JP2017019778A - 可動部を備えたハイブリッド免疫グロブリン - Google Patents
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Abstract
Description
したがって、それは医薬、エレクトロニクス、光学、および他の多くの分野で広く期待されている。膨大な商業活動が化学的に異なるきわめて多数の分子の合成に注目している。しかし、分子コンフィギュレーション(分子形態)(結合の相異)は多様性を生み出す実際的手段のひとつにすぎない。分子コンホメーション(結合の回転の相異)は、連続したサイズおよび形状の領界を生み出すためのもうひとつの重要な手段を提供する。
続アミノ酸の区域(NHCHRCO)nが連続ペプチド結合(=N−C−C=)nにより相互連結したものである。非分枝ポリエチレンは単結合の反復鎖であり、一方、タンパク質は1つの二重結合に2つの単結合が続く反復鎖である。これら2タイプの鎖の間の最も重要な相異は、ポリエチレンはほとんどいかなるコンホメーションも受け入れることができ、したがって明確なサイズまたは形状がなく(統計的に平均したものにすぎない)、一方、タンパク質はきわめて剛性であり、したがってきわめて明確な(かつ変化しない)サイズおよび形状をもつことである。
、セラミックなどと異なり、分子は厳密なサイズおよび形状に切断、工作、鋳造、機械加工または接合するのが容易ではない。
ある態様において、本発明は、下記を含む化合物をも提供する:連続アミノ酸の第1区域:そのそれぞれはその前のアミノ酸にペプチド結合により結合しており、その配列はあるターゲットに対する結合部位を含む;および連続アミノ酸の第2区域:そのそれぞれはその前のアミノ酸にペプチド結合により結合しており、その配列は連続アミノ酸の第1区域の配列と異なり、かつ異なる部分に対する結合部位を含む;その際、アミノ酸の第1区域およびアミノ酸の第2区域はそれぞれ、その予め定めた末端にシステイン残基またはセレノシステイン残基を有し、それらの残基は下記の構造を有する結合で連結している:
は、対称的であり、かつ1以上の重要なターゲットに対して対称的に(すなわち協同的に)結合する。本発明の遺伝子デバイスはタンパク質様の分子であり、下記を含む多数の関連用語で記述することができる:シンメトロアドヘシン(symmetroadhesin)類、イムノシンメトロアドヘシン(immuno−symmetroadhesins)類、ヘミ−シンメトロアドヘシン(hemi−symmetroadhesins)類、ビ−シンメトロアドヘシン(bi−symmetroadhesin)類[“釣り合って付着する(stick to proportionately)”を意味する;ギリシャ語のsymmetros、“共通の尺度をもつ、さらには、釣り合っている”、およびラテン語のadhaerentem、すなわちadhaerere、“付着する”の現在分詞に由来する]。
ある態様において、結合は下記の構造をもつ:
ノシステイン残基である。ある態様において、アミノ酸の第1区域またはアミノ酸の第2区域のうちの1つの予め定めた一方の末端にある残基はシステイン残基であり、予め定めた他方の末端にある残基はセレノシステイン残基である。
本発明化合物のある態様において、アミノ酸の第1区域および/または第2区域は、免疫グロブリンの定常部の配列に相応する。ある態様において、免疫グロブリンはヒト免疫グロブリンである。ある態様において、免疫グロブリンの定常部は、IgG、IgA、IgE、IgD、またはIgM免疫グロブリンの定常部である。ある態様において、免疫グロブリンの定常部は、IgG−1、IgG−2、IgG−3、またはIgG−4免疫グロブリンの定常部である。ある態様において、IgG−1、IgG−2、IgG−3、またはIgG−4免疫グロブリンの定常部である免疫グロブリン定常部は、本明細書に示す配列の1つを有する。ある態様において、免疫グロブリンの定常部はIgG免疫グロブリンの定常部であり、そして、ヒンジ部、CH6領域およびCH3領域を含む。ある態様において、異なる部分はイムノエフェクターまたはイムノレギュレーターである。
アミノ酸の第1区域または第2区域は、TNFRSF1a、TNFRSF1b、VEGFR1、VEGFR6、VEGFR3、ヒトErb1、ヒトErb2、ヒトErb6、ヒトErb3、またはヒトErb4のうちのいずれか1つのアミノ酸配列を含む。
(a)(i)その配列がN−末端シグナル配列である第1部分、これと接した(ii)その配列が連続アミノ酸の区域をコードする第2部分、これと接した(iii)その配列がC−末端インテイン含有結合ドメインをコードする第3部分を含む、組換え核酸により、連続アミノ酸の区域がC−末端インテイン含有結合ドメインと接したものを含むキメラポリペプチドの合成を可能にする条件下で、細胞をトランスフェクションし;
(b)工程(a)で産生されたキメラポリペプチドを単離し;
(c)キメラポリペプチドを、連続アミノ酸の区域からC−末端インテイン含有結合ドメインのチオ仲介開裂が起き、それがC−末端チオエステルで置換されるように処理し;
(d)工程(c)の生成物を、生成物へのシステイン残基の結合が可能となり、これによりC−末端システインを含む生成物が形成されるように処理し;そして
(e)工程(e)の生成物を工程(e)の他の生成物の存在下において、前記化合物の形成が可能な条件下で酸化する。
RIR1インテイン−キチン結合ドメインである。1態様においては、工程b)においてアフィニティークロマトグラフィーによりキメラポリペプチドを単離する。1態様にお
いては、工程b)において生成物をキチン誘導体化樹脂に曝露することによりキメラポリペプチドを単離する。1態様において、酸化条件は生成物それぞれのC−末端システイン間にジスルフィド結合の形成が可能となるものである。
(a)(i)その配列がN−末端シグナル配列をコードする第1部分、これと接した(ii)その配列がN−末端システイン残基を含む連続アミノ酸の区域をコードする第2部分を含む、組換え核酸により、下記を可能にする条件下で細胞をトランスフェクションし:(i)N−末端シグナル配列がそれのC−末端においてペプチド結合により連続アミノ酸の区域のN−末端システインに連結したものを含む、キメラポリペプチドが合成され、そして(ii)N−末端シグナル配列が細胞内でキメラポリペプチドから開裂し、これによりN−末端システインを含む連続アミノ酸の区域が産生される;
(b)工程(a)で産生された連続アミノ酸の区域を回収する。
1態様において、連続アミノ酸の区域は免疫グロブリンFcポリペプチドを含む。1態様において、免疫グロブリンFcポリペプチドはヒト免疫グロブリンFcポリペプチドである。1態様において、N−末端システイン残基はヒト免疫グロブリンFcポリペプチドのCys−5残基である。1態様において、細胞は293ヒト胚細胞またはCHO−K1ハムスター卵巣細胞である。1態様において、トランスフェクションはプラスミドpSAを用いて実施される。1態様において、N−末端シグナル配列はN−末端システインを有するタンパク質から選択される。1態様において、シグナルペプチドはソニックヘッジホッグ、インターフェロンアルファ−2またはコレステロールエステルトランスフェラーゼである。1態様においては、連続アミノ酸の区域をアフィニティークロマトグラフィーにより回収する。1態様において、細胞内でのキメラポリペプチドの開裂は細胞性シグナルペプチダーゼにより行なわれる。
(a)(i)その配列がN−末端シグナル配列をコードする第1部分、これと接した(ii)その配列がN−末端システイン残基を含む連続アミノ酸の区域をコードする第2部分を含む、組換え核酸により、下記を可能にする条件下で細胞をトランスフェクションし:(i)N−末端シグナル配列がそれのC−末端においてFcポリペプチドのN−末端システインに連結したものを含む、キメラポリペプチドが合成され、そして(ii)N−末端シグナル配列が細胞内でキメラポリペプチドから開裂し、これによりN−末端システインを含む連続アミノ酸の区域が産生される;
(b)工程(a)で産生された連続アミノ酸の区域のN−末端を、アミノ酸配列cys−asp−lys−thr−his−thrを含むペプチドのC−末端と、またはアミノ酸配列sec−asp−lys−thr−his−thrを含むペプチドとライゲートさせ、これによりN−末端システインまたはセレノシステインを含む連続アミノ酸の区域を生成させ;そして
(c)工程(b)で生成した連続アミノ酸の区域を回収する。
(a)(i)その配列がN−末端シグナル配列をコードする第1部分、これと接した(ii)その配列が連続アミノ酸の区域をコードする第2部分、これと接した(iii)その配列がC−末端インテイン含有結合ドメインをコードする第3部分を含む、組換え核酸により、下記を可能にする条件下で細胞をトランスフェクションし:(i)N−末端シグナル配列、これと接した連続アミノ酸の区域、これと接したC−末端インテイン含有結合ドメインを含む、キメラポリペプチドが合成され、そして(ii)N−末端シグナル配列がキメラポリペプチドから開裂し、これによりN−末端リジン残基を有しかつ連続アミノ酸の区域がC−末端インテイン含有結合ドメインと接したものを含む、第2キメラポリペプチドが産生される;
(b)工程(a)で産生された第2キメラポリペプチドを単離し;
(c)第2キメラポリペプチドを、連続アミノ酸の区域からC−末端インテイン含有結合ドメインのチオ仲介開裂が起き、これによりC−末端チオエステルが形成されるように処理し;
(d)工程(c)の生成物をそれのC−末端においてシステイン残基またはセレノシステイン残基とライゲートさせ、これによりC−末端システインまたはC−末端セレノシステインを含む生成物を形成させ;そして
(e)工程(d)の生成物を回収する。
胞外ドメインを含む。ある態様において、N−末端シグナル配列はN−末端リジンを有するタンパク質から選択される。ある態様において、N−末端シグナル配列はCD2 T細胞表面糖タンパク質またはCD4 T細胞表面糖タンパク質である。ある態様において、細胞は293ヒト胚細胞またはCHO−K1ハムスター卵巣細胞である。ある態様において、トランスフェクションはプラスミドpSAを用いて実施される。ある態様において、C−末端インテイン含有結合ドメインはインテイン−キチン結合ドメインである。ある態様において、C−末端インテイン含有結合ドメインはMth RIR1インテイン−キチン結合ドメインである。ある態様において、C−末端インテイン含有結合ドメインは自己スプライシングインテイン含有結合ドメインである。ある態様においては、工程b)において生成物をキチン誘導体化樹脂に曝露することによりキメラポリペプチドを単離する。ある態様において、細胞内での第2キメラポリペプチドの開裂は細胞性シグナルペプチダーゼにより行なわれる。ある態様においては、工程(c)の生成物をシステイン残基とライゲートさせる。ある態様においては、工程(c)の生成物をセレノシステイン残基とライゲートさせる。
(a)(i)その配列がN−末端シグナル配列をコードする第1部分、これと接した(ii)その配列が連続アミノ酸の区域をコードする第2部分、これと接した(iii)その配列がC−末端インテイン含有結合ドメインをコードする第3部分を含む、組換え核酸により、下記を可能にする条件下で細胞をトランスフェクションし:(i)N−末端シグナル配列、これと接した連続アミノ酸の区域、これと接したC−末端インテイン含有結合ドメインを含む、キメラポリペプチドが合成され、そして(ii)N−末端シグナル配列がキメラポリペプチドから開裂し、これによりN−末端システイン残基を有しかつ連続アミノ酸の区域がC−末端インテイン含有結合ドメインと接したものを含む、第2キメラポリペプチドが産生される;
(b)工程(a)で産生された第2キメラポリペプチドを単離し;
(c)第2キメラポリペプチドを、連続アミノ酸の区域からC−末端インテイン含有結合ドメインのチオ仲介開裂が起き、これによりC−末端チオエステルが形成されるように処理し;
(d)工程(c)の生成物をそれのC−末端においてシステイン残基またはセレノシステイン残基とライゲートさせ、これによりC−末端システインまたはC−末端セレノシステインを含む生成物を形成させ;そして
(e)工程(d)の生成物を回収する。
る。ある態様においては、工程e)においてアフィニティークロマトグラフィーにより生成物を回収する。ある態様において、細胞内でのキメラポリペプチドの開裂は細胞性シグナルペプチダーゼにより行なわれる。ある態様においては、工程(c)の生成物をシステイン残基とライゲートさせる。ある態様においては、工程(c)の生成物をセレノシステイン残基とライゲートさせる。
(a)(i)その配列がN−末端シグナル配列をコードする第1部分、これと接した(ii)その配列が連続アミノ酸の区域をコードする第2部分、これと接した(iii)その配列がC−末端インテイン含有結合ドメインをコードする第3部分を含む、組換え核酸により、下記を可能にする条件下で細胞をトランスフェクションし:(i)N−末端シグナル配列、これと接した連続アミノ酸の区域、これと接したC−末端インテイン含有結合ドメインを含む、キメラポリペプチドが合成され、そして(ii)N−末端シグナル配列がキメラポリペプチドから開裂し、これによりN−末端システイン残基を有しかつ連続アミノ酸の区域がC−末端インテイン含有結合ドメインと接したものを含む、第2キメラポリペプチドが産生される;
(b)工程(a)で産生された第2キメラポリペプチドを単離し;
(c)(i)工程(a)で産生された連続アミノ酸の区域のN−末端を、cys−asp−lys−thr−his−thrを含むペプチドのC−末端と、またはアミノ酸配列sec−asp−lys−thr−his−thrを含むペプチドとライゲートさせ、これによりそれぞれN−末端システインまたはN−末端セレノシステインを含む連続アミノ酸の区域を形成させ;
(ii)キメラポリペプチドを、連続アミノ酸の区域からC−末端インテイン含有結合ドメインのチオ仲介開裂が起き、それがC−末端チオエステルで置換されるように処理し;
(iii)工程(c)の生成物をそれのC−末端においてシステイン残基またはセレノシステイン残基とライゲートさせ、これによりC−末端システインまたはセレノシステインを含む生成物を形成させ;そして
(d)工程(c)(iii)の生成物を回収する。
s−asp−lys−thr−his−thrを含み、連続アミノ酸の区域。ある態様において、工程(c)(i)のペプチドはアミノ酸配列sec−asp−lys−thr−his−thrを含み、生成した連続アミノ酸の区域はN−末端セレノシステインを含む。ある態様においては、工程(c)のペプチドをライゲーションの前にN−末端Msc保護基で保護する。ある態様において、細胞は293ヒト胚細胞またはCHO−K1ハムスター卵巣細胞である。ある態様において、トランスフェクションはプラスミドpSAを用いて実施される。ある態様において、N−末端シグナル配列はN−末端システインを有するタンパク質から選択される。ある態様において、シグナルペプチドはソニックヘッジホッグ、インターフェロンアルファ−2またはコレステロールエステルトランスフェラーゼである。ある態様においては、連続アミノ酸の区域をアフィニティークロマトグラフィーにより回収する。
ある態様においては、下記を含む化合物を提供する:
連続アミノ酸の第1区域:そのそれぞれはその前のアミノ酸にペプチド結合により結合しており、その配列はあるターゲットに対する結合部位を含む;および
連続アミノ酸の第2区域:そのそれぞれはその前のアミノ酸にペプチド結合により結合しており、その配列は連続アミノ酸の第1区域の配列と同一であり、かつ前記ターゲット
に対する同一結合部位を含む;
その際、アミノ酸の第1区域およびアミノ酸の第2区域はそれぞれ独立して、その予め定めた末端に、硫黄(S)またはセレン(Se)を含む直鎖状脂肪族側鎖酸を有する天然アミノ酸または非天然アミノを有し、それらの硫黄(S)またはセレン(Se)は下記の構造を有する結合で連結している:
連続アミノ酸の第1区域:そのそれぞれはその前のアミノ酸にペプチド結合により結合しており、その配列はあるターゲットに対する結合部位を含む;および
連続アミノ酸の第2区域:そのそれぞれはその前のアミノ酸にペプチド結合により結合しており、その配列は連続アミノ酸の第1区域の配列と異なり、かつ異なる部分に対する結合部位を含む;
その際、アミノ酸の第1区域およびアミノ酸の第2区域はそれぞれ独立して、その予め定めた末端に、硫黄(S)またはセレン(Se)を含む直鎖状脂肪族側鎖酸を有する天然アミノ酸または非天然アミノを有し、それらの硫黄(S)またはセレン(Se)は下記の構造を有する結合で連結している:
下記を含む化合物が提供される:
連続アミノ酸の第1区域:そのそれぞれはその前のアミノ酸にペプチド結合により結合しており、その連続アミノ酸の第1区域はカルコゲン官能基を含む側鎖を有するアミノ酸残基を含む;および
連続アミノ酸の第2区域:少なくとも100個のアミノ酸を含み、そのそれぞれはその前のアミノ酸にペプチド結合により結合しており、連続アミノ酸の第2区域のうち少なくとも90個の連続アミノ酸はヒト免疫グロブリン定常部ポリペプチドの一部と同一の配列を有し、かつ連続アミノ酸の第2区域はその予め定めた末端にカルコゲン官能基を含む側鎖を有するアミノ酸残基を含む;
その際、連続アミノ酸の第1区域のカルコゲン官能基を含む側鎖を有するアミノ酸残基と、連続アミノ酸の第2区域のカルコゲン官能基を含む側鎖を有するアミノ酸残基は下記の構造を有する結合で連結している:
ある態様において、連続アミノ酸の第2区域の予め定めた末端にカルコゲン官能基を含む側鎖を有するアミノ酸残基はシステインである。ある態様において、連続アミノ酸の第2区域の予め定めた末端にカルコゲン官能基を含む側鎖を有するアミノ酸残基はセレノシステイン、ホモシステインまたはホモセレノシステインである。ある態様において、連続アミノ酸の第1区域のカルコゲン官能基を含む側鎖を有するアミノ酸残基はシステインである。ある態様において、連続アミノ酸の第1区域のカルコゲン官能基を含む側鎖を有するアミノ酸残基はセレノシステイン、ホモシステインまたはホモセレノシステインである。ある態様において、連続アミノ酸の第1区域のカルコゲン官能基を含む側鎖を有するアミノ酸残基は末端残基である。ある態様において、連続アミノ酸の第1区域のカルコゲン官能基を含む側鎖を有するアミノ酸残基はピナルト、アンテピナルトまたはプレアンテピナルト末端残基である。
SEQ ID NO:35〜46のうちの1つに示す配列を有する、またはSEQ ID NO:53〜67のうちの1つに示す配列を有する、またはSEQ ID NO:74〜82のうちの1つに示す配列を有する、またはSEQ ID NO:89〜97のうちの1つに示す配列を有する連続アミノ酸からなるポリペプチドを含む組成物が提供され、その際、ポリペプチドは天然免疫グロブリンポリペプチド(その酵素開裂フラグメントを含む)から構成されない。
独立して選択される本発明の2つのポリペプチドが非ペプチド結合により結合したものを含む組成物が提供される。1態様において、結合はジ−カルコゲニド(di−chalcogenide)結合である。1態様において、結合はジスルフィド結合である。
SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:81またはSEQ ID NO:96に示す配列の一部と同一の配列を有する連続アミノ酸からなり、ポリペプチドの末端残基のうち少なくとも1つはカルコゲン官能基を含む側鎖をもつものを含む組成物が提供される。
前記に示した種々のN−末端シグナル配列、プラスミド、発現ベクター、組換え核酸、連続アミノ酸の区域、インテイン結合ドメイン、細胞タイプ、回収/単離法などは限定ではない例であり、それらをさらに後記の実施例に示す。
連続アミノ酸の区域(stretch of amino acids):鎖状に配列した複数のアミノ酸であって、そのそれぞれはその前のアミノ酸にペプチド結合により結合しており、ただし、その鎖の第1アミノ酸はその前のアミノ酸に結合していない。鎖のアミノ酸は自然界に存在するものまたは自然界に存在しないものであってもよく、あるいはその混合物を含むこともできる。別途指摘しない限り、アミノ酸は遺伝子によりコードされるもの、自然界に存在するけれども遺伝子によりコードされないもの、または自然界に存在しないもの、およびそのいずれの選択肢であってもよい。
N−末端:N−末端アミノ酸残基の遊離α−アミノ(NH2)基(またはその誘導体)。
S−末端システイン残基:連続アミノ酸の区域のN−および/またはC−末端残基であるシステインであって、遊離β−スルフヒドリル(SH)官能基、またはβ−スルフヒドリル(SH)官能基の誘導体をもつもの。
誘導体)。
Se−末端セレノシステイン残基:連続アミノ酸の区域のN−および/またはC−末端残基であるセレノシステインであって、遊離β−セレノヒドリル(SeH)官能基、またはβ−セレノヒドリル(SeH)官能基の誘導体をもつもの。
X−末端アミノ酸残基:連続アミノ酸の区域のN−および/またはC−末端残基であるシステイン(またはシステイン誘導体)またはホモシステイン(またはホモシステイン誘導体)またはセレノシステイン(またはセレノシステイン誘導体)またはホモセレノシステイン(またはホモセレノシステイン誘導体)であって、それぞれ遊離β−スルフヒドリル(SH)もしくはβ−セレノヒドリル(SeH)官能基、またはその硫黄含有もしくはセレン含有誘導体をもつもの。
本明細書中で用いる“アミノ酸”は、1態様において、遺伝子コードされるアミノ酸、すなわちイソロイシン、アラニン、ロイシン、アスパラギン、リジン、アスパラギン酸、メチオニン、システイン、フェニルアラニン、グルタミン酸、トレオニン、グルタミン、トリプトファン、グリシン、バリン、プロリン、アルギニン、セリン、ヒスチジン、チロシン、セレノシステイン、ピロリジンのLまたはD異性体を意味し、ホモシステインおよびホモセレノシステインも含まれる。
アミノ酸は酸塩または塩基塩の形のであってもよく、あるいは中性の形であってもよい。個々のアミノ酸残基を酸化または還元により修飾することもできる。考慮される他の修飾には、プロリンおよびリジンのヒドロキシル化、セリルまたはトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、ならびにリジン、アルギニンおよびヒスチジン側鎖のアルファ−アミノ基のメチル化が含まれる。
本明細書中で用いる“カルコゲン(chalcogen)”は、硫黄、セレン、テルルおよびポロニウムのみに限定される;すなわち、本明細書中で用いる“カルコゲン”には酸素およびウンウンヘキシウム(ununhexium)は含まれない。
のを用いて行なうことができる。変更は、目的とする連続アミノ酸配列をコードする1以上のコドンの置換、欠失または挿入であって、天然配列と比較してアミノ酸配列の変化をもたらすものであってもよい。場合により、変更は1以上のドメインにおいて少なくとも1個のアミノ酸を他のいずれかのアミノ酸で置換するものであってもよい。目的活性に有害な影響を与えることなく挿入、置換または欠失するアミノ酸残基を決定する際の指針は、その配列を既知の相同タンパク質分子の配列と比較し、相同性の高い領域において行なうアミノ酸配列変化の個数を最小限に抑えることにより見いだすことができる。アミノ酸置換は、1つのアミノ酸を、類似の構造特性および/または化学的特性をもつ他のアミノ酸で置換した結果であってもよい;たとえば、ロイシンをセリンと交換、すなわち類似(保存的)アミノ酸置換。挿入または欠失は、場合により約1〜5個のアミノ酸の範囲であってもよい。許容される変更は、系統的に配列中のアミノ酸の挿入、欠失または置換を行ない、得られたバリアントを全長または成熟天然配列が示す活性について試験することにより決定できる。末端の変更はいずれも本明細書に開示する概念の範囲内で行なわれると理解される。
なくとも94%の配列同一性、よりさらに好ましくは少なくとも95%の配列同一性、よりさらに好ましくは少なくとも96%の配列同一性、よりさらに好ましくは少なくとも97%の配列同一性、よりさらに好ましくは少なくとも98%の配列同一性、よりさらに好ましくは少なくとも99%の配列同一をもつ連続アミノ酸の区域を含む化合物に関する。
ことができる。
(1)疎水性:ノルロイシン、met、ala、val、leu、ile;
(2)中性親水性:cys、ser、thr;
(3)酸性:asp、glu;
(4)塩基性:asn、gln、his、lys、arg;
(5)鎖の配向に影響を及ぼす残基:gly、pro;
(6)芳香族:trp、tyr、phe。
部位特異的変異誘発(Carter et al., Nucl. Acids Res., 13:4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids Res., 10:6487 (1987))、カセット変異誘発(Wells et al., Gene, 34:315 (1985))、制限選択変異誘発(Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317:415 (1986))、または他の既知の技術をクローン化DNAについて実施して、バリアン
トDNAを製造することができる。
。さらに、それは埋め込まれた位置および露出した位置の両方にしばしばみられる(Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150:1 (1976))。アラニン置換によって適切な量のバリアントが得られない場合、アイソテリック
(isoteric)アミノ酸を使用できる。
基の付加、またはそれらによる置換によって行なうことができる(O−連結グリコシレーション部位について)。アミノ酸配列は、場合によりDNAレベルでの変化により、特にそのアミノ酸配列をコードするDNAを予め選択した塩基において変異させて、これにより目的アミノ酸に翻訳されるであろうコドンを形成することにより変更できる。
Biochem., 118:131 (1981)に記載されている。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素開
裂は、種々のエンド−およびエキソ−グリコシダーゼを用いて達成できる;Thotakura et
al., Meth. Enzymol., 138:350 (1987)に記載。
et al., BioTechnology, 6:1204-1210 (1988));KT3エピトープペプチド(Martin et al., Science, 255:192-194 (1992));アルファ-チューブリンエピトープペプチド(Skinner et al., J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991));ならびにT7遺伝子10タンパ
ク質ペプチドタグ(Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990))が含まれる。
本明細書に開示する化合物の塩類は本発明の範囲に含まれる。本明細書中で用いる“塩類”は、本発明化合物の酸塩または塩基塩を調製することにより修飾した本発明化合物の塩である。
前記の塩類は医薬的に許容できる。医薬的に許容できる塩類の例には、塩基性残基、たとえばアミンの鉱酸塩または有機酸塩;酸性残基、たとえばカルボン酸残基のアルカリ塩または有機塩が含まれるが、これらに限定されない。これらの塩類は、有機酸または無機酸を用いて調製できる。そのような酸性塩は、クロリド、ブロミド、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、スルホン酸塩、ギ酸塩、酒石酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩、クエン酸塩、安息香酸塩、サリチル酸塩、アスコルビン酸塩などである。カルボン酸塩は、アルカリ土類
金属塩、ナトリウム塩、カリウム塩またはリチウム塩である。
。
限定ではないが、そのような組成物および用量の例を以下に示す:
ベバシズマブ(bevacizumab)(たとえばAvastin)の配列をもつ連続アミノ酸を含む連続アミノ酸の区域を含む化合物を含有する組成物は、トレハロース2水和物、リン酸ナトリウム(一塩基性、1水和物)、リン酸ナトリウム(二塩基性、無水物)、ポリソルベート20(polysorbate 20)、およびUSP注射用水を含有することができる。この組成物を凍結乾燥することもでき、これに再構成のために水を添加することができる。ある態様において、組成物は6.2または約6.2のpHをもつ。1態様においては、本発明化合物を化学療法薬、たとえば静脈内5−フルオロウラシルと組み合わせて、結腸または直腸の転移性癌を伴う患者の処置のために投与することができる。1態様においては、本発明化合物を0.1〜10mg/kgの用量で14日毎に1回、静脈内注入として投与する。他の態様において、用量は5mg/kgであり、14日毎に1回投与される。ある態様において、用量は1.0〜2.0mg/kgであり、14日毎に1回投与される。ある態様において、用量は0.01〜1.5mg/kgであり、14日毎に1回投与される。ある態様において、用量は0.001〜10mg/kgであり、1〜21日毎に1回投与される。
Injection)(BWFI)USPまたはその均等物を用いて再構成することができる。ある態様において、組成物は約6.0のpHをもつ。この組成物を凍結乾燥することもでき、これに再構成のために水を添加することができる。1態様においては、転移性乳癌を伴う対象であってその腫瘍がHER2タンパク質を過剰発現している対象に、本発明化合物を投与することができる。ある態様において、対象は化学療法を受けた/受けている。他の態様においては、本発明化合物をパクリタキセル(paclitaxel)と組み合わせて、転移性乳癌を伴う対象であってその腫瘍がHER2タンパク質を過剰発現しておりかつそれらの転移性疾患に対する化学療法を受けていない対象に投与する。1態様においては、本発明化合物を0.1〜10mg/kgの初回量で連続45〜120分間注入の静脈注入により投与する。他の態様においては、本発明化合物を4mg/kgの用量で90分間の注入により投与する。ある態様においては、1週間の維持量を対象に2mg/kgの用量で30分間の注入により投与する。ある態様においては、0.5〜1.5mg/kgの用量で90分間の注入により投与する。ある態様においては、1週間の維持量を対象に0.5〜1.0mg/kgの用量で30分間の注入により投与する。ある態様においては、本発明化合物を0.04〜0.5mg/kgの用量で90分間の注入により投与する。ある態様においては、本発明化合物を0.001〜10mg/kgの用量で90分間の注入により投与する。
る。ある態様においては、本発明化合物を0.001〜1.0mg/kg皮下コンディショニング量で1回投与し、続いて0.008〜0.015mg/kgを週1回、皮下投与する。
ム2水和物を含有することができる。保存剤は1態様においては存在しない。ある態様において、組成物は凍結乾燥品の形態である。ある態様においては、この組成物をたとえば注射用水(BWFI)USPで再構成する。ある態様において、組成物のpHは7.2または約7.2である。1態様においては、本発明化合物を、リウマチ性関節炎を伴う対象に、2〜4mg/kgの用量で静脈内注入として投与し、続いて同様な追加量を第1回注入の2および6週後、次いでその後8週毎に投与する。他の態様においては、本発明化合物を、3mg/kgの用量で静脈内注入として投与し、続いて同様な追加量を第1回注入の2および6週後、次いでその後8週毎に投与する。さらなる態様においては、用量を最大10mg/kgに調整し、または4週毎の頻度で処置する。ある態様においては、本発明化合物をメトトレキセートと組み合わせて投与する。1態様においては、本発明化合物を、クローン病または瘻孔形成クローン病を伴う対象に、中等度ないし重篤な活動性クローン病または瘻孔形成疾患の処置のために、2〜7mg/kgの用量で誘導レジメンとして0、2および6週目に投与し、続いてその後8週毎に4〜6mg/kgの維持レジメンを施す。さらなる態様においては、本発明化合物を、中等度ないし重篤な活動性クローン病または瘻孔形成疾患の処置のために、5mg/kgの用量で誘導レジメンとして0、2および6週目に投与し、続いてその後8週毎に5mg/kgの維持レジメンを施す。ある態様においては、用量を最大10mg/kgに調整する。1態様においては、本発明化合物を、強直性脊椎炎を伴う対象に、2〜7mg/kgの用量で静脈内注入として投与し、続いて第1回注入の2および6週後、次いでその後6週毎に、同様な追加量を投与する。他の態様においては、本発明化合物を、5mg/kgの用量で静脈内注入として投与し、続いて第1回注入の2および6週後、次いでその後6週毎に、同様な追加量を投与する。1態様においては、本発明化合物を、乾癬性関節炎を伴う対象に、2〜7mg/kgの用量で静脈内注入として投与し、続いて第1回注入の2および6週後、次いでその後8週毎に、同様な追加量を投与する。さらなる態様においては、本発明化合物を、5mg/kgの用量で静脈内注入として投与し、続いて第1回注入の2および6週後、次いでその後8週毎に、同様な追加量を投与する。ある態様においては、本発明化合物をメトトレキセートと共に投与する。1態様においては、本発明化合物を、潰瘍性大腸炎を伴う対象に中等度ないし重篤な活動性潰瘍性大腸炎の処置のために、2〜7mg/kgの用量で誘導レジメンとして0、2および6週目に投与し、続いてその後8週毎に2〜7mg/kgの維持レジメンを施す。他の態様においては、本発明化合物を、潰瘍性大腸炎を伴う対象に、5mg/kgの用量で誘導レジメンとして0、2および6週目に投与し、続いてその後8週毎に5mg/kgの維持レジメンを施す。ある態様において、個々の疾患の処置につき用量は上記用量より2〜100倍少ない。
5mL/分)。ある態様において、個々の疾患の処置につき用量は上記用量より2〜100倍少ない。
本明細書中に用量範囲、たとえば1〜10mg/kg/週と記載した場合、本発明は上限〜下限のそれぞれの整数、およびその10分の1をも含むと理解される。したがって、上記のに挙げた例の場合、本発明は1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、・・・・・mg/kg、最大10mg/kgまでを意図する。
一般に、前記の方法により障害または状態を処置するための1日量は、通常は約0.01から約10.0mg/kg(処置される対象の体重)までの範囲である。
キット
本発明の他の観点は、本明細書に開示する化合物およびこれらの化合物を含む医薬組成物を含むキットを提供する。キットは、本発明の化合物または医薬組成物のほかに、診断薬または療法薬を含むことができる。キットは、診断法または療法に使用するための指示も含むことができる。診断態様において、キットは本発明の化合物または医薬組成物および診断薬を含む。療法態様において、キットは抗体またはその医薬組成物、および1種類以上の療法薬、たとえば追加の抗新生物薬、抗腫瘍薬または化学療法薬を含む。
ある態様において、対象はヒトである。ある態様において、対象は18歳以上である。他の態様において、対象は18歳未満である。
本発明は以下の実験の詳細を参照することによってより良く理解されるであろう。ただし、詳述した具体例は特許請求の範囲にさらに十分に記載した本発明の説明にすぎないことは当業者に自明であろう。
本明細書には、遺伝子デバイスであって、連続アミノ酸の機能性区域が新規な様式で連結したものを含むデバイスを記載する。現在まで、タンパク質を遺伝子工学的に操作して、それらが新たな固定された構造またはコンホメーションをとることにより新たな機能が作り出されてきた。遺伝子工学的に作製されたそのようなこれまでのタンパク質と対照的に、本明細書に開示する遺伝子デバイスは2以上の識別可能なタンパク質ドメインを含み、それらが新規な化学結合により、それらのドメイン間での相対的な運動が可能な様式で連結している。タンパク質ドメイン間の相対的な運動によりこの遺伝子デバイスの可動部分が構成され、これによりそれらは有用な作業を行なうことができる。この作業のための入力エネルギーは、これらのタンパク質ドメイン自体に固有の運動および回転エネルギー、ならびにこれらのタンパク質ドメインと溶剤分子の間の機械的相互作用のエネルギーなどにより供給される。
れたシンメトロアドヘシンについては、結合強度はナノHナノモル範囲(nano H nano−molar range)の水準であろう。協同結合によりそのような異例のレベルの結合が可能になる。この異例のレベルの結合では、タンパク質疾患ターゲットに対比してはるかに少ない療法タンパク質を投与する必要があるにすぎない(1対1の基準)。
すべてのタンパク質は1以上のペプチド鎖、すなわち連続アミノ酸の区域からなり、それぞれがその前のアミノ酸にペプチド結合により連結している。アミド結合に起きる単結合形態(−C−N−)と二重結合形態(−C=N−)の間の共鳴のため、ペプチド結合は有意程度の二重結合性をもつ(−C=N−Cα−C=N−)。その結果、タンパク質中のペプチド結合はほぼ平面である。隣接するN−CαとCα−C結合は比較的自由に回転するが、ペプチド結合の剛性により、フォールディングしたポリペプチド鎖の自由度はそれが単一の静的物体のような挙動を示す点まで低下する。
限定ではないが、表2〜11に種々のシンメトロアドヘシンの多様な態様を示す。たとえばCD4−シンメトロアドヘシンを記載した表2の最上列に、CD4ヘミ−シンメトロアドヘシンのコンフィギュレーションを示す;すなわち、C−末端側X−末端を備えたCD4ドメイン、たとえば連続アミノ酸の区域[C−末端システインまたはセレノシステイン残基をもつCD4ドメイン]が、非ペプチド結合(たとえばシステイン−システインジスルフィド結合またはセレノシステイン−セレノシステインジセレニド結合)により、連続アミノ酸の第2区域[C−末端システインまたはセレノシステイン残基をもつCD4ドメイン]に非ペプチド結合により結合したものを、一般的に[CD4−Xc−Xc−CD
4]と記載する。CD4ヘミ−シンメトロアドヘシンとFcヘミ−シンメトロアドヘシンの二量体がイムノ−シンメトロアドヘシンを形成したものを、表2の第2列に示す;たとえば[CD4−Xc−Sn−Fc]2と記載。各表において、XcはC−末端側X−末端、XnはN−末端側X−末端、SnはN−末端システイン残基を表わす。
本明細書中で述べる連続アミノ酸の区域の例には、結合ドメインを含む連続アミノ酸、たとえば分泌型または膜貫通タンパク質、細胞内結合ドメインおよび抗体(全体またはそ
の一部)ならびにその修飾形が含まれるが、これらに限定されない。下記は限定ではない若干例である:
1)免疫グロブリン
免疫グロブリンは、鎖内ジスルフィド結合により互いに保持されたポリペプチド鎖を含む分子であり、その際、結合したアミノ酸のうち少なくとも1個は末端残基でなく、一般に2つの軽鎖および2つの重鎖をもつ。各鎖において、1つのドメイン(V)は分子の抗体特異性に応じた可変アミノ酸配列をもつ。他のドメイン(C)は、同一クラスの分子間に共通のかなり一定の配列をもつ。これらのドメインはアミノ末端から順に番号が付けられる。
125 023; Munro, Nature 312 (13 Dec. 1984); Neuberger et al., Nature 312: (13 Dec. 1984); Sharon et al., Nature 309 (May 24, 1984); Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984); Morrison et al. Science 229:1202-1207 (1985); and Boulianne et al., Nature 312:643-646 (Dec. 13, 1984)を参照。
種に由来する免疫グロブリン定常部に融合させた免疫グロブリンキメラの調製を教示している。
を参照。
ある態様において、本明細書に記載する発明は、1以上の免疫グロブリン構成要素を含む新規なハイブリッド分子を提供する。
細胞外タンパク質は、特に多細胞生物の形成、分化および維持に重要な役割を果たす。関連する種々の細胞内タンパク質はU.S.Patent No.6,723,535、Ashkenaziら、2004年4月20日発行に示されており、これを本明細書に援用する。
上皮増殖因子(EGF)は、上皮細胞および線維芽細胞を含めた種々のタイプの細胞の増殖を刺激する一般的なマイトジェン因子である。EGFはEGF受容体(EGFR)に結合して活性化し、これにより細胞内シグナル伝達、およびこれに続く作用を開始する。
EGFRは、中枢神経系(CNS)の他の領域のニューロンのほか、大脳皮質、小脳および海馬に発現する。さらに、EGFもCNS中の種々の領域に発現する。したがって、EGFは分裂細胞に対してだけでなく、分裂後のニューロンにも作用する。事実、多数の研究が、EGFはCNS中の種々のタイプのニューロンに対して神経栄養作用または神経調節作用をもつことを指摘している。たとえば、EGFは培養した大脳皮質および小脳のニューロンに直接的に作用し、神経突起の伸展および生存を高める。他方、EGFは、中隔コリン作動性および中脳ドーパミン作動性ニューロンを含めた他の細胞タイプに対しても、グリア細胞を介して間接的に作用する。EGFがCNS中のニューロンに作用することの証拠が蓄積されつつあるが、作用機序は依然として本質的に未知である。分裂細胞におけるEGF誘導によるシグナル伝達は、分裂後ニューロンの場合より良く理解されている。クローン化されたクロム親和性細胞腫PC12細胞および培養された大脳皮質ニューロンの研究により、EGF誘導による神経栄養作用は、EGFに応答したEGFRおよびマイトジェン活性化プロテインキナーゼ(MAPK)の持続的な活性化により仲介されることが示唆された。持続的な細胞内シグナル伝達はEGFRのダウンレギュレーション速度の低下と相関し、これがEGFに対する神経細胞の応答を決定すると思われる。EGFは、分裂細胞および分裂後ニューロンを含めた種々のタイプの細胞に作用する多能性増殖因子であり得る。
agiosum)、Porter and Archard, J. Gen. Virol. 68:673-682 (1987)、および粘液腫ウイルス、Upton et al., J. Virol. 61:1271-1275 (1987)、Prigent and Lemoine, Prog. Growth Factor Res. 4:1-24 (1992)。
ロテインC、プロテインS、プロテインZ、組織プラスミノーゲンアクチベーター、ウロキナーゼ)、細胞外マトリックス成分(ラミニン、サイトタクチン(cytotactin)、エンタクチン(entactin))、細胞表面受容体(LDL受容体、トロンボモジュリン受容体)、および免疫関連タンパク質(補体C1r、ウロモジュリン(uro
modulin))が含まれる。
J. Gastroenterol Hepatol, 7(10), 945-50 (1995)。さらに、EGFは下記に関連する
ことが示されている:毛嚢の分化、du Cros, J. Invest. Dermatol. 101 (1 Suppl.), 106S-113S (1993)、Hillier, Clin. Endocrinol. 33(4), 427-28 (1990);腎機能、Hamm et
al., Semin. Nephrol. 13(1): 109-15 (1993)、Harris, Am. J. Kidney Dis. 17(6): 627-30 (1991);涙液、van Setten et al., Int. Ophthalmol 15(6); 359-62(1991);ビタ
ミンK仲介血液凝固、Stenflo et al., Blood 78(7): 1637-51(1991)。EGFは、異常な角化細胞分化を特徴とする種々の皮膚疾患、たとえば乾癬、上皮癌、たとえば肺の扁平上皮癌、外陰部の類表皮癌、および神経膠腫に関連することも示されている。King et al.,
Am. J. Med. Sci. 296:154-158 (1988)。
るc−erb−2(HER−2としても知られる)は、ヒト乳癌に過剰発現する。King et al., Science 229:974-976 (1985); Gullick, Hormones and their actions, Cooke et
al., eds, Amsterdam, Elsevier, pp 349-360 (1986)。
どを促進するための療法に線維芽細胞増殖因子を使用するための基礎を提供する。たとえば、線維芽細胞増殖因子は心臓の疾患および手術における心筋損傷を最小限に抑えることが示唆された(U.S.Pat.No.4,378,347)。
Sci. USA 90, 740-744 (1993); Heikinheimo et al., Mech. Dev. 48:129-138 (1994))
。
FGF−8発現は弱く、性腺組織に限定されるが、ノーザンブロット分析によりFGF−8 mRNAはネズミの妊娠10日から12日目まで存在することが示された;これは、FGF−8が正常な発生に重要であることを示唆する。Heikinheimo et al., Mech Dev. 48(2): 129-38 (1994)。さらに、妊娠8〜16日目のインサイチュハイブリダイゼーションアッセイにより、第1気管支アーチ、前頭鼻突起、前脳および中脳−後脳接合部の表面
外胚葉に初期発現が示された。10〜12日目に、FGF−8は前肢芽および後肢芽、鼻itsおよび鼻咽頭、漏斗部(infundibulum)の表面外胚葉、ならびに終脳、
間脳および後脳に発現した。発生中の後肢では妊娠13日目まで発現が続くが、その後は検出できなくなる。この結果は、FGF−8が胚形成において時間的および空間的に独特のパターンをもつことを示唆し、原腸形成後の胚において外胚葉分化の多数の領域でこの増殖因子が役割をもつことを示唆する。
Roberts, eds. (Springer-Verlag: Berlin, 1990) pp. 419-472)、ならびに分化因子v
g1(Weeks and Melton, Cell, 51:861-867 (1987))およびDPP−Cポリペプチド(Padgett et al., Nature, 325:81-84 (1987))、ホルモンであるアクチビンおよびインヒビン(Mason et al., Nature 318-659-663 (1985); Mason et al., Growth Factors, 1:77-88 (1987))、ミュラー管抑制物質(MIS)(Cate et al., Cell, 45: 685-698 (1986))、骨
形態発生タンパク質(BMP)(Wozney et al., Science, 242:1528-1534 (1988);PCT
WO 88/00205、1988年1月14日公開;U.S.Pat.No.4,877,864、1989年10月31日発行)、発生において調節されるタンパク質Vgr−1(Lyons et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86:45544558 (1989))およびVgr−2(Jones et al., Molec. Endocrinol., 6:1961-1968 (1992))、マウス増殖分化因子(GDF)、たとえばGDF−3およびGDF−9(Kingsley, Genes Dev., 8:133-146 (1994); McPherron and Lee, J. Biol. Chem., 268:3444-3449 (1993))、マウスlefty
/Stra1(Meno et al., Nature, 381:151-155 (1996); Bouillet et al., Dev. Biol., 170: 420-433 (1995))、グリア細胞系由来神経栄養因子(GDNF)(Lin et al., Science, 260:1130-1132 (1993))、ノイルツリン(neurturin)(Kotzbauer et al., Nature, 384:467-470 (1996))、ならびに子宮内膜出血関連因子(EBAF)(Kothapalli et al., J. Clin. Invest., 99:2342-2350 (1997))。サブセットBMP−2Aおよ
びBMP−2Bは、DPP−Cに対して配列が約75%相同であり、そのタンパク質の哺乳動物均等物である。
GF−ベータ2、TGF−ベータ3、TGF−ベータ4、およびTGF−ベータ5。活性形のTGF−ベータ1はホモ二量体であり、アミノ酸390個の前駆体のカルボキシ末端112個のアミノ酸の二量体化により形成される。組換えTGF−ベータ1がクローン化され(Derynck et al., Nature, 316:701-705 (1985))、チャイニーズハムスター卵巣細胞において発現された(Gentry et al., Mol. Cell. Biol. 7:3418-3427 (1987))。さらに、組換えヒトTGF−ベータ2(deMartin et al., EMBO J., 6:3673 (1987))、ならびにヒ
トおよびブタTGF−ベータ3(Derynck et al., EMBO J., 7:3737-3743 (1988); ten Dijke et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:4715 (1988))がクローン化された。TG
F−ベータ2はアミノ酸414個の前駆体の形態であり、同様にプロセシングされて活性形TGF−ベータ1と約70%の相同性をもつカルボキシ末端112個のアミノ酸からなるホモ二量体となる(Marquardt et al., J. Biol. Chem., 262:12127 (1987))。EP 200,341;169,016;268,561;および267,463;U.S Pat No.4,774,322;Cheifetz et al., Cell, 48:409-415 (1987); Jakowlew
et al., Molecular Endocrin., 2:747-755 (1988); Derynck et al., J. Biol. Chem., 261:4377-4379 (1986); Sharples et al., DNA, 6:239-244 (1987); Derynck et al., Nucl. Acids. Res., 15:3188-3189 (1987); Derynck et al., Nucl. Acids. Res. 15:3187 (1987); Seyedin et al., J. Biol. Chem., 261:5693-5695 (1986); Madisen et al., DNA 7:1-8 (1988); and Hanks et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.), 85:79-82 (1988も)も参照されたい。
細胞cDNAから、それぞれクローン化された。
結び目(knot)構造形成に必要なシステイン残基の大部分を含むことが明らかになった。EBAF配列は、追加システイン残基を第1保存システイン残基からアミノ酸12個上流に含む。追加システイン残基を含むことが知られている他の唯一のファミリーメンバーは、TGF−ベータ類、インヒビン類およびGDF−3である。LEFTY、GDF−3/Vgr2、およびGDF−9と同様に、EBAFは、分子間ジスルフィド結合を形成することが知られているシステイン残基を欠如する。したがってEBAFは、非対合システイン残基をもつ、二量体として存在しない可能性のあるTGF−ベータスーパーファミリーの追加メンバーであると思われる。しかし、2つのモノマーサブユニット間の疎水性接触が二量体形成を促進する可能性がある。蛍光インサイチュハイブリダイゼーションにより、ヒト染色体1のバンドq42.1にebaf遺伝子があることが示された。
コンジュゲート
本発明は、シンメトロアドヘシン/イムノシンメトロアドヘシンのコンジュゲートにも関する。よって、本発明組成物は下記のものにコンジュゲートさせることができる:細胞傷害性物質、たとえば化学療法薬、毒素(たとえば、細菌、真菌、植物もしくは動物由来の酵素活性毒素、またはそのフラグメント)、または放射性同位体(すなわち放射性コンジュゲート)。
本明細書に開示する遺伝子デバイスは、多様な経路で合成できる。特定の1経路は、化合物をインビボで組換えDNA技術により合成し、次いで分泌または入手された生成物を本発明化合物が形成される条件下で化学修飾するものである。別経路には固体状態合成が含まれる。
以下の記載は主に、エンコーディング核酸を含むベクターで形質転換またはトランスフェクションした細胞を培養することによる、目的とする連続アミノ酸の区域またはポリペプチドの調製に関する。当技術分野で周知の別法を採用しうることももちろん考慮される。たとえば、固相法を用いる直接ペプチド合成により、アミノ酸配列またはその一部を製造することができる(たとえばStewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., カリフォルニア州サンフランシスコ(1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963)を参照)。インビトロタンパク質合成は、手動法を用いて、また
は自動法により実施できる。自動合成は、たとえばApplied Biosystemsペプチド合成装置(カリフォルニア州フォスターシティー)により、製造業者の指示を用いて達成できる。目的とする連続アミノ酸の区域またはポリペプチドの種々の部分を個別に化学合成し、化学的方法または酵素法を用いて組み合わせて、目的とする連続アミノ酸の区域またはポリペプチドの全長を製造することができる。
目的とするmRNAを保有すると考えられる組織から作成したcDNAライブラリーからエンコーディングDNAを入手し、それを検出可能なレベルで発現させることができる。したがってヒトDNAはヒト組織から作成したcDNAライブラリーから簡便に入手できる、など。エンコーディング遺伝子はゲノムライブラリーから、または既知の合成法により入手することもできる(たとえば自動核酸合成)。
ーヨーク: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)に記載。エンコーディング遺伝子を単離するための別法は、PCR法を用いるものである(Sambrook et al., 前掲; Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995))。
本明細書に記載する調製用の発現ベクターまたはクローニングベクターで宿主細胞をトランスフェクションまたは形質転換し、プロモーターの誘導、形質転換体の選択、または目的配列をコードする遺伝子の増幅のために適宜改変した、一般的な栄養培地で培養する。培養条件、たとえば培地、温度、pHなどは、多大な実験なしに当業者が選択できる。全般的に、細胞培養を最大にするための原理、プロトコルおよび実際の技術は、Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991)およびSambrook et al.,前掲中にある。
rmis)(たとえばバチルス・リケニフォルミス41P、DD 266,710に開示、1989年4月12日公開)、シュードモナス属(Pseudomonas)、たとえば緑膿菌(P.aeruginosa)、ならびに放線菌属(Streptomyces)。これらの例は例示であって、限定ではない。菌株W3110は組換えDNA生成物発酵に慣用される宿主株であるので、特に好ましい宿主または親宿主である。宿主細胞が分泌するタンパク質分解酵素は最少量であることが好ましい。たとえば株W3110を、この宿主の内因性タンパク質をコードする遺伝子に遺伝子変異を起こすように改変することができる;そのような宿主の例には下記のものが含まれる:大腸菌W3110株1A2、これは完全遺伝子型tonAをもつ;大腸菌W3110株9E4、これは完全遺伝子型tonA ptr3をもつ;大腸菌W3110株27C7(ATCC 55,244)、これは完全遺伝子型tonAptr3phoA E15(argF−lac)169 degP ompT kan.sup.rをもつ;大腸菌W3110株37D6、これは完全遺伝子型tonA ptr3 phoA E15(argF−lac)169 degP
ompT rbs7 ilvG kan.sup.rをもつ;大腸菌W3110株40B4、これは非カナマイシン耐性degP欠失変異をもつ株37D6である;および変異ペリプラズムプロテアーゼをもつ大腸菌株:U.S Patent No.4,946,783,1990年8月7日発行に開示。あるいは、インビトロクローニング法、たとえばPCRまたは他の核酸ポリメラーゼ反応が適切である。
is)(MW98−8C,CBS683,CBS4574 Louvencourt et al., J. Bacteriol., 737 (1983))、クライベラ・フラギリス(K.fragilis)(ATCC
12,424)、クライベラ・ブルガリカス(K.bulgaricus)(ATCC 16,045)、クライベラ・ウィッケラミイ(K.wickeramii)(ATCC
24,178)、クライベラ・ワルティイ(K.waltii)(ATCC 56,500)、クライベラ・ドロソフィララム(K.drosophilarum)(ATCC
36,906;Van den Berg et al., Bio/Technology, 8:135 (1990))、クライベラ・サーモトレランス(K.thermotolerans)、およびクライベラ・マルキシアヌス(K.marxianus);ヤロウィア属(yarrowia)(EP 402,226);ピキア・パストリス(Pichia pastoris)(EP 183,070; Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol., 28:265-278 (1988));カンジダ属(Candida);トリコデルマ・リーシア(Trichoderma reesia)(EP 244,234);ニューロスポラ・クラッサ(Neurospora crassa)(Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:5259-5263 (1979));シュバンニオミセス属(Schwanniomyces)、たとえばシュバンニオミセス・オッシデンタリス(Schwanniomyces occidentalis)(EP 394,538,1990年10月31日公開);ならびに糸状菌、たとえばニューロスポラ属(Neurospora)、ペニシリウム属(Penicillium)、トリポクラジウム属(Tolypocladium)(WO 91/00357,1991年1月10日公開)、およびアスペルギルス属(Aspergillus)宿主、たとえばアスペルギルス・ニデュランス(A.nidulans)(Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 112:284-289 (1983); Tilburn et al., Gene, 26:205-221 (1983); Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:1470-1474 (1984))およびアスペル
ギルス・ニガー(A.niger)(Kelly and Hynes, EMBO J., 4:475479 (1985))。メ
チロトロピック酵母は本発明に適切であり、メタノール上で生育しうる下記よりなる属から選択される酵母が含まれるが、これらに限定されない:ハンゼヌラ属(Hansenula)、カンジダ属(Candida)、クレッケラ属(Kloeckera)、ピキア属(Pichia)、サッカロミセス属(Saccharomyces)、トルロプシス属(Torulopsis)およびロドトルラ属(Rhodotorula)。このクラスの酵母の例示である具体的な種のリストは、C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982)中にある。
CRL 1651);ヒト胚性腎系(293細胞、または懸濁培養用にサブクローニングした293,Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977));チャイニーズハムスター卵巣細胞/−DHFR(CHO,Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980));マウスセルトリ細胞(sertoli cell)(TM4、Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980));ヒト肺細胞(W138、ATCC CCL 75
);ヒト肝細胞(Hep G2、HB 8065);およびマウス乳腺腫(MMT 060562、ATCC CCL51)。適切な宿主細胞の選択は当業者が容易になしうる範囲のものであると考えられる。
目的とする連続アミノ酸の区域またはポリペプチドをコードする核酸(たとえばcDNAまたはゲノムDNA)を、複製可能なベクターにクローニング(DNAの増幅)または発現のために挿入することができる。多様なベクターが公開されている。ベクターは、たとえばプラスミド、コスミド、ウイルス粒子またはファージの形であってもよい。適切な核酸配列を多様な方法でベクターに挿入することができる。一般に、当技術分野で既知の技術を用いてDNAを適切な制限エンドヌクレアーゼ部位(1以上)に挿入する。ベクター構成要素には通常は、1以上のシグナル配列、複製起点、1以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、および転写終止配列が含まれるが、これらに限定されない。これらの構成要素のうち1以上を含む適切なベクターの構築には、当業者に既知の標準ライゲーション法を用いる。
を指令するために哺乳動物シグナル配列、たとえば同一種または関連種の分泌ポリペプチドに由来するシグナル配列、およびウイルス分泌リーダーを使用できる。
製および増殖される。酵母に用いるのに適切な選択遺伝子は、酵母プラスミドYRp7中に存在するtrp1遺伝子である(Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979); Kingsman et al., Gene, 7:141 (1979); Tschemper et al., Gene, 10:157 (1980))。trp1遺伝子は、トリプトファン中で増殖する能力を欠如する酵母変異株、たとえばATCC No.44076またはPEP4−1に対する選択マーカーを提供する(Jones, Genetics, 85:12 (1977))。
;EP 36,776)、およびハイブリッドプロモーター、たとえばtacプロモーター(deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983))が含まれる。細菌系に用いるプロモーターは、エンコーディングDNAに作動可能な状態で連結したシャイン・ダルガーノ(S.D.)配列をも含むであろう。
ナーゼ2、イソシトクロムC、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ、ならびにマルトースおよびガラクトース利用に関与する酵素。酵母発現に使用するのに適切なベクターおよびプロモーターは、さらにEP 73,657に記載されている。
293:620-625 (1981); Mantei et al., Nature, 281:4046 (1979);EP 117,06
0;およびEP 117,058に記載されている。
遺伝子の増幅および/または発現は、試料において直接に、たとえば一般的なサザンブロット法、mRNAの転写を定量するためのノーザンブロット法(Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980))、ドットブロット法(DNA分析)、またはイン
サイチューハイブリダイゼーション法により、適宜標識されたプローブを用い、本明細書に提示する配列に基づいて測定できる。あるいは、DNAデュプレックス、RNAデュプレックスおよびDNA−RNAハイブリッドデュプレックス、またはDNA−タンパク質デュプレックスを含めた特異的デュプレックスを認識しうる抗体を使用できる。これらの抗体を標識し、デュプレックスが表面に結合した状態でアッセイを実施することができ、これにより、表面にデュプレックスが形成された状態でデュプレックスに結合した抗体の存在を検出できる。
目的とする連続アミノ酸の区域またはポリペプチドの形態は、培養培地から、または細胞溶解物から回収できる。膜結合している場合、適切な界面活性剤溶液(たとえばTriton−X 100)を用いて、または酵素開裂により、それを膜から開放することができる。目的とする連続アミノ酸の区域またはポリペプチドの発現に用いた細胞は、種々の物理的または化学的手段、たとえば凍結融解サイクル、音波処理、機械的破壊、または細胞溶解剤により破壊することができる。
目的とする連続アミノ酸の区域またはポリペプチドをコードするDNA配列を、選択したPCRプライマーによりまず増幅させる。プライマーは、選択した発現ベクター上の制限酵素部位に相応する制限酵素部位を含むべきである。種々の発現ベクターを使用できる。適切なベクターの例はpBR322(大腸菌由来;参照:Bolivar et al., Gene, 2:95 (1977))であり、これはアンピシリン耐性およびテトラサイクリン耐性に対する遺伝子を
含む。このベクターを制限酵素で消化し、脱リン酸する。次いでPCR増幅した配列をベクターにライゲートさせる。ベクターは、好ましくは下記を含むであろう:抗生物質耐性遺伝子をコードする配列、trpプロモーター、ポリhisリーダー(最初の6つのSTIIコドン、ポリhis配列、およびエンテロキナーゼ開裂部位を含む)、目的とする特定のアミノ酸配列/ポリペプチドをコードする領域、ラムダ転写ターミネーター、およびargU遺伝子。
増殖させることができる。続いて、一夜培養物を大規模培養に使用できる。次いで細胞を目的とする光学濃度まで増殖させる;その間に発現プロモーターが始動する。
この一般例は、グリコシレーションされた形の目的とするアミノ酸配列またはポリペプチド構成要素を哺乳動物細胞において組換え発現により調製することを説明する。
NaCl、1.5mM NaPO4を滴加し、25℃で10分間、沈殿を生成させる。沈殿を懸濁し、293細胞に添加し、37℃で約4時間、沈降させる。培養培地を吸引除去し、PBS中の20%グリセロール2mlを30秒間添加する。次いで293細胞を無血清培地で洗浄し、新鮮な培地を添加し、細胞を約5日間インキュベートする。
キストラン硫酸法により一過性導入することができる。293細胞をスピンナーフラスコ内で最大密度にまで増殖させ、ライゲートしたベクター700μgを添加する。細胞をまずスピンナーフラスコから遠心分離により濃縮し、PBSで洗浄する。DNA−デキストラン沈殿を細胞ペレット上で4時間インキュベートする。細胞を20%グリセロールで90分間処理し、組織培養培地で洗浄し、組織培養培地、5μg/mlのウシインスリンおよび0.1μg/mlのウシトランスフェリンを入れたスピンナーフラスコ内へ再導入する。約4日後、コンディショニングされた培地を遠心分離し、濾過して細胞および細胞屑を除去する。次いで、発現した目的とするアミノ酸配列またはポリペプチド構成要素を含有する試料を濃縮し、いずれかの選択した方法、たとえば透析および/またはカラムクロマトグラフィーにより精製する。
一致させてバキュロウイルス発現ベクター中へ融合させることができる。このポリ−hisタグ付きの目的とするアミノ酸配列またはポリペプチド構成要素の挿入配列を、次いで安定クローンの選択のためのDHFRなどの選択マーカーを含むSV40駆動ベクター中へサブクローニングすることができる。最後に、CHO細胞を(前記に従って)SV40駆動ベクターでトランスフェクションすることができる。標識化を前記に従って実施して、発現を確証することができる。発現したポリ−hisタグ付きの目的とするアミノ酸配列またはポリペプチド構成要素を含有する培養培地を、次いで濃縮し、選択したいずれかの方法、たとえばNi2+−キレートアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。
た標準法によりサブクローニングする。CHO発現ベクターは、cDNAの好都合なシャトリングを可能にするために、適合する制限部位を目的DNAの5’側および3’側にもつように構築される。CHO細胞における発現に用いられるベクターは、Lucas et al., Nucl. Acids Res. 24:9 (1774-1779 (1996)に記載されたものであり、目的cDNAおよ
びジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)の発現を駆動するためにSV40初期プロモーター/エンハンサーを用いる。DHFR発現により、トランスフェクション後に安定に維持されたプラスミドを選択することができる。
以下の方法は、希望する目的アミノ酸配列またはポリペプチド構成要素を酵母において組換え発現させることを記載する。
以下の方法は、バキュロウイルス感染させた昆虫細胞において連続アミノ酸の区域を組換え発現させることを記載する。
波処理緩衝液(25mL Hepes,pH7.9;12.5mM MgCl2;0.1mM EDTA;10%グリセロール;0.1% NP40;0.4M KCl)で洗浄および再懸濁し、氷上で20秒間、2回、超音波処理する。超音波処理物を遠心分離で澄明にし、上清を装填用緩衝液(50mMリン酸塩,300mM NaCl,10%グリセロール,pH7.8)で50倍希釈し、0.45μmフィルターにより濾過する。Ni2+−NTAアガロースカラム(Qiagenから市販)をベッド容量5mLで調製し、25mLの水で洗浄し、25mLの装填用緩衝液で平衡化する。濾過した細胞抽出物をカラムに0.5mL/分で装填する。カラムをベースラインA280まで装填用緩衝液で洗浄し、この時点で画分採集を開始する。次いでカラムを二次洗浄用緩衝液(50mMリン酸塩;300mM NaCl,10%グリセロール,pH6.0)で洗浄すると、非特異的に結合していたタンパク質が溶出する。再びA280ベースラインに達した後、カラムを二次洗浄用緩衝液中の0−500mMイミダゾール勾配で展開する。1mL画分を採集し、SDS−PAGEおよび銀染色、またはアルカリ性ホスファターゼにコンジュゲートしたNi2+−NTA(Qiagen)を用いるウスタンブロットにより分析する。溶出したHis10−タグ付き配列をプールし、装填用緩衝液に対して透析する。
リウム緩衝液、pH6.8中で平衡化した5mlのプロテインAカラム(Pharmacia)に送入する。装填後、カラムを平衡用緩衝液で十分に洗浄した後に100mMクエン酸、pH3.5で溶離する。275mLの1Mトリス緩衝液、pH9を入れた試験管中へ1ml画分を採集することにより、溶離したタンパク質を直ちに中和する。この高度に精製されたタンパク質を、次いで脱塩して、ポリ−Hisタグ付きタンパク質について前記に述べた保存用緩衝液に入れる。タンパク質の均質性を、SDSポリアクリルアミドゲル(PEG)電気泳動およびエドマン分解による末端アミノ酸配列決定により証明する。
たとえばU.S.Patent No 6,849,428、2005年2月1日発行に記載されるように、インテインは自己スプライシングRNAイントロンのタンパク質均等物であり(参照:Perler et al., Nucleic Acids Res. 22:1125-1127 (1994))、前駆タンパク質からのそれら自身の切除を触媒し、同時に、エクステイン(extein)として知られるフランキングタンパク質配列を融合させる(Perler et al., Curr. Opin. Chem. Biol. 1:292-299 (1997); Perler, F. B. Cell 92(1):1-4 (1998); Xu et al., EMBO J. 15(19):5146-5153 (1996)に概説)。
05年5月24日発行、本明細書に援用する)、次いでチオール仲介による開裂およびこ
の時点ではC−末端側チオエステル末端付きであるアドヘシンサブユニットの放出が可能な条件下で処理する。チオエステル末端付きアドヘシンサブユニットは容易にC−末端側システイン末端付きサブユニットに変換される。
N−末端側−S−末端をもつ免疫グロブリンFc(S−Fc)の調製
免疫グロブリン(IgG)をパパインで消化すると、2つのFabフラグメントと1つのFcフラグメントが得られる(Porter (1959) Biochem. 73, 119-126)。ヒトIgGのタンパク質分解部位は重鎖ヒンジ部のcys−5残基とcys−11残基の間である;EPKSCDKTHTCPPCP(Fleischman et al., Biochem J. (1963) 88, 220-227; Edelman et al. (1969) Proc. Natl. Acad. Sci. 63, 78-85)。cys−5残基は普通はヒ
トIgG軽鎖とジスルフィド結合を形成し、これは緩和な還元条件下で容易に開裂し、このためN−末端側−S−末端をもつFc様分子(S−Fc)の理想的な候補となる。
エキソンスプライスドナー(ヌクレオチド63−912,GenBank寄託No.K03104)、3)ヒトアルファ1−グロビン第2エキソンスプライスアクセプター(ヌクレオチド6808−6919,GenBank寄託No.J00153)、4)SV40
T抗原ポリアデニル化部位(ヌクレオチド2770−2533,Reddy et al. (1978) Science 200, 494-502)、および5)SV40複製起点(ヌクレオチド5725−557
8,Reddy et al., 同書)。目的ポリペプチドの発現のために、そのポリペプチドをコー
ドするEcoRI−BglII DNAフラグメントを、プラスミドpSAのそれぞれ1,608および1,632に位置するEcoRI制限部位とBglII制限部位の間に挿入する。他の適切な発現ベクターには、下記のものが含まれる:プラスミドpSVeCD4DHFRおよびpRKCD4(U.S.Pat.No.5,336,603)、プラスミドpIK.1.1(U.S.Pat.No.5,359,046)、プラスミドpVL−2(U.S.Pat.No.5,838,464)、プラスミドpRT43.2F3(U.S.S.N.08/258,152に記載、その全体を本明細書に援用する)、ならびにプラスミドpCDNA3.1(+)(Invitrogen,Inc.)。
スミドpSA−NEOであり、これはSEQ ID NO:2をEcoRIおよびBglIIで消化することにより調製した第1DNAフラグメントと、SEQ ID NO:1をEcoRIおよびBglIIで消化することにより調製した第2DNAフラグメントとをライゲートさせることにより構築される。SEQ ID NO:2はNEO遺伝子(ヌクレオチド1551−2345,Genbank寄託No.U00004)を含み、その前に転写開始配列を含む(Kozak (1991) J. Biol. Chem, 266, 19867-19870)。NEO遺伝子およびDHFR cDNAを含む適切な他の発現ベクターの例は、プラスミドpSVe−NEO−DHFRであり、これはSEQ ID NO:2をEcoRIおよびBglIIで消化することにより調製した第1DNAフラグメントと、pSVeCD4DHFRをEcoRIおよびBglIIで消化することにより調製した第2DNAフラグメントとをライゲートさせることにより構築される。プラスミドpSVe−NEO−DHFRには、NEO遺伝子およびDHFR cDNAの発現を誘導するためにSV40初期プロモーター/エンハンサーが用いられる。他の適切な選択マーカーには、XPGT遺伝子(Mulligan and Berg (1980) Science 209, 1422-1427)およびハイグロマイシン耐性遺伝子(Sugden
et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5, 410-413)が含まれる。
シグナルペプチドの適切な例は、ソニックヘッジホッグ(SHH)(GenBank寄託No.NM 000193)、インターフェロンα−2(IFN)(GenBank寄託No.NP 000596)、およびコレステロールエステルトランスフェラーゼ(CETP)(GenBank寄託No.NM 000078)である。他の適切な例には、下記のものが含まれる:インディアンヘッジホッグ(Indian hedgehog)(Genbank寄託No.NM 002181)、デザートヘッジホッグ(desert hedgehog)(Genbank寄託No.NM 021044)、IFNα−1(Genbank寄託No.NP 076918)、IFNα−4(Genbank寄託No.NM 021068)、IFNα−5(Genbank寄託No.NM 002169)、IFNα−6(Genbank寄託No.NM 021002)、IFNα−7(Genbank寄託No.NM 021057)、IFNα−8(Genbank寄託No.NM 002170)、IFNα−10(Genbank寄託No.NM 002171)、IFNα−13(Genbank寄託No.NM_006900)、IFN
α−14(Genbank寄託No.NM 002172)、IFNα−16(Genbank寄託No.NM 002173)、IFNα−17(Genbank寄託No.NM 021268)およびIFNα−21(Genbank寄託No.NM 002175)。
ID NO:29およびpCDNA3.1(+)を用いて構築され、プラスミドpCDNA3−IFN−IgG1−Fc(IFNシグナル)はSEQ ID NO:30およびpCDNA3.1(+)を用いて構築され、プラスミドpCDNA3−IgG1−Fc(CETPシグナル)はSEQ ID NO:31およびpCDNA3.1(+)を用いて構築された。
ID NO:47およびpCDNA3.1(+)を用いて構築され、プラスミドpCDNA3−IFN−IgG2−Fc(IFNシグナル)はSEQ ID NO:48およびpCDNA3.1(+)を用いて構築され、プラスミドpCDNA3−IgG2−Fc(CETPシグナル)はSEQ ID NO:49およびpCDNA3.1(+)を用いて構築される。
ID NO:68およびpCDNA3.1(+)を用いて構築され、プラスミドpCDNA3−IFN−IgG3−Fc(IFNシグナル)はSEQ ID NO:69およびpCDNA3.1(+)を用いて構築され、プラスミドpCDNA3−IgG3−Fc(CETPシグナル)はSEQ ID NO:70およびpCDNA3.1(+)を用いて構築される。
OM1で消化することにより調製したベクターフラグメントのライゲーションにより構築される。プラスミドpCDNA3−SHH−IgG4−Fc(SHHシグナル)はSEQ
ID NO:83およびpCDNA3.1(+)を用いて構築され、プラスミドpCDNA3−IFN−IgG4−Fc(IFNシグナル)はSEQ ID NO:84およびpCDNA3.1(+)を用いて構築され、プラスミドpCDNA3−IgG4−Fc(CETPシグナル)はSEQ ID NO:85およびpCDNA3.1(+)を用いて構築される。
ウム法により細胞をトランスフェクションする。DNA混合物(10マイクログラム)を、0.5mlの1mMトリス−HCl、0.1mM EDTA、および227mM CaCl2に溶解する。このDNA混合物は、発現ベクターDNA、選択マーカーDNA、およびVA RNA遺伝子をコードするDNA(Thimmappaya et al. (1982) Cell 31, 543-551)を含有する(10:1:1の比率で)。この混合物に、0.5mLの50mM Hepes(pH7.35)、280mM NaCl、および1.5mM NaPO4を滴加する。DNA沈殿を25℃で10分間生成させ、次いで懸濁し、100mmのプラスチック培養皿上で周密状態まで増殖させた細胞に添加する。37℃で4時間後、培養培地を吸引し、PBS中の20%グリセロール2mlを0.5分間添加する。次いで細胞を無血清培地で洗浄し、新鮮な培養培地を添加し、細胞を5日間インキュベートする。
アミド−SDSゲル上で分析する。処理したゲルを乾燥させ、x線フィルムに露光して、S−Fcドメインの存在を明らかにする。
−GV(Millipore)を用いて無菌濾過し、4℃に保存する。
を無血清のものに交換し、5日目まで毎日収穫する。S−Fcタンパク質を、細胞曝露上清からプロテインA−セファロースCL−4B(Pharmacia)により精製する。溶出したS−Fcタンパク質をCentricon−30(Amicon)により、PBS中へ緩衝液交換し、0.5mlに濃縮し、Millex−GV(Millipore)を用いて無菌濾過し、4℃に保存する。
11細胞にプラスミドをリポフェクションにより導入し、無GHT培地中での増殖について選択する(Chisholm (1996),哺乳動物細胞における高効率の遺伝子伝達: Glover, D M,
Hames, B D. DNA Cloning vol 4. Mammalian systems. Oxford Univ. Press, pp 1-41)
。約20の未増幅クローンをランダムに選択し、96ウェルプレートに再播種する。3日後に各ウェルに蓄積したS−Fcタンパク質の定量のためのELISA、およびウェル当
たりの可視細胞数の代理マーカーとしての蛍光色素Calcien AMを用いて、各コロニーの比生産性をモニターする。これらのデータに基づいて、漸増濃度のメトトレキセートの存在下でさらに増幅させるために、幾つかの未増幅クローンを選択する。10、50および100nMのメトトレキセートで生存した個々のクローンを選択し、生産性スクリーニングのために96ウェルプレートへ移す。再現性をもって高い比生産性を示す適切なクローンをT−フラスコ内で増殖させ、スピンナー培養に播種するために使用する。数代の継代後、懸濁適合した細胞を、各種ホルモンおよびタンパク質水解物を補充したGHT含有−無血清培地での生産培養に播種する。収穫したS−Fcタンパク質を含有する細胞培養液を、プロテインA−セファロースCL−4Bにより精製する。
N−末端側−X−末端をもつ免疫グロブリンFc(X−Fc)の調製
セレノシステイン(sec)は、リボソーム仲介タンパク質合成に際して21番目に取り込まれるアミノ酸である(Zinoni et al. (1986) Proc. Natl Acad. Sci. 83, 4650-4654; Chambers et al. (1986) EMBO J. 5, 1221-1227)。このプロセスは複雑であり、シス
テイン取込みとは異なり、UGA停止コドンを解読するためのmRNAセレノシステイン挿入エレメントを必要とする。タンパク質半合成により、システイン(cys)および/またはセレノシステイン(sec)で始まるN−末端側−X−末端をもつFc様の分子(X−Fc)を調製する手段が得られる。
:cys−asp−lys−thr−his−thr)またはS−Fcタンパク質とペプチドFc−B(5−11:sec−asp−lys−thr−his−thr)の自然化学ライゲーションを行なう。挿入配列とEcoRIおよびBglIIで消化することにより調製したベクターフラグメントのライゲーションにより、適切な発現ベクターを構築する。非増幅発現のために、プラスミドpSHH−Fc11(SHHシグナル)はSEQ ID NO:6およびSEQ ID NO:1を用いて構築され、プラスミドpIFN−Fc11(IFNシグナル)はSEQ ID NO 7およびSEQ ID NO:1を用いて構築され、プラスミドpCETP−Fc11(CETPシグナル)はSEQ ID
NO:8およびSEQ ID NO:1を用いて構築される。増幅発現のために、プラスミドpSHH−Fc11−DHFRはSEQ ID NO:6およびpSVeCD4DHFRを用いて構築され、プラスミドpIFN−Fc11−DHFRはSEQ ID NO:7およびpSVeCD4DHFRを用いて構築され、プラスミドpCETP−Fc11−DHFRはSEQ ID NO:8およびpSVeCD4DHFRを用いて構築される。
側鎖保護されたアミノ酸は、Boc−Asp(O−シクロヘキシル)−OH、Boc−Cys(4−メチルベンジル)−OH、Boc−Lys(2−Cl−Z)−OH、およびBoc−Thr(ベンジル)−OHである。鎖の組立てが完了した後、ペプチドを脱保護し、無水HFにより0℃で1時間、スカベンジャーとして4%アニソールを用いて処理することにより、樹脂から開裂させる。
leucine)(TAMPAL)樹脂上で合成して、C−末端MPAL−活性チオエ
ステルを得る(Hackeng et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. 96, 10068-10073)。このチオエステルペプチドのN−末端cys/sec残基を、2−(メチルスルホニル)エチルカーボネート(Msc)基により、最小容量のジメチルホルムアミド/5%ジイソプロピルエチルアミンに溶解した活性Mscニトロフェノールエステルの2時間反応(10倍過剰)で保護する。チオエステル活性ペプチドを脱保護し、TAMPAL樹脂から開裂させ、HPLC精製し、凍結乾燥させ、使用時まで−20℃に保存する。分離用逆相HPLCは、Vydac C−18カラム(10マイクロメートル,1.0cmx25cm)を用いて実施される。結合したペプチドを、H20/10%トリフルオロ酢酸中のアセトニトリル直線勾配により溶離する。
これらのチオエステル活性化ペプチドを過剰モルで、調製したばかりのS−Fcタンパク質(出発濃度1〜200マイクロモル濃度)と混合する。この溶液をCentriprep 3/30装置(Millipore,マサチュセッツ州)により濃縮し、次いでS−Fcタンパク質についてはCentricon 3/10装置により最終濃度0.15〜1.2mMに濃度する。ライゲーション物を4℃で一夜インキュベートし、SDS−page電気泳動により視覚化する。自然化学ライゲーションの後、N−末端Msc保護基をpH13で短時間のインキュベーション(<5分)により除去する。X−Fc生成物を精製して、実施例1の方法を用いてプロテインAセファロースによるアフィニティークロマトグラフィーにより未反応ペプチドを除去する。
実施例3
C−末端側−X−末端をもつ免疫グロブリンFc(Fc−X)の調製
IgGは2つの存在形態で発現する:可溶性抗体分子および細胞結合−B細胞受容体。両形態とも単一メッセンジャーRNAから、オータナティブスプライシングにより2つの追加エキソンがIgG重鎖コード領域に付加された結果として生成する(Tyler et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. 79, 2008-2012; Yamawaki-Kataoka et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. 79, 2623-2627)。付加された第1エキソン(M1エキソン)は18個
のアミノ酸の区域ELQLEESCAEAQDGELDGをコードする;これはIgGを細胞表面にフレキシブルに繋ぎ留め、このためこれはC−末端側−X−末端をもつ新規なFc様分子(Fc−X)について良好な選択肢となる。M1ドメインのC−末端gly−18残基も、C−末端活性チオエステルの調製に用いるFc−インテイン融合タンパク質の調製に好適である。インテイン自動開裂反応に伴ってチオエステル中間体が生成し、これに自然化学ライゲーションによりC−末端にシステインまたはセレノシステインが容易に付加できる。
質スプライシングによりインテインドメインが切除されると、Fc−チオエステル中間体が得られる(パートiii)。最後に、このFc−チオエステルと遊離システインおよび/またはセレノシステインとの自然化学ライゲーションを利用して、C−末端側−X−末端ELQLEESCAEAQDGELDGXをもつFc−Xタンパク質を調製する(パート(iv)。
プチドの精製を促進するために、バシラス・サーキュランス(Bacillus circulans)キチン結合ドメインに融合したMth RRIインテイン配列を用いる。この修飾MthRIR1インテインに適切な配列はプラスミドpTWIN−2中にある(New England BioLabs,マサチュセッツ州)。
cerevisiae)液胞型ATPアーゼ(Sce VMA1)(GenBank寄託No.NC_001136)中にある。他の適切な自己スプライシングインテインの例は、Inbase:インテインデータベース(Perler(2002)Nucl. Acids Res. 30, 383-384)に記載されている。
めに、プラスミドpCD2−Fc7−Mth(CD2シグナル)はSEQ ID NO:9およびSEQ ID NO:1を用いて構築され、プラスミドpCD4−Fc7−Mth(CD4シグナル)はSEQ ID NO:10およびSEQ ID NO:1を用いて構築される。増幅発現のために、プラスミドpCD2−Fc7−Mth−DHFRはSEQ ID NO:9およびpSVeCD4DHFRを用いて構築され、プラスミドpCD4−Fc7−Mth−DHFRはSEQ ID NO:10およびpSVeCD4DHFRを用いて構築される。
N−末端側−S−末端およびC−末端側−X−末端をもつ免疫グロブリンFc(S−Fc−X)の調製
S−FcおよびFc−Xタンパク質は、2つの結合ドメインが単一のFcドメインに連結したものをもつイムノシンメトロアドヘシンの調製に有用である(下記を参照)。結合ドメインをN−末端側−S−末端(S−Fc)またはC−末端側−X−末端(Fc−X)に付加する。4つの結合ドメインが単一のFcドメインに連結したものをもつビ−シンメトロアドヘシンの調製に有用なS−Fc−Xドメインを、実施例1および実施例3に記載した方法により調製する。
現ベクターで、宿主細胞をトランスフェクションする。N−末端システインをもつタンパク質からヘテロロガスシグナルペプチドを選択する(パートi)。こうして、細胞性シグナルペプチダーゼによる開裂により、N−末端にcys−5をもつ、CDKTHTCPPCP、成熟S−Fc−インテイン融合タンパク質が得られるであろう(パートii)。タンパク質スプライシングによりインテインが切除されると、Fc−チオエステル中間体が得られる(パートiii)。最後に、このFc−チオエステルと遊離システインおよび/またはセレノシステインとの自然ライゲーションを利用して、C−末端側−X−末端ELQLEESCAEAQDGELDGXをもつS−Fc−Xタンパク質を調製する(パートiv)。
N−末端側−X−末端およびC−末端側−X−末端をもつ免疫グロブリンFc(X−Fc−X)の調製
X−FcおよびFc−Xタンパク質は、2つの結合ドメインが単一のFcドメインに連結したものをもつイムノシンメトロアドヘシンの調製に有用である(下記を参照)。結合ドメインをN−末端側−X−末端(X−Fc)またはC−末端側−X−末端(Fc−X)に付加する。4つの結合ドメインが単一のFcドメインに連結したものをもつビ−シンメトロアドヘシンの調製に有用なX−Fc−Xドメインを、実施例2および実施例3に記載した方法により調製する。
テイン融合タンパク質が得られるであろう(パートii)。自然ライゲーションを利用して、N−末端にcys−5またはsec−5をもつ、XDKTHTCPPCP、X−Fc−インテイン融合タンパク質を調製する(パートiii)。タンパク質スプライシングによりインテインが切除されると、Fc−チオエステル中間体が得られる(パートiv)。最後に、このFc−チオエステルと遊離システインおよび/またはセレノシステインとの2回目の自然化学ライゲーションを実施して、C−末端側−X−末端ELQLEESCAEAQDGELDGXをもつX−Fc−Xタンパク質を調製する(パートv)。あるいは、パートiiiをパートivおよびvの後に実施する。
ID NO:1を用いて構築され、pIFN−Fc11−MthはSEQ ID NO:15およびSEQ ID NO:1を用いて構築され、pCETP−Fc11−MthはSEQ ID NO:16およびSEQ ID NO:1を用いて構築される。増幅発現のために、pSHH−Fc11−Mth−DHFRはSEQ ID NO:14およびpSVeCD4DHFRを用いて構築され、pIFN−Fc11−Mth−DHFRはSEQ ID NO:15およびpSVeCD4DHFRを用いて構築され、pCETP−Fc11−Mth−DHFRはSEQ ID NO:16およびpSVeCD4DHFRを用いて構築される。
CD4シンメトロアドヘシン
HIV−1感染症を処置するための療法計画は、HIV−1受容体の構成要素であるヒトCD4に基づく。CD4イムノアドヘシン(Capon et al. (1989) Nature 337, 525-531)は、gp120エンベロープタンパク質に結合することによって効果的にHIV−1を
阻害する。その阻害活性はCD4細胞外ドメイン(残基1−371)にある。
書)と比較する。
適切な発現ベクターは、挿入配列と、EcoRIおよびBglIIで消化することにより調製したベクターフラグメントとのライゲーションにより構築される。非増幅発現のために、プラスミドpCD4−MthはSEQ ID NO:17およびSEQ ID NO:1を用いて構築される。増幅発現のために、プラスミドpCD4−Mth−DHFRはSEQ ID NO:17およびpSVeCD4DHFRを用いて構築される。
(1962) Arch. Biochem. Biophys. 1 (Suppl.), 174-180; Edelman et al. (1963) Proc.
Nat. Acad. Sci. (1963) 50, 753-761)。CD4−Xタンパク質(0.5〜2.0mg/ml)を還元用緩衝液(0.05Mトリス−HCl緩衝液,pH8.0;2−メルカプトエタノール中に0.1Mで調製)に溶解し、室温で1時間インキュベートする。次いでタンパク質をSephadex G−100クロマトグラフィーにより酸化用緩衝液(0.1M K2HPO4)中へ入れ換え、ゆるく詰めた綿栓で封じた丸底ガラス試験管内で穏やかに撹拌し、室温で20時間進行させる(Haber and Anfinsen (1961) J. Biol. Chem. 236, 422-424)。
用緩衝液中において、室温で1時間、穏やかに撹拌し、次いで酸化用緩衝液で洗浄する。CD4−Xを還元用緩衝液で処理し、ビーズに添加し、室温で20時間、反応を進行させる。
インキュベートし、次いで同容量のH9細胞(Gallo et al. (1984) Science 224, 500-503)5x106/mlを添加し、37℃で1時間インキュベーションを続ける。ウイルス
の吸着後、150マイクロリットル中の細胞2.5x105個を2mlのインキュベーション培地へ移す。37℃で4日後、培養物を新鮮な培地で1:2に分け、さらに3日間インキュベートする。培養物を回収し、逆転写活性を測定し(Groopman et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses (1987) 3, 71-85)、HIV−1陽性血清による免疫蛍光を記載に従って測定する(Poiesz et al. (1980) Proc. Acad. Nat. Sci. 77, 7415-7419)。攻撃量のウイルスは、H9細胞内で増殖させた100 TCID50のHIV−1株HTLV−IIIBであり、同一系においてアッセイされる。インキュベーション培地は、2mMのL−グルタミン、100単位/mlのペニシリン、100マイクログラム/mlのストレプトマイシン、2マイクログラム/mlのポリブレンおよび20%のウシ胎仔血清を含有する、RPMI 1640培地である。
腫瘍壊死因子受容体シンメトロアドヘシン
自己免疫疾患を処置するための療法計画は、腫瘍壊死因子α(TNF−α)、ならびにそれとTNF−α抗体および受容体(TNR)の結合特性に基づく。両方とも成人性リウマチ性関節炎、若年性リウマチ性関節炎、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、クローン病、および潰瘍性大腸炎における重要な療法選択肢である。
et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 10535-10539)。
抗体Di62は、Di62重鎖(Genbank寄託No.AJ002433);およびDi62軽鎖(Genbank寄託No.AJ002434)を含む(以下、TNR1A=TNR1;TNR1B=TNR2;およびDi62−VH−CH+Di62−VkCk=TNRFab)。
Di62−VH−CH−インテインキメラポリペプチドおよびDi62−VkCkタンパク質をコードする2種類の発現ベクターで宿主細胞をトランスフェクションすると、Di62−VH−CH−インテイン:Di62−Vk−Ckタンパク質が共発現し、これを用いてTNFFab−Xタンパク質を調製する:
1)Di62−VH−CH1ドメインがそれのC−末端においてペプチド結合により自己スプライシングインテインのN−末端の自動開裂部位に連結したものを含む、プレ−Di62−VH−インテインキメラポリペプチド(図41A〜41B);および
2)Di62−Vk−Ckドメインを含むプレ−Di62−Vkポリペプチド(図42)。
1)TNR1A細胞外ドメインがそれのC−末端においてペプチド結合により自己スプライシングインテインのN−末端の自動開裂部位に連結したものを含む、プレ−TNR1A−インテインキメラポリペプチド(図43);および
2)TNR1B細胞外ドメインがそれのC−末端においてペプチド結合により自己スプライシングインテインのN−末端の自動開裂部位に連結したものを含む、プレ−TNR1B−インテインキメラポリペプチド(図44A)。
、SEQ ID NO:155、およびSEQ ID NO:156(TNR1A);SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:159、SEQ ID NO:160、およびSEQ ID NO:161(TNR1B);ならびにSEQ ID NO:163、およびSEQ ID NO:164(TNR1Bイムノアドヘシン)。
NO:19およびSEQ ID NO:1を用いて構築され、プラスミドpTNR1A−MthはSEQ ID NO:20およびSEQ ID NO:1を用いて構築され、プラスミドpTNR1A−MthはSEQ ID NO:22およびSEQ ID NO:1を用いて構築される。増幅発現のために、プラスミドpDi62−VHCH−Mth−DHFRはSEQ ID NO:18およびpSVeCD4DHFRを用いて構築され、プラスミドpDi62−VkCk−DHFRはSEQ ID NO:19およびpSVeCD4DHFRを用いて構築され、プラスミドpTNR1A−Mth−DHFRはSEQ ID NO:20およびpSVeCD4DHFRを用いて構築され、プラスミドpTNR1A−Mth−DHFRはSEQ ID NO:22およびpSVeCD4DHFRを用いて構築される。
TNR1B−イムノアドヘシンを示す。
Systems(ミネソタ州)から入手される。
判定する。競合結合分析において、125I−TNF−αを固定化試料と共に漸増濃度の非標識TNF−αの存在下でインキュベートする。競合IC50値から次式に従ってKdを決定する:Kd=IC50/(1+[T]/KdT);式中、[T]はトレーサーの濃度(0.1nm)であり、KdTは飽和結合により決定したトレーサーのKd(80pM)である。
血管内皮増殖因子受容体シンメトロアドヘシン
血管新生疾患を処置するための療法計画は、血管内皮増殖因子(VEGF)およびそれらとVEGF受容体(VGFR)の結合相互作用に基づく。VEGF−抗体およびVGFR−イムノアドヘシンは、大腸癌、直腸癌、肺癌および乳癌を含めた多数の転移性癌ならびに加齢性黄斑変性症の処置のための有望な候補である。
1)VGFR1細胞外ドメインがそれのC−末端においてペプチド結合により自己スプライシングインテインのN−末端の自動開裂部位に連結したものを含む、プレ−VGFR1−インテインキメラポリペプチド(図45A〜45C);
2)VGFR1細胞外ドメインがそれのC−末端においてペプチド結合により自己スプライシングインテインのN−末端の自動開裂部位に連結したものを含む、プレ−VGFR2−インテインキメラポリペプチド(図46A〜46C);
3)VGFR1細胞外ドメインがそれのC−末端においてペプチド結合により自己スプライシングインテインのN−末端の自動開裂部位に連結したものを含む、プレ−VGFR1−インテインキメラポリペプチド(図47A〜47C)。
ンが切除されると、VGFR−チオエステル中間体が得られる(パートiii)。最後に、このVGFR−チオエステルと遊離システインおよび/またはセレノシステインとの自然化学ライゲーションを利用して、C−末端側−X−末端をもつVGFRドメインを調製する(パートiv)。
ID NO:176、SEQ ID NO:177、SEQ ID NO:178、およびSEQ ID NO:179(VGFR3)。
NO:1を用いて構築され、プラスミドpVGR1−MthはSEQ ID NO:23およびSEQ ID NO:1を用いて構築され、プラスミドpVGR1−MthはSEQ ID NO:24およびSEQ ID NO:1を用いて構築される。非増幅発現について、プラスミドpVGFR1−Mth−DHFRはSEQ ID NO:22およびpSVeCD4DHFRを用いて構築され、プラスミドpVGR1−Mth−DHFRはSEQ ID NO:23およびpSVeCD4DHFRを用いて構築され、プラスミドpVGR1−Mth−DHFRはSEQ ID NO:24およびpSVeCD4DHFRを用いて構築される。
ムの標識していない精製VEGF165の存在下または不存在下で結合を実施する。結合した125I−VEGF165を、次いで96ウェル−分解式(breakaway)イムノソルベントアッセイプレート(Nunc)内での捕獲により測定する。50mM Na2CO3,pH9.6中、2マイクログラム/mlのアフィニティー精製したヤギ抗ヒトFc IgG(Organon−Teknika)により、4℃で一夜、プレートをコーティングし、緩衝液A中で1時間、プレブロックする。次いで結合反応物を、コーティングしたウェル内で室温において1時間インキュベートし、続いて緩衝液Aで4回洗浄する。結合した125I−VEGF165の画分をガンマ計数計で測定する。データを4パラメーター非線形曲線あてはめグプログラム(Kalidagraph,Abelbeck Software,ペンシルベニア州)により分析する。
ErbBシンメトロアドヘシン
悪性疾患を処置するための療法計画は、上皮増殖因子様受容体(ErbB)およびそれ
らのリガンドに基く;これには、ノイレグリン(neuregulin)類/ヘレグリン(heregulin)類(NRG/HRG)、およびEGF関連タンパク質リガンドのファミリーが含まれる。ErbB−抗体およびErbB−イムノアドヘシンは臨床試験中であり、ErbB2を過剰発現する転移性乳癌の処置において十分に立証されている。
005235)が含まれる。ErbB1−X、ErbB2−X、ErbB3−X、およびErbB4−Xを実施例3の方法に従って調製する。下記のものをコードする発現ベクターで宿主細胞をトランスフェクションする:
1)ErbB1細胞外ドメインがそれのC−末端においてペプチド結合により自己スプライシングインテインのN−末端の自動開裂部位に連結したものをが有する、プレ−ErbB1−インテインキメラポリペプチド(図48A〜48B);
2)ErbB2細胞外ドメインがそれのC−末端においてペプチド結合により自己スプライシングインテインのN−末端の自動開裂部位に連結したものを含有する、プレ−ErbB2−インテインキメラポリペプチド(図49A〜49B);
3)ErbB3細胞外ドメインがそれのC−末端においてペプチド結合により自己スプライシングインテインのN−末端の自動開裂部位に連結したものを含有する、プレ−ErbB3−インテインキメラポリペプチド(図50A〜50B);および
4)ErbB4細胞外ドメインがそれのC−末端においてペプチド結合により自己スプライシングインテインのN−末端の自動開裂部位に連結したものを含有する、プレ−ErbB4−インテインキメラポリペプチド(図51A〜51B)。
ID NO:191,SEQ ID NO:192, SEQ ID NO:193、およびSEQ ID NO:194(ERBB3);ならびにSEQ ID NO:196, SEQ ID NO:197, SEQ ID NO:198、およびSEQ ID NO:199(ERBB4)。
NO:1を用いて構築され、プラスミドpErbB2−MthはSEQ ID NO:26およびSEQ ID NO:1を用いて構築され、プラスミドpErbB3−Mth
はSEQ ID NO:27およびSEQ ID NO:1を用いて構築され、プラスミドpErbB4−MthはSEQ ID NO:28およびSEQ ID NO:1を用いて構築される。増幅発現について、プラスミドpErbB1−Mth−DHFRはSEQ ID NO:25およびpSVeCD4DHFRを用いて構築され、プラスミドpErbB2−Mth−DHFRはSEQ ID NO:26およびpSVeCD4DHFRを用いて構築され、プラスミドpErbB3−Mth−DHFRはSEQ ID NO:27およびpSVeCD4DHFRを用いて構築され、プラスミドpErbB4−Mth−DHFRはSEQ ID NO:28およびpSVeCD4DHFRを用いて構築される。
Mannheim)100マイクロリットルでコーティングする。プレートを200マイクロリットルの洗浄用緩衝液(PBS/0.05% Tween−20(商標))で2回すすぎ、続いて100マイクロリットルの1% BSA/PBSと共に室温で30分間の短時間インキュベーションを行なう。緩衝液を除去し、各ウェルを100マイクロリットルの試料と共に1% BSA/PBS中で激しい横方向(side−to−side)回転下に1時間インキュベートする。プレートを洗浄用緩衝液で3回すすぎ、種々の量の
非放射性競合ガンマ−HRGおよび125I−HRGβ1を添加して室温で激しい横方向回転下に2〜3時間インキュベートすることにより競合結合を実施する。ウェルを洗浄用緩衝液で速やかに3回すすぎ、排液し、各ウェルをガンマ計数計で計数する。改変Ligandプログラム(Munson, P. and Robard, D. (1980) Analytical Biochemistry 107: 220-239)によりスカッチャード分析を行なう。
ジン取込みを96ウェル方式で実施する。血清枯渇させたMCF7−7細胞を、50:50 F12/DMEM(高グルコース)中、10,000個/ウェルでプレーティングする。種々の濃度の試料を1nM HRGと共にインキュベートし、細胞に添加する。15時間のインキュベーション後、細胞を3H−チミジンで標識し、DNA合成を測定する(20mLの1/20希釈したトリチウム化チミジン原液:Amersham TRA 120 B363,1mCi/ml)。次いで、Packard Filtermate 196ハーベスターを用いてGF/Cユニフィルター(96ウェル方式)上に細胞を回収する。フィルターをPackard Topcount装置により計数する。
本発明は、連続アミノ酸配列/またはそれらを含む化合物を用いて、多様な薬物スクリーニング法のいずれかで化合物をスクリーニングするのに特に有用である。そのような試験に用いる化合物は、溶液中に遊離したもの、固体支持体に固定されたもの、細胞表面に生じたもの、または細胞内にあるもののいずれであってもよい。薬物スクリーニングの1方法は、本発明化合物を発現する組換え核酸で安定に形質転換した真核または原核宿主細胞を用いる。そのような形質転換細胞に対して競合結合アッセイにおいて薬物をスクリーニングする。そのような細胞は、生存形態または固定形態のいずれも、標準結合アッセイに使用できる。たとえば、化合物またはフラグメントと被験物質との複合体形成を測定できる。あるいは、被験物質による、化合物とそのターゲット細胞またはターゲット受容体との複合体形成の減少を調べることができる。
することができる。
合理的な薬物設計の目標は、目的とする生物活性ポリペプチド(すなわち、本発明化合物、または本発明化合物のアミノ酸配列)の構造類似体、またはそれらが相互作用する低分子、すなわちアゴニスト、アンタゴニストもしくは阻害薬を提供することである。これらの例のいずれかを用いて、より活性もしくは安定な形態の本発明化合物もしくは本発明化合物のアミノ酸配列である薬物、または本発明化合物もしくは本発明化合物のアミノ酸配列の機能をインビボで増強もしくは妨害する薬物を、作製できる(参照:Hodgson, Bio/Technology, 9:19-21 (1991))。
とができる。
生物活性のアッセイ
本明細書に開示する化合物は、化合物の連続アミノ酸の区域などその構成要素を含めて、当技術分野で既知である1以上の標準的な生物活性アッセイ法を用いて容易にアッセイできる。下記は限定ではないそのようなアッセイ法の例である:
血管内皮増殖因子(VEGF)により刺激された内皮細胞増殖を本発明化合物が阻害する能力
VEGFにより刺激された内皮細胞増殖を種々の本発明化合物が阻害する能力を試験した。このアッセイにおける陽性試験は、そのような作用が有益となるであろう哺乳動物においてその化合物が内皮細胞増殖を阻害する(たとえば腫瘍の増殖を阻害する)のに有用であることの指標となる。
このアッセイは、被験化合物が網膜ニューロン細胞の生存性を高める効力をもち、したがってたとえば動物における網膜色素変性症(retinitis pigmentosum)、AMDなどによる視力喪失の処置を含めた、網膜の障害または傷害の療法処置に有用であるかを立証することができる。
このアッセイは、本発明の特定の化合物が杆体光受容細胞の生存/増殖を高める作用をもち、したがってたとえば動物における色素性網膜炎、AMDなどによる視力喪失の処置を含めた、網膜の障害または傷害の療法処置に有用であるかどうかを示すために使用できる。生後7日目のSprague Dawley仔ラット(混合集団:グリアおよび網膜神経細胞タイプ)をCO2麻酔後に断頭屠殺し、無菌条件下で眼を摘出する。色素上皮および他の眼組織から神経性網膜を剥離し、次いでCa2+、Mg2+を含まないPBS中の0.25%トリプシンにより解離させて単細胞懸濁液にする。この網膜を37℃で7〜10分間インキュベートした後、1mlの大豆トリプシンインヒビターの添加によりトリプシンを不活性化する。96ウェルプレートにおいて、N2を補充したDMEM/F12中、細胞100,000個/ウェルで細胞をプレーティングする。すべての実験について、細胞を37℃で水飽和した5% CO2雰囲気において増殖させる。2〜3日間の培養後、細胞を4%パラホルムアルデヒドで固定し、次いでCellTracker Green CMFDAにより染色する。視覚色素ロドプシンに対するモノクローナル抗体であるRho 4D2(腹水またはIgG 1:100)を用いて間接的免疫蛍光により杆体光受容細胞を検出する。結果を生存率%として示す:カルセイン総数−培養2〜3日目のロドプシン陽性細胞を、培養2〜3日目のロドプシン陽性細胞の総数で割る。細胞総数(蛍光性)を20x対物倍率でCCDカメラおよびMacIntosh用NIH imageソフトウェアにより定量する。ウェル内の視野をランダムに選択する。
本明細書に開示する化合物が内皮細胞のアポトーシスを誘導する能力を、ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC,Cell Systems)において試験することができる。このアッセイにおける陽性試験は、内皮細胞のアポトーシス誘導が有益となるであろう腫瘍および血管障害の療法処置における、本発明化合物の有用性の指標となる。
50 Microbeta Trilux(Wallac)により分析を実施した。バックグラウンドを超えるパーセントは、陰性対照を超えるカウント/分のパーセント量を表わす。バックグラウンドより30%以上大きいパーセントを陽性とみなす。
このアッセイは、本明細書に開示する化合物がPDB12膵管細胞によるタンパク質産生を阻害する効力をもち、したがって、糖尿病などを含めた膵臓によるタンパク質分泌を伴う障害の療法処置に有用であるかを立証するであろう。
このアッセイは、本明細書に開示する種々の化合物が成体心臓栄養補給(hypertrophy of adult heart)を刺激する能力を測定するために設計された。このアッセイにおける陽性試験は、その化合物が種々の心不全障害の療法処置に有用であると期待されることの指標となる。
このアッセイは、本明細書に開示する種々の化合物がPDB12膵管細胞の増殖を誘導する効力をもち、したがって糖尿病などを含めた膵臓によるタンパク質分泌を伴う障害の療法処置に有用であるかどうかを立証する。
に添加して、最終容量200μLにする。対照は、このアッセイにおいて不活性であることが示されたタンパク質を含有する増殖培地を含む。細胞を37℃で4日間インキュベートする。次いで20μLのAlamar Blue色素(AB)を各ウェルに添加し、AB添加後4時間目に、マイクロタイタープレートリーダーにより530nmの励起および590nmの発光で蛍光の読みを測定する。使用する基準は、ウシ膵臓抽出物(BPE)を含まない細胞、および種々の濃度のBPEを含む細胞である。緩衝液または増殖培地のみの未知のものに由来する対照を各96ウェルプレート上で2回試験する。
このアッセイは、本明細書に開示する種々の化合物が新生児心臓栄養補給を刺激する能力を測定するために設計された。このアッセイにおける陽性試験は、その化合物が種々の心不全障害の療法処置に有用であると期待されることの指標となる。
このアッセイは、本明細書に開示する化合物が刺激されたTリンパ球の増殖の刺激薬として活性であるかを判定するのに用いられる。リンパ球の増殖を刺激する化合物は、免疫応答の増強が有益である場合の療法に有用である。この療法薬は本発明化合物のアンタゴニスト、たとえば本発明化合物に対するネズミ−ヒトキメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体の形をとることができる。
ている。
100:1の、1%または0.1%に希釈した被験試料、
50:1の照射したスティミュレーター細胞、および
50:1のレスポンダーPBMC細胞。
周皮細胞c−Fos誘導
このアッセイは、本明細書に開示する本発明化合物が周皮細胞におけるc−Fos発現を誘導する能力を示し、したがって特定のタイプの周皮細胞関連腫瘍に対する診断マーカーとしてだけでなく、周皮細胞関連腫瘍の療法処置に用いるアンタゴニストを生成するためにも使用されることを示す。詳細には、1日目に周皮細胞をVEC Technologiesから受け取り、フラスコから5ml以外の培地を除去する。2日目に周皮細胞をトリプシン処理し、洗浄し、遠心分離し、次いで96ウェルプレート上にプレーティングする。7日目に培地を除去し、周皮細胞を100μlの被験化合物試料および対照(陽性対照=DME+5%血清+/−PDGF,500ng/ml;陰性対照=プロテイン32)で処理する。二重測定を平均し、SD/CVを判定する。化学発光単位(RLU)ルミノメーター読みで示したプロテイン32(緩衝液対照)値より増加した倍率を、周波数に対してヒストグラム上にプロットする。プロテイン32値より2倍高いものを、このアッセイについて陽性とみなす。アッセイマトリックス:増殖培地=低グルコースDMEM=20% FBS+1xペニシリン/ストレプトマイシン+1xフンギゾン(fungizone)。アッセイ培地=低グルコースDMEM+5% FBS。
本明細書に開示する化合物が軟骨組織からプロテオグリカンの放出を刺激する能力は、下記に従って試験できる。
出の刺激物質であることが知られているインターロイキン−1アルファ18ng/mlと組み合わせて添加する。次いで上清を採集し、1,9−ジメチル−メチレンブルー(DMB)比色アッセイを用いてプロテオグリカンの量をアッセイする(Farndale and Buttle,
Biochem. Biophys. Acta 883:173-177 (1985))。このアッセイにおける陽性結果は、被
験化合物をたとえばスポーツ関連の軟骨問題、関節軟骨欠損、骨関節炎またはリウマチ性関節炎の処置に使用できるであろうということの指標となる。
このアッセイは、本発明化合物が免疫応答を刺激し、動物の注射部位において単核細胞、好酸球およびPMN浸潤の誘導により炎症を誘発するかどうかを試験するために用いられる。免疫応答を刺激する化合物は、免疫応答の刺激が有益である療法に有用である。この皮膚血管透過性アッセイは下記に従って実施される。体重350グラム以上の無毛モルモットをケタミン(ketamine)(75〜80mg/Kg)およびキシラジン(xylazine)5mg/Kgで筋肉内(IM)麻酔する。被験試料である精製した本発明化合物の試料またはコンディショニングした媒質を被験動物の背に、注射部位当たり100μlで皮内注射する。動物当たり約10〜30、好ましくは約16〜24の注射部位が可能である。1μlのエバンスブルー色素(緩衝化生理食塩水中1%)を心臓内注射する。次いで注射部位の斑点(直径mm)を注射の1時間後および6時間後に測定する。注射の6時間後に動物を屠殺した。皮膚注射部位それぞれを組織採取し、ホルマリン中に固定する。次いで皮膚を組織病理学的評価のために調製する。各部位を皮膚への炎症細胞浸潤について評価する。目視できる炎症細胞炎症を伴う部位を陽性と採点する。炎症細胞は、好中球、好酸球、単球またはリンパ球の可能性がある。注射部位に少なくともわずかな血管周囲浸潤があれば陽性と採点し、注射部位に浸潤がないものを陰性と採点する。
このアッセイは、本明細書に開示する化合物が新生児心臓の栄養補給を刺激する能力を測定するために設計された;陽性試験は種々の心不全障害の療法処置における有用性の指標となる。
この例は、1以上の本発明化合物が、刺激されたT−リンパ球の増殖阻害薬として有効であることを示す。リンパ球の増殖を阻害する化合物は、免疫応答の抑制が有益な療法に有用である。
100:1の、1%または0.1%に希釈した被験試料、
50:1の照射したスティミュレーター細胞、および
50:1のレスポンダーPBMC細胞。
本明細書に開示する化合物が内皮細胞のアポトーシスを誘導する能力を、ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC,Cell Systems)において、96ウェル方式により100ng/mlのVEGF、0.1%のBSA、1xペニシリン/ストレプトマイシンを補充した0%血清培地中で試験することができる。
いずれかを療法処置すること、たとえば腫瘍増殖の阻害に対する、本発明化合物の有用性の指標となる。96ウェルプレートのコーティングは、PBS中の0.2%ゼラチン溶液100μlを>30分間、ゲル化させることにより調製できる。ゼラチンミックスを十分に吸引した後、HUVEC細胞を、10%血清含有培地100μl/ウェル中、最終濃度2x104個/mlでプレーティングする。細胞を24時間増殖させた後、目的化合物を含有する被験試料を添加する。
Detection ELISA plus,カタログNo.1 920 685]に従って溶液を調製して、ELISAによりアポトーシスのレベルを測定する。試料の調製:96ウェルプレートを1 krpmで10分間(200g)遠心分離し;速やかに反転して上清を除去し、プレートをペーパータオル上に裏返すことにより残留液体を除去する。各ウェルに200μlの1x細胞溶解用緩衝液を添加し、室温で30分間、振とうせずにインキュベーションを行なう。プレートを1 krpmで10分間遠心沈殿させ、20μlの溶解物(細胞質画分)をストレプトアビジンコーティングしたMTP内へ移す。80μlの免疫試薬ミックスを、各ウェル内の20μlの溶解物に添加した。MTPを粘着性箔で覆い、室温で2時間、オービタルシェーカー(200rpm)に乗せることによりインキュベートした。2時間後、上清を吸引により除去し、ウェルをウェル当たり250μlの1xインキュベーション用緩衝液で3回すすいだ(吸引により除去)。基質溶液(100μl)を各ウェルに添加し、オービタルシェーカー上、室温、250rpmで、発色が測光分析に十分になるまでインキュベートした(約10〜20分後)。96ウェルリーダーを用いてプレートを405nm、基準波長492nmで読み取った。PIN 32(対照緩衝液)について得たレベルを100%に設定した。>130%のレベルをもつ試料をアポトーシス誘導について陽性とみなした。
このアッセイは、本発明化合物がヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC,Cell Systems)においてカルシウムフラックスを刺激する能力を示すかどうかを判定するために設計された。カルシウムフラックスは特定のリガンドがそれらの受容体に結合する際の応答であり、十分な記載がある。このカルシウムインフラックスアッセイで陽性応答を生じる被験化合物は、ヒト内皮細胞において特定の受容体に結合して生物シグナル伝達経路を活性化すると言うことができる。これにより、最終的にはたとえば内皮細胞分裂、内皮細胞増殖阻害、内皮管形成、細胞移動、アポトーシスなどをもたらす可能性がある。
ートする。インキュベーション後、次いで細胞を緩衝液(前記)で3回洗浄し、100μl/ウェルを残す。化合物の被験試料を、異なる96ウェルプレートに、緩衝液中5x濃度で調製する。陽性対照は、50μMイオノマイシン(ionomycin)(5x)に相応する;陰性対照は、プロテイン32に相応する。細胞プレートと試料プレートをFLIPR(Molecular Devices)機器で操作する。FLIPR機器により25μlの被験試料を細胞に添加し、1秒毎に1分間、次いで3秒毎に次の3分間、読取りを行なう。
このアッセイは、本発明化合物が培養された哺乳動物線維芽細胞の増殖を誘導する作用をもち、したがって機能が哺乳動物系における有用な増殖因子であるかを示すであろう。
このアッセイは、本明細書に開示する種々の化合物が成体心臓肥大を阻害する能力を測定するために設計された。このアッセイにおいて陽性を示す化合物は、心臓肥大に関連する心障害の療法処置に有用な可能性がある。
このアッセイは、本発明化合物が内皮細胞においてc−fosを誘導する能力を示すかどうかを判定するために設定された。このアッセイにおいて陽性を示す化合物は、たとえば創傷治癒などを含めた、血管新生が有益である状態または障害の療法処置に有用であると期待されるであろう(これらの化合物のアゴニスト)。このアッセイにおいて陽性を示
す化合物のアンタゴニストは癌性腫瘍の療法処置に有用であると期待されるであろう。
Ham’s F12 w/o GHT:低グルコース、および50% DMEM、グリシンなし;下記を含む:NaHCO3、1%グルタミン、10mM HEPES、10%
FBS、10ng/ml bFGF)中において、96ウェルプレートに細胞密度1x104個/ウェルでプレーティングする。プレーティングの翌日、増殖培地を除去することにより細胞を飢餓状態にし、細胞を100μl/ウェルの被験試料および対照(陽性対照=増殖培地;陰性対照=プロテイン32、緩衝液=10mM HEPES、14mM NaCl、4%(w/v)マンニトール、pH6.8)で処理する。細胞を37℃で30分間、5% CO2中でインキュベートする。試料を取り出し、bDNAキットプロトコル(Chiron Diagnostics,カタログ#6005−037)の第1部に従う;下記に挙げる大文字で始まる試薬/緩衝液はそれぞれキットから得られる。
このアッセイは、本発明化合物が血管透過を誘導する能力を示すかどうかを判定するために設定された。このアッセイにおいて陽性を示す化合物は、たとえば局所免疫系細胞浸潤の増強が有益となる可能性のある状態を含めた、血管透過性増強が有益となる状態の療法処置に有用であると期待される。
本明細書に開示する化合物が内皮細胞のアポトーシスを誘導する能力を、ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC,Cell Systems)において、ゼラチン処理したT175フラスコ内で10継代以内のHUVECを用いて試験する。このアッセイで陽性を示す化合物は、たとえば腫瘍の療法処置を含めて内皮細胞のアポトーシスが有益となるであろう状態の療法処置に有用であると期待される。
このアッセイは、被験化合物が皮質ニューロンにおいてc−fosを誘導する能力を示すかどうかを判定するために設計された。このアッセイで陽性を示す化合物は、ニューロン増殖が有益となるであろう神経系障害および傷害の療法処置に有用であると期待されるであろう。
このアッセイは、本発明化合物が内因性増殖因子の不存在下で内皮性の空胞(vacuole)および内腔(lumen)形成を促進する能力を示すかどうかを判定するために設計された。このアッセイで陽性を示す化合物は、たとえばピノサイトーシス、イオンポンプ作用、血管透過性および/またはジャンクション形成の刺激を含めた内皮空胞および/または内腔形成が有益となるであろう障害の療法処置に有用であると期待されるであろう。
このアッセイは、本発明化合物が骨格筋によるグルコースまたはFFA取込みに影響を与える能力を示すかどうかを判定するために設計された。このアッセイで陽性を示す化合物は、たとえば糖尿病または高もしくは低インスリン血症を含めて骨格筋によるグルコース取込みの刺激または阻害が有益となるであろう障害の療法処置に有用であると期待されるであろう。
このアッセイは、本発明化合物が杆体光受容細胞の生存/増殖を高める作用をする能力をもち、したがってたとえば動物における色素性網膜炎、AMDなどによる視力喪失の処
置を含めた、網膜の障害または傷害の療法処置に有用であることを調べる。
本明細書に開示する化合物の抗増殖活性は、国立癌研究所(National Cancer Institute)(NCI)の発明による疾患指向インビトロ抗癌薬探索アッセイ法で、スルホローダミンB(SRB)色素結合アッセイ法を用いて判定できる;本質的にSkehan et al., J. Natl. Cancer Inst. 82:1107-1112 (1990)に記載の方法。この試験に用いた60の腫瘍細胞系(“NCIパネル”)、ならびにそれらのインビトロでの維持および培養のための条件は、Monks et al., J. Natl. Cancer Inst. 83:757-766 (1991)に記載されている。このスクリーニングの目的は、種々のタイプの腫瘍に対する被験
化合物の細胞毒性および/または細胞増殖抑制活性をまず評価することである(Monks et al.,前掲; Boyd, Cancer: Princ. Pract. Oncol. Update 3(10):1-12 [1989])。
初代ラット脂肪細胞によるグルコースまたはFFA取込みに影響を与える本発明化合物の判定
このアッセイは、本発明化合物が脂肪細胞によるグルコースまたはFFA取込みに影響を与える能力を示すかどうかを判定するために設計された。このアッセイで陽性を示す化合物は、たとえば肥満症、糖尿病または高もしくは低インスリン血症を含めて脂肪細胞によるグルコース取込みの刺激または阻害が有益となるであろう障害の療法処置に有用であると期待されるであろう。
このアッセイは、本発明化合物が軟骨細胞の再分化を誘導し、したがって種々の骨障害および/または軟骨障害、たとえばスポーツ傷害および関節炎の処置に有用であるかどうかを示す。このアッセイは下記に従って実施される。4〜6カ月齢の雌ブタの中手指節関節の関節軟骨を一夜コラゲナーゼ消化することにより、ブタ軟骨細胞を単離する。単離した細胞を、次いで25,000個/cm2で、10%のFBSおよび4μg/mlのゲンタマイシンを含有するHam F−12中において播種する。培養培地を3日目毎に交換し、次いで細胞を96ウェルプレートに5,000個/ウェルで、血清を含まない同培地100μl中において播種し、100μlの被験化合物、5nMのスタウロスポリン(陽性対照)または培地のみ(陰性対照)を添加して、最終容量200μl/ウェルにする。37℃で5日間のインキュベーション後、各ウェルの写真をとり、軟骨細胞の分化状態を判定する。軟骨細胞の再分化が陰性対照より陽性対照の方に類似すると判定された場合、このアッセイにおいて陽性結果となる。
このアッセイは、赤芽細胞系において成体ヘモグロビンから胎児性ヘモグロビンへの移行を誘導する能力について化合物をスクリーニングするのに有用である。このアッセイで陽性を示す化合物は、種々の哺乳動物ヘモグロビン関連障害、たとえば種々のサラセミア(地中海貧血)の療法処置に有用であると期待される。このアッセイは下記に従って実施される。赤芽細胞を、96ウェル方式で、標準増殖培地に1000個/ウェルでプレーティングする。被験化合物を増殖培地に0.2%または2%の濃度で添加し、細胞を37℃で5日間インキュベートする。陽性対照として細胞を100μMヘミンで処理し、陰性対照としては細胞を処理しない。5日後、細胞溶解物を調製し、ガンマグロビン(胎児マーカー)の発現を分析する。このアッセイにおける陽性は、陰性対照より少なくとも2倍高いレベルのガンマグロビンである。
このアッセイは、本発明化合物が哺乳動物腎メサンギウム細胞の増殖を誘導し、したがって、メサンギウム細胞機能低下に関連する腎障害、たとえばベルガー病、またはシェーンライン-ヘノッホ紫斑病、セリアック病、疱疹状皮膚炎もしくはクローン病に関連する
他の腎障害の処置に有用であるかどうかを示す。このアッセイは下記に従って実施される。1日目に、マウス腎メサンギウム細胞を96ウェルプレートにおいて、増殖培地(ダルベッコの改変イーグル培地とHamのF12培地との3:1混合物、95%ウシ胎仔血清
、5%の14mM HEPESを補充)中で一夜増殖させる。2日目に、被験化合物を2種類の濃度(1%および0.1%)で無血清培地中に希釈し、細胞に添加する。対照試料は無血清培地のみである。4日目に、20μlのCell Titer 96 Aqueous one溶解試薬(Progema)を各ウェルに添加し、比色反応を2時間進行させた。次いで490 nmで吸光度(OD)を測定する。陽性対照は、対照の読みより少なくとも15%高い吸光度の読みである。
このアッセイは、本発明化合物が、聴覚有毛細胞前駆体である内耳支持細胞に対して有効なマイトジェンとして作用し、したがって、哺乳動物において聴覚有毛細胞の再生を誘導して難聴を処置するのに有用であることを判定するために用いられる。このアッセイは下記に従って実施される。ラットUEC−4卵形嚢(utricular)上皮細胞を、96ウェルプレートに3000個/ウェルの密度で200μlの血清含有培地中において33℃で分配する。細胞を一夜培養し、次いで無血清培地、37℃に切り換える。本発明化合物の種々の希釈液(または対照については化合物なし)を次いで培養物に添加し、細胞を24時間インキュベートする。24時間のインキュベーション後、3H−チミジン(1μCi/ウェル)を添加し、次いで細胞をさらに24時間培養する。次いで培養物を洗浄して、取り込まれていない放射性標識を除去し、細胞を回収し、Cpm/ウェルを測定する。対照培養と比較して少なくとも30%高いCpmを、このアッセイにおける陽性とみなす。
このアッセイは、本発明化合物が培養された軟骨細胞の増殖および/または再分化を誘導する能力を示すかどうかを判定するために設計された。このアッセイで陽性を示す化合物は、種々の骨障害および/または軟骨障害、たとえばスポーツ傷害および関節炎の療法処置に有用であると期待されるであろう。
このアッセイは、本発明化合物がLIFおよびエンドセリン−1(ET−1)により誘発される新生児心臓肥大を抑制する能力を示すかどうかを判定するために設計された。このアッセイで陽性応答を与える被験化合物は、心筋の不都合な肥大を特徴とするかまたはそれに関連する心不全性の疾患または障害の療法処置に有用であろう。
に直接添加する。次いで3日目に、LIF+ET−1をウェルに添加する。さらに2日間の培養後に細胞を染色し、次いで翌日に目視採点する。化合物処理した心筋細胞が非処理心筋細胞より平均して視覚的に小さい場合、または個数が少ない場合、このアッセイにおいて陽性となる。
Claims (203)
- 下記を含む化合物:
連続アミノ酸の第1区域:そのそれぞれはその前のアミノ酸にペプチド結合により結合しており、その配列はあるターゲットに対する結合部位を含む;および
連続アミノ酸の第2区域:そのそれぞれはその前のアミノ酸にペプチド結合により結合しており、その配列は連続アミノ酸の第1区域の配列と同一であり、かつ前記ターゲットに対する同一結合部位を含む;
その際、アミノ酸の第1区域およびアミノ酸の第2区域はそれぞれ、その予め定めた末端にシステイン残基またはセレノシステイン残基を有し、それらのシステイン残基またはそれらのセレノシステイン残基は下記の構造を有する結合で連結している:
- 請求項1の化合物であって、結合が下記の構造を有する化合物:
- 請求項1の化合物であって、結合が下記の構造を有する化合物:
- 請求項1の化合物であって、連続アミノ酸の第1区域および第2区域のそれぞれの予め定めた末端にある残基がシステイン残基である化合物。
- 請求項1の化合物であって、連続アミノ酸の第1区域および第2区域のそれぞれの予め定めた末端にある残基がセレノシステイン残基である化合物。
- 請求項1の化合物であって、連続アミノ酸の第1区域または連続アミノ酸の第2区域が少なくとも20個のアミノ酸を含む化合物。
- 請求項1の化合物であって、連続アミノ酸の第1区域または連続アミノ酸の第2区域が少なくとも100個のアミノ酸を含む化合物。
- 下記を含む化合物:
連続アミノ酸の第1区域:そのそれぞれはその前のアミノ酸にペプチド結合により結合しており、その配列はあるターゲットに対する結合部位を含む;および
連続アミノ酸の第2区域:そのそれぞれはその前のアミノ酸にペプチド結合により結合しており、その配列は連続アミノ酸の第1区域の配列と異なり、かつ異なる部分に対する
結合部位を含む;
その際、アミノ酸の第1区域およびアミノ酸の第2区域はそれぞれ、その予め定めた末端にシステイン残基またはセレノシステイン残基を有し、それらの残基は下記の構造を有する結合で連結している:
- 請求項8の化合物であって、結合が下記の構造を有する化合物:
- 請求項8の化合物であって、結合が下記の構造を有する化合物:
- 請求項8の化合物であって、結合が下記の構造を有する化合物:
- 請求項8の化合物であって、結合が下記の構造を有する化合物:
- 請求項8の化合物であって、アミノ酸の第1区域およびアミノ酸の第2区域のそれぞれの予め定めた末端にある残基が両方ともシステイン残基である化合物。
- 請求項8の化合物であって、アミノ酸の第1区域およびアミノ酸の第2区域のそれぞれの予め定めた末端にある残基が両方ともセレノシステイン残基である化合物。
- 請求項8の化合物であって、連続アミノ酸の第1区域または第2区域のうちの1つの予め定めた一方の末端にある残基がシステイン残基であり、予め定めた他方の末端にある残基がセレノシステイン残基である化合物。
- 請求項8の化合物であって、連続アミノ酸の第1区域または連続アミノ酸の第2区域が少なくとも20個のアミノ酸を含む化合物。
- 請求項8の化合物であって、連続アミノ酸の第1区域または連続アミノ酸の第2区域が少なくとも100個のアミノ酸を含む化合物。
- 請求項1または8のいずれかに記載される2以上の同一化合物が少なくとも1つの結合により互いに連結したものを含む多量体。
- 請求項18の多量体であって、二量体である多量体。
- 請求項18の多量体であって、三量体である多量体。
- 請求項18の多量体であって、四量体である多量体。
- 請求項1または8のいずれかの化合物であって、アミノ酸の第1区域とアミノ酸の第2区域の両方の予め定めた末端がそのN−末端である化合物。
- 請求項1または8のいずれかの化合物であって、アミノ酸の第1区域とアミノ酸の第2区域の両方の予め定めた末端がそのC−末端である化合物。
- 請求項1または8のいずれかの化合物であって、アミノ酸の第1区域およびアミノ酸の第2区域のうちの一方の予め定めた末端がC末端であり、他方の予め定めた末端がN末端である化合物。
- 請求項1または8の化合物であって、アミノ酸の第1区域がL−アミノ酸を含む化合物。
- 請求項1または8の化合物であって、アミノ酸の第1区域がD−アミノ酸を含む化合物。
- 請求項1または8の化合物であって、アミノ酸の第1区域がL−アミノ酸およびD−アミノ酸を含む化合物。
- 請求項8の化合物であって、アミノ酸の第2区域がL−アミノ酸を含む化合物。
- 請求項8の化合物であって、アミノ酸の第2区域がD−アミノ酸を含む化合物。
- 請求項8の化合物であって、アミノ酸の第2区域がL−アミノ酸およびD−アミノ酸を含む化合物。
- 請求項1または8の化合物であって、アミノ酸の第1区域が少なくとも50個の連続アミノ酸を含む化合物。
- 請求項8の化合物であって、アミノ酸の第2区域が少なくとも50個の連続アミノ酸を含む化合物。
- 請求項1または8の化合物であって、アミノ酸の第1区域が1種類より多いアミノ酸を含む化合物。
- 請求項1または8の化合物であって、アミノ酸の第2区域が1種類より多いアミノ酸残基
を含む化合物。 - 請求項18の多量体であって、1以上の結合がジスルフィド結合を含む多量体。
- 請求項8の化合物であって、アミノ酸の第2区域の配列が免疫グロブリンの定常部の配列に相応する化合物。
- 請求項8の化合物であって、免疫グロブリンがヒト免疫グロブリンである化合物。
- 請求項8の化合物であって、免疫グロブリンの定常部が、IgG、IgA、IgE、IgD、またはIgM免疫グロブリンの定常部である化合物。
- 請求項8の化合物であって、免疫グロブリンの定常部が、IgG−1、IgG−2、IgG−3、またはIgG−4免疫グロブリンの定常部である化合物。
- 請求項8の化合物であって、免疫グロブリンの定常部がIgG免疫グロブリンの定常部であり、そして、ヒンジ部、CH6領域およびCH3領域を含む化合物。
- 請求項8の化合物であって、異なる部分がイムノエフェクターまたはイムノレギュレーターである化合物。
- 請求項1または8の化合物であって、ターゲットがタンパク質である化合物。
- 請求項1または8の化合物であって、ターゲットが、EGF受容体、HER2、VEGF受容体、CD20抗原、CD11a、IgE免疫グロブリン、グリコプロテインIIa受容体、グリコプロテインIIIa受容体、TNFアルファ、またはTNF受容体、gp120である化合物。
- 請求項1の化合物であって、連続アミノ酸の第1区域および第2区域のそれぞれが、TNFRSF1a、TNFRSF1b、VEGFR1、VEGFR6、VEGFR3、ヒトErb1、ヒトErb2、ヒトErb6、ヒトErb3、またはヒトErb4のうちのいずれか1つのアミノ酸配列を含む化合物。
- 請求項8の化合物であって、連続アミノ酸の第1区域または第2区域が、前記のTNFRSF1a、TNFRSF1b、VEGFR1、VEGFR6、VEGFR3、ヒトErb1、ヒトErb2、ヒトErb6、ヒトErb3、またはヒトErb4のうちのいずれか1つのアミノ酸配列を含む化合物。
- ターゲットを結合するのに有効な量の請求項1の化合物、およびキャリヤーを含む、組成物。
- ターゲットを結合するのに有効な量の請求項8の化合物、およびキャリヤーを含む、組成物。
- ターゲットを結合するのに有効な量の請求項18の多量体、およびキャリヤーを含む、組成物。
- 請求項48の組成物であって、多量体が異なる部分をも結合するのに有効な量で存在する組成物。
- 請求項46、47、48または49のいずれか1項の組成物であって、キャリヤーが医薬的に許容できるキャリヤーである組成物。
- ターゲットの活性に影響を及ぼす方法であって、化合物がターゲットに結合してその活性に影響を及ぼす条件下で、ターゲットを請求項46、47、48または49の組成物と接触させることを含む方法。
- 請求項51の方法であって、ターゲットへの組成物の結合によりターゲットの活性が増大する方法。
- 請求項51の方法であって、ターゲットへの組成物の結合によりターゲットの活性が低下する方法。
- 請求項51の方法であって、ターゲットが、EGF受容体、HER2タンパク質、VEGF受容体、CD20抗原、CD11a、IgE免疫グロブリン、グリコプロテインIIa受容体、グリコプロテインIIIa受容体、TNFアルファ、またはTNF受容体である方法。
- 請求項1、8または18のいずれかの組成物、および連続アミノ酸の第3区域を含む複合体であって、連続アミノ酸の第3区域が連続アミノ酸の第1区域または第2区域のうち一方に1またはそれ以上の結合により結合している複合体。
- 請求項55の複合体であって、1またはそれ以上の結合がファンデルワールス力を含む複合体。
- 請求項55の複合体であって、1またはそれ以上の結合が水素結合を含む複合体。
- 請求項55の複合体であって、1または結合が共有結合を含む複合体。
- 請求項55の複合体であって、1または結合がジスルフィド結合を含む複合体。
- 請求項18の多量体であって、少なくとも1つの結合がジスルフィド結合である多量体。
- 請求項18の多量体であって、ジスルフィド結合が2つの非末端アミノ酸残基の間にある多量体。
- 請求項18の多量体であって、ジスルフィド結合が2つのアミノ酸残基の間にあり、それらのうち少なくとも一方は非末端アミノ酸残基である多量体。
- 請求項1の化合物を調製する方法であって、下記を含む方法:
(a)(i)その配列がN−末端シグナル配列である第1部分、これと接した(ii)その配列が連続アミノ酸の区域をコードする第2部分、これと接した(iii)その配列がC−末端インテイン含有結合ドメインをコードする第3部分を含む、組換え核酸により、連続アミノ酸の区域がC−末端インテイン含有結合ドメインと接したものを含むキメラポリペプチドの合成を可能にする条件下で、細胞をトランスフェクションし;
(b)工程(a)で産生されたキメラポリペプチドを単離し;
(c)キメラポリペプチドを、連続アミノ酸の区域からC−末端インテイン含有結合ドメインのチオ仲介開裂が起き、それがC−末端チオエステルで置換されるように処理し;
(d)工程(c)の生成物を、生成物へのシステイン残基の結合が可能となり、これによりC−末端システインを含む生成物が形成されるように処理し;そして
(e)工程(e)の生成物を工程(e)の別の生成物の存在下において、前記化合物の形成が可能な条件下で酸化する。 - 請求項63の方法であって、組換え核酸がSEQ ID NO.1〜8のいずれかの1つに示す配列を有する方法。
- 請求項63の方法であって、C−末端インテイン含有結合ドメインがインテイン−キチン結合ドメインである方法。
- 請求項63の方法であって、C−末端インテイン含有結合ドメインがMth RIR1インテイン−キチン結合ドメインである方法。
- 請求項63の方法であって、工程b)においてアフィニティークロマトグラフィーによりキメラポリペプチドを単離する方法。
- 請求項63の方法であって、工程b)において生成物をキチン誘導体化樹脂に曝露することによりキメラポリペプチドを単離する方法。
- 請求項63の方法であって、酸化条件は生成物それぞれのC−末端システイン間にジスルフィド結合の形成が可能になるものである方法。
- 独立してフォールディングするタンパク質ドメインが第2の独立してフォールディングするタンパク質ドメインに非ペプチド結合により融合したものを含む化合物。
- 末端システイン残基を含む第1ポリペプチド鎖がそれのS−末端において末端システイン残基を含む第2ポリペプチド鎖のS−末端に融合したものを含む化合物。
- 末端セレノシステイン残基を含む第1ポリペプチド鎖がそれのSe−末端において末端システイン残基を含む第2ポリペプチド鎖のS−末端に融合したものを含む化合物。
- 末端セレノシステイン残基を含む第1ポリペプチド鎖がそれのSe−末端において末端セレノシステイン残基を含む第2ポリペプチド鎖のSe−末端に融合したものを含む化合物。
- 請求項70〜73のいずれかの1項に記載される2以上の同一化合物が少なくとも1つの結合により互いに連結したものを含む多量体。
- N−末端システインを含む連続アミノ酸の区域を調製する方法であって、下記を含む方法:
(a)(i)その配列がN−末端シグナル配列をコードする第1部分、これと接した(ii)その配列がN−末端システイン残基を含む連続アミノ酸の区域をコードする第2部分を含む、組換え核酸により、下記を可能にする条件下で細胞をトランスフェクションし:(i)N−末端シグナル配列がそれのC−末端においてペプチド結合により連続アミノ酸の区域のN−末端システインに連結したものを含む、キメラポリペプチドが合成され、そして(ii)N−末端シグナル配列が細胞内でキメラポリペプチドから開裂し、これによりN−末端システインを含む連続アミノ酸の区域が産生される;
(b)工程(a)で産生された連続アミノ酸の区域を回収する。 - 請求項75の方法であって、連続アミノ酸の区域が免疫グロブリンFcポリペプチドを含む方法。
- 請求項76の方法であって、免疫グロブリンFcポリペプチドがヒト免疫グロブリンFcポリペプチドである方法。
- 請求項77の方法であって、N−末端システイン残基がヒト免疫グロブリンFcポリペプチドのCys−5残基である方法。
- 請求項75の方法であって、細胞が293ヒト胚細胞またはCHO−K1ハムスター卵巣細胞である方法。
- 請求項75の方法であって、トランスフェクションがプラスミドpSAを用いて実施される方法。
- 請求項75の方法であって、N−末端シグナル配列がN−末端システインを有するタンパク質から選択される方法。
- 請求項75の方法であって、シグナルペプチドがソニックヘッジホッグ、インターフェロンアルファ−2またはコレステロールエステルトランスフェラーゼである方法。
- 請求項75の方法であって、連続アミノ酸の区域をアフィニティークロマトグラフィーにより回収する方法。
- 請求項75の方法であって、細胞内でのキメラポリペプチドの開裂が細胞性シグナルペプチダーゼにより行なわれる方法。
- N−末端システインまたはセレノシステインを含む連続アミノ酸の区域を調製する方法であって、下記を含む方法:
(a)(i)その配列がN−末端シグナル配列をコードする第1部分、これと接した(ii)その配列がN−末端システイン残基を含む連続アミノ酸の区域をコードする第2部分を含む、組換え核酸により、下記を可能にする条件下で細胞をトランスフェクションし:(i)N−末端シグナル配列がそれのC−末端においてFcポリペプチドのN−末端システインに連結したものを含む、キメラポリペプチドが合成され、そして(ii)N−末端シグナル配列が細胞内でキメラポリペプチドから開裂し、これによりN−末端システインを含む連続アミノ酸の区域が産生される;
(b)工程(a)で産生された連続アミノ酸の区域のN−末端を、アミノ酸配列cys−asp−lys−thr−his−thrを含むペプチドのC−末端と、またはアミノ酸配列sec−asp−lys−thr−his−thrを含むペプチドとライゲートさせ、これによりN−末端システインまたはセレノシステインを含む連続アミノ酸の区域を生成させ;そして
(c)工程(b)で生成した連続アミノ酸の区域を回収する。 - 請求項85の方法であって、連続アミノ酸の区域が免疫グロブリンFcポリペプチドを含む方法。
- 請求項85の方法であって、免疫グロブリンFcポリペプチドがヒト免疫グロブリンFcポリペプチドである方法。
- 請求項87の方法であって、N−末端システイン残基がヒト免疫グロブリンFcポリペプチドのcys−5残基である方法。
- 請求項85の方法であって、N−末端システイン残基がヒト免疫グロブリンFcポリペプチドのcys−11残基である方法。
- 請求項85の方法であって、工程(b)のペプチドがアミノ酸配列cys−asp−lys−thr−his−thrを含み、生成した連続アミノ酸の区域がN−末端システインを含む方法。
- 請求項85の方法であって、工程(b)のペプチドがアミノ酸配列sec−asp−lys−thr−his−thrを含み、生成した連続アミノ酸の区域がN−末端セレノシステインを含む方法。
- 請求項85の方法であって、工程(b)のペプチドをライゲーションの前にN−末端Msc保護基で保護する方法。
- 請求項85の方法であって、細胞が293ヒト胚細胞またはCHO−K1ハムスター卵巣細胞である方法。
- 請求項85の方法であって、トランスフェクションがプラスミドpSAを用いて実施される方法。
- 請求項85の方法であって、N−末端シグナル配列がN−末端システインを有するタンパク質から選択される方法。
- 請求項85の方法であって、シグナルペプチドがソニックヘッジホッグ、インターフェロンアルファ−2またはコレステロールエステルトランスフェラーゼである方法。
- 請求項85の方法であって、連続アミノ酸の区域をアフィニティークロマトグラフィーにより回収する方法。
- 請求項85の方法であって、細胞内でのキメラポリペプチドの開裂が細胞性シグナルペプチダーゼにより行なわれる方法。
- C−末端システインまたはC−末端セレノシステインを含む連続アミノ酸の区域を調製する方法であって、下記を含む方法:
(a)(i)その配列がN−末端シグナル配列をコードする第1部分、これと接した(ii)その配列が連続アミノ酸の区域をコードする第2部分、これと接した(iii)その配列がC−末端インテイン含有結合ドメインをコードする第3部分を含む、組換え核酸により、下記を可能にする条件下で細胞をトランスフェクションし:(i)N−末端シグナル配列、これと接した連続アミノ酸の区域、これと接したC−末端インテイン含有結合ドメインを含む、キメラポリペプチドが合成され、そして(ii)N−末端シグナル配列がキメラポリペプチドから開裂し、これによりN−末端リジン残基を有しかつ連続アミノ酸の区域がC−末端インテイン含有結合ドメインと接したものを含む、第2キメラポリペプチドが産生される;
(b)工程(a)で産生された第2キメラポリペプチドを単離し;
(c)第2キメラポリペプチドを、連続アミノ酸の区域からC−末端インテイン含有結合ドメインのチオ仲介開裂が起き、これによりC−末端チオエステルが形成されるように処理し;
(d)工程(c)の生成物をそれのC−末端においてシステイン残基またはセレノシステイン残基とライゲートさせ、これによりC−末端システインまたはC−末端セレノシステインを含む生成物を形成させ;そして
(e)工程(d)の生成物を回収する。 - 請求項99の方法であって、接した連続アミノ酸の区域がIgG免疫グロブリンFcポリペプチドおよびIgG M1エキソンを含む方法。
- 請求項100の方法であって、IgG免疫グロブリンがヒトIgG免疫グロブリンである方法。
- 請求項99の方法であって、接した連続アミノ酸の区域がCD4細胞外ドメインを含む方法。
- 請求項99の方法であって、N−末端シグナル配列がN−末端リジンを有するタンパク質から選択される方法。
- 請求項99の方法であって、N−末端シグナル配列がCD2 T細胞表面糖タンパク質またはCD4 T細胞表面糖タンパク質である方法。
- 請求項99の方法であって、細胞が293ヒト胚細胞またはCHO−K1ハムスター卵巣細胞である方法。
- 請求項99の方法であって、トランスフェクションがプラスミドpSAを用いて実施される方法。
- 請求項99の方法であって、C−末端インテイン含有結合ドメインがインテイン−キチン結合ドメインである方法。
- 請求項99の方法であって、C−末端インテイン含有結合ドメインがMth RIR1インテイン−キチン結合ドメインである方法。
- 請求項99の方法であって、C−末端インテイン含有結合ドメインが自己スプライシングインテイン含有結合ドメインである方法。
- 請求項99の方法であって、工程b)において生成物をキチン誘導体化樹脂に曝露することによりキメラポリペプチドを単離する方法。
- 請求項99の方法であって、細胞内での第2キメラポリペプチドの開裂が細胞性シグナルペプチダーゼにより行なわれる方法。
- 請求項99の方法であって、工程(c)の生成物がシステイン残基とライゲートさせる方法。
- 請求項99の方法であって、工程(c)の生成物がセレノシステイン残基とライゲートさせる方法。
- N−末端システインおよびC−末端システインまたはセレノシステインを含む連続アミノ酸の区域を調製する方法であって、下記を含む方法:
(a)(i)その配列がN−末端シグナル配列をコードする第1部分、これと接した(ii)その配列が連続アミノ酸の区域をコードする第2部分、これと接した(iii)その配列がC−末端インテイン含有結合ドメインをコードする第3部分を含む、組換え核酸により、下記を可能にする条件下で細胞をトランスフェクションし:(i)N−末端シグ
ナル配列、これと接した連続アミノ酸の区域、これと接したC−末端インテイン含有結合ドメインを含む、キメラポリペプチドが合成され、そして(ii)N−末端シグナル配列がキメラポリペプチドから開裂し、これによりN−末端システイン残基を有しかつ連続アミノ酸の区域がC−末端インテイン含有結合ドメインと接したものを含む、第2キメラポリペプチドが産生される;
(b)工程(a)で産生された第2キメラポリペプチドを単離し;
(c)第2キメラポリペプチドを、連続アミノ酸の区域からC−末端インテイン含有結合ドメインのチオ仲介開裂が起き、これによりC−末端チオエステルが形成されるように処理し;
(d)工程(c)の生成物をそれのC−末端においてシステイン残基またはセレノシステイン残基とライゲートさせ、これによりC−末端システインまたはC−末端セレノシステインを含む生成物を形成させ;そして
(e)工程(d)の生成物を回収する。 - 請求項114の方法であって、接した連続アミノ酸の区域がIgG免疫グロブリンFcポリペプチドおよびIgG M1エキソンを含む方法。
- 請求項115の方法であって、IgG免疫グロブリンがヒトIgG免疫グロブリンである方法。
- 請求項114の方法であって、N−末端シグナル配列がN−末端システインを有するタンパク質から選択される方法。
- 請求項114の方法であって、N−末端システイン残基がヒト免疫グロブリンFcポリペプチドのcys−5残基である方法。
- 請求項114の方法であって、N−末端システイン残基がヒト免疫グロブリンFcポリペプチドのcys−11残基である方法。
- 請求項114の方法であって、N−末端シグナルがソニックヘッジホッグ、インターフェロンアルファ−2またはコレステロールエステルトランスフェラーゼである方法。
- 請求項114の方法であって、細胞が293ヒト胚細胞またはCHO−K1ハムスター卵巣細胞である方法。
- 請求項114の方法であって、トランスフェクションがプラスミドpSAを用いて実施される方法。
- 請求項114の方法であって、C−末端インテイン含有結合ドメインがインテイン−キチン結合ドメインである方法。
- 請求項114の方法であって、C−末端インテイン含有結合ドメインがMth RIR1インテイン−キチン結合ドメインである方法。
- 請求項114の方法であって、C−末端インテイン含有結合ドメインが自己スプライシングインテイン含有結合ドメインである方法。
- 請求項114の方法であって、工程b)において生成物をキチン誘導体化樹脂に曝露することにより第2キメラポリペプチドを単離する方法。
- 請求項114の方法であって、工程e)においてアフィニティークロマトグラフィーにより生成物を回収する方法。
- 請求項114の方法であって、細胞内でのキメラポリペプチドの開裂が細胞性シグナルペプチダーゼにより行なわれる方法。
- 請求項114の方法であって、工程(c)の生成物がシステイン残基とライゲートさせる方法。
- 請求項114の方法であって、工程(c)の生成物がセレノシステイン残基とライゲートさせる方法。
- N−末端システインまたはセレノシステインおよびC−末端システインまたはセレノシステインを含む連続アミノ酸の区域を調製する方法であって、下記を含む方法:
(a)(i)その配列がN−末端シグナル配列をコードする第1部分、これと接した(ii)その配列が連続アミノ酸の区域をコードする第2部分、これと接した(iii)その配列がC−末端インテイン含有結合ドメインをコードする第3部分を含む、組換え核酸により、下記を可能にする条件下で細胞をトランスフェクションし:(i)N−末端シグナル配列、これと接した連続アミノ酸の区域、これと接したC−末端インテイン含有結合ドメインを含む、キメラポリペプチドが合成され、そして(ii)N−末端シグナル配列がキメラポリペプチドから開裂し、これによりN−末端システイン残基を有しかつ連続アミノ酸の区域がC−末端インテイン含有結合ドメインと接したものを含む、第2キメラポリペプチドが産生される;
(b)工程(a)で産生された第2キメラポリペプチドを単離し;
(c)(i)工程(a)で産生された連続アミノ酸の区域のN−末端を、cys−asp−lys−thr−his−thrを含むペプチドのC−末端と、またはアミノ酸配列sec−asp−lys−thr−his−thrを含むペプチドとライゲートさせ、これによりそれぞれN−末端システインまたはN−末端セレノシステインを含む連続アミノ酸の区域を形成させ;(ii)キメラポリペプチドを、連続アミノ酸の区域からC−末端インテイン含有結合ドメインのチオ仲介開裂が起き、それがC−末端チオエステルで置換されるように処理し;(iii)工程(c)の生成物をそれのC−末端においてシステイン残基またはセレノシステイン残基とライゲートさせ、これによりC−末端システインまたはセレノシステインを含む生成物を形成させ;そして
(d)工程(c)(iii)の生成物を回収する。 - 請求項131の方法であって、接した連続アミノ酸の区域がIgG免疫グロブリンFcポリペプチドおよびIgG M1エキソンを含む方法。
- 請求項132の方法であって、IgG免疫グロブリンがヒトIgG免疫グロブリンである方法。
- 請求項131の方法であって、N−末端シグナル配列がN−末端システインを有するタンパク質から選択される方法。
- 請求項131の方法であって、N−末端システイン残基がヒト免疫グロブリンFcポリペプチドのcys−11残基である方法。
- 請求項131の方法であって、N−末端シグナル配列がN−末端システインを有するタンパク質から選択される方法。
- 請求項131の方法であって、N−末端シグナルがソニックヘッジホッグ、インターフェロンアルファ−2またはコレステロールエステルトランスフェラーゼである方法。
- 請求項131の方法であって、細胞が293ヒト胚細胞またはCHO−K1ハムスター卵巣細胞である方法。
- 請求項131の方法であって、トランスフェクションがプラスミドpSAを用いて実施される方法。
- 請求項131の方法であって、C−末端インテイン含有結合ドメインがインテイン−キチン結合ドメインである方法。
- 請求項131の方法であって、C−末端インテイン含有結合ドメインがMth RIR1インテイン−キチン結合ドメインである方法。
- 請求項131の方法であって、工程b)において生成物をキチン誘導体化樹脂に曝露することによりキメラポリペプチドを単離する方法。
- 請求項131の方法であって、免疫グロブリンFcポリペプチドがヒト免疫グロブリンFcポリペプチドである方法。
- 請求項131の方法であって、FcポリペプチドのN−末端システイン残基がcys−11残基である方法。
- 請求項131の方法であって、工程(c)(i)のペプチドがアミノ酸配列cys−asp−lys−thr−his−thrを含み、生成した連続アミノ酸の区域がN−末端システインを含む方法。
- 請求項131の方法であって、工程(c)(i)のペプチドがアミノ酸配列sec−asp−lys−thr−his−thrを含み、生成した連続アミノ酸の区域がN−末端セレノシステインを含む方法。
- 請求項131の方法であって、工程(c)(i)のペプチドをライゲーションの前にN−末端Msc保護基で保護する方法。
- 請求項131の方法であって、細胞が293ヒト胚細胞またはCHO−K1ハムスター卵巣細胞である方法。
- 請求項131の方法であって、トランスフェクションがプラスミドpSAを用いて実施される方法。
- 請求項131の方法であって、N−末端シグナル配列がN−末端システインを有するタンパク質から選択される方法。
- 請求項131の方法であって、シグナルペプチドがソニックヘッジホッグ、インターフェロンアルファ−2またはコレステロールエステルトランスフェラーゼである方法。
- 請求項131の方法であって、連続アミノ酸の区域をアフィニティークロマトグラフィーにより回収する方法。
- 請求項131の方法であって、工程(c)を工程(c)(i);工程(c)(ii);工程(c)(iii)の順序で実施する方法。
- 請求項131の方法であって、工程(c)を工程(c)(ii);工程(c)(iii);工程(c)(i)の順序で実施する方法。
- 下記の連続アミノ酸の区域を還元条件下で接触させてこれにより化合物を製造すること含む、化合物の製造方法:連続アミノ酸の区域:そのそれぞれはその前のアミノ酸にペプチド結合により結合しており、その配列はあるターゲットに対する結合部位を含む;および連続アミノ酸の第2区域:そのそれぞれはその前のアミノ酸にペプチド結合により結合しており、その配列は連続アミノ酸の第1区域の配列と同一であり、かつ前記ターゲットに対する同一結合部位を含む;その際、アミノ酸の第1区域およびアミノ酸の第2区域はそれぞれ、その予め定めた末端にシステイン残基またはセレノシステイン残基を含む。
- 下記の連続アミノ酸の区域を還元条件下で接触させてこれにより化合物を製造すること含む、化合物の製造方法:連続アミノ酸の区域:そのそれぞれはその前のアミノ酸にペプチド結合により結合しており、その配列はあるターゲットに対する結合部位を含む;および連続アミノ酸の第2区域:そのそれぞれはその前のアミノ酸にペプチド結合により結合しており、その配列は連続アミノ酸の第1区域の配列と異なり、かつ前記ターゲットに対する同一結合部位を含む;その際、アミノ酸の第1区域およびアミノ酸の第2区域はそれぞれ、その予め定めた末端にシステイン残基またはセレノシステイン残基を含む。
- 請求項155または156の方法であって、還元条件が連続アミノ酸の区域を変性させない方法。
- 請求項155または156の方法であって、還元条件が、Tris−HCLおよびメルカプトエタノールを含む緩衝液に連続アミノ酸の区域を曝露することを含む方法。
- 請求項158の方法であって、緩衝液がpH7.6〜8.4である方法。
- 請求項158の方法であって、緩衝液がpH8である方法。
- 請求項158の方法であって、さらに生成物を酸化用緩衝液中へ入れ替えることを含む方法。
- 請求項155または156の方法であって、連続アミノ酸の区域がCD4細胞外ドメインを含む方法。
- 請求項155または156の方法であって、連続アミノ酸の区域が免疫グロブリンFcポリペプチドの配列を含む方法。
- 請求項163の方法であって、免疫グロブリンがヒト免疫グロブリンである方法。
- 下記を含む化合物:
連続アミノ酸の第1区域:そのそれぞれはその前のアミノ酸にペプチド結合により結合しており、その配列はあるターゲットに対する結合部位を含む;および
連続アミノ酸の第2区域:そのそれぞれはその前のアミノ酸にペプチド結合により結合しており、その配列は連続アミノ酸の第1区域の配列と同一であり、かつ前記ターゲットに対する同一結合部位を含む;
その際、アミノ酸の第1区域およびアミノ酸の第2区域はそれぞれ独立して、その予め
定めた末端に、硫黄(S)またはセレン(Se)を含む直鎖状脂肪族側鎖酸を有する天然アミノ酸または非天然アミノを有し、それらの硫黄(S)またはセレン(Se)は下記の構造を有する結合で連結している:
- 請求項165の化合物であって、天然アミノ酸がホモシステインまたはホモセレノシステインである化合物。
- 請求項165の化合物であって、アミノ酸の第1区域および第2区域がその予め定めた末端にホモシステイン残基を有する化合物。
- 請求項165の化合物であって、アミノ酸の第1区域および第2区域がその予め定めた末端にホモセレノシステイン残基を有する化合物。
- 請求項165の化合物であって、アミノ酸の第1区域および第2区域がその予め定めた末端にホモシステイン残基を有する化合物。
- 請求項168または169の化合物であって、予め定めた末端がC−末端である化合物。
- 下記を含む化合物:
連続アミノ酸の第1区域:そのそれぞれはその前のアミノ酸にペプチド結合により結合しており、その配列はあるターゲットに対する結合部位を含む;および
連続アミノ酸の第2区域:そのそれぞれはその前のアミノ酸にペプチド結合により結合しており、その配列は連続アミノ酸の第1区域の配列と異なり、かつ異なる部分に対する結合部位を含む;
その際、アミノ酸の第1区域およびアミノ酸の第2区域はそれぞれ独立して、その予め定めた末端に、硫黄(S)またはセレン(Se)を含む直鎖状脂肪族側鎖酸を有する天然アミノ酸または非天然アミノを有し、それらの硫黄(S)またはセレン(Se)は下記の構造を有する結合で連結している:
- 請求項171の化合物であって、天然アミノ酸がホモシステインまたはホモセレノシステインである化合物。
- 請求項171の化合物であって、アミノ酸の第1区域および第2区域がその予め定めた末端にホモシステイン残基を有する化合物。
- 請求項171の化合物であって、アミノ酸の第1区域および第2区域がその予め定めた末端にホモセレノシステイン残基を有する化合物。
- 請求項171の化合物であって、アミノ酸の第1区域および第2区域がその予め定めた末端にホモシステイン残基を有する化合物。
- 請求項174または175の化合物であって、予め定めた末端がC−末端である化合物。
- 第1ポリペプチドがインテインと接し、このインテインが結合ドメインを含む第2ポリペプチドと接したものを含む、タンパク質を製造する方法であって、動物細胞に動物細胞が該タンパク質を発現および分泌する条件下で核酸をトランスフェクションすることを含み、この核酸が(i)該ポリペプチドをコードする第1部分、これと接した(ii)インテインをコードする第2部分、これと接した、結合ドメインをコードする第3部分を含む、前記方法。
- 請求項177の方法であって、動物細胞が哺乳動物に由来する方法。
- 請求項177の方法であって、結合ドメインがキチン結合ドメインである方法。
- 固体表面に末端ジスルフィド結合を介して結合したポリペプチドを含む組成物。
- 請求項180の組成物であって、固体表面がチップまたはビーズである組成物。
- 下記を含む化合物:
連続アミノ酸の第1区域:そのそれぞれはその前のアミノ酸にペプチド結合により結合しており、この連続アミノ酸の第1区域はカルコゲン官能基を含有する側鎖を有するアミノ酸残基を含む;および
連続アミノ酸の第2区域:少なくとも100個のアミノ酸を含み、そのそれぞれはその前のアミノ酸にペプチド結合により結合しており、連続アミノ酸の第2区域のうち少なくとも90個の連続アミノ酸はヒト免疫グロブリン定常部ポリペプチドの一部と同一の配列を有し、かつ連続アミノ酸の第2区域はその予め定めた末端にカルコゲン官能基を含有する側鎖を有するアミノ酸残基を含む;
その際、連続アミノ酸の第1区域のカルコゲン官能基を含有する側鎖を有するアミノ酸残基と、連続アミノ酸の第2区域のカルコゲン官能基を含有する側鎖を有するアミノ酸残基は下記の構造を有する結合で連結している:
- 請求項182の化合物であって、C1およびC2のうち少なくとも1つはアミノ酸のベータ炭素である化合物。
- 請求項182の化合物であって、結合が下記の構造を有する化合物:
- 請求項182の化合物であって、結合が下記の構造を有する化合物:
- 請求項182の化合物であって、連続アミノ酸の第2区域の予め定めた末端にあるカルコゲン官能基を含有する側鎖を有するアミノ酸残基がシステインである化合物。
- 請求項182の化合物であって、連続アミノ酸の第2区域の予め定めた末端にあるカルコゲン官能基を含有する側鎖を有するアミノ酸残基がセレノシステイン、ホモシステインまたはホモセレノシステインである化合物。
- 請求項182の化合物であって、連続アミノ酸の第1区域のカルコゲン官能基を含有する側鎖を有するアミノ酸残基がシステインである化合物。
- 請求項182の化合物であって、連続アミノ酸の第1区域のカルコゲン官能基を含有する側鎖を有するアミノ酸残基がセレノシステイン、ホモシステインまたはホモセレノシステインである化合物。
- 請求項182の化合物であって、連続アミノ酸の第1区域のカルコゲン官能基を含有する側鎖を有するアミノ酸残基が末端残基である化合物。
- 請求項182の化合物であって、連続アミノ酸の第1区域のカルコゲン官能基を含有する側鎖を有するアミノ酸残基がピナルト、アンテピナルトまたはプレアンテピナルト末端残基である化合物。
- 請求項182の化合物であって、連続アミノ酸の第2区域がヒト免疫グロブリン定常部と同一の配列を有する化合物。
- 請求項192の化合物であって、連続アミノ酸の第2区域がヒト免疫グロブリン定常部の一部である化合物。
- 請求項182の化合物であって、連続アミノ酸の第1区域がヒト免疫グロブリン定常部と同一の配列を有する化合物。
- 請求項182の化合物であって、ヒト免疫グロブリンの定常部ポリペプチドが、ヒトIgG1、ヒトIgG2、ヒトIgG3、またはヒトIgG4である化合物。
- 請求項195の化合物であって、カルコゲン官能基を含有する側鎖を有するアミノ酸残基のうち少なくとも1つの側鎖がC1−C10アルキレンである化合物。
- 請求項182の化合物の2つがそれぞれの化合物の連続アミノ酸の第2区域間で少なくとも1つのジスルフィド結合により互いに結合したものを含む組成物。
- SEQ ID NO:35〜46のうちの1つに示す配列を有する、またはSEQ ID
NO:53〜67のうちの1つに示す配列を有する、またはSEQ ID NO:74〜82のうちの1つに示す配列を有する、またはSEQ ID NO:89〜97のうちの1つに示す配列を有する連続アミノ酸からなるポリペプチド。 - 請求項198のポリペプチドおよびキャリヤーを含む組成物。
- 請求項199の組成物であって、キャリヤーがリン酸緩衝化生理食塩水である組成物。
- 請求項198のポリペプチドの2つが2つのポリペプチド間で少なくとも1つのジスルフィド結合により互いに結合したものを含む組成物。
- SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:81またはSEQ ID NO:96に示す配列の一部と同一の配列を有する連続アミノ酸からなり、ポリペプチドの末端残基のうち少なくとも1つがカルコゲン官能基を含有する側鎖を有するポリペプチド。
- 請求項202のポリペプチドであって、カルコゲン官能基を含有する側鎖を有する末端残基がシステインまたはその類似体であるポリペプチド。
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