JP2018531041A6 - 腎移植後合併症を評価するための分子法 - Google Patents
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Images
Abstract
本開示は、尿からエキソソームおよび微小胞(EMV)を収集する方法、対応するmRNAを単離する方法、および様々な腎移植後合併症を診断および治療するために発現パターンを解析する方法に関する。特に、アネキシン1 mRNA発現パターンを、固有の診断手法により解析する。
Description
優先出願の参照による援用
海外または国内優先権が本願と共に提出した出願データシート中に確認されるいずれかおよび全ての出願は参照により本明細書に組み入れられ、本開示の一部とする。
海外または国内優先権が本願と共に提出した出願データシート中に確認されるいずれかおよび全ての出願は参照により本明細書に組み入れられ、本開示の一部とする。
技術分野
本明細書に開示した方法およびシステムのいくつかの実施形態は、腎移植後の病状のモニタリングに関する。いくつかの実施形態は、尿試料からのエキソソームおよび微小胞のmRNAプロファイルの特徴付けに関する。
本明細書に開示した方法およびシステムのいくつかの実施形態は、腎移植後の病状のモニタリングに関する。いくつかの実施形態は、尿試料からのエキソソームおよび微小胞のmRNAプロファイルの特徴付けに関する。
腎移植は、末期腎疾患患者にとって最後の手段である。100,000人超の患者が腎移植を待っている(平均待ち時間:3.6年)が、ドナーが限られているために2014年に約17,000件の腎移植しか行われておらず、患者とドナー間のギャップは広がっている。免疫抑制剤の開発は、近年、移植片生着率を著しく改善しているが、急性および慢性拒絶反応を含む移植後合併症は、未だに移植片機能損失及びその後の他の合併症の主要な原因である。
血清クレアチニン、尿クレアチニンおよび尿中タンパクなどの従来の尿バイオマーカーは、これまで移植後合併症を予測するのに充分に感受性および特異性がない。腎生検は、移植片状態を診断および治療方針を決定するための金字塔であったが、その侵襲性および患者にとって経済的負担が原因で、頻繁なモニタリングは理想的な解決策ではない。尿毒症性血小板機能低下症、脈管構造変更および他の因子のせいで抗血小板および抗凝血性薬品を受けている患者にとっては特に、腎生検を適用できないかまたはリスクが大きくなる。従って、腎移植後のモニタリングのための非侵襲性バイオマーカーが望ましい。
本明細書において、いくつかの実施形態では、このようなバイオマーカーの同定、およびこのようなバイオマーカーを使用して腎移植後の患者に対する具体的治療を方向づけるための方法およびシステムを提供する。いくつかの実施形態では、方法はコンピュータ支援のものであり、腎状態の本質的にリアルタイムな決定を可能とする。いくつかの実施形態では、方法は腎状態の決定をもたらすが、いくつかの実施形態では、特定の推奨される治療パラダイムを提供する(例えば、医療専門家がそれに従って行動する)。
特定の態様では、これに限定されないが、対象の腎移植後合併症の存在を検出することを含む方法において様々なRNAを使用することができる。いくつかの実施形態では、方法は、マーカーレベルを検出して急性細胞拒絶反応を首尾良く診断することの他に侵襲的生検前に(例えば、生検が診断を裏付ける20日前まで)拒絶反応を予測することも含む。使用する試料としては、血液、尿、または他の生体試料を挙げることができる。特定の変法では、方法は、患者の尿試料から単離されたエキソソームおよび微小胞中のmRNA発現の定量を含む。いくつかの実施形態では、方法は、対象からの尿試料中のANXA1レベルを検出することを含み、ANXA1は尿エキソソームおよび微小胞中に存在し、少なくとも1つのマーカーのレベル上昇の検出は、対象の腎移植後合併症の存在を示す。いくつかの実施形態では、腎移植後合併症は、急性拒絶反応、慢性拒絶反応、境界域、間質性線維症および尿細管萎縮、免疫グロブリンA(IgA)腎症ならびにカルシニューリン阻害剤(CNI)中毒からなる群から選択される。特定の変法では、方法は、ACTBお
よびGAPDHからなる群から選択される参照遺伝子を検出する工程をさらに含み、前記参照遺伝子を使用して少なくとも1つのマーカーレベルを正規化する。いくつかの実施形態では、上昇したレベルは、腎移植後合併症のないドナーの尿試料中のマーカーレベルと比較して2倍以上高いレベルである。
よびGAPDHからなる群から選択される参照遺伝子を検出する工程をさらに含み、前記参照遺伝子を使用して少なくとも1つのマーカーレベルを正規化する。いくつかの実施形態では、上昇したレベルは、腎移植後合併症のないドナーの尿試料中のマーカーレベルと比較して2倍以上高いレベルである。
いくつかの実施形態では、腎移植後合併症と関連するRNAを発現するヒト対象のスクリーニング方法が開示され、該方法は、該対象からの尿試料から単離された小胞中のRNAの発現を腎移植後合併症のないドナーの尿試料から単離された小胞中のRNAの発現と比較することを含み、腎移植後合併症に関連するRNAがANXA1であり、ドナーのRNAの発現と比較した該対象のRNAの前記発現の増加は、該増加が閾値を超える場合に該対象が腎移植後合併症を有することを示し、尿試料から単離した小胞中のRNAの発現の比較は:対象からの試料を、小胞捕捉フィルターを通過させることにより対象からの試料から小胞を捕捉し、小胞捕捉フィルター上に溶解バッファーをロードすることにより小胞を溶解して小胞関連RNAを遊離し、小胞関連RNA中の腎移植後合併症に関連するRNAの発現をPCRにより定量することをさらに含む。いくつかの変法では、方法は、解析ソフトウェアを用いて腎移植後合併症に関連するRNAのマーカーサイクル閾値(Ct値)を決定すること、解析ソフトウェアを用いて参照RNAの参照Ct値を決定すること、および参照Ct値からマーカーCt値を減算してマーカーΔCt値を得ることをさらに含む。いくつかの変法では、参照RNAは、ACTBおよびGAPDHからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、マーカーΔCt値が6未満である場合、増加は閾値を超える。いくつかの実施形態では、方法は、マーカーΔCt値をコントロールΔCt値と比較することを含み、該コントロールΔCt値をコントロール参照Ct値からコントロールマーカーCt値を減算することにより決定し、該コントロールマーカーCt値は健康なドナー集団の尿小胞中の腎移植後合併症に関連するRNAのCt値であり、該コントロール参照Ct値は健康なドナー集団の尿小胞中の前記参照RNAのCt値である。いくつかの実施形態では、マーカーΔCt値がコントロールΔCt値より少なくとも2小さい場合、増加は閾値を超える。
上記要約し、以下にさらに詳細を記載する方法は、開業医が行う特定の措置を記載しているが、別の当事者により行われるこれらの措置の指示も含み得ると理解すべきである。従って、「疾病または病状のため対象を治療する」などの措置は、「疾病または病状のため対象の治療の管理を指示する」を含む。
様々な実施形態を例証目的のため付属の図に示すが、実施形態の範囲を限定するものと決して解釈すべきではない。さらに、異なる開示された実施形態の様々な特徴を組み合わせてさらなる実施形態を作ることができるが、これは本開示の一部である。
図1Aは、間質性線維症(ci)に関する対象のBanffスコアの関数として該対象の尿中EMV中のアネキシンA1(ANXA1)mRNA発現のプロットを示す。 図1Bは、尿細管萎縮(ct)に関する対象のBanffスコアの関数として該対象の尿中EMV中のANXA1 mRNA発現のプロットを示す。 図1Cは、全間質性炎症(ti)に関する対象のBanffスコアの関数として該対象の尿中EMV中のANXA1 mRNA発現のプロットを示す。
図1Dは、尿細管炎(t)に関する対象のBanffスコアの関数として該対象の尿中EMV中のANXA1 mRNA発現のプロットを示す。 図1Eは、間質の浸潤(i)に関する対象のBanffスコアの関数として該対象の尿中EMV中のANXA1 mRNA発現のプロットを示す。 図1Fは、内膜動脈炎(v)に関する対象のBanffスコアの関数として該対象の尿中EMV中のANXA1 mRNA発現のプロットを示す。
図1Gは、硝子質細動脈肥厚(ah)に関する対象のBanffスコアの関数として該対象の尿中EMV中のANXA1 mRNA発現のプロットを示す。 図1Hは、傍尿細管毛細管炎(ptc)に関する対象のBanffスコアの関数として該対象の尿中EMV中のANXA1 mRNA発現のプロットを示す。 図1Iは、糸球体腎炎(g)に関する対象のBanffスコアの関数として該対象の尿中EMV中のANXA1 mRNA発現のプロットを示す。
図1Jは、血管線維化内膜肥厚(cv)に関する対象のBanffスコアの関数として該対象の尿中EMV中のANXA1 mRNA発現のプロットを示す。 図1Kは、硝子質細動脈肥厚(aah)の代替のスコア化に関する対象のBanffスコアの関数として該対象の尿中EMV中のANXA1 mRNA発現のプロットを示す。 図1Lは、Banff法により決定するとき傍尿細管毛細血管炎(ptcbm)に関する該対象のBanffスコアの関数として対象の尿中EMV中のANXA1 mRNA発現のプロットを示す。
図1Mは、慢性糸球体症(cg)に関する対象のBanffスコアの関数として該対象の尿中EMV中のANXA1 mRNA発現のプロットを示す。 図1Nは、補体C4d染色(c4d)に関する対象のBanffスコアの関数として該対象の尿中EMV中のANXA1 mRNA発現のプロットを示す。 図1Oは、メサンギウム基質増加(mm)に関する対象のBanffスコアの関数として該対象の尿中EMV中のANXA1 mRNA発現のプロットを示す。
図2Aは、対象の尿タンパクレベルの関数として該対象の尿中EMV中のANAX1 mRNA発現の散布図を示す。 図2Bは、対象の尿クレアチニンレベルの関数として該対象の尿中EMV中のANAX1 mRNA発現の散布図を示す。 図2Cは、対象の血清クレアチニンレベルの関数として該対象の尿中EMV中のANAX1 mRNA発現の散布図を示す。 図2Dは、対象の推定糸球体濾過量の関数として該対象の尿中EMV中のANAX1 mRNA発現の散布図を示す。
患者および試料の分類の模式図を示す。
腎移植後の病状の様々なタイプに関する対象の状態の関数として該対象の尿中EMV中のANXA1 mRNA発現のプロットを示す。統計的有意性をMann−Whitney−Wilcoxon検定により決定した:p<0.05については1つの星印(*)、p<0.0001については4つの星印(****)。
図5Aは、移植拒絶反応が対象に確認された日付からの時間の関数として該対象の尿中EMV中のANXA1 mRNA発現のプロットを示す。統計的有意性をMann−Whitney−Wilcoxon検定により決定した:p<0.01については2つの星印(**)、p<0.001については3つの星印(***)、p<0.0001については4つの星印(****)。 図5Bは、移植拒絶反応確認前(実線)、中(破線)および後(点線)のANXA1 mRNA発現についての受信者動作特性(ROC)解析を示す。 図5Cは、間質性線維症および尿細管萎縮(IFTA)が対象に確認された日付からの時間の関数として該対象の尿中EMV中のANXA1 mRNA発現のプロットを示す。統計的有意性をMann−Whitney−Wilcoxon検定により決定した:p<0.01については2つの星印(**)、p<0.001については3つの星印(***)、p<0.0001については4つの星印(****)。 図5Dは、IFTA確認前(実線)、確認中(破線)および確認後(点線)のANXA1 mRNA発現についての受信者動作特性(ROC)解析を示す。 図5Eは、免疫グロブリンA(IgA)腎症およびカルシニューリン阻害剤(CNI)中毒などの他の合併症が対象に確認された日付からの時間の関数として該対象の尿中EMV中のANXA1 mRNA発現のプロットを示す。統計的有意性をMann−Whitney−Wilcoxon検定により決定した:p<0.01については2つの星印(**)、p<0.001については3つの星印(***)、p<0.0001については4つの星印(****)。 図5Fは、合併症確認前(実線)、確認中(破線)および確認後(点線)のANXA1 mRNA発現についての受信者動作特性(ROC)解析を示す。
本開示の特定の態様は、概して、患者の腎移植後の病状をモニターする低侵襲方法を対象とする。本明細書に記載の各および全ての特徴、およびこのような特徴の2つ以上の各および全ての組合せは本開示の範囲内に含まれるが、但し、このような組合せに含まれる特徴は相互に相反しない。
起始細胞の細胞質分子をカプセル化することにより、エキソソームおよび微小胞(EMV)を全ネフロン領域から尿腔に遊離する。EMVは、尿中EMV mRNAプロファイルとしてバイオマーカーの有望な供給源が腎機能および腎損傷を反映するものと考えられる。尿中細胞および血液などの従来の非侵襲バイオマーカー供給源と比較して、尿中EMVは、腎損傷のより早期でより明瞭な目印を含み得る。CD3EおよびCXCL10のメッセンジャーRNA(mRNA)発現(例えば、18S rRNAレベルと比較して)は、尿から収集された細胞内で測定されたが、尿中EMVに関しては報告されなかった。また、さらなるマーカー(例えば、CFLAR、DUSP1、IFNGR1、ITGAX、MAPK9、NAMPT、NKTR、PSEN1、RNF130、RYBP、CEACAM4、EPOR、GZMK、RARA、RHEB、RXRA、SLC25A37等)のmRNA発現が全血液中で測定されたが、尿中EMVでは測定されなかった。腎移植後の病状のモニタリングは、長期移植片生着の管理にとって重要である。ネフロンの重症損傷後、尿中細胞は尿中に遊離されるが、尿中EMVは損傷細胞だけでなく正常細胞からも遊離される。従って、損傷細胞が尿中に遊離される前に、損傷関連の分子目印を損傷細胞から得ることができる。従って、本開示のいくつかの実施形態は、尿からのEMVを活用する。
尿中EMVを単離する標準的方法は、超遠心分離を用いた分画遠心分離法である。しかしながら、超遠心分離の使用は、標準的臨床検査室でのルーチン臨床アッセイに適用できない可能性がある。本開示のいくつかの実施形態は、アッセイ感度、再現性および使い勝手の良さの面から標準的方法と同様またはさらにより優れている性能を可能とするバイオマーカーおよび臨床試験のための尿中EMV mRNAアッセイを使用する。いくつかの実施形態は、有利に、標準的診断技術(例えば、生検)の利用より充分な期間前に、移植片移植後のモニタリングのための腎損傷マーカーをスクリーニングするこの尿中EMV mRNAアッセイを使用する。
以下により詳細に記載するように、尿試料を小胞捕捉フィルターに通過させて、これにより超遠心分離を使用することなく、EMVを尿から単離することを可能とすることにより、尿中エキソソームを尿から単離することができる。いくつかの実施形態では、小胞捕捉材は、捕捉する小胞の大きさと比べて大きい桁である多孔性を有する。小胞捕捉材は、EMVの大きさよりずっと大きい細孔径を有するが、EMVを小胞捕捉材に吸着することによりEMVを小胞捕捉材上に捕捉する。小胞捕捉材の細孔径および構造を目的に合わせて、EMVからのmRNAを小胞捕捉材から回収できるように、EMV捕捉とEMV回収とのバランスを取る。いくつかの実施形態では、小胞捕捉材は、異なる多孔性を有する少なくとも2層を備える多層フィルターである。1つの実施形態では、第一層は、0.6〜2.7μm、好ましくは1.5〜1.8μmの粒子保持率を有し、第二層は、0.1〜1.6μm、好ましくは0.6〜0.8μmの粒子保持率を有する。1つの実施形態では、第一層の粒子保持率は、第二層より大きく、それにより、高粒子担持能力およびより速い流速を得ることができる。いくつかの実施形態では、尿試料は、どちらもガラス繊維製である第一層を最初に、それから第二層を通過する。第一層は1.6μmの細孔径を有し、第二層は0.7μmの細孔径を有する。
いくつかの実施形態では、本開示の方法は、腎状態をモニターするために腎移植後患者の尿試料をスクリーニングするフィルターベースEMV mRNAアッセイを使用する。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示の方法を使用して、超遠心分離により尿から単離された小胞から得られるEMV mRNAをスクリーニングすることができる。いくつかの実施形態では、移植拒絶反応の評価の現在の標準的実践(例えば、腎生検)により腎損傷を検出できる前に、検出できる腎損傷バイオマーカーについて尿中EMVをスクリーニングする。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示の方法を使用して、超遠心分離により尿から単離された小胞から得られるEMV mRNAをスクリーニングすることができる。いくつかの実施形態では、移植拒絶反応の評価の現在の標準的実践(例えば、腎生検)により腎損傷を検出できる前に、検出できる腎損傷バイオマーカーについて尿中EMVをスクリーニングする。
末梢血液は、多くの疾病および臓器障害に対するバイオマーカーの豊富な供給源である。しかしながら、腎臓からの損傷関連の目印を他の臓器から末梢血液中に遊離されたEMVと希釈、混合してもよい。尿中EMV mRNAを示し、いくつかの環境における移植後の結果を予測した。しかしながら、LCN2(NGAL)、IL18、HAVCR1(KIM1)およびCST3(シスタチンC)などの試験した特定の遺伝子は、尿中タンパクバイオマーカーまたは7日目クレアチニン低下率といつも決まった相関はなかった。本明細書に開示した方法およびシステムのいくつかの実施形態は、長期移植片生着の管理にとって重要である腎移植後の病状のモニタリングに関する。
本開示のいくつかの態様は、早期腎損傷バイオマーカーを、腎移植を受けた患者からスクリーニングする尿中エキソソームおよび微小胞(EMV) mRNAアッセイを使用する。様々なmRNAは、これに限定されないがアネキシンA1(ANXA1)を含む腎移植後の状態に関して情報を提供する。以下に説明するように、本明細書で開示した方法のいくつかの実施形態は、ANXA1発現レベルが、対応した腎生検(N=117)のBanffスコアci(間質性線維症)、ct(尿細管萎縮)およびti(全間質性炎症)と線形的に相関があることを示す。安定して回復した患者と比較して、T細胞関連型拒絶反応(TCMR、10.2倍)、抗体関連型拒絶反応(ABMR、14.4倍)、間質性線維症および尿細管萎縮(IFTA、22.0倍)および他の合併症(8.7倍)が観察された場合、尿中EMVのアネキシンA1(ANXA1)発現は増加する。移植拒絶反応の少なくとも6.5日前、IFTAの56日前および他の合併症の64日前に、ANXA1は増加し、合併症がなくなった後高いままであった。ROC曲線解析は、尿中ANXA1が移植後合併症を正確に予測、診断することが可能である:移植拒絶反応(AUC=0.857〜0.946)、IFTA(AUC=0.777〜0.995)および他の合併症(AUC=0.698〜0.797)。従って、本明細書に開示したいくつかの実施形態に従えば、尿中EMV ANXA1 mRNA分析を用いた方法およびシステムは、間質性線維症および尿細管萎縮の早期予測において効果的であり、移植片移植後のモニタリングに有用である。
尿中EMV ANXA1 mRNA発現レベルを、腎移植後の患者の対応する生検スコアと比較した。図1A〜Cに示すように、尿中EMV ANXA1発現レベルは、間質性線維症(「ci」、図1A)、尿細管萎縮(「ct」、図1B)、および全間質性炎症(「ti」、図1C)のBanffスコアと線形的に相関関係であった。図1D〜Oに示すように、尿中EMV ANXA1発現レベルは、尿細管炎(「t」、図D)、間質の浸潤(「i」、図1E)、内膜動脈炎(「v」、図1F)、硝子質細動脈肥厚(「ah」、図1G)、傍尿細管毛細管炎(「ptc」、図H)、糸球体炎(「g」、図1I)、血管線維化内膜肥厚(「cv」、図1J)のBanffスコア、硝子質細動脈肥厚(「aah」、図1K)の代替スコア、Banff法による傍尿細管毛細血管炎(「ptcbm」、図1L)、慢性糸球体症(「cg」、図1M)、補体C4d染色(「c4d」、図1N)、およびメサンギウム基質増加(「mm」、図1O)と相関関係はなかった。従って、EMV中のANXA1 mRNAは、間質性線維症および尿細管萎縮を示す有望なバイオマーカーであり得る。
図2A〜Dは、尿中EMV ANXA1 mRNA発現レベルが、腎移植後合併症および/または拒絶反応の従来のマーカーと相関関係を示さないことを示す。尿中EMV A
NXA1 mRNA発現は、尿タンパク濃度(図2A)、尿中クレアチニン濃度(図2B)、血清クレアチニン濃度(図2C)、および推定糸球体濾過量(図2D)と相関関係を示さなかった。
NXA1 mRNA発現は、尿タンパク濃度(図2A)、尿中クレアチニン濃度(図2B)、血清クレアチニン濃度(図2C)、および推定糸球体濾過量(図2D)と相関関係を示さなかった。
様々なタイプの移植後合併症を有する患者および試験期間中安定な術後回復した患者について尿中EMV中のANXA1 mRNA発現を評価した。患者が試験期間中:安定な回復(SR)、移植拒絶反応(TR)、間質性線維症および尿細管萎縮(IFTA)ならびに他の合併症(OTH)と診断された合併症による4つの群に、移植後患者を分類した(図3、表1)。TR、IFTAおよびOTH患者群について、合併症が観察された時間:Cx前、CxおよびCx後、に対するサンプリング時間により尿試料を3つの群に分類した(図3、表2)。TRおよびIFTA患者が、免疫グロブリンA(IgA)腎症およびカルシニューリン阻害剤(CNI)中毒などの他の合併症を示した場合に収集した尿試料もCxとして分類した。Cx前試料は、試験期間中に観察された第一合併症前に収集した試料であり、Cx後は最後の合併症後のものであった。なお、TR群中のCx前の相対的サンプリング時間は、第一合併症のメディアン6.5(IQR5〜9)日前であり、IFTA(メディアン56(IQR43〜168)日前)およびOTH(メディアン64(IQR27〜177)日前)のものと比較して歪んでいたことに注目すべきである。試料収集中に観察された合併症のタイプ:TCMR、境界域、ABMR、IFTAおよび他の合併症により、Cx試料をさらに分類した(図3)。
図4は、安定な回復した患者および移植後合併症を示す患者の尿中EMV ANXA1
mRNA発現レベルを示す。SR群のものと比較した、移植後合併症が観察された場合に得られた試料において、尿中EMVのANXA1の発現レベルを分析した(図4)。TCMR(10.2倍に増加、p=0.017)、ABMR(14.4倍に増加、p=0.015)、IFTA(22.0倍に増加、p=4.3×10−16)および他の合併症(8.7倍に増加、p=2.2×10−5)において、ANXA1レベルの増加が観察された。一方、ANXA1は、境界域において少なくとも2.6倍に増加したが、統計的有意性は観察されなかった。
移植片移植後のモニタリングにおいてANXA1の予測値および予後値を評価するため、TR、IFTAおよびOTH患者の尿試料をサンプリング時間により分類して解析した。SR患者と比較して、TR患者は、第一合併症の少なくともメディアン6.5(IQR5〜9)日においてANXA1レベルの増加を示し、最後の合併症後メディアン288.5(IQR222.5〜346.8)日間高いままであった(図4A)。ROC曲線解析は、ANXA1の発現レベルがTR患者をAUC=0.946(Cx前)、0.857(Cx)、および0.940(Cx後)を有するSRから区別できることを示した(図4B、表3)。
mRNA発現レベルを示す。SR群のものと比較した、移植後合併症が観察された場合に得られた試料において、尿中EMVのANXA1の発現レベルを分析した(図4)。TCMR(10.2倍に増加、p=0.017)、ABMR(14.4倍に増加、p=0.015)、IFTA(22.0倍に増加、p=4.3×10−16)および他の合併症(8.7倍に増加、p=2.2×10−5)において、ANXA1レベルの増加が観察された。一方、ANXA1は、境界域において少なくとも2.6倍に増加したが、統計的有意性は観察されなかった。
移植片移植後のモニタリングにおいてANXA1の予測値および予後値を評価するため、TR、IFTAおよびOTH患者の尿試料をサンプリング時間により分類して解析した。SR患者と比較して、TR患者は、第一合併症の少なくともメディアン6.5(IQR5〜9)日においてANXA1レベルの増加を示し、最後の合併症後メディアン288.5(IQR222.5〜346.8)日間高いままであった(図4A)。ROC曲線解析は、ANXA1の発現レベルがTR患者をAUC=0.946(Cx前)、0.857(Cx)、および0.940(Cx後)を有するSRから区別できることを示した(図4B、表3)。
IFTAおよびOTH患者も、TR患者と同様に、サンプリング時間に依存しないANXA1の増加を示した。しかしながら、ずっと早くまたは少なくとも、第一合併症の、それぞれ中央値で56(IQR43〜168)日前および64(IQR27〜177)日前に増加が観察された(図4C、4E)。ROC曲線解析は、ANXA1が、TR患者:AUC 0.777(Cx前)、0.906(Cx)、および0.995(Cx後)と匹敵する感受性および特異性を有するSR患者からIFTA患者を区別できることを示した(図4D、表3)。一方、OTH患者は、他の合併症群と比較して感受性および特異性が低いが、なお得られたAUCは、0.698〜0.797であった(図3E、表3)。
本開示のいくつかの実施形態では、ANXA1の上方制御は、腎状態の生検再検査の必要性を示すことができる。ANXA1が移植後合併症間を区別しなかったが、尿中EMV
ANXA1 mRNAのレベル上昇は、現在の実践より少なくとも6.5日早く移植片拒絶反応を予測することができ、それぞれ少なくとも56日および64日早くIFTAおよび他の合併症を予測することができる。生検の傷害性および侵襲性を考慮すれば、本開示の方法は、生検の使用を、尿中EMV中ANXA1 mRNA発現のレベル上昇により生検が示される場合の局面に限定することにより、腎移植後合併症の早期治療を援助することができる。
ANXA1 mRNAのレベル上昇は、現在の実践より少なくとも6.5日早く移植片拒絶反応を予測することができ、それぞれ少なくとも56日および64日早くIFTAおよび他の合併症を予測することができる。生検の傷害性および侵襲性を考慮すれば、本開示の方法は、生検の使用を、尿中EMV中ANXA1 mRNA発現のレベル上昇により生検が示される場合の局面に限定することにより、腎移植後合併症の早期治療を援助することができる。
上記説明したように、本明細書では、特定のマーカーの発現レベルを検出および決定するために、血液または尿試料から核酸を評価するいくつかの実施形態を提供する。いくつかの実施形態では、マーカーの発現の決定は、疾病または病状、例えば、腎損傷の診断を可能とする。いくつかの実施形態では、該決定を使用して病状の重症度を測定し、適切な治療計画を立てて実行する。いくつかの実施形態では、それから、検出されたバイオマーカーを使用して適切な治療レジメンを作成する。しかしながら、いくつかの実施形態では、該治療は、さらなる行動(例えば、治療を開始しない)を取り得ない。いくつかの実施形態では、方法をコンピュータ処理する(例えば、RNA単離、cDNA生成、または増幅の1つ以上をコンピュータにより全体または部分的に制御する)。いくつかの実施形態では、バイオマーカーの検出はリアルタイムである。
上記のように、方法の特定の態様は、必要に応じてコンピュータ処理する。また、いくつかの実施形態では、発現量は、その時に行うべき治療がないという決定をもたらし得る。従って、いくつかの実施形態では、本明細書に開示の方法は、不必要な医療費も減らし、その時に必要としない治療による副作用の可能性も低減する。
いくつかの実施形態では、生体試料を収集した後(例えば、尿試料)、膜粒子、細胞、
エキソソーム、エキソソーム様小胞、微小胞および/または対象の他の生体成分を、該試料のろ過により単離する。いくつかの実施形態では、収集した試料のろ過は、フィルター上に、膜粒子、細胞、エキソソーム、エキソソーム様小胞、および微小胞の1つ以上を捕捉するだろう。いくつかの実施形態では、小胞捕捉材は、生体試料から所望の小胞を捕捉する。従って、いくつかの実施形態では、小胞捕捉材を該材料の細孔(または他の小胞捕捉材を貫通する道)径に基づいて選択する。いくつかの実施形態では、小胞捕捉材はフィルターを含んでなる。
エキソソーム、エキソソーム様小胞、微小胞および/または対象の他の生体成分を、該試料のろ過により単離する。いくつかの実施形態では、収集した試料のろ過は、フィルター上に、膜粒子、細胞、エキソソーム、エキソソーム様小胞、および微小胞の1つ以上を捕捉するだろう。いくつかの実施形態では、小胞捕捉材は、生体試料から所望の小胞を捕捉する。従って、いくつかの実施形態では、小胞捕捉材を該材料の細孔(または他の小胞捕捉材を貫通する道)径に基づいて選択する。いくつかの実施形態では、小胞捕捉材はフィルターを含んでなる。
いくつかの実施形態では、フィルターは細孔を含んでなる。本明細書で使用するとき、「細孔」または「細孔(複数)」という語は、その通常の意味を与えられるべきであり、また、小胞捕捉材を貫通する直接的または回旋状通路を表す。いくつかの実施形態では、フィルターを構成する材料は、フィルターを貫通する間接的通路を提供する。例えば、いくつかの実施形態では、小胞捕捉材は、繊維中の隙間を貫通する特定の物質の通過を可能とするが、それ自体は細孔を有さない複数の繊維を含んでなる。例えば、ガラス繊維フィルターは、直径約1.6ミクロン以上の大きさを有する粒子を保持するように構成されたメッシュ様構造を有し得る。本明細書において互換的に、このようなガラス繊維フィルターを1.6ミクロンの細孔径を有する、または直径約1.6ミクロン以上である成分を捕捉する材料を含んでなると呼んでもよい。しかしながら、上記説明したように、フィルターにより捕捉されるEMVは、ガラスフィルターの細孔径より小さい桁の大きさである。従って、本明細書において、フィルターを、直径約1.6ミクロン以上である成分を捕捉する材料を含んでなると記載し得るが、これらの小さい成分がフィルターに吸着し得るので、かかるフィルターはより小さい直径を有する成分(例えば、EMV)を捕捉し得る。
いくつかの実施形態では、フィルターは、直径約1.6ミクロン以上である成分を捕捉する材料を含んでなる。いくつかの実施形態では、複数のフィルターを使用して特に好ましい範囲の大きさ(例えば、直径)以内の小胞を捕捉する。例えば、いくつかの実施形態では、フィルターを使用して、約0.2ミクロン〜約0.4ミクロン、約0.4ミクロン〜約0.6ミクロン、約0.6ミクロン〜約0.8ミクロン、約0.8ミクロン〜約1.0ミクロン、約1.0ミクロン〜約1.2ミクロン、約1.2ミクロン〜約1.4ミクロン、約1.4ミクロン〜約1.6ミクロン(および記載したこれらの間のいずれもの大きさ)を含む直径約0.2ミクロン〜約1.6ミクロンの直径を有する小胞を捕捉する。他の実施形態では、小胞捕捉材は、約0.5ミクロン〜1.0ミクロンの大きさの範囲のエキソソームを捕捉する。
いくつかの実施形態では、フィルター(またはフィルター(複数))は、ガラス様材料、非ガラス様材料、またはその組合せを含んでなる。いくつかの実施形態では、小胞捕捉材がガラス様材料を含んでなる場合、小胞捕捉材は、プラスチックまたはガラスのように、原子スケールで不規則または「非晶質」である構造を有する。ガラス様材料としては、ガラスビーズもしくは繊維、シリカビーズ(または他の構造)、ニトロセルロース、ナイロン、ポリフッ化ポリビニリデン(PVDF)もしくは他の同様な重合体、金属もしくはナノ金属繊維、ポリスチレン、エチレン酢酸ビニルもしくは他の共重合体、天然繊維(例えば、絹)、アルギン酸繊維、またはその組合せが挙げられるが、これに限定されない。特定の実施形態では、小胞捕捉材は、必要に応じて、複数の層の小胞捕捉材を含んでなる。他の実施形態では、小胞捕捉材は、ニトロセルロースをさらに含んでなる。
いくつかの実施形態では、フィルター機器を使用して対象の生体成分を単離する。いくつかの実施形態では、該機器は:入口および出口、ならびに入口および出口の間の内部容積を有する第一本体;入口および出口、入口および出口の間の内部容積、第二本体の内部容積内に配置され、第一本体と流体連通するフィルター材を有する第二本体;ならびに入口、入口反対側の閉端および内部空洞を有する受け容器を備える。いくつかの実施形態で
は、第一本体および第二本体は、第二本体の入口と第一本体の出口との相互作用により可逆的に連結する。いくつかの実施形態では、受け容器の内部空洞は、第一本体および第二本体の両方を可逆的に囲い込み、第一本体の内部容積からフィルター材を貫通し、第二本体の内部空洞を通過して第二本体の出口から出て通った後に収集した試料を受けるような寸法である。いくつかの実施形態では、単離工程は、かかる機器内に収集した試料の少なくとも一部を入れて、機器に力を印加して収集した試料を、機器を通過させて受け容器に渡し対象の生体成分を捕捉させることを含む。いくつかの実施形態では、力の印加は、機器の遠心分離を含む。他の実施形態では、力の印加は、機器に対して正圧を印加することを含む。他の実施形態では、力の印加は、機器に対して真空圧を印加することを含む。かかるフィルター機器の例は、国際公開第2014/182330号および国際公開第2015/050891号に開示されており、これらは参照することにより本明細書に組み入れられるものとする。
は、第一本体および第二本体は、第二本体の入口と第一本体の出口との相互作用により可逆的に連結する。いくつかの実施形態では、受け容器の内部空洞は、第一本体および第二本体の両方を可逆的に囲い込み、第一本体の内部容積からフィルター材を貫通し、第二本体の内部空洞を通過して第二本体の出口から出て通った後に収集した試料を受けるような寸法である。いくつかの実施形態では、単離工程は、かかる機器内に収集した試料の少なくとも一部を入れて、機器に力を印加して収集した試料を、機器を通過させて受け容器に渡し対象の生体成分を捕捉させることを含む。いくつかの実施形態では、力の印加は、機器の遠心分離を含む。他の実施形態では、力の印加は、機器に対して正圧を印加することを含む。他の実施形態では、力の印加は、機器に対して真空圧を印加することを含む。かかるフィルター機器の例は、国際公開第2014/182330号および国際公開第2015/050891号に開示されており、これらは参照することにより本明細書に組み入れられるものとする。
いくつかの実施形態では、収集した試料を複数のフィルターを通過させて対象の生体成分を単離する。他の実施形態では、生体成分の単離は、収集した試料の希釈を含む。他の実施形態では、遠心分離を使用して対象の生体成分を単離してもよい。いくつかの実施形態では、複数の単離技術を使用してもよい(例えば、ろ過選別および/または密度勾配遠心分離の組合せ)。いくつかの実施形態では、収集した試料を単離工程後1つ以上の試料に分離する。
いくつかの実施形態では、測定のため、RNAを対象の生体成分から遊離する。いくつかの実施形態では、対象の生体成分からRNAを遊離することは、膜粒子、エキソソーム、エキソソーム様小胞、および/または微小胞を、溶解バッファーを用いて溶解することを含む。他の実施形態では、遠心分離を使用してもよい。いくつかの実施形態では、膜粒子、エキソソーム、エキソソーム様小胞、微小胞および/または対象の他の成分をフィルターに固定化しながら、該遊離を行う。いくつかの実施形態では、膜粒子、エキソソーム、エキソソーム様小胞、微小胞および/または対象の他の成分を、収集した試料の他の成分から(および/またはもう一方の−例えばエキソソームから分離した小胞)単離さもなければ分離する。
様々な実施形態に従えば、ノーザンブロット解析、リボヌクレアーゼプロテクションアッセイ、PCR、RT−PCR、リアルタイムRT−PCR、他の定量PCR技術、RNAシークエンシング、核酸配列ベース増幅法(NASBA法)、分岐DNA増幅法、質量分析法、CHIPシークエンシング、DNAまたはRNAマイクロアレイ解析および/または他のハイブリダイゼーションマイクロアレイを含むRNAを定量するための様々な方法を使用する。これらの実施形態のいくつかまたは代替の実施形態では、増幅したDNAを生成後、対象のバイオマーカーの部分に補完するプローブに暴露する。
いくつかの実施形態では、コンピュータ処理された方法を使用して1つ以上の工程を完了する。いくつかの実施形態では、コンピュータ処理された方法は、単離したRNAおよび/または調製したcDNA、ポリメラーゼおよび遺伝子特異的プライマーを含んでなる反応混合物を熱サイクルに暴露することを含む。いくつかの実施形態では、反応混合物を暴露する温度、およびサイクル数を制御するように構成されたコンピュータにより熱サイクルを生成する。他の実施形態では、コンピュータは時間のみを制御または反応混合物の温度のみを制御し、個人が1つ以上に追加の変数を制御する。いくつかの実施形態では、検出工程からデータを受取り、バイオマーカーに必要な熱サイクル数を検出して、対象が腎損傷を患っているかまたは腎移植拒絶反応を示しているかを識別するために所定の増幅閾値に達するように構成されたコンピュータを使用する。さらに追加の実施形態では、全試験および検出過程を自動化する。
例えば、いくつかの実施形態では、完全に自動化した方法、例えば、コンピュータプロセッサーおよび関連する自動機械により制御された方法により、RNAを単離する。1つの実施形態では、尿試料などの生体試料を収集し、試料処理ユニット中に配置された受け容器中に投入する。使用者は試料同定、試料量および/または特定患者の特徴などの情報をデータ入力レシーバーに入力する。いくつかの実施形態では、使用者はグラフィカルユーザーインターフェースを使用してデータを入力する。他の実施形態では、データ入力を自動化する(例えば、バーコード、QRコード、または他の図形識別子による入力)。それから、使用者はRNA単離プロトコールを実行でき、このために、アルゴリズムにアクセスして小胞などの生体成分を単離するために試料を処理する関連機能を実行し、その後、小胞を処理してRNAを遊離するようにコンピュータを構成する。さらなる実施形態では、プログラムを実行したコンピュータは単離したRNA量を定量および/または純度を評価することができる。このような実施形態では、量および/または純度は最低閾値を上回るべきであり、RNAを自動的にさらに処理して相補DNA(cDNA)を生成することができる。それから、例えば、ポリA RNA鎖をオリゴdT分子に結合した後RNAポリメラーゼを用いて伸長するなど、確立された方法を用いて、cDNAを生成することができる。他の実施形態では、量および/または純度が最低閾値を超えない場合、プログラムを実行したコンピュータは、使用者が追加の生体試料(複数可)を提供するように促すことができる。
実施形態に依存して、cDNAを個別の小口試料に分割することができ、いくつかは後で行う分析用に貯蔵し、いくつかは直ぐに分析する。いくつかの実施形態では、分析は、既知量のcDNAを塩ベース緩衝液、DNAポリメラーゼ、および少なくとも1つの遺伝子特異的プライマーと混合して反応混合物を生成することを含む。それから、cDNAを、コンピュータシステムを実行するように構成する所定の熱サイクルプログラムを用いて増幅することができる。同様に、この熱サイクルを必要に応じて手動で制御することもできる。増幅(例えば、リアルタイムPCR)後、コンピュータシステムは、発現の特定の閾値を上回るために対象の遺伝子(例えば、腎損傷または腎移植拒絶反応のマーカー)が必要なサイクル数を評価することができる。それから、データ解析プロセッサは、この評価を使用して元試料中に存在する対象の遺伝子数を算出することができ、異なる患者試料、既知コントロール、またはその組合せのいずれかと比較することにより、対象の遺伝子の発現レベルを算出することができる。データ出力プロセッサは、別の許容できるフォーマットで電子的に、試験施設および/または直接医療提供者のいずれかにこの情報を提供することができる。それから、この決定に基づいて、医療提供者は、腎損傷または腎移植拒絶反応の存在の決定に基づいた特定の患者を治療するか、および如何に治療するかを決定することができる。いくつかの実施形態では、リアルタイムに発現データを生成し、必要に応じて、リアルタイムに医療提供者(または他の受取人)に送られる。
いくつかの実施形態では、完全または部分的に自動化した方法は、手動試験方法より速い試料処理および分析を可能とする。特定の実施形態では、機械または試験機器は、医師または検査技師は通常の病院または実験室環境の外で試験を完了し得るように携帯型および/または移動可能型であってもよい。いくつかの実施形態では、移動可能型アッセイ機器は、アッセイパラメーターをアッセイ機器に入力および/またはさらに処理するためにアッセイ機器から完了した試験の生結果を受けるように使用できる携帯電話またはノートパソコンなどのコンピュータを備える携帯型機器と互換性であり得る。いくつかの実施形態では、患者または他の使用者は、検査技師または医師の支援なしでコンピュータインターフェースによりアッセイ機器を使用可能であってもよい。これらの場合、患者は、「在宅」試験を行う選択肢を有することになるだろう。一定のこれらの実施形態において、特殊化したソフトウェアまたはプログラムを備えるコンピュータは、アッセイ機器内に適切に試料を入れて、試験実施命令前にコンピュータに試料関連データおよび情報を入力するように、患者を案内してもよい。全試験を完了した後、コンピュータソフトウェアは、ア
ッセイ機器から受けた生データに基づいて自動的に試験結果を算出してもよい。結果を処理することにより、いくつかの実施形態では、インターネットまたは追加の情報を有するコンピュータを供給する他の手段からのデータまたは他の出所の保存されたライブラリーからのコントロール情報と結果を比較することにより、コンピュータは追加のデータを算出してもよい。それから、コンピュータは、これらの結果に基づいて患者(および/または医療提供者、および/または試験施設)に出力を示してもよい。
ッセイ機器から受けた生データに基づいて自動的に試験結果を算出してもよい。結果を処理することにより、いくつかの実施形態では、インターネットまたは追加の情報を有するコンピュータを供給する他の手段からのデータまたは他の出所の保存されたライブラリーからのコントロール情報と結果を比較することにより、コンピュータは追加のデータを算出してもよい。それから、コンピュータは、これらの結果に基づいて患者(および/または医療提供者、および/または試験施設)に出力を示してもよい。
いくつかの実施形態では、医療専門家は、患者を診断、モニターおよび/または治療するために遺伝子試験が必要であり得る。従って、いくつかの実施形態では、医療専門家は、試験を要求し、結果を使用して患者の診断または治療計画をしてもよい。例えば、いくつかの実施形態では、医療専門家は、患者から試料を集めるか、さもなければ患者に試験用試料(または試料(複数))を提供させてもよい。それから、医療専門家は、試料の処理および試験実施可能な実験室または他の第三者に試料を送ってもよい。あるいは、医療専門家が、自分自身(例えば、院内)で試料の処理および試験の一部または全部を実施してもよい。試験は、尿路上皮の疾病の存在に関連するデータを含む、試料についての定量的および/または定性的情報を提供し得る。一旦、この情報を収集すれば、いくつかの実施形態では、情報をコントロール情報(例えば、ベースラインまたは正常集団)と比較して、試験結果が患者の試料とコントロールとの間で差を示しているかどうかを決定してもよい。情報は比較、解析された後、追加の解析のために医療専門家に戻される。あるいは、医療専門家または他の病院スタッフが適用可能な比較および分析を実施できるように、試験から集められた生データを医療専門家に戻してもよい。試験および医療専門家の解析結果に基づいて、医療専門家は、患者を如何に治療または診断するか(または必要に応じて治療を止めるか)を決定してもよい。
いくつかの実施形態では、ろ過(単独または遠心分離と併用して)を使用して異なる大きさの小胞を捕捉する。いくつかの実施形態では、タンパク質マーカーの表面発現に基づいて小胞の識別捕捉を行う。例えば、特異的表面マーカー(例えば、抗体に結合したフィルター)または特異的タイプの小胞または異なる起源の小胞と反応性があるようにフィルターを設計してもよい。いくつかの実施形態では、フィルターと遠心分離との併用はより高収率またはより高い純度の小胞を可能とする。
いくつかの実施形態では、マーカーは固有の小胞タンパク質またはペプチドである。いくつかの実施形態では、特定の婦人科疾患または障害は、特定の小胞の単離を可能とするように活用できる特定の小胞修飾と関連する。修飾としては、脂質、炭水化物、およびアクリル化、ホルミル化、リポイル化、ミリストイル化、パルミトイル化、アルキル化、メチル化、イソプレニル化、プレニル化、アミド化、グリコシル化、ヒドロキシル化、ヨウ化、アデニル化、ホスホリル化、硫酸化、およびセレノイル化、ユビキチン化などの他の分子の付加を挙げられ得るが、これに限定されない。いくつかの実施形態では、小胞マーカーは、脂質、炭水化物、核酸、RNA、DNA、他などの非タンパク質を含んでなる。
いくつかの実施形態では、その表面マーカーに基づいた小胞の特異的捕捉は、小胞の各異なるタイプを異なる捕捉分子(例えば、異なる特異性を有する抗体)で被覆したプローブを患者の試料中に浸漬することにより捕捉する「ディップスティック」フォーマットも可能とする。
遊離細胞外RNAを、強力に劣化した診断マーカーにするヌクレアーゼにより迅速に分解する。上記のように、いくつかの細胞外RNAは、尿などの様々な生体試料中に見出される粒子または小胞と関連する。mRNAを含むこの小胞関連RNAを、分解過程から保護する。微小胞は、大部分の細胞型から流れ落とされ、細胞膜の断片からなる。微小胞は、RNA、mRNA、マイクロRNA、およびタンパク質を含有し、それらが流れ落とさ
れた細胞の組成を映す。エキソソームは、広範な哺乳類細胞により分泌される小さな微小胞であり、正常および病的状態下で分泌される。これらの小胞は、特定のタンパク質ならびにmRNAおよびマイクロRNAを含むRNAを含有する。いくつかの実施形態は、とりわけ、低分子干渉RNA(siRNA)、tRNA、および低分子活性化RNA(saRNA)などの核酸を評価する。
れた細胞の組成を映す。エキソソームは、広範な哺乳類細胞により分泌される小さな微小胞であり、正常および病的状態下で分泌される。これらの小胞は、特定のタンパク質ならびにmRNAおよびマイクロRNAを含むRNAを含有する。いくつかの実施形態は、とりわけ、低分子干渉RNA(siRNA)、tRNA、および低分子活性化RNA(saRNA)などの核酸を評価する。
いくつかの実施形態では、患者の尿の小胞から単離されたRNAを鋳型として使用し、例えば、逆転写酵素の使用により相補DNA(cDNA)を製造する。いくつかの実施形態では、cDNAを、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いて増幅する。他の実施形態では、核酸配列ベース増幅法(NASBA法)または核酸のプライマー依存性連続増幅、またはリガーゼ連鎖反応などのいずれもの適切な増幅技術によって、核酸およびRNAの増幅を行ってもよい。例えば、ノーザンブロット解析、リボヌクレアーゼプロテクションアッセイ、RNAシークエンシング、RT−PCR、リアルタイムRT−PCR、NASBA法、分岐DNA増幅法、ELISA、質量分析法、CHIPシークエンシング、およびDNAまたはRNAマイクロアレイ解析などを含む他の方法を使用して、核酸を定量してもよい。
いくつかの実施形態では、mRNAからcDNA合成を起こす方法およびPCRを用いたcDNAの増幅により、mRNAを定量する。1つの好ましい実施形態では、マルチウェルフィルタープレートを溶解バッファーおよび洗浄バッファーで洗浄する。それから、cDNA合成バッファーをマルチウェルフィルタープレートに添加する。マルチウェルフィルタープレートを遠心分離することができる。PCRプライマーをPCRプレートに添加し、cDNAをマルチウェルフィルタープレートからPCRプレートに移動する。PCRプレートを遠心分離して、リアルタイムPCRを開始する。
別の好ましい実施形態は、mRNAハイブリダイゼーションまたはcDNA合成中の特異的アンチセンスプライマーの適用を含んでなる。いくつかの実施形態では、過剰のアンチセンスプライマーをcDNA合成中に取り除いて持ち越し効果を避け得るように、mRNAハイブリダイゼーション中にプライマーを添加することが好ましい。オリゴ(dT)および特異的プライマー(NNNN)は、ポリA RNA上の異なる位置においてcDNA合成を同時にプライムする。特異的プライマー(NNNN)およびオリゴ(dT)は、増幅中にcDNA生成を引き起こす。各ウェルの加熱によりGenePlateから特異的プライマー由来cDNAを取り出す場合でさえ、熱変性過程(例えば、TaqMan定量PCRを用いて)から得られた特異的cDNA量は、非加熱ネガティブコントロールから得られた量と同様である。これは、熱変性過程を完全に省くことを可能とする。さらに、異なる標的用の複数のアンチセンスプライマーの添加により、cDNAのアリコットから複数の遺伝子を増幅することができ、GenePlate中のオリゴ(dT)由来cDNAを今後の使用のために貯蔵することができる。
追加の実施形態は、尿(または他の体液)からmRNAの高スループット定量化のための機器を含む。該機器は:複数試料送達ウェル、該試料送達ウェル下部のエキソソーム捕捉フィルター(または対象の別の生体成分を対象にするフィルター)、およびmRNA捕捉ゾーンのウェル内に固定オリゴ(dT)を含有する該フィルター下のmRNA捕捉ゾーンを含むマルチウェルフィルタープレートを備える。エキソソーム収集効率を増大するために、いくつかのろ過膜を積み重ねることができる。
いくつかの実施形態では、増幅は、エキソソーム由来RNAおよびコントロールRNAを用いてリアルタイム定量PCR(TaqMan)を実行することを含む。いくつかの実施形態では、Taqmanアッセイを使用する。Taqポリメラーゼの5'→3'エキソヌクレアーゼ活性をポリメラーゼ連鎖反応生成物検出システムにおいて使用して増幅と同時
に特異的検出可能なシグナルを生成する。3'末端において伸長不能、5'末端において標識化、かつ標的配列内でハイブリダイズするように設計されたオリゴヌクレオチドプローブを、ポリメラーゼ連鎖反応アッセイ中に導入する。増幅の途中でポリメラーゼ連鎖反応生成物の鎖の1本にプローブをアニーリングすることにより、エキソヌクレアーゼ活性に適切な基質を生成する。増幅中、Taqポリメラーゼの5'→3'エキソヌクレアーゼ活性は、該プローブを、未分解プローブから識別できるより小さな断片に分解する。他の実施形態では、方法は:(a)試料を含むPCRアッセイに、標的核酸の領域を相補する配列を含む少なくとも1つの標識化オリゴヌクレオチドを準備することであって、該標識化オリゴヌクレオチドが工程(b)のオリゴヌクレオチドプライマーにより結合された標的核酸配列内にアニールする前記少なくとも1つの標識化オリゴヌクレオチドを準備すること;(b)第一プライマーが標的核酸配列の1つの鎖中の領域を相補する配列を含み、相補DNA鎖の合成をプライムし、第二プライマーが標的核酸配列の第二の鎖中の領域を相補する配列を含み、相補DNA鎖の合成をプライムし;および、各オリゴヌクレオチドプライマーが同じ核酸鎖にアニールしたいずれかの標識化オリゴヌクレオチドの上流のその相補鋳型にアニールするように選択される、1組のオリゴヌクレオチドプライマーを準備すること;(c)(i)プライマーおよび標識化オリゴヌクレオチドを標的領域内に含まれる鋳型核酸配列にアニールすること、および(ii)前記核酸ポリメラーゼがプライマー伸長生成物を合成する一方で、核酸ポリメラーゼの5'→3'ヌクレアーゼ活性が標識化オリゴヌクレオチドを含んでなるアニールした二本鎖およびその相補鋳型核酸配列から標識化断片を同時に遊離することにより、検出可能な標識化断片を作製する、プライマーを伸長すること、のPCRサイクリング工程を許容する条件下鋳型依存重合化剤として5’→3’ヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼを使用して標的核酸配列を増幅すること;ならびに(d)標識化断片の遊離を検出および/または測定して試料中の標的配列の存在または非存在を決定すること、を含む。
に特異的検出可能なシグナルを生成する。3'末端において伸長不能、5'末端において標識化、かつ標的配列内でハイブリダイズするように設計されたオリゴヌクレオチドプローブを、ポリメラーゼ連鎖反応アッセイ中に導入する。増幅の途中でポリメラーゼ連鎖反応生成物の鎖の1本にプローブをアニーリングすることにより、エキソヌクレアーゼ活性に適切な基質を生成する。増幅中、Taqポリメラーゼの5'→3'エキソヌクレアーゼ活性は、該プローブを、未分解プローブから識別できるより小さな断片に分解する。他の実施形態では、方法は:(a)試料を含むPCRアッセイに、標的核酸の領域を相補する配列を含む少なくとも1つの標識化オリゴヌクレオチドを準備することであって、該標識化オリゴヌクレオチドが工程(b)のオリゴヌクレオチドプライマーにより結合された標的核酸配列内にアニールする前記少なくとも1つの標識化オリゴヌクレオチドを準備すること;(b)第一プライマーが標的核酸配列の1つの鎖中の領域を相補する配列を含み、相補DNA鎖の合成をプライムし、第二プライマーが標的核酸配列の第二の鎖中の領域を相補する配列を含み、相補DNA鎖の合成をプライムし;および、各オリゴヌクレオチドプライマーが同じ核酸鎖にアニールしたいずれかの標識化オリゴヌクレオチドの上流のその相補鋳型にアニールするように選択される、1組のオリゴヌクレオチドプライマーを準備すること;(c)(i)プライマーおよび標識化オリゴヌクレオチドを標的領域内に含まれる鋳型核酸配列にアニールすること、および(ii)前記核酸ポリメラーゼがプライマー伸長生成物を合成する一方で、核酸ポリメラーゼの5'→3'ヌクレアーゼ活性が標識化オリゴヌクレオチドを含んでなるアニールした二本鎖およびその相補鋳型核酸配列から標識化断片を同時に遊離することにより、検出可能な標識化断片を作製する、プライマーを伸長すること、のPCRサイクリング工程を許容する条件下鋳型依存重合化剤として5’→3’ヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼを使用して標的核酸配列を増幅すること;ならびに(d)標識化断片の遊離を検出および/または測定して試料中の標的配列の存在または非存在を決定すること、を含む。
代替の実施形態では、標識の発光を修飾するように標識と相互作用するDNA結合化合物の存在下で反応を行い、発光標識で標識化した一本鎖オリゴヌクレオチドプローブの切断をもたらす反応を提供するTaqmanアッセイを使用する。該方法は、プローブの分解から結果として起こる標識化プローブの発光変化を利用する。該方法は、概して、オリゴヌクレオチドプローブの切断をもたらす反応を利用するアッセイに、特に、ハイブリダイズしたプローブをプライマー伸長と同時に切断する均一な増幅/検出アッセイに適用することができる。増幅された標的の蓄積の同時検出および標的配列の配列特異的検出を可能とする均一な増幅/検出アッセイが提供される。
代替の実施形態では、リアルタイムPCRフォーマットを使用してもよい。1つのフォーマットは、SYBRグリーンなどの挿入色素を使用する。この色素は、二本鎖DNAと結合時に強力な蛍光シグナルを提供し;このシグナルは増幅DNAの定量化を可能とする。このフォーマットは増幅の配列特異的モニタリングを可能にしないが、標識化プローブなしで増幅DNAの直接的定量化を可能とする。同様に使用し得る他のこのような蛍光色素は、SYBRゴールド、YO−PRO色素およびYo Yo色素である。
使用し得る別のリアルタイムPCRフォーマットは、単位複製配列にハイブリダイズして蛍光シグナルを生成するレポータープローブを使用する。ハイブリダイゼーション事象は、プローブ上のレポーターおよびクエンチャー部分を分離するかあるいはそれらをより接近させる。プローブ自体は分解せず、反応においてレポーター蛍光シグナル自体は蓄積しない。プローブが単位複製配列にハイブリダイズする場合のレポーター蛍光シグナルの増加により、PCR中の生成物の蓄積をモニターする。この分類のフォーマットとしては、分子指標、デュアルハイブ(dual-hybe)プローブ、SunriseまたはAmpli
fluor、およびScorpionリアルタイムPCRアッセイが挙げられる。
fluor、およびScorpionリアルタイムPCRアッセイが挙げられる。
同様に使用し得る別のリアルタイムPCRフォーマットは、いわゆる、「Policeman」システムである。このシステムでは、プライマーは、FAMなどの蛍光部分、および該プライマーの3'末端において少なくとも1つのヌクレオチド塩基と共有結合した
、TAMRAなどの蛍光部分の蛍光をクエンチ可能なクエンチャー部分を含んでなる。3'末端において、プライマーは、少なくとも1つのミスマッチ塩基を有し、従って、その
塩基における核酸試料または塩基を相補しない。Pfu酵素などの3'−5'エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを用いたPCRにより、鋳型核酸配列を増幅してPCR産物を産生する。クエンチャー部分と結合したミスマッチ塩基(複数可)を、3'−5'エキソヌクレアーゼ活性により、PCR産物の3'末端から切断する。共有結合したクエン
チャー部分を有するミスマッチ塩基がポリメラーゼにより切断され、それ故、蛍光部分に対するクエンチング効果が取り除かれた蛍光を、PCR中少なくとも1つの時間において検出および/または定量する。バックグラウンドより上の蛍光は、合成された核酸試料の存在を示す。
、TAMRAなどの蛍光部分の蛍光をクエンチ可能なクエンチャー部分を含んでなる。3'末端において、プライマーは、少なくとも1つのミスマッチ塩基を有し、従って、その
塩基における核酸試料または塩基を相補しない。Pfu酵素などの3'−5'エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを用いたPCRにより、鋳型核酸配列を増幅してPCR産物を産生する。クエンチャー部分と結合したミスマッチ塩基(複数可)を、3'−5'エキソヌクレアーゼ活性により、PCR産物の3'末端から切断する。共有結合したクエン
チャー部分を有するミスマッチ塩基がポリメラーゼにより切断され、それ故、蛍光部分に対するクエンチング効果が取り除かれた蛍光を、PCR中少なくとも1つの時間において検出および/または定量する。バックグラウンドより上の蛍光は、合成された核酸試料の存在を示す。
別の代替の実施形態は、尿試料、低張緩衝液、および溶解バッファーを機器に適用するロボット;自動真空吸引装置および遠心分離、ならびに自動PCR装置を備える、尿などの生体液中のmRNAの高スループット定量を実行するための完全自動システムを含む。
開示した腎移植後疾患または病状の存在の決定方法は、上記のもの以外のmRNAの他の測定方法を使用してもよい。使用し得る他の方法としては、例えば、ノーザンブロット解析、リボヌクレアーゼプロテクション、溶液ハイブリダイゼーション法、半定量RT−PCR、およびin situハイブリダイゼーションが挙げられる。
いくつかの実施形態では、mRNAを適切に定量するために、参照値に対して、疾病または病状のマーカーをコードするmRNA量を比較することにより、定量を算出する。いくつかの実施形態では、参照値は、健康で疾病のない患者中に見られたmRNA量であろう。他の実施形態では、参照値は、ハウスキーピング遺伝子の発現レベルである。特定のかかる実施形態では、βアクチン、または他の適切な参照遺伝子を、参照値として使用する。当技術分野で周知である多数の他のハウスキーピング遺伝子を、参照値として使用してもよい。他の実施形態では、究極の比較が、疾病のない(コントロール)試料からの同じマーカーと比較したとき、疾病患者からのマーカーの発現レベルであるように、補正因子としてハウスキーピング遺伝子を使用する。いくつかの実施形態では、ハウスキーピング遺伝子は、上記のものなど、組織特異的遺伝子またはマーカーである。さらに他の実施形態では、マーカーの定量が絶対数により表されるように参照値は0である。いくつかの実施形態では、疾病患者からの1つ以上のマーカーと疾病のない人からの1つ以上の他のマーカーとの発現比率を比較する。いくつかの実施形態では、発現分析の早期ステージで試料について決定可能であり得るように、参照値に対する比較をリアルタイムに行う。例えば、試料を処理してリアルタイムで参照値と比較する場合、全長分析を必要とするよりむしろ、数回のみの増幅サイクル後にマーカーの発現が参照値を超えることを決定してもよい。いくつかの実施形態では、この早期比較は、迅速な診断および治療計画を必要とする場合(例えば、腎不全または移植拒絶反応前の強い損傷を受けたまたは機能不良な腎臓の治療)など、特に役立つ。
代替の実施形態では、既知量のスパイク標準RNAの使用による所与の試料の全効率を決定する能力は、投与非依存的および配列非依存的である実施形態に起因する。既知量のコントロールRNAの使用は、PCR測定値を元試料中の標的mRNAの量に換算することを可能とする。
いくつかの実施形態では、尿などの体液試料から標的成分(例えば、EMV)を抽出するためにキットを提供する。いくつかの実施形態では、キットは、捕捉機器および本明細
書に開示の方法を実行するのに有用な追加の品目を備える。いくつかの実施形態では、キットは、溶解バッファー、カオトロピック試薬、洗浄バッファー、アルコール、洗剤、またはその組合せからなる群から選択される1つ以上の試薬を備える。いくつかの実施形態では、キット試薬を個別または貯蔵容器内で提供する。いくつかの実施形態では、キット試薬をすぐ使用できる状態で提供する。いくつかの実施形態では、キット試薬を、使用前に希釈する原液の形態で提供する。いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に開示の方法を実行するのに有用なプラスチックパーツ(必要に応じて滅菌または滅菌可能)を備える。いくつかの実施形態では、キットは、ラック、遠心分離管、真空マニホールド、およびマルチウェルプレートからなる群から選択されるプラスチックパーツを備える。いくつかの実施形態では、使用説明書も提供する。
書に開示の方法を実行するのに有用な追加の品目を備える。いくつかの実施形態では、キットは、溶解バッファー、カオトロピック試薬、洗浄バッファー、アルコール、洗剤、またはその組合せからなる群から選択される1つ以上の試薬を備える。いくつかの実施形態では、キット試薬を個別または貯蔵容器内で提供する。いくつかの実施形態では、キット試薬をすぐ使用できる状態で提供する。いくつかの実施形態では、キット試薬を、使用前に希釈する原液の形態で提供する。いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に開示の方法を実行するのに有用なプラスチックパーツ(必要に応じて滅菌または滅菌可能)を備える。いくつかの実施形態では、キットは、ラック、遠心分離管、真空マニホールド、およびマルチウェルプレートからなる群から選択されるプラスチックパーツを備える。いくつかの実施形態では、使用説明書も提供する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の分析をヒト患者に適用可能であるが、いくつかの実施形態では、方法は動物に適用可能である(例えば、獣医診断)。
いくつかの実施形態では、腎移植後の病状または疾患の存在は、1つ以上のマーカーの変化した発現を含む。いくつかの実施形態では、発現の増加または減少を、前記マーカーをコードするmRNA量により測定する(他の実施形態では、DNAまたはタンパク質を使用して発現レベルを測定する)。いくつかの実施形態では、尿を患者から収集し直接評価する。いくつかの実施形態では、例えば、ろ過または遠心分離の使用により小胞を濃縮する。それから、単離した小胞を溶解バッファーとインキュベートし、小胞からRNAを遊離し、それから、RNAを定量PCR(または他の適切な増幅もしくは定量化技術)などの方法を用いて定量するcDNAのための鋳型として使用する。いくつかの実施形態では、患者小胞からの特異的マーカーRNAのレベルを、例えば、健康な患者集団からのRNAレベル、または同患者からの初期時点からのRNAレベルもしくは同患者からのコントロール遺伝子などの所望のコントロールと比較する。
実装機構
いくつかの実施形態に従えば、本明細書に記載の方法を、1つ以上の専用コンピュータ機器により実行することができる。専用コンピュータ機器は、配線で接続して技術を実行してもよく、1つ以上の特定用途向け集積回路(ASIC)もしくは技術を実行するように持続的にプログラムされたフィールドプログラマブルゲートアレイ(FPGA)などのデジタル電子機器を備えてもよく、またはファームウェア、メモリー、他の記憶装置、もしくは組合せ中にプログラム指示に従って技術を実行するようにプログラムされた1つ以上の汎用ハードウェアプロセッサを備えてもよい。このような専用コンピュータ機器は、技術を実行するように、カスタムハードワイヤードロジック、ASIC、またはFPGAをカスタムプログラムと組み合わせてもよい。専用コンピュータ機器は、技術を実行するように、デスクトップコンピュータシステム、サーバーコンピュータシステム、ポータブルコンピュータシステム、ハンドヘルドデバイス、ネットワークデバイスもしくは他の機器またはハードワイヤードおよび/またはプログラムロジックを組み込んだ機器の組合せであってもよい。
いくつかの実施形態に従えば、本明細書に記載の方法を、1つ以上の専用コンピュータ機器により実行することができる。専用コンピュータ機器は、配線で接続して技術を実行してもよく、1つ以上の特定用途向け集積回路(ASIC)もしくは技術を実行するように持続的にプログラムされたフィールドプログラマブルゲートアレイ(FPGA)などのデジタル電子機器を備えてもよく、またはファームウェア、メモリー、他の記憶装置、もしくは組合せ中にプログラム指示に従って技術を実行するようにプログラムされた1つ以上の汎用ハードウェアプロセッサを備えてもよい。このような専用コンピュータ機器は、技術を実行するように、カスタムハードワイヤードロジック、ASIC、またはFPGAをカスタムプログラムと組み合わせてもよい。専用コンピュータ機器は、技術を実行するように、デスクトップコンピュータシステム、サーバーコンピュータシステム、ポータブルコンピュータシステム、ハンドヘルドデバイス、ネットワークデバイスもしくは他の機器またはハードワイヤードおよび/またはプログラムロジックを組み込んだ機器の組合せであってもよい。
概して、iOS、Android、Chrome OS、Windows XP、Windows Vista、Windows 7、Windows 8、Windows Server、Windows CE、Unix、Linux、SunOS、Solaris、iOS、Blackberry OS、VxWorks、または他の互換性のあるオペレーティングシステムなどのオペレーティングシステムソフトウェアにより、コンピュータ機器(複数可)を制御、統合する。他の実施形態では、コンピュータ機器を、独占所有権のあるオペレーティングシステムにより制御してもよい。従来のオペレーティングシステムは、とりわけ、実行用コンピュータプロセスを制御、スケジュール化し、メモリー管理を行い、ファイルシステム、ネットワーキング、I/Oサービスを提供し、グラフ
ィカルユーザーインターフェース(「GUI」)などのユーザーインターフェース機能を提供する。
ィカルユーザーインターフェース(「GUI」)などのユーザーインターフェース機能を提供する。
いくつかの実施形態では、コンピュータシステムは、バスまたは情報通信用の他の通信機構、および情報処理用バスと接続したハードウェアプロセッサ、またはマルチプルプロセッサを備える。ハードウェアプロセッサ(複数可)は、例えば、1つ以上の汎用マイクロプロセッサであってもよい。
いくつかの実施形態では、コンピュータシステムは、ランダムアクセスメモリー(RAM)などのメインメモリー、キャッシュおよび/または情報記憶用バスと接続した他のダイナミックストレージデバイスおよびプロセッサにより実行される命令を備えてもよい。プロセッサにより実行される命令の実行中、一時的変数または他の中間情報を記憶するために、メインメモリーを使用してもよい。プロセッサにアクセス可能な記憶媒体に記憶された場合、このような命令は、コンピュータシステムを、命令に定められた動作を実行するようにカスタマイズされた専用機にする。
いくつかの実施形態では、コンピュータシステムは、読出し専用メモリー(ROM)または静的情報およびプロセッサに対する命令の記憶用バスと接続した他の静的記憶機器をさらに備える。磁気ディスク、光ディスク、またはUSBサムドライブ(フラッシュドライブ)、他などの記憶機器を準備し、情報および命令の記憶用バスと接続してもよい。
いくつかの実施形態では、コンピュータ使用者に情報を表示するために、コンピュータシステムを陰極線管(CRT)またはLCDディスプレイ(またはタッチスクリーン)などのディスプレイにバス経由で接続してもよい。英数字および他のキーを備える入力デバイスを、プロセッサとの情報および命令選択の通信用バスと接続する。使用者入力デバイスの別のタイプは、プロセッサとの指示情報および命令選択通信用およびディスプレイ上のカーソル移動制御用マウス、トラックボールなどのカーソル制御、またはカーソル方向キーである。この入力デバイスは、通常、機器が平面内の位置を特定することを可能とする二軸、第一軸(例えば、x)および第二軸(例えば、y)の二次自由度を有する。いくつかの実施形態では、同方向の情報およびカーソル制御などの命令選択を、カーソルなしでタッチスクリーン上にタッチを受けることにより実行してもよい。
いくつかの実施形態では、コンピュータシステムは、コンピュータ機器(複数可)により実行される実行用ソフトウェアコードとして大容量記憶装置内に記憶され得るGUIを実行するためのユーザーインターフェースモジュールを備えてもよい。例として、これおよび他のモジュールは、ソフトウェアコンポーネント、オブジェクト指向ソフトウェアコンポーネント、クラスコンポーネントおよびタスクコンポーネントなどのコンポーネント、処理、機能、属性、手順、サブルーチン、プログラムコード区間、ドライバー、ファームウェア、マイクロコード、回路、データ、データベース、データ構造、テーブル、アレイ、および変数を備えてもよい。
概して、本明細書で使用するとき、用語「モジュール」は、ハードウェアもしくはファームウェア中に具体化したロジック、または、例えば、Java、Lua、CもしくはC++などのプログラミング言語で書かれた入口および出口を場合により有するソフトウェア命令のコレクションを表す。ソフトウェアモジュールをダイナミックリンクライブラリにインストールした実行可能プログラムにコンパイルして連係してもよく、例えば、BASIC、Perl、もしくはPythonなどの解釈されたプログラミング言語で書いてもよい。ソフトウェアモジュールは、他のモジュールまたはそれ自体から呼び出し可能であってもよく、および/または検出された事象または割り込みに応じて呼び出してもよいと考えられるだろう。コンピュータ機器上で実行するために構成されたソフトウェアモジ
ュールを、コンパクトディスク、デジタルビデオディスク、フラッシュドライブ、磁気ディスク、またはその他の有形媒体などのコンピュータ可読媒体で、またはデジタルダウンロードとして提供してもよい(実行前にインストレーション、解凍または復号を要する圧縮またはインストール可能なフォーマットで元々記憶してもよい)。このようなソフトウェアコードを、コンピュータ機器により実行するために、実行するコンピュータ機器のメモリーデバイス上に部分的または完全に記憶してもよい。ソフトウェア命令を、EPROMなどのファームウェアに埋め込んでもよい。ハードウェアモジュールは、ゲートおよびフリップフロップなどの接続されたロジックユニットからなってもよく、および/またはプログラム可能なゲートアレイもしくはプロセッサなどのプログラム可能ユニットからなってもよいとさらに考えられるだろう。本明細書に記載のモジュールまたはコンピュータ機器の機能を、好ましくはソフトウェアモジュールとして実行するが、ハードウェアまたはファームウェア内で表現してもよい。概して、本明細書に記載のモジュールは、他のモジュールと組合せたまたはその物理編成もしくは記憶にかかわらずサブモジュールに分割してもよい論理モジュールを表す。
ュールを、コンパクトディスク、デジタルビデオディスク、フラッシュドライブ、磁気ディスク、またはその他の有形媒体などのコンピュータ可読媒体で、またはデジタルダウンロードとして提供してもよい(実行前にインストレーション、解凍または復号を要する圧縮またはインストール可能なフォーマットで元々記憶してもよい)。このようなソフトウェアコードを、コンピュータ機器により実行するために、実行するコンピュータ機器のメモリーデバイス上に部分的または完全に記憶してもよい。ソフトウェア命令を、EPROMなどのファームウェアに埋め込んでもよい。ハードウェアモジュールは、ゲートおよびフリップフロップなどの接続されたロジックユニットからなってもよく、および/またはプログラム可能なゲートアレイもしくはプロセッサなどのプログラム可能ユニットからなってもよいとさらに考えられるだろう。本明細書に記載のモジュールまたはコンピュータ機器の機能を、好ましくはソフトウェアモジュールとして実行するが、ハードウェアまたはファームウェア内で表現してもよい。概して、本明細書に記載のモジュールは、他のモジュールと組合せたまたはその物理編成もしくは記憶にかかわらずサブモジュールに分割してもよい論理モジュールを表す。
いくつかの実施形態では、コンピュータシステムは、コンピュータシステムとの併用において、コンピュータシステムを専用機にするまたは専用機になるようにプログラムする、カスタマイズしたハードワイヤードロジック、1つ以上のASICまたはFPGA、ファームウェアおよび/またはプログラムロジックを用いて本明細書に記載の方法を実行してもよい。1つの実施形態に従えば、本明細書の方法を、メインメモリー内に含まれる1つ以上の命令の1つ以上のシーケンスを実行するハードウェアプロセッサ(複数可)に応じてコンピュータシステムにより実行する。このような命令を、記憶機器などの別の記憶媒体からメインメモリーに読み取ってもよい。メインメモリーに含まれる命令のシーケンスの実行により、プロセッサ(複数可)に本明細書に記載の工程を実施させる。代替の実施形態では、ハードワイヤード回路をソフトウェア命令の代わりにまたはソフトウェア命令と併用して使用してもよい。
本明細書で使用するとき、用語「一時的でない媒体」、および同様の用語は、装置を具体的に動作させるデータおよび/または命令を記憶するいずれもの媒体を表す。このような一時的でない媒体は、非揮発性媒体および/または揮発性媒体を含んでもよい。非揮発性媒体としては、例えば、光ディスクもしくは磁気ディスク、または他のタイプの記憶機器が挙げられる。揮発媒体としては、メインメモリーなどのダイナミックメモリが挙げられる。一時的でない媒体の通常の形態としては、例えば、フロッピーディスク、フレキシブルディスク、ハードディスク、半導体ドライブ、磁気テープ、または他の磁気データ記憶媒体、CD−ROM、他の光データ記憶媒体、孔のパターンを有するいずれもの物理媒体、RAM、PROM、およびEPROM、FLASH−EPROM、NVRAM、その他のメモリーチップもしくはカートリッジ、ならびにそのネットワーク化バージョンが挙げられる。
一時的でない媒体は、伝送媒体とは異なるが、併用して使用してもよい。伝送媒体は、一時的でない媒体間の情報の伝達に関与する。例えば、伝達媒体としては、バスを含んでなる線を含む同軸ケーブル、銅線および光ファイバーが挙げられる。伝送媒体は、電波および赤外データ通信中に生じるものなど、音波または光波の形態も取り得る。
様々な形態の媒体は、実行のための1つ以上の命令の1つ以上のシーケンスをプロセッサに伝送することに関与し得る。例えば、初めに、遠隔コンピュータの磁気ディスクまたは半導体ドライブに命令を伝送してもよい。遠隔コンピュータは命令をそのダイナミックメモリにロードし、モデムまたはWANもしくはLANインターフェースなどの他のネットワークインターフェースを用いて電話線で命令を送信することができる。コンピュータシステム固有のモデムは電話線でデータを受けて、赤外電送機を使用してデータを赤外シ
グナルに変換することができる。赤外検知器は赤外シグナルで伝送されたデータを受けることができ、適切な回路はデータをバスに置くことができる。バスはデータをメインメモリーに伝送し、そこから、プロセッサは命令を検索して実行する。メインメモリーにより受けた命令は、命令を検索し実行してもよい。必要に応じて、プロセッサによる実行前または実行後のいずれかに記憶機器にメインメモリーにより受けた命令を記憶してもよい。
グナルに変換することができる。赤外検知器は赤外シグナルで伝送されたデータを受けることができ、適切な回路はデータをバスに置くことができる。バスはデータをメインメモリーに伝送し、そこから、プロセッサは命令を検索して実行する。メインメモリーにより受けた命令は、命令を検索し実行してもよい。必要に応じて、プロセッサによる実行前または実行後のいずれかに記憶機器にメインメモリーにより受けた命令を記憶してもよい。
いくつかの実施形態では、コンピュータシステムは、バスと接続した通信インターフェースも備えてもよい。通信インターフェースは、ローカルネットワークと接続されたネットワークリンクに連結している双方向データ通信を提供してもよい。例えば、通信インターフェースは、総合デジタル通信網(ISDN)カード、ケーブルモデム、衛星モデム、または対応するタイプの電話線とのデータ通信接続を提供するモデムであってもよい。別の例としては、通信インターフェースは、互換LAN(またはWANと通信するWANコンポーネント)とデータ通信接続を提供するローカルエリアネットワーク(LAN)カードであってもよい。無線リンクも実行してもよい。いずれものこのような実行では、通信インターフェースは、様々なタイプの情報を表現するデジタルデータストリームを伝送する電気、電磁気または光シグナルを送受信する。
ネットワークリンクは、通常、1つ以上のネットワークを通って他のデータ機器にデータ通信を提供してもよい。例えば、ネットワークリンクは、ローカルネットワークを通って、ホストコンピュータまたはインターネットサービスプロバイダー(ISP)により運用されているデータ装置への接続を提供してもよい。次いで、ISPは、現在共通に「インターネット」と呼ばれているワールドワイドパケットデータ通信ネットワークを通ってデータ通信サービスを提供する。ローカルネットワークおよびインターネットは両方デジタルデータストリームを伝送する電気、電磁気または光シグナルを使用する。コンピュータシステムへおよびコンピュータシステムからのデジタルデータを伝送する様々なネットワークを通ったシグナルおよびネットワークリンク上および通信インターフェースを通ったシグナルは、伝送媒体の例証となる形態である。
いくつかの実施形態では、コンピュータシステムは、ネットワーク(複数可)、ネットワークリンク、および通信インターフェースを通って、メッセージを送信し、プログラムコードを含むデータを受信する。インターネットの例では、サーバーは、インターネット、ISP、ローカルネットワーク、および通信インターフェースを通って、要求されたアプリケーションプログラム用コードを伝送し得る。
受信したコードを、それを受けたときに、プロセッサにより実行してもよく、および/または記憶機器、または後で実行するために他の不揮発性記憶装置に記憶してもよい。
限定的意味よりむしろ例証の意味で見るべき下記の実施例を参照して特定の実施形態を記載する。
患者および試料
本試験は、市立札幌病院における施設内審査委員会により審査および承認された。腎移植患者(N=205)を本発明者らの施設において腎移植を受けたものから募集した。15mL以下のスポット尿試料(N=437)を、入院および手術後検査中にインフォームドコンセントを行って収集した。試料を分析するまで−80℃で3時間まで室温において貯蔵した。Banff診断基準2011を用いてeGFR、尿タンパクおよび腎生検に基づいて移植後合併症を診断した(付随表1)。
本試験は、市立札幌病院における施設内審査委員会により審査および承認された。腎移植患者(N=205)を本発明者らの施設において腎移植を受けたものから募集した。15mL以下のスポット尿試料(N=437)を、入院および手術後検査中にインフォームドコンセントを行って収集した。試料を分析するまで−80℃で3時間まで室温において貯蔵した。Banff診断基準2011を用いてeGFR、尿タンパクおよび腎生検に基づいて移植後合併症を診断した(付随表1)。
尿中EMV mRNA分析
先に記載したように、EMV mRNAアッセイを行った。凍結尿試料を37℃水浴にて解凍し、15分間、800xgで遠心分離して尿中細胞および円柱などの大きな粒子を取り除いた。EMVを含む10mL上澄みをエキソソーム単離チューブ(Hitachi
Chemical Diagnostics, Inc.(HCD))による処理後、オリゴ(dT)固定マイクロプレート(HCD)を用いてEMV溶解、mRNA単離およびcDNA合成した。ViiA7リアルタイムPCRシステム(Life Technologies)を用いて、64のmRNAを定量した。これらのバイオマーカー候補を腎拒絶反応において差次的発現されたものおよび健康な対象の尿中EMV中の対応する発現レベル(未公表RNA配列データ)から選択した。参照遺伝子のため、GAPDHおよびACTBを分析した。これらの中で、本試験においてANXA1を選択した。ANXA1、GAPDHおよびACTBのプライマー配列は下記表4中で得られる。ANXA1の発現レベルを、カットオフ値が6であるΔCt法を用いてGAPDHの発現レベルにより正規化した。ΔCt法では、試料のANAX1サイクル閾値(Ct値)を、その同試料のハウスキーピング遺伝子(例えば、ACTB、GAPDH)のCt値から差し引く。従って、より小さなΔCt値ほど、より高いANAX1遺伝子発現となる。図3に示すように、安定な回復患者のΔCt値は5〜6であったが、ABMR患者のΔCt値は約2であった。このことは、ABMR患者においてΔCt値が3〜4に低下することは、上記報告したおよそ14倍に増加することに相当することを示している。Mann−Whitney−Wilcoxon検定において1%または5%未満のp値により統計的有意性を決定した。R(R foundation、バージョン3.2.0)を用いてデータ解析し、「ROCR」パッケージによりAUCを算出した。PCR分析用に使用するセンスおよびアンチセンスプライマーを下記表4に示す。
先に記載したように、EMV mRNAアッセイを行った。凍結尿試料を37℃水浴にて解凍し、15分間、800xgで遠心分離して尿中細胞および円柱などの大きな粒子を取り除いた。EMVを含む10mL上澄みをエキソソーム単離チューブ(Hitachi
Chemical Diagnostics, Inc.(HCD))による処理後、オリゴ(dT)固定マイクロプレート(HCD)を用いてEMV溶解、mRNA単離およびcDNA合成した。ViiA7リアルタイムPCRシステム(Life Technologies)を用いて、64のmRNAを定量した。これらのバイオマーカー候補を腎拒絶反応において差次的発現されたものおよび健康な対象の尿中EMV中の対応する発現レベル(未公表RNA配列データ)から選択した。参照遺伝子のため、GAPDHおよびACTBを分析した。これらの中で、本試験においてANXA1を選択した。ANXA1、GAPDHおよびACTBのプライマー配列は下記表4中で得られる。ANXA1の発現レベルを、カットオフ値が6であるΔCt法を用いてGAPDHの発現レベルにより正規化した。ΔCt法では、試料のANAX1サイクル閾値(Ct値)を、その同試料のハウスキーピング遺伝子(例えば、ACTB、GAPDH)のCt値から差し引く。従って、より小さなΔCt値ほど、より高いANAX1遺伝子発現となる。図3に示すように、安定な回復患者のΔCt値は5〜6であったが、ABMR患者のΔCt値は約2であった。このことは、ABMR患者においてΔCt値が3〜4に低下することは、上記報告したおよそ14倍に増加することに相当することを示している。Mann−Whitney−Wilcoxon検定において1%または5%未満のp値により統計的有意性を決定した。R(R foundation、バージョン3.2.0)を用いてデータ解析し、「ROCR」パッケージによりAUCを算出した。PCR分析用に使用するセンスおよびアンチセンスプライマーを下記表4に示す。
結論
結論として、患者の腎移植後の病状のモニタリングのための安全で効果的である革新的ストラテジーを本明細書に開示する。本願の方法は、非侵襲的であり、現在の標準的技法(例えば、生検)より前に腎移植拒絶反応および他の合併症を同定する有望な診断および予後アッセイを提供することができる。該方法は、また、現在の標準的技法より標的を絞った方法で、いつ生検を実施すべきかを示す。
結論として、患者の腎移植後の病状のモニタリングのための安全で効果的である革新的ストラテジーを本明細書に開示する。本願の方法は、非侵襲的であり、現在の標準的技法(例えば、生検)より前に腎移植拒絶反応および他の合併症を同定する有望な診断および予後アッセイを提供することができる。該方法は、また、現在の標準的技法より標的を絞った方法で、いつ生検を実施すべきかを示す。
上記開示の実施形態の特異的特徴および態様の様々な組合せまたは副組合せを行ってもよいが、それでもやはり本発明の1つ以上に含まれると理解される。さらに、実施形態に関していずれもの特定の特徴、態様、方法、特性、特有性、品質、特質、要素等の本明細書中の開示を、本明細書に記載の他の全ての実施形態で使用することができる。従って、開示された実施形態の様々な特徴および態様を、本開示された発明の様々な方法を形成するために互いに組み合わせるまたは置き換えることができると理解すべきである。従って、本明細書に開示した本発明の範囲を上記特定の開示された実施形態により限定すべきでないものとする。さらに、本発明は様々な変更、および代替の形態の影響を受けやすいが、その具体例を図で示しており、本明細書に詳細に記載する。しかしながら、本発明は開
示した特定の形態または方法に限定されないが、それとは反対に、本発明は記載した様々な実施形態および添付の請求の範囲の趣旨および範囲内である全ての変更、均等物、および代替物を包含するものとすることを理解するべきである。本明細書に開示のいずれもの方法は、必ずしも、記載した順番で実施する必要はない。本明細書に開示した方法は、開業医によりなされる特定の行為を含むが;しかしながら、明示的あるいは含蓄的のいずれかでこれらの行為のいずれもの第三者の指示も包含し得る。例えば、「疾病または病状のため対象を治療する」などの措置は、「疾病または病状のため対象の治療の管理を指示する」を含む。
示した特定の形態または方法に限定されないが、それとは反対に、本発明は記載した様々な実施形態および添付の請求の範囲の趣旨および範囲内である全ての変更、均等物、および代替物を包含するものとすることを理解するべきである。本明細書に開示のいずれもの方法は、必ずしも、記載した順番で実施する必要はない。本明細書に開示した方法は、開業医によりなされる特定の行為を含むが;しかしながら、明示的あるいは含蓄的のいずれかでこれらの行為のいずれもの第三者の指示も包含し得る。例えば、「疾病または病状のため対象を治療する」などの措置は、「疾病または病状のため対象の治療の管理を指示する」を含む。
とりわけ、「できる(can)」、「できる(could)」、「してもよい(might)」、または「してもよい(may)」などの条件的言語は、特に別段の指定がない限り、または使用したときの文脈内で別様に理解されない限り、概して、他の実施形態は含まないが、特定の実施形態が特定の特徴、要素および/またはステップを含むことを伝えるものとする。従って、このような条件的言語は、概して、特徴、要素および/またはステップが何らか1つ以上の実施形態に必要であることを暗示していないものとする。
「第一(first)」、「第二(second)」、「第三(third)、「第四(fourth)」、「第五(fifth)」、「第六(sixth)」、「第七(seventh)」、「第八(eighth)」、「第九(ninth)」、「第十(tenth)」、または「第十一(eleventh)」およびそれ以上は、特に別段の指定がない限り、または使用したときの文脈内で別様に理解されない限り、概して、いずれもの順番を表し、必ずしも、対応する通常の数の単純解釈に基づいた順番を表さない。従って、通常の数を用いる用語は別の個々を単に示し得るし、必ずしも、その間の順番を意味しないかもしれない。従って、例えば、本願で使用する第一および第二バイオマーカーは、単に2組のバイオマーカーがあることを意味し得る。すなわち、いずれもの態様において、「第一」および「第二」組のデータ間の順番の意図が必ずしもないかもしれない。
本明細書に開示した範囲は、いずれかおよび全ての重複部分、部分範囲、およびその組合せも包含する。「まで(up to)」、「少なくとも(at least)」、「より大きい(greater than)」、「より小さい(less than)」、「の間(between)」等の言語は記載した数を含む。「約(about)」または「約(approximately)」などの用語が前に付く数は、記載した数を含む。例えば、「約10ナノメートル」は、「10ナノメートル」を含む。
様々な実施形態を例証目的のため付属の図に示すが、実施形態の範囲を限定するものと決して解釈すべきではない。さらに、異なる開示された実施形態の様々な特徴を組み合わせてさらなる実施形態を作ることができるが、これは本開示の一部である。
図1Aは、間質性線維症(ci)に関する対象のBanffスコアの関数として該対象の尿中EMV中のアネキシンA1(ANXA1)mRNA発現のプロットを示す。 図1Bは、尿細管萎縮(ct)に関する対象のBanffスコアの関数として該対象の尿中EMV中のANXA1 mRNA発現のプロットを示す。 図1Cは、全間質性炎症(ti)に関する対象のBanffスコアの関数として該対象の尿中EMV中のANXA1 mRNA発現のプロットを示す。
図1Dは、尿細管炎(t)に関する対象のBanffスコアの関数として該対象の尿中EMV中のANXA1 mRNA発現のプロットを示す。 図1Eは、間質の浸潤(i)に関する対象のBanffスコアの関数として該対象の尿中EMV中のANXA1 mRNA発現のプロットを示す。 図1Fは、内膜動脈炎(v)に関する対象のBanffスコアの関数として該対象の尿中EMV中のANXA1 mRNA発現のプロットを示す。
図1Gは、硝子質細動脈肥厚(ah)に関する対象のBanffスコアの関数として該対象の尿中EMV中のANXA1 mRNA発現のプロットを示す。 図1Hは、傍尿細管毛細管炎(ptc)に関する対象のBanffスコアの関数として該対象の尿中EMV中のANXA1 mRNA発現のプロットを示す。 図1Iは、糸球体腎炎(g)に関する対象のBanffスコアの関数として該対象の尿中EMV中のANXA1 mRNA発現のプロットを示す。
図1Jは、血管線維化内膜肥厚(cv)に関する対象のBanffスコアの関数として該対象の尿中EMV中のANXA1 mRNA発現のプロットを示す。 図1Kは、硝子質細動脈肥厚(aah)の代替のスコア化に関する対象のBanffスコアの関数として該対象の尿中EMV中のANXA1 mRNA発現のプロットを示す。 図1Lは、Banff法により決定するとき傍尿細管毛細血管炎(ptcbm)に関する該対象のBanffスコアの関数として対象の尿中EMV中のANXA1 mRNA発現のプロットを示す。
図1Mは、慢性糸球体症(cg)に関する対象のBanffスコアの関数として該対象の尿中EMV中のANXA1 mRNA発現のプロットを示す。 図1Nは、補体C4d染色(c4d)に関する対象のBanffスコアの関数として該対象の尿中EMV中のANXA1 mRNA発現のプロットを示す。 図1Oは、メサンギウム基質増加(mm)に関する対象のBanffスコアの関数として該対象の尿中EMV中のANXA1 mRNA発現のプロットを示す。
図2Aは、対象の尿タンパクレベルの関数として該対象の尿中EMV中のA NXA1 mRNA発現の散布図を示す。 図2Bは、対象の尿クレアチニンレベルの関数として該対象の尿中EMV中のANXA1 mRNA発現の散布図を示す。 図2Cは、対象の血清クレアチニンレベルの関数として該対象の尿中EMV中のANXA1 mRNA発現の散布図を示す。 図2Dは、対象の推定糸球体濾過量の関数として該対象の尿中EMV中のANXA1 mRNA発現の散布図を示す。
患者および試料の分類の模式図を示す。
腎移植後の病状の様々なタイプに関する対象の状態の関数として該対象の尿中EMV中のANXA1 mRNA発現のプロットを示す。統計的有意性をMann−Whitney−Wilcoxon検定により決定した:p<0.05については1つの星印(*)、p<0.0001については4つの星印(****)。
図5Aは、移植拒絶反応が対象に確認された日付からの時間の関数として該対象の尿中EMV中のANXA1 mRNA発現のプロットを示す。統計的有意性をMann−Whitney−Wilcoxon検定により決定した:p<0.01については2つの星印(**)、p<0.001については3つの星印(***)、p<0.0001については4つの星印(****)。 図5Bは、移植拒絶反応確認前(実線)、中(破線)および後(点線)のANXA1 mRNA発現についての受信者動作特性(ROC)解析を示す。 図5Cは、間質性線維症および尿細管萎縮(IFTA)が対象に確認された日付からの時間の関数として該対象の尿中EMV中のANXA1 mRNA発現のプロットを示す。統計的有意性をMann−Whitney−Wilcoxon検定により決定した:p<0.01については2つの星印(**)、p<0.001については3つの星印(***)、p<0.0001については4つの星印(****)。 図5Dは、IFTA確認前(実線)、確認中(破線)および確認後(点線)のANXA1 mRNA発現についての受信者動作特性(ROC)解析を示す。 図5Eは、免疫グロブリンA(IgA)腎症およびカルシニューリン阻害剤(CNI)中毒などの他の合併症が対象に確認された日付からの時間の関数として該対象の尿中EMV中のANXA1 mRNA発現のプロットを示す。統計的有意性をMann−Whitney−Wilcoxon検定により決定した:p<0.01については2つの星印(**)、p<0.001については3つの星印(***)、p<0.0001については4つの星印(****)。 図5Fは、合併症確認前(実線)、確認中(破線)および確認後(点線)のANXA1 mRNA発現についての受信者動作特性(ROC)解析を示す。
尿中EMV mRNA分析
先に記載したように、EMV mRNAアッセイを行った。凍結尿試料を37℃水浴にて解凍し、15分間、800xgで遠心分離して尿中細胞および円柱などの大きな粒子を取り除いた。EMVを含む10mL上澄みをエキソソーム単離チューブ(Hitachi
Chemical Diagnostics, Inc.(HCD))による処理後、オリゴ(dT)固定マイクロプレート(HCD)を用いてEMV溶解、mRNA単離およびcDNA合成した。ViiA7リアルタイムPCRシステム(Life Technologies)を用いて、64のmRNAを定量した。これらのバイオマーカー候補を腎拒絶反応において差次的発現されたものおよび健康な対象の尿中EMV中の対応する発現レベル(未公表RNA配列データ)から選択した。参照遺伝子のため、GAPDHおよびACTBを分析した。これらの中で、本試験においてANXA1を選択した。ANXA1、GAPDHおよびACTBのプライマー配列は下記表4中で得られる。ANXA1の発現レベルを、カットオフ値が6であるΔCt法を用いてGAPDHの発現レベルにより正規化した。ΔCt法では、試料のANXA1サイクル閾値(Ct値)を、その同試料のハウスキーピング遺伝子(例えば、ACTB、GAPDH)のCt値から差し引く。従って、より小さなΔCt値ほど、より高いANXA1遺伝子発現となる。図3に示すように、安定な回復患者のΔCt値は5〜6であったが、ABMR患者のΔCt値は約2であった。このことは、ABMR患者においてΔCt値が3〜4に低下することは、上記報告したおよそ14倍に増加することに相当することを示している。Mann−Whitney−Wilcoxon検定において1%または5%未満のp値により統計的有意性を決定した。R(R foundation、バージョン3.2.0)を用いてデータ解析し、「ROCR」パッケージによりAUCを算出した。PCR分析用に使用するセンスおよびアンチセンスプライマーを下記表4に示す。
先に記載したように、EMV mRNAアッセイを行った。凍結尿試料を37℃水浴にて解凍し、15分間、800xgで遠心分離して尿中細胞および円柱などの大きな粒子を取り除いた。EMVを含む10mL上澄みをエキソソーム単離チューブ(Hitachi
Chemical Diagnostics, Inc.(HCD))による処理後、オリゴ(dT)固定マイクロプレート(HCD)を用いてEMV溶解、mRNA単離およびcDNA合成した。ViiA7リアルタイムPCRシステム(Life Technologies)を用いて、64のmRNAを定量した。これらのバイオマーカー候補を腎拒絶反応において差次的発現されたものおよび健康な対象の尿中EMV中の対応する発現レベル(未公表RNA配列データ)から選択した。参照遺伝子のため、GAPDHおよびACTBを分析した。これらの中で、本試験においてANXA1を選択した。ANXA1、GAPDHおよびACTBのプライマー配列は下記表4中で得られる。ANXA1の発現レベルを、カットオフ値が6であるΔCt法を用いてGAPDHの発現レベルにより正規化した。ΔCt法では、試料のANXA1サイクル閾値(Ct値)を、その同試料のハウスキーピング遺伝子(例えば、ACTB、GAPDH)のCt値から差し引く。従って、より小さなΔCt値ほど、より高いANXA1遺伝子発現となる。図3に示すように、安定な回復患者のΔCt値は5〜6であったが、ABMR患者のΔCt値は約2であった。このことは、ABMR患者においてΔCt値が3〜4に低下することは、上記報告したおよそ14倍に増加することに相当することを示している。Mann−Whitney−Wilcoxon検定において1%または5%未満のp値により統計的有意性を決定した。R(R foundation、バージョン3.2.0)を用いてデータ解析し、「ROCR」パッケージによりAUCを算出した。PCR分析用に使用するセンスおよびアンチセンスプライマーを下記表4に示す。
Claims (12)
- 対象からの尿試料中のANXA1レベルを検出することを含む前記対象の腎移植後合併症の存在の検出方法であって、前記ANXA1が尿中エキソソームおよび微小胞中に存在し、少なくとも1つのマーカーのレベル上昇の前記検出が前記対象の腎移植後合併症の存在を示す、前記方法。
- 前記腎移植後合併症が、急性拒絶反応、慢性拒絶反応、境界域、間質性線維症および尿細管萎縮、免疫グロブリンA(IgA)腎症ならびにカルシニューリン阻害剤(CNI)中毒からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記腎移植後合併症が、急性拒絶反応、慢性拒絶反応、間質性線維症および尿細管萎縮からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- ACTBおよびGAPDHからなる群から選択される参照遺伝子を検出する工程をさらに含み、前記参照遺伝子を使用して少なくとも1つのマーカーレベルを正規化する、請求項1に記載の方法。
- 前記レベル上昇が腎移植後合併症のないドナーの尿試料中の前記マーカーのレベルと比較して2倍より高い、請求項1に記載の方法。
- 腎移植後合併症と関連するRNAを発現するヒト対象のスクリーニング方法であって、前記方法が、前記対象からの尿試料から単離された小胞中の前記RNAの発現を腎移植後合併症のないドナーの尿試料から単離された小胞中の前記RNAの発現と比較することを含み、腎移植後合併症と関連する前記RNAがANXA1であり、前記ドナーの前記RNAの前記発現と比較した前記対象の前記RNAの前記発現の増加は、前記増加が閾値を超える場合に前記対象が腎移植後合併症を有することを示し、前記尿試料から単離した前記小胞中の前記RNAの前記発現の前記比較が:
(a)前記試料を前記対象から小胞捕捉フィルターを通過させることにより前記対象からの前記試料から前記小胞を捕捉することと、
(b)前記小胞捕捉フィルター上に溶解バッファーをロードすることにより前記小胞を溶解して小胞関連RNAを遊離することと、
(c)前記小胞関連RNA中の腎移植後合併症と関連する前記RNAの前記発現をPCRにより定量することと、
をさらに含む、前記方法。 - PCRによる、前記RNAの前記発現の定量が:
前記小胞関連RNAを逆転移酵素と接触させて相補DNA(cDNA)を生成すること;
前記cDNAを腎移植後合併症と関連する前記RNAに対して特異的であるセンスおよびアンチセンスプライマー、ならびにDNAポリメラーゼと接触させて増幅DNAを生成すること;
前記cDNAを参照RNAに対して特異的であるセンスおよびアンチセンスプライマー、ならびに前記DNAポリメラーゼと接触させて増幅DNAを生成すること;および
解析ソフトウェアを使用して前記RNAの発現レベル、量(quantity)または量(amount)を決定すること、
を含む、請求項6に記載の方法。 - 解析ソフトウェアを使用して腎移植後合併症と関連する前記RNAの発現レベル、量(quantity)または量(amount)を決定することが:
解析ソフトウェアを使用して腎移植後合併症と関連する前記RNAのマーカーサイクル閾値(Ct値)を決定すること;
解析ソフトウェアを使用して参照RNAの参照Ct値を決定すること:および
参照Ct値からマーカーCt値を差し引いてマーカーΔCt値を得ること、
を含む、請求項7に記載の方法。 - 前記参照RNAが、ACTBおよびGAPDHからなる群から選択される、請求項8に記載の方法。
- 前記マーカーΔCt値が6未満である場合、前記増加が前記閾値を超える、請求項6に記載の方法。
- マーカーΔCt値をコントロールΔCt値と比較することをさらに含み、前記コントロールΔCt値を、コントロール参照Ct値からコントロールマーカーCt値を差し引くことにより決定し、前記コントロールマーカーCt値が健康なドナー集団の尿中小胞中の腎移植後合併症と関連する前記RNAのCt値であり、前記コントロール参照Ct値が健康なドナー集団の尿中小胞中の前記参照RNAのCt値である、請求項6に記載の方法。
- 前記マーカーΔCt値が前記コントロールΔCt値より少なくとも2小さい場合、前記増加が前記閾値を超える、請求項10に記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
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