JP2018029583A - 癌幹細胞集団及びその作製方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明者らは高度免疫不全マウスで癌細胞株を樹立し、その樹立細胞株を用いて、階層構造を持つがんと階層構造を持たないがんを比較・解析した。さらに、癌幹細胞モデルに帰属する階層構造を持つがんでは、その癌幹細胞の分離・濃縮・均質化・大量培養の方法が無いため、解析や癌幹細胞を用いた薬剤のスクリーニングなどに支障が生じているため、その問題の解決を試みた。
〔1〕癌形成能が無い細胞が実質的に除去された癌幹細胞の集団であって、癌組織の階層構造を再現する特徴を有する癌幹細胞集団。
〔2〕前記癌幹細胞がヒト腫瘍組織由来であることを特徴とする、〔1〕に記載の癌幹細胞集団。
〔3〕前記ヒト腫瘍組織が、上皮癌由来の腫瘍組織であることを特徴とする、〔2〕に記載の癌幹細胞集団。
〔4〕前記上皮癌が、膵臓癌、前立腺癌、乳癌、皮膚癌、消化管の癌、肺癌、肝細胞癌、子宮頸癌、子宮体癌、卵巣癌、卵管癌、膣癌、肝臓癌、胆管癌、膀胱癌、尿管の癌、甲状腺癌、副腎癌、腎臓癌、又は、その他の腺組織の癌であることを特徴とする、〔3〕に記載の癌幹細胞集団。
〔5〕実質的に均質であることを特徴とする、〔1〕〜〔4〕のいずれかに記載の癌幹細胞集団。
〔6〕Extreme Limiting Dilution Analysisにおいて癌幹細胞の頻度が1/20以上であることを特徴とする、〔1〕〜〔5〕のいずれかに記載の癌幹細胞集団。
〔7〕癌幹細胞を1x104個以上含むことを特徴とする〔1〕〜〔6〕のいずれかに記載の癌幹細胞集団。
〔8〕癌幹細胞を含む細胞群を付着培養する工程を含む方法により作製されることを特徴とする、〔1〕〜〔7〕のいずれかに記載の癌幹細胞集団。
〔9〕下記(1)〜(3)の工程を含む方法により作製されることを特徴とする、〔1〕〜〔8〕のいずれかに記載の癌幹細胞集団;
(1)癌幹細胞を含む細胞群を、同一又は異なる種に属する非ヒト動物に移植し、癌細胞塊を作製する工程、
(2)作製された癌細胞塊を細分化する工程、及び
(3)(2)の工程により得られた細胞集団を幹細胞培地にて付着培養する工程。
〔10〕前記非ヒト動物が、ヌードマウス、SCIDマウス、NOD-SCIDマウス、NOGマウス、又はヌードラットのいずれかであることを特徴とする、〔1〕〜〔9〕のいずれかに記載の癌幹細胞集団。
〔11〕癌幹細胞を含む細胞群を付着培養する工程を含む、癌形成能が無い細胞が実質的に除去された癌幹細胞の集団を作製する方法。
〔12〕前記癌幹細胞を含む細胞群が、癌組織の階層構造を再現する細胞群であることを特徴とする、〔11〕に記載の方法。
〔13〕前記癌組織の階層構造を再現する細胞群が非ヒト動物で樹立した癌細胞株、スフェロイド、又は、癌幹細胞マーカーCD24、CD29、CD34、CD44、CD49f、CD56、CD90、CD117、CD133、CD135、CD166、CD184、CD271、CD326、Aldefluor、ABCG2、ABCG5、LGR5、及びMsi1から選択される少なくとも1つ以上のマーカーが陽性の細胞であることを特徴とする、〔12〕に記載の方法。
〔14〕付着培養を行う前に癌幹細胞を含む細胞群を増殖させることを特徴とする、〔11〕〜〔13〕のいずれか一項に記載の方法。
〔15〕スフェロイド培養により癌幹細胞を含む細胞群を増殖させることを特徴とする、〔14〕に記載の方法。
〔16〕非ヒト動物に移植し継代することにより細胞群を増殖させることを特徴とする、〔14〕に記載の方法。
〔17〕前記癌幹細胞が、ヒト腫瘍組織由来であることを特徴とする、〔11〕〜〔16〕のいずれか一項に記載の方法。
〔18〕前記ヒト腫瘍組織が、上皮癌由来の腫瘍組織であることを特徴とする、〔17〕に記載の方法。
〔19〕前記上皮癌が、膵臓癌、前立腺癌、乳癌、皮膚癌、消化管の癌、肺癌、肝細胞癌、子宮頸癌、子宮体癌、卵巣癌、卵管癌、膣癌、肝臓癌、胆管癌、膀胱癌、尿管の癌、甲状腺癌、副腎癌、腎臓癌、又は、その他の腺組織の癌であることを特徴とする、〔18〕に記載の方法。
〔20〕前記非ヒト動物が、ヌードマウス、SCIDマウス、NOD-SCIDマウス、NOGマウス、又はヌードラットのいずれかであることを特徴とする、〔11〕〜〔19〕のいずれか一項に記載の方法。
〔21〕〔1〕〜〔10〕のいずれかに記載の癌幹細胞集団が移植された非ヒト動物モデル又は該癌幹細胞集団のin vitro条件下での培養系において、癌幹細胞から形成される階層構造、癌幹細胞から始まる癌進展プロセス、又は癌幹細胞の生物学的特性を指標として評価を行うことを特徴とする、医薬品のターゲット分子探索方法。
〔22〕下記(1)〜(4)に記載された工程を含むことを特徴とする、〔21〕に記載の医薬品のターゲット分子探索方法;
(1)〔1〕〜〔10〕のいずれかに記載の癌幹細胞集団を非ヒト動物に移植することにより非ヒト動物モデルを作製する工程、
(2)該癌幹細胞集団の癌進展プロセスにおいて特徴的に認められる組織構造、又はその生物学的特性を示す組織片を採取する工程、
(3)(2)において採取した組織片についてDNA、RNA、タンパク質、ペプチド又は代謝産物の発現を調べる工程、及び
(4)組織片中の癌幹細胞から形成される階層構造、癌幹細胞から始まる癌進展プロセス、又は癌幹細胞の生物学的特性に依存的に変動するDNA、RNA、タンパク質、ペプチド又は代謝産物を同定する工程。
〔23〕下記(1)〜(3)に記載された工程を含むことを特徴とする、〔21〕に記載の医薬品のターゲット分子探索方法;
(1)〔1〕〜〔10〕のいずれかに記載の癌幹細胞集団をin vitro条件下で培養し、癌幹細胞から始まる癌進展プロセスの特徴構造、又は癌幹細胞の生物学的特性を再現する工程、
(2)特徴構造を再現した培養細胞の、DNA、RNA、タンパク質、ペプチド又は代謝産物の発現を調べる工程、及び
(3)培養細胞中の癌幹細胞から形成される階層構造、癌幹細胞から始まる癌進展プロセス、又は癌幹細胞の生物学的特性に依存的に変動するDNA、RNA、タンパク質、ペプチド及び代謝産物を同定する工程。
〔24〕前記医薬品が抗癌剤であることを特徴とする、〔21〕〜〔23〕のいずれか一項に記載の方法。
〔25〕前記ターゲット分子が癌細胞マーカーであることを特徴とする、〔21〕〜〔24〕のいずれか一項に記載の方法。
〔26〕〔1〕〜〔10〕のいずれかに記載の癌幹細胞集団が移植された非ヒト動物モデル又は該癌幹細胞集団のin vitro条件下での培養系において、癌幹細胞から形成される階層構造、癌幹細胞から始まる癌進展プロセス、又は癌幹細胞の生物学的特性を指標として評価を行うことを特徴とする、医薬品の評価方法。
〔27〕下記(1)〜(5)に記載された工程を含むことを特徴とする、〔26〕に記載の医薬品の評価方法;
(1)〔1〕〜〔10〕のいずれかに記載の癌幹細胞集団を非ヒト動物に移植することにより非ヒト動物モデルを作製する工程、
(2)被験物質を(1)の非ヒト動物モデルに投与する工程、
(3)癌幹細胞から始まる癌進展プロセスにおいて特徴的に認められる組織構造、又はその生物学的特性を示す組織片を採取する工程、
(4)組織片中の癌幹細胞の経時変化、癌進展プロセス、又はその生物学的特性を観察する工程、及び
(5)被験物質により阻害された癌幹細胞から形成される階層構造形成、癌幹細胞から始まる癌進展プロセス、又は癌幹細胞の生物学的特性を同定する工程。
〔28〕下記(1)〜(4)に記載された工程を含むことを特徴とする、 〔26〕に記載の医薬品の評価方法;
(1)〔1〕〜〔10〕のいずれかに記載の癌幹細胞集団をin vitro条件下で培養し、癌幹細胞から始まる癌進展プロセスの特徴構造、又は癌幹細胞の生物学的特性を再現する工程、
(2)被験物質で(1)の培養細胞を処理する工程、
(3)癌幹細胞から形成される階層構造の変化、癌幹細胞から始まる癌進展プロセス、又は癌幹細胞の生物学的特性を観察する工程、及び
(4)被験物質により阻害された癌幹細胞から形成される階層構造形成、癌幹細胞から始まる癌進展プロセス、又は癌幹細胞の生物学的特性を同定する工程。
〔29〕〔1〕〜〔10〕のいずれかに記載の癌幹細胞集団が移植された非ヒト動物モデル又は該癌幹細胞集団のin vitro条件下での培養系において、癌幹細胞から形成される階層構造、癌幹細胞から始まる癌進展プロセス、又は癌幹細胞の生物学的特性を指標として評価を行うことを特徴とする、医薬品のスクリーニング方法。
〔30〕下記(1)〜(5)に記載された工程を含むことを特徴とする、〔29〕に記載の医薬品のスクリーニング方法;
(1)〔1〕〜〔10〕のいずれかに記載の癌幹細胞集団を非ヒト動物に移植することにより非ヒト動物モデルを作製する工程、
(2)被験物質を(1)の非ヒト動物モデルに投与する工程、
(3)癌幹細胞から始まる癌進展プロセスにおいて特徴的に認められる組織構造、又はその生物学的特性を示す組織片を採取する工程、
(4)組織片中の癌幹細胞の経時変化、癌進展プロセス、又はその生物学的特性を観察する工程、及び
(5)特定の癌幹細胞から形成される階層構造形成、癌幹細胞から始まる癌進展プロセス、又は癌幹細胞の生物学的特性を阻害する被験物質を同定する工程。
〔31〕下記(1)〜(4)に記載された工程を含むことを特徴とする、〔29〕に記載の医薬品のスクリーニング方法;
(1)〔1〕〜〔10〕のいずれかに記載の癌幹細胞集団をin vitro条件下で培養し、癌幹細胞から始まる癌進展プロセスの特徴構造、又は癌幹細胞の生物学的特性を再現する工程、
(2)被験物質で(1)の培養細胞を処理する工程、
(3)癌幹細胞から形成される階層構造の変化、癌幹細胞から始まる癌進展プロセス、又は癌幹細胞の生物学的特性を観察する工程、及び
(4)特定の癌幹細胞から形成される階層構造形成、癌幹細胞から始まる癌進展プロセス、又は癌幹細胞の生物学的特性を阻害する被験物質を同定する工程。
〔32〕前記医薬品が、抗癌剤であることを特徴とする、〔26〕〜〔31〕のいずれかに記載の方法。
〔33〕前記in vitro条件下での培養系が、スフェロイド培養であることを特徴とする、〔21〕、〔23〕、〔26〕、〔28〕、〔29〕及び〔31〕のいずれか一項に記載の方法。
i)自己複製能を保有する。自己複製能とは、分裂した2つの娘細胞のどちらか1つ又は両方の細胞が、細胞系譜上、親細胞と同等の能力及び分化程度を保持している細胞を産出できる能力をいう。
ii)癌細胞塊を構成する複数種の癌細胞へ分化できる。癌幹細胞から分化した複数種の癌細胞は、正常幹細胞と同様に、細胞系譜上、癌幹細胞を頂点とする階層構造を形成する。癌幹細胞から段階的に多種癌細胞が産出されることにより多様な特徴を有する癌細胞塊が形成される。
1.癌幹細胞に特異的に発現する、核酸(DNA, RNA)、たんぱく質などを高率に同定し、これらの分子の機能を解明する。
2.癌幹細胞に特異的に発現する、核酸(DNA, RNA)、たんぱく質などを高率に同定し、これを阻害する薬剤候補の探索・スクリーニングを実施する
3.濃縮される各癌幹細胞の生物機能解析結果(浸潤性、分裂速度など)を指標に、癌の予後診断などに用いる
4.濃縮される各癌幹細胞の生物機能解析結果(浸潤性、分裂速度など)を指標に、新たに癌を分類し、この分類ごとの抗癌剤の探索・スクリーニングに応用する。
5.濃縮された癌幹細胞が、癌組織の大部分を占める分化細胞を輩出する過程を研究し、この過程をおさえこむ抗癌剤(癌サイレンサー)の探索・スクリーニングに使用する。
6.癌幹細胞の培養条件(酸素分圧、栄養条件、抗癌剤処置等)を劣悪な方向に調節することで、癌幹細胞に特徴的な生物反応を検出し、癌幹細胞の耐久性の成因を検討する。
7.癌幹細胞の培養条件(酸素分圧、栄養条件、抗癌剤処置等)を劣悪な方向に調節することで、癌幹細胞に特徴的な生物反応を検出し、癌幹細胞の耐久性を阻害する抗癌剤の探索・スクリーニングに使用する。
本発明は、本発明の癌幹細胞集団が移植された非ヒト動物モデル又は本発明の癌幹細胞集団のin vitro条件下での培養系において、癌幹細胞から形成される階層構造、癌幹細胞から始まる癌進展プロセス、又は癌幹細胞の生物学的特性を指標として評価を行うことを特徴とする、医薬品のターゲット分子探索方法に関する。
(1)癌幹細胞集団を非ヒト動物に移植することにより非ヒト動物モデルを作製する工程、
(2)癌幹細胞集団の癌進展プロセスにおいて特徴的に認められる組織構造、又はその生物学的特性を示す組織片を採取する工程、
(3)(2)において採取した組織片についてDNA、RNA、タンパク質、ペプチド又は代謝産物の発現を調べる工程、及び
(4)組織片中の癌幹細胞から形成される階層構造、癌幹細胞から始まる癌進展プロセス、又は癌幹細胞の生物学的特性に依存的に変動するDNA、RNA、タンパク質、ペプチド又は代謝産物を同定する工程。
(1)癌幹細胞集団をin vitro条件下で培養し、癌幹細胞から始まる癌進展プロセスの特徴構造、又は癌幹細胞の生物学的特性を再現する工程、
(2)特徴構造を再現した培養細胞の、DNA、RNA、及びタンパク質、ペプチド又は代謝産物の発現を調べる工程、及び
(3)培養細胞中の癌幹細胞から形成される階層構造、癌肝細胞から始まる癌進展プロセス、又は癌幹細胞の生物学的特性に依存的に変動するDNA、RNA,タンパク質、ペプチド及び代謝産物を同定する工程。
本発明は、本発明の癌幹細胞集団が移植された非ヒト動物モデル又は癌幹細胞集団のin vitro条件下での培養系において、癌幹細胞から形成される階層構造、癌幹細胞から始まる癌進展プロセス、又は癌幹細胞の生物学的特性を指標として評価を行うことを特徴とする、医薬品の評価方法に関する。
(1)癌幹細胞集団を非ヒト動物に移植することにより非ヒト動物モデルを作製する工程、
(2)被験物質を(1)の非ヒト動物モデルに投与する工程、
(3)癌幹細胞から始まる癌進展プロセスにおいて特徴的に認められる組織構造、又はその生物学的特性を示す組織片を採取する工程、
(4)組織片中の癌幹細胞の経時変化、癌進展プロセス、又はその生物学的特性を観察する工程、及び
(5)被験物質により阻害された癌幹細胞から形成される階層構造形成、癌幹細胞から始まる癌進展プロセス、又は癌幹細胞の生物学的特性を同定する工程。
(1)癌幹細胞集団をin vitro条件下で培養し、癌幹細胞から始まる癌進展プロセスの特徴構造、又は癌幹細胞の生物学的特性を再現する工程、
(2)被験物質で(1)の培養細胞を処理する工程、
(3)癌幹細胞から形成される階層構造の変化、癌幹細胞から始まる癌進展プロセス、又は癌幹細胞の生物学的特性を観察する工程、及び
(4)被験物質により阻害された癌幹細胞から形成される階層構造形成、癌幹細胞から始まる癌進展プロセス、又は癌幹細胞の生物学的特性を同定する工程。
本発明は、本発明の癌幹細胞集団が移植された非ヒト動物モデル又は癌幹細胞集団のin vitro条件下での培養系において、癌幹細胞から形成される階層構造、癌幹細胞から始まる癌進展プロセス、又は癌幹細胞の生物学的特性を指標として評価を行うことを特徴とする、医薬品のスクリーニング方法に関する。
(1)癌幹細胞集団を非ヒト動物に移植することにより非ヒト動物モデルを作製する工程、
(2)被験物質を(1)の非ヒト動物モデルに投与する工程、
(3)癌幹細胞から始まる癌進展プロセスにおいて特徴的に認められる組織構造、又はその生物学的特性を示す組織片を採取する工程、
(4)組織片中の癌幹細胞の経時変化、癌進展プロセス、又はその生物学的特性を観察する工程、及び
(5)特定の癌幹細胞から形成される階層構造形成、癌幹細胞から始まる癌進展プロセス、又は癌幹細胞の生物学的特性を阻害する被験物質を同定する工程。
(1)癌幹細胞集団をin vitro条件下で培養し、各癌進展プロセスの特徴構造、又はその生物学的特性を再現する工程、
(2)被験物質で(1)の培養細胞を処理する工程、
(3)培養細胞中の癌幹細胞の階層構造の経時変化、癌進展プロセス、又はその生物学的特性を観察する工程、及び
(4)被験物質により阻害された癌幹細胞の階層構造形成、癌進展プロセス、又はその生物学的特性を同定する工程。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
[実施例1]ヒト癌細胞株を用いた癌幹細胞と癌形成細胞の調製と評価
(1)マウスへ移植した大腸癌株の形態学的評価
大腸癌検体は、PharmaLogicals Research(シンガポール)およびParkway Laboratory Services(シンガポール)の倫理委員会の承認の下で、同意を得た患者から入手したものである。腫瘍片を剪刀で細かく刻み、NOGマウスの側腹部に移植した。ヒト大腸癌異種移植片は、実験動物中央研究所(日本)より供与されたNOGマウス中で継代することにより維持した。本実験で使用したマウスは、PharmaLogicals Researchの動物実験ガイドラインに従って処置した。NOGマウス、又はSCIDマウスで樹立した大腸癌細胞株をNOGマウスへ皮下移植し、癌細胞塊を作成した。癌細胞塊は摘出後、4% パラホルムアルデヒド(paraformaldehyde)にて4℃で16から24 時間の条件で固定し、AMeX法にて包埋して薄切組織標本を作製した。組織標本はHE染色を実施した。図1に結果を示す。NOGマウスへ移植した大腸癌株PLR123、大腸癌株PLR59、大腸癌株PLR325においてヒト組織と同様な形態学的構造が認められ、NOGマウスの影響を受けないことが示された。一方、NOGマウスへ移植した大腸癌株PLR357では形態学的な変化が認められ、NOGマウスへの移植実験に不適切であることが示された。
NOGマウスから癌細胞塊を摘出し、ハサミで物理的にミンスした。次に、DPBS (Invitrogen、Cat. No. 14190144) で数回懸濁し、Collagenase/Dispase(Roche、Cat. No. 10 269 638 001)とDNaseI(Roche、Cat. No. 11 284 932 001)とを含む酵素液に組織を移して、37℃で3時間撹拌した。さらに、ピペッティングを繰り返し細分化した細胞にLysing buffer(BD、Cat. No. 555899)を加え、マウス赤血球を除去した。最後に40μm cell strainer(BD、Cat. No. 352340)に通し、DPBSで数回懸濁し細胞液を調製した。
癌細胞塊から調製した細胞をFACSバッファー(2% Fetal Bovine Serum / DPBS)で懸濁し、Rat mAb to mouse MHC classI(Abcam、Cat. No. ab15680)を加え、4℃で30分反応させた。細胞をFACSバッファーで1回洗浄した後、2次抗体としてPE 標識Goat Ab to rat IgG2a(BioLegend、Cat. No. 405406)あるいはAPC 標識Goat Ab to rat IgG2a(BioLegend、Cat. No. 405407)、死細胞染色として7-AAD Viability Dye(Beckman Coulter、Cat. No. A07704)、癌幹細胞マーカーとしてFITC標識mouse mAb to human CD326 (EpCAM) (Miltenyi Biotec、Cat. No. 130-080-301)、PE標識mouse mAb to human CD133/1 (AC133) (Miltenyi Biotec、Cat. No. 130-080-801)、あるいはPE標識mouse mAb to human CD44 (BD Pharmingen、Cat. No. 550989)をそれぞれ加え、4℃で30分反応させた。次いで細胞をFACSバッファーで1回洗浄した後フローサイトメトリー解析に供した。アルデヒドデヒドロゲナーゼ(ALDEHYDE DEHYDROGENASE:ALDH)活性はAldeFluor Kit(Stemcell Technologies、Cat. No. 01700)を用いて、メーカー推奨の操作を行うことにより検出した。フローサイトメトリー解析にはEPICS ALTRA (Beckman Coulter)を用い、mouse MHC class I陰性かつ7-AAD Viability Dye陰性の細胞について癌幹細胞マーカーの解析を行った。図2に結果を示す。大腸癌株PLR123、大腸癌株PLR59、大腸癌株PLR325から形成された癌細胞塊において癌幹細胞マーカー陽性の細胞が認められた。中分化型の大腸癌株PLR123、大腸癌株PLR59においてはマーカー陽性細胞とマーカー陰性細胞が混在し、ヘテロな細胞集団であった。一方、低分化型の大腸癌株PLR325においては、すべての細胞がEpCAM、AC133、ALDH活性が陽性、またすべての細胞がCD44が陰性という均質な特徴を示す細胞集団であった。
癌細胞塊から調製した細胞をFACSバッファーで懸濁し、Rat mAb to mouse MHC class Iを加え、4℃で15分反応させた。細胞をFACSバッファーで1回洗浄した後、2次抗体としてPE 標識Goat Ab to rat IgG2aを加え、4℃で15分反応させた。さらに細胞をFACSバッファーで1回洗浄した後、EPICS ALTRAによるセルソーティング、 又は、EasySep Mouse PE Positive selection Kit (Stemcell Technologies、Cat. No. 18554)を用いてメーカー推奨の操作を行うことによりマウス細胞を除去した。細胞の純度はEPICS ALTRAを用いて解析した。図3に結果を示す。大腸癌株PLR123、大腸癌株PLR59、大腸癌株PLR325から形成された癌細胞塊において、マウス細胞除去後、95%以上の細胞がmouse MHC class I陰性であることが示された。
上記(2)で調製した細胞液からマウス細胞を除去したのち、癌細胞を顕微鏡下で単一細胞であることを確認し、細胞数をカウントした。Hank's Balanced Salt Solution(Invitrogen、Cat. No. 24020-117)で50%に希釈したMatrigel Basement Membrane Matrix(BD、Cat. No. 354234)を用いて、10000cells/mL、1000cells/mL、100cells/mLの細胞液を調製した。それぞれの細胞液を100μL/spot、すなわち1000cells/spot、100cells/spot、10cells/spotでNOGマウスへ皮下移植し、形成される腫瘍数を評価した。表1に結果を示す。中分化型の大腸癌株PLR123、大腸癌株PLR59において100cells/spot以上の移植において癌の形成が認められ、低分化型の大腸癌株PLR325において10cells/spot以上の移植において癌の形成が認められた。また、癌形成能を有する細胞の頻度をExtreme Limiting Dilution Analysisを用いて解析した。大腸癌株PLR123、大腸癌株PLR59、大腸癌株PLR325においてそれぞれ1/161、1/195、1/14の頻度で癌形成能を有する細胞が含まれていることが示された。
100細胞、10細胞から形成された癌細胞塊は摘出後、4% パラホルムアルデヒド(paraformaldehyde)にて4℃で16から24 時間の条件で固定し、AMeX法にて包埋して薄切組織標本を作製した。組織標本はHE染色を実施した。図4に結果を示す。中分化型の大腸癌株PLR123、大腸癌株PLR59において階層構造が認められ、大腸癌株PLR123、大腸癌株PLR59は癌幹細胞であることが示された。一方、低分化型の大腸癌株PLR325において、階層構造は認められず、大腸癌株PLR325は癌形成細胞であることが示された。
上記(2)で調製した細胞液からマウス細胞を除去したのち、RIPAバッファー(Sigma、Cat. No. R0278)を用いて大腸癌株PLR123、大腸癌株PLR59、大腸癌株PLR325の細胞ライゼートを作成し、SDS-PAGEを行った後、ウエスタンブロッティングを行った。LGR5タンパク質を検出するためにrabbit mAb to human GPR49(Abcam、Cat. No. ab75850)、陽性コントロールのためにmouse mAb to human GAPDH(Santa Cruz、Cat. No. Sc-69778)を用いた。図5に結果を示す。中分化型の大腸癌株PLR123、大腸癌株PLR59においてLGR5タンパク質が検出され、正常腸管幹細胞マーカー陽性の細胞が存在することが示された。一方、低分化型の大腸癌株PLR325において、LGR5タンパク質は検出されなかった。
(1)市販in vitro癌細胞株の培養
市販in vitro癌細胞株の培養は一般的な方法(例えば、37℃、5%CO2存在下)を基本とし、ATCC(http://www.atcc.org/)推奨の培地を用いて行った。なお、全ての培地中のFetal Bovine Serumは、56℃で30min以上保温する処理を行うことにより、非働化したものを用いた。
in vitro培養した癌細胞をAccutase (ICT、Cat. No. AT104)でフラスコから剥がし、FACSバッファーで懸濁し、死細胞染色として7-AAD Viability Dye(Beckman Coulter, Cat. No. A07704)、癌幹細胞マーカーとしてFITC標識mouse mAb to human CD326 (EpCAM)、PE標識mouse mAb to human CD133/1 (AC133)、あるいはPE標識mouse mAb to human CD44をそれぞれ加え、4℃で30分反応させた。次いで細胞をFACSバッファーで1回洗浄した後フローサイトメトリー解析に供した。アルデヒドデヒドロゲナーゼ(ALDEHYDE DEHYDROGENASE:ALDH)活性はAldeFluor Kitを用いて、メーカー推奨の操作を行うことにより検出した。フローサイトメトリー解析にはEPICS ALTRA (Beckman Coulter)を用い、7-AAD Viability Dye陰性の細胞について癌幹細胞マーカーの解析を行った。図6に結果を示す。HCT116において、ほとんどの細胞が幹細胞マーカー陽性という均質な特徴を示す細胞集団であった。
in vitro培養した癌細胞をAccutaseでフラスコから剥がし、癌細胞を顕微鏡下で単一細胞であることを確認し、細胞数をカウントした。Hank's Balanced Salt Solutionで50%に希釈したMatrigel Basement Membrane Matrixを用いて、10000cells/mL、1000cells/mL、100cells/mLの細胞液を調製した。それぞれの細胞液を100μL/spot、すなわち1000cells/spot、100cells/spot、10cells/spotでNOGマウスへ皮下移植し、形成される腫瘍数を評価した。表2に結果を示す。HCT116において10cells/spot以上の移植において癌の形成が認められた。また、癌形成能を有する細胞の頻度をExtreme Limiting Dilution Analysisを用いて解析した。HCT116において1/9の頻度で癌形成能を有する細胞が含まれていることが示された。
10細胞から形成された癌細胞塊は摘出後、4% パラホルムアルデヒド(paraformaldehyde)にて4℃で16から24 時間の条件で固定し、AMeX法にて包埋して薄切組織標本を作製した。組織標本はHE染色を実施した。図7に結果を示す。HCT116において階層構造は認められず、HCT116は癌形成細胞であることが示された。
RIPAバッファーを用いてHCT116の細胞ライゼートを作成し、SDS-PAGEを行った後、ウエスタンブロッティングを行った。LGR5タンパク質を検出するためにrabbit mAb to human GPR49、陽性コントロールのためにmouse mAb to human GAPDHを用いた。図8に結果を示す。HCT116において、LGR5タンパク質が検出されなかった。
HCT116を5000cells/wellでLab-Tek Chamber Slides(Thermo Scientific、Cat. No. 177402)に蒔き込み培養した。約24時間後、in situハイブリダイゼーションに使用した。in situハイブリダイゼーションはQuantiGene ViewRNA Plate-Based Assay Kit(Panomics、Cat. No. QVP0010)、QuantiGene ViewRNA Plate-Based Signal Amplification Kit(Panomics、Cat. No. QVP0200)、QuantaGene ViewRNA GPR49(LGR5) Probe set(Panomics、Cat. No. VA1-10587)を用いてメーカー推奨の操作を行うことにより解析した。また、核染色にDAPI(Invitrogen、Cat. No. D21490)を用いた。図9に結果を示す。HCT116においてLGR5 probeに対して陽性である細胞は認められなかった。
(1)癌幹細胞のin vitro付着培養(以後、単に付着培養という場合もある)
細胞の培養は一般的な方法(例えば、37℃、5%CO2存在下)を基本とし、以下の幹細胞培地を用いて行った。幹細胞培地はDMEM/F12(Invitrogen、Cat. No. 11330057)培地に、最終濃度が1xのN-2 supplement(Invitrogen、Cat. No. 17502014)、20ng/mLのRecombinant Human EGF(Invitrogen、Cat. No. 11330032)、10ng/mL のFibroblast Growth Factor-basic Human Recombinant(Sigma, Cat、No. F0291)、4μg/mLのHeparin Sodium Salt(Sigma、Cat. No. H3149)、4mg/mLのAlbuMax Lipid Rich BSA(Invitrogen、Cat. No. 11010021)、20μg/mLのinsulin, Human Recombinant, Zinc solution(Invitrogen、Cat. No. 12585014)、2.9mg/mLのD-(+)-Glucose Solution (45%)(Sigma、Cat. No. G8769)、1xのAntibiotic- Antimycotic(Invitrogen、Cat. No. 15240062)となるようにそれぞれ加えて作製した。癌幹細胞を含む癌細胞は幹細胞培地を用いて付着培養用の6 wellプレート(BD、Cat. No. 353046)で培養した。数日後、プレートに付着した細胞と浮遊した細胞が認められたが、浮遊細胞は除き、付着細胞のみを培養した。コンフルエントに増殖した付着細胞はAccutaseを用いて剥がし、新しい付着培養用の6 wellプレート、あるいは付着培養用のT25フラスコ(BD、Cat. No. 353109)、T75フラスコ(BD、Cat. No. 356485)、T150フラスコ(BD、Cat. No. 355001)を用いて培養した。以下の(2)に示す方法ですべての付着細胞が癌幹細胞マーカー陽性になるまで継代を続け、一部の細胞は細胞保存液であるバンバンカー(Wako、Cat. No. 302-14681)で懸濁し、-80℃以下で保存した。図10にin vitro培養した中分化型の大腸癌株PLR123の形態を示す。浮遊状態においてのみ、スフェロイドと呼ばれる細胞塊の形成が認められた。
幹細胞培地でin vitro付着培養した癌細胞をAccutaseでフラスコから剥がし、FACSバッファーで懸濁し、死細胞染色として7-AAD Viability Dye、癌幹細胞マーカーとしてFITC標識mouse mAb to human CD326 (EpCAM)、PE標識mouse mAb to human CD133/1 (AC133) 、あるいはPE標識mouse mAb to human CD44をそれぞれ加え、4℃で30分反応させた。次いで細胞をFACSバッファーで1回洗浄した後フローサイトメトリー解析に供した。アルデヒドデヒドロゲナーゼ(ALDEHYDE DEHYDROGENASE:ALDH)活性はAldeFluor Kitを用いて、メーカー推奨の操作を行うことにより検出した。フローサイトメトリー解析にはEPICS ALTRAを用い、7-AAD Viability Dye陰性の細胞について癌幹細胞マーカーの解析を行った。図11に結果を示す。in vitroで付着培養した中分化型の大腸癌株PLR123、大腸癌株PLR59において、すべての細胞が癌幹細胞マーカー陽性で、均質な細胞集団あることが示された。
細胞液からマウス細胞を除去したのち、RIPAバッファーを用いて、中分化型の大腸癌株PLR123、中分化型の大腸癌株PLR59、幹細胞培地でin vitro付着培養した大腸癌株PLR123、幹細胞培地でin vitro付着培養した大腸癌株PLR59各々の細胞ライゼートを作成し、SDS-PAGEを行った後、ウエスタンブロッティングを行った。LGR5タンパク質を検出するためにrabbit mAb to human GPR49、陽性コントロールのためにmouse mAb to human GAPDHを用いた。図12に結果を示す。幹細胞培地でin vitro付着培養した大腸癌株においてLGR5タンパク質の増加が検出された。幹細胞培地でin vitro培養することにより正常腸管幹細胞マーカー陽性の細胞が濃縮されることが示唆された。
幹細胞培地でin vitro付着培養した中分化型の大腸癌株PLR123を50000cells/wellでLab-Tek Chamber Slidesに蒔き込み培養した。約24時間後、in situハイブリダイゼーションに使用した。in situハイブリダイゼーションはQuantiGene ViewRNA Plate-Based Assay Kit、QuantiGene ViewRNA Plate-Based Signal Amplification Kit、QuantaGene ViewRNA GPR49(LGR5) Probe setを用いてメーカー推奨の操作を行うことにより解析した。また、核染色にDAPIを用いた。図13に結果を示す。幹細胞培地でin vitro付着培養した中分化型の大腸癌株PLR123はすべてがLGR5 probeに陽性であることが認められた。幹細胞培地でin vitro培養することにより正常腸管幹細胞マーカー陽性の細胞が濃縮されることが示され、すべての細胞が正常腸管幹細胞マーカーLGR5陽性の均質な細胞であることが示された。
in vitro付着培養した癌細胞をAccutaseでフラスコから剥がし、DPBSで数回懸濁した。細胞液は40μm cell strainerに通し、顕微鏡下で単一細胞であることを確認し、細胞数をカウントした。Hank's Balanced Salt Solutionで50%に希釈したMatrigel Basement Membrane Matrixを用いて、10000cells/mL、1000cells/mL、100cells/mLの細胞液を調製した。それぞれの細胞液を100μL/spot、すなわち1000cells/spot、100cells/spot、10cells/spotでNOGマウスへ皮下移植し、形成される腫瘍数を評価した。表3に結果を示す。in vitroで付着培養した中分化型の大腸癌株PLR123、大腸癌株PLR59において、すべての移植で癌の形成が認められた。in vitroで付着培養した中分化型の大腸癌株PLR123、大腸癌株PLR59はいずれも、すべてが癌形成能を有する細胞であることが示された。
in vitro付着培養した中分化型の大腸癌株PLR123をさらに1ヶ月以上培養し、癌形成能力の比較を行った。in vitro付着培養した細胞をAccutaseでフラスコから剥がし、DPBSで数回懸濁した。細胞液は40μm cell strainerに通し、顕微鏡下で単一細胞であることを確認し、細胞数をカウントした。Hank's Balanced Salt Solutionで50%に希釈したMatrigel Basement Membrane Matrixを用いて、10000cells/mL、1000cells/mL、100cells/mLの細胞液を調製した。それぞれの細胞液を100μL/spot、すなわち1000cells/spot、100cells/spot、10cells/spotでNOGマウスへ皮下移植し、形成される腫瘍数を評価した。表4に結果を示す。1ヶ月以上培養した中分化型の大腸癌株PLR123はすべての移植で癌の形成が認められた。in vitro培養による癌形成能力は100%に保たれ、in vitro株化に成功したことが示された。
10 細胞のin vitro付着培養した中分化型の大腸癌株PLR123、大腸癌株PLR59から形成された癌細胞塊を摘出して、4% パラホルムアルデヒド(paraformaldehyde)にて4℃で、16から24 時間の条件で固定後、AMeX法にて包埋して薄切組織標本を作製した。組織標本はHE染色を実施した。図14に結果を示す。10 細胞のin vitro付着培養した中分化型の大腸癌株PLR123、大腸癌株PLR59から形成された癌細胞塊において、ヒト組織及び樹立癌細胞株と同様な階層構造が認められた。また、1ヵ月以上培養したin vitro付着培養した中分化型の大腸癌株PLR123から形成された癌細胞塊においても、ヒト組織及びNOG樹立癌細胞株と同様な階層構造が認められた。in vitroで付着培養した中分化型の大腸癌株PLR123、大腸癌株PLR59はいずれも、すべてが多分化能を持つ癌幹細胞であることが示された。
10 細胞のin vitro付着培養した中分化型の大腸癌株PLR123、大腸癌株PLR59から形成された癌細胞塊より調製した細胞をFACSバッファーで懸濁し、Rat mAb to mouse MHC classIを加え、4℃で30分反応させた。細胞をFACSバッファーで1回洗浄した後、2次抗体としてPE 標識Goat Ab to rat IgG2aあるいはAPC 標識Goat Ab to rat IgG2a、死細胞染色として7-AAD Viability Dye、癌幹細胞マーカーとしてFITC標識mouse mAb to human CD326 (EpCAM) 、PE標識mouse mAb to human CD133/1 (AC133)、あるいはPE標識mouse mAb to human CD44をそれぞれ加え、4℃で30分反応させた。次いで細胞をFACSバッファーで1回洗浄した後フローサイトメトリー解析に供した。アルデヒドデヒドロゲナーゼ(ALDEHYDE DEHYDROGENASE:ALDH)活性はAldeFluor Kitを用いて、メーカー推奨の操作を行うことにより検出した。フローサイトメトリー解析にはEPICS ALTRAを用い、mouse MHC class I陰性かつ7-AAD Viability Dye陰性の細胞について癌幹細胞マーカーの解析を行った。図15に結果を示す。10 細胞のin vitro付着培養した中分化型の大腸癌株PLR123、大腸癌株PLR59から形成された癌細胞塊において、癌幹細胞マーカー陰性の細胞が認められ、癌幹細胞マーカー陽性細胞から癌幹細胞マーカー陰性細胞が産出されたことが示された。
10 細胞のin vitro付着培養した中分化型の大腸癌株PLR123から形成された癌細胞塊(1世代目)より調製した細胞液からマウス細胞を除去したのち、ヒト癌細胞を顕微鏡下で単一細胞であることを確認し、細胞数をカウントした。Hank's Balanced Salt Solutionで50%に希釈したMatrigel Basement Membrane Matrixを用いて、10000cells/mL、1000cells/mL、100cells/mLの細胞液を調製した。それぞれの細胞液を100μL/spot、すなわち1000cells/spot、100cells/spot、10cells/spotでNOGマウスへ皮下移植し、形成される腫瘍数及び形態を評価した。表5に結果を示す。10箇所以上で階層構造を有する癌の形成が認められたことから、癌細胞塊に含まれる細胞が癌幹細胞としての自己複製能を有することが示された。また、癌細胞塊に含まれる癌幹細胞の頻度は、1/95であったことから、in vitro付着培養した癌幹細胞から癌形成能を持たない分化した細胞が産出されたことが示された。
in vitro付着培養癌細胞から形成された2世代目の癌細胞塊を摘出して、4% パラホルムアルデヒド(paraformaldehyde)にて4℃で、16から24 時間の条件で固定後、AMeX法にて包埋して薄切組織標本を作製した。組織標本はHE染色を実施した。図16に結果を示す。in vitro付着培養した中分化型の大腸癌株PLR123から形成された2世代目の癌細胞塊において、ヒト組織及びNOG樹立癌細胞株と同様な階層構造が認められた。
(1)全長ヒトLgr4、Lgr5、およびLgr6を発現する細胞の樹立
NM_018490(Lgr4)、NM_001017403(Lgr5)、およびNM_003667(Lgr6)の配列に基づくPCRによって、全長ヒトLgr4、Lgr5、およびLgr6 cDNAをクローニングした。クローニングした遺伝子のN末端にHAタグを付加または付加せずに、発現させた。Gene Pulser(BioRad)を用いて、チャイニーズハムスター卵巣細胞株CHO DG44(Invitrogen)に発現プラスミドをトランスフェクトした。G418を用いて、安定な細胞株であるHA-Lgr4/DG、HA-Lgr5/DG、およびHA-Lgr6/DGを選択した。
可溶性のLgr5(アミノ酸1〜555)タンパク質を、CHO DG44のマウスIgG2aのFc部分との融合タンパク質として発現させた。ヤギ抗マウスIgG2a(Bethyl labotratories)およびHRPラット抗マウスIgG2amAb(Serotec)を用いるサンドイッチELISAにより、トランスフェクタントをスクリーニングした。sLgr5-Fcを最も豊富に生じたクローンを2D3と命名した。2D3培養上清を回収し、Lgr5-Fcタンパク質をプロテインA-セファロースカラムによってアフィニティ精製した(Pharmacia)。Lgr5-Fcはタンパク質免疫化およびELISAスクリーニングのための抗原として働いた。
完全フロイントアジュバント中に乳化させた50μgのLgr5-Fcを用いて、Balb/cマウス(Charles River Japan)を皮下免疫した。2週間後、フロイント不完全アジュバント中の同量を用いて2週間にわたり週1回の注射を繰り返した。細胞融合の3日前、マウスに25μgのLgr5Fcを静脈注射した。免疫化マウスに由来する脾臓リンパ球を、従来法(Kremer L and Marquez G (2004) Methods Mol. Biol., 239, 243 - 260)により、P3-X63Ag8U1マウスミエローマ細胞(ATCC)と融合させた。ELISAを用いて、sLgr5-Fcとの反応性を有する抗体についてハイブリドーマ培養上清をスクリーニングした。Lgr5特異的マウスmAb 2T15E-2および2U2E-2を樹立した。
免疫蛍光細胞化学のために、4%パラホルムアルデヒドおよびメタノールで固定した細胞を、マウス抗ヒトE-カドヘリン抗体(Abcam)、ウサギ抗ヒトSnail抗体(Abcam)、またはウサギ抗ヒトβ-カテニン抗体(Sigma)と共にインキュベーションし、その後、それぞれAlexaFluor 488で標識したヤギ抗マウスIgG抗体またはヤギ抗ウサギIgG抗体を用いて可視化した。免疫蛍光組織化学のために、上記異種移植腫瘍のパラフィンブロック由来の薄片をマウス抗ヒトLgr5抗体(2U2E-2)またはウサギ抗ヒトSnail抗体(Abcam)と共にインキュベーションした。一次抗体とインキュベーションした後、Lgr5タンパク質を、ポリマー-HRP(DAKO)と結合したヤギ抗マウス抗体によって検出し、AlexaFluor 488標識チラミド(tyramide)(Invitrogen)によって可視化した。ビオチン化ヤギ抗ウサギ抗体(VECTOR)によってSnailタンパク質を検出し、AlexaFluor 568標識ストレプトアビジン(Invitrogen)によって可視化した。これらの細胞および検体も、DAPI(Invitrogen)で染色した。
CSCを標識抗体でインキュベーションし、EPICS ALTRA(Beckman Coulter)およびFACSCalibur(Becton Dickinson)を用いて解析した。使用した抗体は、PE標識マウス抗ヒトCD133抗体(Miltenyi Biotec)、PE標識マウス抗ヒトCD44抗体(BD Pharmingen)、FITC標識マウス抗ヒトCD326(EpCAM)抗体(Miltenyi Biotec)、PE標識マウス抗ヒトCD166抗体(R&D Systems)、PE標識マウス抗ヒトCD24抗体(BD Pharmingen)、PE標識マウス抗ヒトCD26抗体(BD Pharmingen)、およびPE標識マウス抗ヒトCD29抗体(BD Pharmingen)であった。
大腸癌の幹細胞群の特徴がWntシグナル伝達であるならば、インビボではLgr5陽性の付着細胞しか腫瘍を形成することができない。これが本当なのかどうか確かめるため、本発明者らは、Lgr5陽性の付着細胞およびLgr5陰性の浮遊細胞の腫瘍形成能を調べた。
ウエスタンブロット解析は以下の方法によって実施された。Complete Miniプロテアーゼインヒビターカクテル(Roche)を添加したRIPAバッファー(Sigma)を用いて、タンパク質を抽出した。タンパク質をNuPAGEゲル(Invitrogen)で分画し、PVDF膜に転写した。1%スキムミルク含有PBSでブロッキングした後、膜を、ウサギ抗ヒトβカテニン抗体(Sigma)、ウサギ抗ヒトホスホc-JUN抗体 (Sigma)、ウサギ抗ヒトTCF1抗体 (Cell Signaling)、ウサギ抗ヒトTCF3抗体 (Cell Signaling)、ウサギ抗ヒトTCF4抗体 (Cell Signaling)、ウサギ抗ヒトLgr5抗体 (Abcam)、マウス抗ヒトEカドヘリン抗体 (Abcam)、ウサギ抗ヒトSnail 抗体(Abcam)、および、マウス抗ヒトGAPDH抗体 (Santa Cruz)でプローブした。BCIP/NBT基質(KPL)を用いて反応性のバンドを検出した。
癌幹細胞の特徴の1つは、化学療法剤に対する抵抗性であるため、本発明者らは、5-FUおよびイリノテカンに対する大腸癌幹細胞の感受性を調べた。前述のように、Lgr5陽性細胞は倍加時間約2.5日で増殖したが、Lgr5陰性癌幹細胞は増殖という観点からは静止状態であった。5-FU(10micro g/ml)およびイリノテカン(10micro g/ml)で処理した場合、いずれの場合もLgr5陽性の大腸癌幹細胞の増殖は有意に阻害したが、Lgr5陰性の大腸癌幹細胞の増殖および生存には影響を与えなかった(図29および図30)。Lgr5陽性の大腸癌幹細胞を5-FU(10micro g/ml)またはイリノテカン(10micro g/ml)に3日間曝露した後、これらの化学療法剤に対して抵抗性を有する細胞が現れた。驚くべきことに、該薬物抵抗性細胞はLgr5陰性であり、かつその形態が変化しており(図31、図32、および図33)、これは、Lgr5陽性状態からLgr5陰性状態へ変化したことが示された。
Lgr5:
フォワードプライマー5'-AGTTTATCCTTCTGGTGGTAGTCC-3'(配列番号:1)、
リバースプライマー5'-CAAGATGTAGAGAAGGGGATTGA-3'(配列番号:2)、
GAPDH:
フォワードプライマー5'-CTCTGCTCCTCCTGTTCGAC-3'(配列番号:3)、
リバースプライマー5'-ACGACCAAATCCGTTGACTC-3'(配列番号:4)、
ACTB:
フォワードプライマー5'-AAGTCCCTTGCCATCCTAAAA-3'(配列番号:5)、
リバースプライマー5'-ATGCTATCACCTCCCCTGTG-3'(配列番号:6)
核β-カテニンを発現している間葉様細胞は、EMTを受ける、移動性癌幹細胞および転移形成癌幹細胞であると考えられる(Brabletz T, Jung A, Spaderna S, Hlubek F, Kirchner T (2005) Opinion: migrating cancer stem cells - an integrated concept of malignant tumour progression. Nat Rev Cancer 5:744-749.)。Lgr5陽性の大腸癌幹細胞の形態が間葉細胞に似ているため、本発明者らはLgr5陽性の大腸癌幹細胞は移動性癌幹細胞に相当するかどうか試験した。ウエスタンブロット分析によって、Lgr5陽性の大腸癌幹細胞における、低レベルの細胞表面E-カドヘリン、高レベルのSnail、および核局在β-カテニンの発現(これはEMTの特徴である)が明らかになった(図36、図37、および図38)。これに対して、Lgr5陰性の大腸癌幹細胞はいかなるEMTの兆候も示さず、すなわち、細胞表面E-カドヘリンが高発現し、Snailが低発現し、かつβ-カテニンの核局在は認められなかった。さらに、異種移植腫瘍組織で、出芽性領域でEMTを受けている細胞における、SnailとLgr5の同時発現が観察され(図39)、これは、Lgr5陽性の大腸癌幹細胞が移動性幹細胞に相当するとの見解を支持するものである。
Claims (19)
- 癌形成能が無い細胞が実質的に除去された癌幹細胞集団であり、細胞集団を10 cell/spotでNOD/SCID/gammac nullマウスへ6 spot移植しExtreme Limiting Dilution Analysisにおいて解析した場合の癌形成を示す癌幹細胞の頻度が1である、実質的に均質な癌幹細胞集団であって、前記癌幹細胞がヒト腫瘍組織由来であり、前記癌幹細胞集団は癌幹細胞を1x104個以上含み、かつ前記ヒト腫瘍組織の階層構造を再現する特徴を有する癌幹細胞集団。
- 前記ヒト腫瘍組織が、上皮癌由来の腫瘍組織であることを特徴とする、請求項1に記載の癌幹細胞集団。
- 前記上皮癌が、膵臓癌、前立腺癌、乳癌、皮膚癌、消化管の癌、肺癌、肝細胞癌、子宮頸癌、子宮体癌、卵巣癌、卵管癌、膣癌、肝臓癌、胆管癌、膀胱癌、尿管の癌、甲状腺癌、副腎癌、腎臓癌、又は、腺組織の癌であることを特徴とする、請求項2に記載の癌幹細胞集団。
- 癌幹細胞を含む細胞群を付着培養する工程を含む方法により作製されることを特徴とする、請求項1〜3のいずれかに記載の癌幹細胞集団。
- 下記(1)〜(3)の工程を含む方法により作製されることを特徴とする、請求項1〜4のいずれかに記載の癌幹細胞集団;
(1)癌幹細胞を含む細胞群を、同一又は異なる種に属する非ヒト動物に移植し、癌細胞塊を作製する工程、
(2)作製された癌細胞塊を細分化する工程、及び
(3)(2)の工程により得られた細胞集団を幹細胞培地にて付着培養する工程。 - 前記非ヒト動物が、ヌードマウス、SCIDマウス、NOD-SCIDマウス、NOGマウス、又はヌードラットのいずれかであることを特徴とする、請求項5に記載の癌幹細胞集団。
- 請求項1〜6のいずれかに記載の癌幹細胞集団が移植された非ヒト動物モデル又は該癌幹細胞集団のin vitro条件下での培養系において、癌幹細胞から形成される階層構造、癌幹細胞から始まる癌進展プロセス、又は癌幹細胞の生物学的特性を指標として評価を行うことを特徴とする、医薬品のターゲット分子探索方法。
- 下記(1)〜(4)に記載された工程を含むことを特徴とする、請求項7に記載の医薬品のターゲット分子探索方法;
(1)請求項1〜6のいずれかに記載の癌幹細胞集団を非ヒト動物に移植することにより非ヒト動物モデルを作製する工程、
(2)該癌幹細胞集団の癌進展プロセスにおいて特徴的に認められる組織構造、又はその生物学的特性を示す組織片を採取する工程、
(3)(2)において採取した組織片についてDNA、RNA、タンパク質、ペプチド又は代謝産物の発現を調べる工程、及び
(4)組織片中の癌幹細胞から形成される階層構造、癌幹細胞から始まる癌進展プロセス、又は癌幹細胞の生物学的特性に依存的に変動するDNA、RNA、タンパク質、ペプチド又は代謝産物を同定する工程。 - 下記(1)〜(3)に記載された工程を含むことを特徴とする、請求項7に記載の医薬品のターゲット分子探索方法;
(1)請求項1〜6のいずれかに記載の癌幹細胞集団をin vitro条件下で培養し、癌幹細胞から始まる癌進展プロセスの特徴構造、又は癌幹細胞の生物学的特性を再現する工程、
(2)特徴構造を再現した培養細胞の、DNA、RNA、タンパク質、ペプチド又は代謝産物の発現を調べる工程、及び
(3)培養細胞中の癌幹細胞から形成される階層構造、癌幹細胞から始まる癌進展プロセス、又は癌幹細胞の生物学的特性に依存的に変動するDNA、RNA、タンパク質、ペプチド及び代謝産物を同定する工程。 - 前記医薬品が抗癌剤であることを特徴とする、請求項7〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ターゲット分子が癌細胞マーカーであることを特徴とする、請求項7〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1〜6のいずれかに記載の癌幹細胞集団が移植された非ヒト動物モデル又は該癌幹細胞集団のin vitro条件下での培養系において、癌幹細胞から形成される階層構造、癌幹細胞から始まる癌進展プロセス、又は癌幹細胞の生物学的特性を指標として評価を行うことを特徴とする、医薬品の評価方法。
- 下記(1)〜(5)に記載された工程を含むことを特徴とする、請求項12に記載の医薬品の評価方法;
(1)請求項1〜6のいずれかに記載の癌幹細胞集団を非ヒト動物に移植することにより非ヒト動物モデルを作製する工程、
(2)被験物質を(1)の非ヒト動物モデルに投与する工程、
(3)癌幹細胞から始まる癌進展プロセスにおいて特徴的に認められる組織構造、又はその生物学的特性を示す組織片を採取する工程、
(4)組織片中の癌幹細胞の経時変化、癌進展プロセス、又はその生物学的特性を観察する工程、及び
(5)被験物質により阻害された癌幹細胞から形成される階層構造形成、癌幹細胞から始まる癌進展プロセス、又は癌幹細胞の生物学的特性を同定する工程。 - 下記(1)〜(4)に記載された工程を含むことを特徴とする、請求項12に記載の医薬品の評価方法;
(1)請求項1〜6のいずれかに記載の癌幹細胞集団をin vitro条件下で培養し、癌幹細胞から始まる癌進展プロセスの特徴構造、又は癌幹細胞の生物学的特性を再現する工程、
(2)被験物質で(1)の培養細胞を処理する工程、
(3)癌幹細胞から形成される階層構造の変化、癌幹細胞から始まる癌進展プロセス、又は癌幹細胞の生物学的特性を観察する工程、及び
(4)被験物質により阻害された癌幹細胞から形成される階層構造形成、癌幹細胞から始まる癌進展プロセス、又は癌幹細胞の生物学的特性を同定する工程。 - 請求項1〜6のいずれかに記載の癌幹細胞集団が移植された非ヒト動物モデル又は該癌幹細胞集団のin vitro条件下での培養系において、癌幹細胞から形成される階層構造、癌幹細胞から始まる癌進展プロセス、又は癌幹細胞の生物学的特性を指標として評価を行うことを特徴とする、医薬品のスクリーニング方法。
- 下記(1)〜(5)に記載された工程を含むことを特徴とする、請求項15に記載の医薬品のスクリーニング方法;
(1)請求項1〜6のいずれかに記載の癌幹細胞集団を非ヒト動物に移植することにより非ヒト動物モデルを作製する工程、
(2)被験物質を(1)の非ヒト動物モデルに投与する工程、
(3)癌幹細胞から始まる癌進展プロセスにおいて特徴的に認められる組織構造、又はその生物学的特性を示す組織片を採取する工程、
(4)組織片中の癌幹細胞の経時変化、癌進展プロセス、又はその生物学的特性を観察する工程、及び
(5)特定の癌幹細胞から形成される階層構造形成、癌幹細胞から始まる癌進展プロセス、又は癌幹細胞の生物学的特性を阻害する被験物質を同定する工程。 - 下記(1)〜(4)に記載された工程を含むことを特徴とする、請求項15に記載の医薬品のスクリーニング方法;
(1)請求項1〜6のいずれかに記載の癌幹細胞集団をin vitro条件下で培養し、癌幹細胞から始まる癌進展プロセスの特徴構造、又は癌幹細胞の生物学的特性を再現する工程、
(2)被験物質で(1)の培養細胞を処理する工程、
(3)癌幹細胞から形成される階層構造の変化、癌幹細胞から始まる癌進展プロセス、又は癌幹細胞の生物学的特性を観察する工程、及び
(4)特定の癌幹細胞から形成される階層構造形成、癌幹細胞から始まる癌進展プロセス、又は癌幹細胞の生物学的特性を阻害する被験物質を同定する工程。 - 前記医薬品が、抗癌剤であることを特徴とする、請求項12〜17のいずれかに記載の方法。
- 前記in vitro条件下での培養系が、スフェロイド培養であることを特徴とする、請求項7、9、12、14、15及び17のいずれか一項に記載の方法。
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Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2020032162A1 (ja) * | 2018-08-08 | 2020-02-13 | 中外製薬株式会社 | がん組織またはがん組織に類似した組織の培養方法 |
KR20200068907A (ko) * | 2018-12-06 | 2020-06-16 | 경북대학교 산학협력단 | 암 세포주 스페로이드를 이용한 약물 스크리닝 동물모델 제조방법 및 이의 이용 |
Families Citing this family (23)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP2517555A4 (en) * | 2009-12-25 | 2014-09-24 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | METHOD OF SEARCHING AND SCREENING AN ANTICANCER AGENT TARGET USING A NON-HUMAN ANIMAL MODEL HAVING BEEN TRANSPORTED A LINE OF CANCER CELLS ESTABLISHED ON NOG |
SG189302A1 (en) | 2010-10-06 | 2013-05-31 | Pharmalogicals Res Pte Ltd | Cancer stem cell population and method for production thereof |
EP2749641B1 (en) * | 2011-09-07 | 2021-06-02 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Cancer stem cell isolation |
JP6291254B2 (ja) | 2011-10-28 | 2018-03-14 | 中外製薬株式会社 | 癌幹細胞特異的分子 |
TWI593705B (zh) | 2011-12-28 | 2017-08-01 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Humanized anti-epiregulin antibody and cancer therapeutic agent containing the antibody as an active ingredient |
KR20150041149A (ko) * | 2012-08-15 | 2015-04-15 | 네오스템 온콜로지, 엘엘씨 | 고순도 암 줄기 세포 및 고순도 암 줄기 세포 개체군의 신속한 생성 방법 |
EP2968408A4 (en) * | 2013-03-11 | 2016-11-23 | Neostem Oncology Llc | PROCESS FOR THE INDUCTION AND CLEANING OF A CELL POPULATION RESPONSIBLE FOR VASCULAR MIMICRY AND USE THEREOF |
AU2014248711A1 (en) * | 2013-03-13 | 2015-09-10 | Neostem Oncology, Llc | Individualized high purity colon carcinoma stem cells, methods and use of the same |
EP2796873A1 (en) * | 2013-04-25 | 2014-10-29 | QGel SA | Method for a cell-based drug screening assay and the use thereof |
BR112015032414A2 (pt) | 2013-06-24 | 2017-11-07 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | agente terapêutico compreendendo anticorpo antiepirregulina humanizado como ingrediente ativo para carcinoma de pulmão de célula não pequena excluindo adenocarcinoma |
CA2916394A1 (en) * | 2013-07-23 | 2015-01-29 | Genentech, Inc. | Model of colorectal cancer |
CN106132417B (zh) * | 2014-03-28 | 2020-04-14 | 国立大学法人鸟取大学 | 低分子化合物的癌症以及纤维化抑制效果 |
WO2015199088A1 (ja) * | 2014-06-23 | 2015-12-30 | 国立大学法人京都大学 | 誘導型がん幹細胞 |
TW201619375A (zh) * | 2014-09-25 | 2016-06-01 | 日產化學工業股份有限公司 | 抗癌劑的篩選方法 |
JP6161828B2 (ja) * | 2015-04-20 | 2017-07-12 | 国立大学法人 岡山大学 | がんの非ヒトモデル動物及びその作製方法、がん幹細胞及びその製造方法 |
EP3208331A1 (en) * | 2016-02-17 | 2017-08-23 | PromoCell bioscience alive GmbH Biomedizinische Produkte | Chemically defined medium for the culture of cancer stem cell (csc) containing cell populations |
JP6719769B2 (ja) | 2016-07-22 | 2020-07-08 | 地方独立行政法人 大阪府立病院機構 | 初代細胞培養法 |
JP6956398B2 (ja) * | 2017-06-05 | 2021-11-02 | 国立大学法人神戸大学 | がんオルガノイドを用いた抗がん薬のスクリーニング方法 |
WO2019050482A1 (en) * | 2017-09-08 | 2019-03-14 | Agency For Science, Technology And Research | REPROGRAMMING A DIFFERENTIATED CELL TO AN INDIFFERENCED CELL USING AN EXOSOME |
CN107904206A (zh) * | 2017-11-17 | 2018-04-13 | 张家港澳洋医院有限公司 | 一种脂多糖诱导肿瘤细胞生成肿瘤干细胞的用途和方法 |
CN108130311B (zh) * | 2017-12-19 | 2020-12-08 | 柴怡 | 一种人原代结肠癌肝转移细胞株hcs1220 |
CN111733136B (zh) * | 2020-06-29 | 2021-11-30 | 中山大学孙逸仙纪念医院 | 一种提高CD90posi细胞分离效率的方法 |
US11931460B2 (en) | 2020-11-18 | 2024-03-19 | Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University | Aminoglycoside antibiotic-derived microbead-encapsulated spheroids and methods of making and using the same |
Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP3753321B2 (ja) * | 2000-12-01 | 2006-03-08 | 財団法人実験動物中央研究所 | 異種細胞の生着、分化および増殖に適したマウスの作出方法、該方法により作出されたマウスならびにそのマウスの用途 |
JP2008102012A (ja) * | 2006-10-19 | 2008-05-01 | Kanazawa Univ | 癌幹細胞の同定および単離方法 |
JP2009539374A (ja) * | 2006-06-06 | 2009-11-19 | ユニバーシティ・オブ・テネシー・リサーチ・ファウンデーション | 腫瘍性幹細胞が富化された組成物及びそれを含む方法 |
US20100003265A1 (en) * | 2006-09-11 | 2010-01-07 | University Of Florida Research Foundation | Isolation, expansion and uses of tumor stem cells |
US20100024049A1 (en) * | 2006-09-19 | 2010-01-28 | Istituto Superiore Di Sanita | Digestive System Cancer Stem Cells and Tests and Uses Therefor |
JP2010516259A (ja) * | 2007-01-22 | 2010-05-20 | レイベン バイオテクノロジーズ | ヒトがん幹細胞 |
Family Cites Families (55)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5573924A (en) | 1992-09-08 | 1996-11-12 | Immunex Corporation | CD27 ligand |
US8044259B2 (en) | 2000-08-03 | 2011-10-25 | The Regents Of The University Of Michigan | Determining the capability of a test compound to affect solid tumor stem cells |
US6984522B2 (en) | 2000-08-03 | 2006-01-10 | Regents Of The University Of Michigan | Isolation and use of solid tumor stem cells |
AU2003238897A1 (en) | 2002-06-05 | 2003-12-22 | Avalon Pharmaceuticals, Inc. | Cancer-linked gene as target for chemotherapy |
JPWO2004101775A1 (ja) | 2003-05-16 | 2006-07-13 | 協和醗酵工業株式会社 | 新規な成体組織由来の幹細胞およびその用途 |
CA2447400A1 (en) | 2003-09-12 | 2005-03-12 | The Hospital For Sick Children | Brain tumor stem cells |
JPWO2005035740A1 (ja) | 2003-10-09 | 2006-12-21 | 協和醗酵工業株式会社 | 無血清馴化したゲノム改変細胞 |
JP2005206508A (ja) | 2004-01-22 | 2005-08-04 | Chemo Sero Therapeut Res Inst | 悪性腫瘍細胞増殖抑制抗体 |
AU2005227322A1 (en) | 2004-03-23 | 2005-10-06 | Biogen Idec Ma Inc. | Receptor coupling agents and therapeutic uses thereof |
US20080268476A1 (en) | 2004-05-12 | 2008-10-30 | Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) | Nectin 4 (N4) as a Marker for Cancer Prognosis |
US7524827B2 (en) | 2004-06-01 | 2009-04-28 | Pronai Therapeutics, Inc. | Methods and compositions for the inhibition of gene expression |
WO2006014999A2 (en) | 2004-07-27 | 2006-02-09 | Five Prime Therapeutics, Inc. | Compositions and methods of use for modulators of nectin 4, semaphorin 4b, igsf9, and kiaa0152 in treating disease |
JP2008514205A (ja) | 2004-09-29 | 2008-05-08 | 財団法人実験動物中央研究所 | Nogマウスを用いた高転移性細胞株の樹立 |
CA2998412C (en) | 2004-11-12 | 2024-01-02 | Cambridge University Technical Services Ltd. | Methods and means related to cancer stem cells |
US20090081221A1 (en) | 2004-11-15 | 2009-03-26 | Kirin Beer Kabushiki Kaisha | Method for suppressing cancer cell metastasis and pharmaceutical composition for use in the method |
JP5122441B2 (ja) | 2005-04-19 | 2013-01-16 | シアトル ジェネティックス, インコーポレイテッド | ヒト化抗cd70結合剤およびその使用 |
CA2612021A1 (en) | 2005-06-13 | 2006-12-28 | The Regents Of The University Of Michigan | Compositions and methods for treating and diagnosing cancer |
AU2006273892A1 (en) | 2005-07-26 | 2007-02-01 | Procure Therapeutics Limited | Prostate stem cell markers |
WO2007038637A2 (en) | 2005-09-26 | 2007-04-05 | Medarex, Inc. | Human monoclonal antibodies to cd70 |
JP5129149B2 (ja) * | 2005-10-31 | 2013-01-23 | ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミシガン | 癌を処置および診断するための組成物および方法 |
US20070220621A1 (en) * | 2005-10-31 | 2007-09-20 | Clarke Michael F | Genetic characterization and prognostic significance of cancer stem cells in cancer |
EP1792979A1 (en) | 2005-12-01 | 2007-06-06 | Stiftung Caesar Center of Advanced European Studies and Research | Cell culture system for the enrichment and expansion of stem cells |
CA2631931C (en) | 2005-12-01 | 2014-04-29 | Pronai Therapeutics, Inc. | Cancer therapies and pharmaceutical compositions used therein |
WO2007124125A2 (en) | 2006-04-21 | 2007-11-01 | Stowers Institute For Medical Research | Methods of identifying stem cells in normal and cancerous tissues and related progeny cells |
WO2007132883A1 (ja) | 2006-05-17 | 2007-11-22 | Yokohama City University | 肝臓癌の鑑別、疾患ステージの判定又は予後の予測方法及びキット |
WO2009045201A1 (en) | 2006-08-02 | 2009-04-09 | Biogen Idec Ma Inc. | Cancer stem cells |
CN101506352B (zh) * | 2006-08-11 | 2013-05-29 | 达沃斯Ao研究所 | 鉴别和选择定向分化为特异类型的干细胞以获得均质干细胞群 |
WO2008030611A2 (en) | 2006-09-05 | 2008-03-13 | Medarex, Inc. | Antibodies to bone morphogenic proteins and receptors therefor and methods for their use |
NZ576855A (en) | 2006-10-12 | 2012-08-31 | Forerunner Pharma Res Co Ltd | Diagnosis and treatment of cancer using anti-ereg antibody |
JP2008182912A (ja) | 2007-01-29 | 2008-08-14 | Nippon Kayaku Co Ltd | 癌幹細胞の培養方法、および癌幹細胞 |
BRPI0811857A2 (pt) | 2007-05-14 | 2014-10-21 | Biogen Idec Inc | Regiões fc (scfc) de cadeia simples, polipeptídeos de aglutinação que as compreendem e métodos relacionados. |
WO2008149803A1 (ja) | 2007-06-06 | 2008-12-11 | The University Of Tokyo | 表面抗原マーカーを用いた急性リンパ性白血病における癌幹細胞の分離同定方法 |
SI2173379T1 (sl) | 2007-07-02 | 2015-12-31 | Oncomed Pharmaceuticals, Inc. | Sestavki in postopki za zdravljenje in diagnosticiranje raka |
EP2022848A1 (en) * | 2007-08-10 | 2009-02-11 | Hubrecht Institut | A method for identifying, expanding, and removing adult stem cells and cancer stem cells |
US20110244502A1 (en) * | 2007-08-10 | 2011-10-06 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Hormone responsive tissue culture system and uses thereof |
US20100287638A1 (en) * | 2007-10-01 | 2010-11-11 | The Hospital For Sick Children | Neural tumor stem cells and methods of use thereof |
WO2009064301A1 (en) | 2007-11-15 | 2009-05-22 | The Johns Hopkins University | Methods for detecting and monitoring circulating cancer stem cells |
EP2271941B1 (en) | 2008-03-07 | 2012-08-08 | OSI Pharmaceuticals, Inc. | Methods for the identification of agents that inhibit mesenchymal-like tumor cells or their formation |
CN102076865B (zh) | 2008-05-02 | 2016-03-16 | 西雅图基因公司 | 用于制造核心岩藻糖基化降低的抗体和抗体衍生物的方法和组合物 |
WO2010009121A2 (en) | 2008-07-15 | 2010-01-21 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | Colon stem cells associated with colitis and colorectal cancer and methods of use |
WO2010016766A2 (en) | 2008-08-08 | 2010-02-11 | Koninklijke Nederlandse Akademie Van Wetenschappen | Antibodies recognizing endogenous human lgr5 and/or lgr6 |
US20110301056A1 (en) | 2008-12-12 | 2011-12-08 | Oncotherapy Science, Inc. | Nectin-4 for target genes of cancer therapy and diagnosis |
NZ594950A (en) | 2009-03-06 | 2013-06-28 | Kalobios Pharmaceuticals Inc | Treatment of leukemias and chronic myeloproliferative diseases with antibodies to epha3 |
US8496937B2 (en) | 2009-03-30 | 2013-07-30 | Edimer Pharmaceuticals, Inc. | Preparation of isolated agonist anti-EDAR monoclonal antibodies |
MA33323B1 (fr) | 2009-04-20 | 2012-06-01 | Genentech Inc | Thérapie adjuvante de cancer |
TW201105347A (en) | 2009-04-28 | 2011-02-16 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Pharmaceutical compositions for maintenance therapy containing HLA class I-recognizing antibody as the active ingredient |
JP5808052B2 (ja) | 2009-05-29 | 2015-11-10 | 中外製薬株式会社 | Egfファミリーリガンドのアンタゴニストを成分とする医薬組成物 |
WO2011027308A1 (en) | 2009-09-03 | 2011-03-10 | Koninklijke Philips Electronics N.V. | Novel tumor markers |
EP2517555A4 (en) * | 2009-12-25 | 2014-09-24 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | METHOD OF SEARCHING AND SCREENING AN ANTICANCER AGENT TARGET USING A NON-HUMAN ANIMAL MODEL HAVING BEEN TRANSPORTED A LINE OF CANCER CELLS ESTABLISHED ON NOG |
US9217032B2 (en) | 2010-01-08 | 2015-12-22 | Les Laboratoires Servier | Methods for treating colorectal cancer |
SG189302A1 (en) | 2010-10-06 | 2013-05-31 | Pharmalogicals Res Pte Ltd | Cancer stem cell population and method for production thereof |
KR101463182B1 (ko) | 2011-01-13 | 2014-11-21 | 연세대학교 산학협력단 | 췌장암 암줄기세포 특성을 이용한 췌장암 신규 바이오마커 및 그의 용도 |
JP2013019327A (ja) | 2011-07-12 | 2013-01-31 | Panasonic Corp | 電動送風機およびそれを用いた電気掃除機 |
EP2749641B1 (en) | 2011-09-07 | 2021-06-02 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Cancer stem cell isolation |
JP6291254B2 (ja) | 2011-10-28 | 2018-03-14 | 中外製薬株式会社 | 癌幹細胞特異的分子 |
-
2011
- 2011-10-06 SG SG2013025895A patent/SG189302A1/en unknown
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- 2011-10-06 SG SG2014003966A patent/SG196836A1/en unknown
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2017
- 2017-08-03 JP JP2017150330A patent/JP6653689B2/ja active Active
-
2020
- 2020-08-14 US US16/994,388 patent/US11965180B2/en active Active
Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP3753321B2 (ja) * | 2000-12-01 | 2006-03-08 | 財団法人実験動物中央研究所 | 異種細胞の生着、分化および増殖に適したマウスの作出方法、該方法により作出されたマウスならびにそのマウスの用途 |
JP2009539374A (ja) * | 2006-06-06 | 2009-11-19 | ユニバーシティ・オブ・テネシー・リサーチ・ファウンデーション | 腫瘍性幹細胞が富化された組成物及びそれを含む方法 |
US20100003265A1 (en) * | 2006-09-11 | 2010-01-07 | University Of Florida Research Foundation | Isolation, expansion and uses of tumor stem cells |
US20100024049A1 (en) * | 2006-09-19 | 2010-01-28 | Istituto Superiore Di Sanita | Digestive System Cancer Stem Cells and Tests and Uses Therefor |
JP2008102012A (ja) * | 2006-10-19 | 2008-05-01 | Kanazawa Univ | 癌幹細胞の同定および単離方法 |
JP2010516259A (ja) * | 2007-01-22 | 2010-05-20 | レイベン バイオテクノロジーズ | ヒトがん幹細胞 |
Non-Patent Citations (5)
Title |
---|
BIOCHEM. BIOPHYS. RES. COMMUN., 2007, VOL.361, P.586-592, JPN6011064404, ISSN: 0004019177 * |
BLOOD, 2002, VOL.100, NO.9, P.3175-3182, JPN6018033527, ISSN: 0004019175 * |
BRIT. J. CANCER, PUBLISHED ONLINE 2010.03.23, VOL.102, P.1265-1275, JPN6011064403, ISSN: 0004019176 * |
PROC. NATL. ACAD. SCI., 2008, VOL.105, NO.36, P.13427-13432, JPN6011064401, ISSN: 0004019178 * |
PROC. NATL. ACAD. SCI., 2010.02.23, VOL.107, NO.8, P.3722-3727, JPN6011064402, ISSN: 0004019179 * |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
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