JP2017083293A - 分離材及びその製造方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】架橋ポリマーを含む多孔質ポリマー粒子と、多孔質ポリマーの表面上に設けられた、インプリント用ポリマーを含み分子インプリント法による鋳型を形成している分子鋳型膜と、を有する分離材が開示される。
【選択図】なし
Description
本明細書において「工程」との語には、他の工程から独立した工程に加え、他の工程と明確に区別できない場合であってもその工程の目的が達成されれば、当該工程も含まれる。
本明細書において「〜」を用いて示された数値範囲には、「〜」の前後に記載される数値がそれぞれ最小値及び最大値として含まれる。
本明細書において「層」との語には、当該層が存在する領域を観察したときに、当該領域の全体に形成されている場合に加え、当該領域の一部にのみ形成されている場合も含まれる。
多孔質ポリマー粒子は、二重結合を二つ以上有する多官能モノマーを含むモノマー原料の架橋ポリマーを含み得る。モノマー原料のうち90質量%以上が多官能モノマーであってもよい。多孔質ポリマー粒子は、例えば、モノマー原料、多孔化剤及び水性媒体を含む乳化液中での懸濁重合により合成することができる。
分子鋳型膜は、多孔質ポリマー粒子の表面上に設けられた、インプリント用ポリマーを含み分子インプリント法による鋳型を形成しているものである。
一実施形態に係る分子鋳型膜は、下地層用ポリマーを含む下地層(単に、下地層と称することがある)と、表層用ポリマーを含む表層(単に、表層と称することがある)とを有し、表層は下地層上に形成されている。すなわち、一実施形態に係る分子鋳型膜は、多孔質ポリマー粒子の表面の少なくとも一部を覆う下地層と、前記下地層上に設けられた表層と、を有しており、前記表層によって鋳型が形成されていてもよい。
下地層用ポリマーと表層用ポリマーは同じでも異なっていてもよく、本明細書ではこれらを「インプリント用ポリマー」と総称することがある。下地層と表層との組み合わせにより、分離材の最表面又はその近傍に、標的分子と相互作用する鋳型を形成することができる。これにより効率的な鋳型分子の捕捉を実現することができる。
下地層及び表層を有する分子鋳型膜は、例えば、架橋ポリマーを含む多孔質ポリマー粒子の表面上に下地層用ポリマーを含む下地層を形成させる工程と、下地層に鋳型分子を吸着させる工程と、鋳型分子が吸着している下地層上に、表層用ポリマーを含む表層を形成させる工程と、鋳型分子を除去して、表層と下地層とを有し鋳型分子に由来する鋳型を形成している分子鋳型膜を形成させる工程と、を有する方法により、形成することができる。
一実施形態に係る下地層として、ドーパミンの重合によりポリドーパミン膜を多孔質ポリマー粒子の表面上に形成させることができる。下地層(ここではポリドーパミン膜)は、細孔内の表面を含む多孔質ポリマー粒子の少なくとも一部を覆うように形成される。下地層は、多孔質ポリマー粒子の細孔の一部又は全部に侵入していてもよい。多孔質ポリマー粒子を下地層で覆うことにより、粒子内へのタンパク質の拡散性を向上することができる。また、吸着させるタンパク質と相互作用する物質をポリドーパミン膜に固定化することにより、タンパク質の吸着選択性が向上させることもできる。
1)粒子を、超音波分散装置を使用して水(界面活性剤等の分散剤を含む)に分散させ、1質量%の粒子を含む分散液を調製する。
2)粒度分布計(シスメックスフロー、シスメックス製)を用いて、上記分散液中の粒子約1万個の画像により平均粒径と粒径のC.V.値を測定する。
<多孔質ポリマー粒子の合成>
500mLの三口フラスコ中で、純度96%のジビニルベンゼン(純度96%)14g、オクタノール5g、スパン80(界面活性剤)3g、及び過酸化ベンゾイル0.64gを、ポリビニルアルコール水溶液(濃度0.5質量%)に加え、マイクロプロセスサーバーを使用して乳化した。得られた乳化液を別のフラスコに移し、80℃のウォーターバスで加熱しながら、攪拌機を用いて約8時間撹拌し、ポリマー粒子を生成させた。ポリマー粒子をろ過により回収し、アセトンで洗浄して、多孔質ポリマー粒子を得た。また、多孔質ポリマー粒子の5%圧縮変形弾性率を微小圧縮試験機を用いて測定した。
ポリドーパミンによるコーティング(下地層の形成)
得られた多孔質ポリマー粒子1gを、リン酸緩衝液でpHを8.5に調整したドーパミン塩酸塩水溶液50g(濃度2mg/g)に浸漬し、24時間、室温にて水溶液を攪拌した。その後、水溶液から回収した粒子の表面をXPS測定により分析した。粒子表面に窒素原子を確認できたことから、ポリドーパミン膜が粒子表面上に形成されていることが確認された。
ポリドーパミン膜を有する粒子1gを、グルコース−6−リン酸脱水素酵素(G−6−PDH)を10mg/mL含有する5mLグリシルグリシン水溶液(0.1mol/L,pH8.5)に投入し、12時間かけてG−6−PDHをポリドーパミン膜に吸着させた。その後、再度、上記条件にてポリドーパミン膜を形成することで、G−6−PDHに対応する鋳型を形成させた。NaCl 0.1M水溶液に粒子を浸漬して、鋳型のタンパク質(G−6−PDH)を脱離させた。その後、水溶液から回収した粒子を水で洗浄して、G−6−PDHに対応する鋳型含む分子鋳型膜(ポリドーパミン膜)を有する分離材の粒子を得た。
オクタノールの量を2gに、スパン80の量を5gに変更したこと以外は実施例1と同様にして、G−6−PDHに対応する鋳型を含む分子鋳型膜(ポリドーパミン膜)を有する分離材の粒子を得た。ジビニルベンゼンの量は14gから変更しなかった。得られた粒子の平均粒径、粒径のC.V.値、及び平均細孔径を測定した。
スパン80の量を7gに変更したこと以外は実施例1と同様にして、G−6−PDHに対応する鋳型を含む分子鋳型膜(ポリドーパミン膜)を有する分離材の粒子を得た。ジビニルベンゼンの量の14g、及びオクタノールの量の5gは実施例1から変更しなかった。得られた粒子の平均粒径、粒径のC.V.値、及び平均細孔径を測定した。
リン酸緩衝液でpHを8.5に調整したドーパミン塩酸塩水溶液25g(濃度1mg/g)と、ジヒドロキシフェニルアラニン水溶液25g(濃度1mg/g)とを混合して、ポリドーパミン膜形成用の溶液を準備した。この溶液に、実施例1と同様にして得た多孔質ポリマー粒子を浸漬し、24時間、室温にて水溶液を攪拌した。その後、水溶液から、ジヒドロキシフェニルアラニンを共重合体成分として含むポリドーパミン膜を有するポリマー粒子を回収した。得られたポリマー粒子の表面上に、実施例1と同様にして、G−6−PDHに対応する鋳型を含む分子鋳型膜(ポリドーパミン膜)を有する分離材の粒子を得た。得られた粒子の平均粒径、粒径のC.V.値、及び平均細孔径を測定した。
モノマーをジビニルベンゼンからエチレングリコールジメタクリレート14gに変更し、スパン80の量を5gに変更したこと以外は実施例1と同様にして、G−6−PDHに対応する鋳型を含む分子鋳型膜(ポリドーパミン膜)を有する分離材の粒子を得た。オクタノールの量は5gから変更しなかった。得られた粒子の平均粒径、粒径のC.V.値、及び平均細孔径を測定した。
モノマーをジビニルベンゼンからエチレングリコールジメタクリレート5g、及びグリシジルメタクリレート9gに変更し、スパン80の量を5gに変更したこと以外は実施例1と同様にして、多孔質ポリマー粒子を得た。オクタノールの量は5gから変更しなかった。得られた多孔質ポリマー粒子10g、水80g、及びジエチルアミン20gをフラスコに入れ、50℃で3時間反応させて、粒子表面にアミノ基を導入した。得られたポリマー粒子におけるアミノ基の量は、粒子の質量を基準として3.2mmol/gであった。得られた粒子の平均粒径、粒径のC.V.値、及び平均細孔径を測定した。
モノマーとしてのアクリルアミド9g及びメチレンビスアクリルアミド1gと、酵素(G−6−PDH)150mgを20mLのリン酸緩衝液(pH6.3)に加えた。得られた溶液を、エチルセルロースのトルエン溶液(濃度0.2質量%)に添加した。窒素置換を15分行った後、過硫酸カリウム0.1g、及び亜硫酸水素ナトリウム0.05gを含む水溶液10mLを滴下し、25℃で3時間かけて、モノマーを重合させた。
カラム充填剤用の粒子であるリクロソルブ(登録商標)RP−18(粒子径10μm、Merck製)に、3−メタクリロキシプロピルトリメトキシシランで二重結合を付与した。この粒子10gを、酵素(G−6−PDH)180mgと、モノマーとしてのアクリル酸2.5mL、アクリルアミド2.3g、ジヒドロキシエチレンビスアクリルアミド1.2g、及びメチレンビスアクリルアミド1.2gとを含む12mMのリン酸緩衝液水溶液300mLに添加して、溶液を攪拌した。そこに、過硫酸アンモニウム0.6gを含む水溶液1.5g、及び1.2gのテトラメチレンジアミンを添加し、6時間かけてモノマーを重合させた。重合後、粒子を比較例2と同様に洗浄し、鋳型分子を除去した。その後、粒子を水で洗浄して、比較例3の分離材として使用した。得られた粒子の平均粒径、粒径のC.V.値、及び平均細孔径を測定した。
15mgの酵素(G−6−PDH)を溶解させた15mLのリン酸緩衝液50mMに、250mgのマクロポーラスシリカ(Lichrospher Si1000)を加え、溶液を3時間攪拌して、酵素をマイクロポーラスシリカに吸着させた。その後、マイクロポーラスシリカをろ過により取り出して洗浄して、吸着していない酵素を分離した。マイクロポーラスに50mgの酵素が吸着された。得られた粒子を10mLのトリス緩衝液(10mM、pH8)に添加した。そこに20mgのドーパミンを添加し、溶液を24時間攪拌した。その後、0.5MのNaCl水溶液を用いて、鋳型として使用した酵素を脱離させ、粒子を水で洗浄して、これを比較例4の分離材として使用した。得られた粒子の平均粒径、粒径のC.V.値、及び平均細孔径を測定した。
BSA及び酵素(G−6−PDH)をそれぞれ濃度10mg/mLで含有し、グリシルグリシンを濃度0.1mol/Lで含有する酵素溶液5mL(pH8.5)を調製した。0.1Mのグリシルグリシン緩衝溶液10ml、MgCl2228mg、グルコース−6−リン酸2ナトリウム18mg、及びNADP+40mgを混合して、標準溶液を調製した。この標準溶液に酵素溶液を投入し、分光光度計で340nmのピークを1分ごとに追跡して、NADP+の還元反応速度を測定した。
実施例又は比較例の粒子1gを、10gの水中に分散させた。得られた分散液を20mLサンプル管に投入し、振とう機で6時間、振とうさせた。振とう後、サンプル管を10分間静置してから、上澄みの濁度を測定した。振とうに対する粒子の耐性に関して、水の透過度が3%以上であった場合を×、3%以内であった場合を○と判定した。
実施例又は比較例の粒子をメタノールと混合してスラリーを調製した(粒子濃度30質量%)。このスラリーを、φ7.8×300mmのステンレスカラムに15分かけて充填した。800cm/hの流速で水をカラムに流しながら、カラム圧の初期値を測定した。次いで、3000cm/hに流速を上昇させ、1時間、水を通液させた。その後、流速を800cm/hに下げて、カラム圧を測定した。カラム圧が初期値(3000cm/hに流速を上げる前)より10%以上向上した場合を×、10%以内である場合を○とした。
Claims (11)
- 架橋ポリマーを含む多孔質ポリマー粒子と、
前記多孔質ポリマー粒子の表面上に設けられた、インプリント用ポリマーを含み分子インプリント法による鋳型を形成している分子鋳型膜と、
を有する分離材。 - 前記分子鋳型膜が、前記多孔質ポリマー粒子の表面の少なくとも一部を覆う下地層と、前記下地層上に設けられた表層と、を有しており、前記表層によって前記鋳型が形成されている、請求項1に記載の分離材。
- 前記インプリント用ポリマーがポリドーパミンを含む、請求項1又は2に記載の分離材。
- 前記ポリドーパミンが、ドーパミンに由来する構成単位とジヒドロキシフェニルアラニンに由来する構成単位とを有する変性ポリドーパミンを含む、請求項3に記載の分離材。
- 当該分離材の平均細孔径が0.1〜0.5μmである、請求項1〜4のいずれか一項に記載の分離材。
- 前記多孔質ポリマー粒子の5%圧縮変形弾性率が100〜500MPaである、請求項1〜5のいずれか一項に記載の分離材。
- 前記多孔質ポリマー粒子の比表面積が30m2/g以上である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の分離材。
- 当該分離材の粒径のC.V.値が5〜15%である、請求項1〜7のいずれか一項に記載の分離材。
- 前記分子鋳型膜が、標的タンパク質と相互作用する鋳型を形成しており、
当該分離材が、牛血清アルブミンに対して2〜10倍の選択性で前記標的タンパク質を吸着する、請求項1〜8のいずれか一項に記載の分離材。 - 前記標的タンパク質の吸着量が、当該分離材1g当たり5mg以上である、請求項9に記載の分離材。
- 架橋ポリマーを含む多孔質ポリマー粒子の表面上に、下地層用ポリマーを含む下地層を形成させる工程と、
前記下地層に鋳型分子を吸着させる工程と、
前記鋳型分子が吸着している前記下地層上に、表層用ポリマーを含む表層を形成させる工程と、
前記鋳型分子を除去して、前記表層と前記下地層とを有し前記鋳型分子に由来する鋳型を形成している分子鋳型膜を形成させる工程と、
を備える、分離材を製造する方法。
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