだけ溶けるという短所を有していて医療用の材料に使用するには限界がある。

これによって、ムール貝の接着能力に寄与する重要な官能基であるカテコール（ｃａｔｅｃｈｏｌ）基をキトサンに導入することによって、キトサンの溶解度を高めて、粘膜及び組織に対する接着性を増進させる研究結果が報告されたことがある。一例として、国際公開ＷＯ２０１３−０７７４７５号ではカテコール基が結合されたキトサ及び末端にチオール基が結合されたプルロニックを含む接着性のハイドロゲルの造成物、具体的には生体内外での安全性を有して、温度感応的であり、止血効果が優れて生体接着剤として使用可能な組成物及びこれを含む医療用の接着剤、癒着防止剤及び表面吸着防止剤に関する内容を開示している。また、カテコール基が結合されたキトサンを使用して製造されるハイドロゲルまたはフィルムは外科手術で使用される既存の止血剤を代替することができるほど、優れた機能を有している。

しかしながら、上記のような剤型は外科手術の便宜のための形態であり接着強度と塗布した後の持続性、毒性、人体内での免疫反応などを全部満足させなければならない問題点がある。

これに、本発明者らは新しい形態の医療機構である無出血注射針を開発するために研究していたところ、本発明によるカテコール基
及び酸化されたカテコール基
がキトサンに導入され、架橋されたキトサンでコーティングされた注射針は注射の時に発生する出血を効果的に抑制できることを確認して、本発明を完成した。

本発明の目的は注射の際、出血が起きないようにする注射針のコーティング用のハイドロゲルを提供するものである。

本発明の他の目的は、上記注射針のコーティング用のハイドロゲルが表面にコーティングされた無出血注射針を提供するものである。

本発明のまた他の目的は、上記無出血注射針の製造方法を提供するものである。

本発明の他の目的は、上記無出血注射針を使用した無出血注射方法を提供するものである。

上記の目的を達成するために、本発明はカテコール（ｃａｔｅｃｈｏｌ）基が導入されたキトサン（ｃｈｉｔｏｓａｎ）を含み、上記カテコール基の少なくとも一部分が酸化されて架橋されたことを特徴にする、注射の時出血が起きないようにする注射針のコーティング用のハイドロゲルを提供する。

また、本発明は、上記注射針のコーティング用のハイドロゲルが表面にコーティングされた無出血注射針を提供する。

さらには、本発明はカテコール基
及び少なくとも一部分が酸化されたカテコール基
が導入されて、一部分が架橋されたキトサン溶液を準備する段階（段階１）；及び
上記段階１の溶液を使用して注射針の表面をコーティングする段階（段階２）；を含む上記無出血注射針の製造方法を提供する。

また、本発明はカテコール基
及び少なくとも一部分が酸化されたカテコール基
が導入されて、一部分が架橋されたキトサン溶液を準備する段階（段階１）；
上記段階１の溶液を使用して注射針の表面をコーティングして無出血注射針を準備する段階（段階２）；及び
上記段階２で準備した無出血注射針を使用してヒトまたは動物に注射する段階（段階３）；を含む無出血注射方法を提供する。

図１は走査型電子顕微鏡を通じて実施例１で製造した無出血注射針の形態と成分を確認した結果を示すイメージである。 図２は実施例１−３で製造した無出血注射針にコーティングされたフィルムの厚さを示すグラフで、下段のイメージは走査型電子顕微鏡を通じて測定したフィルムの形態を示す写真である。 図３は、実施例３で製造した無出血注射針の止血メカニズムの確認のための生体外の実験の構成を示すイメージである。 図４（Ａ）は無出血注射針の製造のために使用したキトサン−カテコール溶液（赤色）の紫外線−可視光線の分光スペクトルの分析結果を示すイメージである。青いスペクトルは対照群としてカテコールの酸化及び架橋を部分的に誘導しないキトサン−カテコール溶液に該当するスペクトルである。図４（Ｂ）は無出血注射針の製造のために使用したキトサン−カテコール溶液（赤色）に対する水素^１核磁気共鳴の分析結果を示すイメージである。図４（Ｃ）は、キトサン−カテコール溶液でフィルムを形成した後、生理食塩水に露出させて観察されるレオロジー的な物性を示すグラフである（上部：カテコールの酸化及び架橋を部分的に誘導しないキトサン−カテコール溶液；下部：実施例１−３で使用したキトサン−カテコール溶液）。 図５は実施例１で製造した無出血注射針に対する生体内の実験結果を示すイメージである。具体的に、図５（Ａ）はマウスの伏在静脈モデルを使用して止血効果を確認したもので；図５（Ｂ）はマウスの伏在静脈モデルを使用して観察される出血量を示すグラフで；図５（Ｃ）はウサギの耳介静脈モデルを使用して止血効果を確認したのである。

他の式で定義されない限り、本明細書で使用された全ての技術的及び科学的な用語は、本発明が属する技術分野で熟練された専門家によって、通常的に理解されるものと同一な意味を有する。一般的に、本明細書で使用された命名法は、本技術分野でよく知られていて、通常的に使われるものである。

以下、本発明を詳しく説明する。

本発明はカテコール（ｃａｔｅｃｈｏｌ）基が導入されたキトサン（ｃｈｉｔｏｓａｎ）を含み、上記カテコール基の少なくとも一部分が酸化されて架橋されたものを特徴にする、注射の時出血が起きないようにする注射針のコーティング用のハイドロゲルを提供する。

この時、上記ハイドロゲルはカテコール基に含まれている−ＯＨ基が＝Ｏ基に一部分酸化された後、キトサンに含まれている−ＮＨ_２基と脱水縮合反応を通じて架橋されることを特徴にして、上記カテコール基の酸化の程度はハイドロゲルに含まれたカテコール基の１ないし２０％（モル基準）が酸化されることが好ましい。ここで、上記カテコール基の酸化の程度がハイドロゲルに含まれたカテコール基に対して１％未満である場合、キトサンに含まれている−ＮＨ_２基との架橋が十分に誘導されない問題があり、上記カテコール基の酸化の程度がハイドロゲルに含まれたカテコール基に対して２０％超過８０％以下である場合、注射針のコーティングは可能であるが、コーティングされたフィルムの硬化程度が高まって、止血効果を示すことができない問題がある。上記カテコール基の酸化の程度がハイドロゲルに含まれたカテコール基に対して８０％超過である場合、架橋による硬化程度が高まり、注射針をコーティングするには好ましくない物性を得ることになる問題がある。

また、上記脱水縮合反応を通じた架橋は下記反応式１に示したことのように、酸化されたカテコール基
のオキソ（＝Ｏ）基が、適切な配向に位置されたキトサンに含まれているアミン（−ＮＨ_２）基と反応して結合が形成されることを示す。

［反応式１］

上記反応式１で、
化学式１で表示される化合物はカテコール基
及び酸化されたカテコール基
が導入されたキトサンのアミン（−ＮＨ_２）基を示したもので；
化学式２に表示される化合物はカテコール基
及び酸化されたカテコール基
が導入されたキトサンの酸化されたカテコール基を示したもので；
化学式３で表示される化合物は化学式１で表示される化合物と化学式２に表示される化合物が脱水縮合反応を通じて架橋結合して形成される化合物を示したもので；及び
Ｌは単一結合（Ｓｉｎｇｌｅ ｂｏｎｄ）、Ｃ_１−８の直鎖または側鎖アルキレン又は−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ^１−で、上記Ｒ^１は、単一結合（Ｓｉｎｇｌｅ ｂｏｎｄ）またはＣ_１−８の直鎖または側鎖アルキレンである。

具体的に、上記カテコール基
及び酸化されたカテコール基
が導入されたキトサンの前駆体は酸化されたカテコール基が導入されないキトサンであり後述する実施例で使用したカテコール基が導入されたキトサンの具体的な化学構造式では下記化学式４のようである。

［化学式４］
上記の化学式４で、
ｘ：ｙ：ｚは６：１：３であることが好ましい。

また、本発明は、上記注射針のコーティング用のハイドロゲルが表面にコーティングされた無出血注射針を提供する。この時、上記無出血注射針の表面にコーティングされたハイドロゲルの厚さは２ないし３０μｍであることが好ましい。上記の厚さが２μｍ未満である場合、注射の時に発生する患部を防ぐのに十分ではないハイドロゲルが含まれるため、出血が効果的に抑制されない問題があり、上記の厚さが３０μｍ超過である場合、注射の時に注射針にコーティングされたハイドロゲルの厚さが厚くて注射針とともに、生体内に入ることができず、皮膚にもまれるようになって出血が効果的に抑制されない問題がある。

ひいては、本発明はカテコール基
及び少なくとも一部分が酸化されたカテコール基
が導入されて、一部分が架橋されたキトサン溶液を準備する段階（段階１）；及び
上記段階１の溶液を使用して注射針の表面をコーティングする段階（段階２）；を含む上記無出血注射針の製造方法を提供する。

以下、本発明による無出血注射針の製造方法を段階別に詳細に説明する。

本発明による無出血注射針の製造方法において、上記段階１はカテコール基
及び少なくとも一部分が酸化されたカテコール基
が導入されて、一部分が架橋されたキトサン溶液を準備する段階である。

この時、上記溶液はカテコール基が導入されたキトサンを溶媒に溶解させて保管してカテコール基の部分酸化及び架橋を誘導することができる。ここで上記保管温度は０ないし２０℃が好ましく、２ないし１０℃がさらに好ましく、３ないし５℃がもっと好ましく、４℃が最も好ましい。また、上記の保管時間は１ないし５日が好ましく、２ないし４日がさらに好ましく、３日が最も好ましい。さらには、上記カテコール基が導入されたキトサンは全体の溶液に対して１重量％ないし２重量％であることが好ましく、１．３重量％ないし１．７重量％であることがさらに好ましく、１．５重量％であることが最も好ましい。

上記好ましい保管温度、保管時間及びカテコール基が導入されたキトサンの重量％の範囲を外れる場合、無出血注射針にコーティングするために要求されるフィルムの物性が得られない問題がある。

本発明による無出血注射針の製造方法において、上記段階２は、上記段階１の溶液を使用して注射針の表面をコーティングする段階であり、具体的には上記溶液を注射針の上に位置させた後、注射針を一定な速度で回転させ、均一にコーティングする段階である。

この時、上記使用する溶液の量によって注射針のコーティングの厚さを調節することができ、これによって様々な太さの注射針をコーティングすることができる。

また、本発明はカテコール基
及び少なくとも一部分が酸化されたカテコール基
が導入されて、一部分が架橋されたキトサン溶液を準備する段階（段階１）；
上記段階１の溶液を使用して注射針の表面をコーティングして無出血注射針を準備する段階（段階２）；及び
上記段階２で準備した無出血注射針を使用してヒトまたは動物に注射する段階（段階３）；を含む無出血注射方法を提供する。

以下、本発明による無出血注射方法を段階別に詳細に説明する。

本発明による無出血注射方法において、上記段階１はカテコール基
及び少なくとも一部分が酸化されたカテコール基
が導入されて、一部分が架橋されたキトサン溶液を準備する段階である。

この時、上記溶液はカテコール基が導入されたキトサンを溶媒に溶解させて保管してカテコール基の部分酸化及び架橋を誘導することができる。ここで上記保管温度は０ないし２０℃が望ましく、２ないし１０℃がさらに好ましく、３ないし５℃がもっと好ましく、４℃が最も好ましい。また、上記の保管時間は１ないし５日が好ましく、２ないし４日がさらに好ましく、３日が最も好ましい。さらには、上記カテコール基が導入されたキトサンは全体の溶液に対して１重量％ないし２重量％であることが好ましく、１．３重量％ないし１．７重量％であることがさらに好ましく、１．５重量％であることが最も好ましい。

上記好ましい保管温度、保管時間及びカテコール基が導入されたキトサンの重量％の範囲を外れる場合、無出血注射針にコーティングするために要求されるフィルムの物性が得られない問題がある。

本発明による無出血注射方法において、上記段階２は、上記段階１の溶液を使用して注射針の表面をコーティングして無出血注射針を準備する段階であり、具体的には上記の溶液を注射針の上に位置させた後、注射針を一定な速度で回転させ、均一にコーティングする段階である。

この時、上記使用する溶液の量によって注射針のコーティングの厚さを調節することができ、これによって様々な太さの注射針をコーティングすることができる。

本発明による無出血注射方法において、上記段階３は、上記段階２で準備した無出血注射針を使用してヒトまたは動物に注射する段階である。

この時、上記無出血注射方法は、注射針の表面のコーティングが生体内の水溶性の環境に露出されてハイドロゲルの形態に転移されて、注射により発生する患部をふさぎ、出血が抑制されることを特徴にして、上記ハイドロゲルへの転移のための十分な時間を確保するために注射後１０ないし３０秒の注射した状態で注射針を維持することが好ましい。生体内注射針の維持時間を１０秒未満に維持する場合、ハイドロゲルへの転移のための十分な時間が確保されなくて出血が容易に抑制されない問題があり、注射針の維持時間を３０秒超過して維持する場合、ハイドロゲルへの転移のための十分な時間が確保されることはできるが、皮膚刺激によりあざが生じる問題がある。

本発明による無出血注射針の止血能力を評価するために下記のような実験を遂行した。

まず、走査型電子顕微鏡を通じて実施例１で製造した無出血注射針を観察した結果、実施例１で製造した注射針の形態が維持され、表面が均一にコーティングされていることを確認した。また、エネルギー分散エックス線元素分析を通じて、実施例１で製造した注射針の表面コーティング層の成分を分析した結果、コーティングしなかった注射針の表面では注射針の材料に該当するクロム、鉄などのような元素が檢出される一方、実施例１で製造した注射針の表面ではカテコールが導入されたキトサンに含まれている主要な元素である炭素、窒素、酸素に関する成分が主に検出されることを確認した（実験例１の図１参照）。

また、実施例１−３で製造した無出血注射針にコーティングされたフィルムの厚さを分析するためにフィルムを分離して、走査型電子顕微鏡を通じて厚さを測定した結果、各々の注射針の太さが増加することによって注射針の上での表面張力によってキトサン−カテコールフィルムの形成の厚さが減少することで示された。具体的に実施例１−３で製造した注射針の表面にコーティングされたフィルムの厚さは各々２５．２±２．８μｍ、２６．６±３．０μｍ、３．８±０．７μｍであることを確認した（実験例２の図２参照）。

さらには、実施例１で製造した無出血注射針の止血能力を評価するため、生体外の実験を遂行した結果、一般の注射針は生理食塩水が漏水されることが確認される一方、実施例３で製造した無出血注射針は皮下組織を刺した後、１５ないし２０秒後に起こる、注射針にコーティングされていたフィルムのハイドロゲル転移によって皮下組織の穴が詰まって生理食塩水の漏れが防止されることで示された（実験例３の図３参照）。

また、上記の実験例３で確認した無出血注射針の表面に形成されたフィルムのハイドロゲル転移を確認するため、無出血注射針の製造に使用されたキトサン−カテコール溶液の特性を紫外線−可視光線分光スペクトルを通じて分析した結果、５００ｎｍ波長で吸光が示されることを通じて、キトサン−カテコール溶液内のカテコールが部分的に酸化されたことを確認した（実験例４の図４（Ａ）参照）。

さらには、上記の実験例３で確認した無出血注射針の表面に形成されたフィルムのハイドロゲル転移を確認するため、水素^１核磁気共鳴スペクトルを通じて分析した結果、カテコールの部分的な酸化による媒介体が形成されていることを確認した（実験例４の図４（Ｂ）参照）。

また、実施例で使用したキトサン−カテコール溶液３００μＬを乾燥して形成したフィルムを生理食塩水に１５−２０秒間露出させて形成される物質がハイドロゲルの特性があることを確認した（実験例４の図４（Ｃ）参照）。

さらには、実施例１で製造した無出血注射針の止血能力を評価するために実験を遂行した結果、実施例１で製造した無出血注射針はキトサン−カテコール溶液で形成されたコーティングがハイドロゲルに転移及び膨潤されたことによって、一般的な注射針と比較して顕著に優秀な止血効果があることを確認した（実験例５の図５（Ａ）参照）。また、一般的な注射針は総３回（ｎ＝３）の実験による全体出血量が３１．３μＬであることで示された一方、実施例１で製造した無出血注射針は出血が全く発生しないことを確認した（実験例５の図（Ｂ）参照）。さらに、一般的な注射針はウサギの耳介静脈に注射の時、出血が発生したことで示された一方、実施例１で製造した無出血注射針で注射した場合、出血が全く発生しないことを確認した（実験例５の図５（Ｃ）参照）。

したがって、本発明による無出血注射針は注射の時に発生する出血を抑えることができ、糖尿病患者、抗癌治療患者、血友病患者など、止血能力が劣る患者だけではなく、血液拒否反応を示す患者、子供の注射にも有用に使用することができる効果がある。

以下、本発明を実施例及び実験例により詳しく説明する。

ただし、実施例及び実験例は本発明を例示することだけで、本発明の内容がこれに限定されるものではない。

製造例

製造例１：カテコールが導入されたキトサンの製造

約３０％アセチル化されているキトサン（キトサン７０／１００，モデル名：２４２０４，製造社：Ｈｅｐｐｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｈｉｔｏｓａｎ）３ｇを２９２ｍｌ ＨＣｌ溶液（ｐＨ＝２）に６時間にわたって溶解させた。上記キトサン溶液に０．５Ｎ ＮａＯＨ溶液８ｍｌを徐々に添加してｐＨを５．５に調節した。製造された１％キトサン溶液を１２時間にわたって安定化させた。

上記準備されたキトサン溶液に３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）プロパン酸２．３７ｇを添加した。以後、キトサンのアミン（−ＮＨ_２）基は３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）プロパン酸のカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）の間アミド結合（−ＣＯＮＨ−）を形成するための反応物質で１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）２．０２ｇを５０ｍｌエタノールに溶かした後、これを添加して、溶液の酸度をｐＨ４．５に調節した後、１時間の間反応を遂行した。本過程でカテコールが導入されたキトサンが製造される。

反応しなかった３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）プロパン酸と１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）を除去するため、反応後の溶液を透析膜［分子量カットオフ（ｃｕｔ−ｏｆｆ）１２，０００−１５，０００］を使用して塩化ナトリウムと５Ｎ ＨＣｌ３ｍｌを含めている４．５Ｌ３次蒸留水で２日間、透析した。追加で５Ｎ ＨＣｌ３ｍｌを含めている４．５Ｌ３次蒸留水で２日間、透析した。終わりに３次蒸留水で６時間の間透析した後、凍結乾燥してカテコールが導入されたキトサンを準備した（ｘ：ｙ：ｚ＝６：１：３）。

実施例１：無出血注射針（２６Ｇ）の製造１
上記製造例１で製造したカテコールが導入されたキトサン１．５ｍｇを１００μＬの３次蒸留水に溶解させた後、４℃で３日間保管してカテコール基の酸化及び架橋を部分的に誘導した。これに、カテコール基
及び酸化されたカテコール基
が導入されて、一部分架橋されたキトサン溶液（以下、‘キトサン−カテコール溶液’と命名した）を準備した。

上記キトサン−カテコール溶液のカテコール基の酸化程度は紫外線−可視光線分光スペクトルを通じて５００ｎｍ波長での吸光度を測定することで確認した。酸化されたカテコール基はキトサンのアミン基の架橋結合が形成される場合、５００ｎｍの波長での吸光度が示されることになる。したがって、キトサン−カテコール溶液の酸化を最大に誘導する酸化剤であるＮａＩＯ_４を、カテコール基のモル比の３倍で処理した後に示される吸光度を基準にして、キトサン−カテコール溶液の酸化程度を評価した。その結果、上記キトサン−カテコール溶液の酸化は４．５ないし５．５％の間であることを確認した。

一方で、上記準備したキトサン−カテコール溶液の安定的なコーティングのために、２６Ｇ厚さの注射針を１０分間，酸素プラズマ処理を実行した。以後、上記キトサン−カテコール溶液６．５μＬを注射針に乗せて常温で１時間４０ｒｐｍで回転させ、コーティングして２時間の間乾燥した。上記の過程を２回繰返して無出血注射針を製造した。

実施例２：無出血注射針（２３Ｇ）の製造２
２６Ｇ厚さの注射針を使用する代わりに２３Ｇ厚さの注射針を使用して；キトサン−カテコール溶液を６．５μＬ使用する代わりに９μＬ使用することを除いて；上記の実施例１と同一な方法で遂行して無出血注射針を製造した。

実施例３：無出血注射針（１８Ｇ）の製造３
２６Ｇ厚さの注射針を使用する代わりに１８Ｇ厚さの注射針を使用して；キトサン−カテコール溶液を６．５μＬ使用する代わりに２０μＬ使用することを除いて；上記の実施例１と同一な方法で遂行して無出血注射針を製造した。

実験例

実験例１：無出血注射針の形態観察
走査型電子顕微鏡（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓ−４８００）を通じて実施例１で製造した無出血注射針を観察して、その結果を図１に示した。

図１は走査型電子顕微鏡を通じて実施例１で製造した無出血注射針の形態と成分を確認した結果を示すイメージである。

図１に示したことのように、実施例１で製造した注射針の形態が維持されて注射針の表面にキトサン−カテコールが均一にコーティングされていることを確認した。

また、エネルギー分散エックス線元素分析を通じて、実施例１で製造した注射針の表面コーティング層の成分を分析した。走査型電子顕微鏡に付着されたエネルギー分散型エックス線分光器を利用して、実施例１で製造した注射針の表面コーティング領域の測定の時に発生する蛍光エックス線を検出し、１２０秒の間感知される元素を分析した。

その結果、図１の下段グラフに示したことのように、コーティングしなかった注射針の表面では注射針の材料に該当するクロム、鉄などのような元素が檢出される一方、実施例１で製造した注射針の表面ではカテコールが導入されたキトサンに含まれている主要な元素である炭素、窒素、酸素に関する成分が主に検出されることを確認した。

したがって、本発明による無出血注射針が好ましく製造されたことを確認した。

実験例２：厚さ分析
実施例１−３で製造した無出血注射針にコーティングされたフィルムの厚さを分析するためにフィルムを分離して、走査型電子顕微鏡（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓ−４８００）を通じて厚さを測定した。その結果を図２に示した。

図２は実施例１−３で製造した無出血注射針にコーティングされたフィルムの厚さを示すグラフで、下段のイメージは走査型電子顕微鏡を通じて測定したフィルムの形態を示す写真である。

図２に示したことのように、各々の注射針の太さが増加することによって注射針の上での表面張力によってキトサン−カテコールフィルムの形成の厚さが減少することで示された。しかしながら、実施例１（２６Ｇ）及び実施例２（２３Ｇ）で製造した注射針の場合、太さの差が大きくないので、表面に形成されるフィルムの厚さに大きな差はないことで示された。具体的に実施例１−３で製造した注射針の表面にコーティングされたフィルムの厚さは各々２５．２±２．８μｍ、２６．６±３．０μｍ、３．８±０．７μｍであることを確認した。

実験例３：生体のほか止血能力評価
実施例３で製造した無出血注射針の止血能力を評価するため、生体外の実験を遂行して、具体的な構成を図３に示した。具体的にはヌードマウスの皮下組織（ＢＡＬＢｃヌードマウス、８週齢雄、２３−２５ｇ）を使用して管の片方の端を防ぎ、その上に生理食塩水を満たした後、実施例３で製造した無出血注射針（１８Ｇ）または一般注射針で刺して、穴から生理食塩水の漏水の有無を確認した。

図３は、実施例３で製造した無出血注射針の止血メカニズムの確認のために生体外の実験構成を示すイメージである。

図３に示したことのように、一般注射針は生理食塩水が漏水されることが確認された一方、実施例３で製造した無出血注射針は皮下組織を刺した後、１５ないし２０秒後に起こる注射針にコーティングされていたフィルムのハイドロゲルへの転移によって皮下組織の穴が詰まって生理食塩水の漏水が防止されることで示された。

実験例４：止血メカニズムの確認のためのフィルムの物性分析
上記実験例３で確認した無出血注射針の表面に形成されたフィルムのハイドロゲル転移を確認するため、無出血注射針の製造に使用されるキトサン−カテコール溶液の特性を紫外線−可視光線分光スペクトル（ＨＰ８４５３，Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ）を通じて分析した。その結果を図４（Ａ）に示した。

図４（Ａ）は無出血注射針の製造のために使用したキトサン−カテコール溶液（赤色）の紫外線−可視光線分光スペクトルの分析結果を示すイメージである。青いスペクトルは対照群としてカテコールの酸化及び架橋を部分的に誘導しなかったキトサン−カテコール溶液に該当するスペクトルである。

図４（Ａ）に示したことのように、紫外線−可視光線分光スペクトルを測定し、５００ｎｍ波長で吸光が示されたことを通じて、キトサン−カテコール溶液内のカテコールが部分的に酸化されたことを確認した。

また、水素^１核磁気共鳴スペクトル（Ｂｒｕｋｅｒ ＡＶ−３００）を通じて分析した結果、図４（Ｂ）に示したことのようにカテコールの部分的な酸化による媒介体が形成されていることを確認した。

図４（Ｂ）は無出血注射針の製造のために使用したキトサン−カテコール溶液（赤色）に対する水素^１核磁気共鳴の分析結果を示すイメージである。

さらには、キトサン−カテコール溶液３００μＬを乾燥して形成したフィルムを生理食塩水に１５−２０秒の間、露出させた後形成された物質に対して、レオメーター（Ｒｈｅｏｍｅｔｅｒ）（Ｂｏｈｌｉｎ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｒｈｅｏｍｅｔｅｒ，Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を通じてハイドロゲルの特性があることを確認した。その結果を図４（Ｃ）に示した。

図４（Ｃ）は、キトサン−カテコール溶液でフィルムを形成した後、生理食塩水に露出させて観察されるレオロジー的な物性を示すグラフでる（上部：カテコールの酸化及び架橋を部分的に誘導しなかったキトサン−カテコール溶液；下部：実施例１−３で使用したキトサン−カテコール溶液）。

具体的に、レオメーター（Ｒｈｅｏｍｅｔｅｒ）の試料ホルダーの上に実施例１−３で使用したキトサン−カテコール溶液を使用して製造したフィルムを載せて、２０ｍｍ厚さの平行平板（ｐａｒａｌｌｅｌ ｐｌａｔｅ）を使用して０．１−１０ｒａｄ／ｓｅｃ、振動数で１００Ｐａの一定な力（ｓｈｅａｒ ｓｔｒｅｓｓ）を加えながら材料の変形の程度を貯蔵弾性率（Ｇ‘）及び損失弾性率（Ｇ“）で確認した。貯蔵弾性率（Ｇ‘）及び損失弾性率（Ｇ“）は下記の数学式１によって測定した。

［数学式１］
上記数学式１で
σは材料に加えられる力（ｓｈｅａｒ ｓｔｒｅｓｓ）で；
γ０は材料の変形によって示される信号（ｓｈｅａｒ ｓｔｒａｉｎ）の最大振幅で；
Ｇ‘は貯蔵弾性率で；
Ｇ“は損失弾性率で；
ωは振動数で；及び
ｔは時間である。

図４（Ｃ）の上部に示したことのように、カテコールの酸化及び架橋を部分的に誘導しなかったキトサン−カテコール溶液で製造したフィルムは大部分の区間で、損失弾性率（Ｇ“）が貯蔵弾性率（Ｇ‘）より大きく示されたという点でハイドロゲルが形成されていないことを知ることができた。

一方、図４（Ｃ）の下部に示したことのように、実施例１−３で使用したキトサン−カテコール溶液で製造したフィルムは、全区間で貯蔵弾性率（Ｇ‘）が損失弾性率（Ｇ“）より大きく示されたという点でハイドロゲルが形成されていることを知ることができた。

実験例５：生体内の止血能力の評価
実施例１と実施例２で製造した無出血注射針の止血能力を評価するために下記のような実験を遂行した。

まず、マウスの伏在静脈モデル（ＢＡＬＢｃヌードマウス、８週齢雄、２３−２５ｇ）とうさぎの耳介静脈モデル（ニュージーランドホワイトウサギ、１２−１４週齢雌、２．５−３．０ｋｇ）を準備した。以後、実施例１または実施例２で製造した無出血注射針の表面にコーティングされたフィルムがハイドロゲルに転移のための十分な時間を確保するために注射して２０秒後に注射針を抜いた。その結果を図５に示した。

図５は実施例１または実施例２で製造した無出血注射針に対する生体内の実験結果を示すイメージである。具体的に、図５（Ａ）は実施例１で製造した注射針でマウスの伏在静脈モデルを使用して止血効果を確認したもので；図５（Ｂ）はマウスの伏在静脈モデルを使用して観察される出血量を示すグラフで；図５（Ｃ）は実施例２で製造した注射針でウサギの耳介静脈モデルを使用して止血効果を確認したものである。

図５（Ａ）に示したことのように、実施例１で製造した無出血注射針はキトサン−カテコール溶液で形成されたコーティングがハイドロゲルに転移及び膨潤されたことによって、一般的な注射針と比較して顕著に優秀な止血効果があることで示された。

また、図５（Ｂ）に示したことのように、一般的な注射針は総３回（ｎ＝３）の実験による全体出血量が３１．３μＬであることと示された一方、実施例１で製造した無出血注射針は出血が全く発生しないことで示された。

さらには、図５（Ｃ）に示したことのように、一般的な注射針はウサギの耳介静脈に注射の時、出血が発生することで示された一方、実施例２で製造した無出血注射針で注射する場合、出血が全く発生しないことで示された。

したがって、本発明によるカテコール基
及び酸化されたカテコール基
がキトサンに導入され、架橋されたキトサンでコーティングされた注射針は注射の時に発生する出血を抑えることができ、糖尿病患者、抗癌治療患者、血友病患者など止血能力が劣る患者だけではなく、血液拒否反応を示す患者、子供の注射にも有用に使用することができる効果がある。

本発明による無出血注射針は注射の時、発生する出血を抑制することができ、糖尿病患者、抗癌治療患者、血友病患者など止血能力が劣る患者だけではなく、血液拒否反応を示す患者、子供の注射にも有用に使用することができる効果がある。

以上で本発明内容の特定な部分を詳細に記述したところ、当業界の通常の知識を有する者においてこのような具体的な技術はただ好ましい実施様態だけであり、これにより本発明の範囲が制限されることではない点は自明である。したがって、本発明の実質的な範囲は添付された請求項とそれらの等価物によって定義されるといえる。

Claims (10)

1. カテコール（ｃａｔｅｃｈｏｌ）基が導入されたキトサン（ｃｈｉｔｏｓａｎ）を含み、上記カテコール基の少なくとも一部分が酸化されて架橋されたことを特徴とする、注射時の出血が起きないようにする注射針のコーティング用のハイドロゲル。
2. 前記ハイドロゲルのカテコール基に含まれている−ＯＨ基が＝Ｏ基に一部分酸化された後、キトサンに含まれている−ＮＨ２基と脱水縮合反応を通じて架橋されることを特徴とする請求項１に記載の注射針のコーティング用のハイドロゲル。
3. 前記カテコール基の酸化の程度は、ハイドロゲルに含まれたカテコール基の１ないし２０％（モル基準）が酸化されることを特徴とする請求項１に記載の注射針のコーティング用のハイドロゲル。
4. 請求項１に記載の注射針のコーティング用のハイドロゲルが表面にコーティングされた無出血注射針。
5. 前記無出血注射針の表面にコーティングされたハイドロゲルの厚さは２ないし３０μｍであることを特徴とする請求項４に記載の無出血注射針。
6. カテコール基
   及び少なくとも一部分が酸化されたカテコール基
   が導入されて、一部分が架橋されたキトサン溶液を準備する段階（段階１）；及び
   前記段階１の溶液を使用して注射針の表面をコーティングする段階（段階２）；を含む請求項４に記載の無出血注射針の製造方法。
7. 前記段階２は、注射針の上に、カテコール基及び酸化されたカテコール基が導入されて、一部分が架橋されたキトサン溶液を位置させた後、注射針を一定の速度で回転させ、コーティングすることを特徴とする請求項６に記載の製造方法。
8. 前記製造方法は、カテコール基及び酸化されたカテコール基が導入されて、一部分が架橋されたキトサン溶液の量によってコーティングの厚さを調節することを特徴とする請求項６に記載の製造方法。
9. カテコール基
   及び少なくとも一部分が酸化されたカテコール基
   が導入されて、一部分が架橋されたキトサン溶液を準備する段階（段階１）；
   前記段階１の溶液を使用して注射針の表面をコーティングして無出血注射針を準備する段階（段階２）；及び
   上記段階２で準備した無出血注射針を使用してヒトまたは動物に注射する段階（段階３）；を含む無出血注射方法。
10. 前記無出血注射方法は、注射針の表面のコーティングが生体内の水溶性の環境に露出されてハイドロゲルの形態に転移することによって、注射により発生する患部をふさぎ、出血が抑制されることを特徴とする請求項９に記載の無出血注射方法。