JP2005154345A

JP2005154345A - Ｉｌ−２に結合性を有するペプチド又はタンパク質、及び該ペプチド又はタンパク質を用いたｉｌ−２吸着体、ｉｌ−２検査試薬、ｉｌ−２中和剤

Info

Publication number: JP2005154345A
Application number: JP2003395627A
Authority: JP
Inventors: Masatsugu Suzuki; 政嗣鈴木
Original assignee: Peptide Door Co Ltd
Current assignee: Peptide Door Co Ltd
Priority date: 2003-11-26
Filing date: 2003-11-26
Publication date: 2005-06-16

Abstract

【課題】簡単、かつ安価に得ることができるIL-2に結合性を有する新規なペプチド又はタンパク質を提供すると共に、上記ペプチド又はタンパク質を用いたIL-2吸着体、IL-2検査試薬及びIL-2中和剤を提供する。
【解決手段】 IL-2をターゲット物質として用い、ファージディスプレイ法によりスクリーニングを行い、IL-2に結合性を有するペプチドのアミノ酸配列を同定する。このようにして得られた特定のアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてIL-2に対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列を有するペプチドは容易に化学合成可能であり、例えば、IL-2吸着体、IL-2検査試薬、IL-2中和剤等として利用することができる。
【選択図】なし

Description

本発明は、IL-2に結合性を有する新規なペプチド又はタンパク質に関し、更には該ペプチド又はタンパク質を用いたIL-2吸着体、IL-2検査試薬及びIL-2中和剤に関する。

IL-2（インターロイキン−2）は、免疫に関わる133アミノ酸（分子量約15000）からなるサイトカインの1種であり、通常、抗原によって活性化されたT細胞（CD4^＋T細胞、CD8^＋T細胞、大型顆粒リンパ球（LGL））により産生される。

IL-2は生体内において、T細胞の増殖誘導と分化誘導、細胞障害性Ｔ細胞（CLT）の活性化、T細胞のサイトカイン（IFNγ等）産生増幅、ナチュラルキラー細胞（NK）やリンホカイン活性化キラー細胞（LAK）の活性化、Ｂ細胞の増殖誘導、Ｂ細胞の抗体産生増強、マクロファージ・オリゴデンドロサイトの活性化など、多岐に渡る働きを有している。

そのため、IL-2は腎癌やメラノーマの治療等にも用いられているが、作用が多岐に渡るため副作用も大きく、血中のIL-2濃度の監視が重要である。

一方、IL-2は臓器移植や骨髄移植において大きな問題となる拒絶反応、すなわち、生体が移植片を異物として認識し、それを排除するために惹起される一連の免疫反応にも関与しており、これらの手術においては、拒絶反応を抑制するために、ステロイド剤、アザチオプリン、メトトレキセート、6−メルカプトプリン、サイクロスポリン等の免疫抑制剤が用いられている。しかしながら、これらの免疫抑制剤は副作用等の問題があるため、その使用には制限があった。

そのため、より安全な免疫抑制剤の開発が望まれており、例えば、下記特許文献１には、(1)ヒトインターロイキン2（以下IL-2と略する）受容体重鎖に結合活性を有し、かつ(2)IL-2とIL-2受容体重鎖との結合を阻害する活性を有するポリペプチドが開示されている。

また、下記特許文献２には、ヒトインターロイキン2レセプターγ鎖に特異的に結合し、ヒトインターロイキン2の応答を遮断する活性を有するポリペプチドが開示されている。

また、下記非特許文献１〜３には、抗IL-2レセプター抗体を用いた拒絶反応阻害効果について記載されており、例えば、下記非特許文献１には、抗IL-2レセプター抗体が、小児の腎移植時の急性拒絶反応抑制に非常に有効であり、医療用として用いられている抗IL-2レセプター抗体であるdaclizumabやbasiliximabをカルシニューリン阻害剤と共に用いることによって急性拒絶反応を有意に抑制し、また、サイトカイン放出症候群等の副作用誘発も無いことが記載されている。

また、下記非特許文献２には、抗体IL-2レセプター抗体単独では腎移植時の急性拒絶反応を抑えることはできないが、カルシニューリン阻害剤等と併用することで、カルシニューリン阻害剤量を有意に低減させることができることが記載されている。

また、下記非特許文献３には、抗IL-2抗体が、腎移植だけでなく、肝移植時でも少なくとも14日間はIL-2レセプターをブロックしていることが記載されている。

また、下記非特許文献４には、可溶化IL-2レセプターによるIL-2の阻害効果について記載されており、ホジキンリンパ腫の患者では、T細胞の活性化が必要であるが、可溶化IL-2レセプターによってその効果が阻害されることが言われていたが、可溶化IL-2レセプターがIL-2カラムによって吸着除去されると、血漿中のIL-2の阻害効果が薄れ、T細胞の増殖が促されることが記載されている。
特開平５−３０４９９１号公報特開平７−３１３１８８号公報 Swiatecka-Urban A., Paediatr Drugs. 2003;5(10):699-716. Cibrik DM, Kaplan B, Meier-Kriesche HU., BioDrugs. 2001;15(10):655-66. Koch M, Niemeyer G, Patel I, Light S, Nashan B., Transplantation. 2002 May 27;73(10):1640-6. Damle RN, Advani SH, Gangal SG., Int J Cancer. 1992 Jan 21;50(2):192-6.

しかしながら、上記特許文献１、２に開示されたポリペプチド、上記非特許文献１〜４に開示された抗IL-2レセプター抗体や可溶化IL-2レセプターは、その調製に手間がかかると共に大量調製が難しく、コストがかかってしまうという問題があった。また、それ自身が抗原となったり、培養細胞や微生物に由来する夾雑物の混入等が懸念されるなど、医薬品として使用する時に安全性の面で問題があった。

一方、従来、IL-2の検査試薬として用いられている抗IL-2抗体も、その調製に手間がかかると共に大量調製が難しく、コストがかかってしまうという問題があった。

したがって、本発明の目的は、簡単、かつ安価に得ることができるIL-2に結合性を有する新規なペプチド又はタンパク質を提供すると共に、上記ペプチド又はタンパク質を用いたIL-2吸着体、IL-2検査試薬及びIL-2中和剤を提供することにある。

上記目的を達成するため、本発明の一つは、配列番号1〜10のいずれか一つで表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてIL-2に対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有し、IL-2に結合性を有することを特徴とするペプチド又はタンパク質を提供するものである。

上記発明によれば、IL-2に結合性を有する新規なペプチド又はタンパク質を提供することができる。このペプチド又はタンパク質は容易に化学合成できるので、従来の抗体や組換えタンパク質に比べて簡単、かつ安価に得ることができ、また、夾雑物の混入等の心配がほとんどない。このペプチド又はタンパク質は、IL-2吸着体の素材、IL-2検査試薬、IL-2中和剤等として利用することができる。

また、本発明のもう一つは、配列番号1〜10のいずれか一つで表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてIL-2に対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有し、IL-2に結合性を有するペプチド又はタンパク質を担体に固定化したことを特徴とするIL-2吸着体を提供するものである。

上記発明によれば、上記IL-2に結合性を有するペプチド又はタンパク質を担体に固定化することにより、より安価なIL-2吸着体を提供することができる。このIL-2吸着体は、IL-2の除去や精製等に好適に用いることができる。

更に、本発明のもう一つは、配列番号1〜10のいずれか一つで表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてIL-2に対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有し、IL-2に結合性を有するペプチド又はタンパク質を含有することを特徴とするIL-2検査試薬を提供するものである。

上記発明によれば、上記IL-2に結合性を有するペプチド又はタンパク質を含有することにより、より安価で検出感度の高いIL-2検査試薬を提供することができる。

更にまた、本発明のもう一つは、配列番号1〜10のいずれか一つで表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてIL-2に対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有し、IL-2に結合性を有するペプチド又はタンパク質を有効成分として含有することを特徴とするIL-2中和剤を提供するものである。

上記発明によれば、上記IL-2に結合性を有するペプチド又はタンパク質を有効成分として含有させることにより、より安価なIL-2中和剤を提供することができる。このIL-2中和剤は、IL-2が関与する疾患（例えば、臓器移植時の拒絶反応、炎症性疾患等）の予防・治療薬等への応用が期待できる。

本発明によれば、IL-2に結合性を有する新規なペプチド又はタンパク質を提供することができる。このペプチド又はタンパク質は容易に化学合成できるので、従来のモノクローナル抗体や組換えタンパク質等に比べて安価に得ることができる。したがって、IL-2吸着体の素材、IL-2検査試薬、IL-2中和剤等として利用することができる。

本発明のペプチドは、IL-2に結合性を有するペプチドであり、ペプチド中に配列番号1〜10のいずれか一つで表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてIL-2に対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有するものである。

本発明のペプチドは、上記の部分アミノ酸配列を有するものであれば、そのアミノ酸数は特に制限されないが、通常、アミノ酸数7〜50個からなることが好ましく、アミノ酸数7〜24個からなることがより好ましい。また、本発明のペプチドは、IL-2に対する結合性が損なわれない範囲で修飾（例えばアセチル化、アシル化、アミド化、カルボキシル化、リン酸化、糖鎖の付加等）、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失があってもよい。なお、本発明のペプチドは、上記アミノ酸配列を複数個有していてもよい。

本発明のペプチドは、IL-2をターゲット物質として、ファージディスプレイ法（Smith, G. P., Science, 288, 1315-1317 (1985)）によって得られたものであるが、コンピューターソフト（日立Bio Package）を用いた解析によっても得ることができる。なお、ファージディスプレイ法は、ファージの外殻タンパク質に、ランダムなアミノ酸配列を有するペプチド（通常、アミノ酸数5〜12個程度）を融合タンパク質として提示させたファージライブラリを用いて、ターゲット物質に結合するペプチドをスクリーニングする方法である。ファージライブラリは、例えば、Smith, G. P., Science, 288, 1315-1317 (1985)、J. K. Scott and G. P. Smith, Science, 249, 386-390 (1990)等に記載された方法にしたがって、ランダム化したDNAを化学合成し、これをファージDNAの外殻タンパク質をコードする遺伝子に挿入し、このDNAを大腸菌に導入することにより調製することができる。また、ファージライブラリは市販されており、例えば、商品名「Phage Display Peptide Library Kit」、New England Biolab社製）等を用いることもできる。

そして、ファージディスプレイ法等により決定されたアミノ酸配列に基づいて、例えば、固相法、Fmoc法等の公知のペプチド合成法により、目的とするペプチドを簡単に合成することができる。

また、本発明のタンパク質は、IL-2に結合性を有するタンパク質であって、タンパク質中に配列番号1〜10のいずれか一つで表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてIL-2に対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有するものであり、その分子量等は特に制限されないが、上記アミノ酸配列を有する部分が、IL-2と接触・結合できるように、タンパク分子上に提示されている必要がある。なお、本発明のタンパク質は、上記アミノ酸配列を複数個有していてもよい。

本発明のタンパク質としては、以下のようなものが例示できる。

(1)上記IL-2に結合性を有するペプチドを、HRP（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）、AP（アルカリフォスファターゼ）、β-D-ガラクトシダーゼ、グルコース-6-リン酸脱水素酵素等の酵素に結合したもの。

このようなタンパク質は、例えば「超高感度酵素免疫測定法」（石川栄治著学会出版センター）等に記載された公知の方法にしたがって、上記IL-2に結合性を有するペプチドと上記酵素とを結合させることにより得ることができる。

(2)上記IL-2に結合性を有するペプチドを表面に提示したファージ。
このようなファージは、Smith, G. P., Science, 288, 1315-1317 (1985)、J. K. Scott and G. P. Smith, Science, 249, 386-390 (1990)等に記載されたファージライブラリの作製方法にしたがって得ることができる。すなわち、上記IL-2に結合性を有するペプチドをコードするDNAを化学合成し、このDNAをファージラブラリを作製するときと同様の方法で、ファージDNAの外殻タンパク質をコードする遺伝子に挿入し、このDNAを大腸菌に導入することにより、所望のペプチドを表面に提示したファージを得ることができる。

(3)上記IL-2に結合性を有するペプチドを所定の抗原に連結したものと、該抗原に対する抗体とを結合させた抗体。

このような抗体は、本出願人による特願2002-241688号に記載された方法によって得ることができる。例えば、上記IL-2に結合性を有するペプチドと抗原となるペプチドとを連続した一つのペプチドとして合成し、前記抗原に対する抗体との抗原抗体反応により結合させればよい。

次に、本発明のIL-2吸着体について説明する。
本発明のIL-2吸着体は、上記IL-2に結合性を有するペプチド又はタンパク質を適当な担体に結合させることにより得ることができる。このIL-2吸着体は、例えば、血清やその他の体液、試験や細胞培養に用いるバッファ等に含まれるIL-2の除去やIL-2の精製等に用いる吸着体として利用することができる。

上記担体の素材としては、ペプチド又はタンパク質を物理的あるいは化学的に結合できる素材であればよく、例えば、セルロース等の糖、ナイロン等の化学素材、絹等からなるビーズ、織布、不織布等が挙げられる。また、上記IL-2に結合性を有するペプチド又はタンパク質をポリエチレングリコール（PEG）に結合させてもよい。

上記ペプチド又はタンパク質と担体との結合は、例えば、「新生化学実験講座Ｉタンパク質Ｉ分離・精製・性質」（日本生化学学会編）等の公知の方法にしたがって行うことができる。

なお、上記ペプチド又はタンパク質を担体に結合させる際に、ペプチドの末端やタンパク質の適当な部分等に担体との結合に利用可能な適当なスペーサーを挿入してもよい。スペーサーとしては、例えば、アミノ酸、ペプチド（好ましくは、グリシンやセリンが数個（通常2〜10個）ペプチド結合したペプチド等のフレキシブルリンカー等）、炭素数2〜18の主鎖（主鎖中にエステル結合やエーテル結合を有していてもよい。）を有し、好ましくは水酸基等の親水性の官能基を有するもの（例えば、両末端に活性基を有するポリビニルアルコール、好ましくはビニルアルコール分子が2〜10程度重合したもの）、2〜10糖からなる糖鎖等が例示できる。例えば、スペーサーがアミノ酸やペプチドである場合は、スペーサーを挿入したペプチドを連続した一つのペプチドとして合成することができるので好ましい。

このようなスペーサーを挿入することにより、担体との結合を行いやすくなる。また、スペーサーの長さを調整することにより、上記ペプチド又はタンパク質とIL-2との立体的な結合阻害を回避して、上記ペプチド又はタンパク質とIL-2との接触をより容易にすることができるので、吸着能力の向上を図ることも可能となる。

次に、本発明のIL-2検査試薬について説明する。
本発明のIL-2検査試薬は、上記IL-2に結合性を有するペプチド又はタンパク質を含有するものであり、具体的には、該ペプチド又はタンパク質に、例えば、酵素、蛍光物質、ポリエチレングリコール（PEG）、ビーズ等の標識物質を結合させることにより得ることができる（なお、上記(1)〜(3)に例示したタンパク質はそのままでもIL-2の検出試薬として利用することができる。）。このIL-2検査試薬は、例えば、血清やその他の体液中のIL-2を検出するための診断剤として使用できる。

上記酵素としては、上記(1)に例示した酵素が挙げられる。また、上記蛍光物質としては、Cy3、Cy5、フルオレセイン、Alexa等が例示できる。

上記ペプチド又はタンパク質と標識物質、例えば、蛍光物質との結合は、例えば、「生物化学実験法１３蛋白質の化学修飾（下）」（学会出版センター）等の方法により行うことができる。

なお、上記ペプチド又はタンパク質と標識物質を結合させる場合には、上述したようにペプチドの末端やタンパク質の適当な部分等に標識物質との結合に利用可能な適当なスペーサーを挿入してもよい。スペーサーを挿入することにより、標識物質の結合を行いやすくなると共に、スペーサーの長さを調整することにより、上記ペプチド又はタンパク質とIL-2との立体的な結合阻害を回避して、上記ペプチド又はタンパク質とIL-2との接触をより容易にすることができるので、検出感度の向上を図ることも可能となる。

次に、本発明のIL-2中和剤について説明する。
本発明のIL-2中和剤は、上記IL-2に結合性を有するペプチド又はタンパク質を有効成分として含有するものであり、IL-2に強く結合することにより、IL-2の活性を阻害してIL-2が関与する疾患（例えば、臓器移植時の拒絶反応、炎症性疾患等）の予防・治療薬等への応用が期待できる。

特に、上記IL-2に結合性を有するペプチドは、従来の抗IL-2抗体、抗IL-2レセプター抗体、可溶化IL-2レセプター等に比べて、安価に大量調製することができるだけでなく、安全性も高い。また、上記IL-2に結合性を有するペプチドをポリエチレングリコール（PEG）に結合させることにより、ペプチドの安定性が高まるので、より高い効果が期待できる。

本発明のIL-2中和剤の投与方法としては、血管内への投与が好ましく採用されるが、経口投与あるいは経皮投与であってもよい。本発明のIL-2中和剤の製剤形態は特に限定されないが、血管内に投与する場合は、注射液や点滴液等の製剤形態、あるいは注射液や点滴液に容易に溶解できる製剤形態が好ましい。

本発明のIL-2中和剤の有効投与量は、例えば、血管投与の場合には、成人１日当たり、上記ペプチド又はタンパク質換算で1〜10000μｇであり、好ましくは10〜2000μｇである。

ターゲット物質として、リコンビナントhuman IL-2（PeproTech EC社製）を用い、ファージディスプレイ法により、IL-2に結合性を有するペプチドのスクリーニングを以下の(1)〜(7)のように行った。

なお、ファージディスプレイ法では、M13ファージの表面のマイナータンパクｐIIIにペプチドがランダムに呈示されるライブラリ（呈示されるランダムアミノ酸数が7個又は12個のペプチドライブラリ）を、Smith,G.P.,Science,288,1315-1317（1985）、J. K. Scott and G. P. Smith, Science, 249, 386-390 (1990)等の記載に基づいて作製し、このライブラリを用いた。

(1)IL-2の固定化
ターゲットIL-2（25μg）に、100μlの100mM NaHCO₃溶液（pH8.0）を加えて溶解した。この溶液20μl（IL-2：5μg）を、別に用意した80μlの100mM NaHCO₃溶液（pH8.0）に加えてIL-2溶液を調製した。次に、50mg/mlとなるように商品名「sulfoNHS-LC-Biotin」（PIERCE社製）をDMSOに溶解し、この溶液5μlを上記IL-2溶液に加えて4℃で一晩インキュベートし、IL-2のビオチン化を行った。

そして、400μlのTBSバッファ（100mM Tris-HCl、140mM NaCl、pH7.4）を加えた後、脱塩カラム（商品名「HighTrap Desalting」、Amersham Biosciences社製）に通して未反応のビオチンを除去した。

ストレプトアビジンでコートされた磁気ビーズ（商品名「Dynabeads M280 streptavidin」、Dyanal社製）をTBSで3回洗浄した後、ビオチン化したIL-2を加えて、室温で1時間インキュベートしてビオチン−ストレプトアビジン結合によりIL-2を固定化し、IL-2固定化ビーズを作製した。なお、IL-2固定化ビーズは、TBSで5回洗浄した後、1mlのTBS（100mM Tris-HCl、140mM NaCl pH7.4）−2％(w/v)スキムミルク（2％(w/v)スキムミルク・TBS溶液）に懸濁し、4℃で保存した。

(2)パニング
1mlの2％(w/v)スキムミルク・TBS溶液に各10μl（7アミノ酸、12アミノ酸ライブラリ共、10¹²pfu以上/10μl）のファージ溶液を加えて溶解し、非特異的吸着低減処理を行い、ファージ（ペプチドライブラリ）溶液を調製した。

このファージ溶液を上記IL-2固定化ビーズに加え、軽く撹拌しながら室温で１時間インキュベートした。インキュベート後、IL-2固定化ビーズをTBS−T溶液（TBSに0.1％（v/v）となるようにTween−20を加えたもの）で5回洗浄した。

洗浄後、100μlの0.2M Glycine-HCl（1mg/ml BSA、pH2.2）を加えて約10分間インキュベートした後、マグネットでIL-2固定化ビーズを集め、その上澄みを15μlの1M Tris（pH9.1）に移し、混合・中和した（この溶液をファージ溶離液という）。

(3)ファージ増幅
上記で得られたファージ溶離溶液を、三角フラスコ中20mlの大腸菌（F+）（LB培地でOD₆₀₀＝0.6になるまで培養したもの）に加えて感染させ、4時間半、37℃で激しく撹拌し、ファージを増幅させた。

増幅後、上記培地を50ml遠沈管に移し変え、遠心（10,000rpm・10分・4℃）して上澄みを別の遠沈管に移し、4mlのPEG/NaCl溶液（20％PEG6000、2.5M NaCl）を加えて、4℃で一晩インキュベートした。その後、遠心（10,000rpm・10分・4℃）して上澄みを捨て、1mlのTBSを加え、沈殿（ファージ）を溶解した。この溶解液を1.5mlのエッペンチューブに移し、遠心（10,000rpm・5分・4℃）して余分な大腸菌を沈殿させて、上澄みを別のエッペンチューブに移し、200μlのPEG/NaCl溶液を加えて混ぜ、氷中に30分放置した後、遠心（10,000rpm・10分・4℃）して上澄みを捨て、200μlのTBSを加えて沈殿（ファージ）を溶解した。更に、遠心（10,000rpm・2分・4℃）して、上澄みを0.5mlのエッペンチューブに移してファージ精製溶液とした。このファージ精製溶液を用いて、再びパニング・増幅・精製の操作を同様にして3回繰り返して行い、4回目はパニング工程においてファージを溶出するところまで行い、ファージ溶離液を得た。

(4)タイター測定（プラークの形成）
4ラウンド目のファージ溶離液をTBSで10倍系列希釈して10³〜10⁵倍希釈液を調製した。

一方で、IPTGとX-Galを加えたLBプレート培地（プラスチックシャーレに作製）を37℃で温め、アガローストップをオートクレーブで溶解し、45℃で固まらないように暖めておいた。

LB培地でOD₆₀₀＝0.6になるまで培養した大腸菌（F+）200μlに、希釈したファージ溶液を10μl加え撹拌して2分間放置した後、45℃で保存しておいたアガローストップに加えて撹拌してからIPTGとX-Galを加えたLBプレート培地に流し込み、約5分間放置した。アガローストップが固まり余分な水気が飛んだら、フタをしてパラフィルムを巻き、37℃で一晩放置した（ファージが存在すれば、青色のプラークが出現する）。

(5)プラークからファージの増幅
プラークの数が100個以下、好ましくは50個以下のプレートを選び、出現したプラークを楊枝でつつき、ピッキングした。ピッキングした楊枝はLB培地でOD₆₀₀＝0.6になるまで培養した大腸菌（F+）5ml（試験管）に入れ、4時間半〜5時間激しく振とう培養した。培養後は、上記(3)と同様の操作を行ってシングルファージの精製を行い、各ペプチドライブラリ（7アミノ酸、12アミノ酸ライブラリ）から合計8種類のファージ（ファージ精製溶液）を得た。

(6)ELISAによる得られたペプチドのIL-2に対する結合性の確認
得られたファージが、実際にIL-2に結合するのかを確認した。確認方法としては、ファージを一次抗体の代わりに用いたファージELISAで行った。

まず、IL-2を2μg／mlとなるように100mM NaHCO₃溶液（pH8.0）に溶解し、96穴プレート（Corning社製、高結合タイプ）に100μl入れ、4℃で一晩放置した。その後、液を捨て、IL-2固定化ウエル及びコントロールウエル（IL-2を固定化していないウェル）に2％(w/v)スキムミルク・PBS溶液を加えてブロッキングを行った。

一方、得られた各ファージ精製溶液50μlを250μlの2％(w/v)スキムミルク・PBS溶液に加えて非特異的な結合を抑える前処理を行い、それぞれファージ溶液を調製した。

各ウエルの溶液を除き、PBS-T溶液で3回洗浄後、上記の各ファージ溶液を100μlずつIL-2固定化ウェルとコントロールウェルに加え、軽く振とうしながら室温で1時間インキュベートした。

インキュベート後、各ウエルをPBS-T溶液で5回洗浄し、発色用の抗体を含む溶液を100μlずつ加え、軽く撹拌しながら1時間インキュベートした。なお、発色用の抗体を含む溶液は、2％(w/v)スキムミルク・PBS溶液20mlに、商品名「anti M13 antibody HRP monoclonalconjugate」（Amersham Biosceiences社製）を4μl加えて調製した。

インキュベート後、各ウエルの溶液を捨て、PBS-T溶液で6回洗浄し、ABTS発色溶液（ABTS（和光純薬製）を0.22mg/mlとなるようにクエン酸バッファ（50mM クエン酸、pH4.0）に溶解して作製し、使用直前に、1.8μl/mlとなるように30％過酸化水素水（和光純薬製）を加えたもの）を120μl加えて、30分後に405nmの吸光度を測定した。その結果を表１に示す。

表１に示すように、吸光度比(B/A)の値が高いクローン、すなわち、IL-2に結合性を有するペプチドを提示しているNo.3,4,6,7のファージを選択し、提示しているアミノ酸配列のシークエンスを以下のようにして行った。

(7)ペプチド配列確認
今回行ったファージディスプレイ法では、ペプチドはファージのpIIIタンパクのN末端に呈示されているため、ファージpIIIgene（シグナル配列部を除く）の5’上流を読めば、ペプチドのアミノ酸配列を決定することができる。

シークエンス用のCy5蛍光標識プライマーとして配列番号11に示すプライマーを用いて、商品名「Thrme Sequenase Labelled Primer Cycle Sequencing kit with 7-deaza-dGTP」（Amersham Biosciences社製）でシークエンス反応を行い、商品名「ALFexpress II」（Amersham Biosciences社製）で配列決定を行った。その結果、配列番号1〜3に示す3種のペプチドのアミノ酸配列を同定した。

配列番号1に示すペプチドのC末端にチオール基を導入するためにシステインを付加したペプチド（以下、ペプチドAという）を合成（合成はシグマジェノシス社に依頼）し、IL-2との結合力を商品名「BIACORE2000」（BIACORE社製）を用いて測定した。

具体的には、上記の各ペプチドを商品名「BIACOREセンサーチップCM5」（BIACORE社製）にチオールカップリングにて固定化した（1レーン目をコントロールとし、2レーン目にペプチドAを固定化した）。

そのセンサーチップに、濃度が(1)12.5μg/ml、(2)6.25μg/ml、(3)3.125μg/ml、(4)1.56μg/ml、(5)0.78μg/mlのIL-2溶液（緩衝用バッファTBS（10mM Tris-HCl、0.1M NaCl、pH7.0））をアナライトとして流して測定した。その結果、ペプチドAの解離定数（KD）は10^−９以下のオーダーであり、抗体と同等レベルの結合力があることが分かった（図１参照）。

配列番号1に示すペプチドを用いて、IL-2のIL-2レセプターへの結合阻害活性を商品名「BIACORE2000」（BIACORE社製）で測定した。なお、IL-2として、リコンビナントhuman IL-2（PeproTech EC社製）、IL-2レセプターとして、可溶化α型レセプター（sIL-2Rα）である商品名「Recombinant soluble human IL-2 receptor (code:90254)」（INNOGENETICS社製）を用いた。

具体的には、IL-2のC末端側にシステインを付加し、このチオール基を利用して、商品名「BIACOREセンサーチップCM5」（BIACORE社製）にチオールカップリングにて固定化した。

一方、sIL-2Rαを1％（w/v）BSAを含むHBSバッファで希釈し、(1)0.0625μl/ml（モル濃度：約11nM）、(2)0.03125μl/ml（モル濃度：約5.5nM）の溶液を調製した。更に、(3) (1)の溶液に配列番号1に示すペプチドを1mg/mlとなるように加えた溶液、(4) (2)の溶液に配列番号1に示すペプチドを1mg/mlとなるように加えた溶液を調製した。

そして、IL-2を固定化したセンサーチップに、上記(1)〜(4)の溶液を流し、IL-2とsIL-2Rの結合力を測定した。その結果、配列番号1に示すペプチドを含まない溶液（(1)、(2)）を流した時のIL-2とsIL-2Rの結合は、解離定数（KD）2.69×10^-9であり、配列番号１に示すペプチドを含む溶液（(3)、(4)）を流した時のIL-2とsIL-2Rの結合は、解離定数（KD）1.26×10^-8であった。この結果から、配列番号1に示すペプチドは、IL-2とsIL-2Rの結合を阻害していることが確認された。

M13ファージの表面のマイナータンパクｐIIIにペプチドがランダムに呈示されるライブラリ（呈示されるランダムアミノ酸数が7個）を用いて、実施例１の(1)〜(5)と同様にしてファージディスプレイ法を行った。そして、得られたクローンについて、実施例１の(6)と同様にしてELISAによりIL-2に対する結合性を確認し、表２に示す吸光度比(B/A)の値が高いクローン、すなわち、IL-2に結合性を有するペプチドを提示しているNo.9〜15のファージを選択した。

そして、上記各ファージ（No.9〜15）が提示しているアミノ酸配列のシークエンスを実施例１の(7)と同様にして行い、配列番号4〜10に示す７種類のペプチドのアミノ酸配列を同定した。

「配列表フリーテキスト」
配列番号１：ファージディスプレイ法によって得られた、IL-2に結合性を有するペプチド。

配列番号２：ファージディスプレイ法によって得られた、IL-2に結合性を有するペプチド。

配列番号３：ファージディスプレイ法によって得られた、IL-2に結合性を有するペプチド。

配列番号４：ファージディスプレイ法によって得られた、IL-2に結合性を有するペプチド。

配列番号５：ファージディスプレイ法によって得られた、IL-2に結合性を有するペプチド。

配列番号６：ファージディスプレイ法によって得られた、IL-2に結合性を有するペプチド。

配列番号７：ファージディスプレイ法によって得られた、IL-2に結合性を有するペプチド。

配列番号８：ファージディスプレイ法によって得られた、IL-2に結合性を有するペプチド。

配列番号９：ファージディスプレイ法によって得られた、IL-2に結合性を有するペプチド。

配列番号１０：ファージディスプレイ法によって得られた、IL-2に結合性を有するペプチド。

配列番号１１：ファージ上に提示されたIL-2に結合性を有するペプチドのアミノ酸配列を決定するために用いたプライマー。

本発明のペプチド又はタンパク質は、IL-2に強い結合性を有するので、IL-2吸着体の素材、IL-2検査試薬、IL-2中和剤等として利用することができる。

配列番号１に示すペプチドとIL-2との結合力を測定した結果を示す図である。

Claims

配列番号1〜10のいずれか一つで表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてIL-2に対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有し、IL-2に結合性を有することを特徴とするペプチド又はタンパク質。
配列番号1〜10のいずれか一つで表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてIL-2に対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有し、IL-2に結合性を有するペプチド又はタンパク質を担体に固定化したことを特徴とするIL-2吸着体。
配列番号1〜10のいずれか一つで表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてIL-2に対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有し、IL-2に結合性を有するペプチド又はタンパク質を含有することを特徴とするIL-2検査試薬。
配列番号1〜10のいずれか一つで表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてIL-2に対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有し、IL-2に結合性を有するペプチド又はタンパク質を有効成分として含有することを特徴とするIL-2中和剤。