JP2018500010A - 臓器障害を診断するための方法および装置 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2014年11月12日に出願された米国仮出願シリアル番号62/078,810号の利益を主張し、その開示の全体が、本明細書の一部を構成するものとして援用される。
本開示のいくつかの実施形態は、体液からバイオマーカーを単離するように構成された装置および方法、ならびに、このようなバイオマーカーの発現プロファイルを疾患の診断および治療に用いる方法に関する。いくつかの実施形態は、尿サンプルからのエキソソームおよび微小胞のmRNAプロファイルを特徴づけて急性腎障害(AKI)の発症機序を明らかにすることに関する。
AKIは、世界中で何百万という患者が罹患している、いくつかの疾患および環境(setting)における主要な合併症としてよく認識されている。リスク、障害、不全、機能喪
失,末期疾患(Risk, Injury, Failure, Loss of Function, End-stage disease)(RIFLE)、急性腎障害ネットワーク(AKIN)、および国際腎臓病予後改善機構(Kidney Disease: Improving Global Outcomes)(KDIGO)といった診断システムの発展
に伴い、いくつかの報告書では、様々な環境におけるAKIの疫学が記載されている。これらは、管理データセット、単一および多施設コホートのレトロスペクティブ分析、ならびにプロスペクティブコホート研究に言及している。病期分類システムは、環境に関係なく、ステージが高くなると死亡率および資源利用のリスクが増加する転帰の優れた予測システムであることが示されている。リスクファクターとして、加齢と、心不全、肝不全、および慢性腎疾患(CKD)、ならびに貧血の存在と、抗生物質、NSAIDS、および造影剤を含む腎毒性薬物への暴露とが挙げられている。感染、敗血症、ショック、機械換気の必要性、および心臓手術は、AKIの発症に対する高リスクの環境としてよく認識されている。AKIに対する主な懸案事項は、CKDの発症を含む有害転帰との関連性である。いくつかの研究は、AKIからの非回復は、死亡率の上昇、機能状態の低下、および資源利用の増加を含む悪化した転帰と関連していることを示している。最近の証拠から、障害の潜在重症度およびAKIの期間は、AKIからの転帰を決定する重要な因子であることが示唆されている。例えば、Ishaniらは、退役軍人病院からの29,388人の心臓手術後患者を、血清クレアチニンのベースラインからの増加を基に分類した。彼らは、SCr分類に亘って、発生CKDのハザード比、CKDステージの進行、および長期間の死亡率において段階的な増加があることを示し、血清クレアチニンにおけるデルタの増加には、CKD発症の漸進的リスクがあることを示した。
定する。
対するバイオマーカー、およびAKIからの自然回復を予測するバイオマーカーをスクリーニングし、発見した。
ープロセッサおよび関連の自動機械によって制御される方法によって、RNAを単離する。一実施形態において、尿などの生体サンプルを収集し、サンプル処理ユニットに置かれている受け容器にロードする。ユーザーは、サンプルの同一性、サンプルの量、および/または特定の患者の特性に関する情報をデータ入力レシーバーに入れる。いくつかの実施形態において、ユーザーは、データを入れるために、グラフィカル・ユーザー・インターフェースを用いる。他の実施形態において、データ入力は自動化されている(例えば、バーコード、QRコード、またはその他のグラフィカルな識別子による入力)。次に、ユーザーは、RNA単離プロトコルを実行することができ、このプロトコルでは、コンピューターは、アルゴリズムにアクセスし、サンプルを処理する関連の機能を実行して、小胞などの生体成分を単離し、続いて小胞を処理してRNAを遊離させるように構成されている。他の実施形態において、コンピューターが実行するプログラムは、単離したRNA量の定量化および/または評価および純度ができる。このような実施形態において、量および/または純度が最小閾値を超える場合には、cDNAを生成するために、RNAを自動化された方法でさらに処理することができる。次に、例えば、ポリA RNAテールをオリゴdT分子に結合し、その後RNAポリメラーゼを使用して伸長させるなどして、cDNAを生成できる。他の実施形態において、量および/または純度が最小閾値を超えることができない場合には、コンピューターが実行するプログラムは、追加の生体サンプルを与えるようユーザーを促すことができる。
ピューターに入力し、その後、検査が実行するように指示するように、誘導し得る。全検査が完了した後、コンピューターソフトウェアは、アッセイ装置から受け取った生のデータに基づいて検査結果を自動的に計算し得る。コンピューターは、結果を処理することにより、いくつかの実施形態においては、保存されているデータライブラリーから、またはインターネットもしくはコンピューターに追加情報を供給する他の手段による他の源からのコントロール情報と結果を比較することにより、追加のデータを計算し得る。次に、コンピューターは、これらの結果に基づき、患者(および/または医療機関、および/または検査機関)に出力を表示し得る。
形態において、方法は、サンプルを遠心分離して、細胞残屑を除去すること、および遠心分離した尿の上清をろ過することをさらに含む。一実施形態において、小胞を単離する前に、遠心分離を行う。いくつかの実施形態において、小胞の濃縮は、遠心分離した尿の上清をろ過することをさらに含む。
、「対象の疾患または状態の治療の実施を指示すること」を含む。
一般
医師の診断は、通常、患者の病歴および現在の症候に基づく。基礎疾患の徴候を明らか
にし得る身体検査に加えて、初期診断を確定するために、診断検査が指示されることがある。腎機能の評価は、尿を作る器官の機能として、診断解析に特有の状況を表し、その結果の組成は、血液中の化合物の濃度変化が反映されている。従って、2つの体液、尿および/または血液を用いて、腎機能を評価することができる。
最近の研究は、様々な細胞が、血液、尿、唾液、母乳などの近くの生体液にEMVを放出することを示している。エクソサイトーシス過程中、様々なタンパク質、mRNA、およびmiRNAがEMV中に含まれる。裸のmRNAは直ちに消化され、内在性リボヌクレアーゼの存在により検出不可能になるが、mRNAは、EMV膜内部に閉じ込められることにより、EMV中に安定に存在する。血漿および尿から抽出されるEMV中の様々なmRNAは、RT‐qPCRによって定量化されている。
かの実施形態において、新しい診断用バイオマーカーは、単一遺伝子である。他の実施形態において、新しい診断用バイオマーカーは、複数の遺伝子のプロファイルである。新しいバイオマーカープロファイルは、障害が顕著になる前に、臓器機能不全の診断を可能にし得る。いくつかの実施形態において、新しい診断用バイオマーカーは、より早期の検出、または転帰のより正確な予測を可能にすることによって、疾患の治療を支援する。代替的または追加的に、バイオマーカープロファイルは、治療レジメンに関する臨床的判断を誘導し得る。尿などの体液中に存在するバイオマーカーの使用は、診断法の侵襲性を最小化し、モニタリングにより患者の治療遵守を向上させ得る。好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン(NGAL)または腎障害分子‐1(KIM‐1)などのバイオマーカーは、障害の発生機序を明らかにすることに限界がある。従って、腎臓損傷の原因となっている根底にある経路をより良く明らかにし、転帰をより良く予測し、治療レジメンの選択をより良く誘導する、新しいAKIバイオマーカーを発見することに対する必要性が存在する。
かの実施形態において、体液サンプルのmRNAプロファイルをqPCRを使用して定量化する。少なくとも1つの実施形態において、mRNAプロファイルをqPCRを使用して特徴づけて、多数の目的遺伝子の発現レベルを定量化する。少なくとも1つの実施形態において、mRNAプロファイルをqPCRを使用して特徴づけて、単一の目的遺伝子の発現レベルを定量化する。いくつかの実施形態において、qPCRによるmRNA定量値をGAPDHレベルに規格化する。いくつかの実施形態において、RNAを特徴づけるステップは、1〜1000の遺伝子、1〜500の遺伝子、1〜200の遺伝子、1〜100の遺伝子、1〜50の遺伝子、または1〜20の遺伝子の発現を定量化することを含む。
ル化、ヒドロキシル化、ヨウ素化、アデニル化、リン酸化、硫酸化、およびセレノイル化、ユビキチン化が挙げられ得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、小胞マーカーは、脂質、炭水化物、核酸、RNA、DNAなど非タンパク質を含む。
よっても達成され得る。また、その他の方法を使用して核酸を定量化してもよく、例えば、ノーザンブロット分析、RNアーゼプロテクションアッセイ、RNAシークエンシング、RT‐PCR、リアルタイムRT‐PCR、塩基配列に基づく増幅、分岐DNA増幅、ELISA、質量分析、CHIPシークエンシング、およびDNAまたはRNAマイクロアレイ分析が挙げられる。
補的なDNA鎖の合成を始動させ、第2のプライマーが、目的の塩基配列の第2の鎖のある領域に相補的な配列を含み、相補的なDNA鎖の合成を始動させ、かつ、各オリゴヌクレオチドプライマーが、同じ核酸鎖とアニーリングする任意の標識オリゴヌクレオチドの上流の相補的鋳型とアニーリングするように選択されること、(c)(i)プライマーお
よび標識オリゴヌクレオチドを目的領域内に含まれる鋳型塩基配列にアニーリングさせるステップ、および(ii)プライマーを伸長させるステップを含むPCRサイクルに許容的な条件下で、5’〜3’ヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼを鋳型依存性重合剤として用いて、目的の塩基配列を増幅することであって、前記核酸ポリメラーゼが、プライマー伸長生成物を合成する一方で、核酸ポリメラーゼの5’〜3’ヌクレアーゼ活性が、標識オリゴヌクレオチドおよびその相補的鋳型塩基配列を含むアニーリングされた二本鎖から標識断片を同時に放出し、それによって検出可能な標識断片を生成すること、ならびに(d)標識断片の放出を検出および/または測定して、サンプル中の目的配列の有無を判定することを含む。
Yo色素である。
、および蛍光性部位の蛍光を消光することが可能であるTAMRAなどの消光性部位を含み、消光性部位は、プライマーの3’末端で1つ以上のヌクレオチド塩基と共有結合している。3’末端では、プライマーは、1つ以上のミスマッチ塩基を有し、従って、ミスマッチ塩基では核酸サンプルとの相補性がない。鋳型塩基配列をPCRによりPfu酵素などの3’〜5’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを用いて増幅して、PCR生成物を製造する。消光性部位に結合しているミスマッチ塩基を、3’〜5’エキソヌクレアーゼ活性により、PCR生成物の3’末端から切り出す。共有結合している消光性部
位を有するミスマッチ部位がポリメラーゼにより切断され、それによって蛍光性部位に対する消光効果を取り除いたときに生じる蛍光を、PCR中の1つ以上の時点で、検出および/または定量化する。このようにして生じる蛍光は、合成された核酸サンプルの存在を示す。
の実施形態において、個体のmRNA発現の平均および分散は、第1および第2の時点のそれぞれで、3回以上サンプルを分析することにより求められる。
の検出量により表される)mRNAを定量化する。特定の実施形態において、定量値を、1つ以上のAKIマーカーをコードするmRNAの量と基準値とを比較することにより計算する。いくつかの実施形態において、基準値は、AKIで誘発されない遺伝子、例えばハウスキーピング遺伝子の発現レベルである。特定の実施形態において、ベータ‐アクチンを基準値として用いる。当業で周知の多数のその他のハウスキーピング遺伝子も、基準値として用い得る。他の実施形態において、ハウスキーピング遺伝子を補正因子として使用し、それにより、最終的な比較を、1つ以上のAKIマーカーの、非AKI(コントロール)個体のプールからの同じマーカーと比べて、誘発された、またはダウンレギュレーションされた発現とする。さらなる他の実施形態において、基準値はゼロであり、1つ以上のAKIマーカーの定量値は、絶対数により表される。
ータ表22と比較して、臨床医に患者の診断または治療に関して報告する。
一部の実施形態によると、本明細書に記載の方法を、1つ以上の専用コンピューティング装置により実行できる。専用コンピューティング装置は、技術を実行するためにハードワイヤードであり得、または技術を実行するように永続的にプログラムされている1つ以上の特定用途向け集積回路(ASIC)もしくはフィールド・プログラマブル・ゲート・アレイ(FPGA)などのデジタル電子装置を含み得、またはファームウェア、メモリ、その他のストレージ、もしくはそれらの組み合わせにあるプログラムインストラクションに従って技術を実行するようにプログラムされた1つ以上の汎用ハードウェアプロセッサを含み得る。また、このような専用コンピューティング装置は、カスタム・ハードワイヤードロジック、ASIC、またはFPGAとカスタム・プログラミングとを組み合わせて、技術を達成し得る。専用コンピューティング装置は、デスクトップコンピューターシステム、サーバーコンピューターシステム、ポータブルコンピューターシステム、ハンドヘルド装置、ネットワーク装置、もしくは任意のその他の装置、または技術を実行するようにハードワイヤードおよび/またはプログラムロジックを組み込む装置の組み合わせであり得る。
にアクセス可能な記憶媒体に保存されているとき、コンピューターシステムを、命令に定められているオペレーションを実行するようにカスタマイズされた専用機器にする。
どのプログラム可能なユニットからなっていることがあり得ることがさらに理解されるであろう。本明細書に記載のモジュールまたはコンピューティング装置機能は、ソフトウェアモジュールとして実装されることが好ましいが、ハードウェアまたはファームウェアで表され得る。一般的に、本明細書に記載のモジュールは、その物理編成または記憶に関わらず、他のモジュールと組み合わせられ得るか、またはサブモジュールに分割され得るロジカルモジュールを意味する。
サンプル集団
尿サンプルを、様々な臨床環境にある、AKIを有する、および有しない63人の患者、ならびに11人の健康者コントロールから得た(表1)。以下の3つのハイリスク患者群:(門脈圧亢進および腹水の所見のある代償性および非代償性の)肝硬変を有する患者、心臓手術後の患者、ならびにICUに入れられた重症患者、からのインフォームドコンセントを有する患者を募集した。各カテゴリーにおいて、患者を、その経過に基づいて、AKIおよび非Aki群に階層化した。AKIを発症した患者では、AKIの前、間、および後の尿サンプルを得た。尿サンプルを収集し、分析まで−80℃で保存した。KDIGO基準により、AKIを、48時間以内の>0.3mg/dlの血清クレアチニン(sCr)の上昇、またはベースレインsCrに比して50%の増加として定義した。回復を、上昇したsCrが基準の15%以内へ復帰することとして定義した。
尿中EMVのmRNA解析
尿中EMVのmRNA解析を、AKI群、非AKI群、および健康者コントロール群からの尿サンプルで実施して、AKI発症に特異的な発現プロファイルを決定した。尿サンプルを15分間、800×gで遠心分離して、尿中の細胞および尿円柱などの大粒子を最初に除去した。尿上清を収集し、1/4の体積の25×PBSとpH7.4で混合した。EMVを含む12.5mLの混合物(10mLの尿上清)を、エキソソーム収集管(カリフォルニア州マウンテンビューのHitachi Chemical Diagnostics, Inc.(HCD))に入れ、10分間、2,000×gで遠心分離した。80μLの溶解バッファーをフィルターに加え、フィルター中に捕捉したEMVを溶解した。次に、溶解物を遠心分離よってオリゴ(dT)固定化マイクロプレートに移し、mRNAハイブリダイゼーションのために、4℃で一夜インキュベーションした。洗浄バッファーで6回洗浄後、1.25mMの各dNTP、2.7U/μLのMMLV逆転写酵素、および0.13U/μLのRNasinを含有する30μLの1×逆転写酵素バッファーを加えることによって、cDNAを同じマイクロプレートで合成し、37℃で2時間インキュベートした。リアルタイムPCRを、ABI 7900HTまたはViiA7リアルタイムPCRシステム(カリフォルニア州カールスバッドのライフテクノロジーズ)を使用して、1×SsoAdvanced SYBR Green Supermixおよび500nMの各プライマーペアを含む5μLの反応液中で実施した。温度プロファイルは、10分間の95℃での最初の変性、その後に95℃で30秒間と65℃で1分間とが40サイクル、次いで、融解曲線解析であった。リアルタイムPCRデータを、測定器制御ソフトウェアおよびExcel 2007(ワシントン州レドモンドのマイクロソフト)およびR(R Foundation)により分析した。サンプル当りの遺伝子コピー数を、基準曲線およびオリゴ(dT)マイクロプレートによる10%の推定mRNA回収率を使用して、サイクル閾値を遺伝子コピー数に変換することによって得た。64のmRNAをqPCRによって定量化し、得られたmRNAデータを、デルタCt法を使用して、GAPDHにより規格化した(図1A〜1D)。統計的優位性を、マン・ホイットニー・ウィルコクソン検定により、p値<0.05で判定した。
統計解析
AKI発症およびAKIからの自然回復を診断するための分類方式を開発するために、ロジスティック回帰分析を用いた。最初に、我々は、1〜4つの遺伝子の可能な組み合わせ全て(合計で679,120の組み合わせ)を分析した。各遺伝子の組み合わせについて、曲線下面積(AUC)を、10分割クロスバリデーションを10回繰り返すことにより計算した。遺伝子の組み合わせを平均AUCによってランク付けし、上位500の組み合わせを大規模計算用に選択し、各遺伝子の組み合わせに対する平均AUCを、10分割クロスバリデーションを100回繰り返すことにより得た。計算をRを使用して実施し、AUCの計算を「ROCR」パッケージ4により行った。
AKI発症に対するEMV mRNAマーカー
AKI発症マーカーの診断能をROC曲線によって分析した。EMV mRNAプロファイルを、以下の3つの群:AKI、非AKI,および健康者コントロール間で比較した。AKI群中の前、間、前および間、または後サブ群を、非AKI群と比較し、各AUCを求めた(表2)。同定した特異的に発現される遺伝子は、CALB1、CALM1、CFLAR、EGF、GSTA1、HIF1A、IL18、PKM、PPIA、RIPK1、およびSLC12A1であった(図1A〜1D)。これらの遺伝子の中で、特にCALM1、CFLAR、GSTA1、HIF1A、およびSLC12A1が、AKI群と非AKI群との間で特異的に発現されたので、他の患者からAKI患者を特定するためのAK
I発症のバイオマーカーとして使用できる。これらの遺伝子の診断能を、ROC曲線の曲線下面積(AUC)(図2A〜2F)により推定し、表2に要約した。表2は、これらの遺伝子がAKI発症の可述的(predicative)診断用マーカーであることを示している。
AKI進行に対するEMV mRNAマーカー
AKI患者における尿中EMV mRNA発現プロファイルを、AKI進行をモニタリングするためのマーカーを発見するために、前、間、および後サブ群間でさらに比較した。これらのサブ群を、AKI発症の時点に対するサンプリング時点によって判定した。この比較において、AQP2、CFLAR、CST3、IL1B、LGALS3、MYD88、NLRP3、RAC2、およびTNFRSF1Aを、特異的に発現される遺伝子として同定した(図4A〜4D)。AQP2、CST3、およびLGALS3は、経時的傾向を示したので、これらの遺伝子は、AKI進行をモニタリングするために使用できる。
AKI回復に対するEMV mRNAマーカー
AKIを発症する一部の患者は、医療介入なしに自然回復する。AKI回復を検出するマーカーを発見するために、尿中EMV mRNAプロファイルを、AKI群中の回復および非回復サブ群間で比較した。AKI回復マーカーの診断能をROC曲線によって分析した。前、間、前および間、または後サブ群において、回復群を非回復群と比較した。64の遺伝子の中で、ALB、AQP1、APQ2、B2M、CST3、CXCL1、CXCL3、IL1B、LGALS3、LGALS3BP、MYD88、PKM、RAC2、S100A9、SLC12A1、TNFRSF1A、およびVCAM1は、群の中で特異的に発現されたので、これらの遺伝子は、AKI回復を検出する有望なバイオマーカーである(図5A〜5D)。特に、VCAM1、AQP1、B2M、CLU、AQP2、およびIL1Bは、高い特異度および感度で、AKIから自然回復する患者を自然回復しない患者と区別できるので、これらの遺伝子は、上記の遺伝子の中で最も有望なバイオマーカーであった(図5A〜5D)。これらの遺伝子の診断能を、ROC曲線の曲線下面積(AUC)(図6A〜6F)により推定し、表4に要約した。表4は、これらの遺伝子がAKI回復の可述的(predicative)診断用マーカーであることを示している。
はない。様々な修正および応用が、添付の番号を付けた項において定義される発明の真の精神および範囲から逸脱することなく、当業者に想起され得る。
は「得る(may)」などは、別段の定めがない限り、その反対で使用される文脈の中で理
解される場合、通常、特定の特徴、要素、および/またはステップを特定の実施形態が含み、一方で他の実施形態が含まないことを伝えることが意図されている。従って、このような条件的な言葉は、特徴、要素、および/またはステップが、1つ以上の実施形態にとにかく必要であることを含蓄することを通常意図していない。
。一実施形態において、尿などの生体サンプルを収集し、サンプル処理ユニットに置かれている受け容器にロードする。ユーザーは、サンプルの同一性、サンプルの量、および/または特定の患者の特性に関する情報をデータ入力レシーバーに入れる。いくつかの実施形態において、ユーザーは、データを入れるために、グラフィカル・ユーザー・インターフェースを用いる。他の実施形態において、データ入力は自動化されている(例えば、バーコード、QRコード、またはその他のグラフィカルな識別子による入力)。次に、ユーザーは、RNA単離プロトコルを実行することができ、このプロトコルでは、コンピューターは、アルゴリズムにアクセスし、サンプルを処理する関連の機能を実行して、小胞などの生体成分を単離し、続いて小胞を処理してRNAを遊離させるように構成されている。他の実施形態において、コンピューターが実行するプログラムは、単離したRNA量の定量化および/または評価および純度の評価ができる。このような実施形態において、量および/または純度が最小閾値を超える場合には、cDNAを生成するために、RNAを自動化された方法でさらに処理することができる。次に、例えば、ポリA RNAテールをオリゴdT分子に結合し、その後RNAポリメラーゼを使用して伸長させるなどして、cDNAを生成できる。他の実施形態において、量および/または純度が最小閾値を超えることができない場合には、コンピューターが実行するプログラムは、追加の生体サンプルを与えるようユーザーを促すことができる。
Claims (42)
- ヒト対象における急性腎障害(AKI)の治療法であって、
(A)前記ヒト対象から得られた小胞含有サンプルを研究所に送り、以下のステップ(1)〜(3):
(1)前記サンプルからの少なくとも一部の小胞を小胞捕捉材料上または中に捕捉し、それによって小胞サンプルを生成すること;
(2)前記小胞サンプル中の1つ以上の遺伝子の発現レベルを定量化することであって、前記1つ以上の遺伝子が、CALM1、SLC12A1、CFLAR、GSTA1、HIF1A、およびALBからなる群から選択されること;
(3)前記1つ以上の遺伝子の各々の前記発現レベルが、前記AKIに罹患していない健康ヒトコントロール対象の小胞サンプル中の各遺伝子の発現レベルと有意に異なっていることにより、前記対象が前記IBDを有すると判定し、それによって前記対象をAKIを有すると診断すること
を含むアッセイを前記研究所が行うこと;ならびに
(B)有効量のAKI薬剤を、前記AKIを有するヒト対象に投与することであって、前記AKI薬剤が、利尿薬、静脈内輸液、ステロイド系薬剤、血漿交換、およびシクロホスファミドからなる群から選択され、それによって前記ヒト対象において前記AKIを治療すること
を含む、方法。 - 前記小胞含有サンプルが尿サンプルである、請求項1に記載の方法。
- 捕捉が、ガラス繊維を含むフィルターに前記小胞含有サンプルを通すことを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記小胞捕捉材料上または中の前記小胞サンプルを溶解することをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記小胞サンプル中の1つ以上の遺伝子の発現レベルの定量化が、3つの遺伝子の前記発現レベルの定量化を含む、請求項1に記載の方法。
- 捕捉が、
前記体液サンプルを受け取ること、および
捕捉した小胞集団を小胞捕捉材料内に取り込むように構成されている前記小胞捕捉材料に前記体液サンプルを通すこと
をさらに含む、請求項1に記載の方法。 - 定量化が、
前記小胞捕捉材料と前記捕捉した小胞集団とを、固定化オリゴ(dT)を含む基質の近傍に置くこと;
溶解バッファーを前記小胞捕捉材料に加え、それによって前記捕捉した小胞集団を溶解すること;
前記捕捉した小胞集団からの1つ以上のmRNAを前記基質とハイブリダイズさせること;
前記1つ以上のmRNAから1つ以上のcDNAを前記基質上で直接合成すること;および
前記1つ以上のcDNAのPCR分析によって、前記捕捉した小胞集団中のマーカーmRNAの発現レベルを定量化すること
を含む、請求項6に記載の方法。 - 受け取ることが、医療専門家から前記体液サンプルを受け取ることを含む、請求項6に記載の方法。
- 前記小胞捕捉材料がガラス繊維を含む、請求項7に記載の方法。
- 通すことが、チップに取り外し可能に取り付けられたローディングリザーバを含む装置に前記体液サンプルをロードすることを含み、前記小胞捕捉材料が前記チップ内に収容される、請求項9に記載の方法。
- 判定が、
前記1つ以上の遺伝子のうち2つ以上の発現レベルを合計することにより遺伝子分類指標を判定すること;および
前記遺伝子分類指標が前記AKIに罹患していない健康ヒトコントロール対象の小胞サンプル中の各遺伝子分類指標と有意に異なっているかどうかを判定すること
をさらに含む、請求項1に記載の方法。 - 前記遺伝子分類指標が、少なくともCALB1およびCALM1の発現レベルを含む、請求項11に記載の方法。
- 前記遺伝子分類指標が、GAPDHの発現レベルをさらに含む、請求項12に記載の方法。
- 尿サンプルの小胞中の1つ以上のmRNAの発現レベルを定量化するためのアッセイであって、
前記尿サンプルを小胞捕捉材料に通すことによって、前記尿サンプルからの前記小胞を前記小胞捕捉材料上に捕捉すること;
前記小胞を前記小胞捕捉材料上で溶解し、それによって溶解物を生成すること;
前記溶解物を前記小胞捕捉材料から固定化オリゴ(dT)を含む基質に送ること;
前記溶解物からの前記1つ以上のmRNAを前記基質とハイブリダイズさせること;
前記基質とハイブリダイズした前記mRNAからcDNAを前記基質上で直接合成すること;および
前記cDNAをリアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応に使用し、それによって前記尿サンプルの前記小胞中の前記1つ以上のmRNAの発現レベルを定量化すること
を含む、アッセイ。 - 生体液を収集し、急性腎障害(AKI)の発症のバイオマーカーを同定する方法であって、
ヒト対象から尿を得ること;
膜粒子、細胞、エキソソーム、エキソソーム様小胞、および微小胞のうち1つ以上を前記尿から単離し、それによって小胞サンプルを生成すること;ならびに
CALB1、CALM1、CFLAR、EGF、GSTA1、HIF1A、IL18、PKM、PPIA、RIPK1、およびSLC12A1からなる群から選択される1つ以上の遺伝子からなるバイオマーカーの発現を、
(a)前記小胞サンプルからRNAを遊離させること;
(b)遊離したRNAを逆転写酵素と接触させて、相補DNA(cDNA)を生成すること;ならびに
(c)前記cDNAを、AKIのバイオマーカーに特異的なセンスおよびアンチセンスプライマーならびにDNAポリメラーゼと接触させて、増幅DNAを生成すること
を含む方法により検出すること
を含む、方法。 - 膜粒子、細胞、エキソソーム、エキソソーム様小胞、および微小胞のうち1つ以上を前記尿から単離することが、前記尿を小胞捕捉材料に通すことを含む、請求項15に記載の方法。
- 前記小胞捕捉材料が、ガラス繊維を含むフィルターを含む、請求項16に記載の方法。
- 前記小胞サンプルからRNAを遊離させることが、前記小胞捕捉材料上または中の前記小胞サンプルを溶解することを含む、請求項16に記載の方法。
- 前記1つ以上の遺伝子のうち3つ以上の発現を検出すること、および前記3つ以上の遺伝子の発現レベルを合計することによって遺伝子分類指標を作成することをさらに含む、請求項15に記載の方法。
- 前記遺伝子分類指標を作成することが、CALB1、CALM1、およびGAPDHの発現レベルを合計することを含む、請求項19に記載の方法。
- 生体液を収集し、急性腎障害(AKI)からの回復のバイオマーカーを同定する方法であって、
ヒト対象から尿を得ること;
膜粒子、細胞、エキソソーム、エキソソーム様小胞、および微小胞のうち1つ以上を前記尿から単離し、それによって小胞サンプルを生成すること;ならびに
ALB、AQP1、APQ2、B2M、CST3、CXCL1、CXCL3、IL1B、LGALS3、LGALS3BP、MYD88、PKM、RAC2、S100A9、SLC12A1、TNFRSF1A、およびVCAM1からなる群から選択される1つ以上の遺伝子からなるバイオマーカーの発現を、
(a)前記小胞サンプルからRNAを遊離させること;
(b)遊離したRNAを逆転写酵素と接触させて、相補DNA(cDNA)を生成すること;ならびに
(c)前記cDNAを、AKIからの回復のバイオマーカーに特異的なセンスおよびアンチセンスプライマーならびにDNAポリメラーゼと接触させて、増幅DNAを生成することを含む方法により検出すること
を含む、方法。 - 膜粒子、細胞、エキソソーム、エキソソーム様小胞、および微小胞のうち1つ以上を前記尿から単離することが、前記尿を小胞捕捉材料に通すことを含む、請求項21に記載の方法。
- 前記小胞捕捉材料が、ガラス繊維を含むフィルターを含む、請求項22に記載の方法。
- 前記小胞サンプルからRNAを遊離させることが、前記小胞捕捉材料上または中の前記小胞サンプルを溶解することを含む、請求項22に記載の方法。
- 前記1つ以上の遺伝子のうち3つ以上の発現を検出すること、および前記3つ以上の遺伝子の発現レベルを合計することによって遺伝子分類指標を作成することをさらに含む、請求項21に記載の方法。
- 前記遺伝子分類指標を作成することが、AQP1およびVCAM1の発現レベルを合計することを含む、請求項25に記載の方法。
- 生体液を収集し、急性腎障害(AKI)の進行のバイオマーカーを同定する方法であって、
ヒト対象から尿を得ること;
膜粒子、細胞、エキソソーム、エキソソーム様小胞、および微小胞のうち1つ以上を前記尿から単離し、それによって小胞サンプルを生成すること;ならびに
AQP2、CFLAR、CST3、IL1B、LGALS3、MYD88、NLRP3、RAC2、およびTNFRSF1Aからなる群から選択される1つ以上の遺伝子からなるバイオマーカーの発現を、
(a)前記小胞サンプルからRNAを遊離させること;
(b)遊離したRNAを逆転写酵素と接触させて、相補DNA(cDNA)を生成すること;ならびに
(c)前記cDNAを、AKIの進行のバイオマーカーに特異的なセンスおよびアンチセンスプライマーならびにDNAポリメラーゼと接触させて、増幅DNAを生成すること
を含む方法により検出すること
を含む、方法。 - 膜粒子、細胞、エキソソーム、エキソソーム様小胞、および微小胞のうち1つ以上を前記尿から単離することが、前記尿を小胞捕捉材料に通すことを含む、請求項27に記載の方法。
- 前記小胞捕捉材料が、ガラス繊維を含むフィルターを含む、請求項28に記載の方法。
- 前記小胞サンプルからRNAを遊離させることが、前記小胞捕捉材料上または中の前記小胞サンプルを溶解することを含む、請求項28に記載の方法。
- 前記1つ以上の遺伝子のうち3つ以上の発現を検出すること、および前記3つ以上の遺伝子の発現レベルを合計することによって遺伝子分類指標を作成することをさらに含む、請求項27に記載の方法。
- 前記遺伝子分類指標を作成することが、AQP2、CST3、およびLGALS3の発現レベルを合計することを含む、請求項31に記載の方法。
- 急性腎障害(AKI)を有する対象の生体サンプルからエキソソームを収集して、前記対象がAKIから回復するかどうかを予測する方法であって、
前記対象から前記生体サンプルを得ること;
前記生体サンプルを小胞捕捉材料に通し、それによって小胞サンプルを生成すること;
核酸ベースの検出アッセイを実施して、前記小胞サンプル中の1つ以上の遺伝子のmRNAの発現レベルを検出することであって、前記1つ以上の遺伝子の各々が、ALB、AQP1、APQ2、B2M、CST3、CXCL1、CXCL3、IL1B、LGALS3、LGALS3BP、MYD88、PKM、RAC2、S100A9、SLC12A1、TNFRSF1A、およびVCAM1からなる群から選択されること;
前記対象の前記1つ以上の遺伝子の前記mRNAの発現レベルと事前に測定した標準のレベルとを比較して、前記標準に対する前記対象における前記1つ以上の遺伝子の過剰発現または過少発現のレベルを判定すること;ならびに
前記対象がAKIから回復するかどうかを判定することであって、前記1つ以上の遺伝子の過剰発現または過少発現が、前記対象がAKIから回復することを示すこと
を含む、方法。 - ヒト対象における急性腎障害(AKI)の診断および治療のための方法であって、
前記ヒト対象の小胞を含む生体液サンプルを小胞捕捉材料に通し、それによって小胞サンプルを生成すること;
核酸ベースの検出アッセイを実施して、前記小胞サンプル中の1つ以上の遺伝子のmRNAの発現レベルを検出することであって、前記1つ以上の遺伝子が、ALB、AQP1、APQ2、B2M、CST3、CXCL1、CXCL3、IL1B、LGALS3、LGALS3BP、MYD88、PKM、RAC2、S100A9、SLC12A1、TNFRSF1A、およびVCAM1からなる群から選択されること;
前記小胞サンプルが、前記AKIに罹患していない健康ヒトコントロール対象の小胞サンプル中の各遺伝子の発現レベルと有意に異なるレベルで、前記1つ以上の遺伝子を発現することを判定し、それによって前記ヒト対象をAKIを有すると診断すること;
前記AKIに罹患していない健康ヒトコントロール対象の小胞サンプル中の各遺伝子の発現レベルと有意に異なるレベルで、前記1つ以上の遺伝子を発現する前記ヒト対象への静脈内輸液または利尿薬の投与に関する勧告を与え、それによって前記ヒト対象においてAKIを治療すること
を含む、方法。 - 前記生体液が尿である、請求項34に記載の方法。
- 前記小胞捕捉材料がガラス繊維を含む、請求項34に記載の方法。
- 前記小胞捕捉材料上または中の前記小胞サンプルを溶解することをさらに含む、請求項34に記載の方法。
- 急性腎障害(AKI)を有する対象の生体サンプルからエキソソームを収集して、前記AKIの進行をモニタリングする方法であって、
第1の時点で、前記対象から第1の生体サンプルを得ること;
第2の時点で、前記対象から第2の生体サンプルを得ることであって、前記第2の時点が、前記第1の時点から数時間後、数日後、または数週間後であること;
前記第1および第2の生体サンプルを小胞捕捉材料に通し、それによって第1および第2の小胞サンプルを生成すること;
核酸ベースの検出アッセイを実施して、前記第1および第2の小胞サンプル中の1つ以上の遺伝子のmRNAの発現レベルを検出することであって、前記1つ以上の遺伝子の各々が、AQP2、CFLAR、CST3、IL1B、LGALS3、MYD88、NLRP3、RAC2、およびTNFRSF1Aからなる群から選択されること;
前記1つ以上の遺伝子のうち3つ以上の第1の小胞サンプル中の発現レベルを合計することによって、第1の遺伝子分類指標を作成すること;
前記1つ以上の遺伝子のうち3つ以上の第2の小胞サンプル中の発現レベルを合計することによって、第2の遺伝子分類指標を作成すること;
第1の遺伝子分類指標と第2の遺伝子分類指標とを比較すること;ならびに
前記対象の前記AKIが進行しているかどうかを判定することであって、前記AKIの進行が、前記第2の遺伝子分類指標が前記第1の遺伝子分類指標よりも大きいAKIの進行度を示すことによって示されること
を含む、方法。 - 急性腎障害(AKI)を有する対象の生体サンプルからエキソソームを収集して、前記AKIの回復をモニタリングする方法であって、
第1の時点で、前記対象から第1の生体サンプルを得ること;
第2の時点で、前記対象から第2の生体サンプルを得ることであって、前記第2の時点が、前記第1の時点から数時間後、数日後、または数週間後であること;
前記第1および第2の生体サンプルを小胞捕捉材料に通し、それによって第1および第2の小胞サンプルを生成すること;
核酸ベースの検出アッセイを実施して、前記第1および第2の小胞サンプル中の1つ以上の遺伝子のmRNAの発現レベルを検出することであって、前記1つ以上の遺伝子の各々が、ALB、AQP1、APQ2、B2M、CST3、CXCL1、CXCL3、IL1B、LGALS3、LGALS3BP、MYD88、PKM、RAC2、S100A9、SLC12A1、TNFRSF1A、およびVCAM1からなる群から選択されること;
前記1つ以上の遺伝子のうち3つ以上の第1の小胞サンプル中の発現レベルを合計することによって、第1の遺伝子分類指標を作成すること;
前記1つ以上の遺伝子のうち3つ以上の第2の小胞サンプル中の発現レベルを合計することによって、第2の遺伝子分類指標を作成すること;
第1の遺伝子分類指標と第2の遺伝子分類指標とを比較すること;および
前記対象が前記AKIから回復しているかどうかを判定することであって、前記AKIの回復が、前記第2の遺伝子分類指標が前記第1の遺伝子分類指標よりも大きいAKIの回復度を示すことによって示されること
を含む、方法。 - 急性腎障害(AKI)の症候を示す対象におけるALIの重症度の予測を与えるための方法であって、
前記対象から生体サンプルを得ること;
前記生体サンプルを小胞捕捉材料に通し、それによって小胞サンプルを生成すること;
核酸ベースの検出アッセイを実施して、前記小胞サンプル中の1つ以上の遺伝子のmRNAの発現レベルを検出することであって、前記1つ以上の遺伝子の各々が、CALB1、CALM1、CFLAR、EGF、GSTA1、HIF1A、IL18、PKM、PPIA、RIPK1、およびSLC12A1からなる群から選択されること;
前記対象の前記1つ以上の遺伝子の前記mRNAの発現レベルと事前に測定した標準のレベルとを比較して、前記標準に対する前記対象における前記1つ以上の遺伝子の過剰発現または過少発現のレベルを判定すること;および
前記対象における前記AKIの重症度を判定することであって、前記1つ以上の遺伝子の前記過剰発現または過少発現のレベルが、前記対象における前記AKIの重症度を示すこと
を含む、方法。 - ヒト対象における急性腎障害(AKI)の診断および治療のための方法であって、
前記ヒト対象の小胞を含む腔内液サンプルを小胞捕捉材料に通し、それによって小胞サンプルを生成すること;
核酸ベースの検出アッセイを実施して、前記小胞サンプル中の1つ以上の遺伝子のmRNAの発現レベルを検出することであって、前記1つ以上の遺伝子が、CALB1、CALM1、CFLAR、EGF、GSTA1、HIF1A、IL18、PKM、PPIA、RIPK1、およびSLC12A1からなる群から選択されること;
前記小胞サンプルが、前記AKIに罹患していない健康ヒトコントロール対象の小胞サンプル中の各遺伝子の発現レベルと有意に異なるレベルで、前記1つ以上の遺伝子を発現することを判定し、それによって前記ヒト対象をAKIを有すると診断すること;
前記AKIに罹患していない健康ヒトコントロール対象の小胞サンプル中の各遺伝子の発現レベルと有意に異なるレベルで、前記1つ以上の遺伝子を発現する前記ヒト対象への有効量の静脈内輸液または利尿薬の投与に関する勧告を与え、それによって前記ヒト対象においてAKIを治療すること
を含む、方法。 - 心臓手術を受けること、肝臓疾患を有すること、および病院の集中治療室に入院することからなる群から選択されるリスク特性を有する対象の急性腎障害(AKI)の予測またはリスク階層化、ならびにこのような対象のモニタリングおよび治療ガイダンスのうち1つ以上のための方法であって、
(a)膜粒子、細胞、エキソソーム、エキソソーム様小胞、および微小胞のうち1つ以上を前記対象の尿から単離し、それによって小胞サンプルを生成すること;ならびに
(b)前記小胞サンプルにおけるCALB1、CALM1、CFLAR、EGF、GSTA1、HIF1A、IL18、PKM、PPIA、RIPK1、およびSLC12A1からなる群から選択される1つ以上の遺伝子の発現レベルを検出および定量化することであって、前記遺伝子の発現レベルを、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応を含む評価方法によって検出および定量化すること、ならびに
(c)前記小胞サンプル中の前記1つ以上の遺伝子の前記発現レベルと、各リスク特性を有する対象におけるAKIの予測もしくはリスク階層化と関連している範囲である、各遺伝子に関する所定の統計的に有意なカットオフ値の範囲とを比較することであって、前記小胞サンプル中の各遺伝子の前記発現レベルが前記カットオフ値の範囲内にある場合、前記対象を、AKIのリスクが増加していると予測または階層化し、前記小胞サンプル中の各遺伝子の前記レベルが前記カットオフ値の範囲外にあるとき、前記対象を、AKIのリスクが増加していないと予測または階層化し、各場合において、AKIの予測またはリスク階層化または両方に従って、モニタリング、治療、またはその両方の必要性を示すこと
を含む、方法。
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