JP2022522228A - 畜産温室効果ガス排出量の炭素隔離促進と削減のための牧草地処理 - Google Patents

畜産温室効果ガス排出量の炭素隔離促進と削減のための牧草地処理 Download PDF

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Abstract

本発明は、家畜飼料添加物及び／又はサプリメントを用いて有害な大気ガス及び／又はその前駆体を削減する組成物及び方法を提供する。好ましい実施形態において、１つ以上の有益な微生物及び／又は１つ以上の微生物成長副産物を含む多目的組成物を、家畜動物飼料及び／又は家畜動物が摂取する野外又は牧草地に適用する。いくつかの実施形態において、組成物は、メタン菌を制御する。いくつかの実施形態において、組成物は、植物の健康及び／又は成長を促進することによって、野外又は牧草地における炭素隔離を増進する。

Description

関連出願を相互参照
本出願は、２０１９年４月１２日出願の米国仮出願第６２／８３３，３５５号、２０１９年８月１３日出願の米国仮出願第６２／８８５，８７６号、２０２０年１月３０日出願の米国仮出願第６２／９６７，９０７号の優先権を主張するものであり、それぞれ内容を参照することにより組み込まれる。
大気中の熱を捕捉するガスは、「温室効果ガス」又は「ＧＨＧ」と呼ばれ、二酸化炭素、メタン、亜酸化窒素、及びフッ素化ガスを含む（ＥＰＡ報告書２０１６、６）。
二酸化炭素（ＣＯ2）は、化石燃料（石炭、天然ガス、及び石油）、固形廃棄物、木材及び木材製品を燃焼させることによって、また、ある種の化学反応、例えば、セメントの製造の結果として、大気中に入る。二酸化炭素は、例えば、生物学的炭素循環の一部としての植物による吸収によって、大気から除去される。
亜酸化窒素（Ｎ2Ｏ）は、産業活動中及び化石燃料や固形廃棄物の燃焼中に排出される。農業では、窒素含有肥料の過剰適用及び粗末な土壌管理慣行もまた、亜酸化窒素及び他の窒素ベースのガスの排出の増加につながる。
例えば、ハイドロフルオロカーボン、ペルフルオロカーボン、六フッ化硫黄、及び三フッ化窒素を含むフッ素化ガスは、様々な工業プロセスから排出される合成の強力な温室効果ガスである。
メタン（ＣＨ４）は、石炭、天然ガス、オイルの製造・輸送時に排出される。さらに、他の農業慣行、及びラグーン及び都市固形廃棄物埋立地における有機廃棄物の腐敗は、メタン排出を生じる。しかしながら、特に、メタン排出は、家畜の生産からも生じ、その消化系の多くはメタン菌微生物を含む（温室効果ガスの概要２０１６）。
世界中の監視ステーションからの最近の測定値、及び南極及びグリーンランドからの氷層に捕捉された気泡からの古い気泡の測定値に基づいて、ＧＨＧの地球規模大気濃度は、過去数百年にわたって著しく上昇している（ＥＰＡ報告書２０１６、例えば、６、１５）。
特に、産業革命が１７００年代に始まって以来、人間活動は、化石燃料の燃焼、森林の伐採、その他の活動を行うことによって、大気中のＧＨＧの量に寄与してきた。大気中に排出される多くのＧＨＧは、１０年から数千年にわたる長期間にわたって残存する。時間の経過と共に、これらのガスは、化学反応によって、又は大気からＧＨＧを吸収する海洋及び植物等の排出シンクによって、大気から除去される。
世界の指導者たちは、条約やその他州間協定を通じて、ＧＨＧ排出量の増加を抑制しようと試みてきた。そのような試みの１つは、炭素クレジットシステムの使用によるものである。炭素クレジットとは、１トンの二酸化炭素を排出する権利を表す取引可能な証明書又は許可証、又は同等のＧＨＧの総称である。典型的な炭素クレジットシステムでは、管理機関が、事業者が生産してよいＧＨＧ排出量の割当量を設定する。これらの割当を超える場合、事業者は、全ての炭素クレジットを利用していない他の事業者から追加手当を購入する必要がある。
炭素クレジットシステムの１つの目標は、これらのクレジットの取引から利益を得るために、企業がよりグリーンな技術、機械、及び慣行に投資することを奨励することである。気候変動枠組条約（ＵＮＦＣＣＣ）の京都議定書に基づき、多くの国が、排出権のトレードを含むＧＨＧ削減政策に国際的に拘束されることに合意している。米国は、京都議定書に拘束されておらず、米国には中央国家排出権取引制度は存在しないが、カリフォルニア州や北東部州のグループ等、いくつかの州ではこのような取引制度を採用し始めている。
大気中のＧＨＧ、特に、メタン排出を低減するための別の試みには、畜産における飼料添加物又はサプリメントの使用が含まれる。例えば、ウシ、ヒツジ、スイギュウ、ヤギ、シカ及びラクダのような反芻家畜は、４つの胃区画、網胃、こぶ胃、葉胃及び皺胃があり、独特である。こぶ胃は、特に、大きな中空器官であり、ここで、摂取された物質、例えば、繊維性植物材料の微生物発酵が生じる。この器官は、４０～６０ガロンの物質を保持することができ、推定微生物濃度は、こぶ胃内容物の茶さじ当たり１５００億個の微生物である。
こぶ胃は、気体発酵副産物を産生する特定の細菌、同じくこれらの細菌と共生関係を共有して、例えば、二酸化炭素をメタンに還元するために必要とされる水素を提供する原生動物のための発酵容器として機能する。このように、こぶ胃内で起こる消化プロセスは、水素、酸素、窒素、メタン及び二酸化炭素を含むガスの発生を促進する。二酸化炭素及びメタンは、こぶ胃で生成されるガスの大部分を構成し、二酸化炭素は、メタンの量の約２～３倍を構成する。
腸内発酵に加えて、家畜糞尿もＧＨＧ排出源となりうる。牛糞尿は、例えば、貯蔵及び処理中にＧＨＧ排出をもたらす可能性がある２つの成分、すなわち、メタン排出に変換される有機物と、間接的に亜酸化窒素排出をもたらす窒素とを含有する。メタンは、メタン菌細菌が糞尿中の有機物質を、それがラグーン又は貯蔵タンクに保持されている際に分解するときに排出される。さらに、貯蔵及び処理の間に、アンモニア（ＮＨ3）の形態の窒素が糞尿から排出される。アンモニアは、後に、亜酸化窒素に変換される（非特許文献２）。
現在、牛のメタン排出を削減するためのアプローチには、こぶ胃の除去、及びメタン菌に対する牛のワクチン接種さえも含まれる。しかしながら、これらの戦略の欠点は、有益なこぶ胃微生物の数も減ってしまい、この方法は、微生物適応、同じく適用のコスト及び非効率性のために長続きしないであろう。
他の戦略には、例えば、メタン菌及び原生動物を直接阻害することによって、又はメタン発酵を削減するためにメタン菌から水素イオンを遠ざけさせることによって、こぶ胃発酵を操作するために、特に、牧草地を放牧するウシのための食餌の改善が含まれる。このような食餌の改善には、例えば、プロバイオティクス、アセトゲン、バクテリオシン、イオノフォア（例えば、モネンシン及びラサロシド）、有機酸及び／又は植物抽出物（例えば、タンニン及び／又は海藻）の飼料への添加が含まれる。（Ｉｓｈｌｅｒ２０１６）。
畜産業は、肉や乳製品の製造に重要である。しかし、気候変動に対する懸念が高まっており、ＧＨＧ排出量を削減する必要があることから、ＧＨＧ排出量の削減した畜牛を再三するためのアプローチの改善が求められている。
Government of Western Australia. (2018）. "Carbon farming: reducing methane emissions from cattle using feed additives." https://www.agric.wa.gov.au/climate-change/carbon-farming-reducing-methane-emissions-cattle-using-feed-additives. ("Carbon Farming 2018"）. Gerber, P.J., et al. (2013）. Tackling climate change through livestock - A global assessment of emissions and mitigation opportunities. Food and Agriculture Organization of the United Nations, Rome. Viewed April 5, 2019. http://www.fao.org/3/i3437e/i3437e.pdf. ("Gerber et al. 2013"）. Pidwirny, M. (2006）. "The Carbon Cycle". Fundamentals of Physical Geography, 2nd Edition. Viewed October 1, 2018. http://www.physicalgeography.net/fundamentals/9r.html. ("Pidwirny 2006"）. Storm, Ida M.L.D., A.L.F. Hellwing, N.I. Nielsen, and J. Madsen. (2012）. "Methods for Measuring and Estimating Methane Emission from Ruminants." Animals (Basel）. Jun. 2(2）: 160-183. doi: 10.3390/ani2020160. United States Environmental Protection Agency. (2016）. "Climate Change Indicators in the United States." https://www.epa.gov/sites/production/files/2016-08/documents/climate_indicators_2016.pdf. ("EPA Report 2016"）. United States Environmental Protection Agency. (2016）. "Overview of Greenhouse Gases." Greenhouse Gas Emissions. https://www.epa.gov/ghgemissions/overview-greenhouse-gases. ("Greenhouse Gas Emissions 2016"）.
本発明は、有益な微生物を使用して大気中の温室効果ガス排出を削減する組成物及び方法を提供する。より具体的には、本発明は、家畜の給餌及び／又は放牧場及び牧草地に適用された場合に、畜産の結果として生じたであろう温室効果ガス（ＧＨＧ）排出の削減をもたらす多目的組成物を提供する。
特定の実施形態において、本発明は、大気中のＧＨＧ排出及び／又はＧＨＧ前駆体の排出を低減する組成物であって、１つ以上の有益な微生物及び／又は１つ以上の微生物成長副産物を含む組成物を提供する。好ましい実施形態において、有益な微生物は、非病原性真菌、酵母及び／又は細菌である。
利点を挙げると、好ましい実施形態において、本発明の組成物は、複数の方法で大気中のＧＨＧを削減することができる。一実施形態において、組成物は、メタン性腸内細菌及び／又はそれらの原生動物共生体を制御すること、及び／又はメタン発酵を阻害することによって、家畜の消化器系における有害な腸内大気ガスを削減するのを助けることができる。さらに、この組成物は、放牧場及び牧草地に適用された場合に、植物成長を増強し、それによって、カーボンの隔離のためのカーボンシンクを生成する。
特定の好ましい実施形態において、組成物は、１つ以上の細菌及び／又はその成長産物を含む。細菌は、例えば、Myxococcus sp（例えば、M. xanthus）、及び／又は１つ以上のBacillus spp.細菌である。特定の実施形態において、Bacillus spp.は、B. amyloliquefaciens、B. subtilis及び／又はB. licheniformisである。細菌は、胞子形態で、栄養細胞として、及び／又はそれらの混合物として使用される。
一実施形態において、組成物は、B. amyloliquefaciensを含む。好ましい実施形態において、B. amyloliquefaciensの菌株は、B. amyloliquefaciens NRRL B-67928（「B.amy」）である。
特定の実施形態において、組成物は、１つ以上の真菌及び／又は１つ以上のその成長副産物を含む。真菌は、あ例えば、Pleurotus spp.真菌、例えばP.ostreatus（ひらたけ）、Lentinula spp.真菌、例えばL.edodes（シイタケ）、及び／又はTrichoderma spp.真菌、例えばT.viridaeである。真菌は、生細胞又は不活性細胞、菌糸体、胞子及び／又は果実体の形態である。果実体は、存在する場合、例えば、細断及び／又はブレンドして顆粒及び／又は粉末形態にすることができる。
一実施形態において、組成物は、１つ以上の酵母及び／又はその１つ以上の成長副産物を含む。酵母は、例えば、Wickerhamomyces anomalus、Saccharomyces spp.（例えば、S.cerevisiae及び／又はS.boulardii）、Starmerella bombicola、Meyerozyma guilliermondii、Pichia occidentalis、Monascus purpureus、及び／又はAcremonium chrysogenumである。酵母は、生細胞又は不活性細胞又は胞子の形態、同じく乾燥細胞及び／又は休眠細胞（例えば、酵母加水分解物）の形態である。
例示的な一実施形態において、組成物はB.amyを含む。例示的な一実施形態において、組成物は、B.amy及びP.ostreatusを含む。例示的な一実施形態において、組成物は、B.amy及びS.boulardiiを含む。
例示的な一実施形態において、組成物は、P.ostreatusを含む。例示的な一実施形態において、組成物は、S.boulardiiを含む。例示的な一実施形態において、組成物は、P.ostreatus及びS.boulardiiを含む。
例示的な一実施形態において、組成物は、B.amy、P.ostreatus及びS.boulardiiを含む。
例示的な一実施形態において、組成物は、L.edodes及びW.anomalusを含む。
特定の実施形態において、組成物は、組成物に使用される胞子形態微生物の発芽を増強するための発芽エンハンサーを含む。特定の実施形態において、発芽エンハンサーは、例えば、Ｌ-アラニン及び／又はＬ-ロイシン等のアミノ酸である。一実施形態において、発芽促進剤は、マンガンである。
一実施形態において、組成物は、１つ以上の脂肪酸を含む。特定の好ましい実施形態において、脂肪酸は、飽和長鎖脂肪酸であり、例えば、ミリスチン酸、パルミチン酸及び／又はステアリン酸のような１４～２０個の炭素の炭素骨格を有する。いくつかの実施形態において、２つ以上の飽和長鎖脂肪酸の組み合わせが組成物に含まれる。いくつかの実施形態において、飽和長鎖脂肪酸は、こぶ胃におけるメタン発酵を阻害し、及び／又はメタン菌の細胞膜透過性を増加させることができる。
一実施形態において、組成物は、微生物成長副産物を含む。微生物成長副産物は、組成物の微生物によって産生することができ、及び／又はそれらを別々に産生し、組成物に添加することができる。
一実施形態において、成長副産物は、それが産生された発酵培地から精製されている。あるいは、一実施形態において、成長副産物は、粗形態で利用される。粗形態は、例えば、目的の成長副産物（残留細胞及び／又は栄養素を含む）を産生する微生物の培養から生じる液体上清を含む。
成長副産物は、例えば、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、酵素、バイオサーファクタント、溶剤及び／又は他の代謝産物を含む、細胞成長の結果として産生される代謝産物又は他の生化学物質を含む。
一実施形態において、組成物はロバスタチンを含む。ロバスタチンは、Pleurotus ostreatusの成長副産物であり、メタン菌細胞膜合成に必須なイソプレノイド構築ブロック、ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼの形成に関与する酵素の阻害を介してメタン菌古細菌を阻害する。一実施形態において、組成物は、Pleurotus菌の有無にかかわらず、精製形態のロバスタチンを含む。
一実施形態において、組成物は、ロバスタチンの産生なしにＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼ活性を阻害することができる生きたLentinula edodeを含む。
一実施形態において、組成物は、Monascus purpureusの発酵米製品である赤色酵母米又はコウジを含む。赤色酵母米は、ロバスタチンと類似の構造を有し、ＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼ活性を阻害する類似の能力を有する、成長副産物モナコリンＫを含む。
一実施形態において、組成物は、バリンを含む。バリンは、Wickerhamomyces anomalusとSaccharomyces spp.によって産生されるアミノ酸であり、家畜の成長と健康をサポートすると共に、動物の消化過程による窒素（アンモニウム等）排泄量を削減する。一実施形態において、組成物は、それを産生する微生物の有無にかかわらず、精製された形態のバリンを含む。
いくつかの実施形態において、組成物は、例えば、海藻（例えば、Asparagopsis taxiformis）、昆布、３-ニトロオキシプロパノール、アントラキノン、イオノフォア（例えば、モネンシン及び／又はラサロシド）、ポリフェノール（例えば、サポニン、タンニン）、有機硫黄（例えば、ニンニク抽出物）、フラボノイド（例えば、クエルセチン、ルチン、カンペロール、ナリンギン、及びアントシアニジン、カボス、ローズヒップ及びブラックカラント由来のビオフラボノイド）、カルボン酸、及び／又はテルペン（例えば、ｄ-リモネン、ピネン、及びカンキツ抽出物）等のメタン菌のメタン発酵を削減することが知られている追加の成分を含むことができる。
一実施形態において、本組成物は、家畜動物及び／又は植物の栄養必要性を補い、家畜動物及び／又は植物の健康及び／又は健やかさを促進するための１つ以上の追加の物質及び／又は栄養素、例えば、プレバイオティクス及び／又はアミノ酸源（必須アミノ酸を含む）、ペプチド、タンパク質、ビタミン、微量元素、脂肪、脂肪酸、脂質、炭水化物、ステロール、酵素、カルシウム、マグネシウム、リン、カリウム、ナトリウム、塩素、硫黄、クロム、コバルト、銅、ヨウ素、鉄、マンガン、モリブデン、ニッケル、セレン、及び亜鉛等のミネラルを含むことができる。いくつかの実施形態において、組成物の微生物は、これらの物質を産生及び／又は提供する。
好ましい実施形態において、本発明は、メタン、二酸化炭素、及び／又は他の有害な大気ガス、及び／又はそれらの前駆体（例えば、亜酸化窒素の前駆体である窒素及びアンモニア）の排出を削減する方法を提供し、ここで、１つ以上の有益な微生物及び／又は１つ以上の微生物成長副産物を含む組成物は、野外又は牧草地に適用される。好ましくは、組成物は、本発明の実施形態による多目的組成物である。特定の具体的な実施形態において、家畜動物は、反芻動物である。
特定の実施形態において、野外又は牧草地は、家畜動物が摂取する草及び／又は他の植物を含む、家畜動物のための食物源である。家畜動物は、野外又は牧草地に放牧され、それによって、牧草地で草及び／又は他の植物を摂取することに加えて、組成物を摂取する。
利点を挙げると、好ましい実施形態において、本方法は、家畜動物の消化器系、特に、こぶ胃に存在するメタン菌細菌及び／又は原生動物の削減をもたらす。特定の実施形態において、この方法は、生成される亜酸化窒素前駆体化合物（例えば、窒素及び／又はアンモニア）の量の削減、及び／又は動物の消化プロセス及び代謝プロセスによって生成される二酸化炭素の量の削減を生じる。特定の実施形態において、本方法はまた、家畜動物の排泄物（例えば、糞尿）からのＧＨＧ排出の削減ももたらす。
特定の実施形態において、本方法はまた、土壌炭素隔離を増強するために使用することができ、ここで、野外又は牧草地の土壌は、野外又は牧草地における植物及び微生物バイオマスの量を増強する１つ以上の有益な微生物を接種され、それによって、野外又は牧草地をカーボンシンクに形質転換する。
一実施形態において、組成物は、液体又は乾燥製品のいずれかとして適用される。一実施形態において、組成物は、例えば、潅漑システムを使用して、液体又は乾燥形態のいずれかで、野外又は牧草地上に散布される。さらに、組成物は、散布スプレッダー、ドロップスプレッダー、ハンドヘルドスプレッダー、又はハンドヘルドスプレーヤーのような手動スプレッダーを使用して適用することができる。
特定の実施形態において、本方法は、放牧家畜に提供される飲料水及び／又は補助飼料に組成物を添加することをさらに含む。
一実施形態において、組成物は、補充飼料に配合され、ここで、組成物は加工されたウェット（wet）動物飼料及び／又は乾燥動物飼料を製造する際に利用される標準的な原料飼料成分に添加される。
いくつかの実施形態において、本発明の方法は、炭素クレジット使用を削減するために畜産者によって利用することができる。このように、特定の実施形態において、本方法は、メタン、二酸化炭素、及び／又は他の有害な大気ガス、及び／又はその前駆体（例えば、窒素及び／又はアンモニア）の生成を削減することに対する方法の効果を評価するために、家畜の消化系及び／又は廃棄物中のメタン菌及び／又は原生動物の制御に対する方法の効果を評価するために、及び／又は当技術分野で標準的な技法を使用して、野外又は牧草地の土壌中の炭素の隔離に対する方法の効果を評価するために、測定を行うことをさらに含むことができる。
ウシこぶ胃からの腸メタン排出を削減するそれらの能力を決定するための、本発明の実施形態による組成物のin-vitro研究の結果を示す。 ウシこぶ胃からの腸内二酸化炭素排出を削減するそれらの能力を決定するための、本発明の実施形態による組成物のin-vitro研究の結果を示す。
本発明は、有益な微生物を使用して大気中の温室効果ガス排出を削減する組成物及び方法を提供する。より具体的には、本発明は、例えば、動物の給餌及び／又は放牧場及び牧草地に適用された場合に、畜産の結果として生じたであろう温室効果ガス排出の削減をもたらす、家畜に給餌するための多目的組成物を提供する。
定義
本明細書中で使用される「バイオフィルム」は、細菌のような微生物の複合凝集体であり、細胞は、互いに及び／又は表面に付着する。バイオフィルム中の細胞は、液体培地中で浮遊又は泳動することができる単一細胞である同じ生物のプランクトン細胞とは生理学的に異なる。
本明細書中で使用される、望ましくない微生物（例えば、メタン菌）に関して使用される「制御」という用語は、微生物を殺す、無能にする、固定化する、及び／又は微生物の個体数を減少させる、及び／又はその他、望ましくないプロセス（例えば、メタン産生）を微生物が実行できないようにする行為まで及ぶ。
本明細書で使用される「家畜化」動物とは、ヒトによる持続的な数の生産について影響を受け、繁殖し、飼い慣らされ、及び／又は制御された、動物とヒトとの間に相互の関係が存在する種の動物である。好ましい実施形態において、家畜化された動物は、「家畜」であり、これには食品、繊維、及び労働等の商品を生産するために農業又は工業環境で飼育された動物が含まれる。家畜という用語に含まれる動物の種類には、アルパカ、ラマ、肉牛及び乳牛、バイソン、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ジグマ、ラバ、ロバ、ラクダ、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、ホロホロ鳥、及びひな鳥が含まれるが、これらに限定されない。
特定の好ましい実施形態において、家畜は「反芻動物」、又は特別な腸内細菌の助けを借りて消化する前に植物系食物を発酵させるのに適した区画化された胃を利用する哺乳動物である。反芻動物としては、例えば、ウシ（例えば、バイソン、ボンゴ、バッファロー、ウシ、ブル、オックス、クドゥ、ブッシュバック、水牛、ヤク、及びゼブ）、ヒツジ、ヤギ、イベックス、ギラフェ、シカ、エルク、モース、ラクダ、カリブー、レニジカ、アンテロープ、ガゼル、インパラ、ワイルドビースト、及び数種類のカンガルーが挙げられる。
本明細書中で使用される「単離された」又は「精製された」分子又は他の化合物は、天然由来の細胞物質のような他の化合物を実質的に含まない。例えば、精製又は単離されたポリヌクレオチド（リボ核酸（ＲＮＡ）又はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ））は、その天然に存在する状態でそれに隣接する遺伝子又は配列を含まない。精製又は単離されたポリペプチドは、その天然に存在する状態においてそれに隣接するアミノ酸又は配列を含まない。精製又は単離された微生物株は、天然に存在するか、又はそれが産生された環境から除去される。従って、単離された菌株は、例えば、生物学的に純粋な培養物として、又は担体と会合した胞子（又は菌株の他の形態）として存在する。
特定の実施形態において、精製された化合物は、目的の化合物の少なくとも６０重量％である。好ましくは、調製物は、少なくとも７５重量％、より好ましくは少なくとも９０重量％、最も好ましくは少なくとも９９重量％の目的化合物である。例えば、精製された化合物は、少なくとも９０重量％、９１重量％、９２重量％、９３重量％、９４重量％、９５重量％、９８重量％、９９重量％、又は１００重量％（ｗ／ｗ）の所望の化合物であるものである。純度は、任意の適切な標準的な方法、例えば、カラムクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、又は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析によって測定される。
本明細書で使用される「イオノフォア」は、微生物におけるイオン濃度勾配（Ｃａ２＋、Ｋ＋、Ｈ＋、Ｎａ＋）を破壊するカルボン酸ポリエーテル非治療抗生物質であり、これは、それらを無益イオン回路に入らせる。イオン濃度の破壊は、微生物が正常な代謝を維持することを妨げ、微生物に余分なエネルギーを消費させる。イオノフォアは、メタン菌等のグラム陽性細菌及びこぶ胃中の原生動物の代謝に対して選択的に作用したり、その代謝に負の影響を及ぼすことで作用をする。
「代謝産物」とは、代謝によって産生される任意の物質（例えば、成長副産物）又は特定の代謝プロセスに関与するのに必要な物質をいう。代謝産物は、代謝の出発物質、中間体、又は最終産物である有機化合物であり得る。代謝産物の例としては酵素、毒素、酸、溶剤、アルコール、タンパク質、炭水化物、ビタミン、ミネラル、微量元素、アミノ酸、ポリマー、及び界面活性剤が挙げられ得るが、これらに限定されない。
本明細書中で使用される「メタン菌」は、代謝の副産物としてメタンガスを産生する微生物である。メタン菌は古細菌であり、反芻動物及び非反芻動物（例えば、豚、家禽及び馬）の消化器系及び代謝廃棄物中に見出される。メタン菌の例としては、Methanobacterium spp.（例えば、M. formicicum）、Methanobrevibacter spp.（例えば、M. ruminantium）、Methanococcus spp.（例えば、M. paripaludis）、Methanoculleus spp.（例えば、M. ourgensis）、Methanoforens spp.（例えば、M. stordalenmirensis）、Methanofollis liminatans、Methanogenium wolfei、Methanomicrobium spp.（例えば、M. mobile）、Methanopyrus kandleri、Methanoregula boonei、Methanosaeta spp.（例えば、M. concilii、M. thermophile）、Methanosarcina spp.（例えば、M. bakeri、M. mazeii）、Methanosphaera stadtmanae、Methanospirillium hungatei、Methanothermobacter spp.及び／又はMethanothrix sochngeniiが挙げられるがこれらに限定されない。
本明細書で示される範囲は、その範囲内の全ての値について短縮されたものであると理解される。例えば、１～５０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又は５０からなる群からの任意の数、組み合わせ、又は下位範囲、そして、例えば、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８及び１．９等の前述の整数の間にある全ての１０進値を含むものと理解される。下位範囲に関して、範囲のいずれかの終点から延びる「ネストされた下位範囲」が特に考えられる。例えば、１～５０の例示的な範囲のネストされた下位範囲は、一方向に１～１０、１～２０、１～３０、及び１～４０、他方向に５０～４０、５０～３０、５０～２０、及び５０～１０を含む。
本明細書で使用される「減少」とは、負の変化を意味し、「増加」は正の変化を意味する。正又は負の変化は、少なくとも０．２５％、０．５％、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％である。
「有する」又は「含有する」と同義である「含む」という移行句は、包含的又はオープンエンドであり、追加の引用されていない要素又は方法ステップを除外するものではない。対照的に、「からなる」という移行句は、請求範囲に記載されていない要素、ステップ又は成分を除外する。「から実質的になる」という移行句は、請求範囲を、特定の材料又はステップに限定する。「からなる」という移行句は請求範囲の範囲を、「特定の材料又はステップ」及び「請求範囲に記載された発明の基本的かつ新規な特性に実質的に影響を及ぼさないもの」に限定する。「含む」という用語を使用する場合、引用された要素を「からなる」又は「実質的になる」他の実施形態も意図される。
本明細書で使用される「又は」という用語は、特に明記されていない限り、又は文脈から明らかでない限り、包括的であると理解される。本明細書で使用される用語「１つ」及び「その」は、単数又は複数であると理解される。
本明細書で使用される「約」という用語、特に明記されない限り、又は文脈から明らかでない限り、当技術分野における通常の許容範囲内、例えば、平均の２標準偏差内と理解される。約は、記載された値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、又は０．０１％以内であると理解される。
本明細書に記載される可変の任意の定義における化学基の列挙の引用は、任意の１つの基又は列挙された基の組み合わせとしてその可変の定義を含む。本明細書中の可変又は態様の実施形態の引用には、その実施形態の任意の単一の実施形態、又は任意の他の実施形態又はその一部との組み合わせが含まれる。
本明細書に引用された参考文献は全て、全体が本明細書に援用される。
多目的組成物
特定の実施形態において、本発明は、大気中のＧＨＧ排出及び／又はＧＨＧ前駆体の排出を削減するための多目的組成物であって、１つ以上の有益な微生物及び／又は１つ以上の微生物成長副産物を含む組成物を提供する。
特定の実施形態において、組成物は、「微生物ベースの組成物」であり、微生物又は他の細胞培養物の成長の結果として産生された成分を含む組成物を意味する。このように、微生物ベースの組成物は、微生物自体及び／又は微生物成長副産物を含むことができる。微生物は、栄養状態、胞子形成、菌糸形成、任意の他の形態の微生物繁殖体、又はこれらの混合物である。微生物は、プランクトンであっても、バイオフィルム形態であっても、又は両方の混合物であってもよい。成長副産物は、例えば、代謝産物、細胞膜成分、発現タンパク質、及び／又は他の細胞成分である。微生物は、無傷であっても溶解されていてもよい。細胞は、全く存在しないか、又は、例えば、組成物１ミリリットル当たり、１×１０4、１×１０5、１×１０6、１×１０7、１×１０8、１×１０9、１×１０10、１×１０11、１×１０12、１×１０１３以上のＣＦＵで存在する。
利点を挙げると、好ましい実施形態において、本発明の多目的組成物は、反芻動物の消化プロセスを変化させることができ、その結果、腸内大気ガス産生が削減される。例えば、組成物は、こぶ胃及び／又はそれらの原生動物共生体におけるメタン菌を制御し、及び／又はてメタン生成を阻害することができる。いくつかの実施形態において、本組成物はまた、腸溶性二酸化炭素産生を削減するのにも役立つ。いくつかの実施形態において、組成物はまた、家畜の成長及び健康を増進することもでき、飼料中のタンパク質源の完全な変換を可能にして、例えば、アンモニアの形態の動物の廃棄物中の窒素排出を削減することができる。さらに、この組成物は、放牧場及び牧草地に適用された場合に植物成長を増強することによって、カーボンの隔離のためのカーボンシンクを生成する。
好ましい実施形態において、本組成物の有益な微生物は、非病原性真菌、酵母及び／又は細菌である。有益な微生物は、活性、不活性及び／又は休眠状態であってもよい。
本組成物の微生物及び／又は微生物成長副産物は、小規模から大規模の範囲の培養プロセスを通して得ることができる。これらの培養プロセスには、浸漬培養／発酵、固相発酵（ＳＳＦ）、改変、ハイブリッド、及び／又はそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
特定の実施形態において、本発明の組成物は、有益な微生物及び／又は成長副産物が産生された発酵培地を含むことができる。
本発明の微生物は、天然の微生物であっても、遺伝子改変された微生物であってもよい。例えば、微生物は、特定の特徴を示すために特定の遺伝子で形質転換される。また、微生物は、所望の菌株の突然変異体であってもよい。本明細書中で使用される「突然変異体」は、基準微生物の菌株、遺伝的変異体又はサブタイプを意味し、ここで、突然変異体は、基準微生物と比較して、１つ以上の遺伝的変異（例えば、点変異、ミスセンス変異、ナンセンス変異、欠失、重複、フレームシフト変異又は反復拡大）を有する。突然変異体を作製するための手順は、微生物学的技術分野において周知である。例えば、ＵＶ突然変異誘発及びニトロソグアニジンは、この目的のために広く使用されている。
１つの具体的な実施形態において、組成物は、約１×１０6～約１×１０13、約１×１０7～約１×１０12、約１×１０8～約１×１０11、又は約１×１０9～約１×１０10ＣＦＵ／ｍｌの、組成物中に存在する各種微生物を含む。
特定の実施形態において、組成物の１回の適用における微生物の量は、合計で、１頭当たり約４０～７０グラム（ウシ群における個々の動物）、又は１頭当たり約４５～約６５グラム、又は１頭当たり約５０～約６０グラムである。
一実施形態において、組成物は、総体積で約１～１００％、約１０～９０％、又は約２０～７５％の微生物を含む。
特定の好ましい実施形態において、組成物は、１つ以上の細菌及び／又はその成長産物を含む。細菌は、例えば、Myxococcus sp.（例えば、M. xanthus）、及び／又は１つ以上のBacillus spp.細菌である。特定の実施形態において、Bacillus spp.は、B. amyloliquefaciens、B. subtilis及び／又はB. licheniformisである。細菌は、胞子形態で、栄養細胞として、及び／又はそれらの混合物として使用される。
一実施形態において、組成物は、B. amyloliquefaciensを含む。いくつかの実施形態において、B. amyloliquefaciensは、体重を増加させ、飼料摂取及び変換を増加させ、成長ホルモン（例えば、ＧＨ／ＩＧＨ-１）レベルを増加させるために、ウシにおけるプロバイオティクスとして役立つ。さらに、B. amyloliquefaciensは、他の有益な微生物（例えば、脂肪酸の産生者）の成長を促進し、一方、例えば、抗菌性リポペプチドバイオサーファクタントを産生することによって、動物の腸内の潜在的病原性微生物の量を削減することができる。いくつかの実施形態において、４×１０10ＣＦＵ／日の用量のB. amyloliquefaciensが、本発明の組成物の一部として動物に投与される。
好ましい実施形態において、B. amyloliquefaciensの菌株は、B. amyloliquefaciens NRRL B-67928（「B.amy」）である。
B. amyloliquefaciens「B.amy」微生物の培養物は、Agricultural Research Service Northern Regional Research Laboratory(NRRL),1400 Independence Ave, S.W、Washington、DC,20250、USAに寄託されている。寄託は、寄託機関によって受託番号NRRL B-67928が割り当てられ、２０２０年２月２６日に寄託された。
本発明の培養物は、３７ＣＦＲ１．１４及び３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．１２２に基づき、特許商標庁長官により権利が与えられると決定されたものに対して、本特許出願の係属中に培養物へのアクセスが利用可能であることを保証する条件下で寄託されている。寄託物は、本出願の対応出願又はその孫出願が出願される国において、外国特許法によって要求されるように入手可能である。しかしながら、寄託物の利用可能性は、政府の措置によって付与された特許権を失効させて本発明を実施するためのライセンスを構成しないことを理解されたい。
さらに、本培養物の寄託は「微生物の寄託に関するブダペスト条約」の規定に従い、保存され、一般に公開される。すなわち、寄託のサンプル提供の直近の要請後の最低５年間、また、いずれにせよ、寄託日から最低３０年間（３０年間）、又は培養物を開示する可能性のある特許の有効期間の間、実行可能で汚染されないように、必要なすべての注意を払って保存される。寄託者は、寄託の条件のために、寄託機関が要求に応じて試料を提供することができない場合、寄託を取り替える義務を認める。被写体培養寄託物の公衆への利用可能性に関するすべての制限は、それを開示する特許の付与に際して、取消不能に解除される。
いくつかの実施形態において、B. licheniformisは、メタン菌によるメタン生成を削減し、プロピオン酸及びリポペプチドバイオサーファクタント等の他の代謝産物の産生を通じてメタン菌細菌自体を阻害することができる。さらに、B. licheniformisは、牛のこぶ胃液中のアンモニア濃度を低下させるのに役立ち、一方で乳蛋白質産生を増加させる。豚では、B. licheniformis及びB. subtilisは糞便中のLactobacillus数を増加させるのに役立ち、窒素の消化率を上昇させ、アンモニア及びメルカプタンの排出を低下させる。いくつかの実施形態において、２×１０10ＣＦＵ／日の用量のB. licheniformisが、本発明の構成物の一部として動物に投与される。
一実施形態において、有益な微生物は酵母及び／又は真菌である。本発明による使用に適した酵母及び真菌種としては、Acaulospora、Acremonium chryllus、Aspergillus、Aureobasidium（例えば、Apullulans）、Blakeslea、Candida（例えば、C. albicans、C. apicola、C. batistae、C. bombicola、C. floricola、C. riodocensis、C. kuoi、C. nodaensis、C. stellate）、Cryptococcus、Debaryomyces（例えば、D. hansenii）、Entomophthora、Hansenula（例えば、H. uvarum）、Issatchenkia、Kluyveromyces（例えば、K. phaffii）、Lentinula spp.（例えば、L. edodes）、Meyerozyma（例えば、M. guilliermondii）、菌根（例えば、Leccinum spp.、Suillus spp.、Monascus purpureus、Mortierella、Mucor（例えば、M. piriformis）、Penicillium、Phythium、Phycomyces、Pichia（例えば、P. anomala、P. guilliermondii、P. occidentalis、P. kudriavzevii）、Pleurotus（例えば、P. ostreatus、P. sajorcaju、P. cystidiosus、P. cornucopiae、P. pulmonarius、P. tuberregium、P. citrinopileatus及びP. flabellatus), Pseudozyma（例えば、P. aphidis）、Rhizopus、Rhodotorula（例えば、Rbogoriensis）、Saccharomyces（例えば、S. cerevisiae、S. boulardii、S. torula）、Starmerella（例えば、S. bombicola）、Torulopsis、Thraustochytrium、Trichoderma（例えば、T. reesei、T. harzianum、T. viridae）、Ustilago（例えば、U. maydis）、Wickerhamiella（例えば、W. domericqiae）、Wickerhamomyces（例えば、W. anomalus）、Williopsis（例えば、W. mrakii）、Zygosaccharomyces（例えば、Zbailii）等が挙げられる。
特定の具体的な実施形態において、組成物は、１つ以上の真菌及び／又はその１つ以上の成長副産物を含む。真菌は、例えば、Pleurotus spp.真菌、例えばP. ostreatus（ヒラタケ）、Lentinula spp.真菌、例えば、L. edodes（シイタケ）、及び／又はTrichoderma spp.真菌、例えば、T. viridae又はT. harzianumである。真菌は、生細胞又は不活性細胞、菌糸体、胞子及び／又は子実体の形態である。果実体は、存在する場合、例えば、細断及び／又はブレンドして顆粒及び／又は粉末形態にすることができる。
特定の具体的な実施形態において、組成物は、１つ以上の酵母及び／又はその１つ以上の成長副産物を含む。酵母は、例えば、Wickerhamomyces anomalus、Saccharomyces spp.（例えば、S. cerevisiae及び／又はS. boulardii）、Starmerella bombicola、Meyerozyma guilliermondii、Pichia occidentalis、Monascus purpureus、及び／又はAcremonium chrysogenumである。酵母は、生細胞又は不活性細胞又は胞子の形態、同様に、乾燥細胞及び／又は休眠細胞（例えば、酵母加水分解物）の形態である。
例示的な一実施形態において、B.amyを含む。例示的な一実施形態において、組成物は、S. boulardii及びP. ostreatusを含む。例示的な一実施形態において、組成物は、B.amyと、S.boulardii及びP.ostreatusの一方又は両方とを含む。
特定の実施形態において、組成物は、組成物に使用される胞子形態微生物の発芽を増強するための発芽エンハンサーを含む。特定の実施形態において、発芽エンハンサーは、例えば、Ｌ-アラニン及び／又はＬ-ロイシン等のアミノ酸である。一実施形態において、発芽促進剤は、マンガンである。
一実施形態において、組成物は、１つ以上の脂肪酸を含む。特定の好ましい実施形態において、脂肪酸は、１４～２０個の炭素の炭素骨格を有する飽和長鎖脂肪酸、例えば、ミリスチン酸、パルミチン酸又はステアリン酸である。いくつかの実施形態において、２つ以上の飽和長鎖脂肪酸の組み合わせが組成物に含まれる。いくつかの実施形態において、飽和長鎖脂肪酸は、メタン発酵を阻害し、及び／又はこぶ胃におけるメタン菌の細胞膜透過性を増加する。
一実施形態において、組成物は、微生物成長副産物を含む。微生物成長副産物は、組成物の微生物によって産生することができ、及び／又はそれらを別々に産生し、組成物に添加することができる。
一実施形態において、成長副産物は、それが産生された発酵培地から精製されている。あるいは、一実施形態において、成長副産物は、粗形態で利用される。粗形態は、例えば、残留細胞及び／又は栄養素を含む目的の成長副産物を産生する微生物の培養から生じる液体上清を含む。
成長副産物は、例えば、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、酵素、バイオサーファクタント、溶剤及び／又は他の代謝産物を含む、細胞成長の結果として産生される代謝産物又は他の生化学物質を含むことができる。
一実施形態において、組成物は、Pleurotus ostreatusを含み、その培養物は、約２．５％～３．０％又は２．８％の濃度のロバスタチン（乾燥重量）を含有することができる。
ロバスタチンは、Pleurotusのポリケチド成長副産物であり、その細胞膜合成に必須なイソプレノイド構成単位であるＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼの形成に関与する酵素の阻害を介して、メタン菌古細菌を阻害する。利点を挙げると、ロバスタチンは、こぶ胃中の他のセルロース分解性細菌に悪影響を及ぼすことなく、メタン菌の成長を阻害することができることである。一実施形態において、組成物は、Pleurotus菌の有無にかかわらず、精製形態のロバスタチンを含む。
一実施形態において、組成物は、ロバスタチンの産生なしにＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼ活性を阻害することができる生存Lentinula edodesを含む。
一実施形態において、組成物は、Trichoderma viridae及び／又はAcremonium chrysogenumを含み、これらもロバスタチンと同様のスタチンを産生する。
一実施形態において、組成物は、Monascus purpureusの発酵米製品である赤色酵母米又はコウジを含む。赤色酵母米は、ロバスタチンと類似の構造を有し、ＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼ活性を阻害する能力を有するモナコリンＫを含む。
特定の実施形態において、組成物は、Wickerhamomyces anomalus及び／又はSaccharomyces spp.酵母の培養物を含む。これらの酵母は、反芻動物の消化系内で酢酸生成及び酢酸生成細菌による水素利用を促進する。利点を挙げると、これは動物の消化の健康に悪影響を及ぼすことなく、メタンが産生されるプロセスを実施するためのメタン菌微生物の水素可用性を低下させる。このように、一実施形態において、組成物中のWickerhamomyces anomalus及び／又はSaccharomyces spp.酵母（例えば、Scerevisiae及び／又はSboulardii）、及び／又はその成長副産物の存在は、反芻動物の腸内微生物における酢酸生成菌の量を増強し、及び／又はその中のメタン菌の量を減少させる。
さらに、Wickerhamomyces anomalusは、飼料からのリンの改善された消化及びバイオアベイラビリティに有用な酵素であるフィターゼ、同じく病原性微生物を制御するのに有用なキラー毒素（例えば、エキソ－β－１，３－グルカナーゼ）を産生する。
一実施形態において、組成物は、合成又は生物学的に産生されたアミノ酸を含む。特定の実施形態において、アミノ酸はバリンである。バリンは、Wickerhamomyces anomalus及びSaccharomyces spp.によって産生されるアミノ酸であり、これは、家畜動物の成長及び健康を補助し、飼料中のタンパク質源のより完全な変形を可能にして、それらの廃棄物中に排泄される窒素の量を、例えば、アンモニアの形態で減少させる。一実施形態において、組成物は、それを産生する酵母の有無にかかわらず、精製された形態のバリンを含む。
いくつかの実施形態において、組成物は、こぶ胃中のメタンを減少することが知られている追加の成分、例えば、海藻（例えば、Asparagopsis taxiformis）、ケルプ、３-ニトロオキシプロパノール、アントラキノン、イオノフォア（例えば、モネンシン及び／又はラサロシド）、ポリフェノール（例えば、サポニン、タンニン）、有機硫黄（例えば、ニンニク抽出物）、フラボノイド（例えば、クエルセチン、ルチン、カンペロール、ナリンギン、及びアントシアニジン）、カボス、ローズヒップ及びブラックカラント由来のビオフラボノイド、カルボン酸、及び／又はテルペン（例えば、ｄ-リモネン、ピネン、及びかんきつ類抽出物）を含むことができる。
一実施形態において、本組成物は、例えば、アミノ酸（必須アミノ酸を含む）、ペプチド、タンパク質、ビタミン、微量元素、脂肪、脂肪酸、脂質、炭水化物、ステロール、酵素、そして、カルシウム、マグネシウム、リン、カリウム、ナトリウム、塩素、硫黄、クロム、コバルト、銅、ヨウ素、鉄、マンガン、モリブデン、ニッケル、セレン及び亜鉛等のミネラルの供給源等、野外又は牧草地における家畜及び／又は植物の栄養上の必要性を補うための１つ以上の追加の物質及び／又は栄養素を含むことができる。いくつかの実施形態において、組成物の微生物は、これらの物質を産生及び／又は提供する。
一実施形態において、組成物は、１つ以上のバイオサーファクタントをさらに含むことができる。バイオサーファクタントは、微生物によって産生される構造的に多様な群の界面活性物質で、生分解性であり、再生可能な基質上の選択された生物を使用して効率的に産生される。バイオサーファクタントは、全て両親媒性物質である。それらは、２つの部分：極性（親水性）部分と非極性（疎水性）基とからなる。バイオサーファクタント分子の共通の親油性部分は、脂肪酸の炭化水素鎖であり、一方、親水性部分は、中性脂質のエステル又はアルコール基によって、脂肪酸又はアミノ酸（又はペプチド）のカルボキシレート基によって、フラボ脂質の場合には、有機酸によって、又は糖脂質の場合には、炭水化物によって形成される。
それらの両親媒性構造のために、バイオサーファクタントは、疎水性の水不溶性物質の表面積を増加させ、そのような物質の水バイオアベイラビリティを増加させ、細菌細胞表面の特性を変化させる。バイオサーファクタントは、界面に蓄積し、これにより界面張力を減少させ、溶液中に凝集ミセル構造を形成させる。安全で有効な微生物バイオサーファクタントは、液体、固体、及び気体の分子間の表面及び界面張力を減少させる。バイオサーファクタントは、孔を形成し、生物学的膜を不安定化する能力によって、抗菌剤、抗真菌剤、及び溶血剤として使用することができる。
本発明によるバイオサーファクタントは、例えば、低分子量糖脂質、リポペプチド、フラボ脂質、リン脂質、及びリポタンパク質のような高分子量ポリマー、リポ多糖－タンパク質複合体、及び多糖－タンパク質－脂肪酸複合体を含むことができる。
一実施形態において、バイオサーファクタントは、糖脂質である。糖脂質は、例えば、ソホロ脂質、ラムノ脂質、セロビオース脂質、マンノシルエリトリトール脂質及びトレハロース脂質を含むことができる。一実施形態において、バイオサーファクタントは、リポペプチドである。リポペプチドには、例えば、サーファクチン、イチュリン、アンスロファクチン、ビスコシン、フェンギシン、及びリケニシンが含まれ得る。特定の実施形態において、バイオサーファクタントの混合物が使用される。
一実施形態において、バイオサーファクタントは、それが産生された発酵培地から精製されている。あるいは、一実施形態において、バイオサーファクタントは、バイオサーファクタント産生微生物の培養から生じる発酵ブロスを含む粗形態で利用される。この粗型バイオサーファクタント溶液は、約０．００１％～９９％、約２５％～約７５％、約３０％～約７０％、約３５％～約６５％、約４０％～約６０％、約４５％～約５５％、又は約５０％の純粋なバイオサーファクタントを、残留細胞及び／又は栄養素と共に含むことができる。
一実施形態において、組成物は、水をさらに含むことができる。例えば、微生物及び／又は成長副産物を水と混合し、ウシに投与することができる。他の実施形態において、組成物は、例えば、飼料添加物及び／又はサプリメントとして、ウシの飲料水と混合され得る。飲料水組成物は、例えば、組成物の１ｇ／Ｌ～約５０ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ～約２０ｇ／Ｌ、又は約５ｇ／Ｌ～約１０ｇ／Ｌを含むことができる。
特定の実施形態において、組成物は、家畜動物の胃腸管への組成物の経口送達に適した担体を含む。担体は、錠剤、カプセル又は粉末形態に処方するための固体ベースの乾燥材料から構成することができ、又は担体は、液体又はゲル形態に処方するための液体又はゲルベースの材料から構成することができる。
一実施形態において、組成物は、作製済みウェット又は乾燥動物飼料をさらに含むことができ、ここで、作製済み飼料は、動物の消費の準備ができるように調理及び／又は加工されている。例えば、微生物及び／又は成長副産物は、作製済み飼料に注がれ、及び／又はそれと混合されてもよく、又は微生物及び／又は成長副産物は、乾燥動物飼料片、例えば、モルセル、キブル又はペレットの外側上のコーティングとして機能させてもよい。
一実施形態において、組成物は、動物飼料を製造するための原料成分をさらに含むことができ、原料成分は、微生物及び／又は成長副産物と共に、次いで、加熱及び／又は処理されて、増強された乾燥又はウェット飼料製品が製造される。
組成物は、例えば、約０．１重量％～９９重量％、約１重量％～約７５重量％、又は約５重量％～約５０重量％の濃度で、ウェット又は乾燥飼料及び／又は原飼料成分に添加することができる。
本明細書中で使用される「乾燥飼料」は、限定された水分含量、典型的には、約５％～約１５％又は２０％ｗ／ｖの範囲の水分含量を含有する飼料を指す。典型的には、乾燥加工飼料は、小～中サイズの個片、例えば、モルセル、キブル、トリート、ビスケット、ナッツ、ケーキ又はペレットの形成で得られる。
一実施形態において、組成物は、動物飼料を製造するための原料成分をさらに含むことができ、原料成分は、微生物及び／又は成長副産物と共に、加熱及び／又は処理されて、増強された乾燥又はウェット飼料製品が製造される。原料成分は、例えば、穀物、イネ科牧草、粗飼料、飼料、干し草、わら、シード、ナッツ、作物残渣、野菜、果物、乾燥植物物質、及び他の香味料、添加剤及び／又は栄養源を含むことができる。一実施形態において、組成物は、約０．１重量％～約５０重量％、約１重量％～約２５重量％、又は約５重量％～約１５重量％の濃度で原料飼料成分に添加される。
補充された乾燥飼料片は、１片当たり一定濃度の組成物を含むことができる。他の実施形態において、組成物は、乾燥飼料片上の表面コーティングとして利用することができる。加圧粉砕、押出、及び／又はペレット化を含む、乾燥加工飼料を製造するための当技術分野で公知の方法を使用することができる。
例示的な実施形態において、乾燥飼料は、例えば、スクリュー押出成形によって調製されてもよく、スクリュー押出成形には、調理、成形、及び非常に短時間での特定の形状及びサイズへの原料成分の切断が含まれる。成分は、均質な発泡性生地に混合され、押出機内で調理され、圧力及び高熱下でダイに通されてもよい。調理後、任意で、コーティングを噴霧する前に、ペレットを冷却させる。このコーティングは、例えば、液体脂肪又は消化物（例えば、鶏又はウサギ由来の肝臓又は腸等の動物組織の液体又は粉末加水分解形態を含む）、及び／又は栄養油を含む。他の実施形態において、ペレットは、真空エンロービング技術を使用してコーティングされ、ここで、ペレットは真空に曝され、次いで、コーティング材料に曝され、その後、真空の解除によって、ペレット内部のコーティング材料を駆動する。次いで、熱風乾燥を用いて、総水分含量を１０％以下に減少させることができる。
一実施形態において、乾燥飼料は、「低温」ペレット化処理、又は高熱もしくは蒸気を使用しない処理を使用して製造される。この方法は、例えば、本発明の組成物中の重要な成分及び／又は栄養素を変性又は分解するリスクなしに成分を一緒に保持するために、粘性及び凝集特性を有する液体バインダーを使用することができる。
一実施形態において、組成物は、動物飼料に適用することができ、又は干し草、わら、サイレージ、発芽穀物、マメ科植物及び／又は穀物等の植物物質を切断し、乾燥させることができる。
一実施形態において、組成物は、噴霧乾燥バイオマス製品として作製されてもよい。バイオマスは、遠心分離、濾過、分離、デカンティング、分離とデカンティングの組み合わせ、限外濾過又は精密濾過等の公知の方法によって分離することができる。
一実施形態において、組成物は、例えば、５０％までのタンパク質、同じく多糖類、ビタミン、及びミネラルを含む、高い栄養含量を有する。結果として、この組成物は、完全な動物飼料組成物の全ての一部として使用される。一実施形態において、飼料組成物は、飼料の１５％～飼料の９９％の範囲の対象組成物を含む。
一実施形態において、本組成物は、動物の食餌を補助し、及び／又は動物の健康及び／又は健やかさを促進するための追加の栄養素、例えば、アミノ酸（必須アミノ酸を含む）、ペプチド、タンパク質、ビタミン、微量元素、脂肪、脂肪酸、脂質、炭水化物、ステロール、酵素、プレバイオティクス、微量ミネラル、例えば、鉄、銅、亜鉛、マンガン、コバルト、ヨウ素、セレン、モリブデン、ニッケル、フッ素、バナジウム、スズ及びケイ素を含む。
いくつかの実施形態において、追加の栄養素はまた、野外又は牧草地における植物に対して植物の健康及び成長を促進することもできる。
好ましい組成物は、ビタミン及び／又はミネラルを任意の組み合わせで含む。本発明の組成物において使用されるビタミンは、例えば、ビタミンＡ、Ｅ、Ｋ３、Ｄ３、Ｂ１、Ｂ３、Ｂ６、Ｂ１２、Ｃ、ビオチン、葉酸、パントテン酸、ニコチン酸、塩化コリン、イノシトール及びパラアミノ安息香酸を含むことができる。ミネラルは、例えば、カルシウム、マグネシウム、リン、カリウム、ナトリウム、塩素、硫黄、クロム、コバルト、銅、ヨウ素、鉄、マンガン、モリブデン、ニッケル、セレン、及び亜鉛等を含むことができる。他の成分としては、抗酸化剤、ベータ－グルカン、胆汁酸塩、コレステロール、酵素、カロテノイド、及び他の多くが挙げられるが、これらに限定されない。典型的なビタミン及びミネラルは、例えば、毎日の消費のために、及び推奨される毎日の量（ＲＤＡ）で推奨されるものであるが、正確な量は変化する。組成物は、好ましくはＲＤＡビタミン、ミネラル及び微量ミネラルの複合体、確立されたＲＤＡを有さないが、健康な哺乳動物生理学において有益な役割を有する栄養素を含む。
微生物及び／又は微生物成長副産物の産生
本発明は、微生物の培養及び微生物代謝産物及び／又は微生物成長の他の副産物の産生の方法を利用する。本発明はさらに、微生物の培養及び所望の規模での微生物代謝産物の産生に適した培養プロセスを利用する。これらの培養プロセスには、浸漬培養／発酵、固相発酵（ＳＳＦ）、改変、ハイブリッド、及び／又はそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書中で使用される「発酵」は、制御された条件下での細胞の培養又は成長をいう。成長は、好気性又は嫌気性である。好ましい実施形態において、微生物は、ＳＳＦ及び／又はその改質物を使用して成長する。
一実施形態において、本発明は、バイオマス（例えば、生細胞物質）、細胞外代謝産物、残留栄養素、及び／又は細胞内成分を産生するための物質及び方法を提供する。
本発明に従って使用される微生物成長容器は、工業的使用のための任意の発酵槽又は培養反応器である。一実施形態において、容器は、機能制御／センサを有してもよく、又はｐＨ、酸素、圧力、温度、湿度、微生物密度及び／又は代謝産物濃度等の培養プロセスにおける重要な因子を測定するために機能制御／センサに接続されてもよい。
さらなる実施形態において、容器は、容器内の微生物の成長（例えば、細胞数及び成長期の測定）を監視することもできる。あるいは、毎日のサンプルを容器から採取し、希釈プレーティング技術等の当技術分野で公知の技術による計数を行ってもよい。希釈プレーティングは、サンプル中の生物の数を推定するために使用される単純な技術である。また、この技術は、異なる環境又は処理を比較することができる指標も提供する。
一実施形態において、本方法は、窒素源を用いて培養を補充することを含む。窒素源は例えば、硝酸カリウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、アンモニア、尿素、及び／又は塩化アンモニウムである。これらの窒素源は、単独で、又は２種以上の組み合わせで使用することができる。
本方法は、成長培養物を酸素化することができる。一実施形態は、低酸素含有空気を除去し、酸素化空気を導入するために、空気の緩慢な動きを利用する。浸漬発酵の場合、酸素化空気は、液体の機械的撹拌のためのインペラー、及び液体中への酸素の溶解のために液体に気泡を供給するための空気スパージャーを含む機構を介して毎日補充される周囲空気であってもよい。
本方法は、培養物に炭素源を補充することをさらに含むことができる。炭素源は、典型的には、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、トレハロース、マンノース、マンニトール、及び／又はマルトース等の炭水化物、酢酸、フマル酸、クエン酸、プロピオン酸、リンゴ酸、マロン酸、及び／又はピルビン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、イソブタノール、及び／又はグリセロール等のアルコール、大豆油、カノーラ油、米ぬか油、オリーブ油、トウモロコシ油、ゴマ油、及び／又はアマニ油等の油脂である。これらの炭素源は単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
一実施形態において、微生物の成長因子及び微量栄養素が培地に含まれる。これは、それらが必要とするビタミンの全てを産生することができない微生物を成長させる場合に特に好ましい。鉄、亜鉛、銅、マンガン、モリブデン及び／又はコバルトのような微量元素を含む無機栄養素もまた、培地に含まれる。さらに、ビタミン、必須アミノ酸、及び微量元素の源は、例えば、トウモロコシ粉等の穀粉又はミールの形態で、又は酵母抽出物、ジャガイモ抽出物、ビーフ抽出物、大豆抽出物、バナナ皮抽出物等の抽出物の形態で、又は精製された形態で含まれる。各種アミノ酸、例えば、タンパク質の生合成に有用な各種アミノ酸もまた含まれる。
一実施形態において、無機塩も含まれる。使用可能な無機塩は、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸水素二ナトリウム、硫酸水素マグネシウム、塩化マグネシウム、塩化鉄、塩化鉄、硫酸マンガン、塩化マンガン、硫酸亜鉛、塩化鉛、硫酸銅、塩化カルシウム、塩化ナトリウム、炭酸カルシウム、及び／又は炭酸ナトリウムである。これらの無機塩は単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
一実施形態において、微生物の成長速度を高める物質である、１つ以上の生体刺激剤を含めることもできる。生体刺激剤は、種特異的であるか、又は種々の種の成長速度を増強する。
いくつかの実施形態において、培養する方法は、培養プロセスの前及び／又は間に、培地中に追加の酸及び／又は抗菌剤を付加することをさらに含んでもよい。抗菌剤又は抗生物質は、培養物を汚染から保護するために使用される。
さらに、消泡剤を添加して、浸漬培養の間にガスが生成されるときに泡の形成及び／又は蓄積を防止することもできる。
混合物のｐＨは、目的の微生物に適したものとする。緩衝剤、及び炭酸塩及びリン酸塩等のｐＨ調整剤を使用して、ｐＨを好ましい値付近に安定化させることができる。金属イオンが高濃度で存在するときは、培地中にキレート化剤を使用することが必要な場合がある。
微生物は、プランクトン形態で、又はバイオフィルムとして成長させることができる。バイオフィルムの場合、容器は、その中に微生物をバイオフィルム状態で成長させることができる菌床を有する。また、このシステムは、例えば、バイオフィルム成長特性を促進及び／又は改善する刺激（せん断力応力等）を印加する能力を有してもよい。
一実施形態において、微生物の培養方法は、約５℃～約１００℃、好ましくは１５～６０℃、より好ましくは２５～５０℃で実施される。さらなる実施形態において、培養は、一定温度で連続的に実施されてもよい。他の実施形態において、培養は、変化する温度にさらされてもよい。
一実施形態において、方法及び培養プロセスで使用される機器は無菌である。反応器／容器のような培養機器は、滅菌ユニット、例えば、オートクレーブから分離されてもよいが、それに接続されてもよい。また培養機器は、接種を開始する前にin situで滅菌する滅菌ユニットを有してもよい。空気は、当技術分野で公知の方法によって滅菌することができる。例えば、周囲空気は容器内に導入される前に、少なくとも１つのフィルタを通過することができる。他の実施形態において、培地は、低温殺菌されてもよく、又は任意で、熱を全く加えなくてもよく、低水分活性及び低ｐＨの使用が望ましくない細菌成長を制御するために利用されてもよい。
一実施形態において、本発明はさらに、成長及び代謝産物産生に適切な条件下で本発明の微生物菌株を培養することによって、例えば、バイオサーファクタント、酵素、タンパク質、エタノール、乳酸、ベータ－グルカン、ペプチド、代謝中間体、多価不飽和脂肪酸、及び脂質等の微生物代謝産物を産生する方法、及び、任意で、代謝産物を精製する方法を提供する。本方法によって産生される代謝産物含量は、例えば、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％である。
発酵培地のバイオマス含量は、例えば、５ｇ／ｌ～１８０ｇ／ｌ以上、又は１０ｇ／ｌ～１５０ｇ／ｌである。細胞濃度は、例えば、最終生成物１グラム当たり、少なくとも１×１０9、１×１０10、１×１０11、１×１０12又は１×１０13の細胞である。
目的の微生物によって産生される微生物成長副産物は、微生物中に保持されるか、又は成長培地中に分泌される。培地は、微生物成長副産物の活性を安定化する化合物を含有してもよい。
微生物の培養及び微生物副産物の産生のための方法及び装置は、バッチ、準連続プロセス、又は連続プロセスで実施することができる。
一実施形態において、微生物培養組成物は全て、培養の完了時に（例えば、所望の細胞密度、又は特定の代謝産物の密度を達成した時に）除去される。このバッチ手順において、全く新しいバッチが、第１のバッチの採取時に開始される。
他の実施形態において、発酵産物の一部のみが、任意の時点で除去される。この実施形態において、生細胞、胞子、分生子、菌糸及び／又は菌糸体を有するバイオマスは、新しい培養バッチのための接種物として容器内に残る。除去される組成物は、無細胞培地であるか、又は細胞、胞子、もしくは他の生殖繁殖体、及び／又はそれらの組み合わせを含む。このようにして、準連続システムが作製される。
利点を挙げると、本方法は、複雑な設備や高エネルギー消費を必要としないことである。目的の微生物は、培地と混合されたままであっても、現地で小規模又は大規模に培養される。
微生物ベースの生成物の生産
いくつかの実施形態において、本発明は、所望の結果を達成するために実際に適用される生成物である「微生物ベースの生成物」を提供する。微生物ベースの生成物は、単に、微生物培養プロセスから収穫された微生物ベースの組成物である。あるいは、微生物ベースの生成物は、添加されたさらなる成分を含んでいてもよい。これらの追加の成分は、例えば、安定剤、緩衝剤、担体（例えば、水又は塩溶液）、さらなる微生物成長を支持するために添加された栄養素、非栄養成長エンハンサー、及び／又は適用される環境中の微生物及び／又は組成物の追跡を容易にする薬剤を含むことができる。また、微生物ベースの生成物は、微生物ベースの組成物の混合物を含んでいてもよい。また、微生物ベースの生成物は、濾過、遠心分離、溶解、乾燥、精製等のような、しかしこれらに限定されない、何らかの方法で処理された微生物ベースの組成物の１つ以上の成分を含んでもよい。
本発明の１つの微生物ベースの生成物は、単に、目的の微生物及び／又は微生物によって産生される微生物代謝産物及び／又は任意の残留栄養素を含有する発酵培地である。発酵産物は、抽出又は精製することなく直接使用することができる。所望であれば、抽出及び精製は、文献に記載されている標準的な抽出及び／又は精製方法又は技術を用いて容易に達成することができる。
微生物ベースの生成物中の微生物は、活性又は不活性形態である。さらに、微生物を組成物から除去し、残留培養物を利用することができる。微生物ベースの生成物は、さらなる安定化、保存、及び貯蔵なしに使用される。利点を挙げると、これらの微生物ベースの生成物の直接使用が、微生物の高い生存率を保存し、外来種及び望ましくない微生物からの汚染の可能性を減らし、微生物成長の副産物の活性を維持することである。
微生物成長から生じる微生物及び／又は培地（例えば、ブロス又は固体基質）は、成長容器から除去され、例えば、即時使用のための配管を介して移される。
一実施形態において、微生物ベースの生成物は、単に微生物の成長副産物である。例えば、微生物によって産生されたバイオサーファクタントは、例えば、液体ブロス中に約５０％の純粋なバイオサーファクタントを含む、粗製形態の浸漬発酵容器から収集することができる。
他の実施形態において、微生物ベースの生成物（微生物、培地、又は微生物と培地）は例えば、意図される用途、意図される適用方法、発酵容器のサイズ、及び微生物成長施設から使用場所への任意の輸送モードを考慮に入れて、適切なサイズの容器に入れることができる。このように、微生物ベースの組成物が配置される容器は、例えば、１ガロン～１，０００ガロン以上であってもよい。他の実施形態において、容器は、２ガロン、５ガロン、２５ガロン、又はそれ以上である。
例えば、酵母発酵産物を成長容器から採取すると、採取された産物は、容器に入れられ、及び／又は配管で運ばれる（又は使用のために輸送される）ので、さらなる成分を添加することができる。添加剤は、例えば、緩衝剤、担体、同じ又は異なる施設で生成された他の微生物ベースの組成物、粘度調整剤、防腐剤、微生物成長のための栄養素、追跡剤、溶剤、殺生物剤、他の微生物及び意図された使用に特定の他の成分である。
本発明による処方に含有される他の適切な添加剤には、そのような製剤に慣例的に使用される物質が含まれる。このような添加剤の例には、界面活性剤、乳化剤、潤滑剤、緩衝剤、溶解度制御剤、ｐＨ調整剤、防腐剤、安定剤及び紫外線防止剤が含まれる。
一実施形態において、生成物は、有機酸及びアミノ酸又はそれらの塩を含む緩衝剤をさらに含んでもよい。適切な緩衝剤には、クエン酸塩、グルコン酸塩、酒石酸塩、リンゴ酸塩、酢酸塩、乳酸塩、シュウ酸塩、アスパラギン酸塩、マロン酸塩、グルコヘプトン酸塩、ピルビン酸塩、ガラクタラート、グルカル酸塩、タルトロナート、グルタミン酸塩、グリシン、リジン、グルタミン、メチオニン、システイン、アルギニン及びそれらの混合物が含まれる。また、リン酸及び亜リン酸又はそれらの塩が用いられてもよい。合成緩衝剤を使用することが適切であるが、天然緩衝剤（例えば、有機及びアミノ酸又は上記に列挙したそれらの塩）を使用することが好ましい。
さらなる実施形態において、ｐＨ調整剤は、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、炭酸カリウム又は重炭酸カリウム、塩酸、硝酸、硫酸又は混合物を含む。
一実施形態において、塩の水性調製物（例えば、重炭酸ナトリウム又は炭酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、又は重リン酸ナトリウム）のような追加の成分が、処方物に含まれる。
利点を挙げると、本発明に従って、微生物ベースの生成物は、微生物が成長したブロスを含むことである。生成物は、例えば、少なくとも重量で、１％、５％、１０％、２５％、５０％、７５％、又は１００％ブロスである。生成物中のバイオマスの量は、重量で、例えば、それらの間の全てのパーセンテージを含めて０％～１００％のいずれかである。
任意で、生成物は、使用前に貯蔵することができる。貯蔵時間は短いことが好ましい。このように、貯蔵時間は、６０日未満、４５日未満、３０日未満、２０日未満、１５日未満、１０日未満、７日未満、５日未満、３日未満、２日未満、１日未満、又は１２時間未満とする。好ましい実施形態において、生細胞が生成物中に存在する場合、生成物は、例えば、２０℃、１５℃、１０℃、又は５℃未満等の低温で貯蔵される。一方、バイオサーファクタント組成物は、典型的には、周囲温度で貯蔵される。
微生物ベースの生成物の現地生産
本発明の特定の実施形態において、微生物成長施設は、所望の規模で、新鮮な高密度の微生物及び／又は目的の微生物成長副産物を産生する。微生物成長施設は、適用場所又はその近くに位置してもよい。この施設は、バッチ培養、準連続培養、又は連続培養で高密度の微生物ベースの組成物を生産する。
本発明の微生物成長施設は、微生物ベースの生成物が使用される場所（例えば、放牧の牛牧草地）に配置することができる。例えば、微生物成長施設は、使用場所から３００、２５０、２００、１５０、１００、７５、５０、２５、１５、１０、５、３、又は１マイル未満であってよい。
微生物ベースの生成物は、従来の微生物生産の微生物安定化、保存、貯蔵、及び輸送プロセスに頼ることなく、局所的に生成することができるので、はるかに高密度の微生物を生成することができる。それによって、現地適用で使用するのに必要とされる微生物ベースの生成物は、少ない量でよく、所望の効力を達成するために必要であれば、高密度の微生物の適用が可能になる。これにより、小型化バイオリアクター（例えば、小さい発酵容器、少ない供給量の開始材料、栄養素及びｐＨ調整剤）が可能となり、システムを効率的にし、細胞を安定化させ、培養培地から分離する必要性を排除することができる。また、微生物ベースの生成物を現地生産すると、成長培地を生成物中へ容易に含めることができる。培地は、現地使用に最適な、発酵中に産生された薬剤を含有することができる。
現地生産された高密度で頑強な微生物の培養物は、サプライチェーンにしばらくの間残っていたものよりも、現地でより有効である。本発明の微生物ベースの生成物は、発酵成長培地中に存在する代謝産物及び栄養素から細胞が分離されている従来の生成物と比較して特に有利である。輸送時間の短縮は、現地の要求に応じて、その時間及び体積での微生物及び／又はそれらの代謝産物の新鮮なバッチの生成及び配送を可能にする。
本発明の微生物成長設備は、微生物自体、微生物代謝産物、及び／又は微生物が成長する培地の他の成分を含む、新鮮な微生物ベースの組成物を産生する。所望であれば、組成物は、高密度の栄養細胞又は増殖体、あるいは栄養細胞と増殖体との混合物を有することができる。
一実施形態において、微生物成長施設が、微生物ベースの生成物が使用される場所（例えば、畜産施設）に、又は近く、好ましくは、３００マイル以内、より好ましくは、２００マイル以内、さらに好ましくは、１００マイル以内に位置する。利点を挙げると、これによって、特定の場所での使用のために、組成物を調整することができることである。微生物ベースの組成物の処方及び効力は、例えば、どの動物種を処理するか、組成物が適用されているのが、どの季節、気候及び／又は時機であるか、どの様式及び／又は適用速度が利用されているか、といった、適用時の特定の現地の条件に合わせてカスタマイズすることができる。
利点を挙げると、分散された微生物成長施設は、上流での処理遅延、サプライチェーンのボトルネック、不適切な貯蔵、及び、例えば、細胞が最初に成長する生存高細胞数産物及び関連する培地及び代謝産物のタイムリーな配送及び適用を妨げる他の不測の事態に起因して、その産物の品質が損なわれる、遠方の工業規模の生産者に依存するという現在の問題に対する解決策が提供されることである。
さらに、組成物を現地生成することによって、処方及び効力を、特定の場所及び適用時に存在する条件にリアルタイムで調節することができる。これは、中央の場所で予め作製され、例えば、所与の位置に最適ではない可能性がある設定比や処方の組成物に勝る利点を与えるものである。
微生物成長施設は、目的地の地理との相乗効果を改善するために微生物ベースの生成物を調整する能力によって、製造の汎用性を提供する。利点を挙げると、好ましい実施形態において、本発明のシステムは、ＧＨＧ管理を改善するために、天然に存在する現地の微生物及びそれらの代謝副産物の力を利用する。
個々の容器の培養時間は、例えば、１～７日以上であってよい。培養生成物は、多くの異なる方法のいずれかで収穫することができる。
例えば、発酵の２４時間以内の現地生産及び配送の結果、純粋な、高細胞密度の組成物が得られ、かなり低い輸送コストとなる。より効果的で強力な微生物接種材料の開発における急速な進歩の見通しを考えると、微生物ベースの生成物を即時に配送できるこの能力は消費者にとって大きな利点となる。
大気中の温室効果ガス排出量の削減方法
好ましい実施形態において、本発明は、メタン、二酸化炭素、及び／又は他の有害な大気ガス、及び／又はそれらの前駆体（例えば、亜酸化窒素の前駆体である窒素及びアンモニア）の排出を削減する方法を提供し、組成物は、１つ以上の有益な微生物及び／又は１つ以上の微生物成長副産物を含む組成物は、野外又は牧草地に適用される。好ましくは、組成物は、本発明の実施形態による多目的組成物である。
特定の具体的な実施形態において、家畜動物は反芻動物である。特定の実施形態において、野外又は牧草地は、家畜動物が摂取する草及び／又は他の植物を含む、家畜動物のための食物源である。草及び／又は他の植物を牧草地で摂取することに加えて、家畜動物を、野外又は牧草地に放牧させて、組成物を摂取する。
利点を挙げると、好ましい実施形態において、本方法は、ウシの消化器系、特に、こぶ胃に存在するメタン菌及び／又は原生動物の減少をもたらす。特定の実施形態において、本方法はまた、ウシの消化系及び／又は廃棄物中の、メタン、二酸化炭素、他の有害な大気ガス、及び／又は窒素及び／又はアンモニア（亜酸化窒素の前駆体）等のそれらの前駆体の減少をもたらすことができる。
本明細書で使用される「減少」とは、少なくとも０．２５％、０．５％、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％の負の変化を指す。
いくつかの実施形態において、所望の減少が、比較的短い期間内、例えば、動物が組成物を摂取している１週間、２週間、３週間又は４週間以内に達成される。いくつかの実施形態において、所望の減少は、本発明の方法を使用した後、例えば、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月又は６ヶ月以内に達成される。いくつかの実施形態において、所望の減少は、本方法を使用した後、１年、２年、３年、４年、又は５年以内に達成される。
いくつかの実施形態において、本方法は、適用時に本組成物の微生物の成長を増強するために材料を添加すること（例えば、栄養素及び／又はプレバイオティクスを添加すること）をさらに含むことができる。一実施形態において、栄養源は、例えば、マグネシウム、リン酸塩、窒素、カリウム、セレン、カルシウム、硫黄、鉄、銅、亜鉛、タンパク質、ビタミン及び／又は炭素の供給源を含むことができる。特定の実施形態において、ウシは、例えば、乾燥動物飼料、わら、干し草、アルファルファ、穀物、飼料、草、果物、野菜、エンバク、及び／又は作物残渣を含むプレバイオティクスの供給源を与えられる。
一実施形態において、プレバイオティクス源は、乾燥動物飼料、わら、干し草、アルファルファ、穀物、飼料、草、果物、野菜、エンバク、作物残渣、フミン酸、フミン酸、フルボ酸、及び／又はケルプ抽出物を含むことができる。
組成物はまた、殺虫剤、除草剤、肥料、及び／又は他の土壌改良剤の適用を含む、他の作物管理システムと組み合わせて使用される。好ましい実施形態において、他の作物管理システムは、環境に優しく、ヒトや家畜に有害ではない。
いくつかの実施形態において、組成物を適用する前に、本方法は、現地の条件について家畜動物、野外及び／又は牧草地を評価し、現地の条件に合わせてカスタマイズされた組成物の好ましい処方（例えば、微生物及び／又は成長副産物の種類、組み合わせ及び／又は比率）を決定し、好ましい処方を用いて組成物を生成することを含む。
現地の条件は、例えば、動物の年、健康、サイズ及び種、動物を生産する目的（例えば、肉、毛皮、繊維、卵、労働力、乳等）、群れのサイズ、動物の腸の微生物集団内の種、ＧＨＧ排出量及び種類、現在の気候、及び／又は季節／時機等の環境条件、野外又は牧草地で生育する草及び／又は他の植物の種、組成物の適用の様式及び／又は速度、その他関連があると考えられるものを含むことができる。
評価後、組成物がこれらの現場の条件に合わせてカスタマイズされ得るように、組成物の好ましい処方を決定することができる。次いで、組成物は、好ましくは、適用場所（例えば、動物又は畜産施設）から３００マイル以内、好ましくは２００マイル以内、さらにより好ましくは１００マイル以内の微生物成長施設で培養される。
いくつかの実施形態において、現地の条件は、定期的に、例えば、毎年１回、毎年２回、又は毎月１回で評価される。このようにして、組成式は、変化する現地の条件の要求を満たすために、必要に応じてリアルタイムで修正することができる。
一実施形態において、組成物は、液体又は乾燥製品のいずれかとして適用される。一実施形態において、組成物は、例えば、潅漑システムを使用して、液体又は乾燥形態のいずれかで、野外又は牧草地上に散布される。さらに、組成物は、散布スプレッダー、ドロップスプレッダー、ハンドヘルドスプレッダー、又はハンドヘルドスプレーヤーのような手動スプレッダーを使用して適用することができる。
例示的な実施形態において、組成物は、水に溶解し、１．０～１０流体オンス／エーカー、又は約１．５～約８流体オンス／エーカーで、野外又は牧草地に適用される。
例示的な実施形態において、各動物によって消費される組成物の１日用量は、動物体重１００ｋｇ当たり約１０ｍｇ～約１０ｇ、又は約１５ｍｇ～約５グラムである。
特定の実施形態において、本方法は、摂取の補助として動物に提供される飲料水及び／又は飼料に組成物を添加することを含む。いくつかの実施形態において、組成物は、放牧場又は牧草地、同じく、飲料水及び／又は補助飼料に適用される。
一実施形態において、組成物は、補助飼料に処方される。組成物は、加工されたウェット及び／又は乾燥動物飼料を製造する際に利用される標準的な原料飼料成分に添加される。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組成物は、栄養補助食品として別の飼料組成物と同時投与することができる。栄養補助食品は、グレービー、飲料水、飲料、ヨーグルト、粉末、顆粒、ペースト、懸濁液、チュー、モルセル、液体溶液、トリート、スナック、ペレット、ピル、カプセル、錠剤、サシェ、又は任意の他の適切な送達形態等の任意の適切な形態を有することができる。栄養補助食品は、本組成物、同じく、ビタミン、ミネラル、プロバイオティクス、プレバイオティクス、及び抗酸化剤等の任意の化合物を含むことができる。いくつかの実施形態において、栄養補助食品は、動物への投与の前に、飼料組成物又は水又は他の希釈剤と混合されてもよい。
本発明の方法によれば、組成物の投与は、動物の分娩から成人期の期間にわたる食事療法の一部として実施することができる。特定の実施形態において、動物は、若い又は成長期の動物である。いくつかの実施形態において、動物は、老化した動物である。他の実施形態において、投与は、例えば、動物が、予期又は予想寿命の約３０％、４０％、５０％、６０％、又は８０％を超える寿命に達した場合に、定期的か、長期定期的に開始する。
本明細書に記載の組成物は、動物の生活の質、健康及び健やかさに悪影響を及ぼすことなく、動物から産生されるメタン排出量の削減等、本発明の１つ以上の目的を達成するのに必要な時間、放牧場又は牧草地を介して、及び任意で、補給飼料及び／又は飲料水を介して動物に投与される。
特定の実施形態において、本方法はまた、増強された炭素隔離によってＧＨＧを削減するために使用することもでき、野外又は牧草地の土壌は、組成物の１つ以上の有益な微生物を接種され、有益な微生物は、野外又は牧草地の植物の成長及び健康を促進する。
一実施形態において、この方法を使用して、土壌及び／又は植物の根圏に有益な微生物を接種することができる。本発明の組成物の微生物は、有益な微生物、例えば、菌根菌（mycorrhizal fungi）による根及び／又は根圏のコロニー形成を促進することができる。
菌根菌は、植物と共生的に会合する真菌であり、植物は、真菌の光合成を介して有機分子を作り、真菌は、土壌から水及び栄養素を植物に供給する。真菌には、植物の根の組織に細胞内で定着する内生真菌と、細胞外で根に定着する外生真菌がある。菌根には、例えば、Glomus、Acaulospora、Rhizoctonia、Funneliformis、Endogone、Entrophospora、Gigaspora、Sclerocystis、Scutellospora、Hebeloma、Lactarius及びAmanita spp.が含まれる。
いくつかの実施形態において、多目的組成物は、１つ以上の菌根菌を含むことができ、それによって、根圏に直接接種する。特定の実施形態において、B.amy、Trichoderma harzianum、及び１つ以上の菌根菌を含む組成物は、増強された植物バイオマス及び炭素隔離に対する改善された効果を生じる。
一実施形態において、コロニー形成の促進によって、土壌微生物の生物多様性の改善がもたらされる。本明細書中で使用される場合、生物多様性を改善することは、土壌内の微生物種の多様性を増加させることを指す。好ましくは、生物多様性の改善は、土壌中の嫌気性微生物に対する好気性細菌種、酵母種、及び／又は真菌種の比率を増加させることを含む。
一実施形態において、改善された土壌生物多様性によって、栄養素の可溶化及び／又は取り込みの増強が促進される。例えば、特定の好気性細菌種は、土壌を酸性化し、ＮＰＫ肥料を植物使用可能な形態に可溶化することができる。
一実施形態において、結果は、例えば、植物の葉のボリュームが増え、茎や幹の直径が太くなり、根の成長や密度が増し、植物の数が増えるといった、植物の増強された地上及び地下バイオマスの形態である、植物のカーボン利用の増強となる。一実施形態において、これは、植物の根が成長している根圏の全体のホスピタビリティを改善することによって、例えば、根圏の栄養素及び／又は保湿特性を改善することによって達成される。
一実施形態において、結果は、例えば、植物根成長の増進、植物によって分泌される有機化合物の微生物による取り込みの増加（植物根からの分泌物を含む）、及び土壌の微生物コロニー形成の改善の形態での土壌隔離の増強となる。
いくつかの実施形態において、本発明の方法は、炭素クレジット使用を削減するために畜産者が利用することができる。このように、特定の実施形態において、本方法は、メタン、二酸化炭素及び／又は他の有害な大気ガス、及び／又はその前駆体（例えば、窒素及び／又はアンモニア）の生成を削減することに対する方法の効果を評価するために、家畜の消化系及び／又は廃棄物中のメタン菌及び／又は原生動物の制御に対する方法の効果を評価するために、そして野外又は牧草地の土壌中の炭素の隔離に対する方法の効果を評価するために、測定を行うことをさらに含むことができる。
これらの測定は、例えば、ガス捕捉及び定量化、クロマトグラフィー、呼吸室（個々の動物によって吐き出されるメタンの量を測定する）、及びin vitroガス産生技術（乾燥物質１グラムあたりに排出されるメタン及び／又は亜酸化窒素の量を決定するために、餌は制御された実験室及び微生物条件下で発酵される）を含む、当該分野で公知の方法（例えば、非特許文献４（参照により本明細書中に援用される）を参照のこと））に従って行われる。測定はまた、例えば、牛乳、糞、及び／又は胃内容物をサンプリングし、例えば、ＤＮＡ配列決定及び／又は細胞プレーティングを使用して、動物中に存在するメタン菌微生物の数を決定することによって、動物中の微生物集団を試験する形態で行うことができる。
測定は、組成物の適用後の特定の時点で行うことができる。いくつかの実施形態において、測定は、約１週間以降、２週間以降、３週間以降、４週間以降、３０日以降、６０日以降、９０日以降、１２０日以降、１８０日以降、及び／又は１年以降に行われる。
さらに、測定は、経時的に繰り返すことができる。いくつかの実施形態において、測定は、毎日、毎週、毎月、２ヶ月毎、半月毎、半年毎、及び／又は毎年繰り返される。
実施例
例示としての以下の実施例により、本発明とその多くの利点が理解される。以下の実施例は、本発明の方法、用途、実施形態及び変形のいくつかを例示するものである。それらは、本発明を限定するものではない。本発明に関して、多くの変更及び修正を行うことができる。
実施例１－In vitro試験
本発明の実施形態による組成物を、ウシにおける腸内メタン及び二酸化炭素排出を削減させる能力についてスクリーニングした。２４本の容器に、ウシこぶ胃液、人工唾液、こぶ胃固形分１ｇ、超延期比１ｇ、及び１容量％の処理組成物を充填した。１つの対照３回を含む８つの処理の３回試験を実施した。処理は、以下の通りである。
０－対照
１－B. amy
２－P. ostreatus
３－S. boulardii
４－B. amy＋P. ostreatus
５－B. amy＋S. boulardii
６－P. ostreatus＋S. boulardii
７－B. amy＋P. ostreatus＋S. boulardii
２４時間後、各容器から採取したメタン、二酸化炭素及び総ガス量（ｍｌ／ｇＤＭ）を測定した。
図１は、メタンについての結果を示す。B. amyを含む処理１は、対照と比較して、メタンガスの平均量において７８％の減少（ｐ＝０．０５）を示した。S. boulardii及びP. ostreatusを含む処理６は、対照と比較して、メタンガスの平均量において６９％の減少（ｐ＝０．０３）を示した。
図２は、二酸化炭素還元の結果を示す。B. amyを含む処理１は対照と比較して二酸化炭素ガスの平均量の最大の減少を示し、S. boulardii及びP. ostreatusを含む処理６は、次に最大の減少を示した。

Claims (37)

  1. 腸内有害大気ガス及び／又はその前駆体を削減する方法であって、１つ以上の有益な微生物及び／又は１つ以上の微生物成長副産物を含む組成物を、家畜動物が摂取する草及び／又は他の植物を含む野外又は牧草地に適用し、前記家畜動物を、前記野外又は牧草地に放牧して摂取させることを含み、
    前記家畜は、前記草及び／又は他の植物に加えて、前記組成物を摂取し、前記１つ以上の有益な微生物は、Bacillus amyloliquefaciens、Pleurotus ostreatus、Lentinula edodes、Trichoderma viridae、Wickerhamomyces anomalus、Saccharomyces cerevisiae、Saccharomyces boulardii、Starmerella bombicola、Meyerozyma guilliermondii、Pichia occidentalis、Monascus purpureus、Acremonium chrysogenum、Myxococcus xanthus、Bacillus subtilis及びBacillus licheniformisから選択される、方法。
  2. 前記家畜動物は、反芻動物である、
    請求項１に記載の方法。
  3. 前記１つ以上の有益な微生物の少なくとも１つは、Bacillus amyloliquefaciensの株である、請求項１に記載の方法。
  4. 前記Bacillus amyloliquefaciensの株は、B. amyloliquefaciens NRRL B-67928（「B.amy」）である、請求項１に記載の方法。
  5. 前記１つ以上の微生物は、B.amy、P. ostreatus及び／又はS. boulardiiである、請求項１に記載の方法。
  6. 前記１つ以上の微生物及び／又は微生物成長副産物は、ＨＭＧ-ＣｏＡ還元酵素阻害剤である、請求項１に記載の方法。
  7. 前記１つ以上の微生物成長副産物は、ロバスタチン及び／又は他のスタチンである、請求項１に記載の方法。
  8. 前記１つ以上の成長副産物は、バリンである、請求項１に記載の方法。
  9. 前記１つ以上の成長副産物は、バイオサーファクタントである、請求項１に記載の方法。
  10. 前記バイオサーファクタントは、ソホロ脂質、ラムノ脂質、マンノシルエリトリトール脂質、セロビオース脂質及びトレハロース脂質から選択される糖脂質である、請求項９に記載の方法。
  11. 前記バイオサーファクタントは、サーファクチン、イチュリン、ビスコシン、アンスロファクチン、フェンギシン及びリケニシンから選択されるリポペプチドである、請求項９に記載の方法。
  12. 前記１つ以上の微生物成長副産物は、酵素である、請求項１に記載の方法。
  13. 前記酵素は、フィターゼ及び／又はキラー毒素である、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記１つ以上の微生物成長副産物は、プロピオン酸である、請求項１に記載の方法。
  15. 前記微生物成長副産物は、前記１つ以上の有益な微生物なしで適用される、請求項１に記載の方法。
  16. 前記１つ以上の微生物成長副産物は、精製される、請求項１に記載の方法。
  17. 前記微生物成長副産物は、粗形態にあり、前記粗形態は、前記成長副産物を産生する微生物の発酵から生じる上清を含む、請求項１に記載の方法。
  18. 前記１つ以上の有益な微生物及び／又は１つ以上の微生物成長副産物と共にプレバイオティックを適用することをさらに含み、前記プレバイオティックは、乾燥動物飼料、わら、干し草、アルファルファ、穀物、飼料、草、果実、野菜、エンバク、作物残渣、ケルプ抽出物、フミン酸、フルビン酸、及び／又はフミン酸塩である、請求項１に記載の方法。
  19. 飽和長鎖脂肪酸を、前記１つ以上の有益な微生物及び／又は１つ以上の微生物成長副産物と共に適用することをさらに含み、前記飽和長鎖脂肪酸は、ステアリン酸、パルミチン酸及び／又はミリスチン酸である、請求項１に記載の方法。
  20. 発芽エンハンサーを、前記１つ以上の有益な微生物及び／又は１つ以上の微生物成長副産物と共に適用することをさらに含み、前記発芽エンハンサーは、Ｌ-アラニン、Ｌ-ロイシン又はマンガンである、請求項１に記載の方法。
  21. 以下の成分の１つ以上を、前記１つ以上の有益な微生物及び／又は１つ以上の微生物成長副産物と共に適用することをさらに含み、前記成分は、海藻（Asparagopsis taxiformis）；ケルプ；３-ニトロオキシプロパノール；アントラキノン；モネンシン及びラサロシドから選択されるイオノフォア；サポニン及びタンニンから選択されるポリフェノール；有機硫黄；ニンニク抽出物；クエルセチン、ルチン、カンペロール、ナリンギン、及びアントシアニジンから選択されるフラボノイド；カボス、ローズヒップ及び／又はブラックカラントから単離されるビオフラボノイド；カルボン酸；及びｄ-リモネン、ピネン、及びシトラス抽出物から選択されるテルペンである、請求項１に記載の方法。
  22. 前記１つ以上の微生物及び／又は１つ以上の微生物成長副産物を、前記家畜が摂取する飲料水及び／又は補助飼料に適用することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  23. 前記１つ以上の微生物及び／又は１つ以上の微生物成長副産物は、加工された乾燥動物飼料を製造するために使用される原料と混合され、その中に混合された組成物を有する原料は、モルセル、ペレット、キブル、ケーキ、ナッツ、トリート又はビスケットを形成するために加工及び／又は調理される、請求項２２に記載の方法。
  24. 家畜の消化器系に存在するメタン菌微生物は制御される、請求項１に記載の方法。
  25. 野外又は牧草地の土壌中の植物及び微生物バイオマスを増強し、それによって前記野外又は牧草地中にカーボンシンクを生成するために使用される、請求項１に記載の方法。
  26. 前記有害な大気ガスは、メタン又は二酸化炭素である、請求項１に記載の方法。
  27. 前記有害な大気ガス前駆体は、窒素及び／又はアンモニアである、請求項１に記載の方法。
  28. 前記家畜の消化器系及び／又は廃棄物中の腸内有害大気ガス排出及び／又はその前駆体の削減に対する方法の効果を評価することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  29. 前記家畜の消化器系及び／又は廃棄物中のメタン菌細菌及び／又は原生動物の制御に対する方法の効果を評価することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  30. 前記野外又は牧草地における炭素の隔離に対する前記方法の効果を評価することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  31. 畜産に関与する事業者によって使用される炭素クレジットの数を減少させるために使用される、請求項１に記載の方法。
  32. 有害な大気ガス及び／又はその前駆体の排出を削減する組成物であって、１つ以上の有益な微生物及び／又は１つ以上の微生物成長副産物を含み、
    前記１つ以上の有益な微生物は、Bacillus amyloliquefaciens、Pleurotus ostreatus、Lentinula edodes、Trichoderma viridae、Wickerhamomyces anomalus、Saccharomyces cerevisiae、Saccharomyces boulardii、Starmerella bombicola、Meyerozyma guilliermondii、Pichia occidentalis、Monascus purpureus、Acremonium chrysogenum、Myxococcus xanthus、Bacillus subtilis及び／又はBacillus licheniformisであり、
    前記組成物は、家畜動物による摂取のために処方される、組成物。
  33. 乾燥動物飼料、わら、干し草、アルファルファ、穀物、飼料、草、果実、野菜、エンバク、又は作物残渣から選択されるプレバイオティクスをさらに含む、請求項３２に記載の組成物。
  34. 前記家畜動物の栄養必要性を補い、ウシの健康及び／又は健やかさを促進するための栄養素をさらに含み、前記栄養素は、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、ビタミン、微量元素、脂肪、脂肪酸、脂質、炭水化物、ステロール、酵素、カルシウム、マグネシウム、リン、カリウム、ナトリウム、塩素、硫黄、クロム、コバルト、銅、ヨウ素、鉄、マンガン、モリブデン、ニッケル、セレン、及び／又は亜鉛の供給源である、請求項３２に記載の組成物。
  35. ステアリン酸、パルミチン酸及びミリスチン酸から選択される飽和長鎖脂肪酸をさらに含む、請求項３２に記載の組成物。
  36. Ｌ-アラニン、Ｌ-ロイシン及びマンガンから選択される発芽エンハンサーをさらに含む、請求項３２に記載の組成物。
  37. 海藻（Asparagopsis taxiformis）；ケルプ；３-ニトロオキシプロパノール；アントラキノン；モネンシン及びラサロシドから選択されるイオノフォア；サポニン及びタンニンから選択されるポリフェノール；有機硫黄；ニンニク抽出物；クエルセチン、ルチン、カンペロール、ナリンギン、及びアントシアニジンから選択されるフラボノイド；カボス、ローズヒップ及び／又はブラックカラントから単離されるビオフラボノイド；カルボン酸；及びｄ-リモネン、ピネン、及びシトラス抽出物から選択されるテルペンである成分のうちの１つ以上をさらに含む、請求項３２に記載の組成物。
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