JP2017534245A - 産業的使用のための細菌芽胞組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2014年8月6日付で出願された米国仮出願第62/033,825号、2015年8月6日付で出願された米国特許出願第14/819,577号、2015年8月6日付で出願された米国特許出願第14/819,583号(それらの全体が引用することにより本明細書の一部をなす)の優先権の利益を主張する。
本発明の密接混合物の芽胞の発芽率を発芽剤の非存在下にて従来的に用いられた芽胞の発芽率と比較するために、下記の処理を行った。
バチルス・サブチリス芽胞を、L−アラニン溶液の存在下における芽胞の噴霧乾燥を介してGOSD(発芽最適化噴霧乾燥)で処理し、発芽のレベルを光学密度(OD)の読み取りにより求めた。
0.01M リン酸カリウム緩衝液を、1M K2HPO4(87.09gが0.5Lの蒸留水に溶解されている)及び1M KH2PO4(68.045gが0.5Lの蒸留水に溶解されている)溶液を用いて調製した。61.5mlの1M K2HPO4と38.5mlの1M KH2PO4とを混ぜ合わせ、蒸留水にて1000mlへと希釈することで、pH7.0の0.1M リン酸カリウム緩衝液を作製した。0.1M リン酸カリウム緩衝液を蒸留水にて1:10の比で更に希釈して、0.01M リン酸カリウム緩衝液(pH7.0)を得た。緩衝液を121℃にて60分間オートクレーブで処理することにより滅菌した。
バチルス・リケニホルミス芽胞を、実施例1に記載のように、蒸留水1mL当たり0.044グラムのL−アラニンの存在下における芽胞の噴霧乾燥を介してGOSDで処理した。発芽のレベルは、芽胞懸濁液の調製に0.01M リン酸カリウム緩衝液(pH7.0)を用いて上記のように光学密度(OD)の読み取りにより求めた。
バチルス・サブチリス株ENV923 GO+芽胞及びGO−芽胞を上記のように調製し、様々なpHレベルで0.01M リン酸カリウム緩衝液に再懸濁した。OD600の測定は上記のように行った。
0.01M リン酸カリウム緩衝液(pH7.0緩衝液)を実施例1に記載のように調製した。
pH範囲が3.0〜6.0である0.01M リン酸カリウム緩衝液を調製するために、13.2mlの1M K2HPO4と86.8mlの1M KH2PO4溶液(実施例1に記載されている)とを混合して、蒸留水で容量を1Lにすることにより作製された0.1M リン酸カリウム緩衝液(pH6.0)を基となる緩衝液として使用した。
pH5.0〜pH3.0の0.01M リン酸カリウム緩衝液を得るために、0.1M リン酸カリウム緩衝液(pH6.0)を蒸留水で希釈し、緩衝液のpHを、1M H2PO4を用いてpH5.0、pH4.0及びpH3.0に下げ、0.1M 緩衝液と蒸留水との比を1:10に保ちながら、蒸留水を用いて最終容量にした。
バチルス・サブチリス株ENV 923 GOSD芽胞及び対照芽胞を上記のように調製した。芽胞の発芽を上記のように光学密度(OD)の測定により調べた。OD600の測定のために芽胞懸濁液を調製し、1.7×108cfu/mlの濃度で0.01M リン酸カリウム緩衝液(pH7.0)(リン酸緩衝液、pH7.0調製物)中で4℃に冷却した。各芽胞懸濁液について、3ml容量まで満たした3つの培養管を準備した。撹拌及び初期のOD600測定の後、培養管を25℃、30℃及び37℃に予め加熱しておいた水浴内において120分間インキュベートした。10分間隔で培養管を撹拌し、OD600測定を行った。
培地:
培地は希薄トリプチックソイブロス(mTSB)(BD、211822)とした。培地は、50mgのトリプチックソイブロス粉末を、完全に溶解するまで加熱及び撹拌しながら1Lの水に懸濁させることにより調製した。次いで培地をボトルに等しく分配し(aliquoted)、121℃にて30分間オートクレーブで処理した。製造業者の報告にある粉末含量に基づくと、mTSB培地には1リットル当たり、
カゼインの膵消化物:28.3mg
ダイズのパパイン(Papic)消化物:5.0mg
デキストロース:4.2mg
塩化ナトリウム:8.3mg
リン酸二カリウム:4.2mg
が含有されていた。培地を加熱し、オートクレーブで処理する前に、最終濃度が0.5M又は1.5M(それぞれ、29.22g/L及び87.66g/L)になるように、必要に応じて塩化ナトリウム(Amresco、X190)を添加することで、浸透圧ストレスを誘導した。
GOSDで処理した又は処理していないバチルス・リケニホルミス株ENV100の芽胞粉末を滅菌ブレンダージャー内において0.1% Octosol SLS(FT−SLS−246DRUM、Tiarco Chemical(ジョージア州ドールトン))を含む滅菌水中に懸濁させた。芽胞を5秒間隔で少なくとも合計15秒間、又は芽胞が視覚的に完全に懸濁するまでブレンドすることにより懸濁させた。これはブレンダージャー内の最終濃度が1×1010cfu/mlとなるように行った。この芽胞懸濁液から250μlを4.75mlのmTSBが入った培養管に移し、5×108cfu/mlの最終濃度を得た。これらの濃度は、およそ0.6の開始OD600を達成するために芽胞の各バッチについて行った最適化により求める。
懸濁した芽胞が入った培養管を速やかにボルテックスし、ゼロ時点にてOD600を測定し、37℃の水浴内においてインキュベートした。各時間間隔において、時間を記録し、培養管を取り出し、ボルテックスして、OD600を測定し、水浴に戻した。OD600の減少パーセントは、ゼロ時点の値から測定値を減算し、ゼロ時点の値で除算して、100%を乗算することにより求めた。完全な発芽は60%のOD600の減少パーセントに相当するものであることが以前に報告されている。そのため発芽パーセントはOD600の減少パーセントに1.67を乗算することにより求めた。
培地:
mTSB培地は上記のように調製したが、最終濃度が50mMとなるまでNaClを添加することで、浸透圧が平衡状態の培地を作製した。1×105ppmの硝酸銅(II)ヘミ(五水和物)(Alfa Aesar、12523)ストック溶液を、2gを20mlの水に懸濁させ、0.22μmのフィルターに通すことにより作製した。これを一定分量のmTSBに添加することで、0ppm、50ppm、100ppm及び200ppmの最終濃度を達成した。
GOSDで処理した又は処理していないバチルス・リケニホルミス株ENV100の芽胞粉末を滅菌ブレンダージャー内において0.1% Octosol SLS(FT−SLS−246DRUM、Tiarco Chemical(ジョージア州ドールトン))を含む滅菌水中に懸濁させた。芽胞を5秒間隔で少なくとも合計15秒間、又は芽胞が視覚的に完全に懸濁するまでブレンドすることにより懸濁させた。これはブレンダージャー内の最終濃度が2×109cfu/mlとなるように行った。この芽胞懸濁液から250μlを4.75mlのmTSBが入った培養管に移し、1×108cfu/mlの最終濃度を得た。これらの濃度は、およそ0.6の開始OD600を達成するために芽胞の各バッチについて行った最適化により求めた。
培地:
mTSB培地は上記のように調製したが、最終濃度が50mMとなるまでNaClを添加することで、浸透圧が平衡状態の培地を作製した。1000ppmのAl3+ストック溶液を、0.62gのAl2(SO4)3・14H2O(Alfa Aesar、12362)を50mlの水に懸濁させ、0.22μmのフィルターに通すことにより作製した。これを一定分量のmTSBに添加することで、0ppm、0.25ppm、0.50ppm及び1.0ppmの最終濃度を達成した。培地のpHをHClの添加によりpH4.5へと下げ、Al3+イオンの完全な分離を可能にした。
GOSDで処理した又は処理していないバチルス・リケニホルミス株ENV100の芽胞粉末を滅菌ブレンダージャー内において0.1% Octosol SLS(FT−SLS−246DRUM、Tiarco Chemical(ジョージア州ドールトン))を含む滅菌水中に懸濁させた。芽胞を5秒間隔で少なくとも合計15秒間、又は芽胞が視覚的に完全に懸濁するまでブレンドすることにより懸濁させた。これはブレンダージャー内の最終濃度が1×1010cfu/mlとなるように行った。この芽胞懸濁液から250μlを4.75mlのmTSBが入った培養管に移し、5×108cfu/mlの最終濃度を得た。これらの濃度は、およそ0.6の開始OD600を達成するために芽胞の各バッチについて行った最適化により求めた。
培地:
mTSB培地は上記のように調製したが、最終濃度が50mMとなるまでNaClを添加することで、浸透圧が平衡状態の培地を作製した。80mM 胆汁酸塩ストック溶液を、2.5gのタウロデオキシコール酸ナトリウム(Sigma、T0875)、1.1gのグリコデオキシコール酸ナトリウム(Sigma、G9910)及び0.346gのデオキシコール酸ナトリウム(Sigma、D5670)を100mlの水に懸濁させ、0.22μmのフィルターに通すことにより作製した。これを一定分量のmTSBに添加することで、0mM、4mM、6mM及び8mMの最終濃度を達成した。
GOSDで処理した又は処理していないバチルス・リケニホルミス株ENV100の芽胞粉末を滅菌ブレンダージャー内において0.1% Octosol SLS(FT−SLS−246DRUM、Tiarco Chemical(ジョージア州ドールトン))を含む滅菌水中に懸濁させた。芽胞を5秒間隔で少なくとも合計15秒間、又は芽胞が視覚的に完全に懸濁するまでブレンドすることにより懸濁させた。これはブレンダージャー内の最終濃度が1×1010cfu/mlとなるように行った。この芽胞懸濁液から250μlを4.75mlのmTSBが入った培養管に移し、5×108cfu/mlの最終濃度を得た。これらの濃度は、およそ0.6の開始OD600を達成するために芽胞の各バッチについて行った最適化により求めた。
上記のように行い、算出した。
バチルス・リケニホルミス株ENV 431 GO+芽胞をGOSD(先に記載された手法)で処理した。対照として、GOSDを用いずに噴霧乾燥した同じ培養物由来のGO−芽胞を使用した。増殖試験を、2% グルコースを添加した最小塩培地において行った。
培地を、(NH4)2SO4(1.26g/L)、MgCl2(0.81g/L)、CaCl2(0.15g/L)、NaCl(0.05g/L)を蒸留水に溶解し、1ml/L 1000×Trace Mineral Mix(MnSO4(0.85g/50ml)、ZnSO4(0.15g/50ml)、FeSO4×7H2O(0.15g/50ml)、塩酸チアミン(0.05g/50ml)を添加することにより調製した。好ましい溶液をフラスコに注ぎ(90ml/フラスコ)、121℃にて40分間オートクレーブで処理した。接種前に培地に4mlの滅菌濾過した25×リン酸カリウム溶液(K2HPO4(3.44g/50ml)、KH2PO4(2.81g/50ml))、及び2mlの50×グルコース(100g/200ml)を添加することで、最終濃度を2%にした。
接種に用いた芽胞の量は、GO−及びGO+芽胞粉末の菌数を用いて決定した。濃(1000×)バチルス・リケニホルミス株ENV 431の芽胞懸濁液は、滅菌ブレンダージャー内の芽胞を、滅菌水を用いてブレンドすることにより調製し、培地が入ったフラスコに下記表の0時間に示されている濃度まで添加した。初期培養物のカウントはブレンドされた芽胞懸濁液の希釈及びプレートカウント(plate counts:平板計数)を行うことにより得た。各芽胞サンプルについて3つのフラスコを準備した。
培地:
mTSBは上記のように調製したが、最終濃度が0M、0.5M、1.0M、又は1.5M(それぞれ0g/L、29.22g/L、58.44g/L、又は87.66g/L)となるように必要に応じて塩化ナトリウム(Amresco、X190)を添加することで、浸透圧ストレスを誘導した。培地を加熱し、フラスコに等しく分配し、オートクレーブで処理した。
カゼインの膵消化物:5.0g
酵母抽出物:2.5g
デキストロース:1.0g
寒天:15.0g
GOSDで処理した又は処理していないバチルス・リケニホルミス株ENV100の芽胞粉末を滅菌ブレンダージャー内において0.1% Octosol SLS(FT−SLS−246DRUM、Tiarco Chemical(ジョージア州ドールトン))を含む滅菌水中に懸濁させた。芽胞を5秒間隔で少なくとも合計15秒間、又は芽胞が視覚的に完全に懸濁するまでブレンドすることにより懸濁させ、その後滅菌水で段階希釈を行った。これは培養フラスコ内の最終濃度が1×102cfu/mlとなるように行った。
フラスコを150rpmで28時間(「1日」)又は50時間(「2日」)振盪させながら37℃にてインキュベートした。一定分量を各フラスコからペトリ皿へと45℃未満に冷却したPCAを上から注ぐことで段階希釈し、かき混ぜ(swirled)、固化させた。プレートを反転し、37℃でおよそ24時間インキュベートした。コロニーをカウントし、希釈率に基づき濃度を算出した。また各フラスコからおよそ10μlのサンプルをPCAプレート上で画線培養し、純度を調べた。
先に記載されたようにGOSDで処理した(GO+)、及び非処理の(GO−)バチルス・サブチリス株ENV 923の芽胞をプロテアーゼ活性試験に使用した。
化学的に組成が明確である培地(CDSM:Chemically Defined Salt Medium)をプロテアーゼ試験における細胞増殖に使用した。培地は基となる溶液成分(g/L):(NH4)SO4、1.26g;L−グルタミン酸、1.18g;MgCl2、0.81;CaCl2、0.155及び85% L−乳酸(0.530ml/L)を蒸留水に溶解し、1ml/Lの1000×Trace Mineral Mix(g/50ml)を添加することにより調製した。基となる溶液の入ったフラスコ(48ml/フラスコ)を40分間オートクレーブで処理した。接種前にグルコースを含む2mlの別々に調製した滅菌濾過済み25×緩衝溶液(g/50ml):MOPS、11.6;KH2PO4、0.6;グルコース、4.5を添加した。
接種に用いた芽胞の量は、GO−及びGO+芽胞粉末の菌数を用いて決定した。濃(1000×)バチルス・サブチリス株ENV923の芽胞懸濁液は、滅菌ブレンダージャー内の芽胞を、滅菌済みの0.01M リン酸カリウム緩衝液(pH7.0)を用いてブレンドすることにより調製し、約1×104cfu/mlの濃度でフラスコに添加した。初期培養物の菌数はブレンドされた芽胞懸濁液の希釈及びプレートカウントを行うことにより確認した。各芽胞サンプルについて3つのフラスコを準備した。フラスコを30℃、150rpmでインキュベートし、サンプルを48時間で採取した。
プロテアーゼ活性アッセイを、基質としてカゼインと、チロシンと反応し、青色の発現を促すフォーリン−チオカルト法のフェノール試薬とを用いて細胞上清にて行った。プロテアーゼ活性単位は1分に付き1μgのチロシンを遊離させる酵素の量として定義された。試験管内のチロシンの量は、Jenwayの7305分光光度計にてOD650を測定し、検量線を用いて遊離されたチロシンを算出することにより決定した。
試薬1:0.05M リン酸カリウム緩衝液(pH7.0)
0.1M リン酸カリウム緩衝液(pH7.0)(実施例1に記載のように調製した)を1:1の比で蒸留水にて希釈することで、0.05M リン酸カリウム緩衝液(pH7.0)を得た。
試薬2:0.65% カゼイン溶液
0.65gのカゼインを80mlの0.05M リン酸カリウム緩衝液(pH7.0)に溶解し、加熱することでカゼインを溶液にし、最終容量を、0.05M リン酸カリウム緩衝液(pH7.0)を用いて100mlにした。
試薬3:15% トリクロロ酢酸(TCA)
15gのTCAを蒸留水に溶解し、最終容量を100mlにした。
試薬4:20% Na2CO3
20gのNa2CO3を蒸留水に溶解し、最終容量を100mlにした。
10mlの培養物を遠心分離し、上清を0.2μmのフィルターに通して滅菌管へと濾過した。
3mlの濾過した上清を3mlの0.65% カゼイン溶液と混合して、37℃の水浴に1時間入れた。
反応を6mlの15% TCAを添加することにより停止させ、サンプルを5分間遠心分離した。
0.5mlの各サンプルを1mlの20% Na2CO3と混合し、その後0.5mlのフォーリン−チオカルト法のフェノール試薬の添加及び室温での20分間のインキュベーションを行うことで、青色を発現させた。
3mlの蒸留水を各サンプルに添加し、混合後にOD650を測定した。
プロテアーゼ活性を算出するために、チロシン用の検量線を、蒸留水に溶解したチロシンの希釈系列を得て、それらの希釈系列を培養サンプルと同じ条件にて処理し、OD650を測定することにより作成した。
ストレプトミセス・ビリドクロモゲネス芽胞は、10mlのTX緩衝液(0.001% Tween 80を含む0.05M Tris−HCl緩衝液(pH7.3))を注ぎ、滅菌綿棒を用いて芽胞を取り出すことによりプレートから回収した。プレートからの芽胞懸濁液を50ml容の滅菌管に注いだ。全てのサンプルの芽胞懸濁液を得たら、熱ショックを、芽胞懸濁液の入った滅菌管をヒートブロックに入れ、温度を55℃に到達させ、55℃の温度を10分間維持することにより行った。熱ショック後、芽胞懸濁液を氷水中で5分間冷却し、30分間遠沈した。上清を捨て、芽胞を4℃の25mlの0.02M リン酸カリウム緩衝液(pH7.0)に再懸濁させ、15分間遠沈した。上清を捨てた後、芽胞を20mlの0.02M リン酸カリウム緩衝液(pH7.0)に再懸濁させ、激しく混合することで芽胞懸濁液を得て、これを実験に使用した。
密接混合物の芽胞の発芽率を発芽剤と従来的に混合した芽胞の発芽率と比較するために、下記の処理を行った。
バチルス・リケニホルミス芽胞と発芽性化合物との混合物を作製するために、蒸留水1ml当たり0.044gのL−アラニンの溶液をバチルス・リケニホルミス芽胞塊に導入し、混合物を即座に噴霧乾燥した。バチルス芽胞とL−アラニンとの密接混合物を含有する得られた噴霧乾燥粉末は、下記処理において「GO+」と称する。バチルス芽胞を、対照として使用するためにL−アラニンを添加せずに同様に噴霧乾燥した。L−アラニンを添加していない噴霧乾燥バチルス芽胞は、下記処理において「GO−」と記載する。
トウモロコシ種子を、実施例14に挙げられる細菌芽胞と発芽性化合物との多様な組合せを含む組成物でコーティングする。種子コーティングは、米国特許第7,989,391号及び米国特許第5,849,320号に記載されるような従来の手段によって行う。以下の処理を評価する:
A. 細菌芽胞と発芽性化合物との密接混合物でコーティングされた種子
B. 細菌芽胞と発芽性化合物との従来の混合物でコーティングされた種子
C. 細菌芽胞単独でコーティングされた種子
D. コーティングされていない種子
28日間のバッテリー試験をCobb 500ニワトリ雛(ガッルス・ガッルス・ドメスティクス(Gallus gallus domesticus))に対して行い、アイメリア・マキシマ(家禽におけるコクシジウム症の原因物質)及びクロストリジウム・パーフリンジェンス(壊死性腸炎の原因物質)に感染させたニワトリに対するバチルスプロバイオティクス剤又は標準抗生物質処理(バシトラシン)を有する補助飼料の効果を決定した。バチルスプロバイオティクスは同率のバチルス・サブチリス、バチルス・リケニホルミス及びバチルス・プミルスを含有するものであった。GO+バチルスプロバイオティクスは、L−アラニンを用いたバチルス種の芽胞の噴霧乾燥によって作製した。L−アラニンは、上記のように噴霧乾燥の直前に蒸留水1ミリリットル当たり0.044グラムのアラニンを含有する溶液として芽胞塊に導入した。GO−バチルスプロバイオティクスは、上記のようにバチルス種の芽胞をL−アラニンを添加せずに噴霧乾燥することによって形成した。本研究には、各処理群について8羽のニワトリ雛を1つのケージにした8つの反復試験ケージが含まれる(1処理群につき64羽)。以下の処理群を評価した。処理群2〜5は、アイメリア・マキシマ及びクロストリジウム・パーフリンジェンスに感染させた(感染)。処理群1はアイメリア・マキシマ又はクロストリジウム・パーフリンジェンスに感染させず、非感染陰性対照とした。
1)飼料添加剤なし、感染なし(非感染陰性対照)
2)飼料添加剤なし、感染(感染陰性対照)
3)GO−バチルスプロバイオティクス、飼料1g当たり2×106cfu、感染
4)GO+バチルスプロバイオティクス、飼料1g当たり2×106cfu、感染
5)抗生物質バシトラシン、飼料1トン当たり50g、感染(陽性対照)
幼生個体激減事象が生じたフロリダ州の双殻類孵化場を、個体激減の原因について孵化場における細菌負荷を単離し、定量化することによって評価した。ビブリオ種が源水中に見られる好気性菌数(4×104cfu/ml)の100%、孵化場の好気性菌数(2×104cfu/ml)のおよそ50%を占めることが決定された。この大きなビブリオ集団のうち、異なる培地にわたる2つの優勢コロニー形態が見られ、同定に出した。観察された2つの優勢ビブリオ株は、ビブリオ・チャガシイ及びビブリオ・コラリイリティカスであった。ビブリオ・コラリイリティカスは双殻類に対して毒性であることが示されている。
バチルス・リケニホルミスの細菌酸素要求量(BOD)を、胆汁酸塩を添加したニワトリ飼料抽出物中で測定し、胆汁酸塩ストレス下で成長する細菌の能力を決定した。ニワトリ飼料を、4mM 胆汁酸塩(60%タウロデオキシコール酸塩、30%グリコデオキシコール酸塩、10%デオキシコール酸塩)と組み合わせてエネルギー源として使用した。
42.44gのニワトリ飼料(Chick Starter Grower)をビーカーに量り入れた後、コーヒーグラインダーを用いて粉末へと粉砕した。容量を温かい水道水と合計して1リットルとし、混合物を撹拌プレート上で60分間混合した。100mlの溶液を2本の「予備試験フラスコ」を含む250mL容バッフル付き振盪フラスコに分注し、オートクレーブにかけた。
1. 1.8gのタウロデオキシコール酸塩
2. 0.9gのグリコデオキシコール酸塩
3. 0.3gのデオキシコール酸塩
各成分を少量の水道水中で溶解するまで別個に混合した後、溶液を合わせて混合し、30mLにし、濾過滅菌した。
GO+(上記のようにL−アラニンを用いて噴霧乾燥した)又はGO−(上記のようにL−アラニンを用いずに噴霧乾燥した)配合物として作製されるバチルス・リケニホルミス株ENV100の芽胞粉末を作製した。配合物を、滅菌ブレンダージャー内で0.1%Octosol SLS(FT−SLS−246DRUM、Tiarco Chemical,Dalton,GA)を含む滅菌水に懸濁させた。芽胞は、5秒間隔で少なくとも合計15秒間又は芽胞が完全に懸濁したと視認されるまでブレンドすることによって懸濁させ、続いて滅菌水中で段階希釈した。これをBODボトル中の最終濃度が5×107cfu/ml又は5×103cfu/mlとなるように行った。
生物学的酸素要求量(BOD)を、BODTRAKII機器(Hach 2952450)で取扱説明書に従って測定した。上記の胆汁酸塩を含有する作製したニワトリ飼料抽出物2mlを、BODボトル内の98mlの水に添加し、オートクレーブにかけ、室温まで冷却した。BODTRAKII機器及びボトルは接種前に37℃でプレインキュベートした。ボトルに上記のように接種し、取扱説明書に従って即座に密閉し、37℃でインキュベートした。アッセイが完了した後、データを機器からダウンロードし、およそ10μlの培養物をPCAプレートに画線し、純度を試験した。
Claims (73)
- a)細菌芽胞、及び
b)発芽性化合物、
を含む組成物でコーティングされた植物又は植物部分。 - 前記芽胞及び前記発芽性化合物が、前記組成物が活性化環境に曝されるまで該発芽性化合物が該芽胞の発芽を誘導しないような不活性形態で維持される、請求項1に記載の植物又は植物部分。
- 前記組成物が、該組成物が活性化環境に曝されるまで前記細菌芽胞及び前記発芽性化合物が相互作用するのを妨げる物質を更に含む、請求項1に記載の植物又は植物部分。
- 前記物質が界面活性剤、金属イオン封鎖剤、可塑剤、着色剤、染料、増白剤、乳化剤、流動剤、融合助剤、消泡剤、増粘剤、ワックス、殺菌剤、充填剤、ポリマー、湿潤剤及び凍結防止剤からなる群から選択される、請求項3に記載の植物又は植物部分。
- 前記組成物が、前記細菌芽胞及び前記発芽性化合物が発芽を促す環境に達するまで近接位置に維持される該細菌芽胞と該発芽性化合物との密接混合物を含む、請求項1に記載の植物又は植物部分。
- 花、種子、根、果実、塊茎、球根、根茎、シュート、芽、種子、葉、苗及び移植体からなる群から選択される、請求項1に記載の植物又は植物部分。
- 種子である、請求項1に記載の植物又は植物部分。
- 発芽後に又は土壌から出現した後に前記組成物でコーティングされる、請求項1に記載の植物又は植物部分。
- 発芽前に又は土壌から出現する前に前記組成物でコーティングされる、請求項1に記載の植物又は植物部分。
- 植物繁殖材料である、請求項1に記載の植物又は植物部分。
- 前記細菌芽胞がバチルス・アグリ、バチルス・アイザワイ、バチルス・アルボラクチス、バチルス・アルティチュジニス、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・ブタノリボランス、バチルス・セレウス、バチルス・コアグランス、バチルス・エンドパラシチカス、バチルス・エンドリスモス、バチルス・フィルムス、バチルス・クルスターキ、バチルス・ラクチコラ、バチルス・ラクチモルバス、バチルス・ラクチス、バチルス・ラテロスポラス、バチルス・レンチモルブス、バチルス・リケニホルミス、バチルス・メガテリウム、バチルス・メデューサ、バチルス・メチエンス、バチルス・モジャベンシス、バチルス・ミコイデス、バチルス・ナットー、バチルス・ニグリフィカンス、バチルス・ポピリエ、バチルス・プミルス、バチルス・シアメンシス、バチルス・シンプレックス、バチルス・スファエリクス、バチルス属の種、バチルス・サブチリス、バチルス・チューリンゲンシス、バチルス・ウニファゲラツス、クロストリジウム・サーモセラム、クロストリジウム・リュングダリイ、クロストリジウム・アセトブチリカム、クロストリジウム・ベイジェリンキ、クロストリジウム・ブチリカム、パスツーリア・ペネトランス、パスツーリア・トルネイ、パスツーリア・ニシザワエ及びストレプトミセス属の一種からなる群から選択される、請求項1に記載の植物又は植物部分。
- 前記発芽性化合物がフルクトース、グルコース、カリウム、L−アラニン、L−バリン、L−プロリン、L−ロイシン、L−システイン、L−トレオニン、L−グルタミン、L−アスパラギン、L−フェニルアラニン及びそれらの類似体からなる群から選択される、
請求項1に記載の植物又は植物部分。 - 前記細菌芽胞がB.サブチリス、B.アミロリケファシエンス、B.フィルムス、B.リケニホルミス、B.メガテリウム及びB.プミルスからなる群から選択され、前記発芽性化合物がL−アラニン、L−バリン及びL−アスパラギンからなる群から選択される、請求項1に記載の植物又は植物部分。
- 前記組成物が種子コーティングポリマーを更に含む、請求項7に記載の植物又は植物部分。
- 前記組成物が界面活性剤、金属イオン封鎖剤、可塑剤、着色剤、染料、増白剤、乳化剤、流動剤、融合助剤、消泡剤、増粘剤、ワックス、殺菌剤、充填剤、ポリマー、湿潤剤及び凍結防止剤からなる群から選択される物質を更に含む、請求項1に記載の植物又は植物部分。
- 植物又は植物部分における収量関連形質を向上させる方法であって、該植物又は植物部分を、
a)細菌芽胞と、
b)発芽性化合物と、
を含む組成物で処理することを含み、前記植物又は植物部分の収量関連形質が前記組成物でコーティングされていない対応する植物又は植物部分の収量関連形質と比べて向上する、方法。 - 前記芽胞及び前記発芽性化合物が、前記組成物が活性化環境に曝されるまで該発芽性化合物が該芽胞の発芽を誘導しないような不活性形態で維持される、請求項16に記載の方法。
- 前記組成物が、該組成物が活性化環境に曝されるまで前記細菌芽胞及び前記発芽性化合物が相互作用するのを妨げる物質を更に含む、請求項16に記載の方法。
- 前記物質が界面活性剤、金属イオン封鎖剤、可塑剤、着色剤、染料、増白剤、乳化剤、流動剤、融合助剤、消泡剤、増粘剤、ワックス、殺菌剤、充填剤、ポリマー、湿潤剤及び凍結防止剤からなる群から選択される、請求項18に記載の方法。
- 前記組成物が、前記細菌芽胞及び前記発芽性化合物が発芽を促す環境に達するまで近接位置に維持される該細菌芽胞と該発芽性化合物との密接混合物を含む、請求項16に記載の方法。
- 前記植物又は植物部分が植物繁殖材料である、請求項16に記載の方法。
- 前記植物又は植物部分が種子である、請求項16に記載の方法。
- 前記植物又は植物部分が花、種子、根、果実、塊茎、球根、根茎、シュート、芽、種子、葉、苗及び移植体からなる群から選択される、請求項16に記載の方法。
- 前記植物又は植物部分を発芽後に又は土壌から出現した後に前記組成物で処理することを含む、請求項16に記載の方法。
- 前記植物又は植物部分を発芽前に又は土壌から出現する前に前記組成物で処理することを含む、請求項16に記載の方法。
- 前記細菌芽胞がバチルス・アグリ、バチルス・アイザワイ、バチルス・アルボラクチス、バチルス・アルティチュジニス、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・ブタノリボランス、バチルス・セレウス、バチルス・コアグランス、バチルス・エンドパラシチカス、バチルス・エンドリスモス、バチルス・フィルムス、バチルス・クルスターキ、バチルス・ラクチコラ、バチルス・ラクチモルバス、バチルス・ラクチス、バチルス・ラテロスポラス、バチルス・レンチモルブス、バチルス・リケニホルミス、バチルス・メガテリウム、バチルス・メデューサ、バチルス・メチエンス、バチルス・モジャベンシス、バチルス・ミコイデス、バチルス・ナットー、バチルス・ニグリフィカンス、バチルス・ポピリエ、バチルス・プミルス、バチルス・シアメンシス、バチルス・シンプレックス、バチルス・スファエリクス、バチルス属の種、バチルス・サブチリス、バチルス・チューリンゲンシス、バチルス・ウニファゲラツス、クロストリジウム・サーモセラム、クロストリジウム・リュングダリイ、クロストリジウム・アセトブチリカム、クロストリジウム・ベイジェリンキ、クロストリジウム・ブチリカム、パスツーリア・ペネトランス、パスツーリア・トルネイ、パスツーリア・ニシザワエ及びストレプトミセス種からなる群から選択される、請求項16に記載の方法。
- 前記発芽性化合物がフルクトース、グルコース、カリウム、L−アラニン、L−バリン、L−プロリン、L−ロイシン、L−システイン、L−トレオニン、L−グルタミン、L−アスパラギン、L−フェニルアラニン及びそれらの類似体からなる群から選択される、請求項16に記載の方法。
- 前記細菌芽胞がB.サブチリス、B.アミロリケファシエンス、B.フィルムス、B.リケニホルミス、B.メガテリウム及びB.プミルスからなる群から選択され、前記発芽性化合物がL−アラニン、L−バリン及びL−アスパラギンからなる群から選択される、請求項16に記載の方法。
- 前記組成物が種子コーティングポリマーを更に含む、請求項22に記載の方法。
- 前記組成物が界面活性剤、金属イオン封鎖剤、可塑剤、着色剤、染料、増白剤、乳化剤、流動剤、融合助剤、消泡剤、増粘剤、ワックス、殺菌剤、充填剤、ポリマー、湿潤剤及び凍結防止剤からなる群の1つ又は複数種を更に含む、請求項16に記載の方法。
- 廃水を処理する方法であって、細菌芽胞及び発芽性化合物を含む組成物を廃水に添加することを含む、方法。
- 環境修復の方法であって、細菌芽胞及び発芽性化合物を含む組成物を土壌又は水に適用することを含む、方法。
- 水産養殖システム内の水を処理する方法であって、細菌芽胞及び発芽性化合物を含む組成物と水産養殖システム内の水とを接触させることを含む、方法。
- 前記水産養殖システムが動物を含む、請求項33に記載の方法。
- 水産養殖システム内の動物に給餌する方法であって、細菌芽胞及び発芽性化合物を含む組成物を含む動物飼料を該水産養殖システム内の該動物に投与することを含む、方法。
- 前記動物が魚類、エビ又は軟体動物からなる群から選択される、請求項34又は35に記載の方法。
- 前記水産養殖システムがビブリオ種、アエロモナス種及びフラボバクテリウム種からなる群から選択される病原体を含む、請求項33〜36のいずれか一項に記載の方法。
- 前記動物の成長が前記組成物で処理していない水産養殖システム内の動物と比べて増大する、請求項33〜37のいずれか一項に記載の方法。
- 前記組成物が顆粒、ブリケット、ペレット、錠剤又はカプセルの形態である、請求項33〜38のいずれか一項に記載の方法。
- 細菌芽胞及び発芽性化合物を含む組成物と許容可能な担体とを含むプロバイオティクス。
- 前記許容可能な担体が動物飼料、牛乳、ヨーグルト、チーズ、発酵乳、穀物、発酵穀物、ジュース、アイスクリーム、又は乳児若しくは小児用の配合物からなる群から選択される、請求項40に記載のプロバイオティクス。
- プロバイオティクスを作製する方法であって、細菌芽胞及び発芽性化合物を含む組成物と許容可能な担体とを混合することを含む、方法。
- 前記許容可能な担体が動物飼料、牛乳、ヨーグルト、チーズ、発酵乳、穀物、発酵穀物、ジュース、アイスクリーム、又は乳児若しくは小児用の配合物からなる群から選択される、請求項42に記載の方法。
- 動物に給餌する方法であって、細菌芽胞及び発芽性化合物を含む組成物を動物に投与することを含む、方法。
- 前記動物が家禽、反芻動物、仔ウシ、ブタ、ウサギ、ウマ、甲殻類、軟体動物、魚類及び愛玩動物からなる群から選択される、請求項44に記載の方法。
- 細菌芽胞及び発芽性化合物を含む組成物と許容可能な担体とを含む直接給与生菌。
- 前記担体が動物飼料、代用乳、乳清、植物油、スクロース、二酸化ケイ素、ポリソルベート80、プロピレングリコール、ブチルヒドロキシアニソール、クエン酸、エトキシキン、石灰石、籾殻、酵母培養液、マルトデキストリン、スクロース、デキストロース、乾燥デンプン及びアルミノケイ酸ナトリウムからなる群から選択される、請求項46に記載の直接給与生菌。
- 直接給与生菌を作製する方法であって、細菌芽胞及び発芽性化合物を含む組成物と許容可能な担体とを混合することを含む、方法。
- 前記担体が動物飼料、代用乳、乳清、植物油、スクロース、二酸化ケイ素、ポリソルベート80、プロピレングリコール、ブチルヒドロキシアニソール、クエン酸、エトキシキン、石灰石、籾殻、酵母培養液、マルトデキストリン、スクロース、デキストロース、乾燥デンプン及びアルミノケイ酸ナトリウムからなる群から選択される、請求項48に記載の方法。
- 細菌芽胞及び発芽性化合物を含む組成物と許容可能な担体とを含むクリーニング製品。
- 前記許容可能な担体が洗剤、石鹸及び芳香剤からなる群から選択される、請求項50に記載のクリーニング製品。
- クリーニング製品を作製する方法であって、細菌芽胞及び発芽性化合物を含む組成物と許容可能な担体とを混合することを含む、方法。
- 前記許容可能な担体が洗剤、石鹸及び芳香剤からなる群から選択される、請求項52に記載の方法。
- 廃棄物からメタンを製造する方法であって、細菌芽胞及び発芽性化合物を含む組成物を廃棄物に適用することを含む、方法。
- 動物排泄物、床敷又は敷料を処理する方法であって、細菌芽胞及び発芽性化合物を含む組成物を動物排泄物、床敷又は敷料に適用することを含む、方法。
- サイレージを作製する方法であって、細菌芽胞及び発芽性化合物を含む組成物をサイレージに適用することを含む、方法。
- 微生物石油増進回収(MEOR)の方法であって、細菌芽胞及び発芽性化合物を含む組成物を油井に適用することを含む、方法。
- 前記細菌芽胞がバチルス・サブチリス、バチルス・リケニホルミス及びバチルス・モジャベンシスからなる群から選択される、請求項57に記載の方法。
- 疾患に罹りやすい又は疾患を患う被験体において疾患を治療又は予防する方法であって、該被験体に細菌芽胞及び発芽性化合物を含む組成物を有効量投与し、それにより該被験体において前記疾患を治療又は予防することを含む、方法。
- 前記疾患が細菌性疾患、真菌性疾患又はウイルス性疾患である、請求項59に記載の方法。
- 前記疾患が壊死性腸炎である、請求項59に記載の方法。
- 前記被験体がニワトリ、シチメンチョウ又はカモである、請求項61に記載の方法。
- 前記被験体がクロストリジウム・パーフリンジェンスに感染している、請求項61又は62に記載の方法。
- 前記疾患の治療又は予防が、前記組成物を投与していない被験体と比較して死亡率の低減、病変数の低減及び体重増加の増大の1つ又は複数をもたらす、請求項59〜63のいずれか一項に記載の方法。
- 前記芽胞及び前記発芽性化合物が、前記組成物が活性化環境に曝されるまで該発芽性化合物が該芽胞の発芽を誘導しないような不活性形態で維持される、請求項31〜39、42〜45、48、49又は52〜64のいずれか一項に記載の方法。
- 前記組成物が、該組成物が活性化環境に曝されるまで前記細菌芽胞及び前記発芽性化合物が相互作用するのを妨げる物質を更に含む、請求項31〜39、42〜45、48、49又は52〜64のいずれか一項に記載の方法。
- 前記物質が界面活性剤、金属イオン封鎖剤、可塑剤、着色剤、染料、増白剤、乳化剤、流動剤、融合助剤、消泡剤、増粘剤、ワックス、殺菌剤、充填剤、ポリマー、湿潤剤及び凍結防止剤からなる群から選択される、請求項31〜39、42〜45、48、49又は52〜64のいずれか一項に記載の方法。
- 前記組成物が、前記細菌芽胞及び前記発芽性化合物が発芽を促す環境に達するまで近接位置に維持される該細菌芽胞と該発芽性化合物との密接混合物を含む、請求項31〜39、42〜45、48、49又は52〜64のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細菌芽胞がバチルス・アグリ、バチルス・アイザワイ、バチルス・アルボラクチス、バチルス・アルティチュジニス、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・ブタノリボランス、バチルス・セレウス、バチルス・コアグランス、バチルス・エンドパラシチカス、バチルス・エンドリスモス、バチルス・フィルムス、バチルス・クルスターキ、バチルス・ラクチコラ、バチルス・ラクチモルバス、バチルス・ラクチス、バチルス・ラテロスポラス、バチルス・レンチモルブス、バチルス・リケニホルミス、バチルス・メガテリウム、バチルス・メデューサ、バチルス・メチエンス、バチルス・モジャベンシス、バチルス・ミコイデス、バチルス・ナットー、バチルス・ニグリフィカンス、バチルス・ポピリエ、バチルス・プミルス、バチルス・シアメンシス、バチルス・シンプレックス、バチルス・スファエリクス、バチルス属の種、バチルス・サブチリス、バチルス・チューリンゲンシス、バチルス・ウニファゲラツス、クロストリジウム・サーモセラム、クロストリジウム・リュングダリイ、クロストリジウム・アセトブチリカム、クロストリジウム・ベイジェリンキ、クロストリジウム・ブチリカム、パスツーリア・ペネトランス、パスツーリア・トルネイ、パスツーリア・ニシザワエ及びストレプトミセス種からなる群から選択される、請求項31〜39、42〜45、48、49又は52〜64のいずれか一項に記載の方法。
- 前記発芽性化合物がフルクトース、グルコース、カリウム、L−アラニン、L−バリン、L−プロリン、L−ロイシン、L−システイン、L−トレオニン、L−グルタミン、L−アスパラギン、L−フェニルアラニン及びそれらの類似体からなる群から選択される、請求項31〜39、42〜45、48、49又は52〜64のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細菌芽胞がB.サブチリス、B.アミロリケファシエンス、B.フィルムス、B.リケニホルミス、B.メガテリウム及びB.プミルスからなる群から選択され、前記発芽性化合物がL−アラニン、L−バリン及びL−アスパラギンからなる群から選択される、請求項31〜39、42〜45、48、49又は52〜64のいずれか一項に記載の方法。
- 前記組成物が乾燥粉末の形態である、請求項31〜39、42〜45、48、49又は52〜64のいずれか一項に記載の方法。
- 前記組成物がエマルジョンの形態である、請求項31〜39、42〜45、48、49又は52〜64のいずれか一項に記載の方法。
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