ES2870017T3 - Métodos de producción de polipéptidos híbridos con partes móviles - Google Patents

Métodos de producción de polipéptidos híbridos con partes móviles Download PDF

Info

Publication number
ES2870017T3
ES2870017T3 ES17177719T ES17177719T ES2870017T3 ES 2870017 T3 ES2870017 T3 ES 2870017T3 ES 17177719 T ES17177719 T ES 17177719T ES 17177719 T ES17177719 T ES 17177719T ES 2870017 T3 ES2870017 T3 ES 2870017T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
terminal
stretch
amino acids
human
consecutive amino
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES17177719T
Other languages
English (en)
Inventor
Daniel J Capon
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Biomolecular Holdings LLC
Original Assignee
Biomolecular Holdings LLC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biomolecular Holdings LLC filed Critical Biomolecular Holdings LLC
Application granted granted Critical
Publication of ES2870017T3 publication Critical patent/ES2870017T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C12N15/625—DNA sequences coding for fusion proteins containing a sequence coding for a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6875—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody being a hybrid immunoglobulin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A61K51/1084—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody the antibody being a hybrid immunoglobulin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Un proceso para elaborar un tramo de aminoácidos consecutivos que comprenden una cisteína del terminal C o una selenocisteína del terminal C, que comprende: (a) transfectar una célula con un ácido nucleico recombinante que comprende (i) una primera porción, cuya secuencia codifica una secuencia señal del terminal N, contigua a (ii) una segunda porción, cuya secuencia codifica un tramo de aminoácidos consecutivos seleccionados de un fragmento Fc de una inmunoglobulina IgG humana que contiene el dominio M1 o una porción del mismo, o el dominio extracelular de CD4 humano, TNR1A humano, TNR1B humano, VGFR1 humano, VGFR2 humano, VGFR3 humano, ErbB1 humano, ErbB2 humano, ErbB3 humano o ErbB4 humano, contiguo a (iii) una tercera porción, cuya secuencia codifica un dominio de unión que contiene inteína del terminal C, en condiciones que permitan (i) la síntesis de un polipéptido quimérico que comprende la secuencia señal del terminal N contigua al tramo de aminoácidos consecutivos contiguos al dominio de unión que contiene inteína del terminal C; y (ii) la escisión de la secuencia señal del terminal N del polipéptido quimérico, para producir un segundo polipéptido quimérico que comprende el tramo de aminoácidos consecutivos contiguos con el dominio de unión que contiene inteína del terminal C, (b) aislar el segundo polipéptido quimérico producido en la etapa (a); (c) tratar el segundo polipéptido quimérico para provocar la escisión mediada por tio del dominio de unión que contiene inteína del terminal C del tramo de aminoácidos consecutivos para formar un tioéster del terminal C; (d) ligar el producto de la etapa (c) con un residuo de cisteína o un residuo de selenocisteína en su terminal C para formar un producto con una cisteína del terminal C o una selenocisteína del terminal C; y (e) recuperar el producto de la etapa (d) que es el tramo de aminoácidos consecutivos que comprenden la cisteína del terminal C o la selenocisteína del terminal C.

Description

DESCRIPCIÓN
Métodos de producción de polipéptidos híbridos con partes móviles
Antecedentes de la invención
Todas las máquinas y dispositivos tienen partes móviles. La función de las partes móviles es realizar un trabajo, transformando una fuente de energía, para realizar una tarea útil. Las partes móviles cubren un espectro de tamaños y formas. En un extremo del espectro hay un mundo visible evidente en las máquinas que realizan tareas mecánicas. En el otro extremo del espectro se encuentra un mundo invisible de vehículos de carga utilizados por dispositivos que realizan trabajos eléctricos.
Este espectro es tan vasto que algunas de sus regiones apenas han comenzado a ser explotadas tecnológicamente. Entre estos se encuentran dispositivos con partes móviles de varios nanómetros a varios cientos de nanómetros. Este intervalo de tamaño tiene un interés considerable para muchos científicos e ingenieros porque es comparable al tamaño mismo de las moléculas, las unidades fundamentales de la materia química. Las nanomáquinas tienen el potencial de explotar las propiedades únicas de las moléculas, tales como la unión intermolecular o la catálisis.
La capacidad de fabricar moléculas de cualquier tamaño y forma imaginables es una actividad crucial en la construcción de nanomáquinas. Como tal, ha sido ampliamente anticipado en medicina, electrónica, óptica y muchos otros campos. Se ha centrado una tremenda actividad comercial en la síntesis de un gran número de moléculas químicamente distintas. Sin embargo, la configuración molecular (diferencias en los enlaces) es solo un medio práctico de generar diversidad. La conformación molecular (diferencias en la rotación de enlaces) ofrece otra vía importante para generar un universo de tamaño y forma continuos.
La conformación molecular tiene ciertas ventajas únicas en las estrategias para crear moléculas con partes móviles. Si bien los átomos y los enlaces químicos tienen dimensiones lineales y angulares precisas, el cambio conformacional puede proporcionar una variación ilimitada en el tamaño y la forma de las moléculas. Los enlaces químicos covalentes y no covalentes proporcionan grados de libertad de rotación. La rotación diédrica alrededor de cada uno de una serie de enlaces que conectan distintas partes (dominios) de una molécula es capaz de proporcionar el ingrediente dinámico esencial de las nanomáquinas.
En general, dos átomos dados cualesquiera interconectados por un enlace simple (es decir, un solo par de electrones) pueden girar completamente 360 grados entre sí y con respecto a los otros átomos a los que cada uno está unido. Una serie de enlaces sencillos consecutivos es como una serie de rótulas interconectadas. Aunque se limita a movimientos rotatorios, una serie de enlaces sencillos consecutivos, tal como una serie de rótulas consecutivas, puede recapitular el movimiento de otros tipos de partes móviles interconectadas (por ejemplo, una serie de bisagras consecutivas).
Un aspecto desafiante de la creación de nanomáquinas útiles es lograr un equilibrio en el número de partes móviles y el número de interconexiones. Por encima de cierto umbral, aumentar el número de partes o conexiones en cualquier máquina es contraproducente. Por lo tanto, los motores de automóviles emplean un número óptimo de pistones, válvulas, árboles de levas, poleas, etc.
El desafío análogo en el campo químico se ilustra mediante dos tipos de moléculas relacionadas, pero muy diferentes, a saber, polímeros orgánicos y biológicos. El polietileno y las proteínas proporcionan una buena comparación. Los polietilenos son tramos de etilenos consecutivos, (CH2)n, interconectados por enlaces sencillos consecutivos (-C-)n, mientras que las proteínas son tramos de aminoácidos consecutivos, (NHCHRCO)n, interconectados por enlaces peptídicos consecutivos (=N-C-C=)n. Los polietilenos no ramificados son cadenas repetidas de enlaces sencillos, mientras que las proteínas son cadenas repetidas de un doble enlace seguido de dos enlaces sencillos. La diferencia más importante entre estos dos tipos de cadenas es que el polietileno puede adoptar casi cualquier conformación y, por lo tanto, no tiene un tamaño o forma definidos (solamente uno promediado estadísticamente), mientras que las proteínas son extremadamente rígidas y, por lo tanto, tienen un tamaño y forma muy definidos (e invariables).
Una comparación simple pero razonable con un dispositivo mecánico representaría al polietileno como una máquina con una alta proporción de partes móviles con respecto a las conexiones, y una proteína como una máquina con una baja proporción de partes móviles con respecto a las conexiones. Ninguna molécula es muy adecuada para una tarea similar a una máquina, a menos que se aprovechen las estructuras de orden superior que cada una puede formar. Por ejemplo, el polietileno es útil cuando se aprovecha su capacidad para formar fibras intermoleculares. Es interesante que la capacidad del polietileno para mostrar tal estructura terciaria depende de su flexibilidad inherente. Aunque algunas proteínas pueden formar fibras de valor comercial (por ejemplo, seda, lana y colágeno), la mayoría de las proteínas son globulares y no lo hacen.
Las proteínas globulares son, para casi todos los propósitos prácticos, máquinas con pocas o ninguna parte móvil, como una palanca que debe ejercer su influencia en combinación con otros objetos, como el ser humano que la empuña y los objetos contra los que está encajada. No obstante, hay muchos casos en los que sería de gran valor para las moléculas similares a proteínas que tienen regiones distintas (por ejemplo, dominios de unión) que se unen entre sí de alguna manera permitiendo un movimiento relativo pero coordinado. Un ejemplo serían las moléculas similares a proteínas capaces de unirse cooperativamente a un objetivo de la enfermedad que tiene dos o más sitios de unión idénticos. Esto aprovecharía al máximo las propiedades únicas de los dominios de unión a proteínas globulares, a saber, su gran especificidad por los objetivos, en particular otras proteínas asociadas con la enfermedad.
Se puede estimar cuantitativamente el valor comercial potencial de moléculas similares a proteínas que pueden unirse cooperativamente a un objetivo de la enfermedad. Una suposición inicial es que la mayoría de los compuestos terapéuticos actualmente en uso, ya sean moléculas pequeñas o compuestos biofarmacéuticos, típicamente unen sus dianas de forma no cooperativa con constantes de afinidad del orden nanomolar (10-9 M). Sorprendentemente, un compuesto terapéutico cooperativo podría posiblemente unirse a la misma diana, con una afinidad de nanomolar x nanomolar (10-9 M x 10-9 M) [es decir, attomolar (10-18 M)].
Debido a que los compuestos terapéuticos se requieren típicamente en un gran exceso molar sobre sus dianas (aproximadamente un millón de veces), un compuesto terapéutico cooperativo sería equivalente a un compuesto terapéutico no cooperativo a una dosis de 10-6 veces más pequeña. Para muchos productos biofarmacéuticos actuales (por ejemplo, anticuerpos e inmunoadhesinas), esta diferencia asciende a 1 microgramo por dosis única en lugar de 1 gramo por dosis única. Con costes para los pacientes que exceden los $ 1.000 por gramo, este factor tiene una gran importancia en el descubrimiento y desarrollo de nuevos fármacos, así como para los compuestos biofarmacéuticos existentes.
Una ironía asociada con los anticuerpos y las inmunoadhesinas es que, si bien son proteínas simétricas que tienen dos dominios de unión idénticos, generalmente no se unen simétricamente a dianas simétricas. Las conexiones inflexibles entre los dos dominios de enlace no proporcionan el movimiento similar a una máquina que permitiría el enlace cooperativo. Numerosos intentos de diseñar anticuerpos e inmunoadhesinas que se unan simétricamente han fracasado debido a la dificultad de lograr la geometría precisa necesaria para las simetrías complementarias entre los sitios de unión y los sitios diana. A diferencia de los materiales utilizados para fabricar máquinas convencionales, tales como madera, metales, plásticos, cerámicas y similares, las moléculas no pueden simplemente cortarse, forjarse, fundirse, mecanizarse o unirse a un tamaño y forma exactos.
Si bien la unión cooperativa no se logra así fácilmente con un solo tamaño y forma fijos, la flexibilidad conformacional entre dominios de unión proporciona una solución potencial. Una estrategia de "talla única" se basa en la proposición de que una molécula similar a una proteína con dominios de unión que se mueven simétricamente también será capaz de unirse simétricamente (es decir, cooperatividad). Los dominios de unión se impulsan termodinámicamente en una conformación más compatible con la unión simultánea de ambos sitios diana porque representa los mínimos conformacionales favorecidos energéticamente.
La solicitud internacional de patente WO 00/00625 describe la producción de proteínas o péptidos usando una tecnología de proteína de fusión de dominio de unión de inteína-quitina.
Hondal et al., Methods in enzimology, vol. 347, páginas 70-83, discuten varios enfoques para la síntesis de proteínas con una selenocisteína.
La solicitud de patente de los Estados Unidos US 2005/027109 describe métodos de síntesis de proteínas quiméricas que comprenden una porción de una región constante de inmunoglobulina y una molécula biológicamente activa.
Sumario de la invención
En una realización, esta invención proporciona un proceso para elaborar un tramo de aminoácidos consecutivos que comprenden una cisteína del terminal C o una selenocisteína del terminal C, que comprende:
(a) transfectar una célula con un ácido nucleico recombinante que comprende
(i) una primera porción, cuya secuencia codifica una secuencia señal del terminal N, contigua a
(ii) una segunda porción, cuya secuencia codifica un tramo de aminoácidos consecutivos seleccionados de un fragmento Fc de una inmunoglobulina IgG humana que contiene el dominio M1 o una porción del mismo, o el dominio extracelular de CD4 humana, TNR1A humano, TNr 1b humano , VGFR1 humana, VGFR2 humana, VGFR3 humana, ErbB1 humano, ErbB2 humano, ErbB3 humano o ErbB4 humano, contiguo a
(iii) una tercera porción, cuya secuencia codifica un dominio de unión que contiene inteína del terminal C, en condiciones que permitan
(i) la síntesis de un polipéptido quimérico que comprende la secuencia señal del terminal N contigua con el tramo de aminoácidos consecutivos contiguos al dominio de unión que contiene inteína del terminal C; y
(ii) la escisión de la secuencia señal del terminal N del polipéptido quimérico, para producir un segundo polipéptido quimérico que comprende el tramo de aminoácidos consecutivos contiguos con el dominio de unión que contiene inteína del terminal C,
(b) aislar el segundo polipéptido quimérico producido en la etapa (a);
(c) tratar el segundo polipéptido quimérico para provocar la escisión mediada por tio del dominio de unión que contiene inteína del terminal C del tramo de aminoácidos consecutivos para formar un tioéster del terminal C;
(d) ligar el producto de la etapa (c) con un residuo de cisteína o un residuo de selenocisteína en su terminal C para formar un producto con una cisteína del terminal C o una selenocisteína del terminal C; y
(e) recuperar el producto de la etapa (d) que es el tramo de aminoácidos consecutivos que comprenden la cisteína del terminal C o la selenocisteína del terminal C.
En una realización, esta invención también proporciona un proceso de fabricación de un producto que comprende un tramo de aminoácidos consecutivos de un fragmento Vk-Ck de una inmunoglobulina, unidos por enlaces disulfuro a un tramo de aminoácidos consecutivos de un fragmento VH-CH1 de una inmunoglobulina con una cisteína del terminal C o una selenocisteína del terminal C, que comprende:
(a) cotransfectar una célula con:
(i) un primer ácido nucleico recombinante que comprende
(a) una primera porción, cuya secuencia codifica una secuencia señal del terminal N contigua a
(b) una segunda porción, cuya secuencia codifica un tramo de aminoácidos consecutivos de un fragmento Vk-Ck de una inmunoglobulina; y
(ii) un segundo ácido nucleico recombinante que comprende
(a) una primera porción, cuya secuencia codifica una secuencia señal del terminal N, contigua a
(b) una segunda porción, cuya secuencia codifica un tramo de aminoácidos consecutivos de un fragmento VH-CH1 de una inmunoglobulina, contigua a
(c) una tercera porción, cuya secuencia codifica un dominio de unión que contiene inteína del terminal C,
en condiciones tales que permitan:
(i) la síntesis de (a) un polipéptido quimérico que comprende una secuencia señal del terminal N contigua con un tramo de aminoácidos consecutivos de un fragmento Vk-Ck de una inmunoglobulina, y (b) un polipéptido quimérico que comprende una secuencia señal del terminal N contigua a un tramo de aminoácidos consecutivos de un fragmento VH-CH1 de una inmunoglobulina contigua a un dominio de unión que contiene inteína del terminal C;
(ii) la escisión de la secuencia señal del terminal N de cada polipéptido quimérico;
(iii) la secreción de (1) un tramo de aminoácidos consecutivos de un fragmento Vk-Ck de una inmunoglobulina, y (2) un tramo de aminoácidos consecutivos de un fragmento VH-CH1 de una inmunoglobulina contigua a un dominio de unión que contiene inteína del terminal C; y
(iv) la formación de un enlace disulfuro entre (1) y (2),
(b) aislar el producto de la etapa (a);
(c) tratar el producto aislado de la etapa (b) para provocar la escisión mediada por tio del dominio de unión que contiene inteína del terminal C del tramo de aminoácidos consecutivos de un fragmento VH-CH1 de una inmunoglobulina, para formar un tioéster del terminal C;
(d) ligar el producto de la etapa (c) con un residuo de cisteína o un residuo de selenocisteína para formar un producto que comprende un tramo de aminoácidos consecutivos de un fragmento VH-CH1 de una inmunoglobulina con una cisteína del terminal C o una selenocisteína del terminal C; y
(e) recuperar el producto de la etapa (d) que es el producto que comprende un tramo de aminoácidos consecutivos de un fragmento Vk-Ck de una inmunoglobulina, unido por enlaces disulfuro a un tramo de aminoácidos consecutivos de un fragmento VH-CH1 de una inmunoglobulina con una cisteína del terminal C o una selenocisteína del terminal C.
También se divulga en el presente documento un compuesto que comprende un primer tramo de aminoácidos consecutivos, cada uno de los cuales está unido al aminoácido precedente mediante un enlace peptídico y cuya secuencia comprende un sitio de unión para una diana; y un segundo tramo de aminoácidos consecutivos, cada uno de los cuales está unido al aminoácido precedente por un enlace peptídico y cuya secuencia es idéntica a la secuencia del primer tramo de aminoácidos consecutivos y que comprende un sitio de unión idéntico para el objetivo; en el que cada uno del primer tramo de aminoácidos y el segundo tramo de aminoácidos tiene en un extremo predefinido del mismo un residuo de cisteína o un residuo de selenocisteína y dichos residuos de cisteína o dichos residuos de selenocisteína están unidos por un enlace que tiene la estructura:
Figure imgf000005_0001
en la que cada X es igual y representa un azufre (S) o un selenio (Se) y cada C representa un carbono beta de uno de dichos residuos de cisteína o selenocisteína.
También se divulga en el presente documento un compuesto que comprende un primer tramo de aminoácidos consecutivos, cada uno de los cuales está unido al aminoácido precedente mediante un enlace peptídico y cuya secuencia comprende un sitio de unión para una diana; y un segundo tramo de aminoácidos consecutivos, cada uno de los cuales está unido al aminoácido precedente por un enlace peptídico y cuya secuencia es diferente de la secuencia del primer tramo de aminoácidos consecutivos y que comprende un sitio de unión para una fracción diferente; en el que cada uno del primer tramo de aminoácidos y el segundo tramo de aminoácidos tiene en un extremo predefinido del mismo un residuo de cisteína o un residuo de selenocisteína y dichos residuos están unidos por un enlace que tiene la estructura:
Figure imgf000005_0002
en la que cada X puede ser igual o diferente y representa un azufre (S) o un selenio (Se) y cada C representa un carbono beta de uno de dichos residuos de cisteína o selenocisteína.
Los dispositivos genéticos divulgados en el presente documento comprenden dos o más tramos de aminoácidos consecutivos que están conectados en un terminal predefinido mediante un enlace no peptídico. Dichos dispositivos genéticos son ambos simétricos y se unen simétricamente con respecto a una o más dianas importantes (es decir, cooperativas). Los dispositivos genéticos en este documento son moléculas similares a proteínas que pueden describirse mediante una serie de términos relacionados que incluyen simetroadhesinas, inmunosimetroadhesinas, hemisimetroadhesinas y bisimetroadhesinas [que significa "adherirse proporcionalmente", del griego symmetros "que tienen una medida común, uniforme, proporcionada", y la L. adhaerentem, prp. de adhaerere "adherirse a"].
En el presente documento se divulga un compuesto que comprende dos o más dominios proteicos plegables de forma independiente unidos entre sí a través de uno o más enlaces no peptídicos, alrededor de los cuales puede producirse la rotación diédrica del enlace o enlaces.
Breve descripción de las Figuras
Figura 1: Tramos de aminoácidos consecutivos, con un terminal X, que representan las posiciones de los extremos N, C, S y Se. Los residuos de aminoácidos del terminal N y del terminal C, dibujados como una proyección estilo Newman, se muestran arriba y debajo del plano de proyección, respectivamente: (i) Un tramo de aminoácidos consecutivos (estructura generalizada), que tiene, un residuo de aminoácido del terminal N (cadena lateral = R1) que tiene un grupo a-amino (NH2) libre, y un residuo de aminoácido del terminal C (cadena lateral = Rn) que tiene un grupo a-carboxilo (COOH) libre. (ii) Un tramo de aminoácidos consecutivos, con el extremo S del terminal N, que tiene una cisteína del terminal N que tiene grupos a-amino (NH2) y p-sulfhidrilo (SH) libres, y un residuo de aminoácido del terminal C que tiene un grupo a-carboxilo (COOH) libre. (iii) Un tramo de aminoácidos consecutivos, con extremo S, del terminal C que tiene un residuo de aminoácido del terminal N que tiene un grupo a-amino (NH2) libre, y una cisteína del terminal C que tiene grupos a-carboxilo (COOH) y p-sulfhidrilo (SH) libres. (iv) Un tramo de aminoácidos consecutivos, con un extremo Se del terminal N, que tiene una selenocisteína del terminal N que tiene grupos a-amino (NH2) y pselenohidrilo (SeH) libres, y un residuo de aminoácido del terminal C que tiene un grupo a-carboxilo (COOH) libre. (v) Un tramo de aminoácidos consecutivos, con el extremo Ce del terminal C, que tiene un residuo de aminoácido del terminal N que tiene un grupo a-amino (NH2) libre, y una selenocisteína del terminal C que tiene grupos a-carboxilo (COOH) y p-selenohidrilo (SeH) libres.
Figura 2: Tramos de aminoácidos consecutivos, con dos extremos X, que representan las posiciones de los extremos N, C, S y Se. Los residuos de aminoácidos del terminal N y el terminal C, dibujados como una proyección de estilo Newman, se muestran por encima y por debajo del plano de proyección, respectivamente. (i) Un tramo de aminoácidos consecutivos, con dos extremos X (estructura generalizada), que tiene un residuo de aminoácido del terminal N (cadena lateral = X1) que tiene un grupo a-amino (NH2) libre y un residuo de aminoácidos del terminal C (cadena lateral = Xn) que tiene un grupo a-carboxilo (COOH) libre. (ii) Un tramo de aminoácidos consecutivos, con el extremo S del terminal N y el extremo S del terminal C, que tiene una cisteína del terminal N que tiene grupos a-amino (NH2) y p-sulfhidrilo (SH) libres, y una cisteína del terminal C que tiene grupos a-carboxilo (COOH) y p-sulfhidrilo (SH) libres. (iii) Un tramo de aminoácidos consecutivos, con el extremo S del terminal N el extremo Se del terminal C, que tiene una cisteína del terminal N que tiene grupos a-amino (NH2) y p-sulfhidrilo (SH) libres, y una selenocisteína del terminal C que tiene grupos a-carboxilo (COOH) y p-selenohidrilo (SeH) libres. (iv) Un tramo de aminoácidos consecutivos, con el extremo Se del terminal N y extremo S del terminal C, que tiene, una Selenocisteína del terminal N que tiene grupos a-amino (NH2) y p-selenohidrilo (SeH) libres, y una cisteína del terminal C que tiene grupos a-carboxilo (COOH) y psulfhidrilo (SH) libres. (v) Un tramo de aminoácidos consecutivos, con el extremo Se del terminal N y el extremo Se del terminal C, que tienen una selenocisteína del terminal N que tiene grupos a-amino (NH2) y p-selenohidrilo (SeH) libres, y una selenocisteína del terminal C que tiene grupos a-carboxilo (COOH) y p-selenohidrilo (SeH) libres.
Figura 3: Estructura general de un polipéptido quimérico que consiste en un primer tramo de aminoácidos consecutivos unido en su extremo C por un enlace peptídico al extremo N de un segundo tramo de aminoácidos consecutivos. Los polipéptidos quiméricos, tales como las proteínas que se encuentran en la naturaleza, son tramos continuos de aminoácidos consecutivos, cada uno de los cuales está unido al aminoácido precedente mediante un enlace peptídico. Como otras proteínas, los polipéptidos quiméricos tienen una flexibilidad conformacional limitada porque el enlace peptídico por sí mismo no proporciona más de dos enlaces sencillos consecutivos capaces de rotación diédrica a lo largo de la cadena polipeptídica. Los residuos de aminoácidos en la figura se numeran de la siguiente manera: El primer tramo de aminoácidos consecutivos tiene longitud = n residuos y una numeración = 1, 2, 3, ..., (n-2), (n-1), n. El segundo tramo de aminoácidos consecutivos tiene longitud = p residuos y una numeración = 1 ', 2', 3 ', ..., (p-2), (p-1), p. El polipéptido quimérico tiene longitud = (n p) residuos y una numeración = 1, 2, 3, ..., (n-2), (n-1), n, (n 1), (n 2 ), (n 3), ..., (n p-2), (n p-1), (n p). Las formas tautoméricas mayor y menor y la estructura de resonancia se muestran a la izquierda, centro y derecha, respectivamente.
Figura 4A: Estructura general de una "simetroadhesina" con una configuración de cabeza a cola que consiste en un primer tramo de aminoácidos consecutivos unidos en su extremo X del terminal C por un enlace -X-X- al extremo X del terminal N de un segundo tramo de aminoácidos consecutivos. El enlace -X-X- no es un enlace peptídico. Los ejemplos no limitantes de los enlaces contemplados en este documento incluyen cualquier combinación en la que cada X es un átomo de S o de Se. La polaridad general de las simetroadhesinas de cabeza a cola es del terminal N al C. Las simetroadhesinas, al igual que las proteínas, son tramos de aminoácidos consecutivos, cada uno de los cuales está unido al aminoácido anterior, pero se diferencian de las proteínas al sustituir uno o más enlaces -X-X- por enlaces peptídicos. Las simetroadhesinas tienen mayor flexibilidad conformacional que los polipéptidos porque cada enlace -X-X- proporciona siete enlaces sencillos adyacentes capaces de rotación diédrica. Los residuos de aminoácidos se numeran como sigue: El primer tramo de aminoácidos consecutivos tiene una longitud = n residuos y una numeración = 1,2, 3, ..., (n-2), (n-1), n. El segundo tramo de aminoácidos consecutivos tiene longitud = p residuos y una numeración = 1', 2', 3', ..., (p-2), (p-1), p. La simetroadhesina de cabeza a cola tiene una longitud = (n p) residuos y una numeración = 1, 2, 3, ..., (n-2), (n-1), n, (n 1), (n 2), (n 3), ..., (n p-2), (n p-1), (n p). Las formas tautoméricas mayor y menor y la estructura de resonancia se muestran a la izquierda, centro y derecha, respectivamente.
Figura 4B: La simetroadhesina de la Figura 4A (izquierda) comparada con una simetroadhesina (derecha) que consiste en un primer tramo de aminoácidos consecutivos unidos en el extremo X de su penúltimo residuo del terminal C por un enlace -X-X- al extremo X del penúltimo residuo del terminal N de un segundo tramo de aminoácidos consecutivos. Se muestran las estructuras de resonancia para cada uno.
Figura 4C: La simetroadhesina de la Figura 4A (izquierda) comparada con una simetroadhesina (derecha) que consiste en un primer tramo de aminoácidos consecutivos unidos al extremo X de su antepenúltimo residuo del terminal C por un enlace -X-X- al extremo X del antepenúltimo residuo del terminal N de un segundo tramo de aminoácidos consecutivos. Se muestran las estructuras de resonancia para cada uno.
Figura 4D: La simetroadhesina de la Figura 4A (izquierda) comparada con una simetroadhesina (derecha) que consiste en un primer tramo de aminoácidos consecutivos unidos al extremo X de su preantepenúltimo residuo del terminal C por un enlace -X-X- al extremo X del preantepenúltimo residuo del terminal N de un segundo tramo de aminoácidos consecutivos. Se muestran las estructuras de resonancia para cada uno.
Figura 5: Estructura general de una simetroadhesina con una configuración de cabeza a cabeza que consiste en un primer tramo de aminoácidos consecutivos, unido a su extremo X del terminal N por un enlace -X-X- al extremo X del terminal N de un segundo tramo de aminoácidos consecutivos. La polaridad general de las simetroadhesinas cabeza a cabeza cambia en la posición del enlace -X-X-, pasando del terminal C al N al terminal N al C. Los residuos de aminoácidos se numeran como sigue: El primer tramo de aminoácidos consecutivos tiene una longitud = n residuos y una numeración = 1,2, 3, ..., (n-2), (n-1), n. El segundo tramo de aminoácidos consecutivos tiene longitud = p residuos y una numeración = 1', 2', 3', ..., (p-2), (p-1), p. La simetroadhesina cabeza a cabeza tiene una longitud = (n p) residuos y una numeración = n, (n-1), (n-2), ..., 3, 2, 1, (inversión), 1' , 2', 3', ..., (p-2), (p-1), p. Las formas tautoméricas mayor y menor y la estructura de resonancia se muestran a la izquierda, centro y derecha, respectivamente.
Figura 6: Estructura general de una simetroadhesina con una configuración de cola a cola que consiste en un primer tramo de aminoácidos consecutivos unidos en su extremo X del terminal C por un enlace -X-X- al extremo X del terminal C de un segundo tramo de aminoácidos consecutivos. La polaridad general de las simetroadhesinas de cola a cola cambia en la posición del enlace -X-X-, pasando del terminal N al C al terminal C al N. Los residuos de aminoácidos se numeran como sigue: El primer tramo de aminoácidos consecutivos tiene una longitud = n residuos y una numeración = 1,2, 3, ..., (n-2), (n-1), n. El segundo tramo de aminoácidos consecutivos tiene longitud = p residuos y una numeración = 1', 2', 3', ..., (p-2), (p-1), p. La simetroadhesina de cola a cola tiene longitud = n p residuos y una numeración = 1, 2, 3, ..., (n-2), (n-1), n, (inversión), p, (p -1), (p - 2), ..., 3', 2', 1'. Las formas tautoméricas mayor y menor y la estructura de resonancia se muestran a la izquierda, centro y derecha, respectivamente.
Figura 7: Una representación esquemática de una hemisimetroadhesina de cabeza a la cola que muestra la conformación todo trans. Los siete enlaces sencillos consecutivos que unen el extremo X del terminal C con el extremo X del terminal N son trans (N-C-C-X-X-C-C-C). Los dos dominios de unión apuntan en dirección opuesta entre sí en esta conformación; una rotación de 180 grados alrededor de cualquiera de los siete enlaces sencillos consecutivos apuntará los dos dominios de unión uno hacia el otro. Las hemisimetroadhesinas con la configuración de cabeza a cola son moléculas asimétricas independientemente de la conformación (comparar las Figuras 7 y 8); sin embargo, dos o más hemisimetroadhesinas de cabeza a cola pueden formar juntas una molécula simétrica.
Figura 8: Una representación esquemática de una hemisimetroadhesina de cabeza a cola que muestra la conformación X-cis-X. Todos menos uno de los siete enlaces sencillos consecutivos que unen el extremo X del terminal C con el extremo X del terminal N son trans (N-C-C-X-cis-X-C-C-C). Los dos dominios de unión apuntan uno hacia el otro en esta conformación; más rotaciones de 180 grados alrededor de cualquiera de los siete enlaces sencillos consecutivos apuntarán a los dos dominios de unión lejos uno del otro. Las hemisimetroadhesinas con la configuración de cabeza a cola son moléculas asimétricas independientemente de la conformación (comparar las Figuras 7 y 8); sin embargo, dos o más hemisimetroadhesinas de cabeza a cola pueden formar juntas una molécula simétrica.
Figura 9: Una representación esquemática de una hemisimetroadhesina cabeza a cabeza que muestra la conformación todo trans. Todos los siete enlaces sencillos consecutivos que unen el primer extremo X del terminal N y el segundo extremo X del terminal N son trans (C-C-C-X-X-C-C-C). Los dos dominios de unión apuntan en dirección opuesta entre sí en esta conformación; una rotación de 180 grados alrededor de cualquiera de los siete enlaces sencillos consecutivos apuntará los dos dominios de unión uno hacia el otro. Las hemisimetroadhesinas con la configuración cabeza a cabeza son moléculas simétricas en sólo dos de sus posibles conformaciones: la todo trans y la X-cis-X (comparar las Figuras 9 y 10); sin embargo, dos o más subunidades de hemisimetroadhesinas cabeza a cabeza pueden formar una molécula que tiene un número ilimitado de conformaciones simétricas.
Figura 10: Una representación esquemática de una hemisimetroadhesina cabeza a cabeza que muestra la conformación X-cis-X. Todos menos uno de los siete enlaces sencillos consecutivos que unen el primer extremo X del terminal N y el segundo extremo X del terminal N son trans (C-C-C-X-cis-X-C-C-C). Los dos dominios de unión apuntan uno hacia el otro en esta conformación; más rotaciones de 180 grados alrededor de cualquiera de los siete enlaces sencillos consecutivos apuntarán a los dos dominios de unión lejos uno del otro. Las hemisimetroadhesinas con la configuración cabeza a cabeza son moléculas simétricas en sólo dos de sus posibles conformaciones: la todo trans y la X-cis-X (comparar las Figuras 9 y 10); sin embargo, dos o más subunidades de hemisimetroadhesinas cabeza a cabeza pueden formar una molécula que tiene un número ilimitado de conformaciones simétricas.
Figura 11: Una representación esquemática de una hemisimetroadhesina de cola a cola que muestra la conformación todo trans. Todos los siete enlaces sencillos consecutivos que unen el primer extremo X del terminal C y el segundo extremo X del terminal C son trans (N-C-C-X-X-C-C-N). Los dos dominios de unión apuntan en dirección opuesta entre sí en esta conformación; una rotación de 180 grados alrededor de cualquiera de los siete enlaces sencillos consecutivos apuntará los dos dominios de unión uno hacia el otro. Las hemisimetroadhesinas con la configuración de cola a cola son moléculas simétricas en sólo dos de sus posibles conformaciones: la todo trans y la X-cis-X (comparar las Figuras 11 y 12); sin embargo, dos o más subunidades de hemisimetroadhesinas de cola a cola pueden formar una molécula que tiene un número ilimitado de conformaciones simétricas.
Figura 12: Una representación esquemática de una hemisimetroadhesina de cola a cola que muestra la conformación X-cis-X. Todos menos uno de los siete enlaces sencillos consecutivos que unen el primer extremo X del terminal C y el segundo extremo X del terminal C son trans (N-C-C-X-cis-X-C-C-N). Los dos dominios de unión apuntan uno hacia el otro en esta conformación; más rotaciones de 180 grados alrededor de cualquiera de los siete enlaces sencillos consecutivos apuntarán a los dos dominios de unión lejos uno del otro. Las hemisimetroadhesinas con la configuración de cola a cola son moléculas simétricas en sólo dos de sus posibles conformaciones: la todo trans y la X-cis-X (comparar las Figuras 9 y 10); sin embargo, dos o más subunidades de hemisimetroadhesinas de cola a cola pueden formar una molécula que tiene un número ilimitado de conformaciones simétricas.
Figura 13: Una representación esquemática de una hemisimetroadhesina de cola a cola que consta de dos dominios de unión Fab de inmunoglobulina. La conformación todo trans se muestra en este documento. Todos los siete enlaces sencillos consecutivos que unen el primer extremo X del terminal C y el segundo extremo X del terminal C son trans (N-C-C-X-X-C-C-N). Los dos dominios de unión de Fab se alejan uno del otro en esta conformación; una rotación de 180 grados alrededor de cualquiera de los siete enlaces sencillos consecutivos apuntará los dominios de unión Fab uno hacia el otro (comparar las Figuras 13 y 14). Las regiones de la cadena pesada están unidas por el enlace X-X; las regiones de cadena ligera están unidas a las regiones de cadena pesada mediante enlaces disulfuro internos. Abreviaturas: VL, región variable de cadena ligera; CL, región constante de cadena ligera; VH, región variable de cadena pesada; CH1, región constante 1 de cadena pesada.
Figura 14: Una representación esquemática de una hemisimetroadhesina de cola a cola que consta de dos dominios de unión Fab de inmunoglobulina. En este documento se muestra la conformación X-cis-X. Todos menos uno de los siete enlaces sencillos consecutivos que unen el primer extremo X del terminal C y el segundo extremo X del terminal C son trans (N-C-C-X-cis-X-C-C-N). Los dos dominios de unión de Fab apuntan uno hacia el otro en esta conformación; una rotación adicional de 180 grados alrededor de cualquiera de los siete enlaces sencillos consecutivos apuntará a los dominios de unión Fab alejándose unos de otros (comparar las Figuras 13 y 14). Las regiones de la cadena pesada están unidas por el enlace X-X; las regiones de cadena ligera están unidas a las regiones de cadena pesada mediante enlaces disulfuro internos. Abreviaturas: VL, región variable de cadena ligera; CL, región constante de cadena ligera; VH, región variable de cadena pesada; CH1, región constante 1 de cadena pesada.
Figura 15: Representación esquemática de la molécula de inmunoadhesina (Capon et al., (1989) Nature 337, 525­ 530). Las inmunoadhesinas son polipéptidos quiméricos que forman dímeros unidos por disulfuro. Cada polipéptido quimérico consta de un dominio de unión unido en su terminal C por un enlace peptídico al terminal N de un dominio Fc de inmunoglobulina. Aunque las inmunoadhesinas son estructuralmente simétricas, generalmente no se unen cooperativamente a moléculas diana diméricas o multiméricas. Abreviaturas: CH2, región constante 2 de cadena pesada; CH3, región constante 30de cadena pesada.
Figura 16: Representación esquemática de la molécula de inmunoglobulina (anticuerpo). Las inmunoglobulinas son heterotetrámeros que constan de dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras. Aunque las inmunoglobulinas son estructuralmente simétricas, generalmente no se unen de manera cooperativa a moléculas diana diméricas o multiméricas. Abreviaturas: VL, región variable de cadena ligera; CL, región constante de cadena ligera; VH, región variable de cadena pesada; CH1, región constante 1 de cadena pesada; CH2, región constante 2 de cadena pesada; CH3, región constante 3 de cadena pesada.
Figura 17: Una representación esquemática de una inmunosimetroadhesina de cabeza a cola que muestra la conformación todo trans. Las inmunosimetroadhesinas de cabeza a la cola son hemisimetroadhesinas de cabeza a la cola que forman dímeros unidos por disulfuro. Cada hemisimetroadhesina consta de un dominio de unión Fab de inmunoglobulina que tiene un extremo X del terminal C unido por un enlace -X-X- a una subunidad Fc de inmunoglobulina que tiene un extremo X del terminal N. El dímero contiene dos dominios de unión a Fab funcionales y un dominio de unión a Fc funcional. Los siete enlaces sencillos consecutivos que unen cada dominio Fab a una subunidad Fc son todos trans (N-C-C-X-X-C-C-C). Las rotaciones simétricas de 180 grados alrededor del primer (NC), tercer (CX), quinto (XC) o séptimo (CC) pares de enlaces sencillos consecutivos moverán los dos dominios Fab en una primera dirección general (comparar las Figuras 17 y 18). Las rotaciones simétricas de 180 grados alrededor del segundo (C-C), cuarto (X-X) o sexto (C-C) pares de enlaces sencillos moverán los dos dominios Fab en una segunda dirección general (comparar las Figuras 17 y 19).
Figura 18: Una representación esquemática de una inmunosimetroadhesina de cabeza a cola que muestra la conformación X-cis-C. La conformación X-cis-C se obtiene a partir de la conformación todo trans mediante la rotación simétrica del quinto par de siete enlaces sencillos consecutivos (N-C-C-X-X-cis-C-C-C) (comparar las Figuras 17 y 18) . Otras conformaciones que son similares a la conformación X-cis-C que se muestra en este documento se obtienen de la conformación todo trans después de la rotación simétrica del primero (N-cis-CCXXCCC), el tercero (NCC-cis-XXCCC) o el séptimo pares (NCCXXCC-cis-C) de enlaces sencillos consecutivos.
Figura 19: Una representación esquemática de una inmunosimetroadhesina de cabeza a cola que muestra la conformación X-cis-X. La conformación X-cis-X se obtiene a partir de la conformación todo trans mediante la rotación simétrica del cuarto par de siete enlaces sencillos consecutivos (N-C-C-X-cis-X-C-C-C) (comparar las Figuras 17 y 19) . Otras conformaciones que son similares a la conformación X-cis-X que se muestra en este documento se obtienen a partir de la conformación todo trans después de la rotación simétrica del segundo (NC-cis-CXXCCC), o los sextos pares (NCCXXC-cis-CC) de enlaces sencillos consecutivos.
Figura 20: Una representación esquemática de una inmunosimetroadhesina de cola a cola que muestra la conformación todo trans. Las inmunosimetroadhesinas de cola a cola son hemisimetroadhesinas de cola a cola que forman dímeros unidos por disulfuro. Cada hemisimetroadhesina consta de un dominio de unión Fab de inmunoglobulina que tiene un extremo X del terminal C unido por un enlace X-X a una subunidad Fc de inmunoglobulina que tiene un extremo X del terminal C. El dímero contiene dos dominios de unión a Fab funcionales y un dominio de unión a Fc funcional. Los siete enlaces sencillos consecutivos que unen cada dominio Fab a una subunidad Fc son todos trans (N-C-C-X-X-C-C-N). Las rotaciones simétricas de 180 grados alrededor del primer (NC), tercero (CX), quinto (XC) o séptimo (CN) pares de enlaces sencillos consecutivos moverán los dos dominios Fab en una primera dirección general (comparar las Figuras 20 y 21). Las rotaciones simétricas de 180 grados alrededor del segundo (C-C), cuarto (X-X) o sexto (C-C) pares de enlaces sencillos moverán los dos dominios Fab en una segunda dirección general (comparar las Figuras 20 y 22).
Figura 21: Una representación esquemática de una inmunosimetroadhesina de cola a cola que muestra la conformación X-cis-C. La conformación X-cis-C se obtiene a partir de la conformación todo trans mediante la rotación simétrica del quinto par de siete enlaces sencillos consecutivos (N-C-C-X-X-cis-C-C-N) (comparar las Figuras 20 y 21). Otras conformaciones que son similares a la conformación X-cis-C que se muestra en este documento se obtienen de la conformación todo trans después de la rotación simétrica del primer (N-cis-CCXXCCN), el tercer (NCC-cis-XXCCN) o el séptimo pares (NCCXXCC-cis-N) de enlaces sencillos consecutivos.
Figura 22: Una representación esquemática de una inmunosimetroadhesina de cola a cola que muestra la conformación X-cis-X. La conformación X-cis-X se obtiene a partir de la conformación todo trans mediante la rotación simétrica del cuarto par de siete enlaces sencillos consecutivos (N-C-C-X-cis-X-C-C-N) (comparar las Figuras 20 y 22). Otras conformaciones que son similares a la conformación X-cis-X que se muestran en este documento se obtienen de la conformación todo trans después de la rotación simétrica del segundo (NC-cis-CXXCCN), o el sexto pares (NCCXXC-cis-CN) de enlaces sencillos consecutivos.
Figura 23: Representación esquemática de bisimetroadhesinas con cuatro dominios de unión Fab, que muestra la conformación todo trans. La molécula es un dímero de dos hemisimetroadhesinas, cada una de las cuales consta de tres tramos de aminoácidos consecutivos. La bisimetroadhesina que se muestra en este documento es una hemisimetroadhesina de cabeza a cola, de cola a cola que forma dímeros unidos por disulfuro. Cada hemisimetroadhesina consta de dos dominios Fab de inmunoglobulina que tienen un extremo X del terminal C que está unido por un enlace -X-X- a una subunidad Fc de inmunoglobulina; el primer dominio Fab se une al extremo X del terminal N de Fc, y el segundo Fab se une al terminal X del terminal C de Fc. El dímero tiene cuatro dominios de unión a Fab funcionales y un dominio de unión a Fc funcional. Los siete enlaces sencillos consecutivos que unen los cuatro dominios Fab a una subunidad Fc son todos trans (N-C-C-X-X-C-C-C/N). Las rotaciones simétricas de 180 grados alrededor del primer (NC), tercer (CX), quinto (XC) o séptimo (CC/N) pares de enlaces sencillos consecutivos moverán los cuatro dominios Fab en una primera dirección general (comparar las Figuras 23 y 24). Las rotaciones simétricas de 180 grados alrededor del segundo (C-C), cuarto (X-X) o sexto (C-C) pares de enlaces sencillos moverán los cuatro dominios Fab en una segunda dirección general (comparar las Figuras 23 y 25).
Figura 24: Representación esquemática de la conformación X-cis-C de una biinmunosimetroadhesina que consta de cuatro dominios de unión a Fab y un dominio Fc. La molécula es un dímero de dos hemisimetroadhesinas, cada una de las cuales consta de tres tramos de aminoácidos consecutivos.
Figura 25: Representación esquemática de la conformación X-cis-X de una biinmunosimetroadhesina que consta de cuatro dominios de unión a Fab y un dominio Fc. La molécula es un dímero de dos hemisimetroadhesinas, cada una de las cuales consta de tres tramos de aminoácidos consecutivos.
Figura 26: Representación esquemática de la conformación todo trans de una biinmunosimetroadhesina que consta de dos dominios de unión a Fab, un dominio Fc y dos dominios de unión que no son Fab. La molécula es un dímero de dos hemisimetroadhesinas, cada una de las cuales consta de tres tramos de aminoácidos consecutivos. La bisimetroadhesina que se muestra en el presente documento es una hemisimetroadhesina de cabeza a cola, de cola a cola que forma dímeros unidos por disulfuro. Cada hemisimetroadhesina consta de un dominio Fab de inmunoglobulina que tiene un extremo X del terminal C que está unido por un enlace -X-X- al extremo X del terminal N de una subunidad Fc de inmunoglobulina, y un dominio de unión no a inmunoglobulina que tiene un extremo X del terminal C que está unido por un enlace -X-X- al extremo X del terminal C de una subunidad Fc de inmunoglobulina. El dímero tiene dos dominios de unión a Fab funcionales, dos dominios de unión no a inmunoglobulina funcionales y un dominio de unión a Fc funcional. Los siete enlaces sencillos consecutivos que unen los cuatro dominios de unión a una subunidad Fc son todos trans (N-C-C-X-X-C-C-C/N). Las rotaciones simétricas de 180 grados alrededor del primer (NC), tercer (CX), quinto (XC) o séptimo (CC/N) pares de enlaces sencillos consecutivos moverán los cuatro dominios de unión en una primera dirección general (comparar las Figuras 26 y 27). Las rotaciones simétricas de 180 grados alrededor del segundo (C-C), cuarto (X-X) o sexto (C-C) pares de enlaces sencillos moverán los cuatro dominios de enlace en una segunda dirección general (comparar las Figuras 26 y 28).
Figura 27: Representación esquemática de la conformación X-cis-C de una biinmunosimetroadhesina que consta de dos dominios de unión a Fab, un dominio Fc y dos dominios de unión que no son Fab. La molécula es un dímero de dos hemisimetroadhesinas, cada una de las cuales consta de tres tramos de aminoácidos consecutivos.
Figura 28: Representación esquemática de la conformación X-cis-X de una biinmunosimetroadhesina que consta de dos dominios de unión a Fab, un dominio Fc y dos dominios de unión que no son Fab. La molécula es un dímero de dos hemisimetroadhesinas, cada una de las cuales consta de tres tramos de aminoácidos consecutivos.
Figura 29: Representación esquemática de una inmunoglobulina que se une a una primera diana simétrica. La interacción es simétrica y cooperativa. Ambas dianas están unidas por ambas inmunoglobulinas.
Figura 30: Representación esquemática de una simetroadhesina que se une a una primera diana simétrica. La interacción es simétrica y cooperativa. Ambas dianas están unidas por ambas simetroadhesinas en una primera conformación (todo trans).
Figura 31: Representación esquemática de una inmunoglobulina que se une a una segunda diana simétrica. La interacción no es simétrica ni cooperativa. Cada inmunoglobulina se une solamente a una diana.
Figura 32: Representación esquemática de una simetroadhesina que se une a una segunda diana simétrica. La interacción es simétrica y cooperativa. Ambas dianas están unidos por ambas simetroadhesinas en una segunda conformación (X-cis-C).
Figura 33: Representación esquemática de una inmunoglobulina que se une a una tercera diana simétrica. La interacción no es simétrica ni cooperativa. Cada inmunoglobulina se une solamente a una diana.
Figura 34: Representación esquemática de una simetroadhesina que se une a una tercera diana simétrica. La interacción es simétrica y cooperativa. Ambas dianas están unidas por ambas simetroadhesinas en una tercera conformación (X-cis-X).
Figura 35A: Secuencias de aminoácidos de varios compuestos intermedios sintéticos de polipéptidos de una subunidad precursora de simetroadhesina de Fc de IgG1 humana con un extremo S del terminal N. La parte (i) muestra tres polipéptidos pre-Fc distintos (SEQ ID NOS: 32, 33 y 34, respectivamente) que comprenden, alternativamente, las secuencias señal de erizo Sonic humano (SHH), el interferón alfa-2 humano (IFN) o éster transferasa de colesterol humano (CETP) (residuos -23 a -1, -23 a -1, o -17 a -1, respectivamente), y el dominio Fc de IGHG1 humano (residuos 1 a 228) comenzando en el quinto aminoácido codificado por el exón de bisagra, CDKTHTCPPCP (residuos 1-11 de SEQ ID NO: 35) (Ellison et al., (1982) Nucl. Acids Res. 10, 4071-4079). Los tres polipéptidos pre-Fc distintos tienen longitudes de 251, 251 y 245 residuos, respectivamente. La parte (ii) muestra el dominio Fc maduro (longitud = 228) con un extremo S del terminal N (SEQ ID NO: 35). El residuo de cisteína del terminal N está subrayado (IGHG1, UniProtKB/Swiss-Prot entrada P01857, región C de la cadena gamma-1 de Ig, Homo sapiens).
Figura 35B: Secuencias de aminoácidos de varios compuestos intermedios sintéticos de polipéptidos de una subunidad precursora de simetroadhesina de Fc de IgG2 humana con un extremo S del terminal N. La parte (i) muestra tres polipéptidos pre-Fc distintos (SEQ ID NOS: 50, 51 y 52, respectivamente) que comprenden, alternativamente, las secuencias señal de erizo Sonic humano (SHH), el interferón alfa-2 humano (IFN) o la éster transferasa de colesterol humano (CETP) (residuos -23 a -1, -23 a -1, o -17 a -1, respectivamente), y el dominio Fc de IGHG2 humano (residuos 1 a 225) comenzando en el cuarto aminoácido codificado por el exón bisagra, CCVECPPCP (residuos 1-9 de la SEQ ID NO: 53) (Ellison et al., (1982) Nucl. Acids Res. 10, 4071-4079). Los tres polipéptidos pre-Fc distintos tienen longitudes de 248, 248 y 242 residuos, respectivamente. La parte (ii) muestra el dominio Fc maduro (longitud = 225) con un extremo S del terminal N (SEQ ID NO: 53). El residuo de cisteína del terminal N está subrayado (IGHG2, UniProtKB/Swiss-Prot entrada P01859, región C de la cadena gamma-2 de Ig, Homo sapiens).
Figura 35C: Secuencias de aminoácidos de varios compuestos intermedios sintéticos de polipéptidos de una subunidad precursora de simetroadhesina de Fc de IgG3 humana con un extremo S-terminal del terminal N. La parte (i) muestra tres polipéptidos pre-Fc distintos (SEQ ID NOS: 71, 72 y 73, respectivamente) que comprenden, alternativamente, las secuencias señal de erizo Sonic humano (SHH), el interferón alfa-2 humano (IFN) o éster transferasa de colesterol humano (CETP) (residuos -23 a -1, -23 a -1, o -17 a -1, respectivamente), y el dominio Fc de IGHG3 humano (residuos 1 a 267) comenzando en el decimotercer aminoácido codificado por el primer exón de bisagra, CPRCP (residuos 1-5 de la SEQ ID NO: 74) (Strausberg et al., (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. 99, 16899-1690). Los tres polipéptidos pre-Fc distintos tienen longitudes de 290, 290 y 284 residuos, respectivamente. La parte (ii) muestra el dominio Fc maduro (longitud = 267) con un extremo S del terminal N (SEQ ID NO: 74). El residuo de cisteína del terminal N está subrayado (IGHG3, UniProtKB/Swiss-Prot entrada Q8N4Y9, región C de la cadena gamma-3 de Ig, Homo sapiens).
Figura 35D: Secuencias de aminoácidos de varios compuestos intermedios sintéticos de polipéptidos de una subunidad precursora de simetroadhesina de Fc de IgG4 humana con un extremo S del terminal N. La parte (i) muestra tres polipéptidos pre-Fc distintos (SEQ ID NOS: 86, 87 y 88, respectivamente) que comprenden, alternativamente, las secuencias señal del erizo Sonic humano (SHH), el interferón alfa-2 humano (IFN) o éster transferasa de colesterol humano (CETP) (residuos -23 a -1, -23 a -1, o -17 a -1, respectivamente), y el dominio Fc de IGHG4 humano (residuos 1 a 222) comenzando en el octavo aminoácido codificado por el exón bisagra, CPSCP (residuos 1-5 de la SEQ ID NO: 89) (Strausberg et al., (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. 99, 16899-1690). Los tres polipéptidos pre-Fc distintos tienen longitudes de 245, 245 y 239 residuos, respectivamente. La parte (ii) muestra el dominio Fc maduro (longitud = 222) con un extremo S del terminal N (SEQ ID NO: 89). El residuo de cisteína del terminal N está subrayado (IGHG4, entrada UniProtKB/Swiss-Prot Q8TC63, región C de la cadena gamma-4 de Ig, Homo sapiens).
Figura 36A: Secuencias de aminoácidos de varios compuestos intermedios sintéticos de polipéptidos de una subunidad precursora de la simetroadhesina de Fc humana con un extremo X del terminal N. La parte (i) muestra tres polipéptidos pre-Fc distintos (SEQ ID NOS: 101, 102 y 103, respectivamente) que comprenden, alternativamente, las secuencias señal de erizo Sonic humano (SHH), interferón alfa-2 humano (IFN) o éster transferasa de colesterol humano (CETP) (residuos -23 a -1, -23 a -1, o -17 a -1, respectivamente), y el dominio Fc de IGHG1 humano (residuos 1 a 222) comenzando en el undécimo aminoácido codificado por el exón bisagra, CPPCP (residuos 1-5 de la SEQ ID NO: 104) (Ellison et al. (1982) Nucl. Acids Res. 10, 4071-4079). Los tres polipéptidos pre-Fc distintos tienen longitudes de 245, 245 y 239 residuos, respectivamente. La parte (ii) muestra el dominio Fc maduro (longitud = 222) que tiene un extremo S del terminal N (SEQ ID NO: 104). El residuo de cisteína del terminal N está subrayado. La parte (iii) muestra el dominio Fc maduro extendido por ligación química nativa (longitud = 226) para tener un extremo X del terminal N (SEQ ID NO: 105). El aminoácido X del terminal N (por ejemplo, cisteína, selenocisteína) está subrayado; le sigue el sexto aminoácido codificado por el exón bisagra, XDKt Ht CPPCP (residuos 1-11 de la SEQ ID NO: 105). (IGHG1, UniProtKB/Swiss-Prot entrada P01857, región C de cadena gamma-1 de Ig, Homo sapiens).
Figura 36B: Secuencias de aminoácidos de varios compuestos intermedios sintéticos de polipéptidos de una subunidad precursora de la simetroadhesina de Fc humana con un extremo X del terminal N. La parte (i) muestra tres polipéptidos pre-Fc distintos (SEQ ID NOS: 109, 110 y 111, respectivamente) que comprenden, alternativamente, las secuencias señal de erizo Sonic humano (SHH), de interferón alfa-2 humano (IFN) o de éster transferasa de colesterol humano. (CETP (residuos -23 a -1, -23 a -1, o -17 a -1, respectivamente), y el dominio Fc de IGHG1 humano (residuos 1 a 219) comenzando en el decimocuarto aminoácido codificado por el exón bisagra, CP (residuos 1-2 de la SEQ ID NO: 112) (Ellison et al. (1982) Nucl. Acids Res. 10, 4071-4079). Los tres polipéptidos pre-Fc distintos tienen longitudes de 242, 242 y 236 residuos, respectivamente. La parte (ii) muestra el dominio Fc maduro (longitud = 219) que tiene un extremo S del terminal N (SEQ ID NO: 112). El residuo de cisteína del terminal N está subrayado. La parte (iii) muestra el dominio Fc maduro extendido por ligación química nativa (longitud = 222) para tener un extremo X del terminal N (SEQ ID NO: 113). El aminoácido X del terminal N (por ejemplo, cisteína, selenocisteína) está subrayado; le sigue el duodécimo aminoácido codificado por el exón bisagra, XPPCP (residuos 1-5 de la SEQ ID NO: 113). (IGHG1, UniProtKB/Swiss-Prot entrada P01857, región C de la cadena gamma-1 de Ig, Homo sapiens).
Figura 37A: Secuencias de aminoácidos de varios compuestos intermedios de polipéptidos en una síntesis basada en inteína de una subunidad precursora de simetroadhesina de Fc humana con un extremo X del terminal C. La parte (i) muestra dos polipéptidos pre-Fc-inteína distintos (SEQ ID NOS: 116 y 117, respectivamente) que comprenden, alternativamente, las secuencias señal de CD2 o CD4 humanas (residuos -24 a -1, o -25 a -1, respectivamente), el dominio Fc de IGHG1 humano (residuos 1 a 224) que comienza en el séptimo aminoácido codificado por el exón bisagra (KTHTCPPCP) (residuos 1-9 de SEQ ID NO: 118), el dominio M1 de IGHG3 humano (residuos 225 a 241), y un dominio de unión de inteína-quitina Mth RIR1 (residuos 242 a 441). Los dos polipéptidos quiméricos pre-Fc-inteína distintos tienen longitudes de 465 y 466 residuos, respectivamente. La parte (ii) muestra el polipéptido quimérico de Fc-inteína maduro (longitud = 441) que comprende el dominio Fc/M1 humano y el dominio de unión de inteína-quitina Mth RIR1 (SEQ ID NO: 118). El sitio de autoescisión de inteína está subrayado. La parte (iii) muestra el dominio Fc/ M1 humano terminado en tioéster (longitud = 242) (SEQ ID NO: 119). El residuo de tio-glicina del terminal C (X) está subrayado. La parte (iv) muestra el dominio Fc/M1 humano (longitud = 243) con un extremo X del terminal C (SEQ ID NO: 120). El residuo de aminoácido X del terminal C (por ejemplo, cisteína, selenocisteína) está subrayado (IGHG1, entrada UniProtKB/Swiss-Prot, entrada P01857, región C de la cadena gamma-1 de Ig, Homo sapiens; IGHG3, NCBI/ GenBank acceso BAA11363, cadena gamma de Ig de tipo unido a membrana, Homo sapiens).
Figura 37B: Secuencias de aminoácidos de varios compuestos intermedios sintéticos de polipéptidos de una subunidad precursora de la simetroadhesina de Fc humana con un extremo S del terminal C. La parte (i) muestra dos polipéptidos pre-Fc distintos (SEQ ID NOS: 123 y 124, respectivamente) que comprenden, alternativamente, las secuencias señal de CD2 o CD4 humanas (residuos -24 a -1, o -25 a -1, respectivamente), el dominio Fc de IGHG1 humano (residuos 1 a 224) que comienza en el séptimo aminoácido codificado por el exón bisagra (KTHTCPPCP) (residuos 1-9 de la SEQ ID NO: 125), y una porción del dominio M1 de IGHG3 humano (residuos 225 a 232). Los dos polipéptidos pre-Fc distintos tienen longitudes de 256 y 257 residuos, respectivamente. La parte (ii) muestra el dominio Fc maduro (longitud = 232) con un extremo S del terminal N (SEQ ID NO: 125). El residuo de cisteína del terminal N está subrayado (IGHG1, UniProtKB/Swiss-Prot entrada P01857, región C de la cadena gamma-1 de Ig, Homo sapiens).
Figuras 38A-38B: Secuencias de aminoácidos de varios compuestos intermedios de polipéptidos en una síntesis basada en inteína de una subunidad precursora de la simetroadhesina de Fc humana, con un extremo S del terminal N y un extremo X del terminal C. (A) La parte (i) muestra tres polipéptidos pre-Fc-inteína distintos (SEQ ID NOS: 126, 127 y 128, respectivamente) que comprenden, alternativamente, las secuencias señal de erizo Sonic humano (SHH), interferón alfa-2 humano (IFN), o éster transferasa de colesterol humano (CETP) (residuos -23 a -1, -23 a -1 o -17 a -1, respectivamente), el dominio Fc de IGHG1 humano (residuos 1 a 226) que comienza en el quinto amino ácido codificado por el exón bisagra (CDKTHTCPPCP) (residuos 1-11 de la SEQ ID NO: 129), el dominio M1 de IGHG3 humano (residuos 227 a 243) y un dominio de unión de inteína-quitina Mth RIR1 (residuos 244 a 443). Los tres polipéptidos quiméricos pre-Fc-inteína distintos tienen longitudes de 466, 466 y 460 residuos, respectivamente. La parte (ii) muestra el polipéptido quimérico Fc-inteína maduro (longitud = 443) que comprende el dominio Fc/M1 humano y el dominio de unión de inteína-quitina Mth RIR1 con un extremo S del terminal N (SEQ ID NO: 129). El residuo de cisteína del terminal N y el sitio de autoescisión de inteína están subrayados. (B) La parte (iii) muestra el dominio Fc/ M1 humano terminado en tioéster (longitud = 244) (SEQ ID NO: 130). El residuo de cisteína del terminal N y el residuo de tio-glicina del terminal C (Z) están subrayados. La parte (iv) muestra el dominio Fc/M1 (longitud = 245) con un extremo S del terminal N y un extremo X del terminal C (SEQ ID NO: 131). El residuo de cisteína del terminal N y el residuo de aminoácido X del terminal C (por ejemplo, cisteína, selenocisteína) están subrayados (IGHG1, UniProtKB/Swiss-Prot entrada P01857, región C de la cadena gamma-1 de Ig, Homo sapiens; IGHG3, NCBI/GenBank acceso BAA11363, cadena gamma de Ig del tipo unido a la membrana, Homo sapiens).
Figuras 39A-39B: Secuencias de aminoácidos de varios compuestos intermedios de polipéptidos en una síntesis basada en inteína de una subunidad precursora de la simetroadhesina de Fc humana, con un extremo X del terminal N y un extremo X del terminal C. (A) La parte (i) muestra tres polipéptidos pre-Fc-inteína distintos (SEQ ID NOS: 132, 133 y 134 respectivamente) que comprenden, alternativamente, las secuencias señal de erizo Sonic humano (SHH), interferón alfa-2 humano (IFN), éster transferasa de colesterol humano (CETP) (residuos -23 a -1, -23 a -1 o -17 a -1, respectivamente), el dominio Fc de IGHG1 humano (residuos 1 a 220) que comienza en el undécimo amino ácido codificado por el exón bisagra (CPPCP) (residuos 1-5 de la SEQ ID NO: 135), el dominio M1 de IGHG3 humano (residuos 221 a 237) y un dominio de unión de inteína-quitina Mth RIR1 (residuos 238 a 437). Los tres polipéptidos quiméricos pre-Fc-inteína distintos tienen longitudes de 460, 460 y 454 residuos, respectivamente. La parte (ii) muestra el polipéptido quimérico Fc-inteína maduro (longitud = 437) que comprende el dominio Fc/M1 humano y el dominio de unión de inteína-quitina Mth RIR1 con un extremo S del terminal N (SEQ ID NO: 135). El residuo de cisteína del terminal N y el sitio de autoescisión de inteína están subrayados. (B) La parte (iii) muestra el polipéptido quimérico de Fc-inteína maduro extendido por ligación química nativa (longitud = 443) para tener un extremo X del terminal N (SEQ ID NO: 136). El aminoácido X del terminal N (por ejemplo, cisteína, selenocisteína) está subrayado. La parte (iv) muestra el dominio Fc/M1 humano terminado en tioéster (longitud = 244) (SEQ ID NO: 137). El residuo de aminoácido X del terminal N y el residuo de tio-glicina del terminal C (ZX) están subrayados. La parte (v) muestra el dominio Fc/ M1 (longitud = 245) con un extremo X del terminal N y un extremo X del terminal C (SEQ ID NO: 138). El residuo de aminoácido X del terminal N y el residuo de aminoácido X terminal C están subrayados (IGHG1, UniProtKB/Swiss-Prot entrada P01857, región C de la cadena gamma-1 de Ig, Homo sapiens; IGHG3, NCBI/GenBank acceso BAA11363, cadena gamma de Ig de tipo unido a membrana, Homo sapiens).
Figuras 40A-40B: secuencias de aminoácidos de varios compuestos intermedios de polipéptidos en una síntesis basada en inteína de una subunidad precursora de simetroadhesina CD4 humana con un extremo X del terminal C. (A) La parte (i) muestra el polipéptido pre-CD4-inteína (longitud = 596) que comprende la secuencia señal de CD4 humana (residuos -25 a -1) y el dominio extracelular (residuos 1 a 371), y un dominio de unión de inteína-quitina Mth RIR1 (residuos 372 a 571) (SEQ ID NO: 140). La parte (ii) muestra el polipéptido quimérico CD4-inteína maduro (longitud = 571) que comprende el dominio extracelular de CD4 humano y el dominio de unión de inteína-quitina Mth RIR1 (SEQ ID NO: 141). La posición del sitio de autoescisión de inteína está subrayada. (B) La parte (iii) muestra el dominio extracelular de CD4 humano terminado en tioéster (longitud = 372) (SEQ ID NO: 142). El residuo de tio-glicina del terminal C (ZX) está subrayado. La parte (iv) muestra el dominio extracelular de CD4 humano (longitud = 373) con un extremo X del terminal C (SEQ ID NO: 143). El residuo de aminoácido X del terminal C (por ejemplo, cisteína, selenocisteína) está subrayado (CD4, UniProtKB/Swiss-Prot entrada P01730, glicoproteína c D4 de la superficie de células T).
Figuras 41A-41B: Secuencias de aminoácidos de varios compuestos intermedios de polipéptidos en una síntesis basada en inteína de una subunidad precursora de simetroadhesina Di62-VH con un extremo X del terminal C. (A) La parte (i) muestra el polipéptido pre-Di62-VH-inteína (longitud = 444) que comprende la secuencia señal de Di62-VH de ratón (residuos -19 a -1) y el dominio variable (residuos 1 a 117), el dominio constante CH1 humano (residuos 118 a 225) y un dominio de unión de inteína-quitina Mth RIR1 (residuos 226 a 425) (SEQ ID NO: 145). La parte (ii) muestra el polipéptido quimérico Di62-VH-inteína maduro (longitud = 425) que comprende el dominio variable Di62-VH de ratón, el dominio constante CH1 humano y el dominio de unión de inteína-quitina Mth RIR1 (SEQ ID NO: 146). La posición del sitio de autoescisión de inteína está subrayada. (B) La parte (iii) muestra el dominio variable Di62-VH de ratón terminado en tioéster/dominio constante CH1 humano (longitud = 226) (SEQ ID NO: 147). El residuo de tioglicina del terminal C (Z) está subrayado. La parte (iv) muestra el dominio variable Di62-VH de ratón/dominio constante CH1 humano (longitud = 227) con un extremo X del terminal C (SEQ ID NO: 148). El residuo de aminoácido X terminal C (por ejemplo, cisteína, selenocisteína) está subrayado (Di62-VH, NCBI/GenBank acceso CAA05416, cadena pesada de IgG, unión al antígeno de la subunidad del TNF alfa humana, Mus musculus).
Figura 42: Secuencias de aminoácidos de varios compuestos intermedios sintéticos de polipéptidos de una subunidad precursora de simetroadhesina Di62-Vk. La parte (i) muestra el polipéptido pre-Di62-Vk (longitud = 234) que comprende la secuencia señal de Di62-Vk de ratón (residuos -20 a -1) y el dominio variable (residuos 1 a 107), y el dominio constante Ck humano (residuos 108 a 214) (SEQ ID NO: 150). La parte (ii) muestra el polipéptido quimérico Di62-Vk maduro (longitud = 214) que comprende el dominio variable Di62-Vk de ratón y el dominio contante Ck humano (SEQ ID NO: 151) (Di62-Vk, NCBI/GenBank acceso CAA05417, cadena ligera de IgG, unión a antígeno de la subunidad del TNF alfa humana, Mus musculus).
Figura 43: Secuencias de aminoácidos de varios compuestos intermedios de polipéptidos en una síntesis basada en inteína de una subunidad precursora de la simetroadhesina TNR1A humana con un extremo X del terminal C. La parte (i) muestra el polipéptido pre-TNR1A-inteína (longitud = 411) que comprende la secuencia señal de TNR1A humana (residuos -21 a -1) y el dominio extracelular (residuos 1 a 190), y un dominio de unión de inteína-quitina Mth RIR1 (residuos 191 a 390) (SEQ ID NO: 153). La parte (ii) muestra el polipéptido quimérico de TNR1A-inteína maduro (longitud = 390) que comprende el dominio extracelular de TNR1A humano y el dominio de unión de inteína-quitina Mth RIR1 (SEQ ID NO: 154). La posición del sitio de autoescisión de inteína está subrayada. La parte (iii) muestra el dominio extracelular de TNR1A humano terminado en tioéster (longitud = 191) (SEQ ID NO: 155). El residuo de tioglicina del terminal C (Z) está subrayado. La parte (iv) muestra el dominio extracelular de TNR1A humano (longitud = 192) con un extremo X del terminal C (SEQ ID NO: 156). El residuo de aminoácido X del terminal C (por ejemplo, cisteína, selenocisteína) está subrayado (TNR1A, UniProtKB/Swiss-Prot entrada P19438, miembro 1A de la superfamilia del receptor del factor de necrosis tumoral).
Figura 44A: Secuencias de aminoácidos de varios compuestos intermedios de polipéptidos en una síntesis basada en inteína de una subunidad precursora de simetroadhesina TNR1B humana con un extremo X del terminal C. La parte (i) muestra el polipéptido pre-TNR1B-inteína (longitud = 457) que comprende la secuencia señal de TNR1B humano (residuos -22 a -1) y el dominio extracelular (residuos 1 a 235), y un dominio de unión de inteína-quitina Mth RIR1 (residuos 236 a 435) (SEQ ID NO: 158). La parte (ii) muestra el polipéptido quimérico TNR1B-inteína maduro (longitud = 435) que comprende el dominio extracelular de TNR1B humano y el dominio de unión de inteína-quitina Mth RIR1 (SEQ ID NO: 159). La posición del sitio de autoescisión de inteína está subrayada. La parte (iii) muestra el dominio extracelular de TNR1B humano terminado en tioéster (longitud = 236) (SEQ ID NO: 160). El residuo de tio-glicina del terminal C (Z) está subrayado. La parte (iv) muestra el dominio extracelular de TNR1B humano (longitud = 237) con un extremo X del terminal C (SEQ ID NO: 161). El residuo de aminoácido X del terminal C (por ejemplo, cisteína, selenocisteína) está subrayado (TNR1B, entrada UniProtKB/Swiss-Prot entrada 20333, miembro 1B de la superfamilia del receptor del factor de necrosis tumoral).
Figura 44B: Secuencias de aminoácidos de varios compuestos intermedios sintéticos de polipéptidos de una subunidad precursora de inmunoadhesina TNR1B. La parte (i) muestra el polipéptido pre-inmunoadhesina de TNR1B (longitud = 489) que comprende la secuencia señal de TNR1B (residuos -22 a -1) y el dominio extracelular (residuos 1 a 235), y el dominio constante pesado humano (residuos 236 a 467) (SEQ ID NO: 163). La parte (ii) muestra la inmunoadhesina TNR1B madura (longitud = 467) (SEQ ID NO: 164).
Figuras 45A-45C: Secuencias de aminoácidos de varios compuestos intermedios de polipéptidos en una síntesis basada en inteína de una subunidad precursora de simetroadhesina del VGFR1 humano con un extremo X del terminal C. (A) La parte (i) muestra el polipéptido pre-VGFR1-inteína (longitud = 958) que comprende la secuencia señal del VGFR1 humano (residuos -26 a -1) y el dominio extracelular (residuos 1 a 732), y un dominio de unión de inteínaquitina Mth RIR1 (residuos 733 a 932) (SEQ ID NO: 166). (B) La parte (ii) muestra el polipéptido quimérico de VGFR1-inteína maduro (longitud = 932) que comprende el dominio extracelular del VGFR1 humano y el dominio de unión de inteína-quitina Mth RIR1 (SEQ ID NO: 167). La posición del sitio de autoescisión de inteína está subrayada. (C) La parte (iii) muestra el dominio extracelular del VGFR1 humano terminado en tioéster (longitud = 733) (SEQ ID NO: 168). El residuo de tio-glicina del terminal C (Z) está subrayado. La parte (iv) muestra el dominio extracelular del VGFR1 humano (longitud = 734) con un extremo X del terminal C (SEQ ID NO: 169). El residuo de aminoácido X del terminal C (por ejemplo, cisteína, selenocisteína) está subrayado (VGFR1, UniProtKB/Swiss-Prot entrada P17948, receptor 1 del factor de crecimiento endotelial vascular).
Figuras 46A-46C: Secuencias de aminoácidos de varios compuestos intermedios de polipéptidos en una síntesis basada en inteína de una subunidad precursora de simetroadhesina del VGFR2 humano con un extremo X del terminal C. (A) La parte (i) muestra el polipéptido pre-VGFR2-inteína (longitud = 964) que comprende la secuencia señal del VGFR2 humano (residuos -19 a -1) y el dominio extracelular (residuos 1 a 745), y un dominio de unión de inteínaquitina Mth RIR1 (residuos 746 a 945) (SEQ ID NO: 171). (B) La parte (ii) muestra el polipéptido quimérico de VGFR2-inteína maduro (longitud = 945) que comprende el dominio extracelular de VGFR2 humano y el dominio de unión de inteína-quitina Mth RIR1 (SEQ ID NO: 172). La posición del sitio de autoescisión de inteína está subrayada. (C) La parte (iii) muestra el dominio extracelular de VGFR2 humano terminado en tioéster (longitud = 746) (SEQ ID NO: 173). El residuo de tioglicina del terminal C (ZX) está subrayado. La parte (iv) muestra el dominio extracelular de VGFR2 humano (longitud = 747) con un extremo X del terminal C (SEQ ID NO: 174). El residuo de aminoácido X del terminal C (por ejemplo, cisteína, selenocisteína) está subrayado (VGFR2, UniProtKB/Swiss-Prot entrada P35968, receptor 2 del factor de crecimiento endotelial vascular).
Figuras 47A-47C: Secuencias de aminoácidos de varios compuestos intermedios de polipéptidos en una síntesis basada en inteína de una subunidad precursora de simetroadhesina del VGFR3 humano con un extremo X del terminal C. (A) La parte (i) muestra el polipéptido pre-VGFR3-inteína (longitud = 975) que comprende la secuencia señal del VGFR3 humano (residuos -24 a -1) y el dominio extracelular (residuos 1 a 751), y un dominio de unión de inteínaquitina Mth RIR1 (residuos 752 a 951) (SEQ ID NO: 176). (B) La parte (ii) muestra el polipéptido quimérico de VGFR3-inteína maduro (longitud = 951) que comprende el dominio extracelular de VGFR3 humano y el dominio de unión de inteína-quitina Mth RIR1 (SEQ ID NO: 177). La posición del sitio de autoescisión de inteína está subrayada. (C) La parte (iii) muestra el dominio extracelular de VGFR3 humano terminado en tioéster (longitud = 752) (SEQ ID NO: 178). El residuo (X) de tioglicina del terminal C está subrayado. La parte (iv) muestra el dominio extracelular de VGFR3 humano (longitud = 753) con un extremo X del terminal C (SEQ ID NO: 179). El residuo de aminoácido X del terminal C (por ejemplo, cisteína, selenocisteína) está subrayado (VGFR3, UniProtKB/Swiss-Prot entrada P35916, receptor 3 del factor de crecimiento endotelial vascular).
Figuras 48A-48B: Secuencias de aminoácidos de varios compuestos intermedios de polipéptidos en una síntesis basada en inteína de una subunidad precursora de simetroadhesina de ERBB1 humano con un extremo X del terminal C. (A) La parte (i) muestra el polipéptido pre-ERBB1-inteína (longitud = 845) que comprende la secuencia señal de ERBB1 humano (residuos -24 a -1) y el dominio extracelular (residuos 1 a 621), y un dominio de unión de inteínaquitina Mth RIR1 (residuos 622 a 821) (SEQ ID NO: 181). La parte (ii) muestra el polipéptido quimérico ERBB1-inteína maduro (longitud = 821) que comprende el dominio extracelular de ERBB1 humano y el dominio de unión de inteínaquitina Mth RIR1 (SEQ ID NO: 182). La posición del sitio de autoescisión de inteína está subrayada. (B) La parte (iii) muestra el dominio extracelular de ERBB1 humano terminado en tioéster (longitud = 622) (SEQ ID NO: 183). El residuo (X) de tioglicina del terminal C está subrayado. La parte (iv) muestra el dominio extracelular de ERBB1 humano (longitud = 623) con un extremo X del terminal C (SEQ ID NO: 184). El residuo de aminoácido X del terminal C (por ejemplo, cisteína, selenocisteína) está subrayado (ERBB1, UniProtKB/Swiss-Prot entrada P00533, receptor del factor de crecimiento epidérmico).
Figuras 49A-49B: Secuencias de aminoácidos de varios compuestos intermedios de polipéptidos en una síntesis basada en inteína de una subunidad precursora de simetroadhesina de ERBB2 humano con un extremo X del terminal C. (A) La parte (i) muestra el polipéptido pre-ERBB2-inteína (longitud = 852) que comprende la secuencia señal de ERBB2 humano (residuos -22 a -1) y el dominio extracelular (residuos 1 a 630), y un dominio de unión de inteínaquitina Mth RIR1 (residuos 631 a 830) (SEQ ID NO: 186). La parte (ii) muestra el polipéptido quimérico ERBB2-inteína maduro (longitud = 830) que comprende el dominio extracelular de ERBB2 humano y el dominio de unión de inteínaquitina Mth RIR1 (SEQ ID NO: 187). La posición del sitio de autoescisión de inteína está subrayada. (B) La parte (iii) muestra el dominio extracelular de ERBB2 humano terminado en tioéster (longitud = 631) (SEQ ID NO: 188). El residuo (X) de tioglicina del terminal C está subrayado. La parte (iv) muestra el dominio extracelular de ERBB2 humano (longitud = 632) con un extremo X del terminal C (SEQ ID NO: 189). El residuo de aminoácido X del terminal C (por ejemplo, cisteína, selenocisteína) está subrayado (ERBB2, UniProtKB/Swiss-Prot entrada P04626, receptor de tirosina-proteína quinasa erbB-2).
Figuras 50A-50B: Secuencias de aminoácidos de varios compuestos intermedios de polipéptidos en una síntesis basada en inteína de una subunidad precursora de simetroadhesina de ERBB3 humano con un extremo X del terminal C. (A) La parte (i) muestra el polipéptido pre-ERBB3-inteína (longitud = 843) que comprende la secuencia señal de ERBB3 humano (residuos -19 a -1) y el dominio extracelular (residuos 1 a 624), y un dominio de unión de inteínaquitina Mth RIR1 (residuos 625 a 824) (SEQ ID NO: 191). La parte (ii) muestra el polipéptido quimérico ERBB3-inteína maduro (longitud = 824) que comprende el dominio extracelular de ERBB3 humano y el dominio de unión de inteínaquitina Mth RIR1 (SEQ ID NO: 192). La posición del sitio de autoescisión de inteína está subrayada. (B) La parte (iii) muestra el dominio extracelular de ERBB3 humano terminado en tioéster (longitud = 625) (SEQ ID NO: 193). El residuo (X) de tioglicina del terminal C está subrayado. La parte (iv) muestra el dominio extracelular de ERBB3 humano (longitud = 626) con un extremo X del terminal C (SEQ ID NO: 194). El residuo de aminoácido X del terminal C (por ejemplo, cisteína, selenocisteína) está subrayado (ERBB3, UniProtKB/Swiss-Prot entrada P21860, receptor tirosinaproteína quinasa erbB-3).
Figuras 51A-51B: Secuencias de aminoácidos de varios compuestos intermedios de polipéptidos en una síntesis basada en inteína de una subunidad precursora de simetroadhesina ERBB4 humano con un extremo X del terminal C. (A) La parte (i) muestra el polipéptido pre-ERBB4-inteína (longitud = 851) que comprende la secuencia señal ERBB4 humano (residuos -25 a -1) y el dominio extracelular (residuos 1 a 626), y un dominio de unión de inteína-quitina Mth RIR1 (residuos 627 a 826) (SEQ ID NO: 196). La parte (ii) muestra el polipéptido quimérico ERBB4-inteína maduro (longitud = 826) que comprende el dominio extracelular de ERBB4 humano y el dominio de unión de inteína-quitina Mth RIR1 (SEQ ID NO: 197). La posición del sitio de autoescisión de inteína está subrayada. (B) La parte (iii) muestra el dominio extracelular de ERBB4 humano terminado en tioéster (longitud = 627) (SEQ ID NO: 198). El residuo (X) de tioglicina del terminal C está subrayado. La parte (iv) muestra el dominio extracelular de ERBB4 humano (longitud = 628) con un extremo X del terminal C (SEQ ID NO: 199). El residuo de aminoácido X del terminal C (por ejemplo, cisteína, selenocisteína) está subrayado. (ERBB4, UniProtKB/Swiss-Prot entrada Q15303, receptor tirosina-proteína quinasa erbB-4).
Figura 52: Expresión en células de riñón 293 de subunidades de simetroadhesina de Fc de IgG1 humana con el extremo S del terminal N. Los carriles 1-6 y los carriles 7-12 muestran los polipéptidos de Fc de IgG1 de la Figura 35A (ii) y la Figura 36A (ii), respectivamente. Sobrenadantes celulares: carriles 1, 3, 5, 7, 9 y 11; lisados celulares: carriles 2, 4, 6, 8, 10 y 12. Secuencias señal utilizadas: SHH (carriles 1, 2, 7 y 8); IFNA (carriles 3, 4, 9, 10); CETP (carriles 5, 6, 11 y 12).
Figura 53: Expresión en células renales 293 de subunidades de simetroadhesina de Fc de IgG1 humana. Los carriles 1-2, 3-4 y 5-6 muestran los polipéptidos de Fc de IgG1 de la Figura 35A (ii), Figura 36A (ii) y Figura 37B (ii), respectivamente. Sobrenadantes celulares: (carriles 1-6). Secuencias señal utilizadas: SHH (carriles 1-6).
Figura 54: Purificación de proteína A de subunidades de simetroadhesina de Fc de IgG1 humana expresadas en células de riñón 293. Los carriles 2 y 8 muestran los polipéptidos de Fc de IgG1 de la Figura 36A y la Figura 35A, respectivamente. Carriles 1-7: fracciones de columna de proteína A-sefarosa para el polipéptido del Fc de IgG1 de la Figura 36A.
Figura 55: Unión de tiol-sefarosa de las subunidades de simetroadhesina de Fc de IgG1 humana purificada con proteína A mostradas en la Figura 54. Los carriles 1-3 y los carriles 4-6 muestran los polipéptidos de Fc de IgG1 humana de la Figura 35A y la Figura 36A, respectivamente. Carriles 1 y 4: material de partida; carriles 2 y 5: fracción de flujo continuo de tiol-sefarosa; carriles 3 y 6: fracción unida a tiol-sefarosa.
Figura 56: Expresión en células de riñón 293 humanas de proteínas de fusión CD4-inteína humanas. Los carriles 1-4 muestran el polipéptido de fusión CD4-inteína de la Figura 40A (ii). Sobrenadantes de células: carriles 1 y 3; lisados celulares: carriles 2 y 4.
Figura 57: Expresión en células de riñón 293 humanas de proteínas de fusión TNR1B humanas. Los carriles 2 y 5 muestran la proteína de fusión TNRIB-inteína de la Figura 44A (ii). Los carriles 1 y 3 muestran la proteína de fusión inmunoadhesina de TNR1B de la Figura 44B (ii). Los carriles 3 y 6 muestran proteínas de células transfectadas de forma simulada. Sobrenadantes celulares: carriles 1-3; lisados celulares: carriles 4-7. Carril 7: TNR1B inmunoadhesina de control (R&D Systems).
Figura 58: Subunidades de simetroadhesina TNR1B con el extremo S del terminal C. Los carriles 1-2 muestran el polipéptido TNR1B de la Figura 44A (iii) después de la purificación por cromatografía de afinidad de quitina y escisión/ elución con MESNA. Los carriles 3 muestran el producto de ligación nativo entre el polipéptido TNR1B de la Figura 44A (iii) con un péptido marcado con fluorescencia (New England Biolabs). Panel (i): fluorescencia directa; panel (ii): transferencia Western con anticuerpo anti-TNR1B (R&D Systems); panel (iii): tinción SYPRO Ruby (Sigma-Aldrich).
Figura 59: Subunidades de simetroadhesina TNR1B con extremo S del terminal C. El carril 5 muestra el polipéptido TNR1B de la Figura 44A (iv) después de la purificación por cromatografía de afinidad de quitina y escisión/elución con cisteína. Los carriles 1-4 muestran inmunoadhesina de TNR1B.
Figura 60: Simetroadhesina TNR1B. Los carriles 1-4 muestran la simetroadhesina TNR1B de la Figura 44A (iv) antes de la oxidación (carriles 1 y 4) y después de la oxidación en presencia de CuSO410 mM. Los carriles 3 y 6 muestran un control de inmunoadhesina TNR1B. Carriles 1-3: condiciones reductoras; carriles 4-6: condiciones no reductoras. El monómero de simetroadhesina TNR1B (42 kd) y el dímero (84 kd) son evidentes en los carriles 2 y 5, y en el carril 5, respectivamente.
Figura 61A-61C: Análisis de unión por saturación de TNF-alfa con varios polipéptidos TNR1B en Biacore T-100. (A) La simetroadhesina TNR1B de la Figura 44A (iv) se acopló covalentemente a un chip Biacore CM-5 usando química de amina Biacore estándar. (B) La inmunoadhesina TNR1B (R&D Systems) se acopló covalentemente a un chip Biacore CM-5 usando química de amina Biacore estándar. (C) La simetroadhesina TNR1B de la Figura 44A (iv) se acopló covalentemente a un chip Biacore CM-5 usando química de tiol Biacore estándar. Después del acoplamiento, se llevó a cabo un análisis de unión por saturación usando TNF-alfa (R&D Systems) en las concentraciones indicadas.
Figura 62A-62C: análisis de Scatchard del análisis de unión por saturación de TNF-alfa mostrado en la Figura 61A-61C. (A) simetroadhesina TNR1B de la Figura 44A (iv) acoplada covalentemente usando química de amina; Kd = Kd = 4,697 x 10'9 M. (B) TNR1B - inmunoadhesina (R&D Systems) acoplada covalentemente usando química de amina; Kd = 4,089 x 10'9 M. (C) simetroadhesina TNR1B de la Figura 44A (iv) acoplada covalentemente usando química de tiol; Kd = 0,8476 x 10'9 M.
Descripción detallada
En el presente documento se divulga un compuesto que comprende un primer tramo de aminoácidos consecutivos, cada uno de los cuales está unido al aminoácido precedente mediante un enlace peptídico y cuya secuencia comprende un sitio de unión para una diana; y un segundo tramo de aminoácidos consecutivos, cada uno de los cuales está unido al aminoácido precedente por un enlace peptídico y cuya secuencia es idéntica a la secuencia del primer tramo de aminoácidos consecutivos y que comprende un sitio de unión idéntico para la diana; en el que cada uno del primer tramo de aminoácidos y el segundo tramo de aminoácidos tiene en un extremo predefinido del mismo un residuo de cisteína o un residuo de selenocisteína y dichos residuos de cisteína o dichos residuos de selenocisteína están unidos por un enlace que tiene la estructura:
Figure imgf000015_0001
en la que cada X es igual y representa un azufre (S) o un selenio (Se) y cada C representa un carbono beta de uno de dichos residuos de cisteína o selenocisteína.
En una variante, el enlace tiene la estructura:
o
Figure imgf000015_0002
En una variante, el residuo en el extremo predefinido de cada uno del primer tramo y el segundo tramo de aminoácidos consecutivos es un residuo de cisteína. En una variante, el residuo en el extremo predefinido de cada uno del primer tramo y el segundo tramo de aminoácidos consecutivos es un residuo de selenocisteína.
También se divulga en el presente documento un compuesto que comprende un primer tramo de aminoácidos consecutivos, cada uno de los cuales está unido al aminoácido precedente mediante un enlace peptídico y cuya secuencia comprende un sitio de unión para una diana; y un segundo tramo de aminoácidos consecutivos, cada uno de los cuales está unido al aminoácido precedente por un enlace peptídico y cuya secuencia es diferente de la secuencia del primer tramo de aminoácidos consecutivos y que comprende un sitio de unión para una fracción diferente; en el que cada uno del primer tramo de aminoácidos y el segundo tramo de aminoácidos tiene en un extremo predefinido del mismo un residuo de cisteína o un residuo de selenocisteína y dichos residuos están unidos por un enlace que tiene la estructura:
Figure imgf000016_0001
en la que cada X puede ser igual o diferente y representa un azufre (S) o un selenio (Se) y cada C representa un carbono beta de uno de dichos residuos de cisteína o selenocisteína.
En una variante, el enlace tiene la estructura:
Figure imgf000016_0002
En una variante, ambos residuos en los extremos predefinidos de cada uno del primer tramo de aminoácidos y el segundo tramo de aminoácidos son residuos de cisteína. En una variante, ambos residuos en los extremos predefinidos de cada uno del primer tramo de aminoácidos y el segundo tramo de aminoácidos son residuos de selenocisteína. En una variante, el residuo en un extremo predefinido de uno del primer tramo o segundo tramo de aminoácidos consecutivos es un residuo de cisteína y el residuo en el otro extremo predefinido es un residuo de selenocisteína.
En el presente documento se divulga un multímero que comprende dos o más compuestos idénticos unidos entre sí por al menos un enlace. En una variante, el multímero es un dímero. En una variante, el multímero es un trímero. En una variante, el multímero es un tetrámero. En una variante del multímero, el uno o más enlaces comprende un enlace disulfuro.
En una variante de los compuestos, el extremo predefinido tanto del primer tramo de aminoácidos como del segundo tramo de aminoácidos es un extremo del terminal N del mismo. En una variante, el extremo predefinido tanto del primer tramo de aminoácidos como del segundo tramo de aminoácidos es un extremo del terminal C del mismo. En una variante, el extremo predefinido de uno del primer tramo de aminoácidos y el segundo tramo de aminoácidos es un extremo del terminal C y el otro extremo predefinido es un extremo del terminal N.
En una variante de los compuestos, el primer tramo de aminoácidos comprende L-aminoácidos. En una variante, el primer tramo de aminoácidos comprende D-aminoácidos. En una variante, el primer tramo de aminoácidos comprende L-aminoácidos y D-aminoácidos.
En una variante, el segundo tramo de aminoácidos comprende L-aminoácidos. En una variante, el segundo tramo de aminoácidos comprende D-aminoácidos. En una variante, el segundo tramo de aminoácidos comprende L-aminoácidos y D-aminoácidos.
En una variante, el primer tramo de aminoácidos comprende al menos 50 aminoácidos consecutivos. En una variante, el segundo tramo de aminoácidos comprende al menos 50 aminoácidos consecutivos. En una variante, el primer y/o segundo tramo de aminoácidos tiene una longitud de entre 1 y 100, 100 y 200 o 200 y 300 aminoácidos. En una variante, el primer tramo o segundo tramo de aminoácidos comprende al menos 20, 25, 30, 35, 40 o 45 aminoácidos consecutivos.
En una variante, el primer tramo de aminoácidos comprende más de un tipo de aminoácido. En una variante, el segundo tramo de aminoácidos comprende más de un tipo de aminoácido.
En una variante de los presentes compuestos, la secuencia del primer y/o segundo tramo de aminoácidos corresponde a la secuencia de una región constante de una inmunoglobulina. En una variante, la inmunoglobulina es una inmunoglobulina humana. En una variante, la región constante de la inmunoglobulina es una región constante de una inmunoglobulina IgG, IgA, IgE, IgD o IgM. En una variante, la región constante de la inmunoglobulina es una región constante de una inmunoglobulina IgG-1, IgG-2, IgG-3 o IgG-4. En una variante, la región constante de la inmunoglobulina que es una región constante de una inmunoglobulina IgG-1, IgG-2, IgG-3 o IgG-4 tiene una de las secuencias indicadas en este documento. En una variante, la región constante de la inmunoglobulina es una región constante de una inmunoglobulina IgG y comprende una región bisagra, una región CH6 y una región CH3. En una variante, la fracción diferente es un inmunoefector o inmunorregulador.
En una variante, la diana es proteína. En una variante, la diana es un receptor del EGF, un HER2, un receptor del VEGF, un antígeno CD20, un CD11a, una inmunoglobulina IgE, un receptor de glicoproteína IIa, un receptor de glicoproteína IIIa, un TNF alfa o un receptor de TNF, una gp120. En una variante, cada uno del primer y segundo tramo de aminoácidos consecutivos comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de TNFRSF1a, TNFRSF1b, VEGFR1, VEGFR6, VEGFR3, Erb1 humano, Erb2 humano, Erb6 humano, Erb3 humano o Erb4 humano. En una variante, el primer o segundo tramo de aminoácidos consecutivos comprende la secuencia de aminoácidos expuesta de cualquiera de TNFRSF1a, TNFRSF1b, VEGFR1, VEGFR6, VEGFR3, Erb1 humano, Erb2 humano, Erb6 humano, Erb3 humano o Erb4 humano.
En el presente documento se divulga una composición que comprende cualquiera de los presentes compuestos en una cantidad eficaz para unirse a la diana y un vehículo. En una variante, el compuesto está en una cantidad eficaz para unir la diana y un vehículo. En una variante, el compuesto es un multímero y está en una cantidad eficaz para unir la diana y un vehículo. En una variante, el multímero también está presente en una cantidad eficaz para unir la fracción diferente. En una variante, el vehículo es un vehículo farmacéuticamente aceptable. En una variante, el vehículo es una solución salina tamponada con fosfato. Tal composición puede liofilizarse.
En el presente documento se divulga un método para afectar la actividad de una diana que comprende poner en contacto la diana con la composición de uno o más de los presentes compuestos, en condiciones tales que el compuesto se una y afecte la actividad de la diana. En una variante, la unión de la composición a la diana aumenta la actividad de la diana. En una variante, la unión de la composición a la diana disminuye la actividad de la diana. En una variante, la diana es un receptor del EGF, una proteína HER2, un receptor del VEGF, un antígeno CD20, un CD11a, una inmunoglobulina IgE, un receptor de glicoproteína IIa, un receptor de glicoproteína IIIa, una gp40, una gp120, un TNF alfa, o un receptor de TNF.
En el presente documento se divulga un complejo que comprende la composición de cualquiera de los presentes compuestos y un tercer tramo de aminoácidos consecutivos, en el que el tercer tramo de aminoácidos consecutivos está unido al del primer o segundo tramo de aminoácidos consecutivos por uno o más enlaces. En una variante, uno o más enlaces comprenden fuerzas de van der Waals. En una variante, uno o más enlaces comprenden un enlace de hidrógeno. En una variante, uno o más enlaces comprenden un enlace covalente. En una variante, uno o más enlaces comprenden un enlace disulfuro. En una variante, al menos un enlace es un enlace disulfuro. En una variante, el enlace disulfuro se encuentra entre dos residuos de aminoácidos no terminales. En una variante, el enlace disulfuro se encuentra entre dos residuos de aminoácidos, al menos uno de los cuales es un residuo de aminoácido no terminal.
En el presente documento se divulga un proceso para preparar uno de los presentes compuestos que comprende:
(a) transfectar una célula con un ácido nucleico recombinante que comprende (i) una primera porción, cuya secuencia es una secuencia señal del terminal N, contigua con (ii) una segunda porción, cuya secuencia codifica un tramo de aminoácidos contiguos con (iii) una tercera porción, cuya secuencia codifica un dominio de unión que contiene inteína del terminal C, en condiciones que permiten la síntesis de un polipéptido quimérico que comprende el tramo de aminoácidos consecutivos contiguos con el dominio de unión que contiene inteína del terminal C;
(b) aislar el polipéptido quimérico producido en la etapa (a);
(c) tratar el polipéptido quimérico para provocar la escisión mediada por tio del dominio de unión que contiene inteína del terminal C del tramo de aminoácidos consecutivos y su reemplazo con un tioéster del terminal C;
(d) tratar el producto de la etapa (c) para permitir la unión de un residuo de cisteína al producto para formar un producto con una cisteína del terminal C; y
(e) oxidar el producto de la etapa (e) en presencia de otro producto de la etapa (e) en condiciones que permitan la formación del compuesto.
En una variante, el ácido nucleico recombinante tiene la secuencia indicada en cualquiera de las SEQ ID NOs. 1-8. En una variante, el dominio de unión que contiene inteína del terminal C es un dominio de unión de inteína-quitina. En una variante, el dominio de unión que contiene inteína del terminal C es un dominio de unión de inteína-quitina Mth RIR1. En una variante, el polipéptido quimérico se aísla en la etapa b) mediante cromatografía de afinidad. En una variante, el polipéptido quimérico se aísla en la etapa b) mediante exposición del producto a una resina derivatizada con quitina. En una variante, las condiciones oxidantes permiten la formación de un enlace disulfuro entre la cisteína del terminal C de cada uno de los productos.
Esta solicitud describe un compuesto que comprende un dominio de proteína de plegamiento independiente fusionado a un segundo dominio de proteína de plegamiento independiente mediante un enlace no peptídico. Esta solicitud describe un compuesto que comprende una primera cadena polipeptídica, que comprende un residuo de cisteína terminal, fusionado en su extremo S a un extremo S de una segunda cadena polipeptídica que comprende un residuo de cisteína terminal. Esta solicitud describe un compuesto que comprende una primera cadena polipeptídica, que comprende un residuo de selenocisteína terminal, fusionado en su extremo Se a un extremo S de una segunda cadena polipeptídica que comprende un residuo de cisteína terminal. Esta solicitud describe un compuesto que comprende una primera cadena polipeptídica, que comprende un residuo de selenocisteína terminal, fusionado en su extremo Se a un extremo Se de una segunda cadena polipeptídica que comprende un residuo de selenocisteína terminal. Esta solicitud describe un multímero que comprende dos o más compuestos idénticos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 66 a 69 unidos entre sí por al menos un enlace.
En el presente documento se divulga un método para preparar un tramo de aminoácidos consecutivos que comprenden una cisteína del terminal N que comprende:
(a) transfectar una célula con un ácido nucleico recombinante que comprende (i) una primera porción, cuya secuencia codifica una secuencia señal del terminal N contigua con (ii) una segunda porción, cuya secuencia codifica un tramo de aminoácidos consecutivos que comprende un residuo de cisteína del terminal N, en condiciones que permitan (i) la síntesis de un polipéptido quimérico que comprende la secuencia señal del terminal N unida por un enlace peptídico en su extremo C a la cisteína del terminal N del tramo de aminoácidos consecutivos y (ii) escisión de la secuencia señal del terminal N del polipéptido quimérico dentro de la célula para producir un tramo de aminoácidos consecutivos que comprenden una cisteína del terminal N;
(b) recuperar el tramo de aminoácidos consecutivos producido en la etapa (a).
En una variante de los métodos divulgados en este documento, el tramo de aminoácidos consecutivos se aísla en la etapa (b).
En una variante, el tramo de aminoácidos consecutivos comprende un polipéptido del Fc de inmunoglobulina. En una variante, el polipéptido del Fc de inmunoglobulina es un polipéptido del Fc de inmunoglobulina humana. En una variante, el residuo de cisteína del terminal N es un residuo cys-5 del polipéptido del Fc de inmunoglobulina humana. En una variante, la célula es una célula embrionaria humana 293 o una célula de ovario de hámster CHO-K1. En una variante, la transfección se realiza con un plásmido pSA. En una variante, la secuencia señal del terminal N se selecciona de una proteína que tiene una cisteína del terminal N. En una variante, el péptido señal es erizo Sonic, interferón alfa-2 o éster transferasa de colesterol. En una variante, el tramo de aminoácidos consecutivos se recupera mediante cromatografía de afinidad. En una variante, la escisión del polipéptido quimérico dentro de la célula se efectúa mediante una señal peptidasa celular.
En el presente documento se divulga un método para preparar un tramo de aminoácidos consecutivos que comprende una cisteína o selenocisteína del terminal N que comprende:
(a) transfectar una célula con un ácido nucleico recombinante que comprende (i) una primera porción, cuya secuencia codifica una secuencia señal del terminal N contigua con (ii) una segunda porción, cuya secuencia codifica un tramo de aminoácidos consecutivos que comprenden un residuo de cisteína del terminal N, en condiciones que permiten (i) la síntesis de un polipéptido quimérico que comprende la secuencia señal del terminal N unida en su extremo C a la cisteína del terminal N del polipéptido del Fc y (ii) la escisión de la secuencia señal del terminal N del polipéptido quimérico dentro de la célula para producir un tramo de aminoácidos consecutivos que comprenden una cisteína del terminal N;
(b) ligar el terminal N del tramo de aminoácidos consecutivos producido en la etapa (a) con un terminal C de un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos cys-asp-lys-thr-His-thr o con un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos sec-asp-lys-thr-His-thr para producir de ese modo el tramo de aminoácidos consecutivos que comprenden una cisteína del terminal N o selenocisteína; y
(c) recuperar el tramo de aminoácidos consecutivos producido en la etapa (b).
En una variante, el tramo de aminoácidos consecutivos comprende un polipéptido del Fc de inmunoglobulina. En una variante, el polipéptido del Fc de inmunoglobulina es un polipéptido del Fc de inmunoglobulina humana. En una variante, el residuo de cisteína del terminal N es un residuo cys-5 del polipéptido del Fc de inmunoglobulina humana. En una variante, el residuo de cisteína del terminal N es un residuo cys-11 del polipéptido del Fc de inmunoglobulina humana. En una variante, el péptido en la etapa (b) comprende la secuencia de aminoácidos cys-asp-lys-thr-His-thr y el tramo de aminoácidos consecutivos producido comprende una cisteína del terminal N. En una variante, el péptido en la etapa (b) comprende la secuencia de aminoácidos sec-asp-lys-thr-His-thr y el tramo de aminoácidos consecutivos producido comprende una selenocisteína del terminal N. En una variante, el péptido en la etapa (b) se protege con un grupo protector Msc del terminal N antes de la ligación. En una variante, la célula es una célula embrionaria humana 293 o una célula de ovario de hámster CHO-K1. En una variante, la transfección se realiza con un plásmido pSA. En una variante, la secuencia señal del terminal N se selecciona de una proteína que tiene una cisteína del terminal N. En una variante, el péptido señal es erizo Sonic, interferón alfa-2 o éster transferasa de colesterol. En una variante, el tramo de aminoácidos consecutivos se recupera mediante cromatografía de afinidad. En una variante, la escisión del polipéptido quimérico dentro de la célula se efectúa mediante una peptidasa señal celular. En realizaciones, se emplean otras secuencias peptídicas cortas con una cisteína o selenocisteína del terminal N en lugar de las expuestas anteriormente.
Esta invención proporciona un proceso para preparar un tramo de aminoácidos consecutivos que comprenden una cisteína del terminal C o una selenocisteína del terminal C, que comprende:
(a) transfectar una célula con un ácido nucleico recombinante que comprende (i) una primera porción, cuya secuencia codifica una secuencia señal del terminal N, contigua a (ii) una segunda porción, cuya secuencia codifica un tramo de aminoácidos contiguos con (iii) una tercera porción, cuya secuencia codifica un dominio de unión que contiene inteína del terminal C, en condiciones que permiten (i) la síntesis de un polipéptido quimérico que comprende la secuencia señal del terminal N contigua con el tramo de aminoácidos consecutivos contiguos al dominio de unión que contiene inteína del terminal C y (ii) escisión de la secuencia señal del terminal N del polipéptido quimérico para producir un segundo polipéptido quimérico que tiene un residuo de lisina del terminal N y que comprende el tramo de aminoácidos consecutivos contiguos al dominio de unión que contiene inteína del terminal C;
(b) aislar el segundo polipéptido quimérico producido en la etapa (a);
(c) tratar el segundo polipéptido quimérico para provocar la escisión mediada por tio del dominio de unión que contiene inteína del terminal C del tramo de aminoácidos consecutivos para formar un tioéster del terminal C;
(d) ligar el producto de la etapa (c) con un residuo de cisteína o un residuo de selenocisteína en su terminal C para formar un producto con una cisteína del terminal C o una selenocisteína del terminal C; y
(e) recuperar el producto de la etapa (d).
El tramo de aminoácidos consecutivos contiguos se selecciona de un fragmento Fc de una inmunoglobulina IgG humana que contiene el dominio M1 o una porción del mismo, o el dominio extracelular de CD4 humano, TNR1A humano, TNR1B humano, VGFR1 humano, VGFR2 humano, VGFR3 humano, ErbB1 humano, ErbB2 humano, ErbB3 humano o ErbB4 humano. En una realización, la secuencia señal del terminal N se selecciona de una proteína que tiene una lisina del terminal N. En una realización, la secuencia señal del terminal N es una glicoproteína de superficie de células T CD2 o una glicoproteína de superficie de células T CD4. En una realización, la célula es una célula embrionaria humana 293 o una célula de ovario de hámster CHO-K1. En una realización, la transfección se realiza con un plásmido pSA. En una realización, el dominio de unión que contiene inteína del terminal C es un dominio de unión de inteína-quitina. En una realización, el dominio de unión que contiene inteína del terminal C es un dominio de unión de inteína-quitina Mth RIR1. En una realización, el dominio de unión que contiene inteína del terminal C es un dominio de unión que contiene inteína de autoempalme. En una realización, el polipéptido quimérico se aísla en la etapa b) mediante exposición del producto a una resina derivatizada con quitina. En una realización, la escisión del segundo polipéptido quimérico dentro de la célula se efectúa mediante una señal peptidasa celular. En una realización, el producto de la etapa (c) se liga con un residuo de cisteína. En una realización, el producto de la etapa (c) se liga con un residuo de selenocisteína.
En el presente documento se divulga un proceso para preparar un tramo de aminoácidos consecutivos que comprenden una cisteína del terminal N y una cisteína o selenocisteína del terminal C que comprende:
(a) transfectar una célula con un ácido nucleico recombinante que comprende (i) una primera porción, cuya secuencia codifica una secuencia señal del terminal N, contigua a (ii) una segunda porción, cuya secuencia codifica un tramo de aminoácidos consecutivos contiguos con (iii) una tercera porción, cuya secuencia codifica un dominio de unión que contiene inteína del terminal C, en condiciones que permiten (i) la síntesis de un polipéptido quimérico que comprende la secuencia señal del terminal N contigua con el tramo de aminoácidos consecutivos contiguos con el dominio de unión que contiene inteína del terminal C y (ii) escisión de la secuencia señal del terminal N del polipéptido quimérico para producir un segundo polipéptido quimérico que tiene un residuo de cisteína del terminal N y que comprende el tramo de aminoácidos consecutivos contiguos al dominio de unión que contiene inteína del terminal C;
(b) aislar el segundo polipéptido quimérico producido en la etapa (a);
(c) tratar el segundo polipéptido quimérico para provocar la escisión mediada por tio del dominio de unión que contiene inteína del terminal C del tramo de aminoácidos consecutivos para formar un tioéster del terminal C;
(d) ligar el producto de la etapa (c) con un residuo de cisteína o un residuo de selenocisteína en su terminal C para formar un producto con una cisteína del terminal C o una selenocisteína del terminal C; y
(e) recuperar el producto de la etapa (d).
En una variante, el tramo de aminoácidos consecutivos contiguos comprende un polipéptido del Fc de inmunoglobulina IgG y un exón M1 de IgG. En una variante, la inmunoglobulina IgG es una inmunoglobulina IgG humana. En una variante, la secuencia señal del terminal N se selecciona de una proteína que tiene una cisteína del terminal N. En una variante, el residuo de cisteína del terminal N es un residuo cys-5 del polipéptido del Fc de inmunoglobulina humana. En una variante, el residuo de cisteína del terminal N es un residuo cys-11 del polipéptido del Fc de inmunoglobulina humana. En una variante, la señal del terminal N es un erizo Sonic, interferón alfa-2 o éster transferasa de colesterol. En una variante, la célula es una célula embrionaria humana 293 o una célula de ovario de hámster CHO-K1. En una variante, la transfección se realiza con un plásmido pSA. En una variante, el dominio de unión que contiene inteína del terminal C es un dominio de unión de inteína-quitina. En una variante, el dominio de unión que contiene inteína del terminal C es un dominio de unión de inteína-quitina Mth RIR1. En una variante, el dominio de unión que contiene inteína del terminal C es un dominio de unión que contiene inteína de autoempalme. En una variante, el segundo polipéptido quimérico se aísla en la etapa b) por exposición del producto a una resina derivatizada con quitina. En una variante, el producto se recupera en la etapa e) mediante cromatografía de afinidad. En una variante, la escisión del polipéptido quimérico dentro de la célula se efectúa mediante una señal peptidasa celular. En una variante, el producto de la etapa (c) se liga con un residuo de cisteína. En una variante, el producto de la etapa (c) se liga con un residuo de selenocisteína.
En el presente documento se divulga un proceso para preparar un tramo de aminoácidos consecutivos que comprenden una cisteína o selenocisteína del terminal N y una cisteína o selenocisteína del terminal C que comprende:
(a) transfectar una célula con un ácido nucleico recombinante que comprende (i) una primera porción, cuya secuencia codifica una secuencia señal del terminal N, contigua a (ii) una segunda porción, cuya secuencia codifica un tramo de aminoácidos consecutivos contiguos con (iii) una tercera porción, cuya secuencia codifica un dominio de unión que contiene inteína del terminal C, en condiciones que permiten (i) la síntesis de un polipéptido quimérico que comprende la secuencia señal del terminal N contigua con el tramo de aminoácidos consecutivos contiguos con el dominio de unión que contiene inteína terminal C y (ii) escisión de la secuencia señal del terminal N del polipéptido quimérico para producir un segundo polipéptido quimérico que tiene un residuo de cisteína del terminal N y que comprende el tramo de aminoácidos consecutivos contiguos al dominio de unión que contiene inteína del terminal C;
(b) aislar el segundo polipéptido quimérico producido en la etapa (a);
(c)
(i) ligar el terminal N del tramo de aminoácidos consecutivos producido en la etapa (a) con un terminal C de un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos cys-asp-lys-thr-His-thr o con un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos sec-asp-lys-thr-His-thr para producir de ese modo el tramo de aminoácidos consecutivos que comprenden una cisteína del terminal N o una selenocisteína del terminal N, respectivamente;
(ii) tratar el polipéptido quimérico para provocar la escisión mediada por tio del dominio de unión que contiene inteína del terminal C del tramo de aminoácidos consecutivos y su reemplazo con un tioéster terminal C;
(iii) ligar el producto de la etapa (c) con un residuo de cisteína o un residuo de selenocisteína en su terminal C para formar un producto con una cisteína pr del terminal C con una selenocisteína del terminal C; y
(d) recuperar el producto de la etapa (c) (iii).
En una variante, el tramo de aminoácidos consecutivos contiguos comprende un polipéptido del Fc de inmunoglobulina IgG y un exón M1 de IgG. En una variante, la inmunoglobulina IgG es una inmunoglobulina IgG humana. En una variante, la secuencia señal del terminal N se selecciona de una proteína que tiene una cisteína del terminal N. En una variante, el residuo de cisteína del terminal N es un residuo cys-11 del polipéptido del Fc de inmunoglobulina humana. En una variante, la secuencia señal del terminal N se selecciona de una proteína que tiene una cisteína del terminal N. En una variante, la señal del terminal N es un erizo Sonic, interferón alfa-2 o éster transferasa de colesterol. En una variante, la célula es una célula embrionaria humana 293 o una célula de ovario de hámster CHO-K1. En una variante, la transfección se realiza con un plásmido pSA. En una variante, el dominio de unión que contiene inteína del terminal C es un dominio de unión de inteína-quitina. En una variante, el dominio de unión que contiene inteína del terminal C es un dominio de unión de inteína-quitina Mth RIR1. En una variante, el polipéptido quimérico se aísla en la etapa (b) por exposición del producto a una resina derivatizada con quitina.
En una variante, el polipéptido del Fc de inmunoglobulina es un polipéptido del Fc de inmunoglobulina humana. En una variante, el residuo de cisteína del terminal N del polipéptido del Fc es un residuo de cys-11. En una variante, el péptido en la etapa (c) (i) comprende la secuencia de aminoácidos cys-asp-lys-thr-His-thr y el tramo de aminoácidos consecutivos. En una variante, el péptido en la etapa (c) (i) comprende la secuencia de aminoácidos sec-asp-lys-thr-His-thr y el tramo de aminoácidos consecutivos producido comprende una selenocisteína del terminal N. En una variante, el péptido de la etapa (c) se protege con un grupo protector Msc del terminal N antes de la ligación. En una variante, en la célula hay una célula embrionaria humana 293 o una célula de ovario de hámster CHO-K1. En una variante, la transfección se realiza con un plásmido pSA. En una variante, la secuencia señal del terminal N se selecciona de una proteína que tiene una cisteína del terminal N. En una variante, el péptido señal es erizo Sonic, interferón alfa-2 o éster transferasa de colesterol. En una variante, en el tramo de aminoácidos consecutivos se recupera mediante cromatografía de afinidad.
En una variante, la etapa (c) de este método actual se realiza en el orden de la etapa (c) (i); etapa (c) (ii); etapa (c) (iii). En una variante, la etapa (c) se realiza en el orden de la etapa (c) (ii); etapa (c) (iii); etapa (c) (i).
También se divulga en este documento un proceso para preparar un compuesto que comprende poner en contacto un tramo de aminoácidos consecutivos, cada uno de los cuales está unido al aminoácido precedente mediante un enlace peptídico y cuya secuencia comprende un sitio de unión para una diana con un segundo tramo de aminoácidos consecutivos, cada uno de los cuales está unido al aminoácido anterior por un enlace peptídico y cuya secuencia es idéntica a la secuencia del primer tramo de aminoácidos consecutivos y que comprende un sitio de unión idéntico para la diana, en el que cada uno del primer tramo de aminoácidos y el segundo tramo de aminoácidos tiene en un extremo predefinido del mismo un residuo de cisteína o un residuo de selenocisteína, en condiciones reductoras para producir el compuesto.
También se divulga en este documento un proceso para preparar un compuesto que comprende poner en contacto un tramo de aminoácidos consecutivos, cada uno de los cuales está unido al aminoácido precedente mediante un enlace peptídico y cuya secuencia comprende un sitio de unión para una diana con un segundo tramo de aminoácidos consecutivos, cada uno de los cuales está unido al aminoácido precedente por un enlace peptídico y cuya secuencia es diferente a la secuencia del primer tramo de aminoácidos consecutivos y que comprende un sitio de unión idéntico para la diana, en el que cada uno del primer tramo de aminoácidos y el segundo tramo de aminoácidos tiene en un extremo predefinido del mismo un residuo de cisteína o un residuo de selenocisteína, en condiciones reductoras para producir el compuesto.
En una realización de los presentes procesos, las condiciones reductoras no desnaturalizan los tramos de aminoácidos consecutivos. En una realización, las condiciones reductoras comprenden exponer los tramos de aminoácidos consecutivos a un tampón que comprende Tris-HCl y mercaptoetanol. En una realización, el tampón está entre pH 7,6 y 8,4. En una realización, el tampón tiene pH 8. En una realización, el método comprende además intercambiar el producto en tampón de oxidación. En una realización, los tramos de aminoácidos consecutivos comprenden un dominio extracelular de CD4. En una realización, los tramos de aminoácidos consecutivos comprenden una secuencia de un polipéptido del Fc de inmunoglobulina. En una realización, la inmunoglobulina es una inmunoglobulina humana. En realizaciones, las células transfectadas de los presentes métodos se cultivan en condiciones adecuadas para permitir la expresión del polipéptido.
Se describe un compuesto que comprende un primer tramo de aminoácidos consecutivos, cada uno de los cuales está unido al aminoácido precedente mediante un enlace peptídico y cuya secuencia comprende un sitio de unión para una diana; y un segundo tramo de aminoácidos consecutivos, cada uno de los cuales está unido al aminoácido precedente por un enlace peptídico y cuya secuencia es idéntica a la secuencia del primer tramo de aminoácidos consecutivos y que comprende un sitio de unión idéntico para la diana;
en el que cada uno del primer tramo de aminoácidos y el segundo tramo de aminoácidos tiene en un extremo predefinido del mismo, independientemente, un aminoácido natural o un amino no natural que tiene un ácido de cadena lateral alifático lineal que comprende un azufre (S) o un selenio (Se) y en el que dicho azufre (S) o un selenio (Se) están unidos por un enlace que tiene la estructura:
Figure imgf000021_0001
en la que cada X es un azufre (S) o un selenio (Se) y cada (C) representa un carbono de la cadena lateral alifática lineal de uno de tales aminoácidos naturales o no naturales y en la que n y m son, independientemente, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10.
En una variante, el aminoácido natural es homocisteína de homoselenocisteína. En una variante, el primer tramo y el segundo tramo de aminoácidos tienen una homocisteína en su extremo predefinido. En una variante, el primer tramo y el segundo tramo de aminoácidos tienen una homoselenocisteína en el extremo predefinido de los mismos. En una variante, el primer tramo y el segundo tramo de aminoácidos tienen una homocisteína en su extremo predefinido. En una variante, el extremo predefinido es un terminal C.
Se describe un compuesto que comprende un primer tramo de aminoácidos consecutivos, cada uno de los cuales está unido al aminoácido precedente mediante un enlace peptídico y cuya secuencia comprende un sitio de unión para una diana; y
un segundo tramo de aminoácidos consecutivos, cada uno de los cuales está unido al aminoácido anterior por un enlace peptídico y cuya secuencia es diferente de la secuencia del primer tramo de aminoácidos consecutivos y que comprende un sitio de unión para una fracción diferente;
en el que cada uno del primer tramo de aminoácidos y el segundo tramo de aminoácidos tiene en un extremo predefinido del mismo, independientemente, un aminoácido natural o un amino no natural que tiene un ácido de cadena lateral alifático lineal que comprende un azufre (S) o un selenio (Se) y en el que dicho azufre (S) o un selenio (Se) están unidos por un enlace que tiene la estructura:
Figure imgf000021_0002
en la que cada X puede ser igual o diferente y representa un azufre (S) o un selenio (Se) y cada (C) representa un carbono de la cadena lateral alifática lineal de uno de tales aminoácidos naturales o no naturales y en la que n y m son, independientemente, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10.
En una variante, el aminoácido natural es la homocisteína de la homoselenocisteína. En una variante, el primer tramo y el segundo tramo de aminoácidos tienen una homocisteína en su extremo predefinido. En una variante, el primer tramo y el segundo tramo de aminoácidos tienen una homoselenocisteína en el extremo predefinido de los mismos. En una variante, el primer tramo y el segundo tramo de aminoácidos tienen una homocisteína en su extremo predefinido. En una variante, el extremo predefinido es un terminal C.
Se describe un método para producir una proteína que comprende un primer polipéptido contiguo a una inteína, cuya inteína es contigua a un segundo polipéptido que comprende un dominio de unión, comprendiendo el método transfectar una célula animal con un ácido nucleico, cuyo ácido nucleico comprende (i) una primera porción que codifica el polipéptido contiguo a (ii) una segunda porción que codifica la inteína, contigua a y la tercera porción de la cual codifica el dominio de unión, en condiciones tales que la célula animal expresa y secreta la proteína. En una variante, la célula animal se deriva de un mamífero. En una variante, el dominio de unión es un dominio de unión a quitina.
Se describe una composición que comprende un polipéptido unido a una superficie sólida a través de un enlace disulfuro terminal. En una variante, la superficie sólida es un chip o una perla.
Se describe un compuesto que comprende:
un primer tramo de aminoácidos consecutivos, cada uno de los cuales está unido al aminoácido precedente mediante un enlace peptídico y cuyo primer tramo de aminoácidos consecutivos comprende un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral que contiene un grupo funcional calcógeno; y
un segundo tramo de aminoácidos consecutivos, que comprende al menos 100 aminoácidos, cada uno de los cuales está unido al aminoácido anterior por un enlace peptídico, en el que al menos 90 aminoácidos consecutivos del segundo tramo de aminoácidos consecutivos tienen una secuencia idéntica a una porción de un polipéptido de región constante de inmunoglobulina humana, y en el que el segundo tramo de aminoácidos consecutivos comprende un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral que contiene un grupo funcional calcógeno en un extremo predefinido del mismo,
en el que dicho residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral que contiene un grupo funcional calcógeno del primer tramo de aminoácidos consecutivos y dicho residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral que contiene un grupo funcional calcógeno del segundo tramo de aminoácidos consecutivos están unidos por un enlace que tiene la estructura:
Figure imgf000022_0001
en la que cada X representa, independientemente, un calcógeno, y en la que C1 representa un carbono de cadena lateral del residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral que contiene un grupo funcional calcógeno del primer tramo de aminoácidos consecutivos y C2 representa un carbono de cadena lateral del segundo tramo de aminoácidos consecutivos.
En variantes al menos en las que al menos 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 aminoácidos consecutivos del segundo tramo de aminoácidos consecutivos tienen una secuencia idéntica a una porción de un polipéptido de región constante de inmunoglobulina humana.
En una variante del compuesto, al menos uno de C1 y C2 es un carbono beta de un aminoácido. En una variante del compuesto, el enlace tiene la estructura:
Figure imgf000022_0002
en la que S es azufre. En una variante del compuesto, el enlace tiene la estructura:
o
Figure imgf000022_0003
en la que S es azufre y Se es selenio.
En una variante del compuesto, el residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral que contiene un grupo funcional calcógeno en el extremo predefinido del segundo tramo de aminoácidos es una cisteína. En una variante del compuesto, el residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral que contiene un grupo funcional calcógeno en el extremo predefinido del segundo tramo de aminoácidos es una selenocisteína, homocisteína u homoselenocisteína. En una variante del compuesto, el residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral que contiene un grupo funcional calcógeno del primer tramo de aminoácidos consecutivos es una cisteína. En una variante del compuesto, el residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral que contiene un grupo funcional calcógeno del primer tramo de aminoácidos es una selenocisteína, homocisteína u homoselenocisteína. En una variante del compuesto, el residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral que contiene un grupo funcional calcógeno del primer tramo de aminoácidos consecutivos es un residuo terminal.
En una variante, el residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral que contiene un grupo funcional calcógeno del primer tramo de aminoácidos consecutivos es un residuo terminal penúltimo, antepenúltimo o preantepenúltimo.
En una variante, el segundo tramo de aminoácidos consecutivos tiene una secuencia idéntica a una región constante de inmunoglobulina humana. En una variante, el segundo tramo de aminoácidos consecutivos es una porción de una región constante de inmunoglobulina humana. En una variante, el primer tramo de aminoácidos consecutivos tiene una secuencia idéntica a una región constante de inmunoglobulina humana.
En una variante, el polipéptido de región constante de inmunoglobulina humana es una IgG1 humana, IgG2 humana, IgG3 humana o IgG4 humana. Se proporciona un compuesto en el que la cadena lateral de al menos uno de los residuos de aminoácidos que tienen una cadena lateral que contiene un grupo funcional calcógeno comprende un alquileno C1-C10.
Se describe una composición que comprende dos de los presentes compuestos unidos entre sí mediante al menos un enlace disulfuro entre el segundo tramo de aminoácidos consecutivos de cada uno de los compuestos.
Se describe una composición que comprende un polipéptido que comprende aminoácidos consecutivos que tienen la secuencia indicada en una de las SEQ ID NOS: 35 a 46, o que tienen la secuencia indicada en una de las SEQ ID NOS: 53 a 67, o que tienen la secuencia indicada en una de las SEQ ID NOS: 74 a 82, o que tiene la secuencia indicada en una de las SEQ ID NOS: 89 a 97, en la que el polipéptido no consiste en un polipéptido de inmunoglobulina natural, incluidos los fragmentos del mismo escindidos por enzimas.
Se describe una composición que comprende un polipéptido que consta de aminoácidos consecutivos que tienen la secuencia indicada en una de las SEQ ID NOS: 35 a 46, o que tienen la secuencia indicada en una de las SEQ ID NOS: 53 a 67, o que tienen la secuencia indicada en una de las SEQ ID NOS: 74 a 82, o que tiene la secuencia indicada en una de las SEQ ID NOS: 89 a 97.
Se describe una composición que comprende el presente polipéptido y un vehículo. En una variante del compuesto, el vehículo es solución salina tamponada con fosfato.
Se describe una composición que comprende dos de los presentes polipéptidos elegidos independientemente, unidos por un enlace no peptídico. En una variante, el enlace es un enlace dicalcogenuro. En una variante, el enlace es un enlace disulfuro.
Se describe una composición que comprende dos de los presentes polipéptidos unidos entre sí mediante al menos un enlace disulfuro entre los dos polipéptidos.
Se describe una composición que comprende un polipéptido que consiste en aminoácidos consecutivos que tienen una secuencia idéntica a una porción de la secuencia indicada en la SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 81 o SEQ ID NO: 96, en la que al menos uno de los residuos terminales del polipéptido tiene una cadena lateral que contiene un grupo funcional calcógeno.
En una variante del compuesto, el residuo terminal que tiene una cadena lateral que contiene un grupo funcional calcógeno es una cisteína o un análogo de la misma.
Las diversas secuencias señal del terminal N, plásmidos, vecots de expresión, ácidos nucleicos recombinantes, tramos de aminoácidos consecutivos, dominios de unión a inteína, tipos de células, métodos de recuperación/aislamiento, etc., expuestos en este documento anteriormente, son ejemplos no limitantes, además de que se exponen en los ejemplos siguientes.
Definición de términos
Tramo de aminoácidos consecutivos: una pluralidad de aminoácidos dispuestos en una cadena, cada uno de los cuales está unido a un aminoácido precedente por un enlace peptídico, excepto que el primer aminoácido de la cadena no está unido a un aminoácido precedente. Los aminoácidos de la cadena pueden ser de origen natural o no natural, o pueden comprender una mezcla de los mismos. Los aminoácidos, a menos que se indique lo contrario, pueden ser genéticamente codificados, de origen natural pero no genéticamente codificados, o de origen no natural, y cualquier selección de los mismos.
En una realización, un tramo de aminoácidos consecutivos tiene actividad biológica, que incluye, pero no se limita a, actividad de unión a la diana o una actividad inmunoefectora, cuya actividad biológica se retiene en el enlace del tramo de aminoácidos consecutivos a otro tramo de aminoácidos consecutivos mediante un enlace -X-X- (por ejemplo, enlace -S-S-, -S-Se-, -Se-Se- o -Se-S-). Un "segmento de aminoácidos consecutivos" es una descripción alternativa de "un tramo de aminoácidos".
Residuo de aminoácido del terminal N: el residuo terminal de un tramo de dos o más aminoácidos consecutivos que tiene un grupo funcional a-amino (NH2) libre, o un derivado de un grupo funcional a-amino (NH2).
Terminal N: el grupo a-amino (NH2) libre (o derivado del mismo) de un residuo de aminoácido del terminal N.
Residuo de aminoácido del terminal C: el residuo del terminal de un tramo de dos o más aminoácidos consecutivos que tienen un grupo funcional a-carboxilo (COOH) libre, o un derivado de un grupo funcional a-carboxilo (COOH).
Terminal C: el grupo a-carboxilo (COOH) libre (o derivado del mismo) de un residuo de aminoácido del terminal C.
Residuo de cisteína del terminal S: una cisteína que es el residuo o residuos del terminal N y/o C de un tramo de aminoácidos consecutivos, y que tiene un grupo funcional p-sulfhidrilo (SH) libre, o un derivado de un grupo funcional p-sulfhidrilo (SH).
Termina S: el grupo p-sulfhidrilo (SH) libre (o derivado del mismo) de un residuo de cisteína del terminal S. Residuo de selenocisteína del terminal Se: una selenocisteína que es el residuo o residuos del terminal N y/o C de un tramo de aminoácidos consecutivos, y que tiene un grupo funcional p-selenohidrilo (SeH) libre, o un derivado de un grupo funcional p-selenohidrilo (SeH).
Terminal Se: el grupo p-selenohidrilo (SeH) libre (o derivado del mismo) de un residuo de selenocisteína del terminal Se.
Residuo de aminoácido del terminal X: una cisteína (o derivado de cisteína) u homocisteína (o derivado de homocisteína), selenocisteína (o derivado de selenocisteína) u homoselenocisteína (o derivado de homoselenocisteína), que es el residuo o residuos del terminal N y/o C de un tramo de aminoácidos consecutivos, y que tiene un grupo funcional p-sulfhidrilo (SH) o p-selenohidrilo (SeH) libre, respectivamente, o un derivado del mismo que contiene azufre o selenio.
Terminal X: el grupo p-sulfhidrilo (SH) o p-selenohidrilo (SeH) libre de un residuo de derivado de cisteína del terminal S/cisteína o de un residuo de derivado de selenocisteína del terminal Se/selenocisteína, respectivamente. Además, un extremo X puede ser el grupo p-sulfhidrilo (SH) o p-selenohidrilo (SeH) libre de un residuo de homocisteína del terminal S o un residuo de homoselenocisteína del terminal Se.
Diana: una entidad que se une a una selección discreta de un tramo de aminoácidos consecutivos o una porción de una estructura terciaria del mismo e incluye, pero no se limita a, receptores, proteínas portadoras, hormonas, proteínas adhesivas celulares, factores de adhesión específicos del tejido, factores de crecimiento y enzimas. Los ejemplos específicos de dianas incluyen un receptor del EGF humano, una proteína HER2, un receptor del VEGF, un antígeno c D20 humano, un CD11a humano, una inmunoglobulina IgE humana, un receptor de glucoproteína IIa humana, un receptor de glucoproteína Illa humana, un TNF alfa humano y un receptor del TNF.
Se entiende que un "enlace", a menos que se especifique lo contrario, o contrario al contexto, incluye un enlace covalente, una interacción dipolo-dipolo tal como un enlace de hidrógeno e interacciones intermoleculares tales como las fuerzas de van der Waals.
Una "secuencia señal" es una cadena peptídica corta (de 3 a 60 aminoácidos de longitud) que dirige el transporte postraduccional de un polipéptido.
"Aminoácido", como se usa en este documento, en una realización, significa un isómero L o D de los aminoácidos codificados genéticamente, es decir, isoleucina, alanina, leucina, asparagina, lisina, aspartato, metionina, cisteína, fenilalanina, glutamato, treonina, glutamina, triptófano, glicina, valina, prolina, arginina, serina, histidina, tirosina, selenocisteína, pirrolisina y también incluye homocisteína y homoselenocisteína.
Otros ejemplos de aminoácidos incluyen un isómero L o D de taurina, gaba, dopamina, lantionina, ácido 2-aminoisobutírico, deshidroalanina, ornitina y citrulina, así como homólogos no naturales y formas sintéticamente modificadas de los mismos que incluyen aminoácidos que tienen cadenas de alquileno acortadas o alargadas en hasta dos átomos de carbono, aminoácidos que comprenden grupos arilo opcionalmente sustituidos y aminoácidos que comprenden grupos halogenados, incluidos grupos alquilo y arilo halogenados, así como aminoácidos beta o gamma y análogos cíclicos.
Debido a la presencia de grupos amino y carboxilo ionizables, los aminoácidos en estas realizaciones pueden estar en forma de sales ácidas o básicas, o pueden estar en formas neutras. Los residuos de aminoácidos individuales también pueden modificarse mediante oxidación o reducción. Otras modificaciones contempladas incluyen hidroxilación de prolina y lisina, fosforilación de grupos hidroxilo de residuos serilo o treonilo y mutilación de los grupos alfa-amino de cadenas laterales de lisina, arginina e histidina.
Los derivados covalentes se pueden preparar uniendo grupos funcionales particulares a las cadenas laterales de aminoácidos o en los terminales N o C.
"Calcógeno" como se usa en este documento se limita a azufre, selenio, telurio y polonio solamente, es decir, como se usa en este documento, "calcógeno" excluye oxígeno y ununhexio.
La "cadena lateral que contiene un grupo funcional calcógeno", como se usa en el presente documento, es una cadena lateral de residuos de aminoácido que contiene un átomo de calcógeno que no es ununhexio ni oxígeno terminalmente reactivo. A modo de ejemplo no limitativo, un aminoácido que tiene una cadena lateral que contiene un grupo funcional calcógeno sería cisteína, selenocisteína, homocisteína, etc., pero no incluiría metionina, por ejemplo, que contiene un átomo de calcógeno (S), pero no un átomo de calcógeno terminalmente reactivo.
También se describen compuestos que comprenden aminoácidos con sustituciones de grupos R. Se entiende que los sustituyentes y patrones de sustitución en los compuestos divulgados en este documento pueden ser seleccionados por un experto en la técnica para proporcionar compuestos que sean químicamente estables a partir de materiales de partida fácilmente disponibles.
"Aminoácido natural" como se usa en este documento significa un isómero L o D de los aminoácidos codificados genéticamente, es decir, isoleucina, alanina, leucina, asparagina, lisina, aspartato, metionina, cisteína, fenilalanina, glutamato, treonina, glutamina, triptófano, glicina, valina, prolina, arginina, serina, histidina, tirosina, selenocisteína, pirrolisina y homocisteína y homoselenocisteína.
"Aminoácido no natural", como se usa en este documento, significa un isómero L o D químicamente modificado de isoleucina, alanina, leucina, asparagina, lisina, aspartato, metionina, cisteína, fenilalanina, glutamato, treonina, glutamina, triptófano, glicina, valina, prolina, arginina, serina, histidina, tirosina, selenocisteína, pirrolisina, homocisteína, homoselenocisteína, taurina, gaba, dopamina, lantionina, ácido 2-aminoisobutírico, deshidroalanina, ornitina o citrulina, incluyendo derivados de cisteína y selenocisteína que tienen cadenas laterales alifática C3-C10 entre el carbono alfa y el S o Se. En una realización, la cadena lateral alifática es un alquileno. En otra realización, la cadena lateral alifática es un alquenileno o alquinileno.
Además de los tramos de secuencias de aminoácidos consecutivos descritos en el presente documento, se contempla que se puedan preparar variantes de las mismas introduciendo cambios de nucleótidos apropiados en el ADN codificante y/o mediante síntesis de las secuencias de aminoácidos consecutivas deseadas. Los expertos en la técnica apreciarán que los cambios de aminoácidos pueden alterar los procesos postraduccionales de los tramos de aminoácidos consecutivos divulgados en este documento cuando la expresión es el método de síntesis elegido (en lugar de la síntesis química, por ejemplo), tal como el cambio del número o posición de los sitios de glicosilación o alterando las características de anclaje a la membrana.
Pueden realizarse variaciones en las secuencias divulgadas en el presente documento, por ejemplo, usando cualquiera de las técnicas y directrices para mutaciones conservadoras y no conservadoras expuestas, por ejemplo, en la patente de los Estados Unidos No. 5.364.934. Las variaciones pueden ser una sustitución, eliminación o inserción de uno o más codones que codifican la secuencia de aminoácidos consecutiva de interés que da como resultado un cambio en la secuencia de aminoácidos en comparación con la secuencia nativa. Opcionalmente, la variación es mediante la sustitución de al menos un aminoácido por cualquier otro aminoácido en uno o más de los dominios. Se puede encontrar una guía para determinar qué residuo de aminoácido puede insertarse, sustituirse o eliminarse sin afectar adversamente la actividad deseada comparando la secuencia con la de moléculas de proteína conocidas homólogas y minimizando el número de cambios de secuencia de aminoácidos realizados en regiones de alta homología. Las sustituciones de aminoácidos pueden ser el resultado del reemplazo de un aminoácido por otro que tenga propiedades estructurales y/o químicas similares, tal como el reemplazo de una leucina por una serina, es decir, reemplazos conservadores de aminoácidos. Las inserciones o eliminaciones pueden estar opcionalmente en el intervalo de aproximadamente 1 a 5 aminoácidos. La variación permitida se puede determinar haciendo sistemáticamente inserciones, eliminaciones o sustituciones de aminoácidos en la secuencia y probando las variantes resultantes para determinar la actividad exhibida por la secuencia nativa de longitud completa o madura. Se entiende que cualquier variación terminal se realiza dentro del contexto de la invención divulgada en el presente documento.
Las variantes de la secuencia de aminoácidos del compañero de unión se preparan con varios objetivos en mente, incluido el aumento de la afinidad del compañero de unión por su ligando, facilitando la estabilidad, purificación y preparación del compañero de unión, modificando su vida media en plasma, mejorando la eficacia terapéutica y disminuyendo la gravedad o aparición de efectos secundarios durante el uso terapéutico del compañero de unión.
Las variantes de secuencia de aminoácidos de estas secuencias también se contemplan en el presente documento, incluidas variantes de inserción, sustitución o eliminación. Normalmente, tales variantes se pueden preparar mediante mutagénesis específica del sitio de nucleótidos en el ADN que codifica el monómero de unión a la diana, mediante el cual se obtiene el ADN que codifica la variante, y luego expresando el ADN en cultivo de células recombinantes. Los fragmentos que tienen hasta aproximadamente 100-150 residuos de aminoácidos también pueden prepararse convenientemente mediante síntesis in vitro. Tales variantes de secuencia de aminoácidos son variantes predeterminadas y no se encuentran en la naturaleza. Las variantes exhiben la actividad biológica cualitativa (incluida la unión a la diana) de la forma no variante, aunque no necesariamente del mismo valor cuantitativo. Aunque el sitio para introducir una variación de la secuencia de aminoácidos está predeterminado, la mutación per se no necesita estar predeterminada. Por ejemplo, para optimizar el rendimiento de una mutación en un sitio dado, se lleva a cabo mutagénesis aleatoria o de saturación (en la que se insertan los 20 residuos posibles) en el codón diana y la variante expresada se criba para la combinación óptima de actividades deseadas. Dicho cribado está dentro de los conocimientos habituales en la técnica.
Las inserciones de aminoácidos serán normalmente del orden de aproximadamente 1 a 10 residuos de aminoácidos; las sustituciones se introducen típicamente para residuos individuales; y las eliminaciones oscilarán aproximadamente entre 1 y 30 residuos. Las eliminaciones o inserciones se realizan preferiblemente en pares adyacentes, es decir, una eliminación de 2 residuos o una inserción de 2 residuos. Resultará ampliamente evidente a partir de la siguiente discusión que las sustituciones, eliminaciones, inserciones o cualquier combinación de las mismas se introducen o combinan para llegar a un constructo final.
En un aspecto, se divulga en este documento un compuesto que comprende un tramo de aminoácidos consecutivos que tienen al menos aproximadamente un 80% de identidad de secuencia, preferiblemente al menos aproximadamente un 81% de identidad de secuencia, más preferiblemente al menos aproximadamente un 82% de identidad de secuencia, aún más preferiblemente al menos aproximadamente 83% de identidad de secuencia, aún más preferiblemente al menos aproximadamente 84% de identidad de secuencia, aún más preferiblemente al menos aproximadamente 85% de identidad de secuencia, aún más preferiblemente al menos aproximadamente 86% de identidad de secuencia, aún más preferiblemente al menos aproximadamente 87% identidad de secuencia, aún más preferiblemente al menos aproximadamente 88% de identidad de secuencia, aún más preferiblemente al menos aproximadamente 89% de identidad de secuencia, aún más preferiblemente al menos aproximadamente 90% de identidad de secuencia, aún más preferiblemente al menos aproximadamente 91% de identidad de secuencia, aún más preferiblemente al menos aproximadamente 92% de identidad de secuencia, aún más preferiblemente al menos aproximadamente 93% de identidad de secuencia, aún más preferiblemente al menos aproximadamente 94% de identidad de secuencia, aún más preferiblemente al menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia y aún más preferiblemente al menos aproximadamente 96% de identidad de secuencia, aún más preferiblemente al menos aproximadamente 97% de identidad de secuencia, aún más preferiblemente al menos aproximadamente 98% de identidad de secuencia y aún más preferiblemente al menos aproximadamente 99% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos divulgada en la memoria descriptiva, una figura, una SEQ ID NO. o una lista de secuencias de la presente solicitud.
Los valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos se pueden obtener fácilmente usando, por ejemplo, el programa informático WU-BLAST-2 (Altschul et al., Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)).
Se proporcionan en este documento fragmentos de secuencias nativas. Dichos fragmentos pueden estar truncados en el terminal N o terminal C, o pueden carecer de residuos internos, por ejemplo, cuando se comparan con una proteína nativa de longitud completa. Nuevamente, se entiende que cualquier variación terminal se realiza dentro del contexto de la invención divulgada en este documento. Ciertos fragmentos carecen de residuos de aminoácidos que no son esenciales para una actividad biológica deseada de la secuencia de interés.
Puede usarse cualquiera de varias técnicas convencionales. Los fragmentos de péptidos deseados o los fragmentos de tramos de aminoácidos consecutivos pueden sintetizarse químicamente. Un enfoque alternativo implica generar fragmentos por digestión enzimática, por ejemplo, tratando la proteína con una enzima conocida para escindir proteínas en sitios definidos por residuos de aminoácidos particulares, o digiriendo el ADN con enzimas de restricción adecuadas y aislando el fragmento deseado. Aún otra técnica adecuada implica aislar y amplificar un fragmento de ADN que codifica un polipéptido/fragmento de secuencia deseado, mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Los oligonucleótidos que definen los extremos deseados del fragmento de ADN se emplean en los cebadores 5' y 3' en la PCR.
En realizaciones particulares, las sustituciones conservadoras de interés se muestran en la Tabla 1 bajo el título de sustituciones preferidas. Si tales sustituciones dan como resultado un cambio en la actividad biológica, entonces se introducen cambios más sustanciales, denominados ejemplos de sustituciones en la Tabla 1, o como se describe más adelante en referencia a las clases de aminoácidos, y se criban los productos.
TABLA 1
Original Ejemplo Preferido
Ala (A) val; leu; ile val
Arg (R) lys; gln; asn lys
Original Ejemplo Preferido
Asn(N) gln; his; lys; arg gln
Asp(D) glu glu
Cys (C) ser ser
Gln (Q) asn asn
Glu (E) asp asp
Gly (G) pro; ala ala
His (H) asn; gln; lys; arg arg
Ile (I) leu; val; met; ala; phe; norleucina leu
Leu (L) norleucina; ile; val; met; ala; phe ile
Lys (K) arg; gln; asn arg
Met (M) leu; phe; ile leu
Phe (F) leu; val; ile; ala; tyr leu
Pro (P) ala ala
Ser (S) thr thr
Thr (T) ser ser
Trp (W) tyr; phe tyr
Tyr (Y) trp; phe; thr; ser phe
Val (V) ile; leu; met; phe; ala; norleucina leu
Las modificaciones sustanciales en la función o la identidad inmunológica de la secuencia se logran seleccionando sustituciones que difieren significativamente en su efecto sobre el mantenimiento de (a) la cadena principal del polipéptido en el área de la sustitución, por ejemplo, como una conformación de lámina o helicoidal, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana, o (c) la mayor parte de la cadena lateral. Los residuos de origen natural se dividen en grupos de acuerdo con las propiedades comunes de la cadena lateral:
(1) hidrófoba: norleucina, met, ala, val, leu, ile;
(2) hidrófila neutra: cys, ser, thr;
(3) ácida: asp, glu;
(4) básica: asn, gln, his, lys, arg;
(5) residuos que influyen en la orientación de la cadena: gly, pro;
(6) aromática: trp, tyr, phe.
Las sustituciones no conservadoras implicarán el intercambio de un miembro de una de estas clases por otra clase. Dichos residuos sustituidos también pueden introducirse en los sitios de sustitución conservadores o, más preferiblemente, en los sitios restantes (no conservados).
Las variaciones se pueden realizar usando métodos conocidos en la técnica tales como mutagénesis mediada por oligonucleótidos (dirigida al sitio), barrido de alanina y mutagénesis por PCR. Mutagénesis dirigida al sitio (Carter et al., Nucl. Acids Res., 13: 4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids Res., 10: 6487 (1987)), mutagénesis en casete (Wells et al., Gene, 34: 315 (1985)), mutagénesis de selección de restricción (Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317: 415 (1986)) u otras técnicas conocidas se pueden realizar en el ADN clonado para producir el ADN variante.
El análisis de barrido de aminoácidos también se puede emplear para identificar uno o más aminoácidos a lo largo de una secuencia contigua. Entre los aminoácidos de barrido preferidos se encuentran los aminoácidos neutros relativamente pequeños. Dichos aminoácidos incluyen alanina, glicina, serina y cisteína. La alanina es típicamente un aminoácido de barrido preferido entre este grupo porque elimina la cadena lateral más allá del carbono beta y es menos probable que altere la conformación de la cadena principal de la variante (Cunningham y Wells, Science, 244: 1081-1085 (1989)). La alanina también se prefiere típicamente porque es el aminoácido más común. Además, se encuentra frecuentemente tanto en posiciones enterradas como expuestas (Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150: 1 (1976)). Si la sustitución de alanina no produce cantidades adecuadas de variante, se puede usar un aminoácido isotérico.
Modificaciones covalentes: los tramos de aminoácidos consecutivos pueden modificarse covalentemente. Un tipo de modificación covalente incluye la reacción de residuos de aminoácidos diana con un agente de derivatización orgánico que es capaz de reaccionar con cadenas laterales seleccionadas o los residuos del terminal N o C que no están implicados en un enlace -x-x. La derivatización con agentes bifuncionales es útil, por ejemplo, para entrecruzar a una matriz o superficie de soporte insoluble en agua para usar en el método para purificar anticuerpos anti-secuencia de interés, y viceversa. Los agentes de entrecruzamiento comúnmente usados incluyen, por ejemplo, 1,1-bis (diazoacetil) -2-feniletano, glutaraldehído, ésteres de N-hidroxisuccinimida, por ejemplo, ésteres con ácido 4-azidosalicílico, imidoésteres homobifuncionales, incluyendo ésteres de disuccinimidilo tales como 3,3'-ditiobis(succinimidilpropionato), maleimidas bifuncionales tales como bis-N-maleimido-1,8-octano y agentes tales como metil-3-((p-azidofenil)ditio) propioimidato.
Otras modificaciones incluyen la desamidación de los residuos de glutaminilo y asparaginilo a los correspondientes residuos de glutamilo y aspartilo, respectivamente, hidroxilación de prolina y lisina, fosforilación de grupos hidroxilo de residuos de serilo o treonilo, metilación de los grupos a-amino de lisina, cadenas laterales de arginina e histidina (TE Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, WH Freeman & Co., San Francisco, páginas 79-86 (1983)), acetilación de la amina del terminal N y amidación de cualquier grupo carboxilo del terminal C.
Otro tipo de modificación covalente comprende alterar el patrón de glicosilación nativo del tramo consecutivo de aminoácidos o de un polipéptido. "Alterar el patrón de glicosilación nativo" pretende, para los fines de la presente divulgación, la eliminación de uno o más fracciones de carbohidratos que se encuentran en las secuencias de aminoácidos (ya sea eliminando el sitio de glicosilación subyacente o eliminando la glicosilación por medios químicos y/o enzimáticos), y/o añadir uno o más sitios de glicosilación que no están presentes en la secuencia nativa. Además, la frase incluye cambios cualitativos en la glicosilación de las proteínas nativas, lo que implica un cambio en la naturaleza y proporciones de las diversas fracciones presentes de carbohidratos.
La adición de sitios de glicosilación a la secuencia de aminoácidos se puede lograr alterando la secuencia de aminoácidos. La alteración se puede realizar, por ejemplo, mediante la adición o sustitución de uno o más residuos de serina o treonina a la secuencia nativa (para sitios de glicosilación ligados a O). La secuencia de aminoácidos puede alterarse opcionalmente mediante cambios a nivel del ADN, particularmente mediante la mutación del ADN que codifica la secuencia de aminoácidos en bases preseleccionadas de modo que se generen codones que se traducirán en los aminoácidos deseados.
Otro medio para aumentar el número de fracciones de carbohidratos en la secuencia de aminoácidos es mediante el acoplamiento químico o enzimático de glucósidos al polipéptido. Dichos métodos se describen en la técnica, por ejemplo, en el documento WO 87/05330 publicado el 11 de septiembre de 1987 y en Aplin y Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., páginas 259 - 306 (1981).
La eliminación de fracciones de carbohidratos presentes en la secuencia de aminoácidos se puede lograr química o enzimáticamente o mediante sustitución mutacional de codones que codifican residuos de aminoácidos que sirven como dianas para la glicosilación. Las técnicas de desglicosilación química son conocidas en la técnica y descritas, por ejemplo, por Hakimuddin, et al., Arch. Biochem. Biophys., 259: 52 (1987) y por Edge et al., Anal. Biochem. 118: 131 (1981). La escisión enzimática de fracciones de carbohidratos en polipéptidos se puede lograr mediante el uso de una variedad de endo y exoglicosidasas como describen Thotakura et al., Meth. Enzymol. 138: 350 (1987).
Otro tipo de modificación covalente comprende unir la secuencia de aminoácidos a uno de una variedad de polímeros no proteináceos, por ejemplo, polietilenglicol (PEG), polipropilenglicol o polioxialquilenos, de la manera indicada en las patentes de los Estados Unidos Nos 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 o 4.179.337, o a un polipéptido etiqueta que proporciona un epítopo al que puede unirse selectivamente un anticuerpo anti-etiqueta. Se conocen bien en la técnica varios polipéptidos etiqueta y sus respectivos anticuerpos. Los ejemplos incluyen etiquetas de poli-Histidina (poli-His) o poli-Histidina-glicina (poli-His-gly); el polipéptido etiqueta de HA de la gripe y su anticuerpo 12CA5 (Field et al., Mol. Cell. Biol., 8: 2159-2165 (1988)); la etiqueta c-myc y los anticuerpos 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 y 9E10 contra la misma (Evan et al., Molecular and Cellular Biology, 5: 3610-3616 (1985); y la etiqueta de glicoproteína D del virus del Herpes simple (gD) y su anticuerpo (Paborsky et al., Protein Engineering, 3 (6): 547-553 (1990)). Otros polipéptidos etiqueta incluyen el péptido Flag (Hopp et al., BioTechnology, 6: 1204-1210 (1988)); el péptido del epítopo KT3 (Martin et al., Science, 255: 192-194 (1992)); un péptido del epítopo de alfa-tubulina (Skinner et al., J. Biol. Chem., 266: 15163-15166 (1991)); y la etiqueta peptídica de la proteína 10 del gen T7 (Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 6393-6397 (1990)).
Sales
Las sales de los compuestos divulgadas en el presente documento también se describen en este documento. Como se usa en el presente documento, una "sal" es una sal de los presentes compuestos que ha sido modificada haciendo sales ácidas o básicas de los compuestos.
Productos farmacéuticos
La sal puede ser farmacéuticamente aceptable. Los ejemplos de sales farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, sales de ácidos minerales u orgánicos de residuos básicos tales como aminas; sales alcalinas u orgánicas de residuos ácidos tales como ácidos carboxílicos. Las sales se pueden preparar usando un ácido orgánico o inorgánico. Tales sales ácidas son cloruros, bromuros, sulfatos, nitratos, fosfatos, sulfonatos, formiatos, tartratos, maleatos, malatos, citratos, benzoatos, salicilatos, ascorbatos y similares. Las sales carboxilato son las sales de metales alcalinotérreos, sodio, potasio o litio.
Las sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos divulgados en el presente documento se pueden preparar de cualquier manera convencional, por ejemplo, tratando una solución o suspensión de la base o ácido libre correspondiente con un equivalente químico de un ácido o base farmacéuticamente aceptable. Pueden emplearse técnicas convencionales de concentración o cristalización para aislar las sales. Ejemplos de ácidos adecuados son los ácidos acético, láctico, succínico, maleico, tartárico, cítrico, glucónico, ascórbico, benzoico, cinámico, fumárico, sulfúrico, fosfórico, clorhídrico, bromhídrico, yodhídrico, sulfámico, sulfónico tales como metanosulfónico, bencenosulfónico, p- toluenosulfónico y ácidos afines. Las bases ilustrativas son sodio, potasio y calcio.
Se entiende que el término "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye excipientes, vehículos o diluyentes. El vehículo, diluyente o excipiente particular utilizado dependerá de los medios y el propósito para el que se aplica el ingrediente activo.
Los compuestos divulgados en el presente documento se pueden administrar solos o en combinación con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables, en dosis únicas o múltiples. Los vehículos farmacéuticos adecuados incluyen diluyentes o rellenos sólidos inertes, soluciones acuosas estériles y diversos disolventes orgánicos. Las composiciones farmacéuticas divulgadas en el presente documento se pueden administrar fácilmente en una variedad de formas de dosificación tales como soluciones inyectables, comprimidos, polvos, pastillas, jarabes y similares. Estas composiciones farmacéuticas pueden, si se desea, contener ingredientes adicionales tales como saborizantes, aglutinantes, excipientes y similares. Además, se pueden utilizar agentes lubricantes tales como estearato de magnesio, lauril sulfato de sodio y talco para la formación de comprimidos. También se pueden emplear composiciones sólidas de un tipo similar como rellenos en cápsulas de gelatina rellenas, blandas y duras. Los materiales preferidos para esto incluyen lactosa o azúcar de leche y polietilenglicoles de alto peso molecular. Cuando se desean suspensiones o elixires acuosos para la administración oral, el ingrediente activo esencial que contienen se puede combinar con varios agentes edulcorantes o saborizantes, materias colorantes o tintes y, si se desea, agentes emulsionantes o de suspensión, junto con diluyentes tales como agua, etanol, propilenglicol, glicerina y combinaciones de los mismos.
Para la administración parenteral, se pueden emplear soluciones que contengan un compuesto como se divulga en el presente documento o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo en una solución acuosa estéril. Tales soluciones acuosas deben tamponarse adecuadamente si es necesario y el diluyente líquido primero debe volverse isotónico con suficiente solución salina o glucosa. Estas soluciones acuosas particulares son especialmente adecuadas para la administración intravenosa, intramuscular, subcutánea e intraperitoneal. Los medios acuosos estériles empleados están todos fácilmente disponibles mediante técnicas estándar conocidas por los expertos en la técnica.
La composición farmacéutica final se puede procesar en una forma de dosificación unitaria (por ejemplo, pulverizada o liofilizada en un vial, comprimido, cápsula o sobre) y luego empaquetada para su distribución. La etapa de procesamiento variará dependiendo de la forma de dosificación unitaria particular. Por ejemplo, un comprimido se comprime generalmente bajo presión en una forma deseada y una cápsula o sobre emplea una operación de llenado simple. Los expertos en la técnica conocen bien los procedimientos utilizados para preparar las diversas formas de dosificación unitaria.
Las composiciones divulgadas en este documento pueden estar en una variedad de formas. Estas incluyen, por ejemplo, formas de dosificación líquidas, semisólidas y sólidas, tales como soluciones líquidas (por ejemplo, soluciones inyectables e infusibles), dispersiones o suspensiones, comprimidos, píldoras, polvos, liposomas y supositorios. La forma preferida depende del modo de administración y aplicación terapéutica previstos. Algunas composiciones se encuentran en forma de soluciones inyectables o infusibles. Un modo de administración es parenteral (por ejemplo, intravenoso, subcutáneo, intraperitoneal, intramuscular). En una variante, el compuesto se administra mediante infusión o inyección intravenosa. En otra variante, el compuesto se administra por inyección intramuscular o subcutánea.
Las composiciones terapéuticas contempladas en el presente documento típicamente deben ser estériles y estables en las condiciones de fabricación y almacenamiento. La composición se puede formular como solución, microemulsión, dispersión, liposoma u otra estructura ordenada adecuada para una alta concentración de fármaco. Pueden prepararse soluciones inyectables estériles incorporando el compuesto en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinación de ingredientes según se requiera, seguido de esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación preferidos son el secado al vacío y la liofilización que produce un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional de una solución previamente filtrada en forma estéril de la misma. La fluidez adecuada de una solución se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un revestimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y mediante el uso de tensioactivos. La absorción prolongada de composiciones inyectables puede conseguirse incluyendo en la composición un agente que retrase la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina.
En ciertas variantes, el compuesto activo se puede preparar con un vehículo que protegerá al compuesto contra la liberación rápida, tal como una formulación de liberación controlada, que incluye implantes, parches transdérmicos y sistemas de administración microencapsulados. Se pueden usar polímeros biodegradables y biocompatibles, tales como acetato de etileno y vinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Muchos métodos para la preparación de tales formulaciones están patentados o son generalmente conocidos por los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1978. En ciertas variantes, los compuestos divulgados en este documento se pueden administrar por vía oral, por ejemplo, con un diluyente inerte o un vehículo comestible asimilable. El compuesto (y otros ingredientes, si se desea) también pueden incluirse en una cápsula de gelatina de cubierta dura o blanda, comprimirse en comprimidos o incorporarse directamente en la dieta del sujeto. Para la administración terapéutica oral, los compuestos pueden incorporarse con excipientes y usarse en forma de comprimidos ingeribles, comprimidos bucales, grageas, cápsulas, elixires, suspensiones, jarabes, obleas y similares. Al administrar un compuesto divulgado en el presente documento mediante una administración distinta a la parenteral, el compuesto puede recubrirse o coadministrarse con un material para evitar su inactivación.
También se pueden incorporar compuestos activos complementarios en las composiciones, por ejemplo, un agente quimioterapéutico, un agente antineoplásico o un agente antitumoral. Además, los compuestos divulgados en el presente documento pueden formularse conjuntamente y/o coadministrarse con uno o más agentes terapéuticos adicionales. Estos agentes incluyen, sin limitación, anticuerpos que se unen a otras dianas (por ejemplo, anticuerpos que se unen a uno o más factores de crecimiento o citocinas, sus receptores de superficie celular), proteínas de unión, agentes antineoplásicos, agentes quimioterapéuticos, agentes antitumorales, oligonucleótidos antisentido, factores de crecimiento. En una variante, una composición farmacéutica de los compuestos divulgados en este documento puede comprender uno o más agentes terapéuticos adicionales.
Para uso terapéutico, las composiciones divulgadas en el presente documento se pueden administrar de varias maneras, incluida la forma soluble mediante inyección en bolo, infusión continua, liberación sostenida de implantes, ingestión oral, inyección local (por ejemplo, intracardiaca, intramuscular), inyección sistémica u otras técnicas adecuadas bien conocidas en las técnicas farmacéuticas. Otros métodos de administración farmacéutica incluyen, pero no se limitan a, métodos de administración oral, subcutánea, transdérmica, intravenosa, intramuscular y parenteral. Normalmente, una composición soluble comprenderá un compuesto purificado junto con vehículos, excipientes o diluyentes fisiológicamente aceptables. Dichos vehículos no serán tóxicos para los receptores a las dosis y concentraciones empleadas. La preparación de tales composiciones puede implicar la combinación de un compuesto con tampones, antioxidantes, carbohidratos que incluyen glucosa, sacarosa o dextrinas, agentes quelantes tales como EDTA, glutatión y otros estabilizadores y excipientes. La solución salina tamponada neutra o la solución salina mezclada con albúmina de suero específica son ejemplos de diluyentes apropiados. El producto se puede formular como un liofilizado usando soluciones de excipientes apropiadas (por ejemplo, sacarosa) como diluyentes.
Otros derivados comprenden los compuestos/composiciones divulgados en este documento unidos covalentemente a un polímero no proteico. La unión al polímero se realiza generalmente para no interferir con la actividad biológica preferida del compuesto, por ejemplo, la actividad de unión del compuesto a una diana. El polímero no proteico es normalmente un polímero sintético hidrófilo, es decir, un polímero que no se encuentra de otra manera en la naturaleza. Sin embargo, los polímeros que existen en la naturaleza y se producen mediante métodos recombinantes o in vitro son útiles, al igual que los polímeros que se aíslan de la naturaleza. Los polímeros de polivinilo hidrófilos también se divulgan en el presente documento, por ejemplo, alcohol polivinílico y polivinilpirrolidona. Son particularmente útiles los éteres de polialquileno tales como polietilenglicol, polipropilenglicol, ésteres de polioxietileno o metoxipolietilenglicol; polioxialquilenos tales como polioxietileno, polioxipropileno y copolímeros de bloques de polioxietileno y polioxipropileno (Pluronics); polimetacrilatos; carbómeros; polisacáridos ramificados o no ramificados que comprenden los monómeros sacáridos D-manosa, D- y L-galactosa, fucosa, fructosa, D-xilosa, L-arabinosa, ácido D-glucurónico, ácido siálico, ácido D-galacturónico, ácido D-manurónico (por ejemplo, ácido polimanurónico o ácido algínico), D-glucosamina, D-galactosamina, D-glucosa y ácido neuramínico, incluidos homopolisacáridos y heteropolisacáridos tales como lactosa, amilopectina, almidón, hidroxietil almidón, amilosa, sulfato de dextrano, dextrano, dextrinas, glucógeno o la subunidad de polisacárido de mucopolisacáridos ácidos, por ejemplo, ácido hialurónico; polímeros de alcoholes de azúcar tales como polisorbitol y polimanitol; así como heparina o heparon.
Las composiciones farmacéuticas divulgadas en el presente documento pueden incluir una "cantidad terapéuticamente eficaz" o una "cantidad profilácticamente eficaz" de un compuesto como se divulga en el presente documento. Una "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, en las dosis y durante los períodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado terapéutico deseado. Una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto puede variar de acuerdo con factores tales como el estado de la enfermedad, la edad, el sexo y el peso del individuo. Una cantidad terapéuticamente eficaz es también aquella en la que los efectos terapéuticamente beneficiosos superan los efectos tóxicos o perjudiciales del compuesto. Una "cantidad profilácticamente eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, en las dosis y durante los períodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado profiláctico deseado. Normalmente, dado que se usa una dosis profiláctica en sujetos antes o en una etapa más temprana de la enfermedad, la cantidad profilácticamente eficaz será menor que la cantidad terapéuticamente eficaz.
Ejemplos de composiciones farmacéuticas
Los ejemplos no limitantes de tales composiciones y dosis se exponen a continuación:
Las composiciones que comprenden un compuesto que comprende un tramo de aminoácidos consecutivos que comprenden aminoácidos consecutivos que tienen la secuencia de bevacizumab (por ejemplo, Avastina) pueden comprender dihidrato de trehalosa, fosfato de sodio (monobásico, monohidratado), fosfato de sodio (dibásico, anhidro), polisorbato 20 y agua para inyectables, USP. La composición también se puede liofilizar, a la que se puede añadir agua para su reconstitución. En una variante, la composición tiene un pH de 6,2 o aproximadamente 6,2. En una variante, el compuesto se puede administrar en combinación con un compuesto quimioterapéutico tal como 5-fluorouracilo intravenoso para el tratamiento de pacientes con carcinoma metastásico de colon o recto. En una variante, el compuesto se administra en una dosis de entre 0,1 y 10 mg/kg administrada una vez cada 14 días como infusión intravenosa. En una variante adicional, la dosis es de 5 mg/kg administrada una vez cada 14 días. En una variante, la dosis está entre 1,0 y 2,0 mg/kg administrada una vez cada 14 días. En una variante, la dosis está entre 0,01 y 1,5 mg/kg administrada una vez cada 14 días. En una variante, la dosis está entre 0,001 y 10 mg/kg administrada una vez cada 1-21 días.
Las composiciones que comprenden un compuesto que comprende un tramo de aminoácidos consecutivos que comprende aminoácidos consecutivos que tienen la secuencia de trastuzumab (por ejemplo, Herceptina) pueden comprender dihidrato de trehalosa, L-Histidina HCl, L-Histidina y polisorbato 20, USP. Este se puede reconstituir con agua bacteriostática para inyección (BWFI), USP, o equivalentes de la misma, que contiene alcohol bencílico al 1,1% como conservante o equivalentes del mismo. En una variante, la composición tiene un pH de aproximadamente 6,0. La composición también se puede liofilizar, a la que se puede añadir agua para su reconstitución. En una variante, el compuesto se puede administrar a sujetos con cáncer de mama metastásico cuyo tumor sobreexpresa la proteína HER2. En una variante, el sujeto ha recibido/está recibiendo quimioterapia. En otra variante, el compuesto se administra en combinación con paclitaxel a sujetos con cáncer de mama metastásico cuyos tumores sobreexpresan la proteína HER2 y que no han recibido quimioterapia para su enfermedad metastásica. En una variante, el compuesto se administra en una dosis inicial de entre 0,1 y 10 mg/kg en una infusión intravenosa continua de 45 a 120 minutos. En una variante adicional, el compuesto se administra en una dosis de 4 mg/kg en una infusión de 90 minutos. En una variante, se administra al sujeto una dosis de mantenimiento semanal a una dosis de 2 mg/kg en una infusión de 30 minutos. En una variante, el compuesto se administra en una dosis de 0,5 a 1,5 mg/kg en una infusión de 90 minutos. En una variante, se administra al sujeto una dosis de mantenimiento semanal a una dosis de 0,5-1,0 mg/kg en una infusión de 30 minutos. En una variante, el compuesto se administra en una dosis de 0,04 a 0,5 mg/kg en una infusión de 90 minutos. En una variante, el compuesto se administra en una dosis de entre 0,001 y 10 mg/kg en una infusión de 90 minutos.
Las composiciones que comprenden un compuesto que comprende un tramo de aminoácidos consecutivos que comprende aminoácidos consecutivos que tienen la secuencia de rituximab (por ejemplo, Rituxin) pueden comprender cloruro de sodio, citrato de sodio dihidratado, polisorbato 80 y agua para inyección (USP), o equivalentes del mismo. En una variante, el pH de la composición se ajusta a 6,5. La composición también se puede liofilizar, a la que se puede añadir agua para su reconstitución. En una variante, el compuesto se administra a un sujeto para el tratamiento de linfoma no Hodgkin de células B recidivante o refractario de bajo grado o folicular, positivo para CD20. En una variante, el compuesto se administra a una dosis de 250-500 mg/m2 en infusión IV una vez a la semana durante 4 u 8 dosis. En una variante adicional, el compuesto se administra en infusión IV de 375 mg/m2 una vez a la semana durante 4 u 8 dosis. En una variante, el compuesto se administra a una dosis de infusión intravenosa de 150-250 mg/m2 una vez a la semana durante 4 u 8 dosis. En una variante, el compuesto se administra a una dosis de infusión IV de 1,5 a 5 mg/m2 una vez a la semana durante 4 u 8 dosis. En una variante, el compuesto se administra a una dosis de infusión IV entre 1,0 y 500 mg/m2 una vez a la semana durante 4 u 8 dosis.
Las composiciones que comprenden un compuesto que comprende un tramo de aminoácidos consecutivos que comprende aminoácidos consecutivos que tienen la secuencia de efalizumab (por ejemplo, Raptiva) pueden comprender sacarosa, clorhidrato de L-Histidina monohidratado, L-Histidina y polisorbato 20. Tal composición puede ser diluida en una forma de dosificación apropiada con agua estéril no USP, o agua estéril para inyección, USP, o equivalentes de la misma. La composición también se puede liofilizar, a la que se puede añadir agua para su reconstitución. En una variante, el compuesto se administra a un sujeto para el tratamiento de la psoriasis crónica en placas de moderada a grave. Tal sujeto puede ser candidato para terapia sistémica o fototerapia. En una variante, el compuesto se administra en una dosis de acondicionamiento subcutánea (SC) única de 0,1-1,1 mg/kg seguida de dosis SC semanales de 0,8-1,5 mg/kg (la dosis única máxima no debe superar un total de 250 mg). En una variante adicional, el compuesto se administra en una única dosis de acondicionamiento SC de 0,7 mg/kg seguida de dosis SC semanales de 1 mg/kg (la dosis única máxima no debe superar un total de 200 mg). En una variante, el compuesto se administra en una única dosis de acondicionamiento subcutánea (SC) de 0,001-1,0 mg/kg seguida de dosis SC semanales de 0,008-0,015 mg/kg.
Las composiciones que comprenden un compuesto que comprende un tramo de aminoácidos consecutivos que comprende aminoácidos consecutivos que tienen la secuencia de omalizumab (por ejemplo, Xolair) pueden comprender sacarosa, Clorhidrato de L-Histidina monohidratado, L-Histidina y polisorbato 20. Tal composición puede liofilizarse. En una variante, la composición se diluye a una forma de dosificación apropiada con agua estéril para inyección, USP o equivalentes de la misma. En una variante, el compuesto se administra a un sujeto para el tratamiento de asma persistente de moderada a grave. En otra variante, el compuesto se administra a un sujeto que tiene una prueba cutánea positiva o reactividad in vitro a un aeroalergeno perenne y cuyos síntomas no se controlan adecuadamente con corticosteroides inhalados para disminuir la incidencia de exacerbaciones del asma. En una variante, el compuesto se administra a una dosis de 100 a 400 mg por vía subcutánea cada 2 o 4 semanas. En una variante adicional, el compuesto se administra a una dosis de 150 a 375 mg SC cada 2 o 4 semanas. En una variante, el compuesto se administra a una dosis de 25 a 150 mg por vía subcutánea cada 2 o 4 semanas. En una variante, el compuesto se administra a una dosis de 1 a 4 mg por vía subcutánea cada 2 o 4 semanas.
Las composiciones que comprenden un compuesto que comprende un tramo de aminoácidos consecutivos que comprende aminoácidos consecutivos que tienen la secuencia de etanercept (por ejemplo, Enbrel) pueden comprender manitol, sacarosa y trometamina. En una variante, la composición se presenta en forma de liofilizado. En una variante, la composición se reconstituye, por ejemplo, con agua bacteriostática estéril para inyección (BWFI), USP (que contiene alcohol bencílico al 0,9%). En una variante, el compuesto se administra a un sujeto para reducir los signos y síntomas, inducir una respuesta clínica importante, inhibir la progresión del daño estructural y mejorar la función física en sujetos con artritis reumatoide activa de moderada a grave. El compuesto puede iniciarse en combinación con metotrexato (MTX) o usarse solo. En una variante, el compuesto se administra a un sujeto para reducir los signos y síntomas de la artritis reumatoide juvenil de curso poliarticular activa de moderada a grave en sujetos que han tenido una respuesta inadecuada a uno o más DMARD. En una variante, el compuesto se administra a un sujeto para reducir los signos y síntomas, inhibir la progresión del daño estructural de la artritis activa y mejorar la función física en sujetos con artritis psoriásica. En una variante, el compuesto se administra a un sujeto para reducir los signos y síntomas en sujetos con espondilitis anquilosante activa. En una variante, el compuesto se administra a un sujeto para el tratamiento de la psoriasis en placas crónica de moderada a grave. En una variante en la que el sujeto tiene artritis reumatoide, artritis psoriásica o espondilitis anquilosante, el compuesto se administra a razón de 25-75 mg por semana administrado como una o más inyecciones subcutáneas (SC). En una variante adicional, el compuesto se administra a razón de 50 mg por semana en una única inyección subcutánea. En una variante en la que el sujeto tiene psoriasis en placas, el compuesto se administra a razón de 25-75 mg dos veces por semana o con 4 días de diferencia durante 3 meses, seguido de una reducción a una dosis de mantenimiento de 25-75 mg por semana. En una variante adicional, el compuesto se administra a una dosis de 50 mg dos veces por semana o con 4 días de diferencia durante 3 meses, seguido de una reducción a una dosis de mantenimiento de 50 mg por semana. En una variante, la dosis es entre 2x y 100x menor que las dosis indicadas en el presente documento. En una variante en la que el sujeto tiene JRA de curso poliarticular activo, el compuesto puede administrarse a una dosis de 0,2 a 1,2 mg/kg por semana (hasta un máximo de 75 mg por semana). En una variante adicional, el compuesto se administra a una dosis de 0,8 mg/kg por semana (hasta un máximo de 50 mg por semana). En algunas variantes, la dosis es entre 2 veces y 100 veces menor que las dosis indicadas anteriormente.
Las composiciones que comprenden un compuesto que comprende un tramo de aminoácidos consecutivos que comprende aminoácidos consecutivos que tienen la secuencia de infliximab (por ejemplo, Remicade) pueden comprender sacarosa, polisorbato 80, fosfato de sodio monobásico, monohidratado y fosfato de sodio dibásico, dihidratado. Los conservantes no están presentes en una variante. En una variante, la composición se presenta en forma de liofilizado. En una variante, la composición se reconstituye con, por ejemplo, agua para inyección (BWFI), USP. En una variante, el pH de la composición es 7,2 o aproximadamente 7,2. En una variante, el compuesto se administra a un sujeto con artritis reumatoide en una dosis de 2-4 mg/kg administrada como infusión intravenosa seguida de dosis similares adicionales a las 2 y 6 semanas después de la primera infusión y luego cada 8 semanas. En una variante adicional, el compuesto se administra en una dosis de 3 mg/kg administrada como una infusión intravenosa seguida de dosis similares adicionales a las 2 y 6 semanas después de la primera infusión y luego cada 8 semanas. En una variante, la dosis se ajusta hasta 10 mg/kg o se trata con una frecuencia de hasta 4 semanas. En una variante, el compuesto se administra en combinación con metotrexato. En una variante, el compuesto se administra a un sujeto con enfermedad de Crohn o enfermedad de Crohn fistulizante a una dosis de 2-7 mg/kg administrada como régimen de inducción a las 0, 2 y 6 semanas seguido de un régimen de mantenimiento de 4-6 mg/kg cada 8 semanas a partir de entonces para el tratamiento de la enfermedad de Crohn activa de moderada a grave o enfermedad fistulizante. En una variante adicional, el compuesto se administra a una dosis de 5 mg/kg administrada como un régimen de inducción a las 0, 2 y 6 semanas seguido de un régimen de mantenimiento de 5 mg/kg cada 8 semanas a partir de entonces para el tratamiento de la enfermedad de Crohn activa de moderada a grave o enfermedad fistulizante. En una variante, la dosis se ajusta hasta 10 mg/kg. En una variante, el compuesto se administra a un sujeto con espondilitis anquilosante a una dosis de 2-7 mg/kg administrada como una infusión intravenosa seguida de dosis similares adicionales a las 2 y 6 semanas después de la primera infusión, y luego cada 6 semanas a partir de entonces. En una variante adicional, el compuesto se administra a una dosis de 5 mg/kg administrada como una infusión intravenosa seguida de dosis similares adicionales a las 2 y 6 semanas después de la primera infusión, luego cada 6 semanas a partir de entonces. En una variante, el compuesto se administra a un sujeto con artritis psoriásica a una dosis de 2-7 mg/kg administrada como una infusión intravenosa seguida de dosis similares adicionales a las 2 y 6 semanas después de la primera infusión y luego cada 8 semanas. En una variante adicional, el compuesto se administra a una dosis de 5 mg/kg administrada como una infusión intravenosa seguida de dosis similares adicionales a las 2 y 6 semanas después de la primera infusión y luego cada 8 semanas. En una variante, el compuesto se administra con metotrexato. En una variante, el compuesto se administra a un sujeto con colitis ulcerosa a una dosis de 2-7 mg/kg administrada como régimen de inducción a las 0, 2 y 6 semanas seguido de un régimen de mantenimiento de 2-7 mg/kg cada 8 semanas a partir de entonces para el tratamiento de la colitis ulcerosa activa de moderada a grave. En una variante adicional, el compuesto se administra a un sujeto con colitis ulcerosa a una dosis de 5 mg/kg administrada como régimen de inducción a las 0, 2 y 6 semanas seguido de un régimen de mantenimiento de 5 mg/kg cada 8 semanas a partir de entonces. En algunas variantes, la dosis es entre 2 veces y 100 veces menor que las dosis indicadas anteriormente para el tratamiento de enfermedades individuales.
Las composiciones que comprenden un compuesto que comprende un tramo de aminoácidos consecutivos que comprende aminoácidos consecutivos que tienen la secuencia de cetuximab (por ejemplo, Erbitux) pueden comprender una composición sin conservantes que incluye cloruro de sodio, fosfato de sodio dibásico heptahidratado, fosfato de sodio monobásico monohidratado. En una variante, la composición se presenta en forma de liofilizado. En una variante, la composición se reconstituye con, por ejemplo, agua para inyección, USP. En una variante, el pH de la composición está en el intervalo de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 7,4. En una variante, el compuesto se administra a un sujeto para el tratamiento de carcinoma colorrectal metastásico que expresa EGFR. En otra variante, el compuesto se usa en combinación con irinotecano para el tratamiento en pacientes que son refractarios a la quimioterapia basada en irinotecano. En una variante, el compuesto se administra a una dosis de 300-500 mg/m2 como dosis de carga inicial (primera infusión) administrada como una infusión intravenosa de 120 minutos (velocidad máxima de infusión 5 ml/min). En una variante adicional, el compuesto se administra a una dosis de 400 mg/m2 como dosis de carga inicial (primera infusión) administrada como una infusión intravenosa de 120 minutos (velocidad máxima de infusión 5 ml/min). En una variante, la dosis de mantenimiento semanal (todas las demás infusiones) es de 200­ 300 mg/m2 infundidos durante 60 minutos (velocidad máxima de infusión 5 ml/min). En una variante adicional, la dosis de mantenimiento semanal (todas las demás infusiones) es de 250 mg/m2 infundidos durante 60 minutos (velocidad máxima de infusión 5 ml/min). En algunas variantes, la dosis es entre 2 veces y 100 veces menor que las dosis indicadas anteriormente.
Las composiciones que comprenden un compuesto que comprende un tramo de aminoácidos consecutivos que comprende aminoácidos consecutivos que tienen la secuencia de abciximab (por ejemplo, Reopro) pueden comprender una composición sin conservantes que incluye fosfato de sodio, cloruro de sodio y polisorbato 80. En una variante, la composición está en forma de liofilizado. En una variante, la composición se diluye o se reconstituye con, por ejemplo, agua para inyección, USP. En una variante, el pH de la composición es 7,2 o aproximadamente 7,2. En una variante, la composición se utiliza como complemento de la intervención coronaria percutánea (PCI). En tal uso, las composiciones se pueden administrar como un bolo intravenoso de 0,15 a 0,35 mg/kg 10-60 minutos antes del inicio de la PCI. En otra variante, la dosis es de 0,2 mg/kg. En una variante, el bolo va seguido de una infusión intravenosa continua de 0,1 a 0,15 g/kg/min durante un máximo de 12 horas. En otra variante, la dosis es de 0,125 g/kg/min durante un máximo de 12 horas. En una variante, la composición se utiliza como complemento de la intervención coronaria percutánea (PCI) en sujetos que padecen angina inestable. En una variante de dicho uso, las composiciones se pueden administrar como un bolo intravenoso a razón de 0,1 a 0,4 mg/kg antes del inicio de la PCI, seguido de una infusión intravenosa continua de 5 a 15 g/min durante un máximo de 24 horas, concluyendo 1 hora después de la PCI. En una variante adicional, la composición se administra como un bolo intravenoso a razón de 0,25 mg/kg antes del inicio de la PCI seguido de una infusión intravenosa continua de 10 g/min durante hasta 24 horas, concluyendo 1 hora después de la PCI. En algunas variantes, la dosis es entre 2 veces y 100 veces menor que las dosis indicadas anteriormente.
En cada una de las variantes de las composiciones descritas en el presente documento, las composiciones, cuando están en forma de liofilizado, pueden reconstituirse con, por ejemplo, soluciones acuosas estériles, agua estéril, agua estéril para inyecciones (USP), agua bacteriostática estéril para Inyecciones (USP) y equivalentes de la misma conocidos por los expertos en la técnica.
Se entiende que en la administración de cualquiera de los presentes compuestos, el compuesto se puede administrar de forma aislada, en un vehículo, como parte de una composición farmacéutica o en cualquier vehículo apropiado.
Dosificación
Se entiende que cuando se indica en este documento un intervalo de dosificación, por ejemplo, 1-10 mg/kg por semana, la presente descripción también contempla cada dosis entera, y la décima parte de la misma, entre los límites superior e inferior. En el caso del ejemplo dado, por lo tanto, la divulgación contempla 1,0; 1,1; 1,2; 1,3; 1,4; 1,5; 1,6; 1,7; 1,8; 1,9; 2,0; 2,1; 2,2; 2,3; 2,4 etc., mg/kg hasta 10 mg /kg.
En variantes, los compuestos divulgados en el presente documento pueden administrarse como una dosis única o pueden administrarse como dosis múltiples.
En general, la dosificación diaria para tratar un trastorno o afección de acuerdo con los métodos descritos anteriormente generalmente variará de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 10,0 mg/kg de peso corporal del sujeto a tratar.
Un médico con experiencia ordinaria puede realizar variaciones basadas en los intervalos de dosificación antes mencionados teniendo en cuenta consideraciones conocidas tales como el peso, la edad y la condición de la persona que está siendo tratada, la gravedad de la aflicción y la ruta particular de la administración elegida.
También se espera que los compuestos divulgados efectúen una unión cooperativa con las consiguientes consecuencias sobre las dosis efectivas requeridas.
Kits
También se divulgan en este documento kits que comprenden los compuestos divulgados en este documento y las composiciones farmacéuticas que comprenden estos compuestos. Un kit puede incluir, además del compuesto o composición farmacéutica, agentes de diagnóstico o terapéuticos. Un kit también puede incluir instrucciones para su uso en un método de diagnóstico o terapéutico. En una variante de diagnóstico, el kit incluye el compuesto o una composición farmacéutica del mismo y un agente de diagnóstico. En una variante terapéutica, el kit incluye el anticuerpo o una composición farmacéutica del mismo y uno o más agentes terapéuticos, tales como un agente antineoplásico, agente antitumoral o agente quimioterapéutico adicional.
Sujetos
En algunas variantes, el sujeto es un ser humano. En una variante, el sujeto tiene 18 años o más. En otra variante, el sujeto tiene menos de 18 años.
Esta invención se entenderá mejor con referencia a los detalles experimentales que siguen, pero los expertos en la técnica apreciarán fácilmente que los ejemplos específicos detallados son solo ilustrativos de la invención como se describe más completamente en las reivindicaciones que siguen a continuación.
Simetroadhesinas
Esta memoria descriptiva de patente describe dispositivos genéticos que son dispositivos que comprenden tramos funcionales de aminoácidos consecutivos unidos de una manera novedosa. Hasta ahora, las proteínas se han diseñado genéticamente para crear nuevas funciones en virtud de que adoptan una nueva estructura o conformación fija. En contraste con tales proteínas previamente manipuladas genéticamente, los dispositivos genéticos divulgados en este documento comprenden dos o más dominios proteicos distinguibles que están conectados por enlaces químicos novedosos de una manera que permite que se produzca un movimiento relativo entre los dominios. El movimiento relativo entre dominios de proteínas constituye las partes móviles de los dispositivos genéticos y el trabajo útil que pueden realizar de ese modo. La energía de entrada para este trabajo es proporcionada por las energías cinética y rotacional intrínsecas a los dominios proteicos mismos, así como la energía de interacciones mecánicas entre los dominios proteicos y moléculas de solvente, y similares.
Esta divulgación describe "simetroadhesinas", una clase específica de dispositivos genéticos. Las simetroadhesinas comprenden dos o más adhesinas unidas químicamente (dominios de unión a polipéptidos que se pliegan independientemente o tramos de aminoácidos consecutivos). Estas adhesinas unidas químicamente son capaces de movimiento relativo entre sí, dando como resultado la formación de dos o más dominios de unión orientados simétricamente útiles para unir ligandos diméricos, ligandos triméricos, ligandos tetraméricos y similares, con una afinidad muy aumentada. Las proteínas híbridas simetroadhesina-Fc son una realización particularmente útil de los dispositivos genéticos.
La importancia de la simetría en la eficacia de las proteínas terapéuticas se debe al hecho de que la mayoría de las dianas de enfermedades de las proteínas muestran por sí mismas una estructura simétrica de orden superior. Por ejemplo, si la diana de la enfermedad consta de dos proteínas, se dice que es un dímero, si consta de tres proteínas, se dice que es un trímero, y así sucesivamente. Si una proteína terapéutica se une a la proteína diana de la enfermedad solo de una en una, entonces la fuerza de la unión es típicamente del orden del intervalo nano-molar. En este nivel ordinario de unión, que es típico de las proteínas terapéuticas actuales, se hace necesario inundar el cuerpo con un exceso enorme y derrochador de la proteína terapéutica en relación con la proteína diana de la enfermedad (una base de un millón a uno).
Cada simetroadhesina se diseña usando un conjunto simple de reglas que convierte a las proteínas en agentes terapéuticos más útiles haciéndolas más simétricas. Para una simetroadhesina diseñada para unirse a la proteína diana de la enfermedad de dos en dos, la fuerza de unión será del orden del intervalo nano H nano-molar. La unión cooperativa permite un nivel extraordinario de unión. A este extraordinario nivel de unión, solo es necesario administrar mucha menos proteína terapéutica en relación con la proteína diana de la enfermedad (una a una).
Química del enlace peptídico
Todas las proteínas consisten en una o más cadenas polipeptídicas, tramos de aminoácidos consecutivos, cada uno de los cuales está unido al aminoácido precedente mediante un enlace peptídico. Debido a la resonancia entre la forma de enlace simple (-C-N-) y la forma de enlace doble (-C=N-) que se produce en las amidas, el enlace peptídico tiene un grado significativo de carácter de enlace doble (-C=N-Ca-C=N-). Como consecuencia, los enlaces peptídicos en las proteínas son aproximadamente planos. Aunque los enlaces N-Ca y Ca-C contiguos son relativamente libres de rotar, la rigidez del enlace peptídico reduce los grados de libertad de la cadena polipeptídica plegada hasta el punto en que se comporta como un único objeto estático.
Considere un primer tramo de N aminoácidos consecutivos y un segundo tramo de P aminoácidos consecutivos, AA1 -[]-AAn y AA1-[]-AAp, con el enlace peptídico mostrado en 1:
Ca(i)-C=N-[]-C=N-Ca(N) y Ca(i)-C=N-[]-C=N-Ca (P) 1
La unión del primer tramo de aminoácidos consecutivos en su terminal N por un nuevo enlace peptídico al terminal C del segundo tramo de aminoácidos consecutivos formará un polipéptido quimérico, AAi-[]-AAn-AAn+i-[]-AAn+p, con el enlace peptídico mostrado en 2:
Ca(1)-C=N-[]-C=N-Ca(N)-C=N-Ca(N+1)-C=N-[]-C=N-Ca(N+P) 2
El polipéptido quimérico, como cualquiera de sus progenitores, es un tramo único de aminoácidos consecutivos, cada uno de los cuales también está unido al aminoácido precedente mediante un enlace peptídico. Por lo tanto, la cadena polipeptídica quimérica plegada también se comportará generalmente como un objeto estático único.
En la presente invención se describen nuevas moléculas similares a proteínas, denominadas en el presente documento dispositivos genéticos, que, al igual que los dispositivos mecánicos, son objetos dinámicos con dos o más partes móviles que están interconectadas de manera que permitan un movimiento relativo. Cada parte, o dominio, en un dispositivo genético es un tramo de aminoácidos consecutivos, y cada interconexión se realiza mediante un enlace no peptídico que une un extremo predefinido de cada tramo de aminoácidos consecutivos. Preferiblemente, los dominios en un dispositivo genético son dominios de unión. Tres tipos distintos de dispositivos genéticos se distinguen por la topología de sus interconexiones como se muestra en 3, 4 y 5:
Ca(1)-C=N-[]-C=N-Ca(N)-X c -X n -Ca(N+1)-C=N-[]-C=N-Ca(N+P) 3
Ca(1)-C=N-[]-C=N-Ca(N)-X c -X c -Ca(P)-N=C-[]-N=C-Ca(1) 4
Ca(N)-N=C-[]-N=C-Ca(1)-X n -X n -Ca(1)-C=N-[]-C=N-Ca(P) 5
El dispositivo genético con dos dominios de unión idénticos que están conectados en distintos extremos (6) tiene una configuración asimétrica,
Ca(1)-C=N-[]-C=N-Ca(N)-X c -X N -Ca(N+1)-C=N-[]-C=N-Ca(2N) 6
El dispositivo genético con dos dominios de unión idénticos que están conectados en terminales idénticos (7 y 8) tiene una configuración con simetría de puntos,
Ca(1)-C=N-[]-C=N-Ca(N)-X c -X c -Ca(N)-N=C-[]-N=C-Ca(1) 7
Ca(N)-N=C-[]-N=C-Ca(1)-X n -X n -Ca(1)-C=N-[]-C=N-Ca(N) 8
Los dispositivos genéticos mostrados en 7 y 8 se denominan en este documento hemisimetroadhesinas. Aunque las hemisimetroadhesinas tienen estructuras con simetría puntual, no son capaces de rotar ambos dominios de unión de forma independiente y, por lo tanto, generalmente no pueden unirse simétricamente a más de un sitio de unión en una diana simétrica.
También se divulgan moléculas similares a proteínas capaces de unirse simétricamente a dos o más sitios de unión en una diana simétrica (es decir, cooperativamente). Los dispositivos genéticos que son capaces de unir dianas simétricas simétricamente se denominan en este documento simetroadhesinas. Al igual que un cuerpo humano que agarra un objeto de gran tamaño pero simétrico (por ejemplo, un balón medicinal) con dos manos en lugar de una, la capacidad de las simetroadhesinas para unirse a dianas simétricas es generalmente mucho mayor que las proteínas.
Subtipos de simetroadhesinas
Las Tablas 2-11 exponen varias realizaciones no limitantes de diferentes simetroadhesinas. Por ejemplo, la Tabla 2, que describe simetroadhesinas CD4, muestra en la línea superior la configuración de una hemisimetroadhesina de CD4, es decir, un dominio de CD4 con un extremo X del terminal C, por ejemplo, un tramo de aminoácidos consecutivos que es un dominio de CD4 con un residuo de cisteína o selenocisteína del terminal C unido a través de un enlace no peptídico (por ejemplo, un enlace disulfuro cisteína-cisteína o un enlace diselenuro selenocisteínaselenocisteína) a un segundo tramo de aminoácidos consecutivos que es un dominio de CD4 con un residuo de cisteína o selenocisteína del terminal C unido a través de un enlace no peptídico, genéricamente descrito como [CD4-Xc-Xc-CD4]. Un dímero de la hemisimetroadhesina de CD4 y una hemisimetroadhesina de Fc para formar una inmunosimetroadhesina se expone en la segunda fila de la Tabla 2, por ejemplo, descrita como [CD4-Xc-Sn-Fc]2. En cada una de las tablas, Xc, representa un extremo X del terminal C; Xn, un extremo X del terminal N; Sn, un residuo de cisteína del terminal N
Tabla 2
Simetroadhesinas de CD4
Tramos de aminoácidos consecutivos Clase Configuración de la simetroadhesina
CD4-Xc hemi- [CD4-Xc-Xc-CD4]
CD4-Xc Sn-Fc inmuno [CD4-Xc-Sn-Fc]2
CD4-Xc Xn-Fc inmuno [CD4-Xc-Xn-Fc]2
CD4-Xc Fc-Xc inmuno [Fc-Xc-Xc-CD4]2
CD4-Xc Sn-Fc-Xc bi- [CD4-Xc-Sn-Fc-Xc-Xc-CD4]2
CD4-Xc Xn-Fc-Xc bi- [CD4-Xc-Xn-Fc-Xc-Xc-CD4]2
Tabla 3
Hemisimetroadhesinas de TNR
Tramos de aminoácidos consecutivos # Configuraciones de Simetroadhesina
TNR1-Xc 1 [TNR-i-Xc-Xc-TNR-i]
TNR2-Xc 1 [TNR2-Xc-Xc-TNR2]
TNRFab-Xc 1 [TNRFab-Xc-Xc-TNRFab]
TNR1-Xc TNR2-Xc 3 [(TNR1/2)-Xc-Xc-(TNR1/2)]
TNR1-Xc TNRFab-Xc 3 [(TNR1/Fab)-Xc-Xc-(TNR1/Fab)]
TNR2-Xc TNRFab-Xc 3 [(TNR2/Fab)-Xc-Xc-(TNR2/Fab)]
TNR1-Xc TNR2-Xc TNRFab-Xc 6 [(TNR1/2/Fab)-Xc-Xc-(TNR1/2/Fab)]
Tabla 4
Inmunosimetroadhesinas de TNR
Tramos de aminoácidos consecutivos # Configuraciones de simetroadhesina
TNR1-Xc Sn-Fc 1 [TNR1-Xc-Sn-Fc]2
TNR1-Xc Xn-Fc 1 [TNR1-Xc-Xn-Fc]2
TNR1-Xc Fc-Xc 1 [Fc-Xc-Xc-TNR1]2
TNR2-Xc Sn-Fc 1 [TNR2-Xc-Sn-Fc]2
TNR2-Xc Xn-Fc 1 [TNR2-Xc-Xn-Fc]2
TNR2-Xc Fc-Xc 1 [Fc-Xc-Xc-TNR2]2
TNRFab-Xc Sn-Fc 1 [TNRFab-Xc-Sn-Fc]2
Inmunosimetroadhesinas de TNR
Tramos de aminoácidos consecutivos # Configuraciones de simetroadhesina TNRFab-Xc Xn-Fc 1 [TNRFab-Xc-Xn-Fc]2
TNRFab-Xc Fc-Xc 1 [Fc-Xc-Xc-TNRFab]2
TNR1-Xc TNR2-Xc Sn-Fc 3 [(TNR1/2)-Xc-Sn-Fc]2
TNR1-Xc TNR2-Xc Xn-Fc 3 [(TNR1/2)-Xc-Xn-Fc]2
TNR1-Xc TNR2-Xc Fc-Xc 3 [Fc-Xc-Xc-(TNR1/2)]2
TNR1-Xc TNRFab-Xc Sn-Fc 3 [(TNR1/Fab)-Xc-Sn-Fc]2
TNR1-Xc TNRFab-Xc Xn-Fc 3 [(TNR1/Fab)-Xc-Xn-Fc]2
TNR1-Xc TNRFab-Xc Fc-Xc 3 [Fc-Xc-Xc-(TNR1/Fab)]2
TNR2-Xc TNRFab-Xc Sn-Fc 3 [(TNR2/Fab)-Xc-Sn-Fc]2
TNR2-Xc TNRFab-Xc Xn-Fc 3 [(TNR2/Fab)-Xc-Xn-Fc]2
TNR2-Xc TNRFab-Xc Fc-Xc 3 [Fc-Xc-Xc-(TNR2/Fab)]2
TNR1-Xc TNR2-Xc TNRFab-Xc Sn-Fc 6 [(TNR1/2/Fab)-Xc-Sn-Fc]2
TNR1-Xc TNR2-Xc TNRFab-Xc Xn-Fc 6 [(TNR1/2/Fab)-Xc-Xn-Fc]2
TNR1-Xc TNR2-Xc TNRFab-Xc Fc-Xc 6 [Fc-Xc-Xc-(TNR1/2/Fab)]2
Tabla 5
Bisimetroadhesinas de TNR
Tramos de aminoácidos consecutivos # Configuraciones de simetroadhesina TNR1-Xc Sn-Fc-Xc 1 [TNR1 -Xc-Sn- F c-Xc-Xc-T NR1]2 TNR1-Xc Xn-Fc-Xc 1 [TNR1-Xc-Xn-Fc-Xc-Xc-TNR1]2 TNR2-Xc Sn-Fc-Xc 1 [TNR2-Xc-Sn-Fc-Xc-Xc-TNR2]2 TNR2-Xc Xn-Fc-Xc 1 [TNR2-Xc-Xn-Fc-Xc-Xc-TNR2]2 TNRFab-Xc Sn-Fc-Xc 1 [TNRFab-Xc-Sn-Fc-Xc-Xc-TNRFab]2 TNRFab-Xc Xn-Fc-Xc 1 [TNRFab-Xc-Xc-Fc-Xc-Xc-TNRFab]2
TNR1-Xc TNR2-Xc Sn-Fc-Xc 12 [ (TNR1/2) -Xc-Sn-Fc-Xc-Xc-(TNR1/2)]2 TNR1-Xc TNR2-Xc Xn-Fc-Xc 12 [ (TNR1/2)-Xc-Xn-Fc-Xc-Xc-(TNR1/2)]2 TNR1-Xc TNRFab-Xc Sn-Fc-Xc 12 [(TNR1/Fab)-Xc-Sn-Fc-Xc-Xc-(TNR1/Fab)]2 TNR1-Xc TNRFab-Xc Xn-Fc-Xc 12 [(TNR1/Fab)-Xc-Xn-Fc-Xc-Xc-(TNR1/Fab) ] 2 TNR2-Xc TNRFab-Xc Sn-Fc-Xc 12 [ (TNR2/Fab)-Xc-Sn-Fc-Xc-Xc-(TNR2/Fab)]2 TNR2-Xc TNRFab-Xc Xn-Fc-Xc 12 [ (TNR2/Fab)-Xc-Xn-Fc-Xc-Xc-(TNR2/Fab)]2
TNR1-Xc TNR2-Xc TNRFab-Xc Sn-Fc-Xc 63 [(TNR1/2/Fab)-Xc-Xn-Fc-Xc-Xc-(TNR1/2/Fab)]2 TNR1-Xc TNR2-Xc TNRFab-Xc Sn-Fc-Xc 63 [(TNR1/2/Fab)-Xc-Xn-Fc-Xc-Xc-(TNR1/2/Fab)]2 Tabla 6
Hemisimetroadhesinas de VGFR
Tramos de aminoácidos consecutivos # Configuraciones de Simetroadhesina VGFRi-Xc 1 [VGFRi-Xc-Xc-VGFRi]
VGFR2-Xc 1 [VGFR2-Xc-Xc-VGFR2 ]
VGFRa-Xc 1 [VGF Ra-Xc-Xc-VGFRa ]
VGFRi-Xc VGFR2-Xc a [ (VGFRi/2)-Xc-Xc-(VGFRi/2)] VGFRi-Xc VGFRa-Xc a [ (VGFRi/a)-Xc-Xc-(VGFRi/a)] VGFR2-Xc VGFRa-Xc a [ (VGFR2/a)-Xc-Xc-(VGFR2/a)]
VGFRi-Xc VGFR2-Xc VGFRa-Xc 6 [ (VGFRi/2/a) -Xc-Xc-(VGFRi/2/a)]
Tabla 7
Inmunosimetroadhesinas de VGFR
Tramos de aminoácidos consecutivos # Configuraciones de Simetroadhesina VGFRi-Xc Sn-Fc 1 [VGFRi-Xc-Sn-Fc]2
VGFRi-Xc Xn-Fc 1 [VGFRi-Xc-Xn-Fc]2
VGFRi-Xc Fc-Xc 1 [Fc-Xc-Xc-VGFRi]2
VGFR2-Xc Sn-Fc 1 [VGFR2-Xc-Sn-Fc]2
VGFR2-Xc Xn-Fc 1 [VGFR2-Xc-Xn-Fc]2
VGFR2-Xc Fc-Xc 1 [Fc-Xc-Xc-VGFR2]2
VGFRa-Xc Sn-Fc 1 [VGFRa-Xc-Sn-Fc]2
VGFRa-Xc Xn-Fc 1 [VGFRa-Xc-Xn-Fc]2
VGFRa-Xc Fc-Xc 1 [Fc-Xc-Xc-VGFRa]2
VGFRi-Xc VGFR2-Xc Sn-Fc a [ (VGFRi/2)-Xc-Sn-Fc]2 VGFRi-Xc VGFRa-Xc Xn-Fc a [ (VGFRi/2) -Xc-Xn-Fc]2 VGFRi-Xc VGFR2-Xc Fc-Xc a [Fc-Xc-Xc-(VGFRi/2) ]2
VGFRi-Xc VGFRa-Xc Sn-Fc a [(VGFRi/a)-Xc-Sn-Fc]2
VGFRi-Xc VGFRa-Xc Xn-Fc a [ (VGFRi/a)-Xc-Xn-Fc]2 VGFRi-Xc VGFRa-Xc Fc-Xc a [Fc-Xc-Xc-(VGFRi/a) ]2
VGFR2-Xc VGFRa-Xc Sn-Fc a [(VGFR2/a)-Xc-Sn-Fc]2
VGFR2-Xc VGFRa-Xc Xn-Fc a [(VGFR2/a) -Xc-Xn-Fc]2
VGFR2-Xc VGFRa-Xc Fc-Xc a [Fc-Xc-Xc-(VGFR2/a)] 2
VGFRi-Xc VGFR2-Xc VGFRa-Xc Sn-Fc 6 [(VGFRi/2/a) -Xc-Sn-Fc]2 VGFRi-Xc VGFR2-Xc VGFRa-Xc Xn-Fc 6 [(VGFRi/2/a) -Xc-Xn-Fc]2
Inmunosimetroadhesinas de VGFR
Tramos de aminoácidos consecutivos # Configuraciones de Simetroadhesina VGFRi-Xc VGFR2-Xc VGFRa-Xc Fc-Xc 6 [Fc-Xc-Xc-(VGFR1/2/a) ]2
Tabla 8
Bisimetroadhesinas de VGFR
Tramos de aminoácidos consecutivos # Configuraciones de simetroadhesina VGFR1-Xc Sn-Fc-Xc 1 [VGFR1-Xc-Sn-Fc-Xc-Xc-VGFR1]2 VGFR1-Xc Xn-Fc-Xc 1 [VGFR1 -Xc-Xn-Fc-Xc-Xc-VGFR1]2 VGFR2-Xc Sn-Fc-Xc 1 [VGFR2-Xc-Sn-Fc-Xc-Xc-VGFR2]2 VGFR2-Xc Xn-Fc-Xc 1 [VGFR2-Xc-Xn-Fc-Xc-Xc-VGFR2]2 VGFRa-Xc Sn-Fc-Xc 1 [VGFRa-Xc-Sn-Fc-Xc-Xc-VGFRa]2 VGFRa-Xc Xn-Fc-Xc 1 [VGFRa-Xc-Xn-Fc-Xc-Xc-VGFRa]2
VGFR1-Xc VGFR2-Xc Sn-Fc-Xc 12 [(VGFR1/2)-Xc-Sn-Fc-Xc-Xc-(VGFR1/2)]2 VGFR1-Xc VGFR2-Xc Xn-Fc-Xc 12 [(VGFR1/2)-Xc-Xn-Fc-Xc-Xc-(VGFR1/2)]2 VGFR1-Xc VGFRa-Xc Sn-Fc-Xc 12 [(VGFR1/a)-Xc-Sn-Fc-Xc-Xc-(VGFR1/a)]2 VGFR1-Xc VGFRa-Xc Xn-Fc-Xc 12 [(VGFR1/a)-Xc-Xn-Fc-Xc-Xc-(VGFR1/a)]2 VGFR2-Xc VGFRa-Xc Sn-Fc-Xc 12 [(VGFR2/a)-Xc-Sn-Fc-Xc-Xc-(VGFR2/a)]2 VGFR2-Xc VGFRa-Xc Xn-Fc-Xc 12 [(VGFR2/a)-Xc-Xn-Fc-Xc-Xc-(VGFR2/a)]2
VGFRi-Xc VGFR2-Xc VGFRa-Xc Sn-Fc-Xc 6a [(VGFR1/2/a)-Xc-Xn-Fc-Xc-Xc-(VGFR1/2/a) ]2 VGFRi-Xc VGFR2-Xc VGFRa-Xc Sn-Fc-Xc 6a [(VGFR1/2/a)-Xc-Xn-Fc-Xc-Xc-(VGFR1/2/a)]2
Tabla 9
Hemisimetroadhesinas de ErbB
Tramos de aminoácidos consecutivos # Configuraciones de simetroadhesina ErbBi-Xc 1 [ErbB1-Xc-Xc-ErbB1]
ErbB2-Xc 1 [ErbB2-Xc-Xc-ErbB2]
ErbBa-Xc 1 [ErbBa-Xc-Xc-ErbBa]
ErbB4-Xc 1 [ErbB4-Xc-Xc-ErbB4]
ErbBi-Xc ErbB2-Xc a [(ErbB1/2)-Xc-Xc-(ErbB1/2)]
ErbBi-Xc ErbBa-Xc a [(ErbB1/a)-Xc-Xc-(ErbB1/a)]
ErbBi-Xc ErbB4-Xc a [(ErbB1/4)-Xc-Xc-(ErbB1/4)]
ErbB2-Xc ErbBa-Xc a [(ErbB2/a)-Xc-Xc-(ErbB^a)]
ErbB2-Xc ErbB4-Xc a [(ErbB2/4)-Xc-Xc-(ErbB^4)]
ErbBa-Xc ErbB4-Xc a [(ErbBa/4)-Xc-Xc-(ErbBa/4)]
ErbBi-Xc ErbB2-Xc ErbBa-Xc 6 [ (ErbB1/2/a) -Xc-Xc-(ErbB1/2/a)] ErbBi-Xc ErbB2-Xc ErbB4-Xc 6 [ (ErbB1/2/4) -Xc-Xc-(ErbB1/2/4)] ErbBi-Xc ErbBa-Xc ErbB4-Xc 6 [ (ErbB1/a/4) -Xc-Xc-(ErbB1/a/4)] ErbB2-Xc ErbBa-Xc ErbB4-Xc 6 [ (ErbB2/a/4) -Xc-Xc-(ErbB2/a/4)]
Hemisimetroadhesinas de ErbB
Tramos de aminoácidos consecutivos # Configuraciones de simetroadhesina ErbBi-Xc ErbB2-Xc ErbB3-Xc ErbB4-Xc 10 [ (ErbB1/2/3/4)-Xc-Xc-(ErbB1»3/4)]
Tabla 10
Inmunosimetroadhesinas de ErbB
Tramos de aminoácidos consecutivos # Configuraciones de simetroadhesina ErbB1-Xc Xn-Fc 1 [ErbB1-Xc-Xn-Fc]2
ErbB1-Xc Fc-Xc 1 [Fc-Xc-Xc-ErbB1]2
ErbB2-Xc Xn-Fc 1 [ErbB2-Xc-Xn-Fc]2
ErbB2-Xc Fc-Xc 1 [Fc-Xc-Xc-ErbB2]2
ErbB3-Xc Xn-Fc 1 [ErbB3-Xc-Xn-Fc]2
ErbB3-Xc Fc-Xc 1 [Fc-Xc-Xc-ErbB3]2
ErbB4-Xc Xn-Fc 1 [ErbB4-Xc-Xn-Fc]2
ErbB4-Xc Fc-Xc 1 [Fc-Xc-Xc-ErbB4]2
ErbB1-Xc ErbB2-Xc Xn-Fc 3 [(ErbB1/2)-Xc-Xn-Fc]2
[ErbB1-Xc ErbB2-Xc Fc-Xc 3 [Fc-Xc-Xc-(ErbB1/2)]2
ErbB1-Xc ErbB3-Xc Xn-Fc 3 [(ErbB1/3)-Xc-Xn-Fc]2
ErbB1-Xc ErbB3-Xc Fc-Xc 3 [Fc-Xc-Xc-(ErbB1/3)]2
ErbB1-Xc ErbB4-Xc Xn-Fc 3 [(ErbB1/4)-Xc-Xn-Fc]2
ErbB1-Xc ErbB4-Xc Fc-Xc 3 [Fc-Xc-Xc-(ErbB1/4)]2
ErbB2-Xc ErbB3-Xc Xn-Fc 3 [(ErbB2/3)-Xc-Xn-Fc]2
ErbB2-Xc ErbB3-Xc Fc-Xc 3 [Fc-Xc-Xc-(ErbB2/3)]2
ErbB2-Xc ErbB4-Xc Xn-Fc 3 [(ErbB2/4)-Xc-Xn-Fc]2
ErbB2-Xc ErbB4-Xc Fc-Xc 3 [Fc-Xc-Xc-(ErbB2/4)]2
ErbB3-Xc ErbB4-Xc Xn-Fc 3 [(ErbB3/4)-Xc-Xn-Fc]2
ErbB3-Xc ErbB4-Xc Fc-Xc 3 [Fc-Xc-Xc-(ErbB3/4)]2
ErbB1-Xc ErbB2-Xc ErbB3-Xc Xn-Fc 6 [ (ErbB1/2/3) -Xc-Xn-Fc]2
ErbB1-Xc ErbB2-Xc ErbB3-Xc Fc-Xc 6 [Fc-Xc-Xc-(ErbB1/^3)]2
ErbB1-Xc ErbB2-Xc ErbB4-Xc Xn-Fc 6 [(ErbB1/2/4) -Xc-Xn-Fc]2
ErbB1-Xc ErbB2-Xc ErbB4-Xc Fc-Xc 6 [Fc-Xc-Xc-(ErbB1/2M)]2
Inmunosimetroadhesinas de ErbB
Tramos de aminoácidos consecutivos # Configuraciones de simetroadhesina
ErbBi-Xc ErbB3-Xc ErbB4-Xc Xn-Fc 6 [ (ErbB1/3/4) -Xc-Xn-Fc]2
ErbBi-Xc ErbB3-Xc ErbB4-Xc Fc-Xc 6 [Fc-Xc-Xc-(ErbB1/3/4)]2
ErbB2-Xc ErbB3-Xc ErbB4-Xc Xn-Fc 6 [(ErbB2/3/4) -Xc-Xn-Fc]2
ErbB2-Xc ErbB3-Xc ErbB4-Xc Fc-Xc 6 [Fc-Xc-Xc-(ErbB2/3/4)]2
ErbB1-Xc ErbB2-Xc ErbB3-Xc ErbB4-Xc Xn-Fc 10 [(ErbB1/2/3/4) -Xc-Xn-Fc] 2
ErbB1-Xc ErbB2-Xc ErbB3-Xc ErbB4-Xc Fc-Xc 10 [ Fc-Xc-Xc-(ErbB1/^3/4) ]2
Tabla 11
Bisimetroadhesinas de ErbB
Tramos de aminoácidos consecutivos # Configuraciones de Simetroadhesina ErbB1-Xc Xn-Fc-Xc 1 [ErbB1-Xc-Xn-Fc-Xc-Xc-ErbB1]2
ErbB2-Xc Xn-Fc-Xc 1 [ErbB2-Xc-Xn-Fc-Xc-Xc-ErbB2]2
ErbB3-Xc Xn-Fc-Xc 1 [ErbB3-Xc-Xn-Fc-Xc-Xc-ErbB3]2
ErbB4-Xc Xn-Fc-Xc 1 [ErbB4-Xc-Xn-Fc-Xc-Xc-ErbB4]2
ErbB1-Xc ErbB2-Xc Xn-Fc-Xc 12 [ (ErbB1/2)-Xc-Xn-Fc-Xc-Xc-(ErbB1/2) ]2 ErbB1-Xc ErbB3-Xc Xn-Fc-Xc 12 [ (ErbB1/3)-Xc-Xn-Fc-Xc-Xc-(ErbB1/3)]2 ErbB1-Xc ErbB4-Xc Xn-Fc-Xc 12 [ (ErbB1/4)-Xc-Xn-Fc-Xc-Xc-(ErbB1/4)]2 ErbB2-Xc ErbB3-Xc Xn-Fc-Xc 12 [(ErbB2/3) -Xc-Xn-Fc-Xc-Xc-(ErbB2/3) ]2 ErbB2-Xc ErbB4-Xc Xn-Fc-Xc 12 [(ErbB2/4)-Xc-Xn-Fc-Xc-Xc-(ErbB2/4)]2
ErbB3-Xc ErbB4-Xc Xn-Fc-Xc 12 [(ErbB3/4) -Xc-Xn-Fc-Xc-Xc-(ErbB3/4) ]2 rbB1-Xc ErbB2-Xc ErbB3-Xc Xn-Fc-Xc 63 [(ErbB1/2/3)-Xc-Xn-Fc-Xc-Xc-(ErbB1/2/3)]2 rbB1-Xc ErbB2-Xc ErbB4-Xc Xn-Fc-Xc 63 [(ErbB1/2/4)-Xc-Xn-Fc-Xc-Xc-(ErbB1/2/4)]2 rbB1-Xc ErbB3-Xc ErbB4-Xc Xn-Fc-Xc 63 [(ErbB1/3/4)-Xc-Xn-Fc-Xc-Xc-(ErbB1/3/4)]2 rbB2-Xc ErbB3-Xc ErbB4-Xc Xn-Fc-Xc 63 [(ErbB2/3/4)-Xc-Xn-Fc-Xc-Xc-(ErbB2/3/4)]2
ErbB1-Xc ErbB2-Xc ErbB3-Xc ErbB4-Xc Xn-Fc-Xc [(ErbB1/2/3/4)-Xc-Xn-Fc-Xc-Xc-(ErbB1/2/3/4)]2
Tramos de aminoácidos consecutivos
Los ejemplos de tramos de aminoácidos consecutivos a los que se hace referencia en este documento incluyen, entre otros, aminoácidos consecutivos que incluyen dominios de unión tales como proteínas secretadas o transmembrana, dominios de unión intracelulares y anticuerpos (completos o porciones de los mismos) y versiones modificadas de los mismos. Los siguientes son algunos ejemplos no limitativos:
1) Inmunoglobulinas
Las inmunoglobulinas son moléculas que contienen cadenas polipeptídicas que se mantienen juntas mediante enlaces disulfuro intracatenarios, en los que al menos uno de los aminoácidos enlazados no es un residuo terminal, que típicamente tiene dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas. En cada cadena, un dominio (V) tiene una secuencia de aminoácidos variable dependiendo de la especificidad del anticuerpo de la molécula. Los otros dominios (C) tienen una secuencia bastante constante común entre moléculas de la misma clase. Los dominios están numerados en secuencia desde el extremo del terminal amino.
La superfamilia de genes de inmunoglobulina consta de moléculas con dominios de tipo inmunoglobulina. Los miembros de esta familia incluyen antígenos mayores de histocompatibilidad clase I y clase II, inmunoglobulinas, cadenas alfa, beta, gamma y delta del receptor de células T, CD1, c D2, CD4, CD8, CD28, las cadenas gamma, delta y épsilon de CD3, OX-2, Thy-1, las moléculas de adhesión celular intercelulares o neuronales (I-CAM o N-CAM), antígeno 3 asociado a la función de los linfocitos (LFA-3), proteína neurocitoplasmática (NCP-3), receptor de poli-Ig, glicoproteína asociada a mielina (MAG), receptor de IgE de alta afinidad, glucoproteína mayor de mielina periférica (Po), receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas, receptor del factor 1 estimulante de colonias, receptor de Fc de macrófagos, receptores gamma de Fc y antígeno carcinoembrionario.
Se sabe que se pueden sustituir dominios variables (incluidas regiones hipervariables) de una inmunoglobulina por otra, y de una especie a otra. Véanse, por ejemplo, los documentos EP 0173494; EP 0125023; Munro, Nature 312 (13 de diciembre de 1984); Neuberger et al., Nature 312: (13 de diciembre de 1984); Sharon et al., Nature 309 (24 de mayo de 1984); Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855 (1984); Morrison et al., Science 229: 1202­ 1207 (1985); y Boulianne et al., Nature 312: 643-646 (13 de diciembre de 1984).
Morrison et al., Science 229: 1202-1207 (1985) enseña la preparación de una quimera de inmunoglobulina que tiene una región variable de una especie fusionada a una región constante de inmunoglobulina de otra especie.
También se ha demostrado que es posible sustituir dominios de tipo variable de inmunoglobulina de dos miembros de la superfamilia de genes de inmunoglobulina, CD4 y el receptor de células T, por un dominio variable en una inmunoglobulina; véase por ejemplo, Capon et al., Nature 337: 525-531, 1989, Traunecker et al., Nature 339: 68-70, 1989, Gascoigne et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 84: 2936-2940, 1987, y la solicitud europea publicada EPO 0325 224 A2.
La patente estadounidense No. 5.116.964 (Capon et al., 26 de mayo de 1992) describe inmunoglobulinas híbridas comúnmente denominadas inmunoadhesinas, que combinan, por ejemplo, las propiedades adhesivas y de direccionamiento de un compañero de unión al ligando con funciones efectoras de inmunoglobulina. La patente de los Estados Unidos No. 5.336.603 (Capon et al., 9 de agosto de 1994), describe una inmunoadhesión heterofuncional que comprende una proteína de fusión en la que un polipéptido que comprende una región variable (V) del antígeno CD4 humano se fusiona en su terminal C con el terminal N de un polipéptido que comprende una región constante de un disulfuro de cadena de inmunoglobulina unido a un par de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina acompañante que porta un sitio de combinación de anticuerpo capaz de unirse a un antígeno predeterminado.
Los "componentes" de inmunoglobulinas incluyen fragmentos de anticuerpos que comprenden una porción de un anticuerpo intacto, preferiblemente la región de unión al antígeno o variable del anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales (Zapata et al., Protein Eng. 8 (10): 1057-1062 (1995)); moléculas de anticuerpos monocatenarios; y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos.
La digestión de anticuerpos con papaína produce dos fragmentos de unión a antígeno idénticos, denominados fragmentos "Fab", cada uno con un único sitio de unión a antígeno, y un fragmento "Fc" residual, una designación que refleja la capacidad de cristalizar fácilmente. El tratamiento con pepsina produce un fragmento F(ab')2 que tiene dos sitios de combinación de antígeno y todavía es capaz de entrecruzar el antígeno.
"Fv" es el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un sitio de unión y reconocimiento de antígeno completo. Esta región consta de un dímero de un dominio variable de cadena pesada y uno de cadena ligera en asociación estrecha no covalente. Es en esta configuración que las tres CDR de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de unión al antígeno en la superficie del dímero Vh-Vl. En conjunto, las seis CDR confieren especificidad de unión al antígeno al anticuerpo. Sin embargo, incluso un único dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende sólo tres CDR específicas para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y unirse al antígeno, aunque con una afinidad menor que el sitio de unión completo.
El fragmento Fab también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab se diferencian de los fragmentos Fab' por la adición de algunos residuos en el extremo carboxilo del dominio CH1 de la cadena pesada que incluyen una o más cisteínas de la región bisagra del anticuerpo. Fab'-SH es la designación en el presente documento para Fab' en la que el residuo o residuos de cisteína de los dominios constantes portan un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpo F(ab')2 se produjeron originalmente como pares de fragmentos Fab' que tienen cisteínas bisagra entre ellos. También se conocen otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpos.
Las "cadenas ligeras" de anticuerpos (inmunoglobulinas) de cualquier especie de vertebrado pueden asignarse a uno de dos tipos claramente distintos, llamados kappa y lambda, con base en las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes.
Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, las inmunoglobulinas se pueden asignar a diferentes clases. Hay cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de ellas pueden dividirse en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgA2.
Los fragmentos de anticuerpo "Fv monocatenario" o "sFv" comprenden los dominios Vh y Vl del anticuerpo, en los que estos dominios están presentes en una única cadena polipeptídica. Preferiblemente, el polipéptido de Fv comprende además un conector polipeptídico entre los dominios Vh y Vl que permite que el sFv forme la estructura deseada para la unión al antígeno. Para una revisión de sFv, véase Pluckthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol.
113, Rosenburg y Moore eds., Springer-Verlag, Nueva York, páginas 269-315 (1994).
Por lo tanto, la unión de los diversos componentes de las inmunoglobulinas y otras moléculas biológicamente activas ha permitido la producción de moléculas híbridas que retienen las funcionalidades de los componentes individuales.
También se divulgan en el presente documento nuevas moléculas híbridas que incluyen uno o más componentes de inmunoglobulina.
2) Proteínas extracelulares
Las proteínas extracelulares desempeñan papeles importantes en, entre otras cosas, la formación, diferenciación y mantenimiento de organismos multicelulares. Se expone una discusión de varias proteínas intracelulares de interés en la Patente de los Estados Unidos No. 6.723.535, Ashkenazi et al., Expedida el 20 de abril de 2004.
El destino de muchas células individuales, por ejemplo, proliferación, migración, diferenciación o interacción con otras células, se rige típicamente por la información recibida de otras células y/o del entorno inmediato. Esta información a menudo se transmite por polipéptidos secretados (por ejemplo, factores mitogénicos, factores de supervivencia, factores citotóxicos, factores de diferenciación, neuropéptidos y hormonas) que, a su vez, son recibidos e interpretados por diversos receptores celulares o proteínas unidas a la membrana. Estos polipéptidos secretados o moléculas de señalización normalmente pasan a través de la vía secretora celular para alcanzar su sitio de acción en el entorno extracelular.
Las proteínas secretadas tienen diversas aplicaciones industriales, que incluyen productos farmacéuticos, diagnósticos, biosensores y biorreactores. La mayoría de los fármacos proteicos disponibles en la actualidad, tales como agentes trombolíticos, interferones, interleucinas, eritropoyetinas, factores estimulantes de colonias y varias otras citocinas, son proteínas secretoras. Sus receptores, que son proteínas de membrana, también tienen potencial como agentes terapéuticos o de diagnóstico. Tanto la industria como el mundo académico están realizando esfuerzos para identificar nuevas proteínas secretadas nativas. Muchos esfuerzos se centran en el cribado de bibliotecas de ADN recombinante de mamíferos para identificar las secuencias codificantes de nuevas proteínas secretadas. En la bibliografía se describen ejemplos de métodos y técnicas de cribado (véase, por ejemplo, Klein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 7108-7113 (1996); patente de los Estados Unidos No. 5.536.637).
Las proteínas y los receptores unidos a la membrana pueden desempeñar papeles importantes, entre otras cosas, en la formación, diferenciación y mantenimiento de organismos multicelulares. El destino de muchas células individuales, por ejemplo, proliferación, migración, diferenciación o interacción con otras células, se rige típicamente por la información recibida de otras células y/o del entorno inmediato. Esta información a menudo se transmite por polipéptidos secretados (por ejemplo, factores mitogénicos, factores de supervivencia, factores citotóxicos, factores de diferenciación, neuropéptidos y hormonas) que, a su vez, son recibidos e interpretados por diversos receptores celulares o proteínas unidas a la membrana. Tales proteínas unidas a la membrana y receptores celulares incluyen, pero no se limitan a, receptores de citocinas, receptores quinasas, receptores fosfatasas, receptores implicados en interacciones célula-célula y moléculas de adhesina celular como selectinas e integrinas. Por ejemplo, la transducción de señales que regulan el crecimiento y la diferenciación celular está regulada en parte por la fosforilación de varias proteínas celulares. Las proteínas tirosina quinasas, enzimas que catalizan ese proceso, también pueden actuar como receptores de factores de crecimiento. Los ejemplos incluyen el receptor del factor de crecimiento de fibroblastos y el receptor del factor de crecimiento nervioso.
Las proteínas unidas a la membrana y las moléculas receptoras tienen diversas aplicaciones industriales, incluso como agentes farmacéuticos y de diagnóstico. Las inmunoadhesinas receptoras, por ejemplo, pueden emplearse como agentes terapéuticos para bloquear interacciones receptor-ligando. Las proteínas unidas a la membrana también se pueden emplear para el cribado de inhibidores de péptidos o moléculas pequeñas potenciales de la interacción receptor/ligando relevante.
Los ejemplos de tales proteínas incluyen EGF y factores de crecimiento.
El factor de crecimiento epidérmico (EGF) es un factor mitogénico convencional que estimula la proliferación de varios tipos de células, incluidas las células epiteliales y los fibroblastos. EGF se une y activa el receptor del EGF (EGFR), que inicia la señalización intracelular y los efectos posteriores. El EGFR se expresa en neuronas de la corteza cerebral, cerebelo e hipocampo, además de otras regiones del sistema nervioso central (SNC). Además, EGF también se expresa en varias regiones del SNC. Por lo tanto, el EGF actúa no solo sobre las células mitóticas, sino también sobre las neuronas posmitóticas. De hecho, muchos estudios han indicado que EGF tiene efectos neurotróficos o neuromoduladores sobre varios tipos de neuronas en el SNC. Por ejemplo, EGF actúa directamente sobre neuronas cerebelosas y corticales cerebrales cultivadas, mejorando el crecimiento y supervivencia de neuritas. Por otro lado, el EGF también actúa sobre otros tipos de células, incluidas las neuronas dopaminérgicas mesencefálicas y colinérgicas septales, indirectamente a través de las células gliales. Se están acumulando pruebas de los efectos del EGF sobre las neuronas en el SNC, pero los mecanismos de acción siguen siendo esencialmente desconocidos. La señalización inducida por EGF en las células mitóticas se comprende mejor que en las neuronas posmitóticas. Los estudios de células PC12 de feocromocitoma clonadas y neuronas corticales cerebrales cultivadas han sugerido que las acciones neurotróficas inducidas por EGF están mediadas por la activación sostenida del EGFR y la proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK) en respuesta a EGF. La señalización intracelular sostenida se correlaciona con la disminución de la tasa de subregulación del EGFR, lo que podría determinar la respuesta de las células neuronales al EGF. Es probable que el EGF sea un factor de crecimiento multipotente que actúa sobre varios tipos de células, incluidas las células mitóticas y las neuronas posmitóticas.
El EGF es producido por las glándulas salivales y de Brunner del sistema gastrointestinal, riñón, páncreas, glándula tiroides, glándula pituitaria y sistema nervioso, y se encuentra en fluidos corporales tales como saliva, sangre, líquido cefalorraquídeo (CSF), orina, líquido amniótico, líquido prostático, jugo pancreático y leche materna, Plata-Salaman, Peptides 12: 653-663 (1991).
El EGF está mediado por su receptor específico de membrana, que contiene una tirosina quinasa intrínseca. Stoscheck et al., J. Cell Biochem. 31: 135 - 152 (1986). Se cree que el e Gf funciona uniéndose a la porción extracelular de su receptor que induce una señal transmembrana que activa la tirosina quinasa intrínseca.
La purificación y el análisis de secuencia del dominio similar a EGF ha revelado la presencia de seis residuos de cisteína conservados que se unen de forma cruzada para crear tres bucles de péptidos, Savage et al., J. Biol. Chem.
248: 7669 - 7672 (1979). Ahora se sabe generalmente que varios otros péptidos pueden reaccionar con el receptor de EGF que comparten el mismo motivo generalizado Xn CX7 CX4/5 CX10 CXCX5 GX2 CXn, en el que X representa cualquier aminoácido no cisteína y n es un número de repetición variable. Los péptidos no aislados que tienen este motivo incluyen TGF-alfa, anfirregulina, factor de crecimiento derivado de schwannoma (SDGF), factores de crecimiento similares a EGF que se unen a heparina y ciertos péptidos codificados por virus (por ejemplo, Vaccinia Virus, Reisner, Nature 313: 801-803 (1985), Shope fibroma virus, Chang et al., Mol Cell Biol. 7: 535-540 (1987), Molluscum contagiosum, Porter y Archard, J. Gen. Virol. 68: 673-682 (1987), y Myxoma virus, Upton et al., J. Virol. 61: 1271-1275 (1987), Prigent y Lemoine, Prog. Growth Factor Res. 4: 1-24 (1992).
Los dominios similares a EGF no se limitan a factores de crecimiento sino que se han observado en una variedad de proteínas extracelulares y de la superficie celular que tienen propiedades interesantes en la adhesión celular, interacción y desarrollo proteína-proteína, Laurence y Gusterson, Tumor Biol. 11: 229 - 261 (1990). Estas proteínas incluyen factores de coagulación sanguínea (factores VI, IX, X, XII, proteína C, proteína S, proteína Z, activador del plasminógeno tisular, uroquinasa), componentes de la matriz extracelular (laminina, citotactina, entactina), receptores de superficie celular (receptor de LDL, receptor de trombomodulina) y proteínas relacionadas con la inmunidad (complemento C1r, uromodulina).
Aún más interesante, el patrón de estructura general de los precursores similares a EGF se conserva a través de organismos inferiores así como en células de mamíferos. Se han identificado varios genes con importancia para el desarrollo en invertebrados con repeticiones de tipo EGF. Por ejemplo, el gen Notch de Drosophila codifica 36 repeticiones de 40 aminoácidos dispuestas en tándem que muestran homología con EGF, Wharton et al., Cell 43: 557­ 581 (1985). Las gráficas de hidropatía indican un dominio putativo que se extiende sobre la membrana, con las secuencias relacionadas con EGF que se encuentran en el lado extracelular de la membrana. Otros genes homeóticos con repeticiones similares a EGF incluyen Delta, 95F y 5ZD que se identificaron usando sondas basadas en Notch, y el gen de nematodo Lin-12 que codifica un receptor putativo para una señal de desarrollo transmitida entre dos células específicas.
Específicamente, se ha demostrado que EGF tiene potencial en la conservación y mantenimiento de la mucosa gastrointestinal y la reparación de lesiones mucosas agudas y crónicas, Konturek et al., Eur. J. Gastroentero1Hepatol.
7 (10), 933-37 (1995), incluido el tratamiento de enterocolitis necrotizante, síndrome de Zollinger-Ellison, ulceración gastrointestinal, ulceraciones gastrointestinales y atrofia congénita de microvellosidades, Guglietta y Sullivan, Eur. J. Gastroenterol Hepatol, 7 (10), 945 - 50 (1995). Además, el EGF se ha relacionado con la diferenciación de los folículos pilosos; du Cros, J. Invest. Dermatol. 101 (Supl. 1), 106S-113S (1993), Hillier, Clin. Endocrinol. 33 (4), 427 - 28 (1990); función renal, Hamm et al., Semin. Nephrol. 13 (1): 109 - 15 (1993), Harris, Am. J. Kidney Dis. 17 (6): 627 - 30 (1991); líquido lagrimal, van Setten et al., Int. Oftalmol 15 (6); 359 - 62 (1991); coagulación sanguínea mediada por vitamina K, Stenflo et al., Blood 78 (7): 1637-51 (1991). El EGF también está implicado en diversas enfermedades de la piel caracterizadas por diferenciación anormal de queratinocitos, por ejemplo, psoriasis, cánceres epiteliales tales como carcinomas de células escamosas de pulmón, carcinoma epidermoide de vulva y gliomas. King et al., Am. J. Med. Sci.
296: 154-158 (1988). Es de gran interés la creciente evidencia de que las alteraciones genéticas en las vías de señalización de los factores de crecimiento están estrechamente relacionadas con anomalías del desarrollo y con enfermedades crónicas, incluido el cáncer. Aaronson, Science 254: 1146-1153 (1991). Por ejemplo, c-erb-2 (también conocido como HER-2), un protooncogén con una estrecha similitud estructural con la proteína receptora de EGF, se sobreexpresa en el cáncer de mama humano. King et al., Science 229: 974-976 (1985); Gullick, Hormones and their actions, Cooke et al., Eds, Ámsterdam, Elsevier, páginas 349-360 (1986).
Los factores de crecimiento son señales moleculares o mediadores que potencian el crecimiento o la proliferación celular, solos o en conjunto, uniéndose a receptores específicos de la superficie celular. Sin embargo, existen otras reacciones celulares además del crecimiento por expresión de factores de crecimiento. Como resultado, los factores de crecimiento se caracterizan mejor como reguladores celulares multifuncionales y potentes. Sus efectos biológicos incluyen proliferación, quimiotaxis y estimulación de la producción de matriz extracelular. Los factores de crecimiento pueden tener efectos tanto estimulantes como inhibidores. Por ejemplo, el factor de crecimiento transformante (TGF-beta) es altamente pleiotrópico y puede estimular la proliferación en algunas células, especialmente el tejido conectivo, mientras que es un potente inhibidor de la proliferación en otras, tal como los linfocitos y las células epiteliales.
El efecto fisiológico de la estimulación o inhibición del crecimiento por factores de crecimiento depende del estado de desarrollo y diferenciación del tejido diana. El mecanismo de regulación celular local por moléculas endocrinas clásicas comprende las vías autocrina (misma célula), yuxtacrina (célula vecina) y paracrina (células adyacentes). Los factores de crecimiento de péptidos son elementos de un lenguaje biológico complejo, que proporcionan la base para la comunicación intercelular. Permiten que las células se transmitan información entre sí, medien la interacción entre células y cambien la expresión génica. El efecto de estos factores multifuncionales y pluripotentes depende de la presencia o ausencia de otros péptidos.
El FGF-8 es un miembro de los factores de crecimiento de fibroblastos (FGF) que son una familia de mitógenos potentes que se unen a heparina tanto para los fibroblastos diploides normales como para las líneas celulares establecidas, Gospodarowicz et al., (1984), Proc. Nat. Acad. Sci. Estados Unidos 81: 6963. La familia de FGF comprende FGF ácido (FGF-1), FGF básico (FGF-2), INT-2 (FGF-3), K-FGF/HST (FGF-4), FGF-5, FGF-6, KGF (FGF-7), AIGF (FGF-8) entre otros. Todos los FGF tienen dos residuos de cisteína conservados y comparten una homología de secuencia del 30-50% a nivel de aminoácidos. Estos factores son mitogénicos para una amplia variedad de células derivadas de la cresta neural y del mesodermo diploide normal, incluidas las células de la granulosa, las células corticales suprarrenales, los condrocitos, los mioblastos, las células endoteliales corneales y vasculares (bovinas o humanas), las células del músculo liso vascular, células del cristalino, la retina, y epiteliales prostáticas, oligodendrocitos, astrocitos, condrocitos, mioblastos y osteoblastos.
Los factores de crecimiento de fibroblastos también pueden estimular un gran número de tipos de células de una manera no mitógena. Estas actividades incluyen la promoción de la migración celular al área de la herida (quimiotaxis), el inicio de la formación de nuevos vasos sanguíneos (angiogénesis), la modulación de la regeneración y supervivencia nerviosas (neurotrofismo), la modulación de las funciones endocrinas y la estimulación o supresión de la expresión de proteínas celulares específicas, producción de la matriz extracelular y supervivencia celular. Baird & Bohlen, Handbook of Exp. Pharmacol. 95 (1): 369418, Springer, (1990). Estas propiedades proporcionan una base para usar factores de crecimiento de fibroblastos en enfoques terapéuticos para acelerar la cicatrización de heridas, reparación de nervios, formación de vasos sanguíneos colaterales y similares. Por ejemplo, se ha sugerido que los factores de crecimiento de fibroblastos minimizan el daño del miocardio en enfermedades cardíacas y cirugías (patente de los Estados Unidos No. 4.378.347).
El FGF-8, también conocido como factor de crecimiento inducido por andrógenos (AIGF), es una proteína de 215 aminoácidos que comparte una homología de secuencia del 30-40% con los otros miembros de la familia de FGF. Se ha propuesto que FGF-8 está bajo regulación e inducción androgénica en la línea celular de carcinoma mamario de ratón Sc 3. Tanaka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 8928-8932 (1992); Sato et al., J. Steroid Biochem. Molec. Biol. 47: 91-98 (1993). Como resultado, el FGF-8 puede tener un papel local en la próstata, que se sabe que es un órgano que responde a los andrógenos. El FGF-8 también puede ser oncogénico, ya que muestra actividad transformadora cuando se transfecta en fibroblastos NIH-3T3. Kouhara et al., Oncogene 9455462 (1994). Si bien se ha detectado FGF-8 en corazón, cerebro, pulmón, riñón, testículo, próstata y ovario, también se detectó expresión en ausencia de andrógenos exógenos. Schmitt et al., J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 57 (34): 173-78 (1996).
El FGF-8 comparte la propiedad con varios otros FGF de expresarse en una variedad de etapas de la embriogénesis murina, lo que apoya la teoría de que los diversos FGF tienen funciones múltiples y quizás coordinadas en la diferenciación y embriogénesis. Además, FGF-8 también se ha identificado como un protooncogén que coopera con Wnt-1 en el proceso de tumorigénesis mamaria (Shackleford et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 740-744 (1993); Heikinheimo et al., Mech. Dev. 48: 129-138 (1994)).
En contraste con los otros FGF, el FGF-8 existe como tres isoformas de proteína, como resultado del corte y empalme alternativo del transcrito primario. Tanaka et al., citado anteriormente. La expresión adulta normal de FGF-8 es débil y se limita al tejido gonadal; sin embargo, el análisis de transferencia Northern ha indicado que el ARNm de FGF-8 está presente desde el día 10 hasta el día 12 o la gestación murina, lo que sugiere que f GF-8 es importante para el desarrollo normal. Heikinheimo et al., Mech Dev. 48 (2): 129-38 (1994). Otros ensayos de hibridación in situ entre el día 8 y el 16 de gestación indicaron expresión inicial en el ectodermo de superficie de los primeros arcos bronquiales, el proceso frontonasal, el prosencéfalo y la unión del mesencéfalo-rombencéfalo. En los días 10-12, FGF-8 se expresó en el ectodermo de superficie de las yemas de las extremidades anteriores y posteriores, la nariz y la nasofaringe, el infundíbulo y en el telencéfalo, diencéfalo y metencéfalo. La expresión continúa en las extremidades posteriores en desarrollo hasta el día 13 de gestación, pero es indetectable a partir de entonces. Los resultados sugieren que FGF-8 tiene un patrón temporal y espacial único en la embriogénesis y sugiere un papel para este factor de crecimiento en múltiples regiones de diferenciación ectodérmica en el embrión post-gastrulación.
La familia del supergén de TGF-beta, o simplemente la superfamilia de TGF-beta, un grupo de proteínas secretadas, incluye un gran número de factores de crecimiento y diferenciación relacionados expresados en prácticamente todos los filos. Los miembros de la superfamilia se unen a receptores específicos de la superficie celular que activan los mecanismos de transducción de señales para provocar sus efectos de citocinas multifuncionales. Kolodziejczyk y Hall, Biochem. Cell. Biol. 74: 299-314 (1996); Attisano y Wrana, Cytokine Growth Factor Rev., 7: 327-339 (1996); y Hill, Cellular Signaling, 8: 533-544 (1996).
Los miembros de esta familia incluyen cinco formas distintas de TGF-beta (Sporn y Roberts, en Peptide Growth Factors and Their Receptors, Sporn y Roberts, eds. (Springer-Verlag: Berlín, 1990) págs. 419-472), así como los factores de diferenciación vg1 (Weeks y Melton, Cell, 51: 861-867 (1987)) y el polipéptido DPP-C (Padgett et al., Nature, 325: 81­ 84 (1987)), las hormonas activina e inhibina (Mason et al., Nature 318-659-663 (1985); Mason et al., Growth Factors, 1: 77-88 (1987)), la sustancia inhibidora de Muller (MIS) (Cate et al., Cell, 45 : 685-698 (1986)), las proteínas morfogenéticas óseas (BMP) (Wozney et al., Science, 242: 1528-1534 (1988); PCT WO 88/00205 publicada el 14 de enero de 1988; patente de los Estados Unidos No. 4.877.864 expedida el 31 de octubre de 1989), las proteínas reguladas por el desarrollo Vgr-1 (Lyons et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86: 45544558 (1989)) y Vgr-2 (Jones et al., Molec. Endocrinol., 6: 1961-1968 (1992)), el factor de diferenciación del crecimiento del ratón (GDf ), tal como GDF-3 y GDF-9 (Kingsley, Genes Dev., 8: 133-146 (1994); McPherron y Lee, J. Biol. Chem., 268: 3444-3449 (1993)), el l efty/Stra 1 de ratón (Meno et al., Nature, 381: 151-155 (1996); Bouillet et al., Dev. Biol., 170: 420-433 (1995)), factor neurotrófico derivado de la línea celular glial (GDNF) (Lin et al., Science, 260: 1130-1132 (1993), neurturina (Kotzbauer et al., Nature, 384: 467-470 (1996)), y el factor asociado a hemorragia endometrial (EBAF) (Kothapalli et al., J. Clin. Invest., 99: 2342-2350 (1997)). El subconjunto BMP-2A y BMP-2B es aproximadamente un 75% homólogo en secuencia a DPP-C y puede representar el equivalente mamífero de esa proteína.
Las proteínas de la superfamilia de TGF-beta son homo o heterodímeros unidos por disulfuro codificados por cadenas polipeptídicas precursoras más grandes que contienen una secuencia señal hidrófoba, una región pro del terminal N larga y relativamente pobremente conservada de varios cientos de aminoácidos, un sitio de escisión (generalmente polibásico), y una región del terminal C más corta y más altamente conservada. Esta región del terminal C corresponde a la proteína madura procesada y contiene aproximadamente 100 aminoácidos con un motivo de cisteína característico, es decir, la conservación de siete de los nueve residuos de cisteína de TGF-beta entre todos los miembros conocidos de la familia. Aunque la posición del sitio de escisión entre las regiones madura y pro varía entre los miembros de la familia, el terminal C de todas las proteínas está en la posición idéntica, terminando en la secuencia Cys-X-Cys-X, pero difiriendo en cada caso del TGF-beta consenso del terminal C de Cys-Lys-Cys-Ser. Sporn y Roberts, 1990, citado anteriormente.
Hay al menos cinco formas de TGF-beta identificadas actualmente, TGF-beta1, TGF-beta2, TGF-beta3, TGF-beta4 y TGF-beta5. La forma activada de TGF-beta1 es un homodímero formado por dimerización de los 112 aminoácidos del terminal carboxilo de un precursor de 390 aminoácidos. Se ha clonado TGF-beta1 recombinante (Derynck et al., Nature, 316: 701-705 (1985)) y se ha expresado en células de ovario de hámster chino (Gentry et al., Mol. Cell. Biol.
7: 3418-3427 (1987)). Además, TGF-beta2 humano recombinante (deMartin et al., EMBO J., 6: 3673 (1987)), así como TGF-beta3 humano y porcino (Derynck et al., EMBO J., 7: 3737-3743 (1988); han sido clonados diez (Dijke et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 4715 (1988)). TGF-beta2 tiene una forma precursora de 414 aminoácidos y también se procesa a un homodímero de los 112 aminoácidos del terminal carboxilo que comparte aproximadamente el 70% de homología con la forma activa de TGF-beta1 (Marquardt et al., J. Biol. Chem., 262: 12127 (1987)). Véanse también los documentos EP 200,341; 169.016; 268.561; y 267.463; la patente de los Estados Unidos No. 4.774.322; Cheifetz et al., Cell, 48: 409-415 (1987); Jakowlew et al., Molecular Endocrin., 2: 747-755 (1988); Derynck et al., J. Biol. Chem., 261: 4377-4379 (1986); Sharples et al., DNA, 6: 239-244 (1987); Derynck et al., Nucl. Ácidos. Res., 15: 3188-3189 (1987); Derynck et al., Nucl. Ácidos. Res. 15: 3187 (1987); Seyedin et al., J. Biol. Chem., 261: 5693-5695 (1986); Madisen et al., DNA 7: 1-8 (1988); y Hanks et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (Estados Unidos), 85: 79-82 (1988).
Se clonaron TGF-beta4 y TGF-beta5 de una biblioteca de ADNc de condrocitos de pollo (Jakowlew et al., Molec. Endocrinol., 2: 1186-1195 (1988)) y de una biblioteca de ADNc de ovocitos de rana, respectivamente.
La región pro de TGF-beta se asocia de forma no covalente con el dímero de TGF-beta maduro (Wakefield et al., J. Biol. Chem., 263: 7646-7654 (1988); Wakefield et al., Growth Factors, 1: 203-218 (1989)), y se encuentra que las regiones pro son necesarias para el plegamiento y la secreción adecuados de los dímeros maduros activos de TGF-beta y activina (Gray y Mason, Science, 247: 1328-1330 ( 1990)). La asociación entre las regiones maduras y pro de TGF-beta enmascara la actividad biológica del dímero maduro, lo que da como resultado la formación de una forma latente inactiva. La latencia no es una constante de la superfamilia TGF-beta, ya que la presencia de la región pro no tiene ningún efecto sobre la actividad biológica de la activina o inhibina.
Una característica unificadora de la biología de las proteínas de la superfamilia de TGF-beta es su capacidad para regular los procesos de desarrollo. Se ha demostrado que TGF-beta tiene numerosas acciones reguladoras en una amplia variedad de células tanto normales como neoplásicas. TGF-beta es multifuncional, ya que puede estimular o inhibir la proliferación, la diferenciación y otros procesos críticos celulares en la función celular (Sporn y Roberts, citados anteriormente).
Un miembro de la superfamilia de TGF-beta, EBAF, se expresa en el endometrio solo en la fase secretora tardía y durante la hemorragia endometrial anormal. Kothapalli et al., J. Clin. Invest., 99: 2342-2350 (1997). El endometrio humano es único porque es el único tejido del cuerpo que sangra a intervalos regulares. Además, el sangrado endometrial anormal es una de las manifestaciones más comunes de enfermedades ginecológicas y es una indicación principal para la histerectomía. La hibridación in situ mostró que el ARNm de EBAF se expresaba en el estroma sin ninguna expresión significativa de ARNm en las glándulas endometriales o en las células endoteliales.
La secuencia de proteína predicha de EBAF mostró una fuerte homología con la proteína codificada por lefty/stra3 de la superfamilia TGF-beta. Una búsqueda de motivos reveló que la proteína EBAF predicha contiene la mayoría de los residuos de cisteína que se conservan entre las proteínas relacionadas con TGF-beta y que son necesarios para la formación de la estructura del nudo de cisteína. La secuencia de EBAF contiene un residuo de cisteína adicional, 12 aminoácidos secuencia arriba del primer residuo de cisteína conservado. Los únicos otros miembros de la familia que se sabe que contienen un residuo de cisteína adicional son TGF-beta, inhibinas y GDF-3. EBAF, similar a LEFTy , GDF-3/Vgr2 y GDF-9, carece del residuo de cisteína que se sabe que forma el enlace disulfuro intermolecular. Por lo tanto, EBAF parece ser un miembro adicional de la superfamilia de TGF-beta con un residuo de cisteína desapareado que puede no existir como dímero. Sin embargo, los contactos hidrófobos entre las dos subunidades de monómeros pueden promover la formación de dímeros. La hibridación fluorescente in situ mostró que el gen ebaf se encuentra en el cromosoma 1 humano en la banda q42.1.
Otros ejemplos de tales proteínas extracelulares son bien conocidos en la técnica, por ejemplo, véase la patente de Estados Unidos No. 6.723.535.
Conjugados
También se divulgan en el presente documento conjugados de simetroadhesinas/inmunosimetroadhesinas. Por lo tanto, las presentes composiciones se pueden conjugar con un agente citotóxico tal como un agente quimioterapéutico, una toxina (por ejemplo, una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de la misma), o un isótopo radiactivo (es decir, un radioconjugado).
Los agentes quimioterapéuticos útiles en la generación de tales inmunoconjugados son bien conocidos en la técnica. Las toxinas enzimáticamente activas y sus fragmentos que pueden usarse incluyen la cadena A de la difteria, los fragmentos activos no enlazantes de la toxina diftérica, la cadena A de la exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), la cadena A de la ricina, la cadena A de la abrina, la cadena A de la modecina, la alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii , proteínas diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPH y PAP-S), inhibidor de Momordica charanda, curcina, crotina, inhibidor de Sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos. Se dispone de una variedad de radionúclidos para la producción de anticuerpos radioconjugados. Los ejemplos incluyen 212Bi, 131I, 113In, 90Y y 186Re.
Los conjugados de las composiciones que incluyen un agente citotóxico se preparan usando una variedad de agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales tales como N-succinimidil-3-(2-piridilditiol)propionato (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como como dimetil adipimidato HCl), ésteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo), aldehídos (tales como glutaraldehído), compuestos bis-azido (tales como bis(pazidobenzoil)hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tales como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (tales como tolueno 2,6-diisocianato) y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, se puede preparar una inmunotoxina de ricina como se describe en Vitetta et al., Science, 238: 1098 (1987). El ácido 1-isotiocianatobencil-3-metildietilen triaminopentaacético (MX-DTPA) marcado con carbono 14 es un ejemplo de agente quelante para la conjugación de radionucleótidos con el anticuerpo. Véase el documento WO94111026.
Síntesis de dispositivos genéticos
Los dispositivos genéticos divulgados en el presente documento pueden sintetizarse mediante diversas rutas. Una ruta particular es sintetizar componentes in vivo mediante tecnología de ADN recombinante y luego modificar químicamente los productos secretados u obtenidos en condiciones para formar los compuestos. Las rutas alternativas incluyen la síntesis en estado sólido.
Técnicas generales
La siguiente descripción se refiere principalmente a la producción de tramos de aminoácidos consecutivos o polipéptidos de interés mediante el cultivo de células transformadas o transfectadas con un vector que contiene un ácido nucleico codificante. Por supuesto, se contempla que se puedan emplear métodos alternativos, que son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos, o porciones de la misma, puede producirse mediante síntesis directa de péptidos usando técnicas en fase sólida (véase, por ejemplo, Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, WH Freeman Co., San Francisco, CA. (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85: 2149-2154 (1963)). La síntesis de proteínas in vitro se puede realizar utilizando técnicas manuales o mediante automatización. La síntesis automatizada se puede lograr, por ejemplo, usando un sintetizador de péptidos de Applied Biosystems (Foster City, CA) usando las instrucciones del fabricante. Varias porciones de los tramos de aminoácidos consecutivos o polipéptidos de interés pueden sintetizarse químicamente por separado y combinarse usando métodos químicos o enzimáticos para producir tramos completos de aminoácidos o polipéptidos consecutivos de interés.
1. Aislamiento de ADN que codifica tramos de aminoácidos consecutivos o polipéptidos de interés
El ADN codificante puede obtenerse de una biblioteca de ADNc preparada a partir de tejido que se cree que posee el ARNm de interés y que lo expresa a un nivel detectable. Por consiguiente, el ADN humano se puede obtener convenientemente a partir de una biblioteca de ADNc preparada a partir de tejido humano, etc. También se puede obtener un gen codificante de una biblioteca genómica o mediante procedimientos de síntesis conocidos (por ejemplo, síntesis automatizada de ácidos nucleicos).
Las bibliotecas se pueden cribar con sondas (tales como anticuerpos contra el tramo de aminoácidos consecutivos u oligonucleótidos de al menos aproximadamente 20-80 bases) diseñadas para identificar el gen de interés o la proteína codificada por él. El cribado del ADNc o biblioteca genómica con la sonda seleccionada puede realizarse usando procedimientos estándar, como los descritos en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Nueva York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Un medio alternativo para aislar el gen codificante es utilizar la metodología de PCR (Sambrook et al., citado anteriormente; Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)).
Las secuencias de oligonucleótidos seleccionadas como sondas deben tener una longitud suficiente y ser suficientemente inequívocas para minimizar los falsos positivos. El oligonucleótido se marca preferiblemente de modo que se pueda detectar tras la hibridación con el ADN en la biblioteca que se está cribando. Los métodos de marcaje son bien conocidos en la técnica e incluyen el uso de radiomarcadores tales como ATP marcado con 32P, biotinilación o marcaje enzimático. Las condiciones de hibridación, que incluyen rigurosidad moderada y rigurosidad alta, se proporcionan en Sambrook et al., citado anteriormente.
Las secuencias identificadas en tales métodos de cribado de bibliotecas se pueden comparar y alinear con otras secuencias conocidas depositadas y disponibles en bases de datos públicas tales como GenBank u otras bases de datos de secuencias privadas. La identidad de secuencia (a nivel de aminoácidos o de nucleótidos) dentro de regiones definidas de la molécula o en toda la secuencia se puede determinar usando métodos conocidos en la técnica y como se describe en el presente documento.
El ácido nucleico que tiene una secuencia codificante de proteínas puede obtenerse cribando bibliotecas genómicas o de ADNc seleccionadas usando la secuencia de aminoácidos deducida descrita en este documento por primera vez y, si es necesario, usando procedimientos de extensión de cebadores convencionales como se describe en Sambrook et al., citado anteriormente, para detectar precursores y compuestos intermedios de procesamiento de ARNm que pueden no haber sido transcritos de forma inversa en ADNc.
2. Selección y transformación de células huésped
Las células huésped se transfectan o transforman con los vectores de expresión o clonación descritos en el presente documento para su producción y se cultivan en un medio nutritivo convencional modificado según sea apropiado para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas. Las condiciones de cultivo, tales como el medio, la temperatura, el pH y similares, pueden ser seleccionadas por el experto en la materia sin una experimentación indebida. En general, los principios, protocolos y técnicas prácticas para maximizar la productividad de los cultivos celulares se pueden encontrar en Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991) y Sambrook et al., citado anteriormente.
Los expertos en la materia conocen métodos de transfección de células eucariotas y transformación de células procariotas, por ejemplo, CaCb, CaPO4, mediada por liposomas y electroporación. Dependiendo de la célula huésped utilizada, la transformación se realiza utilizando técnicas estándar apropiadas para tales células. El tratamiento con calcio que emplea cloruro de calcio, como se describe en Sambrook et al., citado anteriormente, o electroporación se usa generalmente para procariotas. La infección con Agrobacterium tumefaciens se usa para la transformación de ciertas células vegetales, como describen Shaw et al., Gene, 23: 315 (1983) y el documento WO 89/05859 publicado el 29 de junio de 1989. Para células de mamífero sin tales paredes celulares, se puede emplear el método de precipitación con fosfato de calcio de Graham y van der Eb, Virology, 52: 456-457 (1978). Los aspectos generales de las transfecciones del sistema huésped de células de mamífero se han descrito en la patente de los Estados Unidos No. 4.399.216. Las transformaciones en levadura se llevan a cabo típicamente de acuerdo con el método de Van Solingen et al., J. Bact., 130: 946 (1977) y Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (Estados Unidos), 76: 3829 (1979). Sin embargo, también se pueden usar otros métodos para introducir ADN en células, tales como microinyección nuclear, electroporación, fusión de protoplastos bacterianos con células intactas o policationes, por ejemplo, polibreno, poliornitina. Para diversas técnicas para transformar células de mamíferos, véase Keown et al., Methods in Enzymology, 185: 527-537 (1990) y Mansour et al., Nature, 336: 348-352 (1988).
Las células huésped adecuadas para clonar o expresar el ADN en los vectores de la presente invención incluyen células procariotas, de levadura o eucariotas superiores. Las procariotas adecuadas incluyen pero no se limitan a eubacterias, tales como organismos Gram-negativos o Gram-positivos, por ejemplo, Enterobacteriaceae tal como E. coli. Varias cepas de E. co liestán disponibles públicamente, tales como E. co liK12 la cepa MM294 de (ATCC 31.446); E. coli X1776 (ATCC 31.537); E. coli cepa W3110 (ATCC 27.325) y K5772 (ATCC 53.635). Otras células huésped procariotas adecuadas incluyen Enterobacteriaceae tales como Escherichia, por ejemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por ejemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por ejemplo, Serratia marcescans y Shigella, así como Bacilos tales como B. subtilis y B. licheniformis (por ejemplo, B. licheniformis 41P divulgado en el documento DD 266.710 publicado el 12 de abril de 1989), Pseudomonas tales como P. aeruginosa y Streptomyces. Estos ejemplos son ilustrativos más que limitativos. La cepa W3110 es un huésped o huésped parental particularmente preferido porque es una cepa huésped común para fermentaciones de productos de ADN recombinante. Preferiblemente, la célula huésped secreta cantidades mínimas de enzimas proteolíticas. Por ejemplo, la cepa W3110 puede modificarse para efectuar una mutación genética en los genes que codifican proteínas endógenas al huésped, con ejemplos de tales huéspedes que incluyen E. coli W3110 cepa 1A2, que tiene el genotipo tonA completo; E. coli W3110 cepa 9E4, que tiene el genotipo tonA ptr3 completo; E. coli W3110 cepa 27C7 (At Cc 55.244), que tiene el genotipo tonAptr3phoA E15 completo (argF-lac)169 degP ompT kan.sup.r; E. coli W3110 cepa 37D6, que tiene el genotipo tonA ptr3 phoA E15 completo (argF-lac)169 degP ompT rbs7 ilvG kan.sup.r, E. co liW3110 cepa 40B4, que es la cepa 37D6 con una mutación de eliminación degP no resistente a kanamicina; y una cepa de E. coli que tiene proteasa periplásmica mutante divulgada en la patente de los Estados Unidos No. 4.946.783 expedida el 7 de agosto de 1990. Alternativamente, son adecuados los métodos de clonación in vitro, por ejemplo, PCR u otras reacciones de polimerasa de ácido nucleico.
Además de las procariotas, los microbios eucariotas tales como hongos filamentosos o levaduras son huéspedes de clonación o expresión adecuados para codificar vectores. Saccharomyces cerevisiae es un microorganismo huésped eucariota inferior comúnmente utilizado. Otros incluyen Schizosaccharomyces pombe (Beach y Nurse, Nature, 290: 140 (1981); documento EP 139.383 publicado el 2 de mayo de 1985); huéspedes de Kluyveromyces (patente de Estados Unidos No. 4.943.529; Fleer et al., Bio/Technology, 9: 968-975 (1991)) tales como, por ejemplo, K. lactis (MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt et al., J. Bacteriol., 737 (1983)), K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii(ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906; Van den Berg et al., Bio/Technology, 8: 135 (1990)), K. thermotolerans y K. marxianus; milenrama (documento EP 402.226); Pichia pastoris (documento EP 183.070; Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol., 28: 265-278 (1988)); Candida; Trichoderma reesia (documento EP 244.234); Neurospora crassa (Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 5259-5263 (1979)); Schwanniomyces tales como Schwanniomyces occidentalis (documento EP 394 538 publicado el 31 de octubre de 1990); y hongos filamentosos tales como, por ejemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (documento WO 91/00357 publicado el 10 de enero de 1991) y huéspedes de Aspergillus tales como A. nidulans (Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 112 : 284-289 (1983); Tilburn et al., Gene, 26: 205-221 (1983); Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474 (1984)) y A niger (Kelly y Hynes, EMBO J., 4: 475479 (1985)). Las levaduras metilotrópicas son adecuadas en el presente documento e incluyen, pero no se limitan a, levaduras capaces de crecer en metanol seleccionada de los géneros que consisten en Hansenula, Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis y Rhodotorula. Se puede encontrar una lista de especies específicas que son ejemplos de esta clase de levaduras en C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982).
Las células huésped adecuadas para la expresión de tramos glicosilados de aminoácidos consecutivos o polipéptidos de interés se derivan de organismos multicelulares. Ejemplos de células de invertebrados incluyen células de insectos como Drosophila S2 y Spodoptera Sf9, así como células vegetales. Los ejemplos de líneas celulares huésped de mamíferos útiles incluyen células de ovario de hámster chino (CHO) y COS. Los ejemplos más específicos incluyen la línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); línea de riñón embrionario humano (células 293 o 293 subclonadas para crecimiento en cultivo en suspensión, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977)); células de ovario de hámster chino/-DHFR (CHO, Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4216 (1980)); células de Sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23: 243-251 (1980)); células de pulmón humano (W138, ATc C CCL 75); células de hígado humano (Hep G2, h B 8065); y tumor mamario de ratón (m Mt 060562, ATc C CCL51). Se considera que la selección de la célula huésped apropiada está dentro del conocimiento de la técnica.
3. Selección y uso de un vector replicable
El ácido nucleico (por ejemplo, ADNc o ADN genómico) que codifica el tramo de aminoácidos consecutivos o polipéptidos de interés puede insertarse en un vector replicable para clonación (amplificación del ADN) o para expresión. Varios vectores están disponibles públicamente. El vector puede estar, por ejemplo, en forma de plásmido, cósmido, partícula viral o fago. La secuencia de ácido nucleico apropiada puede insertarse en el vector mediante una variedad de procedimientos. En general, el ADN se inserta en un sitio o sitios de endonucleasa de restricción apropiados usando técnicas conocidas en la técnica. Los componentes del vector generalmente incluyen, pero no se limitan a, uno o más de una secuencia señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor y una secuencia de terminación de la transcripción. La construcción de vectores adecuados que contienen uno o más de estos componentes emplea técnicas de ligación estándar que son conocidas por los expertos en la técnica.
Los tramos de aminoácidos consecutivos o polipéptidos de interés pueden producirse de forma recombinante no solo directamente, sino también como un polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, que puede ser una secuencia señal u otro polipéptido que tiene un sitio de escisión específico en el terminal N de la proteína o polipéptido maduro. En general, la secuencia señal puede ser un componente del vector o puede ser parte del ADN codificante que se inserta en el vector. La secuencia señal puede ser una secuencia señal procariota seleccionada, por ejemplo, del grupo de los líderes de fosfatasa alcalina, penicilinasa, 1 pp o enterotoxina II termoestable. Para la secreción de levadura, la secuencia señal puede ser, por ejemplo, el líder de la invertasa de levadura, el líder del factor alfa (incluidos los líderes del factor alfa de Saccharomyces y Kluyveromyces, este último descrito en la patente de los Estados Unidos No. 5.010.182), o el líder de la fosfatasa ácida, el líder de glucoamilasa de C. albicans (documento EP 362.179 publicado el 4 de abril de 1990), o la señal descrita en el documento WO 90/13646 publicado el 15 de noviembre de 1990. En la expresión de células de mamífero, pueden usarse secuencias señal de mamífero para dirigir la secreción de la proteína, tales como secuencias señal de polipéptidos secretados de la misma especie o especies relacionadas, así como líderes secretores virales.
Tanto los vectores de expresión como los de clonación contienen una secuencia de ácido nucleico que permite que el vector se replique en una o más células huésped seleccionadas. Tales secuencias son bien conocidas para una variedad de bacterias, levaduras y virus. El origen de replicación del plásmido pBR322 es adecuado para la mayoría de las bacterias Gram negativas, el origen del plásmido 2mu es adecuado para levaduras y varios orígenes virales (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) son útiles para clonar vectores en células de mamíferos.
Los vectores de clonación y expresión contendrán típicamente un gen de selección, también denominado marcador seleccionable. Los genes de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, (b) complementan las deficiencias auxotróficas, o (c) suministran nutrientes críticos no disponibles en medios complejos, por ejemplo, el gen que codifica la D-alanina racemasa para Bacilos.
Un ejemplo de marcadores seleccionables adecuados para células de mamífero son aquellos que permiten la identificación de células competentes para absorber el ácido nucleico codificante, tal como DHFR o timidina quinasa. Una célula huésped apropiada cuando se emplea DHFR de tipo silvestre es la línea celular CHO deficiente en actividad DHFR, preparada y propagada como se describe por Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4216 (1980). Un gen de selección adecuado para uso en levadura es el gen trp1 presente en el plásmido de levadura YRp7 (Stinchcomb et al., Nature, 282: 39 (1979); Kingsman et al., Gene, 7: 141 (1979); Tschemper et al., Gene, 10: 157 (1980)). El gen trp1 proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carece de la capacidad de crecer en triptófano, por ejemplo, ATCC No. 44076 o PEP4-1 (Jones, Genetics, 85:12 (1977)).
Los vectores de expresión y clonación normalmente contienen un promotor unido operativamente a la secuencia de ácido nucleico codificante para dirigir la síntesis de ARNm. Los promotores reconocidos por una variedad de células huésped potenciales son bien conocidos. Los promotores adecuados para su uso con huéspedes procariotas incluyen los sistemas promotores de beta-lactamasa y lactosa (Chang et al., Nature, 275: 615 (1978); Goeddel et al., Nature, 281: 544 (1979)), fosfatasa alcalina, un sistema promotor triptófano (trp) (Goeddel, Nucleic Acids Res., 8: 4057 (1980); EP 36.776), y promotores híbridos tales como el promotor tac (deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80 : 21-25 (1983)). Los promotores para uso en sistemas bacterianos también contendrán una secuencia de Shine-Dalgarno (S.D.) unida operativamente al ADN codificante.
Los ejemplos de secuencias promotoras adecuadas para su uso con huéspedes de levadura incluyen los promotores de la 3-fosfoglicerato quinasa (Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255: 2073 (1980)) u otras enzimas glicolíticas (Hess et al. , J. Adv. Enzyme Reg., 7: 149 (1968); Holland, Biochemistry, 17: 4900 (1978)), tales como enolasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructoquinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa, triosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucoquinasa.
Otros promotores de levadura, que son promotores inducibles que tienen la ventaja adicional de la transcripción controlada por las condiciones de crecimiento, son las regiones promotoras de la alcohol deshidrogenasa 2, isocitocromo C, fosfatasa ácida, enzimas degradativas asociadas con el metabolismo del nitrógeno, metalotioneína, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa y enzimas responsables de la utilización de maltosa y galactosa. Los vectores y promotores adecuados para su uso en la expresión de levaduras se describen adicionalmente en el documento EP 73.657.
La transcripción de vectores en células huésped de mamíferos se controla, por ejemplo, mediante promotores obtenidos de los genomas de virus tales como polioma virus, virus de la viruela aviar (RU 2.211.504 publicado el 5 de julio de 1989), adenovirus (tal como adenovirus 2), virus del papiloma bovino, virus del sarcoma aviar, citomegalovirus, un retrovirus, virus de la hepatitis B y virus del simio 40 (SV40), de promotores de mamíferos heterólogos, por ejemplo, el promotor de actina o un promotor de inmunoglobulina, y de promotores de choque térmico, siempre que tales promotores sean compatibles con los sistemas de células huésped.
La transcripción de un ADN que codifica los tramos de aminoácidos consecutivos o polipéptidos de interés por eucariotas superiores puede aumentarse insertando una secuencia potenciadora en el vector. Los potenciadores son elementos de ADN que actúan en cis, normalmente entre 10 y 300 pb, que actúan sobre un promotor para aumentar su transcripción. Actualmente se conocen muchas secuencias potenciadoras de genes de mamíferos (globina, elastasa, albúmina, alfa-fetoproteína e insulina). Sin embargo, normalmente se utilizará un potenciador de un virus de células eucariotas. Los ejemplos incluyen el potenciador de SV40 en el lado tardío del origen de replicación (pb 100­ 270), el potenciador del promotor temprano de citomegalovirus, el potenciador de polioma en el lado tardío del origen de replicación y potenciadores de adenovirus. El potenciador puede empalmarse en el vector en una posición 5' o 3' de la secuencia codificante, pero preferiblemente está ubicado en un sitio 5' del promotor.
Los vectores de expresión usados en células huésped eucariotas (levadura, hongos, insectos, plantas, animales, humanos o células nucleadas de otros organismos multicelulares) también contendrán secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para estabilizar el ARNm. Dichas secuencias están comúnmente disponibles a partir de las regiones no traducidas 5' y, ocasionalmente 3', de ADN o ADNc eucariotas o virales. Estas regiones contienen segmentos de nucleótidos transcritos como fragmentos poliadenilados en la porción no traducida del ARNm que codifica tramos de aminoácidos consecutivos o polipéptidos de interés.
Aún otros métodos, vectores y células huésped adecuados para la adaptación a la síntesis de tramos de aminoácidos o polipéptidos consecutivos en cultivos de células de vertebrados recombinantes se describen en Gething et al., Nature 293: 620-625 (1981); Mantei et al., Nature, 281: 4046 (1979); EP 117.060; y EP 117.058.
4. Detección de la amplificación/expresión de genes
La amplificación y/o expresión de genes se puede medir en una muestra directamente, por ejemplo, mediante transferencia Southern convencional, transferencia Northern para cuantificar la transcripción de ARNm (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 5201- 5205 (1980)), transferencia de puntos (análisis de ADN) o hibridación in situ, usando una sonda marcada apropiadamente, con base en las secuencias proporcionadas en el presente documento. Alternativamente, se pueden emplear anticuerpos que puedan reconocer dúplex específicos, incluidos dúplex de ADN, dúplex de ARN y dúplex híbridos de ADN-ARN o dúplex de ADN-proteína. Los anticuerpos, a su vez, pueden marcarse y el ensayo puede llevarse a cabo donde el dúplex está unido a una superficie, de modo que tras la formación del dúplex en la superficie, se puede detectar la presencia del anticuerpo unido al dúplex.
La expresión génica, alternativamente, puede medirse mediante métodos inmunológicos, tales como tinción inmunohistoquímica de células o secciones de tejido y ensayo de cultivo celular o fluidos corporales, para cuantificar directamente la expresión del producto génico. Los anticuerpos útiles para la tinción inmunohistoquímica y/o el ensayo de muestras de fluidos pueden ser monoclonales o policlonales y pueden prepararse en cualquier mamífero. Convenientemente, los anticuerpos se pueden preparar contra tramos de secuencia nativa de aminoácidos consecutivos o polipéptidos de interés o contra un péptido sintético basado en las secuencias de ADN proporcionadas en este documento o contra una secuencia exógena fusionada con ADN que codifica un tramo de aminoácidos consecutivos o polipéptido de interés y codificar un epítopo de anticuerpo específico.
5. Purificación de polipéptidos
Las formas de los tramos de aminoácidos consecutivos o polipéptidos de interés pueden recuperarse del medio de cultivo o de los lisados de células huésped. Si está unido a la membrana, se puede liberar de la membrana utilizando una solución de detergente adecuada (por ejemplo, Triton-X 100) o mediante escisión enzimática. Las células empleadas en la expresión de los tramos de aminoácidos consecutivos o polipéptidos de interés pueden romperse por diversos medios físicos o químicos, tales como ciclos de congelación-descongelación, sonicación, alteración mecánica o agentes de lisis celular.
Puede desearse purificar los tramos de aminoácidos o polipéptidos consecutivos de interés a partir de proteínas o polipéptidos de células recombinantes. Los siguientes procedimientos son ejemplos de procedimientos de purificación adecuados: por fraccionamiento en una columna de intercambio iónico; precipitación con etanol; HPLC de fase inversa; cromatografía sobre sílice o sobre una resina de intercambio catiónico como DEAE; cromatoenfoque; SDS-PAGE; precipitación con sulfato de amonio; filtración en gel usando, por ejemplo, Sephadex G-75; columnas de proteína A Sefarosa para eliminar contaminantes tales como IgG; y columnas quelantes de metales para unir formas marcadas con epítopos. Pueden emplearse varios métodos de purificación de proteínas y dichos métodos son conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, Nueva York (1982). La o las etapas de purificación seleccionadas dependerán, por ejemplo, de la naturaleza del proceso de producción utilizado y de los tramos particulares de aminoácidos o polipéptidos de interés consecutivos producidos.
Ejemplo de expresión de tramos de aminoácidos consecutivos o componente polipeptídico de interés en E. coli La secuencia de ADN que codifica la secuencia de aminoácidos deseada de interés o polipéptido se amplifica inicialmente usando cebadores de PCR seleccionados. Los cebadores deben contener sitios de enzimas de restricción que correspondan a los sitios de enzimas de restricción en el vector de expresión seleccionado. Puede emplearse una variedad de vectores de expresión. Un ejemplo de un vector adecuado es pBR322 (derivado de E. coli; véase Bolivar et al., Gene, 2:95 (1977)) que contiene genes para la resistencia a ampicilina y tetraciclina. El vector se digiere con enzima de restricción y se desfosforila. Las secuencias amplificadas por PCR se ligan luego en el vector. El vector incluirá preferiblemente secuencias que codifiquen un gen de resistencia a antibióticos, un promotor trp, un líder poli-His (incluidos los primeros seis codones STII, la secuencia poli-His y el sitio de escisión de la enteroquinasa), la secuencia de aminoácidos específica de interés/región codificante del polipéptido, terminador transcripcional lambda y un gen argU.
La mezcla de ligación se usa luego para transformar una cepa de E. coli seleccionada usando los métodos descritos en Sambrook et al., citado anteriormente. Los transformantes se identifican por su capacidad para crecer en placas de LB y luego se seleccionan las colonias resistentes a los antibióticos. El ADN plasmídico se puede aislar y confirmar mediante análisis de restricción y secuenciación del ADN.
Los clones seleccionados se pueden cultivar durante la noche en medio de cultivo líquido, tal como caldo LB complementado con antibióticos. El cultivo de la noche a la mañana puede usarse posteriormente para inocular un cultivo a mayor escala. A continuación, las células se cultivan hasta una densidad óptica deseada, durante la cual se activa el promotor de expresión.
Después de cultivar las células durante varias horas más, las células se pueden recolectar mediante centrifugación. El sedimento celular obtenido por centrifugación se puede solubilizar usando varios agentes conocidos en la técnica, y la secuencia de aminoácidos solubilizada de interés o polipéptido puede luego purificarse usando una columna quelante de metales en condiciones que permitan una unión estrecha de la proteína.
Los cebadores pueden contener sitios de enzimas de restricción que corresponden a los sitios de enzimas de restricción en el vector de expresión seleccionado y otras secuencias útiles que proporcionan un inicio de traducción eficaz y fiable, purificación rápida en una columna de quelación de metales y eliminación proteolítica con enteroquinasa. Las secuencias etiquetadas con poli-His amplificadas por PCR se pueden ligar en un vector de expresión usado para transformar un huésped E. coli basado, por ejemplo, en la cepa 52 (W3110 fuhA (tonA) Ion galE rpoHts (htpRts) clpP (lacIq). Los transformantes se pueden cultivar primero en LB que contiene 50 mg/ml de carbenicilina a 30 °C con agitación hasta alcanzar una DO600 de 3-5. Luego, los cultivos se diluyen 50-100 veces en medio C RAP (preparado mezclando 3,57 g (NH4)2SO4, 0,71 g de citrato de sodio-2H2O, 1,07 g de KCl, 5,36 g de extracto de levadura Difco, 5,36 g de Sheffield Hy-Case SF en 500 ml de agua, así como MPOS 110 mM, pH 7,3, glucosa al 0,55% (p/v) y MgSO47 mM) y se cultivaron durante aproximadamente 20-30 horas a 30 °C con agitación. Se extrajeron muestras para verificar la expresión mediante análisis SDS-PAGE, y el cultivo en masa se centrifugó para sedimentar las células. Los sedimentos celulares se congelaron hasta la purificación y replegamiento.
Se resuspendió pasta de E. coli de fermentaciones de 0,5 a 1 l (6-10 g de gránulos) en 10 volúmenes (p/v) en guanidina 7 M, Tris 20 mM, tampón pH 8. Se añaden sulfito de sodio sólido y tetrationato de sodio para obtener concentraciones finales de 0,1 M y 0,02 M, respectivamente, y la solución se agitó durante la noche a 4 °C. Esta etapa da como resultado una proteína desnaturalizada con todos los residuos de cisteína bloqueados por sulfitolización. La solución se centrifugó a 40.000 rpm en una ultracentrífuga Beckman durante 30 min. El sobrenadante se diluyó con 3-5 volúmenes de tampón de columna de quelato metálico (guanidina 6 M, Tris 20 mM, pH 7,4) y se filtró a través de filtros de 0,22 micrómetros para aclarar. Dependiendo del extracto clarificado, se cargó en una columna de quelato metálico Qiagen Ni-NTA de 5 milésimas de pulgada equilibrada en el tampón de columna de quelato metálico. La columna se lavó con tampón adicional que contenía imidazol 50 mM (Calbiochem, grado Utrol), pH 7,4. La proteína se eluyó con tampón que contenía imidazol 250 mM. Las fracciones que contenían la proteína deseada se agruparon y almacenaron a 4 °C. La concentración de proteína se estimó por su absorbancia a 280 nm usando el coeficiente de extinción calculado basado en su secuencia de aminoácidos.
Expresión de tramos consecutivos de aminoácidos en células de mamíferos
Este ejemplo general ilustra una preparación de una forma glicosilada de una secuencia de aminoácidos deseada de interés o componente polipeptídico mediante expresión recombinante en células de mamífero.
El vector pRK5 (véase el documento EP 307.247, publicado el 15 de marzo de 1989) se puede emplear como vector de expresión. Opcionalmente, el ADN codificante se liga en pRK5 con enzimas de restricción seleccionadas para permitir la inserción del ADN usando métodos de ligación como los descritos en Sambrook et al., citado anteriormente.
En una variante, las células huésped seleccionadas pueden ser células 293. Se cultivan células 293 humanas (ATCC CCL 1573) hasta la confluencia en placas de cultivo de tejidos en un medio tal como DMEM suplementado con suero de ternero fetal y, opcionalmente, componentes nutritivos y/o antibióticos. Aproximadamente 10 |jg del ADN del vector ligado se mezclan con aproximadamente 1 jg de ADN que codifica el gen de ARN de VA [Thimmappaya et al., Cell 31: 543 (1982)] y se disuelven en 500 |jl de Tris-HCl 1 mM, EDTA 0,1 mM, CaCl20,227 M. A esta mezcla se le añade, gota a gota, 500 j l de HEPES 50 mM (pH 7,35), NaCl 280 mM, NaPO41,5 mM y se deja que se forme un precipitado durante 10 minutos a 25 °C. El precipitado se suspende y se añade a las células 293 y se deja reposar durante aproximadamente cuatro horas a 37 °C. Se aspira el medio de cultivo y se añaden 2 ml de glicerol al 20% en PBS durante 30 segundos. A continuación, las células 293 se lavan con medio libre de suero, se añade medio fresco y las células se incuban durante aproximadamente 5 días.
Aproximadamente 24 horas después de las transfecciones, el medio de cultivo se retira y se reemplaza con medio de cultivo (solo) o medio de cultivo que contiene 200 jC i/ml de 35S-cisteína y 200 jCi/ml de 35S-metionina. Después de una incubación de 12 horas, el medio acondicionado se recoge, se concentra en un filtro giratorio y se carga en un gel de SDS al 15%. El gel procesado se puede secar y exponer a una película durante un período de tiempo seleccionado para revelar la presencia de la secuencia de aminoácidos de interés o componente polipeptídico. Los cultivos que contienen células transfectadas pueden someterse a incubación adicional (en medio sin suero) y el medio se prueba en bioensayos seleccionados.
En una técnica alternativa, la secuencia de aminoácidos de ácido nucleico de interés o el componente polipeptídico se puede introducir en células 293 de forma transitoria usando el método de sulfato de dextrano descrito por Somparyrac et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 12: 7575 (1981). Se cultivan células 293 hasta la densidad máxima en un matraz giratorio y se añaden 700 jg del vector ligado. En primer lugar, las células se concentran del matraz giratorio mediante centrifugación y se lavan con PBS. El precipitado de ADN-dextrano se incuba en el sedimento celular durante cuatro horas. Las células se tratan con glicerol al 20% durante 90 segundos, se lavan con medio de cultivo de tejidos y se vuelven a introducir en el matraz giratorio que contiene medio de cultivo de tejidos, 5 jg/m l de insulina bovina y 0,1 jg/m l de transferrina bovina. Después de aproximadamente cuatro días, el medio acondicionado se centrifuga y se filtra para eliminar las células y los desechos. La muestra que contiene la secuencia de aminoácidos de interés expresada o el componente polipeptídico puede luego concentrarse y purificarse mediante cualquier método seleccionado, tal como diálisis y/o cromatografía en columna.
En otra realización, la secuencia de aminoácidos de interés o el componente polipeptídico se puede expresar en células CHO. La secuencia de aminoácidos de interés o el componente polipeptídico se puede transfectar en células CHO usando reactivos conocidos tales como CaPO4 o DEAE-dextrano. Como se describió anteriormente, los cultivos celulares se pueden incubar y el medio se puede reemplazar con medio de cultivo (solo) o medio que contenga un radiomarcador tal como 35S-metionina. Después de determinar la presencia de la secuencia de aminoácidos de interés o del componente polipeptídico, el medio de cultivo puede reemplazarse con medio libre de suero. Preferiblemente, los cultivos se incuban durante aproximadamente 6 días y luego se recolecta el medio acondicionado. A continuación, el medio que contiene la secuencia de aminoácidos de interés expresada o el componente polipeptídico puede concentrarse y purificarse mediante cualquier método seleccionado.
La secuencia de aminoácidos de interés etiquetada con epítopo o el componente polipeptídico también se puede expresar en células CHO huésped. La secuencia de aminoácidos de interés o el componente polipeptídico puede subclonarse a partir de un vector pRK5. El inserto del subclón puede someterse a PCR para fusionarse en marco con una etiqueta de epítopo seleccionada, tal como una etiqueta poli-His, en un vector de expresión de baculovirus. La secuencia de aminoácidos de interés etiquetada con poli-His o el inserto del componente polipeptídico puede subclonarse luego en un vector dirigido por SV40 que contiene un marcador de selección tal como DHFR para la selección de clones estables. Finalmente, las células CHO se pueden transfectar (como se describió anteriormente) con el vector dirigido por SV40. El etiquetado se puede realizar, como se describió anteriormente, para verificar la expresión. El medio de cultivo que contiene la secuencia de aminoácidos de interés expresada etiquetada con poli-His o el componente polipeptídico puede luego concentrarse y purificarse mediante cualquier método seleccionado, tal como mediante cromatografía de afinidad de quelato de Ni2+.
En una realización, la secuencia de aminoácidos de interés o el componente polipeptídico se expresan como un constructo de IgG (inmunoadhesina), en la que las secuencias codificantes de las formas solubles (por ejemplo, dominios extracelulares) de las proteínas respectivas se fusionan con una secuencia de región constante de IgG1 que contiene los dominios bisagra, CH2 y CH2 y/o es una forma etiquetada con poli-His.
Después de la amplificación por PCR, los ADN respectivos se subclonan en un vector de expresión de CHO usando técnicas estándar como se describe en Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Biology, Unidad 3.16, John Wiley and Sons (1997). Los vectores de expresión de CHO se construyen para que tengan sitios de restricción 5' y 3' compatibles del ADN de interés para permitir el transporte conveniente de los ADNc. El vector usado en la expresión en células CHO es como se describe en Lucas et al., Nucl. Acids Res. 24: 9 (1774-1779 (1996), y usa el promotor/potenciador temprano de SV40 para impulsar la expresión del ADNc de interés y la dihidrofolato reductasa (DHFR). La expresión de DHFR permite la selección para el mantenimiento estable del plásmido después de la transfección.
Expresión del tramo de aminoácidos consecutivos en levadura
El siguiente método describe la expresión recombinante de una secuencia de aminoácidos deseada de interés o componente polipeptídico en levadura.
En primer lugar, se construyen vectores de expresión de levadura para la producción o secreción intracelular de un tramo de aminoácidos consecutivos del promotor ADH2/GAPDH. El ADN que codifica una secuencia de aminoácidos deseada de interés o componente polipeptídico, un péptido señal seleccionado y el promotor se insertan en sitios de enzimas de restricción adecuados en el plásmido seleccionado para dirigir la expresión intracelular de la secuencia de aminoácidos de interés o componente polipeptídico. Para la secreción, el ADN que codifica el tramo de aminoácidos consecutivos se puede clonar en el plásmido seleccionado, junto con el ADN que codifica el promotor ADH2/GAPDH, la secuencia líder/señal secretora del factor alfa de levadura y las secuencias enlazadoras (si es necesario) para la expresión de el tramo de aminoácidos consecutivos.
Las células de levadura, tales como la cepa de levadura AB110, pueden transformarse luego con los plásmidos de expresión descritos anteriormente y cultivarse en medios de fermentación seleccionados. Los sobrenadantes de levadura transformados se pueden analizar por precipitación con ácido tricloroacético al 10% y separación por SDS-PAGE, seguido de tinción de los geles con tinción de azul de Coomassie.
La secuencia de aminoácidos recombinante de interés o el componente polipeptídico se puede aislar y purificar posteriormente eliminando las células de levadura del medio de fermentación mediante centrifugación y luego concentrando el medio usando filtros de cartucho seleccionados. El concentrado que contiene la secuencia de aminoácidos de interés o el componente polipeptídico puede purificarse adicionalmente usando resinas de cromatografía en columna seleccionadas.
Expresión de tramos de aminoácidos consecutivos en células de insectos infectadas con baculovirus
El siguiente método describe la expresión recombinante de tramos de aminoácidos consecutivos en células de insecto infectadas con baculovirus.
El ácido nucleico deseado que codifica el tramo de aminoácidos consecutivos se fusiona secuencia arriba de una etiqueta de epítopo contenida con un vector de expresión de baculovirus. Dichas etiquetas de epítopo incluyen etiquetas poli-His y etiquetas de inmunoglobulina (como las regiones Fc de IgG). Puede emplearse una variedad de plásmidos, incluidos plásmidos derivados de plásmidos disponibles comercialmente tales como pVL1393 (Novagen). Brevemente, la secuencia de aminoácidos de interés o componente polipeptídico o la porción deseada de la secuencia de aminoácidos de interés o componente polipeptídico (como la secuencia que codifica el dominio extracelular de una proteína transmembrana) se amplifica mediante PCR con cebadores complementarios a las regiones 5' y 3'. El cebador 5' puede incorporar sitios de enzimas de restricción flanqueantes (seleccionados). A continuación, el producto se digiere con las enzimas de restricción seleccionadas y se subclona en el vector de expresión.
El baculovirus recombinante se genera cotransfectando el plásmido anterior y el ADN del virus BaculoGoldMR (Pharmingen) en células de Spodoptera frugiperda ("Sf9") (ATCC CRL 1711) usando lipofectina (disponible comercialmente a través de GIBCO-BRl ). Después de 4-5 días de incubación a 28 °C, los virus liberados se recolectan y se usan para amplificaciones adicionales. La infección viral y la expresión de proteínas se llevan a cabo como describen O'Reilley et al., Baculovirus expression vectors: A Laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994).
La secuencia de aminoácidos de interés o el componente polipeptídico expresado marcado con poli-His se puede purificar, por ejemplo, mediante cromatografía de afinidad de quelato de Ni2+ como sigue. Los extractos se preparan a partir de células Sf9 infectadas con virus recombinantes como describen Rupert et al., Nature, 362: 175-179 (1993). Brevemente, las células Sf9 se lavan, se resuspenden en tampón de sonicación (25 ml de Hepes, pH 7,9; MgCh 12,5 mM; EDTA 0,1 mM; Glicerol al 10%; NP40 al 0,1%; KCl 0,4 m ) y se sonican dos veces durante 20 segundos en hielo. Los sonicados se aclaran por centrifugación y el sobrenadante se diluye 50 veces en tampón de carga (fosfato 50 mM, NaCl 300 mM, glicerol al 10%, pH 7,8) y se filtra a través de un filtro de 0,45 |jm. Se prepara una columna de agarosa Ni2+-NTA (disponible comercialmente a través de Qiagen) con un volumen de lecho de 5 ml, se lava con 25 ml de agua y se equilibra con 25 ml de tampón de carga. El extracto celular filtrado se carga en la columna a razón de 0,5 ml por minuto. La columna se lava hasta una A280 de línea base con tampón de carga, momento en el que se inicia la recogida de fracciones. A continuación, la columna se lava con un tampón de lavado secundario (fosfato 50 mM; NaCl 300 mM, glicerol al 10%, pH 6,0), que eluye la proteína unida inespecíficamente. Después de alcanzar la línea base de A280 nuevamente, la columna se desarrolla con un gradiente de imidazol de 0 a 500 mM en el tampón de lavado secundario. Se recogen fracciones de un ml y se analizan mediante SDS-PAGE y tinción con plata o transferencia Western con Ni2+-NTA conjugado con fosfatasa alcalina (Qiagen). Las fracciones que contienen la secuencia eluida marcada con His10 se combinan y se dializan frente al tampón de carga.
Alternativamente, la purificación de la secuencia de aminoácidos etiquetada con IgG (o etiquetada con Fc) se puede realizar usando técnicas de cromatografía conocidas, que incluyen, por ejemplo, cromatografía en columna de proteína A o proteína G. Los constructos de proteínas de inmunoadhesina (que contienen Fc) pueden purificarse a partir de medios acondicionados como sigue. El medio acondicionado se bombea a una columna de Proteína A de 5 ml (Pharmacia) que se equilibra en tampón de fosfato de sodio 20 mM, pH 6,8. Después de la carga, la columna se lava extensamente con tampón de equilibrio antes de la elución con ácido cítrico 100 mM, pH 3,5. La proteína eluida se neutraliza inmediatamente recogiendo fracciones de 1 ml en tubos que contienen 275 ml de tampón Tris 1 M, pH 9. La proteína altamente purificada se desala posteriormente en tampón de almacenamiento como se describió anteriormente para las proteínas etiquetadas con poli-His. La homogeneidad de las proteínas se verifica mediante electroforesis en gel de poliacrilamida (PEG) SDS y secuenciación de aminoácidos del terminal N mediante degradación de Edman.
Síntesis del terminal C basada en inteína
Como se describe, por ejemplo, en la patente de los Estados Unidos No. 6.849.428, expedida el 1 de febrero de 2005, las inteínas son el equivalente proteico de los intrones de ARN auto-empalmados (véase Perler et al., Nucleic Acids Res. 22: 1125- 1127 (1994)), que catalizan su propia escisión a partir de una proteína precursora con la fusión concomitante de las secuencias de proteínas flanqueantes, conocidas como exteínas (revisado en Perler et al., Curr. Opin. Chem. Biol. 1: 292-299 ( 1997); Perler, FB Cell 92 (1): 1-4 (1998); Xu et al., EMBO J. 15 (19): 5146-5153 (1996)).
Los estudios sobre el mecanismo de empalme de inteína condujeron al desarrollo de un sistema de purificación de proteínas que utilizó la escisión inducida por tiol del enlace peptídico en el terminal N de la inteína Sce VMA (Chong et al., Gene 192 (2): 271-281 (1997)). La purificación con este sistema mediado por inteína genera una proteína expresada por bacterias con un tioéster del terminal C (Chong et al., (1997)). En una aplicación, en la que se describe el aislamiento de una proteína citotóxica, la proteína expresada en bacterias con el tioéster del terminal C se fusiona luego con un péptido sintetizado químicamente con una cisteína del terminal N usando la química descrita para "ligación química nativa" (Evans et al., Protein Sci. 7: 2256-2264 (1998); Muir et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 6705-6710 (1998)).
Esta técnica, denominada "ligadura de proteínas mediada por inteína" (IPL), representa un avance importante en las técnicas semisintéticas de proteínas. Sin embargo, debido a que los péptidos sintetizados químicamente de más de aproximadamente 100 residuos son difíciles de obtener, la aplicación general de IPL se vio limitada por el requisito de un péptido sintetizado químicamente como compañero de ligación.
La tecnología IPL se expandió significativamente cuando se generó una proteína expresada con un terminal N predeterminado, tal como cisteína, como se describe, por ejemplo, en la patente de los Estados Unidos No. 6.849.428. Esto permite la fusión de una o más proteínas expresadas de una célula huésped, como células bacterianas, de levadura o de mamífero. En un ejemplo no limitante, se usa la inteína en un Methanobacterium thermoautotrophicum RIR1 modificado que se escinde en el terminal C o en el terminal N, lo que permite la liberación de una proteína expresada en bacterias durante una purificación en columna, eliminando así completamente la necesidad de proteasas.
La tecnología de inteína es un ejemplo de una ruta para obtener componentes. En una realización, las subunidades de los compuestos divulgados en el presente documento se obtienen transfectando células adecuadas, capaces de expresar y secretar polipéptidos quiméricos maduros, en los que dichos polipéptidos comprenden, por ejemplo, un dominio de adhesina contiguo a un dominio de inteína del terminal C aislable (véase la patente de los Estados Unidos No. 6.849.428, Evans et al., expedida el 1 de febrero de 2005). Las células, tales como células de mamíferos o células bacterianas, se transfectan usando técnicas conocidas de ADN recombinante. A continuación, se puede aislar el polipéptido quimérico secretado, por ejemplo, usando una resina derivatizada de quitina en el caso de un dominio de unión de inteína-quitina (véase la patente de los Estados Unidos No. 6.897.285, Xu et al., expedida el 24 de mayo de 2005), y luego se trata en condiciones que permiten la escisión mediada por tiol y la liberación de la ahora subunidad de adhesión del terminal C terminada en tioéster. La subunidad de adhesión terminada en tioéster se convierte fácilmente en una subunidad terminada en cisteína del terminal C.
Estas subunidades se pueden tratar en condiciones oxidantes para permitir la formación de, por ejemplo, un enlace disulfuro entre los dos residuos de cisteína terminales, formando así una simetroadhesina. Además, esta técnica puede usarse para preparar las subunidades híbridas de simetroadhesina-Fc tratando los heterodímeros de adhesión-Fc individuales en condiciones que permitan la formación de enlaces entre las porciones Fc de los heterodímeros.
Ejemplo 1
Preparación de Fc de inmunoglobulina con el extremo S del terminal N (S-Fc)
La digestión de inmunoglobulina (IgG) con papaína produce dos fragmentos Fab y un fragmento Fc (Porter (1959) Biochem. 73, 119-126). El sitio de proteólisis en la IgG humana es la región bisagra de la cadena pesada entre los residuos cys-5 y cys-11, EPKSCd Kt HTCPPCP, (Fleischman et al., Biochem J. (1963) 88, 220-227; Edelman et al., (1969) Proc. Natl. Acad. Sci. 63, 78-85). El residuo cys-5 normalmente forma un enlace disulfuro con la cadena ligera de IgG humana, que se escinde fácilmente en condiciones reductoras suaves, lo que lo convierte en un candidato ideal para moléculas similares a Fc con el extremo S del terminal N (S-Fc).
En consecuencia, las células huésped se transfectaron con vectores de expresión que codifican polipéptidos quiméricos pre-Fc de IgG1 que consisten en un péptido señal unido en su terminal C por un enlace peptídico al terminal N de un dominio Fc que comienza en el residuo cys-5, CDKTHTCPPCP (Figura 35A). Los péptidos señal heterólogos usados se seleccionan de proteínas con cisteínas del terminal N (parte i). Por lo tanto, la escisión por la peptidasa señal celular proporcionará una proteína S-Fc madura que tiene cys-5 en el terminal N (parte ii).
Las secuencias de los polipéptidos precursores de IgG1 de la Figura 35A se muestran en la SEQ ID NO: 32, la SEQ ID NO: 33 y la SEQ ID NO: 34. La secuencia del polipéptido de IgG1 maduro de la Figura 35A se muestra en la SEQ ID NO: 35. Otros polipéptidos IgG1 maduros preparados mediante métodos descritos en los Ejemplos 1 a 5 se muestran en la Se Q iD NO: 36 a la SEQ ID NO: 46.
Las células huésped se transfectan con vectores de expresión que codifican polipéptidos quiméricos pre-Fc de IgG2 que consisten en un péptido señal unido en su terminal C por un enlace peptídico al terminal N de un dominio Fc que comienza en el residuo cys-4, CCVECPPCP (Figura 35B). Los péptidos señal heterólogos usados se seleccionan de proteínas con cisteínas del terminal N (parte i). Por lo tanto, la escisión por la peptidasa señal celular proporcionará una proteína S-Fc madura que tiene cys-4 en el terminal N (parte ii).
Las secuencias de los polipéptidos precursores de IgG2 de la Figura 35B se muestran en la SEQ ID NO: 50, la SEQ ID NO: 51 y la SEQ ID NO: 52. La secuencia del polipéptido de IgG2 maduro de la Figura 35B se muestra en la SEQ ID NO: 53. Otros polipéptidos de IgG2 maduros preparados mediante los métodos descritos en los Ejemplos 1 a 5 se muestran en la s Eq Id NO: 54 a la SEQ ID NO: 67.
Las células huésped se transfectan con vectores de expresión que codifican polipéptidos quiméricos pre-Fc de IgG3 que consisten en un péptido señal unido en su terminal C por un enlace peptídico al terminal N de un dominio Fc que comienza en el residuo cys-13, CPRCP (Figura 35C). Los péptidos señal heterólogos usados se seleccionan de proteínas con cisteínas del terminal N (parte i). Por lo tanto, la escisión por la peptidasa señal celular proporcionará una proteína S-Fc madura que tiene cys-13 en el terminal N (parte ii).
Las secuencias de los polipéptidos precursores de IgG3 de la Figura 35C se muestran en la SEQ ID NO: 71, la SEQ ID NO: 72 y la SEQ ID NO: 73. La secuencia del polipéptido de IgG3 maduro de la Figura 35C se muestra en la SEQ ID NO: 74. Otros polipéptidos de IgG2 maduros preparados mediante los métodos descritos en los Ejemplos 1 a 5 se muestran en la s Eq Id NO: 75 a la SEQ ID NO: 82.
Las células huésped se transfectan con vectores de expresión que codifican polipéptidos quiméricos pre-Fc de IgG4 que consisten en un péptido señal unido en su terminal C por un enlace peptídico al terminal N de un dominio Fc que comienza en el residuo cys-8, CPSCP (Figura 35D). Los péptidos señal heterólogos usados se seleccionan de proteínas con cisteínas del terminal N (parte i). Por lo tanto, la escisión por la peptidasa señal celular proporcionará una proteína S-Fc madura que tiene cys-8 en el terminal N (parte ii).
Las secuencias de los polipéptidos precursores de IgG4 de la Figura 35D se muestran en la SEQ ID NO: 86, la SEQ ID NO: 87 y la SEQ ID NO: 88. La secuencia del polipéptido de IgG4 maduro de la Figura 35D se muestra en la SEQ ID NO: 89. Otros polipéptidos de IgG4 maduros preparados mediante los métodos descritos en los Ejemplos 1 a 5 se muestran en la s Eq Id NO: 90 a la SEQ ID NO: 97.
Las células huésped adecuadas incluyen células embrionarias humanas 293 (ATCC CRL-1573) y células de ovario de hámster CHO-K1 (ATCC CCL-61) obtenidas de la American Type Culture Collection (Rockville, Maryland). Las células se cultivan a 37 °C en una atmósfera de aire, 95%; dióxido de carbono, 5%. Las células 293 se mantienen en medio esencial mínimo (Eagle) con L-glutamina 2 mM y BSS de Earle ajustada para contener 1,5 g/l de bicarbonato de sodio, aminoácidos no esenciales 0,1 mM y piruvato de sodio 1,0 mM, 90%; suero fetal bovino, 10%. Las células CHO-K1 se mantienen en medio F12K de Ham con L-glutamina 2 mM ajustada para contener 1,5 g/l de bicarbonato de sodio, 90%; suero fetal bovino, 10%. Otras células huésped adecuadas incluyen células de riñón de mono CV1 (ATCC CCL-70), células de riñón de mono COS-7 (ATCC Cr L-1651), células de riñón de mono VERO-76 (ATCC CRL-1587), células cervicales humanas HELA (At Cc CCL-2), células de pulmón humano W138 (ATCC c Cl-75), células de riñón canino MDCK (ATCC CCL-34), células de hígado de rata BRL3A (ATCC CRL-1442), células renales de hámster BHK (ATCC CCL-10), células mamarias de ratón MMT060562 (a Tc C CCL-51) y linfocitos T CD8+ humanos (descritos en el documento U.S.S.N.08/258.152).
Un ejemplo de un vector de expresión adecuado es el plásmido pSA (SEQ ID NO: 1). El plásmido pSA contiene los siguientes elementos de secuencia de ADN: 1) pBluescriptIIKS (+) (nucleótidos 912 a 2941/1 a 619, GenBank Acceso No. X52327), 2) un promotor de citomegalovirus humano, potenciador y un primer donante de empalme de exón (nucleótidos 63 a 912, GenBank Acceso No. K03104), 3) un aceptor de empalme de segundo exón de alfa1-globina humana (nucleótidos 6808 a 6919, GenBank Acceso No. J00153), 4) un sitio de poliadenilación del antígeno T de SV40 (nucleótidos 2770 a 2533, Reddy et al., (1978) Science 200, 494-502), y 5) un origen de replicación de SV40 (nucleótidos 5725 a 5578, Reddy et al., Ibídem). Para la expresión del polipéptido de interés, se inserta un fragmento de ADN EcoRI-BglII que codifica el polipéptido en el plásmido pSA entre los sitios de restricción EcoRI y BglII ubicados en las posiciones 1.608 y 1.632, respectivamente. Otros vectores de expresión adecuados incluyen los plásmidos pSVeCD4DHFR y pRKcD4 (patente de los Estados Unidos No. 5.336.603), plásmido pIK.1.1 (patente de los Estados Unidos No 5.359.046), plásmido pVL-2 (patente de los Estados Unidos No. 5.838.464), plásmido pRT43.2F3 (descrito en el documento Us Sn 08/258.152) y el plásmido pCADN3.1(+) (Invitrogen, Inc.).
Los marcadores seleccionables adecuados incluyen el gen de neomicina fosfotransferasa (NEO) del transposón Tn5 (Southern y Berg (1982) J. Mol. Appl. Gen.1, 327-341), y el ADNc de dihidrofolato reductasa (DHFR) (Lucas et al. (1996) Nucl. Acids Res. 24, 1774-1779). Un ejemplo de un vector de expresión adecuado que incorpora un gen NEO es el plásmido pSA-NEO, que se construye ligando un primer fragmento de ADN, preparado al digerir la SEQ ID NO: 2 con EcoRI y BglII, con un segundo fragmento de ADN, preparado digiriendo la SEQ ID NO: 1 con EcoRI y BglII. La SEQ ID NO: 2 incorpora un gen NEO (nucleótidos 1551 a 2345, GenBank Acceso No. U00004) precedido por una secuencia para el inicio de la traducción (Kozak (1991) J. Biol. Chem, 266, 19867-19870). Otro ejemplo de un vector de expresión adecuado que incorpora un gen NEO y un ADNc de DHFR es el plásmido pSVe-NEO-DHFR, que se construye ligando un primer fragmento de ADN, preparado al digerir la SEQ ID NO: 2 con EcoRI y BglII, con un segundo fragmento de ADN, preparado digiriendo pSVeCD4DHFR con EcoRI y BglII. El plásmido pSVe-NEO-DHFR utiliza promotores/potenciadores tempranos de SV40 para impulsar la expresión del gen NEO y el ADNc de DHFR. Otros marcadores seleccionables adecuados incluyen el gen XPGT (Mulligan y Berg (1980) Science 209, 1422-1427) y el gen de resistencia a higromicina (Sugden et al., (1985) Mol. Cell. Biol. 5, 410-413).
Las secuencias de ADN de IgG1 humana se describen en Ellison et al., (1982) Nucl. Acids Res. 10, 4071-4079) (GenBank acceso No. Z17370).
Los ejemplos adecuados de péptidos señal son erizo Sonic (SHH) (GenBank acceso No. NM_000193), interferón a-2 (IFN) (GenBank acceso No. Np_000596) y éster transferasa de colesterol (CETP) (GenBank Acceso No. NM_000078). Otros ejemplos adecuados incluyen erizo indio (GenBank acceso No. NM_002181), erizo del desierto (GenBank acceso No. NM_021044), IFNa-1 (GenBank acceso No. NP_076918), IFNa-4 (GenBank acceso No. NM_021068), IFNa-5 (GenBank acceso No. NM_002169), IFNa-6 (GenBank acceso No. NM_021002), IFNa-7 (GenBank acceso No. NM_021057), IFNa-8 (GenBank acceso No. NM_002170), IFNa-10 (GenBank acceso No. NM_002171), IFNa-13 (GenBank acceso No. n M_006900), IFNa-14 (GenBank acceso No. NM_002172), IFNa-16 (GenBank acceso No. NM_002173), IFNa-17 (GenBank acceso No. NM_021268) e IFNa-21 (GenBank acceso No. NM_002175).
Los vectores de expresión adecuados se construyen mediante ligación de un inserto y un fragmento de vector preparado por digestión con EcoRI y BglII. Para la expresión no amplificada, el plásmido pSHH-Fc5 (señal de SHH) se construye usando la SEQ ID NO: 3 y la SEQ ID NO: 1, el plásmido pIFN-Fc5 (señal de IFN) se construye usando la SEQ ID NO: 4 y la SEQ ID NO: 1 y el plásmido pCETP-Fc5 (señal de CETP) se construye usando la Se Q ID NO: 3 y la SEQ ID NO: 1. Para la expresión amplificada, el plásmido pSHH-Fc5-DHFR se construye usando la SEQ ID NO: 3 y pSVeCD4DHFR (patente de Estados Unidos No. 5.336.603), pIFN-Fc5-DHFR se construye usando la SEQ ID NO: 4 y pSVeCD4DHFR, y pCETP-Fc5-DHFR se construye usando la SEQ ID NO: 5 y pSVeCD4DHFR.
Se construyeron vectores de expresión adecuados para polipéptidos de Fc de IgG1 humanos mediante ligación de un fragmento de inserto preparado mediante digestión con Hind III y EagI y un fragmento de vector preparado mediante digestión con Hind III y PspOM1. El plásmido pCADN3-SHH-IgG1-Fc (señal de SHH) se construyó usando la SEQ ID NO: 29 y pCADN3.1(+), el plásmido pCADN3-IFN-IgG1-Fc (señal de IFN) se construyó usando la SEQ ID NO: 30 y pCADN3.1(+), y se construyó el plásmido pCADN3-IgG1-Fc (señal de CETP) usando la SEQ ID NO: 31 y pCADN3.1 (+).
Los vectores de expresión adecuados para polipéptidos de Fc de IgG2 humanos se construyen mediante ligación de un fragmento de inserto preparado por digestión con Hind III y EagI y un fragmento de vector preparado por digestión con Hind III y PspOM1. El plásmido pCADN3-SHH-IgG2-Fc (señal de SHH) se construye usando la SEQ ID NO: 47 y pCADN3.1(+), el plásmido pCADN3-IFN-IgG2-Fc (señal de IFN) se construye usando la SEQ ID NO: 48 y pCADN3.1 (+), y el plásmido pCADN3-IgG2-Fc (señal de CeTp ) se construye usando la SEQ ID NO: 49 y pCADN3.1(+).
Los vectores de expresión adecuados para polipéptidos de Fc de IgG3 humanos se construyen por ligación de un fragmento de inserto preparado por digestión con Hind III y EagI y un fragmento de vector preparado por digestión con Hind III y PspOM1. El plásmido pCADN3-SHH-IgG3-Fc (señal de SHH) se construye usando la SEQ ID NO: 68 y pCADN3.1(+), el plásmido pCADN3-IFN-IgG3-Fc (señal de IFN) se construye usando la SEQ ID NO: 69 y pCADN3 .1 (+), y el plásmido pCADN3-IgG3-Fc (señal de CeTp ) se construye usando la SEQ ID NO: 70 y pCADN3.1(+).
Los vectores de expresión adecuados para polipéptidos de Fc de IgG4 humanos se construyen mediante ligación de un fragmento de inserto preparado mediante digestión con Hind III y EagI y un fragmento de vector preparado mediante digestión con Hind III y PspOM1. El plásmido pCADN3-SHH-IgG4-Fc (señal de SHH) se construye usando la SEQ ID NO: 83 y pCADN3.1(+), el plásmido pCADN3-IFN-IgG4-Fc (señal de IFN) se construye usando la SEQ ID NO: 84 y pCADN3 .1(+), y el plásmido pCADN3-IgG4-Fc (señal de CETP) se construye usando la SEQ ID NO: 85 y pCADN3.1 (+).
En una realización, las células se transfectan mediante el método del fosfato de calcio de Graham et al. (1977) J. Gen. Virol. 36, 59-74. Se disuelve una mezcla de ADN (10 microgramos) en 0,5 ml de Tris-HCl 1 mM, EDTA 0,1 mM y CaCl2 227 mM. La mezcla de ADN contiene (en una proporción de 10: 1: 1) el ADN del vector de expresión, el ADN marcador seleccionable y un ADN que codifica el gen de ARN de VA (Thimmappaya et al. (1982) Cell 31, 543-551). A esta mezcla se le añade, gota a gota, 0,5 ml de Hepes 50 mM (pH 7,35), NaCl 280 mM y NaPO4 1,5 mM. Se deja que se forme el precipitado de ADN durante 10 minutos a 25 °C, luego se suspende y se añade a las células que crecen hasta confluencia en placas de cultivo de tejidos de plástico de 100 mm. Después de 4 horas a 37 °C, se aspira el medio de cultivo y se añaden 2 ml de glicerol al 20% en PBS durante 0,5 minutos. A continuación, las células se lavan con medio sin suero, se añade medio de cultivo fresco y las células se incuban durante 5 días.
En otra realización, las células se transfectan transitoriamente mediante el método de sulfato de dextrano de Somparyrac et al., (1981) Proc. Nat. Acad. Sci. 12, 7575-7579. Las células se cultivan hasta la máxima densidad en matraces giratorios, se concentran por centrifugación y se lavan con PBS. El precipitado de ADN-dextrano se incuba en el sedimento celular. Después de 4 horas a 37 °C, se aspira el DEAE-dextrano y se añade glicerol al 20% en PBS durante 1,5 minutos. A continuación, las células se lavan con medio sin suero y se vuelven a introducir en matraces giratorios que contienen medio de cultivo fresco con 5 |jg/ml de insulina bovina y 0,1 |jg/ml de transferencia bovina, y las células se incuban durante 4 días. Después de la transfección por cualquiera de los métodos, el medio acondicionado se centrifuga y se filtra para eliminar las células huésped y los desechos. La muestra que contiene el dominio S-Fc se concentra y purifica luego mediante cualquier método seleccionado, como diálisis y/o cromatografía en columna (véase más abajo).
Para identificar el S-Fc en el sobrenadante del cultivo celular, el medio de cultivo se retira 24 horas después de la transfección y se reemplaza con medio de cultivo que contiene 200 microCi/ml cada uno de 35S-metionina y 35S-cisteína. Después de una incubación de 12 horas, el medio acondicionado se recoge por centrifugación para eliminar las células huésped y los desechos, y se concentra en un filtro de diálisis giratorio. Los sobrenadantes marcados se analizan mediante inmunoprecipitación con perlas de proteína A sefarosa en ausencia de anticuerpos añadidos. Las proteínas precipitadas se analizan en geles de poliacrilamida-SDS al 7,5% con o sin reducción con p-mercaptoetanol. El gel procesado se seca y se expone a una película de rayos X para revelar la presencia del dominio S-Fc.
Para la expresión no amplificada, los plásmidos pSHH-Fc-5, pIFN-Fc-5 y pCETP-Fc-5 se transfectan en células 293 humanas (Graham et al., J. Gen. Virol. 36:5974 (1977)), utilizando un procedimiento de alta eficacia (Gorman et al., DNA Prot. Eng. Tech. 2: 3 10 (1990)). Los medios se cambian a sin suero y se recolectan diariamente durante un máximo de cinco días. Las proteínas S-Fc se purifican del sobrenadante del cultivo celular usando proteína A-Sefarosa CL-4B (Pharmacia). La proteína S-Fc eluida se intercambia con tampón en PBS usando un Centricon-30 (Amicon), se concentra a 0,5 ml, se filtra de forma estéril usando un Millex-GV (Millipore) y se almacena a 4 °C.
Para la expresión no amplificada, los plásmidos pCADN3-SHH-IgG1-Fc, pCDA3-IFN-IgG1-Fc y pCDA-3-CETP-IgG1-Fc se transfectaron en células 293 humanas (Graham et al., J. Gen. Virol 36:5974 (1977)), usando un procedimiento de alta eficacia (Gorman et al., DNA Prot. Eng. Tech. 2: 310 (1990)). El medio se cambió a libre de suero y se recogió diariamente durante un máximo de cinco días. Las proteínas S-Fc se purificaron del sobrenadante del cultivo celular usando proteína A-Sefarosa CL-4B (Pharmacia). La proteína S-Fc eluida se intercambió con tampón en PBS usando un Centricon-30 (Amicon), se concentró a 0,5 ml, se esterilizó por filtración usando un Millex-GV (Millipore) y se almacenó a 4 °C.
La Figura 52 muestra la expresión en células de riñón 293 de subunidades de simetroadhesina de Fc de IgG1 humana con el extremo S del terminal N. Los carriles 1-6 y los carriles 7-12 muestran los polipéptidos de Fc de IgG1 de la Figura 35A (ii) y la Figura 36A (ii), respectivamente. Sobrenadantes celulares: carriles 1, 3, 5, 7, 9 y 11; lisados celulares: carriles 2, 4, 6, 8, 10 y 12. Secuencias señal utilizadas: SHH (carriles 1,2, 7 y 8); IFNA (carriles 3, 4, 9, 10); CETP (carriles 5, 6, 11 y 12).
La Figura 53 muestra la expresión en células 293 de riñón de subunidades de simetroadhesina de Fc de IgG1 humana. Los carriles 1-2, 3-4 y 5-6 muestran los polipéptidos de Fc de IgG1 de la Figura 35A (ii), Figura 36A (ii) y Figura 37B (ii), respectivamente. Sobrenadantes celulares: (carriles 1-6). Secuencias de señales utilizadas: SHH (carriles 1-6).
La Figura 54 muestra la purificación de la proteína A de las subunidades de simetroadhesina de Fc de IgG1 humana expresadas en células de riñón 293. Los carriles 2 y 8 muestran los polipéptidos de Fc de IgG1 de la Figura 36A y la Figura 35A, respectivamente. Carriles 1-7: fracciones de columna de proteína A-sefarosa para el polipéptido del Fc de IgG1 de la Figura 36A.
La Figura 55 muestra la unión de tiol-sefarosa de las subunidades de simetroadhesina de Fc de IgG1 humana purificada con proteína A mostradas en la Figura 54. Los carriles 1-3 y los carriles 4-6 muestran los polipéptidos de Fc de IgG1 humana de la Figura 35A y la Figura 36A, respectivamente. Carriles 1 y 4: material de partida; carriles 2 y 5: fracción de flujo continuo de tiol-sefarosa; carriles 3 y 6: fracción unida a tiol-sefarosa.
El análisis de los dos polipéptidos de Fc de IgG1 de la Figura 35A y la Figura 36A por espectrometría de masas (MALDI) revela masas moleculares promedio de 54.552,85 y 53.173,43 daltons, respectivamente. Suponiendo que cada masa molecular representa los dímeros de Fc correspondientes, la diferencia aparente en la masa molecular entre los dos polipéptidos (1379,4 daltons) está en buen acuerdo (desviación del 0,6%) con la diferencia prevista en la masa molecular (1371,5).
Para la expresión amplificada, se transfectan células de ovario de hámster chino (CHO) con vectores dicistrónicos pSHH-Fc5-DHFR, pIFN-Fc-5-DHFR y pCETP-Fc-5-DHFR que coexpresan un ADNc de DHFR. Los plásmidos se introducen en células CHO-K1 DUX B11 desarrolladas por L. Chasin (Universidad de Columbia) mediante lipofección y se seleccionan para su crecimiento en medio libre de GHT (Chisholm (1996) Chisholm (1996) High efficiency gene transfer in mammalian cells. En: Glover, D M, Hames, B D. DNA Cloning vol 4. Mammalian systems. Oxford Univ. Press, páginas 1-41). Aproximadamente 20 clones sin amplificar se eligen al azar y se vuelven a sembrar en placas de 96 pocillos. La productividad relativa específica de cada colonia se controla usando un ELISA para cuantificar la proteína S-Fc acumulada en cada pocillo después de 3 días y un tinte fluorescente, Calcien AM, como marcador sustituto del número de células viables por pocillo. Basándose en estos datos, se eligen varios clones no amplificados para una amplificación adicional en presencia de concentraciones crecientes de metotrexato. Los clones individuales que sobreviven en metotrexato 10, 50 y 100 nM se eligen y se transfieren a placas de 96 pocillos para la selección de la productividad. Los clones adecuados, que exhiben de forma reproducible una alta productividad específica, se expanden en matraces en T y se utilizan para inocular cultivos de centrifugado. Después de varios pases, las células adaptadas a la suspensión se utilizan para inocular cultivos de producción en medios libres de suero que contienen GHT suplementados con diversas hormonas e hidrolizados de proteínas. El fluido de cultivo celular recolectado que contiene la proteína S-Fc se purifica usando proteína A-Sefarosa CL-4B.
Ejemplo 2
Preparación de Fc de inmunoglobulina con el extremo X del terminal N (X-Fc)
La selenocisteína (sec) es el vigésimo primer aminoácido incorporado durante la síntesis de proteínas mediada por ribosomas (Zinoni et al., (1986) Proc. Natl Acad. Sci. 83, 4650-4654; Chambers et al., (1986) EMBO J. 5, 1221-1227). El proceso es complejo y distinto de la incorporación de cisteína, que requiere un elemento de inserción de selenocisteína de ARNm para decodificar un codón de terminación UGA. La semisíntesis de proteínas ofrece un medio alternativo para preparar moléculas similares a Fc que tienen un extremo X del terminal N (X-Fc) que comienzan en cisteína (cys) y/o selenocisteína (sec).
Por consiguiente, las células huésped se transfectan con constructos que codifican polipéptidos quiméricos pre-Fc que consisten en un péptido señal unido en su terminal C por un enlace peptídico al terminal N de un dominio Fc que comienza en cys-11, Cd KTHTCPPCP (Figura 36A) y cys-14, CDKTHt Cp PCP (Figura 36B). Los péptidos señal heterólogos usados se seleccionan de proteínas con cisteínas del terminal N (parte i). Por lo tanto, la escisión por la peptidasa señal celular proporcionará una proteína S-Fc madura que tiene cys-11 en el terminal N (parte ii). A continuación, se emplea la ligadura química nativa para preparar proteínas X-Fc maduras que tienen cys-5 o sec-5 en el terminal N, XDKTHTCPPCP (parte iii).
Las secuencias de los polipéptidos precursores de IgG1 de la Figura 36A se muestran en la SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102 y SEQ ID NO: 103. La secuencia del polipéptido de IgG1 maduro de la Figura 36A se muestra en la SEQ ID NO: 104. Las secuencias de los polipéptidos precursores de IgG1 de la Figura 36B se muestran en la SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110 y SEQ ID No : 111. La secuencia del polipéptido de IgG1 maduro de la Figura 35B se muestra en la SEQ ID NO: 112.
Por consiguiente, las células huésped se transfectan con constructos que codifican polipéptidos quiméricos pre-Fc que consisten en un péptido señal unido en su terminal C por un enlace peptídico al terminal N de un dominio Fc que comienza en cys-14, CDKTHTCPPCP (Figura 36B). Los péptidos señal heterólogos usados se seleccionan de proteínas con cisteínas del terminal N (parte i). Por lo tanto, la escisión por la peptidasa señal celular proporcionará una proteína S-Fc madura que tiene cys-11 en el terminal N (parte ii). A continuación, se emplea la ligadura química nativa para preparar proteínas X-Fc maduras que tienen cys-11 o sec-11 en el terminal N, XPPCP (parte iii).
Las proteínas S-Fc con cys-11 y cys-14 en el terminal N se preparan primero usando los procedimientos descritos en el Ejemplo 1. La ligadura química nativa se lleva a cabo con la proteína S-Fc y el péptido Fc-A (5-11: cys-asp-lys-thrhis-thr), o proteína S-Fc y péptido Fc-B (5-11: sec-asp-lys-thr-his-thr). Los vectores de expresión adecuados se construyen mediante ligación de un inserto y un fragmento de vector preparado por digestión con EcoRI y BglII. Para la expresión no amplificada, el plásmido pSHH-Fc11 (señal de SHH) se construye usando la SEQ ID NO: 6 y la SEQ ID n O: 1, el plásmido pIFN-Fc11 (señal de IFN) se construye usando la SEQ ID No 7 y la SEQ ID NO: 1 y el plásmido pCETP-Fc11 (señal de CETP) se construye usando la SEQ ID NO: 8 y la SEQ ID NO: 1. Para la expresión amplificada, el plásmido pSHH-Fc11-DHFR se construye usando la SEQ ID NO: 6 y pSVeCD4DHFR, el plásmido pIFN-Fc11-DHFR se construye usando la SEQ ID NO: 7 y pSVeCD4DHFR, y el plásmido pCETP-Fc11-DHFR se construye usando la SEQ ID NO: 8 y pSVeCD4DHFR.
Los vectores de expresión adecuados para Fc de IgG1 humana se construyen mediante ligación de un fragmento de inserto preparado mediante digestión con Hind III y EagI y un fragmento de vector preparado mediante digestión con Hind III y PspOM1. El plásmido pCADN3-SHH-IgG1-Fc11 (señal de SHH) se construye usando la SEQ ID NO: 98 y pCADN3.1(+), el plásmido pCADN3-IFN-IgG1-Fc11 (señal de IFN) se construye usando la SEQ ID NO: 99 y pCADN3.1 (+), y el plásmido pCADN3-IgG1-Fc11 (señal de CETP) se construye usando la SEQ ID NO: 100 y pCADN3.1(+). El plásmido pCADN3-SHH-IgG1-Fc14 (señal de SHH) se construye usando la SEQ ID NO: 106 y pCADN3.1(+), el plásmido pCADN3-IFN-IgG1-Fc14 (señal de IFN) se construye usando la SEQ ID NO: 107 y pCADN3 .1(+), y el plásmido pCADN3-IgG1-Fc14 (señal de CETP) se construye usando la SEQ ID NO: 108 y pCADN3.1(+).
Los principios generales de la ligadura química nativa se describen en la patente de los Estados Unidos No. 6.184.344. Los péptidos Fc-A y Fc-B se sintetizan usando una resina TAMPAL a partir de la cual se puede obtener fácilmente cualquier tioéster deseado. Después de la desprotección de los grupos protectores de la cadena lateral, los péptidos activados resultantes del terminal C se utilizan en la ligadura química nativa sin más modificaciones. Para prevenir la ciclación o polimerización de péptidos bifuncionales, la fracción sulfhidrilo (péptido Fc-A) y la fracción selenohidrilo (péptido Fc-B) se bloquean reversiblemente con Msc.
La síntesis de péptidos se lleva a cabo mediante un procedimiento manual en fase sólida usando un procedimiento de neutralización/activación de HBTU in situ para la química Boc (Schnolzer et al., (1992) Int. J. Pept. Protein Res. 40, 180-193) . Después de cada etapa de acoplamiento, se determinan los rendimientos midiendo la amina libre residual con el ensayo cuantitativo de ninhidrina (Sarin et al. (1981) Anal. Biochem. 117, 147-157). Los aminoácidos protegidos de cadena lateral son Boc-Asp (O-ciclohexil)-OH, Boc-Cys (4-metilbencil)-OH, Boc-Lys (2-Cl-Z)-OH y Boc-Thr(bencil) -OH. Una vez completado el ensamblaje de la cadena, los péptidos se desprotegen y se escinden de la resina mediante tratamiento con h F anhidro durante 1 hora a 0 °C con anisol al 4% como depurador.
Los péptidos Fc-A y Fc-B se sintetizan en resina de leucina de ácido mercaptopropiónico asociado a tritilo (TAMPAL) para producir tioésteres del terminal C activados por MPAL (Hackeng et al., (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. 96, 10068­ 10073). Los residuos de cys/sec del terminal N de los péptidos de tioéster se protegen con grupos de carbonato de 2-(metilsulfonil)etilo (Msc) en una reacción de 2 horas (exceso de 10 veces) de éster de nitrofenol de Msc activado disuelto en un volumen mínimo de dimetilformamida/ iisopropiletilamina al 5%. Los péptidos activados por tioéster se desprotegen y se escinden de la resina TAMPAL, se purifican por HPLC, se liofilizan y se almacenan hasta su uso a -20 °C. La HPLc preparativa de fase inversa se realiza usando una columna Vydac C-18 (10 micrómetros, 1,0 cm x 25 cm). Los péptidos unidos se eluyen usando un gradiente lineal de acetonitrilo en H2O/ácido trifluoroacético al 10%.
A partir de la proteína S-Fc del terminal C purificada, la ligación química nativa se lleva a cabo con el péptido Msc-NH-cys5-thr10-a-tioéster (Fc-A) o el péptido Msc-NH-sec5-thr10-a-tioéster (Fc-B) en condiciones no desnaturalizantes como se describió previamente (Evans et al., (1999) J. Biol. Chem. 274, 3923-3926). Los péptidos activados por tioéster se mezclan en exceso molar con proteína S-Fc recién preparada (concentración inicial, 1-200 micromolar). La solución se concentra con un aparato Centriprep 3/30 (Millipore, MA), luego con un aparato Centricon 3/10 hasta una concentración final de 0,15 a 1,2 mM para la proteína S-Fc. Las ligaduras se incuban durante la noche a 4 °C y se visualizan usando electroforesis en SDS-PAGE. Después de la ligación química nativa, el grupo protector Msc del terminal N se elimina mediante una breve incubación (<5 minutos) a pH 13. El producto X-Fc se purifica para eliminar los péptidos sin reaccionar mediante cromatografía de afinidad con proteína A sefarosa usando el procedimiento del Ejemplo 1.
La secuencia del producto de ligación nativo de la Figura 36A se muestra en la SEQ ID NO: 105. La secuencia del producto de ligación nativo de la Figura 36B se muestra en la SEQ ID NO: 113.
Ejemplo 3
Preparación de Fc de inmunoglobulina con el extremo X del terminal C (Fc-X)
La IgG se expresa en dos formas abundantes, la molécula de anticuerpo soluble y el receptor de células B unido a células. Ambas formas surgen de un solo ARN mensajero mediante empalme alternativo con el resultado de que se agregan dos exones adicionales a la región codificante de la cadena pesada de IgG (Tyler et al., (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. 79, 2008-2012; Yamawaki-Kataoka et al., (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. 79, 2623-2627). El primer exón agregado (exón M1) codifica un tramo de 18 aminoácidos, ELQLEESCAEAQDGELDG, que une de manera flexible la IgG a la superficie celular, lo que la convierte en una buena opción para moléculas nuevas similares a Fc con un extremo X del terminal C (Fc-X). El residuo gly-18 del terminal C del dominio M1 también es muy adecuado para preparar proteínas de fusión Fc-inteína utilizadas en la generación de un tioéster activado del terminal C. Después de una reacción de autoescisión de inteína, se genera un compuesto intermedio de tioéster que permite la fácil adición de cisteína o selenocisteína al terminal C mediante ligación química nativa.
Por consiguiente, las células huésped se transfectan con vectores de expresión que codifican polipéptidos quiméricos pre-Fc-inteína que contienen el dominio M1 unido en su terminal C, ELQLEESCAEAQDGELDG, mediante un enlace peptídico al terminal N de una inteína de autoempalme en el sitio de autoescisión (Figura 37A), o la proteína Fc que contiene una porción del dominio M1, ELQLEESc (Figura 37B). Para asegurar que la proteína Fc-X no tiene un extremo X del terminal N, se utilizan péptidos señal heterólogos que son escindidos por la peptidasa señal celular antes de los residuos de lisina (parte i). Por lo tanto, la escisión por la peptidasa señal celular proporcionará una proteína de fusión Fc-inteína con lys-7, EPKSCDKTHTCPPCP, en el terminal N (parte ii). La escisión del dominio de inteína mediante corte y empalme de proteínas proporciona un compuesto intermedio de Fc tioéster (parte iii). Finalmente, se emplea la ligadura química nativa del Fc-tioéster con cisteína y/o selenocisteína libres para preparar proteínas Fc-X que tienen el extremo X del terminal C, ELQLEESCAEAQDGELDGX (parte iv).
Las secuencias de los polipéptidos precursores de IgG1 de la Figura 37A se muestran en la SEQ ID NO: 116 y SEQ ID NO: 117. La secuencia de los polipéptidos de IgG1 maduros y modificados de la Figura 37A se muestra en la SEQ ID NO: 118 a la SEQ ID NO: 120. Las secuencias de los polipéptidos precursores de IgG1 de la Figura 37B se muestran en la SEQ ID NO: 123 y la SEQ ID NO: 124. La secuencia del polipéptido de IgG1 maduro de la Figura 37B se muestra en la SEQ ID NO: 125.
La proteína de fusión Fc-inteína con lys-7 en el extremo N se prepara usando los procedimientos descritos en el Ejemplo 1. La etapa de purificación inicial se lleva a cabo usando cromatografía de afinidad con una resina de quitina en lugar de proteína A sefarosa. Después de la escisión de la resina, el compuesto intermedio de Fc-tioéster activado se usa directamente para la ligadura nativa con cisteína y/o selenocisteína.
Se describe una secuencia de ADN adecuada para el dominio de membrana M1 de IgG1 humana en Strausberg et. al., (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. 99, 16899-16903 (GenBank acceso No. BC019046).
Los ejemplos adecuados de péptidos señal son la glicoproteína de superficie de células T CD2 (CD2) (GenBank acceso No. NM_001767), y la glicoproteína de superficie de células T CD4 (CD4) (GenBank acceso No. NP_000616).
Un ejemplo adecuado de una inteína de auto-empalme se encuentra en la subunidad grande de ribonucleótido reductasa de Methanobacterium thermoautotrophicum (MthRIR1) (GenBank acceso No. AE000845). Para limitar la reacción de autoescisión de inteína a la unión de fusión Fc-inteína, se prepara una variante de inteína MthRR1 con solo actividad de escisión del terminal N cambiando el pro en la posición -1 por gly y el asn del terminal C en la posición 134 por ala (Evans et al., (1999) J. Biol. Chem. 274, 3923-3926). Además, se usa una secuencia de inteína Mth RRI fusionada a un dominio de unión a quitina de Bacillus circulans para facilitar la purificación del polipéptido quimérico Fc-inteína mediante cromatografía de afinidad. Una secuencia adecuada para la inteína MthRIR1 modificada se encuentra en el plásmido pTWIN-2 (New England BioLabs, MA).
Otros ejemplos adecuados se encuentran en la subunidad A girasa de Mycobacterium xenopi (Mxe GyrA) (GenBank acceso No. MXU67876) y la ATPasa vacuolar de Saccharomyces cerevisiae (Sce VMA1) (GenBank acceso No. NC_001136). Otros ejemplos adecuados de inteínas de autoempalme se describen en Inbase: la base de datos de Inteína (Perler (2002) Nucl. Acids Res. 30, 383-384).
Los vectores de expresión adecuados se construyen mediante ligación de un inserto y un fragmento de vector preparado por digestión con EcoRI y BglII. Para la expresión no amplificada, el plásmido pCD2-Fc7-Mth (señal de CD2) se construye con la SEQ ID NO: 9 y la SEQ ID n O: 1, y el plásmido pCD4-Fc7-Mth (señal de CD4) se construye con la SEQ ID NO: 10 y la SEQ ID NO: 1. Para la expresión amplificada, el plásmido pCD2-Fc7-Mth-DHFR se construye con la SEQ ID NO: 9 y pSVeCD4DHFR, y el plásmido pCD4-Fc7-Mth-DHFR se construye con la SEQ ID NO: 10 y pSVeCD4DHFR.
Los vectores de expresión adecuados se construyen mediante ligación de un fragmento de inserto preparado mediante digestión con Hind III y EagI y un fragmento de vector preparado mediante digestión con Hind III y PspOM1. El plásmido pCADN3-CD2-Fc7-Mth (señal de CD2) se construye con la SEQ ID NO: 114 y pCADN3.1(+), y el plásmido pCADN3-CD4-Fc7-Mth (señal de CD4) se construye con la SEQ ID NO: 115 y pCADN3.1(+). El plásmido pCADN3-CD2-Fc7-ELQLEESC (señal CD2) se construye con la SEQ ID NO: 121 y pCADN3.1(+), y el plásmido pCADN3-CD4-Fc7-ELQLEESC (señal CD4) se construye con la SEQ ID NO: 122 y pCADN3.1(+).
Los principios generales de la purificación por afinidad de quitina y la reacción de autoescisión de inteína de autoempalme se describen en la patente de los Estados Unidos No. 5.834.247.
Después de la transfección de la célula huésped, el sobrenadante del cultivo celular se aplica a una columna empaquetada con resina de quitina (New England BioLabs, MA) que se equilibra en tampón A (Tris-HCl 20 mM, pH 7,5 que contiene NaCl 500 mM). La proteína no unida se lava de la columna con 10 volúmenes de columna de tampón A. La escisión inducida por el reactivo tiol se inicia equilibrando rápidamente la resina de quitina en tampón B (Tris-HCl 20 mM, pH 8 que contiene NaCl 0,5 M y ácido 2-mercaptoetano sulfónico 0,1 M (m Es NA)). La escisión, que genera simultáneamente un tioéster del terminal C en la proteína diana, se lleva a cabo durante la noche a 4 °C, después de lo cual se eluyó la proteína de la columna.
Comenzando con el compuesto intermedio de Fc-tioéster purificado, se lleva a cabo la ligadura química nativa con cisteína o selenocisteína usando el procedimiento del Ejemplo 2. El producto Fc-X final se purifica para eliminar la cisteína y la selenocisteína sin reaccionar mediante cromatografía de afinidad con proteína A sefarosa.
Ejemplo 4
Preparación de Fc de inmunoglobulina con el extremo S del terminal N y el extremo X del terminal C (S-Fc-X) Las proteínas S-Fc y Fc-X son útiles en la preparación de inmunosimetroadhesinas que tienen dos dominios de unión unidos a un solo dominio Fc (véase más abajo). Los dominios de unión se añaden al extremo S del terminal N (S-Fc) 0 al extremo X del terminal C (Fc-X). Los dominios S-Fc-X que son útiles en la preparación de bisimetroadhesinas con cuatro dominios de unión unidos a un solo dominio Fc se preparan usando los procedimientos descritos en el Ejemplo 1 y el Ejemplo 3.
En consecuencia, las células huésped se transfectan con vectores de expresión que codifican polipéptidos quiméricos pre-Fc-inteína que contienen el dominio M1 unido en su terminal C, ELQLEESCAEAQDGELDg , mediante un enlace peptídico al terminal N de una inteína de autoempalme en el sitio de autoescisión (Figura 38). Los péptidos señal heterólogos se seleccionan de proteínas con cisteínas del terminal N (parte i). Por lo tanto, la escisión por la peptidasa señal celular proporcionará una proteína de fusión S-Fc-inteína madura que tiene cys-5 en el terminal N, CDKTHTCPPCP (parte ii). La escisión de la inteína por empalme de proteínas proporciona un compuesto intermedio de Fc-tioéster (parte iii). Finalmente, se emplea la ligación nativa del Fc tioéster con cisteína y/o selenocisteína libres para preparar proteínas S-Fc-X que tienen el extremo X del terminal C, ELQLEESCAEAQDGELDGX (parte iv).
Las secuencias de los polipéptidos precursores de IgG1 de las Figuras 38A-38B se muestran en la SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 127 y SEQ ID NO: 128. La secuencia de los polipéptidos IgG1 maduros y modificados de las Figuras 38A-38B se muestra en la SEQ ID NO: 129 a LA SEQ ID NO: 131.
Los vectores de expresión adecuados se construyen mediante ligación de un inserto y un fragmento de vector preparados por digestión con EcoRI y BglII. Para la expresión no amplificada, pSHH-Fc5-Mth se construye con la SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 1, pIFN-Fc5-Mth se construye con la SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 1, y pCETP-Fc5-Mth se construye con SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 1. Para la expresión amplificada, pSHH-Fc5-Mth-DHFR se construye con la SEQ ID NO: 11 y pSVeCD4DHFR, pIFN-Fc5-Mth-DHFR se construye con la SEQ ID NO: 12 y pSVeCD4DHFR, y pCETP-Fc5-Mth-DHFR se construye con la SEQ ID NO: 13 y pSVeCD4DHFR.
La proteína de fusión S-Fc-inteína se purifica primero a partir del sobrenadante del cultivo de células huésped transfectadas usando cromatografía de afinidad de quitina. Después de la escisión de la resina de quitina, el compuesto intermedio Fc-tioéster se aplica directamente a una columna de proteína A Sefarosa para evitar reacciones secundarias de ciclación o polimerización. El S-Fc tioéster activado unido a la columna se usa directamente para la ligación nativa con cisteína y/o selenocisteína. A continuación, se lava la columna para eliminar el exceso de aminoácidos y se eluye el S-Fc-X de la proteína A sefarosa.
Ejemplo 5
Preparación de Fc de inmunoglobulina con el extremo X del terminal N y el extremo X del terminal C (X-Fc-X)
Las proteínas X-Fc y Fc-X son útiles en la preparación de inmunosimetroadhesinas que tienen dos dominios de unión unidos a un solo dominio Fc (véase más abajo). Los dominios de unión se añaden al extremo X del terminal N (X-Fc) o al extremo X del terminal C (Fc-X). Los dominios X-Fc-X que son útiles para preparar bisimetroadhesinas con cuatro dominios de unión unidos a un solo dominio Fc se preparan usando los procedimientos descritos en el Ejemplo 2 y el Ejemplo 3.
Por consiguiente, las células huésped se transfectan con vectores de expresión que codifican polipéptidos quiméricos pre-Fc-inteína que contienen el dominio M1 unido en su terminal C, ELQLEESCAEAQDGELDg , mediante un enlace peptídico al terminal N de una inteína de autoempalme en el sitio de autoescisión (Figura 39). Los péptidos señal heterólogos se seleccionan de proteínas con cisteínas del terminal N (parte i). Por lo tanto, la escisión por la peptidasa señal celular proporcionará una proteína de fusión S-Fc-inteína madura que tiene cys-11 en el terminal N (parte ii). A continuación, se emplea la ligadura química nativa para preparar proteínas de fusión X-Fc-inteína que tienen cys-5 o sec-5 en el terminal N, XDKTHTCPPCP (parte iii). La escisión de la inteína por empalme de proteínas proporciona un compuesto intermedio de Fc-tioéster (parte iv). Finalmente, en una segunda reacción de ligación química nativa, se lleva a cabo con el Fc tioéster con cisteína libre y/o selenocisteína para preparar las proteínas X-Fc-X que tienen un extremo X del terminal C ELQLEESCAEAQDGELDGX (parte v). Alternativamente, la parte iii se lleva a cabo después de las partes iv y v.
Las secuencias de los polipéptidos precursores de IgG1 de las Figuras 39A-39B se muestran en la SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 133 y SEQ ID NO: 134. La secuencia de los polipéptidos IgG1 maduros y modificados de las Figuras 38A-38B se muestra en la SEQ ID NO: 135 a SEQ ID NO: 138.
Los vectores de expresión adecuados se construyen mediante ligación de un inserto y un fragmento de vector preparado por digestión con EcoRI y BglII. Para la expresión no amplificada, el plásmido pSHH-Fc11-Mth se construye con la SEQ ID NO: 14 y la SEQ ID NO: 1, pIFN-Fc11-Mth se construye con la SEQ ID NO: 15 y la SEQ ID NO: 1, y pCETP-Fc11- Mth se construye con la SEQ ID NO: 16 y la SEQ ID NO: 1. Para la expresión amplificada, pSHH-Fc11-Mth-DHFR se construye con la SEQ ID NO: 14 y pSVeCD4DHFR, pIFN-Fc11-Mth-DHFR se construye con la SEQ ID NO: 15 y pSVeCD4DHFR, y pCETP-Fc11-Mth-DHFR se construye con la SEQ ID NO: 16 y pSVeCD4DHFR.
La proteína de fusión S-Fc-inteína se purifica primero a partir del sobrenadante del cultivo de células huésped transfectadas usando cromatografía de afinidad de quitina. La ligadura química nativa se lleva a cabo en la columna de quitina con el péptido Msc-NH-cys5 -thr10-a- tioéster (Fc-A) o el péptido Msc-NH-sec5-thr10-a-tioéster (Fc-B) como se describe (Ejemplo 2). La columna de quitina se lava luego a fondo para eliminar el péptido que no ha reaccionado. A continuación, se lleva a cabo la reacción de autoescisión de inteína. Después de la escisión, el compuesto intermedio de X-Fc tioéster se aplica directamente a la proteína A Sefarosa. El X-Fc tioéster activado unido se usa directamente para la ligadura nativa con cisteína y/o selenocisteína. Luego, la columna se lava para eliminar el exceso de aminoácidos. El X-Fc-X bloqueado con Msc se eluye de la columna, se trata para eliminar el grupo protector Msc y se vuelve a purificar usando proteína A Sefarosa para producir el producto X-Fc-X final.
Ejemplo 6
Simetroadhesinas de CD4
Una estrategia terapéutica para tratar la infección por VIH-1 se basa en CD4 humano, un componente del receptor de VIH-1. Las inmunoadhesinas de CD4 (Capon et al., (1989) Nature 337, 525-531) bloquean eficazmente la infectividad del VIH-1 uniéndose a la proteína de la envoltura gp120. La actividad de bloqueo reside en el dominio extracelular de CD4 (residuos 1 a 371).
Por consiguiente, se preparan diversas simetroadhesinas de CD4 usando la proteína CD4-X y se analizan para determinar su capacidad para unirse a gp120 y bloquear la infectividad del VIH-1. La actividad de las simetroadhesinas de CD4 se compara con la inmunoadhesina de CD4 preparada como se describe (Capon et al., Ibídem).
La proteína CD4-X se prepara mediante los procedimientos del Ejemplo 3. Las células huésped se transfectan con vectores de expresión que codifican el polipéptido quimérico pre-CD4 que contiene el dominio extracelular de CD4 unido a su terminal C por un enlace peptídico al terminal N de una inteína de autoempalme en el sitio de autoescisión (Figuras 40A-40B).
La escisión de la secuencia señal de CD4 (parte i) por la peptidasa señal celular proporciona proteína de fusión CD4-inteína madura (parte ii). La escisión del dominio inteína proporciona un compuesto intermedio CD4 tioéster (parte iii). Finalmente, se emplea la ligación química nativa del CD4 tioéster con cisteína y/o selenocisteína libres para preparar dominios de CD4 con el extremo X del terminal C (parte iv).
Las secuencias de estos polipéptidos se muestran en la SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 142 y SEQ ID NO: 143. Los vectores de expresión adecuados se construyen mediante ligación de un inserto y un fragmento de vector preparado por digestión con EcoRI y BglII. Para la expresión no amplificada, el plásmido pCD4-Mth se construye usando la SEQ ID NO: 17 y la SEQ ID NO: 1. Para la expresión amplificada, el plásmido pCD4-Mth-DHFR se construye usando la SEQ ID NO: 17 y pSVeCD4DHFR.
Se construyeron vectores de expresión adecuados mediante ligación de un fragmento de inserto preparado mediante digestión con Hind III y EagI y un fragmento de vector preparado mediante digestión con Hind III y PspOM1. El plásmido pCADN3-CD4-Mth se construyó usando la SEQ ID NO: 139 y pCADN3.1(+).
La Figura 56 muestra la expresión en células de riñón 293 humanas de proteínas de fusión CD4-inteína humanas. Los carriles 1-4 muestran el polipéptido de fusión CD4-inteína de la Figura 40A (ii). Sobrenadantes de células: carriles 1 y 3; lisados celulares: carriles 2 y 4.
Se usa CD4-X para preparar diversas simetroadhesinas de CD4 (Tabla 2). Las hemisimetroadhesinas se preparan usando la proteína CD4-X sola, las inmunosimetroadhesinas se preparan usando la proteína CD4-X con S-Fc, X-Fc o Fc-X, y las bisimetroadhesinas se preparan usando la proteína CD4-X con S-Fc-X o X-Fc-X.
La hemisimetroadhesina de CD4 se prepara usando proteína CD4-X expuesta a condiciones levemente reductoras que activan los extremos X, pero no desnaturalizan la proteína (Fleischman et al., (1962) Arch. Biochem. Biophys. 1 (Supl.), 174-180; Edelman et al., (1963) Proc. Nat. Acad. Sci. (1963) 50, 753-761). Se disuelve la proteína CD4-X (0,5 a 2,0 mg/ml) en tampón reductor (tampón Tris-HCl 0,05 M pH 8,0, preparado en 2-mercaptoetanol 0,1 M) y se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente. Luego, la proteína se intercambia en tampón de oxidación (K2HPO40,1 M) mediante cromatografía Sephadex G-100, se agita suavemente en un tubo de ensayo de vidrio de fondo redondo tapado con un tapón de algodón en forma suelta y se deja proceder a temperatura ambiente durante 20 horas (Haber y Anfinsen (1961) J. Biol. Chem. 236, 422-424).
Se preparan inmunosimetroadhesinas de CD4 y bisimetroadhesinas de CD4 en perlas de proteína A Sefarosa usando las proteínas S-Fc, X-Fc, Fc-X, S-Fc-X o X-Fc-X como se indica (Tabla 2). Las proteínas unidas se agitan suavemente en tampón reductor durante 1 hora a temperatura ambiente y luego se lavan con tampón de oxidación. Se trata CD4-X con tampón reductor, se añade a las perlas y se deja que la reacción prosiga a temperatura ambiente durante 20 horas. El análisis de unión por saturación de CD4-gp120 se lleva a cabo como se describe (Smith et al., (1987) Science 238, 1704-1707) usando gp120 radioyodada preparado como se describe (Lasky et al., (1987) Cell 50, 975-985). Las reacciones (0,2) contienen NP-40 al 0,25%, desoxicolato de sodio al 0.1%, NaCI 0,06 M, Tris-HCl 0,01 M, pH 8,0 (1x tampón A) con 125I-gp120 (3 ng a 670 ng a razón de 2,9 nCi/ng). La unión se lleva a cabo durante 1 hora a 0 °C en presencia o ausencia de 50 microgramos de gp120 purificada sin marcar. A continuación, se determina la unión de 125I-gp120 mediante inmunoprecipitación. Las reacciones de unión se preabsorben con 5 microlitros de suero de conejo normal durante 1 hora a 0 °C, se aclaran con 40 microlitros de Pansorbin (Calbiochem) al 10% p/v durante 30 minutos a 0 °C y se incuban durante la noche a 0 °C con 2 microlitros de suero normal o 5 microlitros (0,25 microgramos) de anticuerpo monoclonal OKT4 (Ortho Biotech). Los inmunoprecipitados se recogen con 10 microlitros de Pansorbin, se lavan dos veces en tampón 2x y una vez en agua, luego se eluyen a 100 °C durante 2 minutos en Tris-HCl 0,12 M pH 6,8, SDS al 4%, mercaptoetanol 0,7 M. La fracción de 125I-gp120 unida se determina en un contador gamma y se usa el análisis de Scatchard para determinar el contenido de disociación aparente.
Los estudios de bloqueo del VIH-1 se llevan a cabo como se describe (Robert-Guroff et al., (1985) Nature 316, 72-74). Se incuban volúmenes iguales de inhibidor y VIH-1 (60 microlitros) a 4 °C durante 1 hora, luego el mismo volumen de células H9 (Gallo et al., (1984) Science 224, 500-503) a razón de 5x106/ml l y se continúa la incubación durante 1 hora a 37 °C. Después de la absorción del virus, se transfieren 2,5 x 105 células en 150 microlitros a 2 ml de medio de incubación. Después de 4 días a 37 °C, los cultivos se dividen 1: 2 con medio fresco y se incuban durante 3 días más. Se recogen los cultivos, se mide la actividad de la transcriptasa inversa (Groopman et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses (1987) 3, 71-85), y se determina la inmunofluorescencia con suero VIH-1 positivo como se describe (Poiesz et al., (1980). Proc. Acad. Nat. Sci. 77, 7415-7419). La dosis de desafío del virus es 100 TCID50 de la cepa de VIH1 HTLV-IIIB cultivada en células H9 ensayadas en el mismo sistema. Los medios de incubación son medios RPMI 1640 que contienen L-glutamina 2 mM, 100 unidades/ml de penicilina, 100 microgramos/ml de estreptomicina, 2 microgramos/ml de polibreno y suero fetal bovino al 20%.
Ejemplo 7
Simetroadhesinas del receptor del factor de necrosis tumoral
Una estrategia terapéutica para tratar enfermedades autoinmunes se basa en el factor de necrosis tumoral a (TNF-a) y su interacción de unión con anticuerpos y receptores de TNF-a (TNR). Ambos son una opción terapéutica importante en la artritis reumatoide del adulto, la artritis reumatoide juvenil, la espondilitis anquilosante, la artritis psoriásica, la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa.
Por consiguiente, se preparan diversas simetroadhesinas de TNR usando proteínas TNR-X, y se analizan para determinar su capacidad para unirse a TNF-a y bloquear la actividad biológica de TNF-a. La actividad de las simetroadhesinas de TNR se compara con la de las inmunoadhesinas de TNR (Ashkenazi et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 10535-10539).
Los TNR humanos incluyen TNR1A (GenBank acceso No. NM_001065); y TNR1B (GenBank acceso No. NM_001066). El anticuerpo de TNF-a Di62 incluye la cadena pesada de Di62 (GenBank acceso No. AJ002433); y la cadena ligera Di62 (GenBank acceso No. AJ002434) (en adelante, TNR1A = TNR1; TNR1B = TNR2; y Di62-VH-CH Di62-VkCk = TNRFab).
Se prepara Di62-Vk de acuerdo con el método del Ejemplo 1. Se preparan Di62-VH-X, TNR1A-X y TNR1B-X de acuerdo con el método del Ejemplo 3.
Las células huésped se cotransfectan con dos vectores de expresión que codifican el polipéptido quimérico Di62-VH-CH-inteína y la proteína Di62-VkCk dan como resultado la coexpresión de la proteína Di62-VH-CH:Di62-Vk-Ck que se utiliza para preparar la proteína TNFFab-X:
1) un polipéptido quimérico pre-Di62-VH-inteína que contiene el dominio Di62-VH-CH1 unido en su terminal C por un enlace peptídico al terminal N de una inteína de autoempalme en el sitio de autoescisión (Figuras 41A-41B); y
2) un polipéptido pre-Di62-Vk que contiene el dominio Di62-Vk-Ck (Figura 42).
La escisión de la secuencia señal homóloga Di62-VH-CH (parte i) por la peptidasa señal celular proporciona la proteína de fusión Di62-VH-CH-inteína madura (parte ii). La escisión de la inteína por empalme de proteínas proporciona el compuesto intermedio Di62-VH-CH-tioéster (parte iii). Finalmente, se emplea la ligación química nativa del Di62-VH-CH-tioéster con cisteína y/o selenocisteína libre para preparar la proteína Di62-VH-CH-X con el extremo X del terminal C (parte iv) (véanse las Figuras 41A -41B).
La escisión de la secuencia señal homóloga Di62-Vk-Ck (parte i) por la peptidasa señal celular proporciona la proteína Di62-Vk-Ck madura (parte ii) (véase la Figura 42).
Las células huésped se transfectan con vectores de expresión que codifican el polipéptido quimérico TNR1A-inteína y el polipéptido quimérico TNR1B-inteína para preparar las proteínas TNF1-X y TNF2-X, respectivamente:
1) un polipéptido quimérico pre-TNRIA-inteína que contiene el dominio extracelular de TNR1A unido en su terminal C por un enlace peptídico al terminal N de una inteína de autoempalme en el sitio de autoescisión (Figura 43); y 2) un polipéptido quimérico pre-TNR1B-inteína que contiene el dominio extracelular de TNR1B unido a su terminal C por un enlace peptídico al terminal N de una inteína de autoempalme en el sitio de autoescisión (Figura 44A).
La escisión de las secuencias señal de TNR homólogas (parte i) por la peptidasa señal celular proporciona proteínas de fusión TNR-inteína maduras (parte ii). La escisión de la inteína por empalme de proteínas proporciona compuestos intermedios de TNR-tioéster (parte iii). Finalmente, se emplea la ligación química nativa de los TNR tioésteres con cisteína y/o selenocisteína libres para preparar proteínas TNR-X con el extremo X del terminal C (parte iv) (véase la Figura 43, 44A).
Las secuencias de estos polipéptidos se muestran en la SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 147 y SEQ ID NO: 148 (Di62-VHCH); en la SEQ ID NO: 150 y la SEQ ID NO: 151 (Di62-VkCk); en la SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 155 y SEQ ID NO: 156 (TNR1A); en la SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 160 y SEQ ID NO: 161 (TNR1B); y en la SEQ ID NO: 163 y SEQ ID NO: 164 (inmunoadhesina de TNR1B).
Los vectores de expresión adecuados se construyen mediante ligación de un inserto y un fragmento de vector preparado por digestión con EcoRI y BglII. Para la expresión no amplificada, el plásmido pDi62-VHCH-Mth se construye usando la SEQ ID NO: 18 y la SEQ ID NO: 1, el plásmido pDi62-VkCk se construye usando la SEQ ID NO: 19 y la SEQ ID NO: 1, se construye el plásmido pTNR1A-Mth usando la SEQ ID NO: 20 y la SEQ ID NO: 1, y el plásmido pTNR1A-Mth se construye usando Se Q ID NO: 22 y SEQ ID NO: 1. Para la expresión amplificada, el plásmido pDi62-VHCH-Mth-DHFR se construye usando la SEQ iD NO: 18 y pSVeCD4DHFR, el plásmido pDi62-VkCk-DHFR se construye usando la SEQ ID NO: 19 y pSVeCD4DHFR, el plásmido pTNR1A-Mth-DHFR se construye usando la SEQ. ID NO: 20 y pSVeCD4DHFR, y el plásmido pTNR1A-Mth-DHFR se construye usando la SEQ ID NO: 22 y pSVeCD4DHFR.
Los vectores de expresión adecuados se construyen por ligación de un fragmento de inserto preparado por digestión con Hind III y EagI y un fragmento de vector preparado por digestión con Hind III y PspOM1. El plásmido pCDA3-Di62-VHCH-Mth se construye usando la SEQ ID n O: 144 y pCADN3.1(+). El plásmido pCDA3-Di62-VkCk se construye usando la SEQ ID NO: 149 y pCADN3.1(+). El plásmido pCADN-3-TNR1A-Mth-DHFR se construye usando la SEQ ID NO: 152 y pCADN3.1(+). El plásmido pCADN-3-TNR1 B-Mth-DHFR se construyó usando la SEQ ID NO: 157 y pCADN3.1(+). El plásmido pCADN-3-inmunoadhesina de TNR1B se construyó usando la SEQ ID NO: 162 y pCADN3.1 (+).
La Figura 57 muestra la expresión en células de riñón 293 humanas de proteínas de fusión TNR1B humanas. Los carriles 2 y 5 muestran la proteína de fusión TNR1 B-inteína de la Figura 44A (ii). Los carriles 1 y 3 muestran la proteína de fusión inmunoadhesina de TNR1B de la Figura 44B (ii). Los carriles 3 y 6 muestran proteínas de células transfectadas de forma simulada. Sobrenadantes celulares: carriles 1-3; lisados celulares: carriles 4-7. Carril 7: TNR1B- inmunoadhesina de control (R&D Systems).
La Figura 58 muestra subunidades de simetroadhesina de TNR1B con el extremo S del terminal C. Los carriles 1-2 muestran el polipéptido TNR1B de la Figura 44A (iii) después de la purificación por cromatografía de afinidad de quitina y escisión/elución con MESNA. Los carriles 3 muestran el producto de ligación nativo entre el polipéptido TNR1B de la Figura 44A (iii) con un péptido marcado con fluorescencia (New England Biolabs). Panel (i): fluorescencia directa; panel (ii): transferencia Western con anticuerpo anti-TNR1B (R&D Systems); panel (iii): tinción con SYPRO Ruby (Sigma-Aldrich).
La Figura 59 muestra subunidades de simetroadhesina de TNR1B con el extremo S del terminal C. El carril 5 muestra el polipéptido TNR1B de la Figura 44A (iv) después de la purificación por cromatografía de afinidad de quitina y escisión/elución con cisteína. Los carriles 1-4 muestran inmunoadhesina de TNR1B.
La Figura 60 muestra la simetroadhesina de TNR1B. Los carriles 1-4 muestran la simetroadhesina de TNR1B de la Figura 44A (iv) antes de la oxidación (carriles 1 y 4) y después de la oxidación en presencia de CuSO4 10 mM. Los carriles 3 y 6 muestran un control de inmunoadhesina de TNR1B. Carriles 1-3: condiciones reductoras; carriles 4-6: condiciones no reductoras. El monómero de simetroadhesina de TNR1B (42 kd) y el dímero (84 kd) son evidentes en los carriles 2 y 5, y en el carril 5, respectivamente.
Las Figuras 61A-61C muestran el análisis de unión por saturación de TNF-alfa con varios polipéptidos TNR1B en Biacore T-100. (A) La simetroadhesina de TNR1B de la Figura 44A (iv) se acopló covalentemente a un chip Biacore CM-5 usando química de amina Biacore estándar. (B) La inmunoadhesina de TNR1B (R&D Systems) se acopló covalentemente a un chip Biacore CM-5 usando química de amina Biacore estándar. (C) La simetroadhesina de TNR1B de la Figura 44A (iv) se acopló covalentemente a un chip Biacore CM-5 usando química de tiol Biacore estándar. Después del acoplamiento, se llevó a cabo un análisis de unión por saturación usando TNF-alfa (R&D Systems) en las concentraciones indicadas.
Las Figuras 62A-62C muestran el análisis de Scatchard del análisis de unión por saturación de TNF-alfa mostrado en las Figuras 61A-61C. (A) simetroadhesina de TNR1B de la Figura 44A (iv) acoplada covalentemente usando química de amina; Kd = Kd = 4,697 x 10-9 M. (B) inmunoadhesina de TNR1B (R&D Systems) acoplada covalentemente usando química de amina; Kd = 4,089 x 10-9 M. (C) simetroadhesina de TNR1B de la Figura 44A (iv) acoplada covalentemente usando química de tiol; Kd = 0,8476 x 10-9 M.
Las proteínas TNR1-X, TNR2-X y TNRFab-X, individualmente y en diversas combinaciones, se utilizan para preparar diversas simetroadhesinas de VGFR (Tablas 3, 4 y 5). También se muestra el número de configuraciones distintas obtenidas para cada combinación, así como la estructura general de cada una.
Las hemisimetroadhesinas se preparan utilizando las proteínas TNR-X solas, las inmunosimetroadhesinas se preparan utilizando las proteínas TNR-X con S-Fc, X-Fc o Fc-X, y las bisimetroadhesinas se preparan utilizando las proteínas TNR-X con S-Fc-X o X-Fc-X.
Cada proteína TNR-X o simetroadhesina de TNR se determina mediante un inmunoensayo cuantitativo utilizando anticuerpos policlonales purificados por afinidad específicos de subtipo para TNR1A, TNR1B y Di62 (cabra-antirratón) e inmunoadhesinas (TNR1A-Ig y TNR2A-Ig) como patrones de referencia. Los anticuerpos TNR, las inmunoadhesinas de TNR-Ig y la proteína TNF-a se obtienen de R&D Systems (MN).
La unión de las simetroadhesinas de TNGR a TNF-a se estudia como se describe (Ashkenazi et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 10535-10539). Se inmovilizan muestras individuales (1 microgramo/ml) en pocillos de microtitulación recubiertos con anticuerpo de cabra anti-Ig Fc humana. Las reacciones con 125I-TNF-a humano recombinante (radiodinado mediante el uso de lactoperoxidasa a una actividad específica de 19,1 microCi/microgramo; 1 microCi = 37 kBq) se realizan en solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contiene albúmina de suero bovino al 1% durante 1 hora a 24 °C. La unión no específica se determina omitiendo la muestra. En los análisis de unión competitiva, el 125I-TNF-a se incuba con muestras inmovilizadas en presencia de concentraciones crecientes de TNF-a no marcado. La Kd se determina a partir de los valores de IC50 de competición de acuerdo con la siguiente ecuación: Kd = IC50/(1 [T]/KdT), en la que [T] es la concentración del trazador (0,1 nm) y KdT es la Kd del trazador determinada por unión por saturación (80 pM). La citotoxicidad del TNF se estudia como se describe (Kawade y Watanabe (1984) J. Interferon Res. 4, 571-584). Las células LM de ratón se siembran en placas de microtitulación (4 x 104 células por pocillo) y se tratan con actinomicina D (3 microgramos/ml) y TNF-a o TNF-p (1 nanogramo/ml) en presencia o ausencia de la muestra u otros inhibidores. Después de 20 horas de incubación a 39 °C, la supervivencia celular se determina mediante una prueba de exclusión del colorante cristal violeta.
Se estudia un modelo de ratón para choque séptico mediante inyección de endotoxina de ratones BALB/c de 6 a 8 semanas de edad. Se inyecta a los animales por vía intravenosa (i.v.) con una dosis LD100 de endotoxina derivada de Salmonella abortus (175 microgramos por ratón) en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se hace un seguimiento de la supervivencia durante al menos 78 horas. Se utilizan inmunoadhesina de TNR1 e inmunoadhesina de CD4 como controles positivos y negativos, respectivamente. Cada uno se diluye en PBS y se inyecta i.v. antes o después de la administración de endotoxina.
Ejemplo 8
Simetroadhesinas del receptor del factor de crecimiento endotelial vascular
Una estrategia terapéutica para tratar la enfermedad angiogénica se basa en factores de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y su interacción de unión con los receptores de VEGF (VGFR). Los anticuerpos de VEGF y las inmunoadhesinas de VGFR son candidatos prometedores para el tratamiento de varios carcinomas metastásicos que incluyen colon, recto, pulmón y mama, y en la degeneración macular relacionada con la edad.
Por consiguiente, se preparan diversas simetroadhesinas de VGFR usando proteínas VGFR-X y se analizan para determinar su capacidad para unirse a VEGF y bloquear la actividad biológica de VEGF. La actividad de las simetroadhesinas de VGFR se compara con la de las inmunoadhesinas de VGRF (Park et al., (1994) J. Biol. Chem.
269, 25646-25654).
Los VGFR humanos incluyen VGFR1 (GenBank acceso No. NM_002019); VGFR2 (GenBank acceso No. NM_002253); y VGFR3 (GenBank acceso No. NM_002020). VGFR1-X, VGFR2-X y VGFR3-X se preparan de acuerdo con el método del Ejemplo 3. Las células huésped se transfectan con vectores de expresión que codifican:
1) un polipéptido quimérico pre-VGFR1-inteína que contiene el dominio extracelular de VGFR1 unido en su terminal C por un enlace peptídico terminal N de una inteína de autoempalme en el sitio de autoescisión (Figuras 45A-45C);
2) un polipéptido quimérico pre-VGFR2-inteína que contiene el dominio extracelular de VGFR1 unido en su terminal C por un enlace peptídico al terminal N de una inteína de autoempalme en el sitio de autoescisión (Figuras 46A-46C); y
3) un polipéptido quimérico pre-VGFR1-inteína que contiene el dominio extracelular de VGFR1 unido en su terminal C por un enlace peptídico al terminal N de una inteína de autoempalme en el sitio de autoescisión (Figuras 47A-47C).
La escisión de la secuencia señal de VGFR (parte i) por la peptidasa de señal celular proporciona proteínas de fusión VGFR-inteína maduras (parte ii). La escisión del dominio de inteína proporciona un compuesto intermedio de VGFR tioéster (parte iii). Finalmente, se emplea la ligación química nativa del VGFR tioéster con cisteína y/o selenocisteína libres para preparar dominios de VGFr con el extremo X del terminal (parte iv).
Las secuencias de estos polipéptidos se muestran en la SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 168 y SEQ ID NO: 169 (VGFR1); en la SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 173 y SEQ ID NO: 174 (VGFR2); y en la SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 178 y SEQ ID NO: 179 (VGFR3).
Los vectores de expresión adecuados se construyen mediante ligación de un inserto y un fragmento de vector preparado por digestión con EcoRI y BglII. Para la expresión no amplificada, el plásmido pVGFR1-Mth se construye usando la Se Q ID NO: 22 y la SEQ ID NO: 1, el plásmido pVGR1-Mth se construye usando la SEQ ID NO: 23 y la SEQ ID NO: 1, y el plásmido pVGR1-Mth se construye usando la SEQ ID NO: 24 y la SEQ ID NO: 1. Para la expresión no amplificada, el plásmido pVGFR1-Mth-DHFR se construye usando la SEQ ID NO: 22 y pSVeCD4DHFR, el plásmido pVGR1-Mth-DHFR se construye usando la SEQ ID NO: 23 y pSVeCD4DHFR, y el plásmido pVGR1-Mth-DHFR se construye usando la SEQ ID NO: 24 y pSVeCD4DHFR.
Los vectores de expresión adecuados se construyen mediante ligación de un fragmento de inserto preparado mediante digestión con Hind III y EagI y un fragmento de vector preparado mediante digestión con Hind III y PspOM1. El plásmido pCADN3-VGFR1-Mth se construye usando la SEQ ID NO: 165 y pCADN3.1(+). El plásmido pCADN3-VGFR2-Mth se construye usando la SEQ ID NO: 170 y pCADN3.1(+). El plásmido pCADN3-VGFR3-Mth se construye usando la SEQ ID NO: 175 y pCADN3.1(+).
Las proteínas VGFR1-X, VGFR2-X y VEGFR3-X, individualmente y en diversas combinaciones, se utilizan para preparar diversas simetroadhesinas de VGFR (Tablas 6, 7 y 8). También se muestra el número de configuraciones distintas obtenidas para cada combinación, así como la estructura general de cada una. Las hemisimetroadhesinas se preparan utilizando las proteínas VGFR-X solas, las inmunosimetroadhesinas se preparan utilizando las proteínas VGFR-X con S-Fc, X-Fc o Fc-X, y las bisimetroadhesinas se preparan utilizando las proteínas VGFR-X con S-Fc-X o X-Fc-X.
Cada proteína VGFR-X o simetroadhesina de VGFR se determina mediante un inmunoensayo cuantitativo usando anticuerpos policlonales purificados por afinidad específicos de subtipo para VGFR1, VGFR2 y VGFR3, e inmunoadhesinas (VGFR1-Ig, VGFR2-Ig y VGFR3-Ig) como patrones de referencia. Los anticuerpos de VGFR, las inmunoadhesinas de VGFR-Ig y la proteína de VEGF165 se obtienen de R&D Systems (MN).
La unión de las simetroadhesinas de VEGR a VEGF se estudia usando un ensayo de unión por saturación de VEGF. Las reacciones (0,1 ml) contienen suero bovino fetal al 10% en PBS (tampón A) con 125I-VEGF165 (<9000 cpm/pocillo, 5,69 x 107 cpm/microgramo). Se usa cloramina T para yodar VEGF165 como se describe (Keyt et al., (1996) J. Biol Chem. 271, 5638-5646). La unión se lleva a cabo durante la noche a 4 °C en presencia o ausencia de 50 nanogramos de VEGF165 purificado sin marcar. El 125I-VEGF165 unido se determina luego mediante captura en placas de ensayo de inmunoabsorción de separación de 96 pocillos (Nunc). Las placas se recubren durante la noche a 4 °C con 2 microgramos/ml de IgG anti-Fc humana de cabra purificada por afinidad (Organon-Teknika) en Na2CO350 mM, pH 9,6, y se bloquean previamente durante 1 hora en tampón A. Las reacciones de unión se incuban en los pocillos recubiertos durante 4 horas a temperatura ambiente, seguido de 4 lavados con tampón A. La fracción de 125I-VEGF165 unida se determina en un contador gamma. Los datos se analizan usando un programa de ajuste de curvas no lineales de 4 parámetros (Kalidagraph, Abelbeck Software, PA).
La unión de VEGF a simetroadhesinas de VEGR también se estudia usando un ensayo de unión competitiva. Las placas de ELISA se recubren con 2 microgramos/ml de F(ab')2 de conejo a Fc de IgG humano (Jackson ImmunoResearch, PA) y se bloquean con tampón A. Se añade a la placa KDR-IgG (3 nanogramos/ml) en tampón A y se incuba durante 1 hora. Las muestras diluidas en serie se incuban con VEGF biotinilado 2 nM durante 1 h en tubos. A continuación, las reacciones se transfieren a las placas de ELISA y se incuban durante 1 h. Después del lavado, la fracción de VEGF biotinilado unido a KDR-Ig se detecta usando estreptavidina marcada con peroxidasa de rábano picante (Sigma, MO) seguida de sustrato de 3,3',5,5'-tetrametilbencidina. Los datos se analizan utilizando un análisis de ajuste de curvas de regresión no lineal de 4 parámetros.
Los estudios de inhibición del crecimiento de células endoteliales se llevan a cabo como se describe (Leung et al., (1989) Science 246, 1306-1309). Se cultivan células endoteliales capilares de la corteza suprarrenal bovina en presencia de medio de Eagle modificado de Dulbecco (GIBCO) bajo en glucosa complementado con suero de ternera al 10% y glutamina 2 mM (medio de crecimiento). Las células se siembran a una densidad de 6 x 103 células/pocillo en placas de 6 pocillos. Se añaden muestras diluidas en serie a las células a concentraciones entre 1 y 5000 nanogramos/ml y se incuban durante 2 a 3 horas. Se añade VEGF165 purificado hasta una concentración final de 3 nanogramos/ml. A continuación, las células se incuban durante 5 a 6 días, se retiran de las placas con tripsina y se determina el número de células en un contador Coulter (Coulter Electronics, FL). Los datos se analizan utilizando un análisis de ajuste de curvas de regresión no lineal de 4 parámetros.
Los estudios de tumores in vivo se llevan a cabo como se describe (Kim et al., (1993) Nature 362, 841-844; Borgstrom et al. (1996) Cancer Res. 56, 4032-4039). Se cultivan células de rabdomiosarcoma A673 humano (ATCC CRL-1598) en DMEM/F12 complementado con suero bovino fetal al 10% y glutamina 2 mM. Se inyectan subcutáneamente ratones desnudos hembra BALB/c, de 6 a 10 semanas de edad, con 2 x 106 células tumorales en el área dorsal en un volumen de 200 microlitros. Después de la inoculación de células tumorales (24 horas), los animales (10 por grupo) se tratan con muestras diluidas en serie a dosis de 0,05 mg/kg, 0,5 mg/kg y 5 mg/kg, administradas dos veces por semana por vía intraperitoneal en un volumen de 0,1 ml. El tamaño del tumor se determina a intervalos semanales. Cuatro semanas después de la inoculación de las células tumorales, los animales se sacrifican y los tumores se extraen y pesan. El análisis estadístico se realiza mediante ANOVA.
Ejemplo 9
Simetroadhesinas de ErbB
Una estrategia terapéutica para tratar enfermedades malignas se basa en receptores similares al factor de crecimiento epidérmico (ErbB) y sus ligandos, incluidas las neuregulinas/herregulinas (NRG/HRG) y la familia de ligandos proteicos relacionados con EGF. Los anticuerpos de ErbB y las inmunoadhesinas de ErbB están bajo investigación clínica y están bien probados en el tratamiento de cánceres de mama metastásicos que sobreexpresan ErbB2.
Por consiguiente, se preparan diversas simetroadhesinas de ErbB usando proteínas ErbB-X, y se analizan para determinar su capacidad para unirse a herregulinas y bloquear la actividad biológica de la herregulina. La actividad de las simetroadhesinas de ErbB se compara con la de las inmunoadhesinas de ErbB (Sliwkowski et al., (1994) J. Biol. Chem. 269, 14661-14665).
La ErbB humana incluye ErbB1 (GenBank acceso No. NM_005228); ErbB2 (GenBank acceso No. NM_004448); ErbB3 (GenBank acceso No. NM_001982); y ErbB4 (GenBank acceso No. NM-005235). ErbB1-X, ErbB2-X, ErbB3-X y ErbB4-X se preparan de acuerdo con el método del Ejemplo 3. Las células huésped se transfectan con vectores de expresión que codifican:
1) un polipéptido quimérico pre-ErbB1-inteína que contiene el dominio extracelular de ErbB1 unido en su terminal C por un enlace peptídico al terminal N de una inteína de autoempalme en el sitio de autoescisión (Figuras 48A-48B);
2) un polipéptido quimérico pre-ErbB2-inteína que contiene el dominio extracelular de ErbB2 unido en su terminal C por un enlace peptídico al terminal N de una inteína de autoempalme en el sitio de autoescisión (Figuras 49A-49B);
3) un polipéptido quimérico pre-ErbB3-inteína que contiene el dominio extracelular de ErbB3 unido en su terminal C por un enlace peptídico al terminal N de una inteína de autoempalme en el sitio de autoescisión (Figuras 50A-50B); y
4) un polipéptido quimérico pre-ErbB4-inteína que contiene el dominio extracelular de ErbB4 unido en su terminal C por un enlace peptídico al terminal N de una inteína de autoempalme en el sitio de autoescisión (Figuras 51A-50B).
La escisión de la secuencia señal ErbB homóloga (parte i) por la peptidasa señal celular proporciona proteínas de fusión ErbB-inteína maduras (parte ii). La escisión del dominio de inteína por corte y empalme de proteínas proporciona un compuesto intermedio ErbB tioéster (parte iii). Finalmente, se emplea la ligación química nativa del ErbB tioéster con cisteína y/o selenocisteína libres para preparar dominios de VEGR con el extremo X del terminal C (parte iv).
Las secuencias de estos polipéptidos se muestran en la SEQ ID NO: 181, SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 183 y SEQ ID NO: 184 (ERBB1); en la SEQ ID NO: 186, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 188 y SEQ ID NO: 189 (ERBB2); en la SEQ ID NO: 191, SEQ ID NO: 192, SEQ ID NO: 193 y SEQ ID NO: 194 (ERBB3); y en la SEQ ID NO: 196, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 198 y SEQ ID NO: 199 (ERBB4).
Los vectores de expresión adecuados se construyen mediante ligación de un inserto y un fragmento de vector preparado por digestión con EcoRI y BglII. Para la expresión no amplificada, el plásmido pErbB1-Mth se construye usando la Se Q ID NO: 25 y la SEQ ID NO: 1, el plásmido pErbB2-Mth se construye usando la SEQ ID NO: 26 y la SEQ ID NO: 1, el plásmido pErbB3-Mth se construye usando la SEQ ID NO: 27 y la SEQ ID NO: 1, y el plásmido pErbB4-Mth se construye usando la SEQ ID NO: 28 y la SEQ ID NO: 1. Para la expresión amplificada, el plásmido pErbB1-Mth-DHFR se construye usando la SEQ ID NO: 25 y pSVeCD4DHFR, el plásmido pErbB2-Mth-DHFR se construye usando la SEQ ID NO: 26 y pSVeCD4DHFR, el plásmido pErbB3-Mth-DHFR se construye usando la SEQ ID NO: 27 y pSVeCD4DHFR, y el plásmido pErbB4-Mth-DHFR se construye usando la SEQ ID NO: 28 y pSVeCD4DHFR.
Los vectores de expresión adecuados se construyen mediante ligación de un fragmento de inserto preparado mediante digestión con Hind III y EagI y un fragmento de vector preparado mediante digestión con Hind III y PspOM1. El plásmido pCADN3-ERBB1-Mth se construye usando la SEQ ID NO: 180 y pCADN3.1(+). El plásmido pCADN3-ERBB2-Mth se construye usando la SEQ ID NO: 185 y pCADN3.1(+). El plásmido pCADN3-ERBB3-Mth se construye usando la SEQ ID NO: 190 y pCADN3.1(+). El plásmido pCADN3-ERBB4-Mth se construye usando la Se Q ID NO: 195 y pCADN3.1(+).
Las proteínas ErbB1-X, ErbB2-X, ErbB3-X y ErbB4-X, individualmente y en diversas combinaciones, se utilizan para preparar diversas simetroadhesinas de VGFr (Tablas 9, 10, 11). También se muestra el número de configuraciones distintas obtenidas para cada combinación, así como la estructura general de cada una.
Las hemisimetroadhesinas se preparan usando las proteínas ErbB-X solas, las inmunosimetroadhesinas se preparan usando las proteínas ErbB-X con S-Fc, X-Fc o Fc-X, y las bisimetroadhesinas se preparan usando las proteínas ErbB-X con S-Fc-X o X-Fc-X.
Cada proteína ErbB-X o simetroadhesina de ErbB se determina mediante un inmunoensayo cuantitativo utilizando anticuerpos policlonales purificados por afinidad específicos de subtipo para ErbB1, ErbB2, ErbB3 y ErbB4, e inmunoadhesinas (ErbB1-Ig, ErbB2-Ig, ErbB3-Ig y ErbB4-Ig) como patrones de referencia. Los anticuerpos de ErbB, las inmunoadhesinas de ErbB-Ig, la proteína NRG1-a177-241, la proteína NRG1-p176-246, la proteína NRG1-p1-246 y la proteína NRG1-SMDF1-296 se obtienen de R&D Systems (MN).
La unión de las simetroadhesinas de ErbB a las neuregulinas se estudia usando un ensayo de unión por saturación de HRG (Sliwkowski et al., (1994) J. Biol. Chem. 269, 14661-14665). Las reacciones se realizan en placas de inmunomódulo de ruptura Nunc. Los pocillos de las placas se recubren a 4 °C durante la noche con 100 microlitros de 5 microgramos/ml de anticuerpo antihumano de cabra (Boehringer Mannheim) en tampón de carbonato 50 mM (pH 9,6). Las placas se enjuagan dos veces con 200 microlitros de tampón de lavado (PBS/Tween-20MR al 0,05%) seguido de una breve incubación con 100 microlitros de BSA/PBS al 1% durante 30 min a temperatura ambiente. Se retira el tampón y cada pocillo se incuba con 100 microlitros de la muestra en BSA/PBS al 1% bajo una vigorosa rotación de lado a lado durante 1 hora. Las placas se enjuagan tres veces con tampón de lavado y la unión competitiva se lleva a cabo añadiendo varias cantidades de competidor frío gamma-HRG y 125I-HRGp1 e incubando a temperatura ambiente durante 2 a 3 horas con rotación vigorosa de lado a lado. Los pocillos se enjuagan rápidamente tres veces con tampón de lavado, se drenan y los pocillos individuales se cuentan en un contador gamma. El análisis de Scatchard se realiza usando un programa de ligando modificado (Munson, P. y Robard, D. (1980) Analytical Biochemistry 107: 220-239).
La capacidad de las simetroadhesinas de ErbB para inhibir la proliferación dependiente de HRG se estudia en la línea celular de carcinoma de mama MCF7 (Lewis et al. (1996) Cancer Res. 56, 1457-1465). La incorporación de 3H-timidina se lleva a cabo en formato de 96 pocillos. Las células MCF7-7 privadas de suero se cultivan en placas a razón de 10.000 células/pocillo en F12/DMEM 50:50 (alto contenido de glucosa). Se incuban concentraciones variables de muestra con HRG 1 nM y se añaden a las células. Después de una incubación de 15 horas, las células se marcan con 3H-timidina para medir la síntesis de ADN (20 ml de patrón de timidina tritiada diluida 1/20: Amersham TRA 120 B363, 1 mCi/ml). A continuación, las células se recogen en unifiltros GF/C (formato de 96 pocillos) usando un recolector Packard Filtermate 196. Los filtros se cuentan usando un aparato Packard Topcount.
Cribado
Esta invención es particularmente útil para cribar compuestos mediante el uso de secuencias de aminoácidos consecutivas/o compuestos que los comprenden en cualquiera de una variedad de técnicas de cribado de fármacos. El compuesto empleado en tal ensayo puede estar libre en solución, fijado a un soporte sólido, soportado sobre una superficie celular o localizado intracelularmente. Un método de selección de fármacos utiliza células huésped eucariotas o procariotas que se transforman de forma estable con ácidos nucleicos recombinantes que expresan el compuesto. Los fármacos se criban frente a tales células transformadas en ensayos de unión competitiva. Estas células, ya sea en forma viable o fija, pueden usarse para ensayos de unión estándar. Se puede medir, por ejemplo, la formación de complejos entre el compuesto o un fragmento y el agente que se está probando. Alternativamente, se puede examinar la disminución en la formación de complejos entre el compuesto y su célula diana o receptores diana causada por el agente que se está probando.
Por lo tanto, en el presente documento también se divulgan métodos de cribado de fármacos o cualquier otro agente que pueda afectar a una enfermedad o trastorno asociado con un tramo de aminoácidos consecutivos del compuesto. Estos métodos comprenden poner en contacto dicho agente con el compuesto o fragmento del mismo y analizar (i) la presencia de un complejo entre el agente y el compuesto o fragmento del mismo, o (ii) la presencia de un complejo entre el compuesto o fragmento del mismo y la célula, mediante métodos bien conocidos en la técnica. En tales ensayos de unión competitiva, típicamente se marca el compuesto o fragmento del mismo. Después de una incubación adecuada, el compuesto libre o fragmento del mismo se separa del presente en forma unida, y la cantidad de marcador libre o no acomplejado es una medida de la capacidad del agente particular para unirse al compuesto o fragmento del mismo o para interferir con el complejo/compuesto/célula.
Otra técnica para el cribado de fármacos proporciona un cribado de alto rendimiento para compuestos que tienen una afinidad de unión adecuada a un polipéptido y se describe en detalle en el documento WO 84/03564, publicado el 13 de septiembre de 1984. En pocas palabras, se sintetizan un gran número de diferentes compuestos de ensayo de péptidos pequeños sobre un sustrato sólido, como alfileres de plástico o alguna otra superficie. Según se aplica al presente compuesto o fragmento del mismo, los compuestos de ensayo de péptidos se hacen reaccionar con el compuesto o fragmento del mismo y se lavan. El compuesto unido o fragmento del mismo se detecta mediante métodos bien conocidos en la técnica. El compuesto purificado o fragmento del mismo también puede recubrirse directamente sobre placas para usar en las técnicas de cribado de fármacos mencionadas anteriormente. Además, se pueden usar anticuerpos no neutralizantes para capturar el péptido e inmovilizarlo sobre el soporte sólido.
Esta divulgación también contempla el uso de ensayos competitivos de cribado de fármacos en los que los anticuerpos neutralizantes capaces de unirse al compuesto o fragmento del mismo compiten específicamente con un compuesto de prueba para unirse al compuesto o fragmento del mismo. De esta manera, los anticuerpos pueden usarse para detectar la presencia de cualquier péptido que comparta uno o más determinantes antigénicos con el tramo o tramos de aminoácidos consecutivos del compuesto.
Diseño racional de fármacos
El objetivo del diseño racional de fármacos es producir análogos estructurales de polipéptidos de interés biológicamente activos (es decir, un compuesto como se divulga en este documento, o una secuencia de aminoácidos de un compuesto como se divulga en este documento) o de pequeñas moléculas con las que interactúan, por ejemplo, agonistas, antagonistas o inhibidores. Cualquiera de estos ejemplos puede usarse para diseñar fármacos que sean formas más activas o estables de un compuesto como se divulga en este documento, o una secuencia de aminoácidos de un compuesto como se divulga en este documento o que mejoran o interfieren con la función de un compuesto como se des divulga cribe en este documento o una secuencia de aminoácidos de un compuesto como se divulga en este documento in vivo (véase, Hodgson, Bio/Technology, 9: 19-21 (1991)).
En un enfoque, la estructura tridimensional de un compuesto como se divulga en este documento, o una secuencia de aminoácidos de un compuesto como se divulga en este documento, o de un complejo compuesto-inhibidor, se determina mediante cristalografía de rayos X, mediante modelado informático o, más típicamente, mediante una combinación de los dos enfoques. Tanto la forma como las cargas de un compuesto como se divulga en este documento, o una secuencia de aminoácidos como se divulga en este documento, deben determinarse para dilucidar la estructura y determinar el sitio o sitios activos. La información estructural relevante se usa para luego diseñar moléculas análogas o para identificar inhibidores eficientes. Los ejemplos útiles de diseño de fármacos racionales pueden incluir moléculas que tienen una actividad o estabilidad mejoradas como se muestra en Braxton y Wells, Biochemistry, 31: 7796-7801 (1992) o que actúan como inhibidores, agonistas o antagonistas de péptidos nativos como se muestra en Athauda et al., J. Biochem., 113: 742-746 (1993).
También es posible aislar un anticuerpo específico de la diana, seleccionado mediante ensayo funcional, como se describió anteriormente, y luego resolver su estructura cristalina. Este enfoque, en principio, produce un núcleo farmacéutico en el que se puede basar el diseño de un fármaco posterior. Es posible evitar la cristalografía de proteínas generando anticuerpos antiidiotípicos (antiid) contra un anticuerpo funcional farmacológicamente activo. Como imagen especular de una imagen especular, se esperaría que el sitio de unión de los antiid fuera un análogo del receptor original. A continuación, el antiid podría usarse para identificar y aislar péptidos de bancos de péptidos producidos química o biológicamente. Los péptidos aislados actuarían entonces como núcleo farmacéutico.
En virtud de la presente invención, se pueden poner a disposición cantidades suficientes de los compuestos divulgados en el presente documento, o una secuencia de aminoácidos de un compuesto divulgado en el presente documento, para realizar estudios analíticos tales como cristalografía de rayos X.
Ensayos de actividad biológica
Los compuestos divulgados en el presente documento, incluidos los componentes de los mismos, tales como un tramo de aminoácidos consecutivos de un compuesto, se analizan fácilmente usando uno o más ensayos estándar de actividad biológica conocidos por los expertos en la técnica. Los siguientes son ejemplos no limitantes de tales ensayos:
Capacidad de los compuestos para inhibir la proliferación estimulada del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) del crecimiento de células endoteliales
Se ensayó la capacidad de los diversos compuestos divulgados en el presente documento para inhibir la proliferación de células endoteliales estimulada por VEGF. Las pruebas positivas en este ensayo indican que el compuesto es útil para inhibir el crecimiento de células endoteliales en mamíferos en los que tal efecto sería beneficioso, por ejemplo, para inhibir el crecimiento de tumores.
En un ejemplo específico del ensayo, las células endoteliales capilares corticales suprarrenales bovinas (ACE) (de cultivo primario, máximo de 12 a 14 pases) se siembran en placas de 96 pocillos a razón de 500 células/pocillo por 100 microlitros. Los medios de ensayo incluyen DMEM bajo en glucosa, suero de ternera al 10%, glutamina 2 mM y 1 x penicilina/estreptomicina/fungizona. Los pocillos de control incluyen lo siguiente: (1) no se agregaron células ACE; (2) células ACE solas; (3) células ACE más 5 ng/ml de FGF; (4) células ACE más 3 ng/ml de VEGF; (5) células ACE más 3 ng/ml de VEGF más 1 ng/ml de TGF-beta; y (6) células ACE más 3 ng/ml de VEGF más 5 ng/ml de LIF. Las muestras de ensayo, compuestos etiquetados con poli-His (en volúmenes de 100 microlitros), se añaden luego a los pocillos (en diluciones del 1%, 0,1% y 0,01%, respectivamente). Los cultivos celulares se incuban durante 6-7 días a 37 °C/CO2 al 5%. Después de la incubación, se aspira el medio de los pocillos y se lavan las células 1x con PBS. A continuación, se añade a cada pocillo una mezcla de reacción de fosfatasa ácida (100 microlitros; acetato de sodio 0,1 M, pH 5,5, Triton X-100 al 0,1%, p-nitrofenilfosfato 10 mM). Después de una incubación de 2 horas a 37 °C, la reacción se detiene mediante la adición de 10 microlitros de NaOH 1M. La densidad óptica (DO) se mide en un lector de microplacas a 405 nm.
La actividad del compuesto ensayado se calcula como el porcentaje de inhibición de la proliferación estimulada por VEGF (3 ng/ml) (según se determina midiendo la actividad de la fosfatasa ácida a una DO de 405 nm) en relación con las células sin estimulación. El TGF-beta se puede emplear como referencia de actividad a razón de 1 ng/ml, ya que TGF-beta bloquea el 70-90% de la proliferación de células ACE estimuladas por VEGF. Los resultados son indicativos de la utilidad del compuesto ensayado en la terapia del cáncer y específicamente en la inhibición de la angiogénesis tumoral. Los valores numéricos (inhibición relativa) se determinan calculando el porcentaje de inhibición de la proliferación estimulada por VEGF por el compuesto ensayado en relación con las células sin estimulación y luego dividiendo ese porcentaje en el porcentaje de inhibición obtenido por TGF-beta a razón de 1 ng/ml que se sabe que bloquea el 70-90% de la proliferación celular estimulada por VEGF. Los resultados se consideran positivos si el compuesto ensayado presenta un 30% o más de inhibición de la estimulación por VEGF del crecimiento de células endoteliales (inhibición relativa del 30% o más).
Supervivencia de las neuronas retinianas
Este ensayo puede demostrar si el compuesto probado tiene eficacia para mejorar la supervivencia de las células neuronales de la retina y, por lo tanto, es útil para el tratamiento terapéutico de trastornos o lesiones de la retina que incluyen, por ejemplo, el tratamiento de la pérdida de visión en mamíferos debido a la retinitis pigmentosa, AMD, etc.
Las crías de rata Sprague Dawley en el día 7 después del nacimiento (población mixta: tipos de neuronas gliales y retinianas) se sacrifican por decapitación después de la anestesia con CO2 y se extraen los ojos en condiciones estériles. La retina neural se disecciona del epitelio pigmentario y de otro tejido ocular y luego se disocia en una suspensión de células individuales usando tripsina al 0,25% en PBS libre de Ca2+, Mg2+. Las retinas se incuban a 37 °C durante 7-10 minutos, después de lo cual se inactiva la tripsina añadiendo 1 ml de inhibidor de tripsina de soja. Las células se cultivan en placas a razón de 100.000 células por pocillo en placas de 96 pocillos en DMEM/F12 suplementado con N2 y con o sin el compuesto de ensayo específico. Las células para todos los experimentos se cultivan a 37 °C en una atmósfera saturada de agua de CO2 al 5%. Después de 2-3 días en cultivo, las células se tiñen con calceína AM, luego se fijan usando paraformaldehído al 4% y se tiñen con DAPI para la determinación del recuento celular total. Las células totales (fluorescentes) se cuantifican con un aumento objetivo de 20x utilizando una cámara CCD y un software de imagen NIH para Macintosh. Los campos en el pocillo se eligen al azar.
El efecto de diversas concentraciones del compuesto probado se informa en este documento en el que el porcentaje de supervivencia se calcula dividiendo el número total de células positivas para calceína AM a los 2-3 días en cultivo por el número total de células marcadas con DAPI a los 2-3días en cultivo. Todo lo que supere el 30% de supervivencia se considera positivo.
Supervivencia de las células fotorreceptoras de bastones
Este ensayo se usa para mostrar si ciertos compuestos divulgados en este documento actúan para mejorar la supervivencia/proliferación de las células fotorreceptoras de bastón y, por lo tanto, son útiles para el tratamiento terapéutico de trastornos o lesiones de la retina que incluyen, por ejemplo, el tratamiento de la pérdida de visión en mamíferos debido a retinitis pigmentosa, AMD, etc. Las crías de rata Sprague Dawley a los 7 días después del nacimiento (población mixta: tipos de células neuronales de la glía y la retina) se sacrifican por decapitación después de la anestesia con CO2 y los ojos se extirpan en condiciones estériles. La retina neural se disecciona del epitelio pigmentario y otro tejido ocular y luego se disocia en una suspensión de células individuales usando tripsina al 0,25% en PBS libre de Ca2+, Mg2+. Las retinas se incuban a 37 °C durante 7-10 minutos, después de lo cual se inactiva la tripsina añadiendo 1 ml de inhibidor de tripsina de soja. Las células se cultivan en placas a razón de 100.000 células por pocillo en placas de 96 pocillos en DMEM/F12 suplementado con N2. Las células para todos los experimentos se cultivan a 37 °C en una atmósfera saturada de agua de CO2 al 5%. Después de 2-3 días en cultivo, las células se fijan con paraformaldehído al 4% y luego se tiñen utilizando CMFDA verde CellT racker. Se usa Rho 4D2 (ascitis o IgG 1: 100), un anticuerpo monoclonal dirigido al pigmento visual rodopsina para detectar células fotorreceptoras de bastones mediante inmunofluorescencia indirecta. Los resultados se calculan como % de supervivencia: número total de células positivas para calceína-rodopsina a los 2-3 días en cultivo, dividido por el número total de células positivas para rodopsina a los 2-3 días en cultivo. Las células totales (fluorescentes) se cuantifican con un aumento objetivo de 20x utilizando una cámara CCD y un software de imagen NIH para Macintosh. Los campos del pocillo se eligen al azar.
Inducción de la apoptosis de células endoteliales
La capacidad de los compuestos divulgados en el presente documento para inducir apoptosis en células endoteliales se puede probar en células endoteliales de vena umbilical venosa humana (HUVEC, Cell Systems). Una prueba positiva en el ensayo indica la utilidad del compuesto en el tratamiento terapéutico de tumores así como trastornos vasculares en los que sería beneficioso inducir la apoptosis de las células endoteliales.
Las células se cultivan en placas de microtitulación de 96 pocillos (Amersham Life Science, microplaca de centelleo cytostar-T, RPNQ160, estéril, tratada con cultivo de tejidos, envuelta individualmente), en suero al 10% (medio CSG, Cell Systems), a una densidad de 2x104 células por pocillo en un volumen total de 100 pl. El día 2, las muestras de prueba que contienen el compuesto de prueba se añaden por triplicado a diluciones de 1%, 0,33% y 0,11%. Los pocillos sin células se utilizaron como blanco y los pocillos con células solo se utilizaron como control negativo. Como control positivo se utilizaron diluciones en serie 1:3 de 50 pl de un patrón 3x de estaurosporina. La capacidad del compuesto para inducir la apoptosis se determina procesando las placas de 96 pocillos para la detección de Anexina V, un miembro de las proteínas de unión a calcio y fosfolípidos, para detectar la apoptosis.
Se diluyeron 0,2 ml de solución madre de Anexina V-Biotina (100 pg/ml) en 4,6 ml de tampón de unión 2x Ca2+ y BSA al 2,5% (dilución 1:25). Se añadieron 50 pl de la solución diluida de Anexina V-Biotina a cada pocillo (excepto los controles) hasta una concentración final de 1,0 pg/ml. Las muestras se incubaron durante 10-15 minutos con anexinabiotina antes de la adición directa de 35S-estreptavidina. Se diluyó 35S-estreptavidina en tampón de unión 2x Ca2+, BSA al 2,5% y se añadió a todos los pocillos a una concentración final de 3x104 cpm/pocillo. A continuación, se sellaron las placas, se centrifugaron a 1000 rpm durante 15 minutos y se colocaron en un agitador orbital durante 2 horas. El análisis se realizó en un 1450 Microbeta Trilux (Wallac). El porcentaje sobre el fondo representa la cantidad porcentual de recuentos por minuto por encima de los controles negativos. Los porcentajes superiores o iguales al 30% por encima del fondo se consideran positivos.
Inhibición de células PDB12
Este ensayo demostrará si los compuestos divulgados en este documento tienen eficacia para inhibir la producción de proteínas por las células ductales pancreáticas PDB12 y, por lo tanto, son útiles en el tratamiento terapéutico de trastornos que implican la secreción de proteínas por el páncreas, incluida la diabetes, y similares.
Las células ductales pancreáticas PDB12 se siembran en placas de 96 pocillos recubiertas con fibronectina a razón de 1,5 x 103 células por pocillo en 100 pl/180 pl de medio de cultivo. A continuación, se añaden al pocillo 100 pl de medio de cultivo con la muestra de ensayo del compuesto o el control negativo que carece del compuesto, para un volumen final de 200 pl. Los controles contienen medio de crecimiento que contiene una proteína que se muestra inactiva en este ensayo. Las células se incuban durante 4 días a 37 °C. Luego se añaden 20 pl de colorante Alamar Blue (AB) a cada pocillo y se mide la lectura fluorescente 4 horas después de la adición de AB, en un lector de placas de microtitulación a 530 nm de excitación y 590 nm de emisión. El estándar empleado son células sin extracto de pituitaria bovina (BPE) y con varias concentraciones de BPE. Los controles de tampón o CM de desconocidos se procesan 2 veces en cada placa de 96 pocillos.
Estos ensayos permiten calcular un porcentaje de disminución en la producción de proteína comparando la concentración de proteína calculada con colorante Alamar Blue producida por las células tratadas con el compuesto con la concentración de proteína calculada con colorante Alamar Blue producida por las células de control negativas. Una disminución del porcentaje en la producción de proteínas mayor o igual al 25% en comparación con las células de control negativo se considera positiva.
Estimulación de hipertrofia cardíaca en adultos
Este ensayo está diseñado para medir la capacidad de los diversos compuestos divulgados en este documento para estimular la hipertrofia del corazón adulto. Una prueba positiva en este ensayo indica que se esperaría que el compuesto fuera útil para el tratamiento terapéutico de diversos trastornos de insuficiencia cardíaca.
Se siembran en placa miocitos ventriculares recién aislados de ratas Sprague Dawley adultas (250 g) a razón de 2000 células/pocillo en un volumen de 180 pl. Las células se aíslan y se cultivan en placa el día 1, las muestras de ensayo que contienen el compuesto o el medio de crecimiento solamente (control negativo) (volumen de 20 pl) se añaden el día 2 y las células se fijan y tiñen el día 5. Después de la tinción, el tamaño de las células se visualiza cuando las células que no muestran ninguna mejora del crecimiento en comparación con las células de control reciben un valor de 0,0, las células que muestran una mejora del crecimiento de pequeña a moderada en comparación con las células de control reciben un valor de 1,0 y las células que muestran una gran mejora del crecimiento en comparación con las células de control reciben un valor de 2,.0. Cualquier grado de mejora del crecimiento en comparación con las células de control negativo se considera positivo para el ensayo.
Proliferación de células PDB12
Este ensayo demuestra si los diversos compuestos divulgados en este documento tienen eficacia para inducir la proliferación de células ductales pancreáticas PDB12 y, por lo tanto, son útiles en el tratamiento terapéutico de trastornos que implican la secreción de proteínas por el páncreas, incluida la diabetes, y similares.
Las células ductales pancreáticas PDB12 se cultivan en placas de 96 pocillos recubiertas con fibronectina a razón de 1,5 x 103 células por pocillo en 100 |jl/180 |jl de medio de cultivo. A continuación, se añaden al pocillo 100 |jl de medio de cultivo con la muestra de ensayo del compuesto o el control negativo que carece del compuesto ensayado, para un volumen final de 200 jil. Los controles contienen medio de crecimiento que contiene una proteína que se muestra inactiva en este ensayo. Las células se incuban durante 4 días a 37 °C. Luego se añaden 20 jil de colorante Alamar Blue (AB) a cada pocillo y se mide la lectura fluorescente 4 horas después de la adición de AB, en un lector de placas de microtitulación a 530 nm de excitación y 590 nm de emisión. El estándar empleado son células sin extracto de pituitaria bovina (BPE) y con varias concentraciones de BPE. Los controles de tampón o medio de crecimiento sólo de los desconocidos se procesan 2 veces en cada placa de 96 pocillos.
El aumento porcentual en la producción de proteínas se calcula comparando la concentración de proteína calculada con colorante Alamar Blue producida por las células tratadas con el compuesto de prueba con la concentración de proteína calculada con colorante Alamar Blue producida por las células de control negativo. Un aumento porcentual en la producción de proteínas mayor o igual al 25% en comparación con las células de control negativo se considera positivo.
Aumento de la hipertrofia neonatal del corazón
Este ensayo está diseñado para medir la capacidad de los compuestos divulgados en este documento para estimular la hipertrofia del corazón neonatal. La prueba positiva en este ensayo indica que los compuestos son útiles para el tratamiento terapéutico de varios trastornos de insuficiencia cardíaca.
Se obtienen miocitos cardíacos de ratas Harlan Sprague Dawley de 1 día de edad. Las células (180 j l a razón de 7,5 x 104/ml, suero <0,1%, recién aisladas) se añaden el día 1 a placas de 96 pocillos previamente recubiertas con DMEM/F12 FCS al 4%. Las muestras de prueba que contienen solo el compuesto de prueba o el medio de crecimiento (control negativo) (20 jl/pocillo) se agregan directamente a los pocillos el día 1. A continuación, se agrega PGF (20 jl/pocillo) el día 2 a una concentración final de 10-6 M. A continuación, las células se tiñen el día 4 y reciben un puntaje visualmente el día 5, en el que las células que no muestran aumento de tamaño en comparación con los controles negativos reciben un puntaje de 0,0; las células que muestran un aumento de tamaño pequeño a moderado en comparación con los controles negativos reciben un puntaje de 1,0 y las células que muestran un gran aumento de tamaño en comparación con los controles negativos reciben un puntaje de 2,0. Un resultado positivo en el ensayo es una puntuación de 1,0 o más.
Actividad estimuladora en el ensayo de reacción mixta de linfocitos (MLR)
Este ensayo se usa para determinar si los compuestos divulgados en este documento son activos como estimuladores de la proliferación de linfocitos T estimulados. Los compuestos que estimulan la proliferación de linfocitos son útiles terapéuticamente cuando es beneficiosa la potenciación de una respuesta inmunitaria. Un agente terapéutico puede tomar la forma de antagonistas de los compuestos divulgados en este documento, por ejemplo, anticuerpos humanos, humanizados o quiméricos murino-humanos contra el compuesto.
El protocolo básico para este ensayo se describe en Current Protocols in Immunology, unidad 3.12; editado por J E Coligan, A M Kruisbeek, D H Marglies, E M Shevach, W Strober, National Insitutes of Health, Publicado por John Wiley & Sons, Inc.
Más específicamente, en una variante de ensayo, las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se aíslan de individuos mamíferos, por ejemplo, un voluntario humano, mediante leucoféresis (un donante suministrará PBMC estimulantes, el otro donante suministrará PBMC que responden). Si se desea, las células se congelan en suero bovino fetal y DMSO después del aislamiento. Las células congeladas se pueden descongelar durante la noche en medio de ensayo (37 °C, CO2 al 5%) y luego se lavan y resuspenden hasta 3x106 células/ml de medio de ensayo (RPMI; suero bovino fetal al 10%, penicilina/estreptomicina al 1%, glutamina al 1%, HEPES al 1%, aminoácidos no esenciales al 1%, piruvato al 1%). Las PBMC estimulantes se preparan irradiando las células (aproximadamente 3000 Rads).
El ensayo se prepara sembrando en placas en pocillos por triplicado una mezcla de:
100: 1 de muestra de prueba diluida al 1% o al 0,1%, 50: 1 de células estimuladoras irradiadas y 50: 1 de células PBMC que responden.
Se utilizan 100 microlitros de medio de cultivo celular o 100 microlitros de CD4-IgG como control. A continuación, los pocillos se incuban a 37 °C, CO2 al 5% durante 4 días. El día 5, cada pocillo se pulsa con timidina tritiada (1,0 mC/pocillo; Amersham). Después de 6 horas, las células se lavan 3 veces y luego se evalúa la absorción del marcador.
En otra variante de este ensayo, las PBMC se aíslan de los bazos de ratones Balb/c y ratones C57B6. Las células se extraen de bazos recién recolectados en medios de ensayo (RPMI; suero bovino fetal al 10%, penicilina/estreptomicina al 1%, glutamina al 1%, HEPES al 1%, aminoácidos no esenciales al 1%, piruvato al 1%) y las PBMC se aíslan superponiendo estas células sobre Lympholyte M (Organon Teknika), centrifugando a 2000 rpm durante 20 minutos, recogiendo y lavando la capa de células mononucleares en medio de ensayo y resuspendiendo las células a razón de 1x107 células/ml de medio de ensayo. A continuación, se realiza el ensayo como se describió anteriormente.
Los aumentos positivos sobre el control se consideran positivos, prefiriéndose los aumentos superiores o iguales al 180%. Sin embargo, cualquier valor mayor que el control indica un efecto estimulante para la proteína de prueba.
Inducción de c-Fos en pericitos
Este ensayo muestra la capacidad de los compuestos divulgados en el presente documento para inducir la expresión de c-fos en células de pericito y, por lo tanto, su uso no solo como marcadores de diagnóstico para tipos particulares de tumores asociados a pericitos, sino también para dar lugar a antagonistas que se esperaría que fueran útiles para el tratamiento terapéutico de tumores asociados a pericitos. Específicamente, el día 1, los pericitos se reciben de VEC Technologies y todos los medios excepto 5 ml se retiran del matraz. El día 2, los pericitos se tripsinizan, se lavan, se centrifugan y luego se colocan en placas de 96 pocillos. El día 7, se retira el medio y los pericitos se tratan con 100 |jl de muestras de compuesto de prueba y controles (control positivo = DME suero al 5% /- PDGF a razón de 500 ng/ml; control negativo = proteína 32). Las réplicas se promedian y se determinan la SD/CV. Las veces que aumenta el valor de la Proteína 32 (control de tampón) indicada por la lectura del luminómetro de las unidades de quimioluminiscencia (RLU), frente a la frecuencia se representa en un histograma. El doble del valor de Proteína 32 se considera positivo para el ensayo. Matriz ASY: Medio de crecimiento = DMEM bajo en glucosa = FBS al 20% 1x penicilina/estreptomicina 1x fungizona. Media del ensayo = DMEM bajo en glucosa FBS al 5%.
Capacidad de los compuestos divulgados en este documento para estimular la liberación de proteoglicanos del cartílago
La capacidad de los compuestos divulgados en el presente documento para estimular la liberación de proteoglicanos del tejido del cartílago se puede probar de ka siguiente manera.
Se disecciona asépticamente la articulación metacarfofalángica de cerdos de 4 a 6 meses y se extrae el cartílago articular mediante corte a mano alzada, teniendo cuidado de evitar el hueso subyacente. El cartílago se trituró y se cultivó a granel durante 24 horas en una atmósfera humidificada de 95% de aire, 5% de CO2 en medio libre de suero (SF) (DME/F12 1:1) con BSA al 0,1% y 100 U/ml de penicilina y 100 jg/m l de estreptomicina. Después de lavar tres veces, se colocan alícuotas de aproximadamente 100 mg de cartílago articular en tubos micrónicos y se incuban durante 24 horas más en el medio SF anterior. A continuación, el compuesto se añade al 1% solo o en combinación con 18 ng/ml de interleucina-1 alfa, un estimulador conocido de la liberación de proteoglicanos del tejido del cartílago. A continuación, el sobrenadante se recoge y se analiza la cantidad de proteoglicanos usando el ensayo calorimétrico de 1,9-dimetil-azul de metileno (DMB) (Farndale y Buttle, Biochem. Biophys. Acta 883: 173-177 (1985)). Un resultado positivo en este ensayo indica que el compuesto de prueba encontrará uso, por ejemplo, en el tratamiento de problemas articulares relacionados con el deporte, defectos del cartílago articular, osteoartritis o artritis reumatoide.
Ensayo de permeabilidad vascular cutánea
Este ensayo se usa para probar si los compuestos divulgados en el presente documento estimulan una respuesta inmune e inducen inflamación al inducir la infiltración de células mononucleares, eosinófilos y PMN en el sitio de inyección del animal. Los compuestos que estimulan una respuesta inmune son útiles terapéuticamente cuando la estimulación de una respuesta inmune es beneficiosa. Este ensayo de permeabilidad vascular de la piel se realiza como sigue. Se anestesian cobayas sin pelo que pesan 350 gramos o más con ketamina (75-80 mg/kg) y 5 mg/kg de xilacina por vía intramuscular (IM). Una muestra del compuesto purificado divulgado en este documento o una muestra de prueba de medio acondicionado se inyecta por vía intradérmica en el lomo de los animales de prueba con 100 j l por sitio de inyección. Es posible tener aproximadamente 10-30, preferiblemente aproximadamente 16-24, lugares de inyección por animal. Se inyecta intracardialmente un j l de colorante azul de Evans (1% en solución salina tamponada fisiológica). A continuación, se miden las imperfecciones en los lugares de inyección (mm de diámetro) 1 hora y 6 horas después de la inyección. Los animales se sacrificaron 6 horas después de la inyección. Cada sitio de inyección de piel se biopsia y se fija en formalina. Luego, las pieles se preparan para la evaluación histopatológica. Cada sitio se evalúa para detectar infiltración de células inflamatorias en la piel. Los sitios con inflamación celular inflamatoria visible se puntúan como positivos. Las células inflamatorias pueden ser neutrofílicas, eosinofílicas, monocíticas o linfocíticas. Al menos un infiltrado perivascular mínimo en el sitio de inyección se puntúa como positivo, ningún infiltrado en el sitio de inyección se puntúa como negativo.
Aumento de la hipertrofia neonatal cardíaca inducida por F2a
Este ensayo está diseñado para medir la capacidad de los compuestos divulgados en este documento para estimular la hipertrofia del corazón neonatal, una prueba positiva que indica la utilidad para el tratamiento terapéutico de diversos trastornos de insuficiencia cardíaca.
Se obtuvieron miocitos cardíacos de ratas Harían Sprague Dawley de 1 día de edad. Las células (180 |jl a razón de 7,5 x 104/ml, suero <0,1%, recién aisladas) se añaden el día 1 a placas de 96 pocilios previamente recubiertas con DMEM/F12 FCS al 4%. Las muestras de ensayo que contienen el compuesto de ensayo (20 jl/pocillo) se añaden directamente a los pocillos el día 1. A continuación, se añade PGF (20 jl/pocillo) el día 2 a una concentración final de 10-6 M. Las células se tiñen luego el día 4 y puntúan visualmente el día 5. Las puntuaciones visuales se basan en el tamaño de las células, en las que las células que no muestran ningún aumento de tamaño en comparación con los controles negativos se puntúan con 0,0, las células que muestran un aumento de tamaño pequeño a moderado en comparación con los controles negativos se puntúan con 1,0 y las células que muestran un gran aumento de tamaño en comparación con los controles negativos se puntúan con 2,0. Una puntuación de 1,0 o más se considera positiva.
No se incluye PBS, ya que la concentración de calcio es crítica para la respuesta del ensayo. Las placas se recubren con DMEM/F12 más FCS al 4% (200 jl/pocillo). Los medios de ensayo incluyeron: DMEM/F12 (con 2,44 g de bicarbonato), jg/m l de transferrina, 1 jg/m l de insulina, 1 jg/m l de aprotinina, 2 mmol/l de glutamina, 100 U/ml de penicilina G, 100 jg/m l de estreptomicina. El tampón proteico que contenía manitol (4%) produjo una señal positiva (puntuación 3,5) a 1/10 (0,4%) y 1/100 (0,04%), pero no a 1/1000 (0,004%). Por lo tanto, no se procesa el tampón de muestra de prueba que contiene manitol.
Actividad inhibitoria en el ensayo de reacción mixta de linfocitos (MLR)
Este ejemplo muestra que uno o más de los compuestos divulgados en este documento son activos como inhibidores de la proliferación de linfocitos T estimulados. Los compuestos que inhiben la proliferación de linfocitos son útiles terapéuticamente cuando es beneficiosa la supresión de una respuesta inmune.
El protocolo básico para este ensayo se describe en Current Protocols in Immunology, unidad 3.12; editado por J E Coligan, A M Kruisbeek, D H Marglies, E M Shevach, W Strober, National Insitutes of Health, Publicado por John Wiley & Sons, Inc.
Más específicamente, en una variante de ensayo, las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se aíslan de individuos mamíferos, por ejemplo, un voluntario humano, mediante leucoféresis (un donante proporcionará PBMC estimulantes, el otro donante proporcionará PBMC que responden). Si se desea, las células se congelan en suero bovino fetal y DMSO después del aislamiento. Las células congeladas se pueden descongelar durante la noche en medio de ensayo (37 °C, CO2 al 5%) y luego lavar y resuspender a 3x106 células/ml de medio de ensayo (RPMI; suero bovino fetal al 10%, penicilina/estreptomicina al 1%, glutamina 1%, HEPES al 1%, aminoácidos no esenciales al 1%, piruvato al 1%). Las PBMC estimulantes se preparan irradiando las células (aproximadamente 3000 Rads).
El ensayo se prepara sembrando en placa en pocillos por triplicado una mezcla de:
100:1 de muestra de prueba diluida al 1% o al 0,1%, 50:1 de células estimuladoras irradiadas, y
50:1 de células PBMC que responden.
Se utilizan 100 microlitros de medio de cultivo celular o 100 microlitros de CD4-IgG como control. A continuación, los pocillos se incuban a 37 °C, CO2 al 5% durante 4 días. El día 5, cada pocillo se pulsa con timidina tritiada (1,0 mC/pocillo; Amersham). Después de 6 horas, las células se lavan 3 veces y luego se evalúa la absorción del marcador.
En otra variante de este ensayo, las PBMC se aíslan de los bazos de ratones Balb/c y ratones C57B6. Las células se extraen de bazos recién recolectados en medios de ensayo (RPMI; suero bovino fetal al 10%, penicilina/estreptomicina al 1%, glutamina al 1%, HEPES al 1%, aminoácidos no esenciales al 1%, piruvato al 1%) y las PBMC se aíslan superponiendo estas células sobre Lympholyte M (Organon Teknika), centrifugando a 2000 rpm durante 20 minutos, recogiendo y lavando la capa de células mononucleares en medio de ensayo y resuspendiendo las células hasta 1x107 células/ml de medio de ensayo. A continuación, se realiza el ensayo como se describió anteriormente.
Se considera que cualquier disminución por debajo del control es un resultado positivo para un compuesto inhibidor, prefiriéndose disminuciones menores o iguales al 80%. Sin embargo, cualquier valor menor que el control indica un efecto inhibidor para la proteína de prueba.
Inducción de apoptosis de células endoteliales (ELISA)
La capacidad de los compuestos divulgados en el presente documento para inducir apoptosis en células endoteliales se puede probar en células endoteliales de vena umbilical venosa humana (HUVEC, Cell Systems) usando un formato de 96 pocillos, en medio de suero al 0% suplementado con 100 ng/ml de VEGF, bSa al 0,1%, 1x penicilina/ estreptomicina.
Un resultado positivo en este ensayo indica la utilidad del compuesto para tratar terapéuticamente cualquiera de una variedad de afecciones asociadas con el crecimiento celular endotelial no deseado que incluye, por ejemplo, la inhibición del crecimiento tumoral. El recubrimiento de placas de 96 pocillos se puede preparar dejando que se produzca la gelatinización durante más 30 minutos con 100 j l de gelatina al 0,2% en solución de PBS. La mezcla de gelatina se aspira completamente antes de sembrar en placa las células HUVEC a una concentración final de 2x104 células/ml en medio que contiene suero al 10%, volumen de 100 |jl por pocillo. Las células se cultivaron durante 24 horas antes de añadir las muestras de ensayo que contenían el compuesto de interés.
A todos los pocillos, se añaden 100 j l de medio de suero al 0% (Cell Systems) complementado con 100 ng/ml de VEGF, BSA al 0,1%, 1x penicilina/ estreptomicina. Las muestras de prueba que contenían el compuesto de prueba se añadieron por triplicado a diluciones de 1%, 0,33% y 0,11%. Los pocillos sin células se utilizaron como blanco y los pocillos con células solo se utilizaron como control negativo. Como control positivo, se utilizan diluciones en serie 1:3 de 50 j l de un patrón 3x de estaurosporina. Las células se incubaron durante 24 a 35 horas antes de ELISA.
Se usa ELISA para determinar los niveles de apoptosis preparando soluciones de acuerdo con el Manual de Boehringer [Boehringer, Cell Death Detection ELISA plus, Cat No. 1 920 685]. Preparaciones de la muestra: se centrifugan placas de 96 pocillos a 1 krpm durante 10 minutos (200 g); el sobrenadante se elimina mediante inversión rápida, colocando la placa boca abajo sobre una toalla de papel para eliminar el líquido residual. A cada pocillo, se añaden 200 j l de tampón de lisis 1x y se deja la incubación a temperatura ambiente durante 30 minutos sin agitar. Las placas se centrifugaron durante 10 minutos a 1 krpm y se transfirieron 20 j l del lisado (fracción citoplásmica) a MTP recubierto con estreptavidina. Se añadieron 80 j l de mezcla de inmunorreactivos a los 20 j l de lisado en cada pocillo. El MTP se cubrió con una lámina adhesiva y se incubó a temperatura ambiente durante 2 horas colocándolo en un agitador orbital (200 rpm). Después de dos horas, el sobrenadante se eliminó por succión y los pocillos se enjuagaron tres veces con 250 j l de tampón de incubación 1x por pocillo (eliminado por succión). Se añadió solución de sustrato (100 j l) en cada pocillo y se incubó en un agitador orbital a temperatura ambiente a 250 rpm hasta que el desarrollo de color fue suficiente para un análisis fotométrico (aproximadamente después de 10-20 minutos). Se utilizó un lector de 96 pocillos para leer las placas a 405 nm, longitud de onda de referencia, 492 nm. Los niveles obtenidos para PIN 32 (tampón de control) se establecieron en 100%. Las muestras con niveles> 130% se consideraron positivas para la inducción de apoptosis.
Ensayo de flujo de calcio de células endoteliales venosas humanas
Este ensayo está diseñado para determinar si los compuestos divulgados en el presente documento muestran la capacidad de estimular el flujo de calcio en las células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC, Cell Systems). El influjo de calcio es una respuesta bien documentada tras la unión de ciertos ligandos a sus receptores. Se puede decir que un compuesto de prueba que da como resultado una respuesta positiva en el presente ensayo de entrada de calcio se une a un receptor específico y activa una ruta de señalización biológica en las células endoteliales humanas. En última instancia, esto podría conducir, por ejemplo, a la división de células endoteliales, inhibición de la proliferación de células endoteliales, formación de tubos endoteliales, migración celular, apoptosis, etc.
Las células endoteliales de la vena umbilical venosa humana (HUVEC, Cell Systems) en medio de crecimiento (50:50 sin glicina, glutamina al 1%, Hepes 10 mM, FBS al 10%, 10 ng/ml de bFGF) se siembran en placa en placas de microtitulación de 96 pocillos ViewPlates-96 (Packard Instrument Company Parte # 6005182) a una densidad celular de 2x104 células/pocillo. El día después de la siembra en placa, las células se lavan tres veces con tampón (HBSS más Hepes 10 mM), dejando 100 jl/pocillo. A continuación, se añaden 100 jl/pocillo de Fluo-38 jM (2x). Las células se incuban durante 1,5 horas a 37 °C/CÜ2 al 5%. Después de la incubación, las células se lavan 3 veces con tampón (descrito anteriormente) dejando 100 jl/pocillo. Las muestras de ensayo del compuesto se preparan en diferentes placas de 96 pocillos a una concentración de 5x en tampón. El control positivo corresponde a ionomicina 50 jM (5x); el control negativo corresponde a la proteína 32. La placa celular y las placas de muestra se procesan en una máquina FLIPR (Molecular Devices) La máquina FLIPR agregó 25 j l de muestra de prueba a las células, y las lecturas se tomaron cada segundo durante un minuto, luego cada 3 segundos durante los siguientes tres minutos.
Se calcula el cambio de fluorescencia desde la línea base hasta el aumento máximo de la curva (cambio A) y se promedian las réplicas. Se monitoriza la velocidad de aumento de la fluorescencia, y solo se consideran positivas aquellas muestras que tuvieron un cambio A superior a 1000 y un aumento en 60 segundos.
Proliferación de fibroblasto (BHK-21)
Este ensayo mostrará si los compuestos divulgados en el presente documento actúan para inducir la proliferación de células de fibroblastos de mamíferos en cultivo y, por lo tanto, la función es factores de crecimiento útiles en sistemas de mamíferos.
El ensayo se realiza a continuación. Células de fibroblastos BHK-21 sembradas en medio de crecimiento estándar a razón de 2500 células/pocillo en un volumen total de 100 jl. A continuación, se añade a los pocillos el compuesto, beta-FGF (control positivo) o nada (control negativo) en presencia de 1 jg/m l de heparina para un volumen final total de 200 jl. A continuación, las células se incuban a 37 °C durante 6 a 7 días. Después de la incubación, se retira el medio, se lavan las células con PBS y luego se agrega una mezcla de reacción de sustrato de fosfatasa ácida (100 jl/pocillo). A continuación, las células se incuban a 37 °C durante 2 horas. A continuación, se añaden 10 j l por pocillo de NaÜH 1 N para detener la reacción de la fosfatasa ácida. A continuación, se leen las placas a una DÜ 405 nm. Un resultado positivo en el ensayo es la actividad de la fosfatasa ácida que está al menos un 50% por encima del control negativo.
Inhibición de la hipertrofia del corazón en adultos
Este ensayo está diseñado para medir la inhibición de la hipertrofia del corazón del adulto. Los compuestos que dan positivo en este ensayo pueden resultar útiles en el tratamiento terapéutico de los trastornos cardíacos asociados con la hipertrofia cardíaca.
Los miocitos ventriculares se aíslan en forma fresca de ratas Harlan Sprague Dawley adultas (250 g) y las células se cultivan en placas a razón de 2000/pocillo en un volumen de 180 pl. El segundo día, se añaden muestras de prueba (20 pl) que contienen el compuesto de prueba. El día cinco, las células se fijan y luego se tiñen. También se puede medir un aumento en el mensaje de ANP mediante PCR a partir de células después de unas pocas horas. Los resultados se basan en una puntuación visual del tamaño de las células: 0 = sin inhibición, -1 = pequeña inhibición, -2 = gran inhibición. Una puntuación inferior a 0 se considera positiva. La actividad de referencia corresponde a la fenilefrina (PE) a 0,1 mM, es un control positivo. Medios de ensayo incluidos: M199 (modificado) sin glutamina, NaHCO3, rojo fenol, suplementado con insulina 100 nM, BSA al 0,2%, cretina 5 mM, L-carnitina 2 mM, taurina 5 mM, 100 U/ml de penicilina G, 100 pg/ml de estreptomicina (medio CCT). En placas de 96 pocillos solo se utilizan 60 pocillos internos. De estos, 6 pocillos están reservados para controles negativos y positivos (PE).
Inducción de c-fos en células endoteliales
Este ensayo está diseñado para determinar si los compuestos divulgados en el presente documento muestran la capacidad de inducir c-fos en células endoteliales. Se esperaría que los compuestos que dan positivo en este ensayo sean útiles para el tratamiento terapéutico de afecciones o trastornos en los que la angiogénesis sería beneficiosa, incluyendo, por ejemplo, la cicatrización de heridas y similares (serían agonistas de estos compuestos). Se esperaría que los antagonistas de los compuestos que dan positivo en este ensayo sean útiles para el tratamiento terapéutico de tumores cancerosos.
Células endoteliales de vena umbilical venosa humana (HUVEC, Cell Systems) en medio de crecimiento (F12 de Ham al 50% sin GHT: glucosa baja y DMEM al 50% sin glicina: con NaHCO3, glutamina al 1%, HEPES 10 mM, FBS al 10%, 10 ng/ml de bFGF) se siembran en placas de microtitulación de 96 pocillos a una densidad celular de 1x104 células/pocillo. El día después de la siembra en placa, a las células se les quita el medio de alimentación removiendo el medio de crecimiento y tratando las células con 100 pl/pocillo de muestras de prueba y controles (control positivo = medio de crecimiento; control negativo = tampón de proteína 32 = HEPES 10 mM, NaCl 140 mM, manitol 4 % (p/v), pH 6,8). Las células se incuban durante 30 minutos a 37 °C, en CO2 al 5%. Se extraen las muestras y se sigue la primera parte del protocolo del kit de b-ADN (Chiron Diagnostics catálogo No. 6005-037), en el que cada reactivo/tampón en mayúsculas que se enumera a continuación está disponible en el kit.
En resumen, las cantidades de Tampón de Lisis TM y las Sondas necesarias para las pruebas se calculan basándose en la información proporcionada por el fabricante. Se añaden las cantidades adecuadas de Sondas descongeladas al Tampón de Lisis Tm . El Tampón de Hibridación de Captura se calienta a temperatura ambiente. Las tiras de b-ADN se colocan en los soportes de tiras de metal y se añaden 100 pl de Tampón de Hibridación de Captura a cada pocillo de b-ADN necesario, seguido de incubación durante al menos 30 minutos. Las placas de prueba con las células se retiran de la incubadora y el medio se retira suavemente utilizando el colector de vacío. Se pipetean rápidamente 100 pl de Tampón de Hibridación de Lisis con Sondas en cada pocillo de las placas de microtitulación. A continuación, las placas se incuban a 55 °C durante 15 minutos. Al retirarlas de la incubadora, las placas se colocan en el mezclador de vórtice con el cabezal del adaptador de microtitulación y se agitan con vórtice en la posición # 2 durante un minuto. Se retiran 80 pl del lisado y se añaden a los pocillos de b-ADN que contienen el Tampón de Hibridación de Captura y se pipetean hacia arriba y hacia abajo para mezclar. Las placas se incuban a 53 °C durante al menos 16 horas.
Al día siguiente, se sigue la segunda parte del protocolo del kit de b-ADN. Específicamente, las placas se retiran de la incubadora y se colocan en el banco para que se enfríen durante 10 minutos. Los volúmenes de adiciones necesarios se calculan con base en la información proporcionada por el fabricante. Se prepara una Solución de Trabajo del Amplificador haciendo una dilución 1:100 del Concentrado de Amplificador (20 fm/pl) en Tampón de Hibridación AL. La mezcla de hibridación se retira de las placas y se lava dos veces con Lavado A. Se añaden 50 pl de Solución de Trabajo del Amplificador a cada pocillo y los pocillos se incuban a 53 °C por 30 minutos. A continuación, las placas se retiran de la incubadora y se dejan enfriar durante 10 minutos. La Solución de Trabajo de la Sonda de Marcación se prepara haciendo una dilución 1:100 de concentrado de marcación (40 pmoles/pl) en Tampón de Hibridación AL. Después del período de enfriamiento de 10 minutos, se retira la mezcla de hibridación del amplificador y las placas se lavan dos veces con Lavado A. Se agregan 50 pl de Solución de Trabajo de la Sonda de Marcación a cada pocillo y los pocillos se incuban a 53 °C durante 15 minutos. Después de enfriar durante 10 minutos, el Sustrato se calienta a temperatura ambiente. Tras la adición de 3 pl de Potenciador de Sustrato a cada ml de Sustrato necesario para el ensayo, las placas se dejan enfriar durante 10 minutos, se retira la mezcla de hibridación de marcación y las placas se lavan dos veces con Lavado A y tres veces con Lavado D. Se añaden 50 pl de la Solución de Sustrato con Potenciador a cada pocillo. Las placas se incuban durante 30 minutos a 37 °C y se lee el RLU en un luminómetro apropiado.
Se promedian las repeticiones y se determina el coeficiente de variación. La medida de la actividad del aumento de veces sobre el valor del control negativo (proteína 32/tampón HEPES descrito anteriormente) se indica mediante unidades de quimioluminiscencia (RLU). Los resultados se consideran positivos si el compuesto presenta al menos un valor doble sobre el control de tampón negativo. Control negativo = 1,00 RLU a una dilución del 1,00%. Control positivo = 8,39 RLU a una dilución del 1,00%.
Fuga vascular de conejillo de indias
Este ensayo está diseñado para determinar si los compuestos divulgados en este documento muestran la capacidad de inducir permeabilidad vascular. Se espera que los compuestos que dan positivo en este ensayo sean útiles para el tratamiento terapéutico de afecciones que se beneficiarían de una mayor permeabilidad vascular, incluidas, por ejemplo, afecciones que pueden beneficiarse de una mayor infiltración de células del sistema inmunológico local.
Se anestesian conejillos de indias sin pelo que pesan 350 gramos o más con ketamina (75-80 mg/kg) y 5 mg/kg de xilacina por vía intramuscular. Las muestras de prueba que contienen el compuesto de prueba o un tampón fisiológico sin el compuesto de prueba se inyectan en la piel del lomo de los animales de prueba con 100 |jl por sitio de inyección por vía intradérmica. Hay aproximadamente 16-24 sitios de inyección por animal. Luego se inyecta intracardialmente un ml de colorante azul de Evans (1% en PBS). Las respuestas de permeabilidad vascular de la piel a los compuestos (es decir, imperfecciones en los lugares de inyección) se puntúan visualmente midiendo el diámetro (en mm) de las fugas de color azul desde el lugar de la inyección 1 y 6 horas después de la administración de los materiales de prueba. Se observa el diámetro en mm de azul en el lugar de la inyección y se registra bien la gravedad de la fuga vascular. Las imperfecciones de al menos 5 mm de diámetro se consideran positivas para el ensayo cuando se analizan proteínas purificadas, lo que es indicativo de la capacidad de inducir fuga vascular o permeabilidad. Una respuesta de más de 7 mm de diámetro se considera positiva para las muestras de medios acondicionados. Se utiliza VEGF humano a razón de 0,1 jg/100 j l como control positivo, que induce una respuesta de 15-23 mm de diámetro.
Detección de apoptosis de células endoteliales (FACS)
La capacidad de los compuestos divulgados en este documento para inducir apoptosis en células endoteliales se prueba en células endoteliales de vena umbilical venosa humana (HUVEC, Cell Systems) en matraces T175 gelatinizados usando células HUVEC por debajo del pase 10. Se espera que los compuestos que dan positivo en este ensayo para ser útiles para el tratamiento terapéutico de afecciones en las que la apoptosis de células endoteliales sería beneficiosa, incluyen, por ejemplo, el tratamiento terapéutico de tumores.
El día uno, las células se dividen [420.000 células por placa gelatinizada de 6 cm (11x103 células/cm2 Falcon, Primaria)] y se cultivan en medio que contiene suero (CS-C, Cell System) durante la noche o de 16 a 24 horas.
El día 2, las células se lavan 1x con 5 ml de PBS; se añaden 3 ml de medio de suero al 0% con VEGF (100 ng/ml); y se añaden 30 j l del compuesto de prueba PRO (dilución final al 1%) o medio de suero al 0% (control negativo). Las mezclas se incuban durante 48 horas antes de la recolección.
A continuación, se recogen las células para el análisis FACS. El medio se aspira y las células se lavan una vez con PBS. Se añaden 5 ml de tripsina 1x a las células en un matraz T-175, y las células se dejan reposar hasta que se liberan de la placa (aproximadamente 5-10 minutos). La tripsinización se detiene añadiendo 5 ml de medio de cultivo. Las células se centrifugan a 1000 rpm durante 5 minutos a 4 °C. El medio se aspira y las células se resuspenden en 10 ml de medio complementado con suero al 10% (Cell Systems), se añaden 5 j l de Anexina-FITC (BioVison) y se envían tubos refrigerados para FACS. Se determina que un resultado positivo aumenta la apoptosis en las muestras tratadas con el compuesto y se compara con el control negativo.
Inducción de c-fos en neuronas corticales
Este ensayo está diseñado para determinar si los compuestos probados muestran la capacidad de inducir c-fos en neuronas corticales. Se esperaría que los compuestos que dan positivo en este ensayo sean útiles para el tratamiento terapéutico de trastornos y lesiones del sistema nervioso en los que la proliferación neuronal sería beneficiosa.
Las neuronas corticales se disocian y se siembran en medio de crecimiento a razón de 10.000 células por pocillo en placas de 96 pocillos. Después de aproximadamente 2 divisiones celulares, las células se tratan durante 30 minutos con el compuesto o nada (control negativo). A continuación, las células se fijan durante 5 minutos con metanol frío y se tiñen con un anticuerpo dirigido contra CREB fosforilado. A continuación, se calculan los niveles de ARNm usando quimioluminiscencia. Un positivo en el ensayo es cualquier factor que dé como resultado un aumento de al menos 2 veces en el mensaje de c-fos comparado con los controles negativos.
Estimulación de la formación del tubo endotelial
Este ensayo está diseñado para determinar si los compuestos divulgados en el presente documento muestran la capacidad de promover la formación de lumen y vacuola endotelial en ausencia de factores de crecimiento exógenos. Se esperaría que los compuestos que dan positivo en este ensayo sean útiles para el tratamiento terapéutico de trastornos en los que la formación de vacuola endotelial y/o lumen sería beneficiosa, incluyendo, por ejemplo, cuando la estimulación de pinocitosis, bombeo de iones, permeabilidad vascular y/o formación de uniones sería beneficiosa.
Se mezclan células HUVEC (pase <8 del primario) con colágeno de cola de rata tipo I (concentración final 2,6 mg/ml) a una densidad de 6x105 células por ml y se cultivan en placas a razón de 50 |jl por pocillo de medio de cultivo M199 complementado con FBS al 1% y colorante 6-FAM-FITc 1 jM para teñir las vacuolas mientras se forman y en presencia del compuesto de prueba. A continuación, las células se incuban a 37 °C/CÜ2 al 5% durante 48 horas, se fijan con formalina al 3,7% a temperatura ambiente durante 10 minutos, se lavan 5 veces con medio M199 y luego se tiñen con Rh-Faloidina a 4 °C durante la noche seguido de tinción nuclear con DAPI 4 jM . Un resultado positivo en el ensayo es cuando hay vacuolas presentes en más del 50% de las células.
Detección de compuestos como se divulga en el presente documento que afectan la captación de glucosa y/o FFA en el músculo esquelético
Este ensayo está diseñado para determinar si los compuestos divulgados en el presente documento muestran la capacidad de afectar la captación de glucosa o FFA por las células del músculo esquelético. Se esperaría que los compuestos que dan positivo en este ensayo sean útiles para el tratamiento terapéutico de trastornos en los que la estimulación o inhibición de la captación de glucosa por el músculo esquelético sería beneficiosa incluyendo, por ejemplo, diabetes o híper o hipoinsulinemia.
En un formato de 96 pocillos, se añade un compuesto a ensayar al músculo esquelético diferenciado primario de rata y se deja incubar durante la noche. A continuación, se añaden a los pocillos medios nuevos con el compuesto y /-insulina. A continuación, se monitoriza el medio de muestra para determinar la captación de glucosa y FFA por las células del músculo esquelético. La insulina estimulará la captación de glucosa y FFA por el músculo esquelético, y la insulina en los medios sin el compuesto es un control positivo y un límite para la puntuación. Dado que el compuesto que se está probando puede estimular o inhibir la absorción de glucosa y FFA, los resultados se puntúan como positivos en el ensayo si son superiores a 1,5 veces o menos de 0,5 veces el control de insulina.
Ensayo de supervivencia de células fotorreceptores de bastones
Este ensayo prueba la capacidad de los compuestos que se divulgan en este documento para mejorar la supervivencia/proliferación de las células fotorreceptoras de bastones y, por lo tanto, son útiles para el tratamiento terapéutico de trastornos o lesiones de la retina que incluyen, por ejemplo, el tratamiento de la pérdida de visión en mamíferos debido a retinitis pigmentosa, AMD, etc.
Las crías de rata Sprague Dawley (día 7 después del nacimiento, población mixta: tipos de células neurales gliales y neurales) se sacrifican por decapitación después de anestesia con CO2 y se extraen los ojos en condiciones estériles. La retina neural se disecciona del epitelio pigmentario y de otro tejido ocular y luego se disecciona en una suspensión de células individuales usando tripsina al 0,25% en p Bs libre de Ca2+, Mg2+. Las retinas se incuban a 37 °C en esta solución durante 7-10 minutos, después de lo cual se inactiva la tripsina añadiendo 1 ml de inhibidor de tripsina de soja. Las células se cultivan en placas a una densidad de aproximadamente 10.000 células/ml en placas de 96 pocillos en DMEM/F12 suplementado con N2. Las células para todos los experimentos se cultivan a 37 °C en una atmósfera saturada de agua con CO2 al 5%. Después de 7-10 días en cultivo, las células se tiñen usando calceína AM o CMFDA verde CellTracker y luego se fijan usando paraformaldehído al 4%. El anticuerpo monoclonal Rho 4D2 (ascitis o IgG 1:100) dirigido hacia el pigmento visual rodopsina se usa para detectar células fotorreceptoras de bastones mediante inmunofluorescencia indirecta. Los resultados se calculan como % de supervivencia: número total de células positivas a calceína-rodopsina a los 7-10 días en cultivo, dividido por el número total de células positivas a rodopsina a los 7-10 días en cultivo. Las células totales (fluorescentes) se cuantifican con un aumento de objetivo 20x utilizando una cámara CCD y un software de imágenes NIH para Macintosh. Los campos en el pocillo se eligen al azar.
Ensayo antitumoral in vitro
La actividad antiproliferativa de los compuestos divulgados en el presente documento se puede determinar en el ensayo investigativo de descubrimiento de fármacos anticancerosos in vitro orientado a la enfermedad del Instituto Nacional del Cáncer (NCI), usando un ensayo de unión de colorante de sulforrodamina B (SRB) esencialmente como el descrito por Skehan et al., J. Natl. Cancer Inst. 82: 1107-1112 (1990). Las 60 líneas de células tumorales empleadas en este estudio ("el panel del NCI"), así como las condiciones para su mantenimiento y cultivo in vitro, han sido descritas por Monks et al., J. Natl. Cancer Inst. 83: 757-766 (1991). El propósito de este cribado es evaluar inicialmente la actividad citotóxica y/o citostática de los compuestos de prueba contra diferentes tipos de tumores (Monks et al., citado anteriormente; Boyd, Cancer: Princ. Pract. Üncol. Update 3 (10): 1-12 [1989]).
Se recolectan células de aproximadamente 60 líneas de células tumorales humanas con tripsina/EDTA (Gibco), se lavan una vez, se resuspenden en IMEM y se determina su viabilidad. Las suspensiones de células se añaden mediante pipeta (volumen de 100 j l) en placas de microtitulación de 96 pocillos separadas. La densidad celular para la incubación de 6 días es menor que para la incubación de 2 días para evitar el crecimiento excesivo. A los inoculados se les permite un período de preincubación de 24 horas a 37 °C para estabilización. Se agregan diluciones al doble de la concentración de prueba deseada en el tiempo cero en alícuotas de 100 |jl a los pocillos de la placa de microtitulación (dilución 1: 2). Los compuestos de prueba se evalúan en cinco diluciones semilogarítmicas (de 1000 a 100.000 veces). Las incubaciones se realizaron durante dos días y seis días en una atmósfera de CO2 al 5% y una humedad del 100%.
Después de la incubación, se retira el medio y las células se fijan en 0,1 ml de ácido tricloroacético al 10% a 40 °C. Las placas se enjuagan cinco veces con agua desionizada, se secan, se tiñen durante 30 minutos con 0,1 ml de colorante de sulforrodamina B al 0,4% (Sigma) disuelto en ácido acético al 1%, se enjuagan cuatro veces con ácido acético al 1% para eliminar el tinte no unido, se secan, y el colorante se extrae durante cinco minutos con 0,1 ml de base Tris 10 mM [tris(hidroximetil)aminometano], pH 10,5. La absorbancia (DO) de la sulforrodamina B a 492 nm se mide usando un lector de placas de microtitulación de 96 pocillos con interfaz de ordenador.
Una muestra de prueba se considera positiva si muestra al menos un 50% de efecto inhibidor del crecimiento a una o más concentraciones.
Determinación de compuestos como se divulga en el presente documento que afectan la absorción de glucosa o FFA por adipocitos primarios de rata
Este ensayo está diseñado para determinar si los compuestos de esta invención muestran la capacidad de afectar la captación de glucosa o FFA por las células de adipocitos. Se esperaría que los compuestos que dan positivo en este ensayo sean útiles para el tratamiento terapéutico de trastornos en los que la estimulación o inhibición de la captación de glucosa por los adipocitos sería beneficiosa, incluyendo, por ejemplo, obesidad, diabetes o híper o hipoinsulinemia.
En un formato de 96 pocillos, los compuestos a ensayar se añaden a adipocitos primarios de rata y se dejan incubar durante la noche. Se toman muestras a las 4 y 16 horas y se analizan para la absorción de glicerol, glucosa y FFA. Después de la incubación de 16 horas, se agrega insulina al medio y se deja incubar durante 4 horas. En este momento, se toma una muestra y se mide la absorción de glicerol, glucosa y FFA. Los medios que contienen insulina sin el compuesto se utilizan como control de referencia positivo. Dado que el compuesto que se está probando puede estimular o inhibir la absorción de glucosa y FFA, los resultados se puntúan como positivos en el ensayo si son superiores a 1,5 veces o menos de 0,5 veces el control de insulina.
Ensayo de rediferenciación de condrocitos
Este ensayo muestra si los compuestos divulgados en este documento actúan para inducir la rediferenciación de condrocitos y, por lo tanto, se espera que sean útiles para el tratamiento de diversos trastornos óseos y/o cartilaginosos como, por ejemplo, lesiones deportivas y artritis. El ensayo se realiza como sigue. Los condrocitos porcinos se aíslan mediante digestión con colagenasa durante la noche del cartílago articular de las articulaciones metacarpofalángicas de cerdas de 4 a 6 meses de edad. A continuación, las células aisladas se siembran a razón de 25.000 células/cm2 en F-12 de Ham que contiene FBS al 10% y 4 jg/m l de gentamicina. El medio de cultivo se cambia cada tres días y luego las células se siembran en placas de 96 pocillos a razón de 5.000 células/pocillo en 100 j l del mismo medio sin suero y se añaden 100 j l del compuesto de prueba, estaurosporina 5 nM (control positivo) o medio solo (control negativo) para obtener un volumen final de 200 jl/pocillo. Después de 5 días de incubación a 37 °C, se toma una fotografía de cada pocillo y se determina el estado de diferenciación de los condrocitos. Se produce un resultado positivo en el ensayo cuando se determina que la rediferenciación de los condrocitos es más similar al control positivo que al control negativo.
Inducción de hemoglobina fetal en una línea de células eritroblásticas
Este ensayo es útil para cribar compuestos por su capacidad para inducir el cambio de hemoglobina adulta a hemoglobina fetal en una línea celular eritroblástica. Se espera que los compuestos que dan positivo en este ensayo sean útiles para tratar terapéuticamente varios trastornos asociados a la hemoglobina de mamíferos, tales como las diversas talasemias. El ensayo se realiza como sigue. Las células eritroblásticas se cultivan en placa en medio de crecimiento estándar a razón de 1000 células/pocillo en un formato de 96 pocillos. El compuesto ensayado se añade al medio de cultivo a una concentración de 0,2% o 2% y las células se incuban durante 5 días a 37 °C. Como control positivo, las células se tratan con hemina 100 jM y como control negativo, las células no se tratan. Después de 5 días, los lisados celulares se preparan y analizan para determinar la expresión de gamma globina (un marcador fetal). Un resultado positivo en el ensayo es un nivel de gamma globina al menos 2 veces superior al control negativo.
Ensayo de proliferación de células mesangiales de riñón de ratón
Este ensayo muestra si los compuestos divulgados en el presente documento actúan para inducir la proliferación de células mesangiales de riñón de mamífero y, por lo tanto, son útiles para tratar trastornos renales asociados con una función celular mesangial disminuida, tal como la enfermedad de Berger u otras nefropatías asociadas con la púrpura de Schonlein-Henoch, enfermedad celíaca, dermatitis herpetiforme o enfermedad de Crohn. El ensayo se realiza como sigue. El día uno, las células mesangiales de riñón de ratón se siembran en una placa de 96 pocillos en medio de crecimiento (mezcla 3:1 de medio Eagle modificado de Dulbecco y medio F12 de Ham, suero bovino fetal al 95%,

Claims (12)

REIVINDICACIONES
1. Un proceso para elaborar un tramo de aminoácidos consecutivos que comprenden una cisteína del terminal C o una selenocisteína del terminal C, que comprende:
(a) transfectar una célula con un ácido nucleico recombinante que comprende
(i) una primera porción, cuya secuencia codifica una secuencia señal del terminal N, contigua a
(ii) una segunda porción, cuya secuencia codifica un tramo de aminoácidos consecutivos seleccionados de un fragmento Fc de una inmunoglobulina IgG humana que contiene el dominio M1 o una porción del mismo, o el dominio extracelular de CD4 humano, TNR1A humano, TNR1B humano, VGFR1 humano, VGFR2 humano, VGFR3 humano, ErbB1 humano, ErbB2 humano, ErbB3 humano o ErbB4 humano, contiguo a
(iii) una tercera porción, cuya secuencia codifica un dominio de unión que contiene inteína del terminal C, en condiciones que permitan
(i) la síntesis de un polipéptido quimérico que comprende la secuencia señal del terminal N contigua al tramo de aminoácidos consecutivos contiguos al dominio de unión que contiene inteína del terminal C; y
(ii) la escisión de la secuencia señal del terminal N del polipéptido quimérico, para producir un segundo polipéptido quimérico que comprende el tramo de aminoácidos consecutivos contiguos con el dominio de unión que contiene inteína del terminal C,
(b) aislar el segundo polipéptido quimérico producido en la etapa (a);
(c) tratar el segundo polipéptido quimérico para provocar la escisión mediada por tio del dominio de unión que contiene inteína del terminal C del tramo de aminoácidos consecutivos para formar un tioéster del terminal C;
(d) ligar el producto de la etapa (c) con un residuo de cisteína o un residuo de selenocisteína en su terminal C para formar un producto con una cisteína del terminal C o una selenocisteína del terminal C; y
(e) recuperar el producto de la etapa (d) que es el tramo de aminoácidos consecutivos que comprenden la cisteína del terminal C o la selenocisteína del terminal C.
2. Un proceso para elaborar un producto que comprende un tramo de aminoácidos consecutivos de un fragmento Vk-Ck de una inmunoglobulina, unido por un enlace disulfuro a un tramo de aminoácidos consecutivos de un fragmento VH-CH1 de una inmunoglobulina con una cisteína del terminal C o una selenocisteína del terminal C, que comprende:
(a) cotransfectar una célula con:
(i) un primer ácido nucleico recombinante que comprende
(a) una primera porción, cuya secuencia codifica una secuencia señal del terminal N contigua a
(b) una segunda porción, cuya secuencia codifica un tramo de aminoácidos consecutivos de un fragmento Vk-Ck de una inmunoglobulina; y
(ii) un segundo ácido nucleico recombinante que comprende
(a) una primera porción, cuya secuencia codifica una secuencia señal del terminal N, contigua a
(b) una segunda porción, cuya secuencia codifica un tramo de aminoácidos consecutivos de un fragmento VH-CH1 de una inmunoglobulina, contigua a
(c) una tercera porción, cuya secuencia codifica un dominio de unión que contiene inteína del terminal C, en condiciones tales que permitan:
(i) la síntesis de (a) un polipéptido quimérico que comprende una secuencia señal del terminal N contigua con un tramo de aminoácidos consecutivos de un fragmento Vk-Ck de una inmunoglobulina, y (b) un polipéptido quimérico que comprende una secuencia señal del terminal N contiguo a un tramo de aminoácidos consecutivos de un fragmento VH-CH1 de una inmunoglobulina contigua a un dominio de unión que contiene inteína del terminal C;
(ii) la escisión de la secuencia señal del terminal N de cada polipéptido quimérico;
(iii) la secreción de (1) un tramo de aminoácidos consecutivos de un fragmento Vk-Ck de una inmunoglobulina, y (2) un tramo de aminoácidos consecutivos de un fragmento VH-CH1 de una inmunoglobulina contigua a un dominio de unión que contiene inteína del terminal C; y
(iv) formación de un enlace disulfuro entre el (1) y (2),
(b) aislar el producto de la etapa (a);
(c) tratar el producto aislado de la etapa (b) para provocar la escisión mediada por tio del dominio de unión que contiene inteína del terminal C del tramo de aminoácidos consecutivos de un fragmento VH-CH1 de una inmunoglobulina, para e formar un tioéster del terminal C;
(d) ligar el producto de la etapa (c) con un residuo de cisteína o un residuo de selenocisteína para formar un producto que comprende un tramo de aminoácidos consecutivos de un fragmento VH-CH1 de una inmunoglobulina con una cisteína del terminal C o una selenocisteína del terminal C; y
(e) recuperar el producto de la etapa (d) que es el producto que comprende un tramo de aminoácidos consecutivos de un fragmento Vk-Ck de una inmunoglobulina, unido por enlaces disulfuro a un tramo de aminoácidos consecutivos de un fragmento VH-CH1 de una inmunoglobulina con una cisteína del terminal C o una selenocisteína del terminal C.
3. El proceso de las reivindicaciones 1-2, en el que la célula es una célula eucariota.
4. El proceso de la reivindicación 3, en el que la célula se deriva de un mamífero.
5. El proceso de la reivindicación 4, en el que la célula es una célula de riñón embrionario humano 293 o una célula de ovario de hámster chino (CHO).
6. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que la transfección o cotransfección se realiza con un plásmido que tiene nucleótidos en la secuencia expuesta como la SEQ ID NO: 1.
7. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que el dominio de unión que contiene inteína del terminal C es un dominio de unión de inteína-quitina.
8. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que el dominio de unión que contiene inteína del terminal C es un dominio de unión de inteína-quitina Mth RIR1.
9. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que la célula está en un medio de cultivo, y el producto de la etapa (a) se aísla del medio de cultivo en la etapa (b) por exposición del producto de la etapa (a) a una resina derivatizada con quitina.
10. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que la escisión de la secuencia señal del terminal N del polipéptido o polipéptidos quiméricos dentro de la célula se efectúa mediante una peptidasa señal celular.
11. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en el que el producto de la etapa (c) se liga con el residuo de cisteína para formar el tramo de aminoácidos consecutivos que comprenden la cisteína del terminal C.
12. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en el que el producto de la etapa (c) se liga con el residuo de selenocisteína para formar el tramo de aminoácidos consecutivos que comprenden la selenocisteína del terminal C.
ES17177719T 2006-11-02 2007-10-31 Métodos de producción de polipéptidos híbridos con partes móviles Active ES2870017T3 (es)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US85686406P 2006-11-02 2006-11-02

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2870017T3 true ES2870017T3 (es) 2021-10-26

Family

ID=39854063

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES17177719T Active ES2870017T3 (es) 2006-11-02 2007-10-31 Métodos de producción de polipéptidos híbridos con partes móviles

Country Status (16)

Country Link
US (3) US20080254512A1 (es)
EP (2) EP2078040B1 (es)
JP (3) JP5519287B2 (es)
KR (1) KR20090105913A (es)
CN (1) CN101965363A (es)
AU (1) AU2007353396C1 (es)
BR (1) BRPI0716680A2 (es)
CA (1) CA2668208C (es)
DK (1) DK3284825T3 (es)
ES (1) ES2870017T3 (es)
HK (1) HK1251609A1 (es)
IL (1) IL198424A (es)
MX (1) MX2009004664A (es)
NZ (1) NZ576445A (es)
SG (1) SG176476A1 (es)
WO (1) WO2008140477A2 (es)

Families Citing this family (112)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5519287B2 (ja) * 2006-11-02 2014-06-11 ダニエル・ジェイ・カポン 可動部を備えたハイブリッド免疫グロブリン
WO2008122039A2 (en) * 2007-04-02 2008-10-09 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Selenocysteine mediated hybrid antibody molecules
EP2095829A1 (en) 2008-02-27 2009-09-02 LEK Pharmaceuticals D.D. Selenium containing modifying agents and conjugates
WO2011064758A2 (en) * 2009-11-30 2011-06-03 Pfizer Limited Fusion protein
CN107936092B (zh) * 2010-01-29 2022-08-09 阿切尔丹尼尔斯密德兰公司 结合有工业意义的小分子的肽结构域
JP6158090B2 (ja) * 2011-10-31 2017-07-05 ダニエル・ジェイ・カポン 非ペプチドヒンジ部含有フレキシブル抗体様分子
JP6231263B2 (ja) 2012-07-17 2017-11-15 株式会社島津製作所 アフィニティ支持体及びそれを用いた物質の捕捉方法
ES2759061T3 (es) 2013-03-15 2020-05-07 Biomolecular Holdings Llc Inmunoglobulina híbrida que contiene unión no peptidílica
WO2014161405A1 (en) * 2013-04-03 2014-10-09 Gene-Vinate Limited Means and method for expression of authentic human epidermal growth factor and/or basic fibrolast growth factor in cytoplasm and/or culture medium of escherichia coli
US10273520B2 (en) 2013-04-03 2019-04-30 Wan Keung Raymond Wong Means and methods for hyper-production of authentic human basic fibroblast growth factor in Escherichia coli
EP3077010B1 (en) * 2013-12-03 2020-04-01 Welt Bio-Molecular Pharmaceutical LLC Antibodies targeting b-cell receptor complex membrane bound igm and uses thereof
JOP20200094A1 (ar) 2014-01-24 2017-06-16 Dana Farber Cancer Inst Inc جزيئات جسم مضاد لـ pd-1 واستخداماتها
JOP20200096A1 (ar) 2014-01-31 2017-06-16 Children’S Medical Center Corp جزيئات جسم مضاد لـ tim-3 واستخداماتها
ME03558B (me) 2014-03-14 2020-07-20 Novartis Ag Molekuli anti-lag-3 antiтela i njihove upotrebe
LT3701971T (lt) 2014-03-14 2023-01-10 Biomolecular Holdings Llc Junginiai, naudingi hibridinio imunoglobulino, turinčio nepeptidilo ryšį, gamyboje
EP3593812A3 (en) 2014-03-15 2020-05-27 Novartis AG Treatment of cancer using chimeric antigen receptor
DK3126383T3 (en) 2014-04-03 2019-04-01 Igm Biosciences Inc MODIFIED J-CHAIN
US9777061B2 (en) 2014-07-21 2017-10-03 Novartis Ag Treatment of cancer using a CD33 chimeric antigen receptor
JP2017528433A (ja) 2014-07-21 2017-09-28 ノバルティス アーゲー 低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤とＣＡＲの組み合わせ
US10174095B2 (en) 2014-07-21 2019-01-08 Novartis Ag Nucleic acid encoding a humanized anti-BCMA chimeric antigen receptor
WO2016014553A1 (en) 2014-07-21 2016-01-28 Novartis Ag Sortase synthesized chimeric antigen receptors
ES2781175T3 (es) 2014-07-31 2020-08-31 Novartis Ag Subconjunto optimizado de células T que contienen un receptor de antígeno quimérico
AU2015301460B2 (en) 2014-08-14 2021-04-08 Novartis Ag Treatment of cancer using GFR alpha-4 chimeric antigen receptor
JP7084138B2 (ja) 2014-08-19 2022-06-14 ノバルティス アーゲー 癌処置に使用するための抗ｃｄ１２３キメラ抗原受容体（ｃａｒ）
CA2961636A1 (en) 2014-09-17 2016-03-24 Boris ENGELS Targeting cytotoxic cells with chimeric receptors for adoptive immunotherapy
CU20170052A7 (es) 2014-10-14 2017-11-07 Dana Farber Cancer Inst Inc Moléculas de anticuerpo que se unen a pd-l1
US20180334490A1 (en) 2014-12-03 2018-11-22 Qilong H. Wu Methods for b cell preconditioning in car therapy
JP7179464B2 (ja) 2015-01-20 2022-11-29 アイジーエム バイオサイエンシズ インコーポレイテッド 腫瘍壊死因子 （ｔｎｆ） スーパーファミリー受容体結合分子およびその使用
SG11201706774WA (en) * 2015-02-27 2017-09-28 Icell Gene Therapeutics Llc Chimeric antigen receptors (cars) targeting hematologic malignancies, compositions and methods of use thereof
RU2021121771A (ru) 2015-04-08 2022-01-12 Новартис Аг Cd20 терапия, cd22 терапия и комбинированная терапия клетками, экспрессирующими химерный антигенный рецептор (car) к cd19
WO2016172583A1 (en) 2015-04-23 2016-10-27 Novartis Ag Treatment of cancer using chimeric antigen receptor and protein kinase a blocker
US11173179B2 (en) 2015-06-25 2021-11-16 Icell Gene Therapeutics Llc Chimeric antigen receptor (CAR) targeting multiple antigens, compositions and methods of use thereof
CN115058395A (zh) 2015-06-25 2022-09-16 美商生物细胞基因治疗有限公司 嵌合抗原受体(car)、组合物及其使用方法
WO2017019897A1 (en) 2015-07-29 2017-02-02 Novartis Ag Combination therapies comprising antibody molecules to tim-3
SI3317301T1 (sl) 2015-07-29 2021-10-29 Novartis Ag Kombinirane terapije, ki obsegajo molekule protitelesa na LAG-3
DK3356401T3 (da) 2015-09-30 2020-09-07 Igm Biosciences Inc Bindingsmolekyler med modificeret j-kæde
AU2016329197B2 (en) 2015-09-30 2021-01-21 Igm Biosciences, Inc. Binding molecules with modified J-chain
WO2017106810A2 (en) 2015-12-17 2017-06-22 Novartis Ag Combination of c-met inhibitor with antibody molecule to pd-1 and uses thereof
JP2019503349A (ja) 2015-12-17 2019-02-07 ノバルティス アーゲー Ｐｄ−１に対する抗体分子およびその使用
US20210198368A1 (en) 2016-01-21 2021-07-01 Novartis Ag Multispecific molecules targeting cll-1
CN106397598B (zh) * 2016-02-23 2020-07-14 上海交通大学 多价多特异性抗体及免疫杂合蛋白的表达和制备方法
BR112018067679A2 (pt) 2016-03-04 2019-01-15 Novartis Ag células que expressam múltiplas moléculas do receptor de antígeno quimérico (car) e seu uso
WO2017165683A1 (en) 2016-03-23 2017-09-28 Novartis Ag Cell secreted minibodies and uses thereof
HRP20230457T1 (hr) 2016-04-15 2023-07-21 Novartis Ag Pripravci i postupci za selektivnu ekspresiju kimernih antigenskih receptora
EP3464375A2 (en) 2016-06-02 2019-04-10 Novartis AG Therapeutic regimens for chimeric antigen receptor (car)- expressing cells
US20200283534A1 (en) 2016-06-24 2020-09-10 iCell Gene Therapeuticics LLC CHIMERIC ANTIGEN RECEPTORS (CARs), COMPOSITIONS AND METHODS THEREOF
CA3030163A1 (en) * 2016-07-11 2018-01-18 Board Of Regents, The University Of Texas System Recombinant polypeptides comprising selenocysteine and method for producing the same
AU2017295886C1 (en) 2016-07-15 2024-01-25 Novartis Ag Treatment and prevention of cytokine release syndrome using a chimeric antigen receptor in combination with a kinase inhibitor
US20190151365A1 (en) 2016-07-28 2019-05-23 Novartis Ag Combination therapies of chimeric antigen receptors and pd-1 inhibitors
US20190161542A1 (en) 2016-08-01 2019-05-30 Novartis Ag Treatment of cancer using a chimeric antigen receptor in combination with an inhibitor of a pro-m2 macrophage molecule
WO2018067992A1 (en) 2016-10-07 2018-04-12 Novartis Ag Chimeric antigen receptors for the treatment of cancer
EP4043485A1 (en) 2017-01-26 2022-08-17 Novartis AG Cd28 compositions and methods for chimeric antigen receptor therapy
WO2018160731A1 (en) 2017-02-28 2018-09-07 Novartis Ag Shp inhibitor compositions and uses for chimeric antigen receptor therapy
EP3615055A1 (en) 2017-04-28 2020-03-04 Novartis AG Cells expressing a bcma-targeting chimeric antigen receptor, and combination therapy with a gamma secretase inhibitor
US20200179511A1 (en) 2017-04-28 2020-06-11 Novartis Ag Bcma-targeting agent, and combination therapy with a gamma secretase inhibitor
WO2018237157A1 (en) 2017-06-22 2018-12-27 Novartis Ag CD73 BINDING ANTIBODY MOLECULES AND USES THEREOF
CA3066747A1 (en) 2017-06-27 2019-01-03 Novartis Ag Dosage regimens for anti-tim-3 antibodies and uses thereof
PE20200757A1 (es) 2017-07-11 2020-07-27 Compass Therapeutics Llc Anticuerpos agonistas que se unen a cd137 humano y sus usos
CN111163798A (zh) 2017-07-20 2020-05-15 诺华股份有限公司 用于抗lag-3抗体的给药方案及其用途
WO2019089753A2 (en) 2017-10-31 2019-05-09 Compass Therapeutics Llc Cd137 antibodies and pd-1 antagonists and uses thereof
US20210179709A1 (en) 2017-10-31 2021-06-17 Novartis Ag Anti-car compositions and methods
CA3081602A1 (en) 2017-11-16 2019-05-23 Novartis Ag Combination therapies
EP3713961A2 (en) 2017-11-20 2020-09-30 Compass Therapeutics LLC Cd137 antibodies and tumor antigen-targeting antibodies and uses thereof
CA3090249A1 (en) 2018-01-31 2019-08-08 Novartis Ag Combination therapy using a chimeric antigen receptor
EP3758735B1 (en) * 2018-02-28 2023-12-13 AP Biosciences, Inc. Bifunctional proteins combining checkpoint blockade for targeted therapy
US20210147547A1 (en) 2018-04-13 2021-05-20 Novartis Ag Dosage Regimens For Anti-Pd-L1 Antibodies And Uses Thereof
EP3784351A1 (en) 2018-04-27 2021-03-03 Novartis AG Car t cell therapies with enhanced efficacy
EP3797120A1 (en) 2018-05-21 2021-03-31 Compass Therapeutics LLC Compositions and methods for enhancing the killing of target cells by nk cells
WO2019226658A1 (en) 2018-05-21 2019-11-28 Compass Therapeutics Llc Multispecific antigen-binding compositions and methods of use
US20210213063A1 (en) 2018-05-25 2021-07-15 Novartis Ag Combination therapy with chimeric antigen receptor (car) therapies
WO2019232244A2 (en) 2018-05-31 2019-12-05 Novartis Ag Antibody molecules to cd73 and uses thereof
EP3806962A1 (en) 2018-06-13 2021-04-21 Novartis AG Bcma chimeric antigen receptors and uses thereof
CA3104295A1 (en) 2018-06-19 2019-12-26 Atarga, Llc Antibody molecules to complement component 5 and uses thereof
AR116109A1 (es) 2018-07-10 2021-03-31 Novartis Ag Derivados de 3-(5-amino-1-oxoisoindolin-2-il)piperidina-2,6-diona y usos de los mismos
WO2020021465A1 (en) 2018-07-25 2020-01-30 Advanced Accelerator Applications (Italy) S.R.L. Method of treatment of neuroendocrine tumors
US11046769B2 (en) 2018-11-13 2021-06-29 Compass Therapeutics Llc Multispecific binding constructs against checkpoint molecules and uses thereof
AU2019400978A1 (en) 2018-12-20 2021-06-24 Novartis Ag Extended low dose regimens for MDM2 inhibitors
JP2022514315A (ja) 2018-12-20 2022-02-10 ノバルティス アーゲー ３－（１－オキソイソインドリン－２－イル）ピペリジン－２，６－ジオン誘導体を含む投与計画及び薬剤組み合わせ
CA3124935A1 (en) 2019-02-15 2020-08-20 Novartis Ag 3-(1-oxo-5-(piperidin-4-yl)isoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives and uses thereof
US10871640B2 (en) 2019-02-15 2020-12-22 Perkinelmer Cellular Technologies Germany Gmbh Methods and systems for automated imaging of three-dimensional objects
KR20210129672A (ko) 2019-02-15 2021-10-28 노파르티스 아게 치환된 3-(1-옥소이소인돌린-2-일)피페리딘-2,6-디온 유도체 및 이의 용도
EP3927371A1 (en) 2019-02-22 2021-12-29 Novartis AG Combination therapies of egfrviii chimeric antigen receptors and pd-1 inhibitors
MX2021011830A (es) 2019-03-29 2022-01-24 Atarga Llc Anticuerpo anti fgf23.
US11684655B2 (en) 2019-05-31 2023-06-27 Spectrum Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating neutorpenia using G-CSF protein complex
US11267858B2 (en) 2019-05-31 2022-03-08 Spectrum Pharmaceuticals, Inc. Methods of treatment using G-CSF protein complex
BR112022007179A2 (pt) 2019-10-21 2022-08-23 Novartis Ag Inibidores de tim-3 e usos dos mesmos
KR20220103947A (ko) 2019-10-21 2022-07-25 노파르티스 아게 베네토클락스 및 tim-3 억제제를 사용한 조합 요법
CN114761037A (zh) 2019-11-26 2022-07-15 诺华股份有限公司 结合bcma和cd19的嵌合抗原受体及其用途
CN115052662A (zh) 2019-12-20 2022-09-13 诺华股份有限公司 抗TGFβ抗体和检查点抑制剂用于治疗增殖性疾病的用途
MX2022008763A (es) 2020-01-17 2022-07-27 Novartis Ag Combinacion que comprende un inhibidor de tim-3 y un agente hipometilante para usarse en el tratamiento del sindrome mielodisplasico o leucemia mielomonocitica cronica.
EP4090762A1 (en) 2020-01-17 2022-11-23 Becton, Dickinson and Company Methods and compositions for single cell secretomics
WO2021173995A2 (en) 2020-02-27 2021-09-02 Novartis Ag Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
CN111499724A (zh) * 2020-04-15 2020-08-07 上海领潮生物新材料有限公司 一种s-腺苷同型半胱氨酸-鸡卵白蛋白偶联物的制备方法
EP4153214A1 (en) 2020-05-22 2023-03-29 Trustees of Boston University Methods and compositions for treating a fibrotic disease
WO2021247475A1 (en) * 2020-06-02 2021-12-09 Trustees Of Boston University Production of soluble relaxin and relaxin analogs
JP2023531676A (ja) 2020-06-23 2023-07-25 ノバルティス アーゲー ３－（１－オキソイソインドリン－２－イル）ピぺリジン－２，６－ジオン誘導体を含む投与レジメン
MX2023000547A (es) 2020-07-16 2023-02-13 Novartis Ag Anticuerpos anti-betacelulina, fragmentos de los mismos, y moleculas de union multiespecificas.
WO2022026592A2 (en) 2020-07-28 2022-02-03 Celltas Bio, Inc. Antibody molecules to coronavirus and uses thereof
CN116134027A (zh) 2020-08-03 2023-05-16 诺华股份有限公司 杂芳基取代的3-(1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮衍生物及其用途
EP4204020A1 (en) 2020-08-31 2023-07-05 Advanced Accelerator Applications International S.A. Method of treating psma-expressing cancers
WO2022043557A1 (en) 2020-08-31 2022-03-03 Advanced Accelerator Applications International Sa Method of treating psma-expressing cancers
WO2022097065A2 (en) 2020-11-06 2022-05-12 Novartis Ag ANTIBODY Fc VARIANTS
CA3198447A1 (en) 2020-11-13 2022-05-19 Novartis Ag Combination therapies with chimeric antigen receptor (car)-expressing cells
WO2022162569A1 (en) 2021-01-29 2022-08-04 Novartis Ag Dosage regimes for anti-cd73 and anti-entpd2 antibodies and uses thereof
TW202304979A (zh) 2021-04-07 2023-02-01 瑞士商諾華公司 抗ＴＧＦβ抗體及其他治療劑用於治療增殖性疾病之用途
AR125874A1 (es) 2021-05-18 2023-08-23 Novartis Ag Terapias de combinación
WO2023044483A2 (en) 2021-09-20 2023-03-23 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of her2 positive cancer
WO2023064841A1 (en) * 2021-10-13 2023-04-20 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Antibodies for use against sars-cov-2
WO2023092004A1 (en) 2021-11-17 2023-05-25 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of tau-related disorders
TW202342548A (zh) 2022-02-07 2023-11-01 美商威特拉公司 抗獨特型(anti-idiotype)抗體分子及其用途
WO2023220695A2 (en) 2022-05-13 2023-11-16 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of her2 positive cancer
WO2024030976A2 (en) 2022-08-03 2024-02-08 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for crossing the blood brain barrier

Family Cites Families (69)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE266710C (es)
US4179337A (en) * 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4352804A (en) 1978-07-25 1982-10-05 Acf Chemiefarma Nv Oxime ethers, their preparation and pharmaceutical compositions containing them
JPS6023084B2 (ja) 1979-07-11 1985-06-05 味の素株式会社 代用血液
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
ZA811368B (en) 1980-03-24 1982-04-28 Genentech Inc Bacterial polypedtide expression employing tryptophan promoter-operator
US4378347A (en) * 1980-06-30 1983-03-29 Franco Wayne P Composition for treating the heart for myocardial infarction
NZ201705A (en) 1981-08-31 1986-03-14 Genentech Inc Recombinant dna method for production of hepatitis b surface antigen in yeast
US4640835A (en) * 1981-10-30 1987-02-03 Nippon Chemiphar Company, Ltd. Plasminogen activator derivatives
US4943529A (en) * 1982-05-19 1990-07-24 Gist-Brocades Nv Kluyveromyces as a host strain
US4713339A (en) 1983-01-19 1987-12-15 Genentech, Inc. Polycistronic expression vector construction
AU2353384A (en) 1983-01-19 1984-07-26 Genentech Inc. Amplification in eukaryotic host cells
NZ207394A (en) 1983-03-08 1987-03-06 Commw Serum Lab Commission Detecting or determining sequence of amino acids
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
DD266710A3 (de) 1983-06-06 1989-04-12 Ve Forschungszentrum Biotechnologie Verfahren zur biotechnischen Herstellung van alkalischer Phosphatase
AU3145184A (en) 1983-08-16 1985-02-21 Zymogenetics Inc. High expression of foreign genes in schizosaccharomyces pombe
US4496689A (en) * 1983-12-27 1985-01-29 Miles Laboratories, Inc. Covalently attached complex of alpha-1-proteinase inhibitor with a water soluble polymer
ATE128715T1 (de) 1984-07-16 1995-10-15 Celtrix Pharma Polypeptide induzierende faktoren in knochen und knorpel.
EP0173494A3 (en) 1984-08-27 1987-11-25 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Chimeric receptors by dna splicing and expression
US4879231A (en) 1984-10-30 1989-11-07 Phillips Petroleum Company Transformation of yeasts of the genus pichia
IL78197A (en) 1985-03-22 1991-07-18 Genentech Inc Nucleic acid encoding tgf-beta and its uses
EP0206448B1 (en) * 1985-06-19 1990-11-14 Ajinomoto Co., Inc. Hemoglobin combined with a poly(alkylene oxide)
EP0272253A4 (en) 1986-03-07 1990-02-05 Massachusetts Inst Technology METHOD FOR IMPROVING GLYCOPROTE INSTABILITY.
GB8610600D0 (en) 1986-04-30 1986-06-04 Novo Industri As Transformation of trichoderma
US4791192A (en) 1986-06-26 1988-12-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified protein with polyethyleneglycol
US4877864A (en) 1987-03-26 1989-10-31 Genetics Institute, Inc. Osteoinductive factors
IL83003A (en) 1986-07-01 1995-07-31 Genetics Inst Factors that soak bone formation
NZ222168A (en) 1986-10-20 1991-05-28 Oncogene Science Inc Tumour growth inhibiting protein related to tgf-#b#1 and tgf-#b#2, preparation by genetic engineering methods, antibodies and pharmaceutical compositions
JPH01501361A (ja) 1986-11-17 1989-05-18 サンド・アクチエンゲゼルシャフト 新しいｔ細胞サプレッサー因子の生産およびその用途
US4946783A (en) * 1987-01-30 1990-08-07 President And Fellows Of Harvard College Periplasmic protease mutants of Escherichia coli
US5010182A (en) 1987-07-28 1991-04-23 Chiron Corporation DNA constructs containing a Kluyveromyces alpha factor leader sequence for directing secretion of heterologous polypeptides
IL87737A (en) 1987-09-11 1993-08-18 Genentech Inc Method for culturing polypeptide factor dependent vertebrate recombinant cells
US5336603A (en) * 1987-10-02 1994-08-09 Genentech, Inc. CD4 adheson variants
GB8724885D0 (en) 1987-10-23 1987-11-25 Binns M M Fowlpox virus promotors
ATE105585T1 (de) 1987-12-21 1994-05-15 Univ Toledo Transformation von keimenden pflanzensamen mit hilfe von agrobacterium.
EP0325224B1 (en) 1988-01-22 1996-07-31 ZymoGenetics, Inc. Methods of producing secreted receptor analogs
AU4005289A (en) 1988-08-25 1990-03-01 Smithkline Beecham Corporation Recombinant saccharomyces
US5116964A (en) * 1989-02-23 1992-05-26 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
FR2646437B1 (fr) 1989-04-28 1991-08-30 Transgene Sa Nouvelles sequences d'adn, leur application en tant que sequence codant pour un peptide signal pour la secretion de proteines matures par des levures recombinantes, cassettes d'expression, levures transformees et procede de preparation de proteines correspondant
DE68927344T2 (de) 1989-04-28 1997-02-20 Rhein Biotech Proz & Prod Gmbh Hefezellen der Gattung-Schwanniomyces
EP0402226A1 (en) 1989-06-06 1990-12-12 Institut National De La Recherche Agronomique Transformation vectors for yeast yarrowia
FR2649120B1 (fr) 1989-06-30 1994-01-28 Cayla Nouvelle souche et ses mutants de champignons filamenteux, procede de production de proteines recombinantes a l'aide de ladite souche et souches et proteines obtenues selon ce procede
DE69123241T2 (de) * 1990-12-14 1997-04-17 Cell Genesys Inc Chimärische ketten zur transduktion von rezeptorverbundenen signalwegen
US5206161A (en) 1991-02-01 1993-04-27 Genentech, Inc. Human plasma carboxypeptidase B
AU648140B2 (en) * 1991-02-01 1994-04-14 Virtual Drug Development, Inc. Reverse antimicrobial peptides and antimicrobial compositions
EP0752248B1 (en) 1992-11-13 2000-09-27 Idec Pharmaceuticals Corporation Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma
US5834247A (en) * 1992-12-09 1998-11-10 New England Biolabs, Inc. Modified proteins comprising controllable intervening protein sequences or their elements methods of producing same and methods for purification of a target protein comprised by a modified protein
US5536637A (en) 1993-04-07 1996-07-16 Genetics Institute, Inc. Method of screening for cDNA encoding novel secreted mammalian proteins in yeast
US5834256A (en) * 1993-06-11 1998-11-10 Cell Genesys, Inc. Method for production of high titer virus and high efficiency retroviral mediated transduction of mammalian cells
JPH10501613A (ja) * 1994-03-07 1998-02-10 クールター コーポレイション ポリマービーズに共有結合により固定化した抗体
US6184344B1 (en) 1995-05-04 2001-02-06 The Scripps Research Institute Synthesis of proteins by native chemical ligation
US5838464A (en) * 1995-11-02 1998-11-17 Eastman Kodak Company System and method for scanning images contained on a strip of photosensitive film
US6849428B1 (en) * 1997-03-05 2005-02-01 New England Biolabs, Inc. Intein-mediated protein ligation of expressed proteins
US20030092002A1 (en) * 1997-09-17 2003-05-15 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
EP1090132A1 (en) * 1998-06-26 2001-04-11 PPL Therapeutics (Scotland) Limited Methods for production of recombinant polypeptides
AUPP589598A0 (en) * 1998-09-14 1998-10-08 University Of Queensland, The Novel peptides
US20050100987A1 (en) * 1998-09-30 2005-05-12 Evans Thomas C. Intein-mediated protein ligation of expressed proteins
WO2001057183A2 (en) * 2000-02-04 2001-08-09 New England Biolabs, Inc. Method for producing circular or multimeric protein species in vivo or in vitro and related methods
GB0024550D0 (es) * 2000-10-06 2000-11-22 Oxford Biomedica Ltd
AU2001242732B2 (en) * 2001-02-26 2006-08-24 Council Of Scientific And Industrial Research Carrier systems comprising vitamin B12-biodegradable micro particulate conju gates for peroral delivery of drugs, peptides/proteins and vaccines
CN1633501B (zh) * 2002-01-08 2010-10-27 迈克尔·R·拉尔布 表达civps或内含肽修饰蛋白的转基因植物及其制备方法
US20040009498A1 (en) * 2002-01-14 2004-01-15 Diversa Corporation Chimeric antigen binding molecules and methods for making and using them
WO2003074660A2 (en) * 2002-02-28 2003-09-12 New England Biolabs, Inc. Modified chitin binding domain and uses thereof
WO2004013311A2 (en) * 2002-08-06 2004-02-12 Diadexus, Inc. Compositions and methods relating to ovarian specific genes and proteins
US7348004B2 (en) * 2003-05-06 2008-03-25 Syntonix Pharmaceuticals, Inc. Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
TWI353991B (en) * 2003-05-06 2011-12-11 Syntonix Pharmaceuticals Inc Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
US20040265921A1 (en) * 2003-06-30 2004-12-30 National University Of Singapore Intein-mediated attachment of ligands to proteins for immobilization onto a support
JP2005154345A (ja) * 2003-11-26 2005-06-16 Peptide Door Co Ltd Ｉｌ−２に結合性を有するペプチド又はタンパク質、及び該ペプチド又はタンパク質を用いたｉｌ−２吸着体、ｉｌ−２検査試薬、ｉｌ−２中和剤
JP5519287B2 (ja) * 2006-11-02 2014-06-11 ダニエル・ジェイ・カポン 可動部を備えたハイブリッド免疫グロブリン

Also Published As

Publication number Publication date
CA2668208C (en) 2017-09-12
JP6357194B2 (ja) 2018-07-11
SG176476A1 (en) 2011-12-29
IL198424A (en) 2015-05-31
DK3284825T3 (da) 2021-05-25
EP3284825B1 (en) 2021-04-07
EP3284825A1 (en) 2018-02-21
MX2009004664A (es) 2009-10-12
US20200032272A1 (en) 2020-01-30
JP5519287B2 (ja) 2014-06-11
US20160376601A1 (en) 2016-12-29
IL198424A0 (en) 2011-08-01
CN101965363A (zh) 2011-02-02
WO2008140477A9 (en) 2009-10-15
JP2010509222A (ja) 2010-03-25
WO2008140477A2 (en) 2008-11-20
AU2007353396C1 (en) 2013-06-27
AU2007353396B9 (en) 2013-01-17
JP2014062105A (ja) 2014-04-10
AU2007353396B2 (en) 2012-12-13
WO2008140477A8 (en) 2009-04-23
EP2078040A2 (en) 2009-07-15
BRPI0716680A2 (pt) 2013-09-24
US20080254512A1 (en) 2008-10-16
KR20090105913A (ko) 2009-10-07
CA2668208A1 (en) 2008-11-20
NZ576445A (en) 2012-03-30
WO2008140477A3 (en) 2009-08-27
HK1251609A1 (zh) 2019-02-01
EP2078040B1 (en) 2017-06-28
JP2017019778A (ja) 2017-01-26
US10428332B2 (en) 2019-10-01
AU2007353396A1 (en) 2008-11-20
EP2078040A4 (en) 2010-08-11
JP6012580B2 (ja) 2016-10-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2870017T3 (es) Métodos de producción de polipéptidos híbridos con partes móviles
ES2424643T3 (es) Proteínas bouganina modificadas, citotoxinas y procedimientos y usos de las mismas
EP2571992B1 (en) Bi-specific fusion proteins
ES2784131T3 (es) Polipéptidos de unión beta del receptor PDGF
AU735851B2 (en) Modified dorsal tissue affecting factor and compositions
ES2932285T3 (es) Compuestos útiles en la preparación de inmunoglobulina híbrida que contiene una unión distinta de peptidilo
CN112534052A (zh) 全新il-21前药及使用方法
JP2001095566A (ja) サイトカインの免疫複合体
CN108285487B (zh) 抗5t4抗体-药物偶联物及其应用
US11566045B2 (en) Tumor targeting polypeptide and method of use thereof
CA2572825A1 (en) Compositions for multi-step delivery of hot-spots radiation to cancer cells
CN101914161B (zh) 抑制肿瘤生长的融合蛋白HGFα-Fc及其用途
WO2022001710A1 (zh) 用于抗体与药物偶联体(adc)制备的中间体及其制备方法和应用
KR20130033273A (ko) 항 ｉｇｆ-1ｒ 단일클론 항체와 ｉｌ-2를 포함하는 융합 단일클론 항체 및 이를 포함하는 암치료용 조성물
AU2006218437A1 (en) Anti-angiogenic compounds