JP2007259856A - SrcSH3結合性ペプチドとその分離法と利用法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】SH3ドメインに結合する領域を有するペプチドの同定方法であって、
(a)SH3ドメインを含む標的タンパク質を固定化し;
(b)この固定化標的タンパク質を、ランダムペプチドライブラリーから分取したアリコートとともにインキュベートし;
(c)固定化標的タンパク質から未結合ペプチドを洗い流し;
(d)固定化標的タンパク質に結合したペプチドを回収し;そして
(e)SH3ドメイン結合性ペプチドの一次配列を決定する;
ことを含んでなる方法。
【選択図】なし
Description
本発明は、広範囲の結合特異性を有するSH3結合性ペプチドに関する。ここで開示するSH3結合性ペプチドの中には、SH3ドメインを含む別のタンパク質由来のSH3ドメインとほぼ同じ容易さで結合するものがある。これとは対照的に、別のメンバーでは、特異的なSH3ドメインに対してはるかに大きな親和性で結合するものがある。このSH3結合性ペプチドを、ファージ表示のランダムペプチドライブラリーから得ることができる。ここでは、SH3ドメインターゲットに結合するファージクローンを得る方法、それらの関連ヌクレオチド配列、および、その結合性ペプチドの一次アミノ酸配列を決定する方法を説明する。ここで得られるSH3結合性タンパク質は多くの点で有用で、細胞レベルでのシグナル伝達経路を調節する方法、発癌性タンパク質の活性を調節する方法ないしはシグナル伝達に関与するタンパク質の広いクラスおよび特異的なクラスを調節する能力のある薬剤を開発するためにリード化合物を提供するなどにおいて利用できるがこれらに限定されるものではない。
2.1. SrcおよびSH3ドメイン
真核細胞シグナリングに関与している相当数のタンパク質には、SH3ドメインと呼ばれるコンセンサス配列モチーフがある。それは50−70個のアミノ酸の長さであり、一次構造において中程度に保存されており、シグナル伝達に関与する多数のタンパク質や細胞骨格タンパク質に1回から数回の頻度で存在しうる。
Src関連チロシンキナーゼは、免疫系の多様な細胞型(リンパ球、T細胞、B細胞、およびナチュラルキラー細胞)と中枢神経系の多様な細胞型(神経細胞、ニューロン、乏突起神経細胞、小脳の一部など)を含む多様な細胞型に発現される(Umemori,H.ら、Brain Res.Mol.Brain Res.[1992]Dec.16[3-4]:303-310)。これらのキナーゼが、これらの細胞や組織に存在していること、および、それらが特異的な細胞表面受容体および免疫調節タンパク質(例:T細胞抗原受容体、CD14、CD2,CD4,CD40またはCD45)と相互作用をするということは、これらのキナーゼが中枢神経系だけでなく免疫系のシグナリング経路で重要な役目をしていることを示唆している(例えば、Ren,C.L.ら、J.Exp.Med.[1994]179(2):673-680:「CD40によるシグナル伝達にはLynキナーゼの活性化が関与する」、Donovan,J.A.およびKoretzky,G.A,J.Am.Soc.Nephrol[1993]4(4):976-985:「CD45、免疫応答およびLckキナーゼ、Fynキナーゼの制御」;およびCarmo,A.M.ら、Eur.J.Immunol.[1993]23(9)2196-2201:「CD2の細胞質ドメインとp56lckとp59fynとの物理的会合」。
上記で述べたように、SH3ドメインはタンパク質−タンパク質相互作用の部位であると長年推測されてきたが、どのSH3ドメインが実際に結合するのか不明であった。SH3ドメインに対するリガンドを同定しようと努力がなされた結果、多数のSH3結合性タンパク質が特性決定された。例えば、3BP1と3BP2(Ren,R.,Mayer ら、Science[1993]259:1157-61)、SOS(Olivier,J.P.ら、Cell[1993]73:179-91; およびRozakis-Adcock,M.ら、Nature[1993]363:83-5)、p85 PI−3’キナーゼ(Xingquan,L.ら、Mol.Cell.Biol.[1993]13:5225-5232)、dynamin(Gout,I.ら、Cell[1993]75:25-36)、AFAP−110(Flynn,D.C.ら、Mol.Cell.Biol.[1993]13:7892-7900)、CD42(Barfod,E.T.ら、J.Bio.Chem.[1993]268:26059-26062)である。これらのタンパク質は、短くてプロリンを多く含んだアミノ酸の伸張部を持つ傾向があり、そのいくつかはSH3結合に直接的に関係してくる。別のSH3結合性タンパク質のプロリンの多い領域間ではその類似性が極めて低い傾向があるけれども、多様なコンセンサス配列が提案されてきた。コンセンサス配列を構築しようとする試みは、別のSH3ドメインを結合するタンパク質からのデータを取り込むことで混乱が発生しているように見える。
Src相同領域3(SH3)とグリタチオンS−トランスフェラーゼ(GST)からなる細菌融合タンパク質と結合する分離体について、3つのファージ表示ランダムペプチドライブラリーをスクリーニングした。この分離体のDNA配列決定により、この分離体は、その8、22、または36アミノ酸の長いランダム領域の中に、コンセンサスモチーフRPLPPLP(配列番号:9)と似た配列を含むことが判明した。SH3結合ファージのpIII挿入物に対応するペプチドを合成したところ、それらのペプチドは、SrcやYes,(但し、Grb2は例外)、Crk、Abl、 PLCγ1のような Src関連タンパク質のSH3ドメインのGST融合物に結合した。これらの合成ペプチドは、Src SH3ドメインと極めてうまく結合し、細胞溶解物中では、天然のSrc SH3相互作用の強力な競合相手として作用する。例えば、これらの合成ペプチドは、固定化したSrc−GSTとの結合に際して細胞溶解物からの放射能標識したタンパク質と競合できるもので、その見かけのIC50は1−10μMであった。コンセンサス配列RPLPPLP(配列番号:9)を有するペプチドをアルリカツメガエル(Xenopus laevis)の卵母細胞に注入したところ、プレゲステロン誘発成熟速度が上昇した。これらの結果は、ファージ表示ランダムペプチドライブラリーを使用してSH3結合性ペプチド配列を同定し、そのようにして同定されたペプチドがin vivoとin vitroで生物学的活性を示すことを証明している。
(図面の簡単な説明については後述)
5.1.一般的考慮
本発明は、多くの生理学的に重要なタンパク質中に存在することが知られているSH3ドメインに対する結合親和性を示すペプチドに関するものである。特に、これらに限定されるものではないが、Abl、Src、Grb2、PLC−δ、PLC−γ、Ras GAP、Nck、およびp85PI−3’キナーゼを含む一群のタンパク質に含まれるSH3ドメインに対して、一般的な結合特性を示すペプチドを開示する。好適なペプチドは、特異的でない場合には、SrcのSH3ドメインに対する選択的結合親和性を示す。ここで記載されたように、本発明のペプチドはコア配列、好ましくはコンセンサス配列と、コア配列に隣接する別のアミノ酸残基とを含む。これらのペプチドは、複数の方法によって同定することを含めて、以下に非常に詳細に記載されている。
R−2−L−P−5−6−P−8−9(配列番号10)
に類似するアミノ酸配列を含めて、最低9個から約45個までのアミノ酸残基をペプチド中の任意の位置に含むペプチドが提供される。上記式中、各数字はアミノ酸残基を表し、例えば、2システイン以外のアミノ酸残基を表し、5および6は疎水性アミノ酸残基を表し、8はシステイン以外のアミノ酸残基を表し、そして9はシステイン以外の親水性アミノ酸残基を表す。この式中で用いられた各文字は、対応するアミノ酸の標準的一文字表記である。このペプチドが9−mer の場合に、R−P−L−P−P−L−P−T−S(配列番号11)は除外される。特に目的のペプチドは、Yes、Fyn、Lyn、Lck、HckおよびFgrを含む、SrcまたはSrc−関連タンパク質のSH3ドメインに対する結合親和性を示すものである。好ましくは、本発明のペプチドは、SrcのSH3ドメインに対する結合親和性よりも、ペプチドRPLPPLP(配列番号9)により示される結合親和性が、少なくとも3倍、さらに好ましくは少なくとも4倍、最も好ましくは少なくとも約5倍の結合親和性を示すものである。さらに別の実施形態では、このペプチドは、ペプチドRPLPPLP(配列番号9)が示す結合親和性よりも、少なくとも10倍高いSrcのSH3ドメインに対する結合親和性を示す。
好ましいファージ表示ランダムペプチドライブラリーの調製と特徴づけは、他で記載されている。例えば、Kay,B.K.ら、Gene(1992)128:59-65を、下記TSAR−9として知られるファージ表示ランダムペプチドライブラリーの調製の記載について参照せよ。特に、バクテリオファージ中の一定の長さのオリゴヌクレオチドのクローニング変性によって、M13ウイルス粒子の表面上のpIIIタンパク質のアミノ−末端に発現しているランダムペプチドの組換えライブラリーが生成される。(各粒子の表面上にpIII融合タンパク質の3〜5コピーがある)。ファージ表示により、第一に、発現されたペプチドがウイルス粒子の表面上にあり、相互作用に関与することができること;第二に、組換えウイルス粒子は安定であること(すなわち、凍結が可能で、極端なpHに曝すことができる);第三に、ウイルスが増殖可能であること;そして第四に、各ウイルス粒子が組換えゲノムをコードするDNAを含むという、幾つかの証拠が提供された。続いて、これらのライブラリーを、標的に結合するウイルス粒子を単離することによってスクリーニングする。単離物は終夜増殖可能であり、そして結合に応答可能な表示ペプチド配列をDNA配列を決定することによって推定することができる。
したがって、SH3ドメインに対する結合親和性を示すペプチドは非拘束ランダムペプチドライブラリーから単離された。さらに、開示したペプチドが示す結合親和性はそれらの選択性の点で異なっており、いくつかのペプチドは様々なタンパク質から誘導されたSH3ドメインに対して同様の結合親和性を示すが、他のものは特定のSH3ドメインに対してより大きい親和性を示す。
したがって、好適な9-merコンセンサスモチーフに従うか、または「似ている」他のペプチドを特定して開示していないが、これらは当業者には容易に推察でき、上に開示したものと同様であると考えられる。特に、従わないものは1位(Rの代わりにS、GおよびIが許容される)、3位(Lの代わりにV、AおよびQが許容される)、4位(Pの代わりにLが許容される)、5位(疎水性アミノ酸残基の代わりに親水性アミノ酸残基、S、RおよびTが許容される)、6位(疎水性アミノ酸残基の代わりに親水性アミノ酸残基、RおよびTが許容される)、7位(Pの代わりにTおよびSが許容される)、および9位(親水性アミノ酸残基の代わりにPおよびAが許容される)に観察された。
開示の結合性ペプチドのいくつかがひとつのSH3ドメインに対してもうひとつのものよりも高い相対的結合親和性を有することが発見されている。ここで図8に言及すると、異なるSH3 ドメインターゲットに対する上記の種々のペプチドの相対的結合親和性がグラフで表示されている。見てのとおり、各ペプチドの相対的結合親和性は大きさ(magnitude)の順序により異なることがある。従って、図8に示されているように、T12.SRC3.3と同定されたファージクローンの関連配列を有するペプチドGPHRRLPPTPATR(配列番号65)は、Src、Yes、Lek、Hck、Fgr、Fyn、およびLynを含むが、これらに限定されることはないSrcファミリーSH3ドメインに特異的である。このSH3結合性ペプチドは、PLCγまたはGrb2に由来するSH3ドメインに対してはほとんど親和性を有さない。一方、ファージクローンT12.SRC3.1(これは、本方法により見いだされた最も豊富な結合性クローンのひとつである。)の関連配列に相当するペプチドGILAPPVPPRNTR(配列番号63)は、Src、PLCγ、およびGrb2を含む広い範囲のSH3ドメインに一般的に(generically)結合する。
最初に、SrcおよびSrc関連タンパク質のSH3ドメインに対するある種のペプチドの結合親和性は、好ましいコアコンセンサス配列RPLPPLP(配列番号9)またはRPLPMLP(配列番号95; すなわち、RPLP(P/M)LP、配列番号96)の存在のみによって少なからず支配されることは明らかである。従って、合成ペプチドRSTPRPLPMLPTTR(R8C.YES3.5;配列番号62)およびRSTPRPLPPLPTTR(コンセンサス;配列番号67)はSrc SH3 に対して強い特異的結合親和性を示す一方、試験した他の合成ペプチドも7-merのRPLPPLP(配列番号9)と比べてSH3ドメインに対して強烈な結合親和性を示した。これらの他のペプチドであるGILAPPVPPRNTR(配列番号63)、VLKRPLPIPPVTR(配列番号64)、GPHRRLPPTPATR(配列番号65)、およびANPSPATRPLPTR(配列番号66)、スポートコア配列(sport core sequence)並びにフランキング配列は、好ましいコアコンセンサス配列に密着しない。従って、これらの結果は、SH3ドメインに対する結合親和性がかなりの程度までコア7-mer 配列に隣接するアミノ酸残基の性質によって支配されることを示唆している。
既に上で示したように、本発明は、また、本明細書に記載したSH3結合性ペプチドをベースとする診断、予防、および治療薬を提供することを目的とする。
6.1.TSAR-9ライブラリーの調製
6.1.1.オリゴヌクレオチドの合成および構築
図1は、オリゴヌクレオチドの式およびTSAR−9ライブラリーの構築の際に使用した構築スキームを示す。アプライドバイオシステムズ380a合成機(Foster City,CA)でオリゴヌクレオチドを合成し、そして全長ヌクレオチドをHPLCにより精製した。
TSARライブラリーを発現させるのに有用なM13起源のファージベクターの構築が最近記述された(Fowlkes,D.らのBioTech.(1992)13:422-427)。TSAR-9ライブラリーを発現するために、M13起源のベクターm663をFowlkesに記載されたとおり構築した。m663ベクターは、c-mycエピトープを有するpIII遺伝子を含む、すなわち、スタッファー断片として成熟N-末端で導入され、Xho IおよびXba I制限部位により隣接された(Fowlkesの図1も参照)。
その後、合成オリゴヌクレオチドを、リガーゼで一夜12℃インキュベートすることにより、pIII遺伝子(Fowlkes)を含むXho IおよびXba I二重消化m663 RFDNAにライゲートした。さらに詳細には、50ngのベクターDNAおよび5ngの消化された合成DNAを、T4 DNAリガーゼを用いて50μLライゲーション緩衝液(50mM トリス、pH8.0、10mM MgCl2、20mM DTT、0.1mM ATP)で一緒に混合した。一夜12℃でライゲーションした後、エタノール沈殿および70%エタノールでの洗浄によりDNAを濃縮した。その後、電気穿孔法によりライゲートされたDNAをE.coli(DH5αF';GIBCO BRL,Gaithersburg,MD)に導入した。
図2は、合成オリゴヌクレオチドのための式およびTSAR-12ライブラリーの構築に使用した構築スキームを示す。以下の除外をもって図2に示したように、上記セクション6.1に記載したTSAR-9ライブラリーと実質的に同じようにTSAR-12ライブラリーを製造した。(1)変異の予測されないオリゴヌクレオチド配列の各々、すなわちNNBは、54ヌクレオチドよりむしろ30ヌクレオチド長であった。(2)変異の予測されない配列の5'末端に含まれる制限部位は、Xho IおよびXba IよりむしろSal IおよびSpo Iだった。そして(3)2つの鎖をアニールすることを助けるための3'末端での不変の配列はCCAGGTおよびGGTCCAよりむしろGCGGTGおよびCGCCACであった(5’から3'へ)。
上記セクション6.1および6.2に記載されたTSARライブラリーのそれぞれに挿入された合成オリゴヌクレオチドは、それぞれ2036(-1047)および2020の潜在的なコード複雑さを示し、-1014分子を各形質転換実験に使用したので、これらのTSARライブラリーの各員は、特徴的であった。プレート増幅後、ライブラリー溶液または保存液は104コピーの各員/mLを示した。
23のランダムに選択された分離物の導入された合成オリゴヌクレオチド断片を、TSAR-9ライブラリーから試験した。個々のプラークは、E.coli(DH5 αF')細胞を含む2XYTブロスの1 mLを接種するのに使用し、培養液を一夜37℃で通気して成長させた。Maniatisの上記文献にしたがって、培養上清からDNAを分離した。オリゴヌクレオチド5'-AGCGTAACGATCTCCCG(SEQ ID NO.99)をプライマーとして使用するSanger(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1979)74:5463-5467)の方法にしたがって、23の個々の分離物をシーケンスした。そのオリゴヌクレオチドは、TSARを発現するのに使用されたm663ベクターのpIII遺伝子クローニング部位の89ヌクレオチド下流である。
TSAR-12ライブラリー由来のおよそ10のランダムに選択された挿入オリゴヌクレオチドが、セクション6.3.1.で上述されたとおりDNAシーケンシングにより試験された。分離物は、TSAR-9分離物にしたようにTSAR-12ライブラリーからランダムに選択され、そしてシーケンシングのために製造された。分析では、不変のGly を除き、任意位置が、任意のアミノ酸を有することができた。したがって、配列は、予想できないか、またはランダムである。
ここで図3にしたがって、配列
(式中、Nは、デオキシヌクレオチドA,C,GおよびTの当モル比であり、そしてKは、GおよびTの当モル比である。)を用い、アブライドバイオシステムズ380a合成機で、2つのオリゴヌクレオチドが合成された。50ピコモルの各オリゴヌクレオチドを50μLのSequenase(登録商標)緩衝液(U.S.Biochemicals,Cleveland,Oh)中で、0.1μg/mLアセチル化BSAおよび10mM DTTを用いて42℃で、5分間、その後37℃で15分間インキュベートした。アニーリング後、10単位のSequenaase(登録商標)緩衝液(U.S.Biochemicals)および0.2mMの各dNTPを添加し、37℃で15分間インキュベートした。その後、サンプルを65℃で2時間加熱し、100単位のXho IおよびXba Iの両方(New England BioLabs,Beverly,MA)で消化し、フェノール抽出し、エタノール沈殿し、そして15% 非変性ポリアクリルゲルに溶かした。構築された消化断片はゲル精製してからライゲーションした。ベクターm663(Fowlkes,D.らのBiotech.(1992)13:422-427)をXho IおよびXba Iで消化して製造し、子ウシアルカリホスファターゼ(Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN)で処理し、フェノール抽出し、そしてアガロースゲル電気泳動により精製した。ライゲートするために、製造者の指示にしたがって、20μg ベクターを、T4 DNAリガーゼ(Boehringer Mannheim)を有する3 mL中に0.2 μgの挿入物とともに混合した。フェノール抽出およびエタノール沈殿によりタンパク質および緩衝液を除去した後、ライゲートしたDNAをXLI-ブルーE.coli(Stratagene,San Diego,CA)に電気穿孔し、そして8時間37℃で、プレートにかけた。組換え体ファージを回収するために、スパチュラで頂部寒天を収集し、同量の100mM NaCl、10mM MgCl2、および50mM トリス-HCl(pH7.5)と混合し、18-ゲージのシリンジ針を2回通過することにより中断させた。遠心分離により細菌細胞を取り除き、そしてポリエチレングリコール沈殿によりファージ粒子を収集し、-70℃で、25%グリセロール中に貯蔵した。ライブラリーは、全部で106総組換え体を有し、そして6 ×1013pfu/mLの作業力価を示した。
6.5.1.GST-SH3融合タンパク質の製造
Src-GST融合タンパク質の製造は最初Smith and Johnsonにより、Gene(1988)67:31で記載された。この開示は、ここに参照として組み込まれる。簡潔には、Src、Grb2、Crk AblまたはPLCγのSH3ドメインを含むGST融合タンパク質を発現するpGEX誘導(Pharmacia,Piscataway,NJ)構築物をChanning Der博士(University of North Carolina at Chapel Hill)から得た。SH3 ドメインを発現する構築物をMarius Sudol(Rockefeller University)から得た。GST-SH3融合タンパク質を製造するためのpGEX細菌発現ベクターを使用することが当業者によく知られている。Cicchetti,P.らのScience(1992)257:803-806参照。簡潔には、特にSH3ドメインのためのコード領域を、pGEX-2TのBam HI部位でインフレームに融合できる。したがって、融合タンパク質を製造者の指示にしたがい製造し、SDSポリアクリルアミドゲルのクマシーブルー染色により定量した。100mM NaHCO3(pH8.5)中の5-20μg GST-SH3融合タンパク質、を用いてマイクロタイターウェルを被覆し、100mM NaHCO3(pH8.5)で保護し、1% BSAで洗浄した。全ての洗浄は、IXPBS、0.1%ツイーン20、0.1% BSA(バッファーA)の5つの応用からなった。各ウェルに結合されたタンパク質の量を抗-GST抗体をベースとしたELISA(Pharmacia,Piscataway,NJ)を用いて適切に定量し、この作業工程の間GST-結合性ファージで単離した。
製造者の指示にしたがって、細菌に発現されたSrc SH3グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(Src-GST)融合タンパク質を、グルタチオンアガロース4B(Pharmacia)を用いて細菌溶解産物から精製した。PBS 中の10mMグルタイオンを用い、グルタチオンアガロース4Bから結合性Src-GST 融合タンパク質を溶出させた。その後、マイクロタイターウェルを、4 ℃で一夜でSrc-GST融合タンパク質(1-10μg/ウェル、50mM NaHCO3、pH8.5)で被覆した。ファージの非特異的結合を保護するために、100mM NaHCO3中の1% BSA(pH8.5)100 μLを、各ウェルに添加して、室温で1時間インキュベートさせた。その後、200 μL PBS、0.1%ツイーン20、0.1% BSA(バッファーA)でウェルを5回洗浄した。
6.6.1. Src SH 結合性ファージの単離
先述のとおりに、ライブラリースクリーンを行った。Kay,B.K.らのGene(1993)128:59-65。簡潔には、バッファーA 中の1×1011pfu TSAR 9、TSAR 12またはRBCファージをSrc SH3-GST-被覆ウェルで、2時間インキュベートした。ウェルを洗浄し、そして結合性ファージを100 μL の50mM グリシン-HCl(pH2.2)で溶出し、新たなウェル移し、そして100mLの200mM NaHPO4(pH7.0)で中和した。回収されたファージを、20mL 2xYT中の1×109DH5 αP'E.coli細胞に感染させるのに使用した。感染細胞を一夜生育し、1000〜10000倍の増殖のファージ力価を得た。増幅段階外は上述の通り増殖ファージを2回以上パンした。3週目のパンニング後回収した結合性ファージをDH5 αP'E.coli細胞の低い密度でプレートして、クローナル分析のための単離プラークを得た。単離プラークを使用して、各々ファージ結合実験およびジデオキシシーケンシング(Sanger,P.らのProc.Natl.Acad.Sci.USA(1977)74:5483-5467)のためのファージ貯蔵物およびDNAを回収した少量の培養物を作った。Src SH3-GSTまたはGSTのみを含有するファージの当力価をウェルにかけることによりSH3ドメインを結合することが、クローンで確認され、各ウェルから溶出粒子の数を滴定するか、または抗ファージ抗体をベースとしたELISA(Pharmacia)を用いて結合性ファージを予測した。
単離物のさまざまな標的タンパク質への結合について評価するために、酵素結合イムノアッセイ(ELISA)もおこなった。細菌培養液をファージ単離物で感染させ、2XYT中、37℃で一晩培養した。細胞を遠心沈殿させ、25mlの上清を50mlのタンパク質で被ったマイクロタイタープレートウェルに加え(100mM NaHCO3中1mg/ml、pH8.4;4℃で一晩または室温で2、3時間)、遮断した(100mM NaHCO3中1mg/ml BSA、pH8.4;約1時間)。ファージをウェル中で25mlのPBS-0.1% Tween 20とともに室温で2時間インキュベートする。次いで、ウェルを30分間にわたり何度も洗浄する。それぞれのウェルにホースラディッシュペルオキシダーゼをコンジュゲートしたポリクローナル抗ファージ抗体を50μL加える。抗体はPharmacia(Piscataway,NJ; カタログ番号27-9402-01)より購入したもので、BSA-PBS-Tween 20で1:3000に希釈する。30分後、BSA-PBS-Tween20で20分間、ウェルを再度洗浄した。最後に、呈色のために100μLのABTS試薬(Pharmacia,H2O2とともに)をそれぞれのウェルに加える。プレートを、プレートリーダー(Molecular Devices,Menlo Park,CA)を用いて波長405nmで測定する。
ペプチドは、Research Genetics(Birmingham,AL)、Chiron Mimotopes(Victoria,Australia)より購入、またはCytogen Corporation(Princeton,NJ)のDr.J.Mark Carterによる一般的な方法により合成した。ペプチドの純度はHPLCおよび/または質量分析により検定された。ビオチニル化ペプチドは、ビオチンとペプチドのN-末端との間の、KSGSG(配列番号103)またはGSGS(配列番号104)ペプチドリンカー(スペーサー)のいずれかを用いて合成された。結合実験は、ファージに代わりに10μMのペプチドを用いる以外は、上記のとおりにおこなった。結合したビオチニル化ペプチドはアルカリホスファターゼ(Sigma Chemical Co.,St.Lois,MO)とコンジュゲートしたストレプトアビジンにより検出した。1時間室温でインキュベーションをおこなった後、ウェルを洗浄し、3mM リン酸 p-ニトロフェニル(US Biochemicals,Cleveland,OH)の50mM NaCO3(pH9.8)溶液および50mM MgCl2を加えて、呈色させた。ELISAプレートリーダー(Molecular Devices,Menlo Park,CA)を用いて、波長405nmで測定した。結合実験は3回繰り返した。図7および8に結果を示す。
HeLa細胞の培養物を、≧100μCi/mL 35S-メチオニンとともに一晩インキュベートすることにより、標識したタンパク質を調製する。次いで細胞を洗浄し、弱い界面活性剤を用いて溶解する。この放射性タンパク質の混合物を、グルタチオン結合セファロースビーズ(Pharmacia,Piscataway,NJ)に固定化したSrc-GST融合タンパク質とともにインキュベートする。数時間撹拌した後、低速の遠心分離により、ビーズを静かに沈殿させ、上清を捨てる。次いで、ビーズを再度PBS-0.1% Tween20に懸濁させてスラリーを作り、沈殿させ、さらに数回洗浄する。最後に、サンプルに2% SDS溶液を加え、次いで、100℃で3分間煮沸する。その後、サンプルを遠心分離し、上清を電気泳動のために10% ポリアクリルアミドSDSゲル上にのせた。タンパク質が溶解した後、ゲルを固定し、乾燥して、オートラジオグラフィー用のX-線フィルムまたはMolecular Dynamics Phosphorlmagerによる走査のための燐光体プレートにさらした。
PI-3'キナーゼの沈降に続いて、SH3-結合性ペプチドの存在下、または不在下において、細胞溶解物から得られたSrcによりPI-3’の沈降の追跡がが可能である。HeLa細胞を界面活性剤で溶解して、タンパク質混合物を、グルタチオン結合セファロースビーズに固定化されたSrc-GST融合タンパク質とともに数時間インキュベートする。数時間撹拌した後、低速の遠心分離によりビーズを静かに沈殿させ、、上清を捨てる。次いで、ビーズを、PBS-0.1% Tween 20中に再懸濁させてスラリーとし、沈殿させ、さらに数回洗浄する。最後に、サンプルにSDS溶液を加えた後、100℃で3分間煮沸する。その後、サンプルを遠心分離し、上清を、電気泳動のために10%ポリアクリルアミドSDSゲル上にのせる。タンパク質が溶解した後、ゲルをニトロセルロースまたはナイロンにブロットする(例、ウエスタンブロット)。次いで、フィルターに、PI-3'キナーゼ抗体(モノクローナルおよびポリクローナル抗体は、Upstate Biotechnology Incorporated,Lake Placid,NY)から購入できる)を結合させ、さらに酵素-結合第二抗体を結合させる。次いで、PI-3'キナーゼの量を定量する。
細胞内でSH3-結合性ペプチドとタンパク質のSH3-ドメインが会合することを示すため、SH3-結合性ペプチドにタグをつけて細胞内に局在化させた。たとえば、Bar-Sagi et al.,Cell(1993)74:83-91には、SH3-結合性タンパク質は細胞内にはいると細胞骨格に局在することが示されている。こうして、本発明のSH3ドメイン結合性ペプチドは、細胞のターゲッティングシグナル(例、細胞骨格への)として使うことができる。すなわち、ペプチドにビオチンでタグをつけた後、細胞内に注入する。別の方法として、SH3-結合性ペプチドと緑の蛍光を有するタンパク質(GFP、Chalfie et al.,Science(1994)263:802-805)からなる融合タンパク質を発現する組換えプラスミドを細胞内に移入することもできる。次いで、ビオチニル化ペプチドの位置またはGFP融合タンパク質の位置を、それぞれ、パラホルムアルデヒドで固定した細胞内のFITC-標識ストレプトアビジンにより、または生細胞内で直接蛍光を測定することによりアッセイする。SH3-結合性ペプチドが細胞骨格に局在することは、SH3-結合性ペプチドがin vivoでSH3-ドメインタンパク質と結合し得ることを示している。これに加えて、Src富化病巣索状帯(focal adhesion)もまたSH3-結合性ペプチドの細胞下局在の可能性がある位置である。
ツメガエル属ラエビス(Xenopus laevis)卵母細胞に脱制御SrcをコードするmRNAを注入すると、卵母細胞に劇的な細胞学的変化および生化学的変化が起こる(Unger,T.F.and Steele,R.E.,in Mol.Cell.Biol.(1992)12:5485-5498)。出願人はSrcのmRNAを生成するためのプラスミドをDr.Robert Steele(カリフォルニア大学アーヴィン校)から入手した。合成SH3−結合性ペプチドを、予めSrcのmRNAを注入しておいた卵母細胞に注入する。表層色素粒の配置を解剖顕微鏡で観察することによって、細胞骨格の状態を視覚的に調べた。幾つかのタンパク質のリン酸化の状態を、上記のUnger とSteeleの記載のように、抗ホスホチロシンモノクロナール抗体を用いたウエスタンブロッティングによって調べた(4G10;Upstate Biotechnology Incorporated)。
成熟した卵巣部分を外科的に取り除き、それを0.1%コラゲナーゼタイプD(Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN)を含むCa2+無添加OR2(82.5mM NaCl,2.5mM KCl,1.0mM MgCl2,1.0mM Na2HPO,5.0mM HEPES,及び3.8mM NaOH,pH7.6)中でインキュベートした。その後、卵母細胞を1.0mM CaCl2を含むOR2で3-5回洗浄した。18℃で一晩、OR2中で再生させた。VI期の卵母細胞に40nLの100mM ペプチド又は水を注入した。注入後、その卵母細胞を2mg/mLのプロゲステロン(Sigma,StLouis,MO)を含むOR2中に置き、20℃でインキュベートした。1時間ごとの卵母細胞の胚胞崩壊(GVBD)を記録した。
SH3結合性ペプチドをコードする領域を、動物細胞中で発現するベクター中にクローニングする。c-mycエピトープ及びSH3結合性ペプチドを有するタンパク質をコードする二連遺伝子(bipartite gene)を、強力な構造プロモーター(例えば、SV40,CMV,HSV TK,カルモジュリン)から転写して構築する。ベクターを、トランスフェクション(例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム、リポソーム、DEAEデキストラン)を介して、正常の又はSrcで形質転換された細胞のいずれかに導入する。トランスフェクションされた細胞は、培養され、一時的に二連遺伝子を発現する。安定した形質転換された細胞系を作るために、ベクターは選択可能なマーカー(例えば、ネオマイシン耐性)を有するか、又はトランスフェクションを選択可能なマーカー(例えば、ネオマイシン耐性)を有する過剰のプラスミド及びそのマーカーのために選択された細胞の存在下で行なう。トランスフェクションされた細胞を免疫蛍光法によって染色し、二連タンパク質(bipartite protein)の発現を検出する。ハイブリドーマ 9E10 が、c-myc エピトープ(EQKLISEEDLN(配列番号105);Evan,G.A.ら.,in Mol.Cell.Biol.(1985)5:3610-3616参照)に対して高い特異性を有するモノクロナール抗体を分泌する。二連タンパク質が細胞中に発現され、ある場合には、SH3ドメイン保持タンパク質(SH3 domain bearing protein)中に豊富に存在する亜細胞性構造に局在することを明らかにするために、この抗体が免疫蛍光法の実験に用いられる。
好ましいファージ表示ランダムペプチドライブラリーの調製及び特性決定を上記6.1−6.4節に記載した。
SH3結合性ペプチドにRPLPPLPコンセンサスモチーフの全部又は一部を固定し、隣接する残基をランダム化する、第二世代又はバイアス(biased)ペプチドライブラリーの使用により、選択的なSH3結合を示す追加の配列残基が定義された。
Claims (74)
- SrcのSH3ドメインに対する結合親和性を示し、かつ9個以上で45個までのアミノ酸残基を有するペプチドであって、該ペプチドの任意の場所に式:R−2−L−P−5−6−P−8−9(配列番号10)〔式中、各数字はアミノ酸残基を表すもので、2はシステイン以外の任意のアミノ酸残基を表し、5および6はそれぞれ疎水性アミノ酸残基を表し、8はシステイン以外の任意のアミノ酸残基を表し、9はシステイン以外の親水性アミノ酸残基を表し、そして各文字は対応アミノ酸の標準一文字表記である〕のアミノ酸配列が配置されているが、R−P−L−P−P−L−P−T−S(配列番号11)であることはない上記のペプチド。
- 2がP、R、A、L、Q、EまたはSである、請求項1に記載のペプチド。
- 5がP、M、IまたはLである、請求項1に記載のペプチド。
- 6がP、L、IまたはVである、請求項1に記載のペプチド。
- 8がT、R、P、I、N、E、V、S、A、GまたはLである、請求項1に記載のペプチド。
- 9がT、R、S、HまたはDである、請求項1に記載のペプチド。
- 式10、10−11、10−11−12、10−11−12−13(配列番号12)または10−11−12−13−14(配列番号13)〔式中、各数字はシステイン以外の任意のアミノ酸残基を表し、10がペプチド結合で9に結合されている〕のC末端フランキングアミノ酸配列をさらに含む、請求項1に記載のペプチド。
- 10がT、R、L、S、D、P、AまたはNである、請求項7に記載のペプチド。
- 11がR、P、A、Q、SまたはTである、請求項7に記載のペプチド。
- 12がP、S、RまたはTである、請求項7に記載のペプチド。
- 13がP、S、R、F、HまたはTである、請求項7に記載のペプチド。
- 14がS、R、GまたはTである、請求項7に記載のペプチド。
- 式1’、2’−1’、3’−2’−1’または4’−3’−2’−1’(配列番号14)〔式中、各数字はシステイン以外の任意のアミノ酸残基を表し、1’がペプチド結合でRに結合されている〕のN末端フランキングアミノ酸配列をさらに含む、請求項1に記載のペプチド。
- 1’がT、P、S、N、F、W、K、H、QまたはGである、請求項13に記載のペプチド。
- 2’がS、T、G、P、R、Q、L、AまたはHである、請求項13に記載のペプチド。
- 3’がR、S、P、G、A、V、YまたはLである、請求項13に記載のペプチド。
- 4’がR、S、V、T、G、LまたはFである、請求項13に記載のペプチド。
- SrcのSH3ドメインに対する結合親和性を示し、かつ13個以上で45個までのアミノ酸残基を有するペプチドであって、該ペプチドの任意の場所に式:3’−2’−1’−R−2−L−P−5−6−P−8−9−10(配列番号15)〔式中、各数字はアミノ酸残基を表すもので、3’、2’、1’、2、8および10はそれぞれシステイン以外の任意のアミノ酸残基を表し、5および6はそれぞれ疎水性アミノ酸残基を表し、9はシステイン以外の親水性アミノ酸残基を表し、そして各文字は対応アミノ酸の標準一文字表記である〕のアミノ酸配列が配置されている上記のペプチド。
- 5がPまたはMである、請求項18に記載のペプチド。
- 1’がT、P、SまたはNである、請求項18に記載のペプチド。
- 2’がSまたはTである、請求項18に記載のペプチド。
- 3’がRまたはSである、請求項18に記載のペプチド。
- 10がTまたはRである、請求項18に記載のペプチド。
- SrcのSH3ドメインに対する結合親和性がペプチドRPLPPLPにより示される結合親和性より少なくとも3倍大きい、請求項1に記載のペプチド。
- SrcのSH3ドメインに対する結合親和性がペプチドRPLPPLP(配列番号9)により示される結合親和性より少なくとも3倍大きい、請求項18に記載のペプチド。
- SrcのSH3ドメインに対する結合親和性がペプチドRPLPPLP(配列番号9)により示される結合親和性より少なくとも4倍大きい、請求項1に記載のペプチド。
- SrcのSH3ドメインに対する結合親和性がペプチドRPLPPLP(配列番号9)により示される結合親和性より少なくとも4倍大きい、請求項18に記載のペプチド。
- Abl、Grb2、PLC−δ、PLC−γ、Ras GAP、Nck、p85 PI−3’キナーゼ、およびこれらに関連したタンパク質のSH3ドメインに対する一般的結合親和性をさらに示す、請求項1に記載のペプチド。
- SrcおよびSrc関連タンパク質のSH3ドメインに対する選択的結合親和性を示す、請求項1に記載のペプチド。
- Abl、Grb2、PLC−δ、PLC−γ、Ras GAP、Nck、p85 PI−3’キナーゼ、およびこれらに関連したタンパク質のSH3ドメインに対する一般的結合親和性をさらに示す、請求項18に記載のペプチド。
- SrcおよびSrc関連タンパク質のSH3ドメインに対する選択的結合親和性を示す、請求項18に記載のペプチド。
- アミノ酸配列:RSTPRPLPMLPTTR(配列番号62)を有するペプチド。
- アミノ酸配列:RSTPRPLPPLPTTR(配列番号67)を有するペプチド。
- アミノ酸配列:GILAPPVPPRNTR(配列番号63)を有するペプチド。
- アミノ酸配列:VLKRPLPIPPVTR(配列番号64)を有するペプチド。
- アミノ酸配列:GPHRRLPPTPATR(配列番号65)を有するペプチド。
- アミノ酸配列:ANPSPATRPLPTR(配列番号66)を有するペプチド。
- RSTRPLPILPRTT、STPRPLPMLPTTR、STNRPLPMIPTTR、RSTRPLPSLPITT、STSRPLPSLPTTR、RSTRSLPPLPPTT、RSTRQLPIPPTTT、STPRPLPLIPTTP、RSTRPLPPTPLTT、およびRSTRPQPPPPITT(配列番号85−94)よりなる群から選ばれるアミノ酸配列を有するペプチド。
- VLKRPLPIPPVTR(配列番号64)、YSTRPVPPITRPS(配列番号76)、SHKSRLPPLPTRP(配列番号77)、GPHRRLPPTPATR(配列番号65)、PATRPLPTRPSRT(配列番号
81)、およびSGGILAPPVPPRN(配列番号84)よりなる群から選ばれるアミノ酸配列を有するペプチド。 - PPNSPLPPLPTHL(配列番号72)、TGRGPLPPLPNDS(配列番号74)、YRFRALPSPPSAS、LAQRQLPPTPGRD、ALQRRLPRTPPPA(配列番号78−80)、YSTRPLPSRPSRT、およびXPGRILLLPSEPR(配列番号82−83)よりなる群から選ばれるアミノ酸配列を有するペプチド。
- 請求項1に記載のペプチドをコードする核酸またはその相補鎖を含む構築物。
- DNAポリヌクレオチドである、請求項41に記載の構築物。
- RNAポリヌクレオチドである、請求項41に記載の構築物。
- 請求項18に記載のペプチドをコードする核酸またはその相補鎖を含む構築物。
- DNAポリヌクレオチドである、請求項44に記載の構築物。
- RNAポリヌクレオチドである、請求項44に記載の構築物。
- 形質転換用のベクターである、請求項41に記載の構築物。
- 形質転換用のベクターである、請求項44に記載の構築物。
- 請求項47に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
- 請求項48に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
- 請求項1に記載のペプチドおよび第2の分子を含んでなるコンジュゲート。
- 第2の分子がアミノ酸、ペプチド、タンパク質、核酸、ヌクレオシド、グリコシド残基、標識、薬剤または小分子よりなる群から選ばれる、請求項51に記載のコンジュゲート。
- SH3ドメイン結合性ペプチドおよび該ペプチドに直接的に、間接的にまたは複合体化により結合された検出可能な標識を含んでなる、SH3ドメインを検出するための診断用キットであって、該ペプチドが(i)式RXLPφφP(配列番号71)〔式中、Xはシステイン以外の任意のアミノ酸を表し、φは疎水性アミノ酸残基を表し、各文字は対応アミノ酸残基の標準一文字表記を表す〕のコア配列モチーフ;および(ii)該コア配列にそのC末端、N末端または両末端で隣接する2個以上の追加のアミノ酸残基;を含むことを特徴とする上記の診断用キット。
- SH3ドメイン結合性ペプチドおよび該ペプチドに直接的に、間接的にまたは複合体化により結合された薬剤を含んでなるドラッグデリバリーシステムであって、該ペプチドが(i)式RXLPφφP(配列番号71)〔式中、Xはシステイン以外の任意のアミノ酸を表し、φは疎水性アミノ酸残基を表し、各文字は対応アミノ酸残基の標準一文字表記を表す〕のコア配列モチーフ;および(ii)該コア配列にそのC末端、N末端または両末端で隣接する2個以上の追加のアミノ酸残基;を含むことを特徴とする上記のドラッグデリバリーシステム。
- 非経口的に、経口的に、腸内に、局所的に、または吸入により投与することができる、請求項54に記載のドラッグデリバリーシステム。
- 鼻腔内に、眼内に、または膣内に投与することができる、請求項54に記載のドラッグデリバリーシステム。
- 固体、ゲル、液体またはエーロゾルの形態である、請求項54に記載のドラッグデリバリーシステム。
- 有効量の請求項1に記載のペプチドおよび担体を含む組成物を投与することを含んでなる、SrcまたはSrc関連タンパク質の活性をモジュレートする方法。
- SrcまたはSrc関連タンパク質の活性を抑制する、請求項58に記載の方法。
- SrcまたはSrc関連タンパク質を活性化する、請求項58に記載の方法。
- SH3ドメインに結合する領域を有するペプチドの同定方法であって、
(a)SH3ドメインを含む標的タンパク質を固定化し;
(b)この固定化標的タンパク質を、ランダムペプチドライブラリーから分取したアリコートとともにインキュベートし;
(c)固定化標的タンパク質から未結合ペプチドを洗い流し;
(d)固定化標的タンパク質に結合したペプチドを回収し;そして
(e)SH3ドメイン結合性ペプチドの一次配列を決定する;
ことを含んでなる方法。 - 前記のライブラリーが表示ランダムペプチドライブラリーである、請求項61に記載の方法。
- 前記のライブラリーがファージ表示ランダムペプチドライブラリーである、請求項62に記載の方法。
- 前記のライブラリーがファージミド表示ランダムペプチドライブラリーである、請求項62に記載の方法。
- ステップ(c)が固定化標的タンパク質から未結合ファージを洗い流すことを含み、ステップ(d)が固定化標的タンパク質に結合したファージを回収することを含み、そしてステップ(e)が結合しているファージの核酸の関係のあるヌクレオチド配列を決定し、これからSH3ドメイン結合性ペプチドに対応する一次配列を推定することを含む、請求項61に記載の方法。
- SH3ドメインに結合する領域を有するペプチドの同定方法であって、
(a)SH3ドメインを含む標的タンパク質を固定化し;
(b)この固定化標的タンパク質を、ファージ表示ランダムペプチドライブラリー(該ライブラリーは≧8アミノ酸残基のランダム配列を有するペプチドを含む)から分取したアリコートとともにインキュベートし;
(c)固定化標的タンパク質から未結合ファージを洗い流し;
(d)固定化標的タンパク質に結合したファージを回収し;そして
(e)結合しているファージの核酸の関係のあるヌクレオチド配列を決定し、SH3ドメイン結合性ペプチドに対応する一次配列を推定する;
ことを含んでなる方法。 - 回収したファージの力価を増幅することをさらに含む、請求項66に記載の方法。
- SH3ドメイン結合性ペプチドを富化したファージを得るためにインキュベーション、洗浄および回収のステップを繰り返すことをさらに含む、請求項66に記載の方法。
- SH3ドメイン結合性ペプチドおよび製剤学的に許容される担体を含んでなる医薬組成物であって、該ペプチドが(i)式RXLPφφPXψ(配列番号10)〔式中、Xはシステイン以外の任意のアミノ酸を表し、φは疎水性アミノ酸残基を表し、ψはシステイン以外の親水性アミノ酸残基を表し、各文字は対応アミノ酸残基の標準一文字表記を表す〕の9-mer配列モチーフ;および場合により、(ii)該9-mer配列にそのC末端、N末端または両末端で隣接する追加のアミノ酸残基(該9-mer配列を加えて合計45個までのアミノ酸残基);を含むことを特徴とする上記の医薬組成物。
- 少なくとも1個の追加のアミノ酸が前記の9-mer配列に隣接して存在する、請求項69に記載の組成物。
- 少なくとも2個の追加のアミノ酸が前記の9-mer配列に隣接して存在する、請求項69に記載の組成物。
- 少なくとも3個の追加のアミノ酸が前記の9-mer配列に隣接して存在する、請求項69に記載の組成物。
- 有効量の請求項1に記載のペプチドを投与することを含んでなる、タンパク質チロシンキナーゼ媒介シグナル伝達経路の中断方法。
- 有効量の請求項1に記載のペプチドを投与することによる、RNAのプロセシング、トラフィッキング(trafficking)または翻訳の調節方法。
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