JP2016014070A - 遺伝子発現と疼痛 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】疼痛は実際の、もしくは潜在的な組織の損傷に関連する不快な感覚的および情動的経験として定義されるか、または、そのような損傷の観点において説明され得る。慢性疼痛は合衆国人口の40%が罹患しており、そして多くの有害な医学的状態と関連している。本発明は2本鎖オリゴヌクレオチド、その医薬組成物、ならびに細胞における侵害受容シグナル伝達を調節するか患者における疼痛を予防および/または処置するためのそのような2本鎖オリゴヌクレオチドおよび医薬組成物の使用に関する。
【選択図】図8
Description
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される:
(項目1)
2つの転写因子結合部位を含むオリゴヌクレオチドデコイであって、各転写因子結合部位がPOU1F1、POU2F、POU3F、POU5F1、USF、EGR1、CREB/ATF、AP1、CEBP、SRF、ETS1、MEF2、SP1、RUNX、NFAT、ELK1、三元複合体因子、STAT、GATA1、ELF1、核因子−顆粒球/マクロファージa、POU4F1、HNF1、ZFHX3、IRF、TEAD1、TBP、NFY、caccc−ボックス結合因子、KLF4、KLF7、IKZF、MAF、REST、HSF、KCNIP3およびPPAR転写因子よりなる群から選択される転写因子に結合する、オリゴヌクレオチドデコイ。
(項目2)
前記デコイ上の前記2つの転写因子結合部位の相対的位置が、前記オリゴヌクレオチドデコイと標的転写因子の間の結合親和性を増大させる、項目1に記載のオリゴヌクレオチドデコイ。
(項目3)
前記2つの転写因子結合部位がオーバーラップしている、項目1に記載のオリゴヌクレオチドデコイ。
(項目4)
前記2つの転写因子結合部位が同じ転写因子に結合する、項目1に記載のオリゴヌクレオチドデコイ。
(項目5)
前記転写因子がEGR1である、項目4に記載のオリゴヌクレオチドデコイ。
(項目6)
前記2つの転写因子結合部位が異なる転写因子に結合する、項目1に記載のオリゴヌクレオチドデコイ。
(項目7)
前記デコイが約20〜40塩基対長である、項目1に記載のオリゴヌクレオチドデコイ。
(項目8)
式(3)で表される配列を含む、項目1に記載のオリゴヌクレオチドデコイ。
(項目9)
前記配列が配列番号3の配列と少なくとも70%の同一性を有する、項目8に記載のオリゴヌクレオチドデコイ。
(項目10)
位置15〜21におけるヌクレオチドが存在しない、項目8に記載のオリゴヌクレオチドデコイ。
(項目11)
(a)配列番号42の配列;または、
(b)配列番号42の配列と少なくとも80%の同一性を有する配列;
を含む、項目1に記載のオリゴヌクレオチドデコイ。
(項目12)
第3の転写因子結合部位を更に含む項目1に記載のオリゴヌクレオチドデコイであって、前記第3の転写因子結合部位がPOU1F1、POU2F、POU3F、POU5F1、USF、EGR1、CREB/ATF、AP1、CEBP、SRF、ETS1、MEF2、SP1、RUNX、NFAT、ELK1、三元複合体因子、STAT、GATA1、ELF1、核因子−顆粒球/マクロファージa、POU4F1、HNF1、ZFHX3、IRF、TEAD1、TBP、NFY、caccc−ボックス結合因子、KLF4、KLF7、IKZF、MAF、REST、HSF、KCNIP3およびPPAR転写因子よりなる群から選択される転写因子に結合する、オリゴヌクレオチドデコイ。
(項目13)
(a)配列番号45の配列;または、
(b)配列番号45の配列と少なくとも70%の同一性を有する配列;
を含む、項目12に記載のオリゴヌクレオチドデコイ。
(項目14)
:
(a)配列番号1〜40、42、45および47〜53よりなる群から選択される配列;(b)配列番号1〜39、42、45および47〜53よりなる群から選択される配列と少なくとも90%の同一性を有する配列;
(c)配列番号1〜17、19〜39、42、45、47〜53よりなる群から選択される配列と少なくとも85%の同一性を有する配列;または、
(d)配列番号1〜5、7〜17、19〜39、42、45および47〜53よりなる群から選択される配列と少なくとも80%の同一性を有する配列;
を含む、オリゴヌクレオチドデコイ。
(項目15)
項目1に記載のオリゴヌクレオチドデコイおよび薬学的に許容しうる担体を含む、医薬組成物。
(項目16)
項目1に記載のオリゴヌクレオチドデコイおよび場合により前記オリゴヌクレオチドデコイを使用するための説明書を含む、キット。
(項目17)
項目1に記載のオリゴヌクレオチドデコイの有効量を細胞に投与することを含む、侵害受容シグナル伝達に関与する細胞中に存在する遺伝子の転写を調節するための方法。
(項目18)
前記細胞がニューロンである、項目17に記載の方法。
(項目19)
転写の調節が遺伝子発現を抑制、阻害、活性化、誘導または安定化する、項目17に記載の方法。
(項目20)
前記遺伝子がBDKRD2、HTR3A、SCN9A、BDNF、GRM5、NOS1、GCH1、CDK5R1、およびPNMTよりなる群から選択される、項目17に記載の方法。
(項目21)
項目1に記載のオリゴヌクレオチドデコイの有効量を細胞に投与することを含む、該細胞における侵害受容シグナル伝達を調節するための方法。
(項目22)
前記細胞がニューロンである、項目21に記載の方法。
(項目23)
項目1に記載のオリゴヌクレオチドデコイの治療有効量を患者に投与することを含む、該患者における疼痛を処置または予防するための方法。
(項目24)
該疼痛が急性から慢性の疼痛の何れかの疼痛である、項目23に記載の方法。
(項目25)
前記疼痛が術後疼痛である、項目23に記載の方法。
(項目26)
前記オリゴヌクレオチドデコイを硬膜外/硬膜周囲または髄腔内に投与する、項目23に記載の方法。
(項目27)
1つ以上のオリゴヌクレオチドデコイの治療有効量を患者に投与することを含む、該患者における疼痛を処置または予防するための方法であって、各オリゴヌクレオチドデコイが転写因子結合部位を含み、そして前記転写因子結合部位がPOU1F1、POU2F、POU3F、POU5F1、USF、EGR1、CREB/ATF、CEBP、SRF、MEF2、SP1、RUNX、NFAT、ELK1、三元複合体因子、ELF1、核因子−顆粒球/マクロファージa、POU4F1、HNF1、ZFHX3、IRF、TEAD1、TBP、NFY、caccc−ボックス結合因子、KLF4、KLF7、IKZF、MAF、REST、HSF、KCNIP3およびPPARよりなる群から選択される転写因子に結合する、方法。
(項目28)
各オリゴヌクレオチドデコイが2つの転写因子結合部位を含み、そして各転写因子結合部位がPOU1F1、POU2F、POU3F、POU5F1、USF、EGR1、CREB/ATF、AP1、CEBP、SRF、ETS1、MEF2、SP1、RUNX、NFAT、ELK1、三元複合体因子、STAT、GATA1、ELF1、核因子−顆粒球/マクロファージa、POU4F1、HNF1、ZFHX3、IRF、TEAD1、TBP、NFY、caccc−ボックス結合因子、KLF4、KLF7、IKZF、MAF、REST、HSF、KCNIP3およびPPARよりなる群から選択される転写因子に結合する、項目27に記載の方法。
「結合」とは、オリゴヌクレオチドデコイへの転写因子の結合の文脈において使用される場合、転写因子とオリゴヌクレオチドデコイとの間の直接の相互作用(たとえば、水素結合、ファンデルワールス結合等を含む、転写因子とオリゴヌクレオチドデコイの間の非共有結合)を指す。したがって、転写因子に結合しないオリゴヌクレオチドは該転写因子とは直接相互作用しない。
オリゴヌクレオチドデコイ
本発明はオリゴヌクレオチドデコイ、その医薬組成物、および侵害受容シグナル伝達を調節するため、および疼痛を予防および/または処置するためのそのようなオリゴヌクレオチドデコイおよび医薬組成物の使用に関する。
号2のヌクレオチド配列に対して有する。
Institute(EBI)より入手可能)、ClustalW プログラム(やはりEuropean Bioinformatics Institute(EBI)より入手可能)、またはBLASTプログラム(BLASTマニュアル,Altschulら、Natl Cent.Biotechnol.Inf.,Natl Lib.Med.(NCIB NLM NIH),Bethesda,Md.およびAltschulら(1997)NAR25:3389−3402)を包含する。
医薬組成物
本明細書に開示した医薬組成物は、患者への適切な投与のための形態を与えるために、薬学的に許容しうるビヒクルの適当な量と共に、好ましくは精製された形態における1つ以上のオリゴヌクレオチドデコイの治療有効量を含む。患者に投与する場合には、オリゴヌクレオチドデコイおよび薬学的に許容しうるビヒクルは好ましくは滅菌されている。オリゴヌクレオチドデコイを静脈内投与する場合には水が好ましいビヒクルである。食塩水および水性デキストロースおよびグリセロール溶液もまた特に注射用溶液のための液体ビヒクルとして使用できる。適当な薬学的ビヒクルは賦形剤、たとえば澱粉、グルコース、乳糖、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、白墨、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール等を包含する。本発明の医薬組成物は、所望により、少量の湿潤または乳化剤、またはpH緩衝剤も含有できる。更にまた、補助剤、安定化剤、濃厚化剤、潤滑剤および着色剤も使用してよい。
Science,第19版、1995参照)。
治療用途
特定の実施形態においては、オリゴヌクレオチドデコイおよび/またはその医薬組成物は、疼痛、限定しないがたとえば機械的疼痛(たとえば機械的痛覚過敏および/または異痛)、化学的疼痛、温度疼痛、慢性疼痛、亜慢性疼痛、急性疼痛、亜急性疼痛、炎症性疼痛、神経障害性疼痛、筋肉疼痛、骨格疼痛、術後疼痛、関節炎の疼痛、および糖尿病性の疼痛に罹患している患者、たとえば動物(たとえば鳥類、哺乳類、霊長類、またはヒト)に投与する。更にまた、特定の実施形態においては、オリゴヌクレオチドデコイおよび/またはその医薬組成物は、限定しないがたとえば術後疼痛、慢性疼痛、炎症性疼痛、神経障害性疼痛、筋肉疼痛、および骨格疼痛を包含する疼痛に対抗する予防手段として動物のような患者に投与される。特定の実施形態においては、オリゴヌクレオチドデコイおよび/またはその医薬組成物は、疼痛の1つの特徴の予防のために、疼痛の他の症状を同時に処置しつつ、使用してよい。
投与方法および投薬量
疼痛の処置または予防のための本発明の方法は、そのような処置または予防を必要とする患者へのオリゴヌクレオチドデコイまたはその医薬組成物の投与を必要とする。化合物および/またはその医薬組成物は何れかの都合のよい経路、たとえば注入または瞬時注射により、上皮または粘膜皮膚ライニング(たとえば口腔粘膜、直腸および腸の粘膜等)を介した吸収により、または経口により投与してよい。投与は全身または局所であることができる。種々の送達系が知られており、たとえば化合物および/またはその医薬組成物を投与するために使用できるリポソーム、微粒子、マイクロカプセル、カプセル等の中へのカプセル化が挙げられる。投与の方法は限定しないがたとえば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻内、硬膜上/硬膜周囲、経口、舌下、鼻内、大脳内、膣内、経皮、直腸、吸入または特に耳、鼻、眼、または皮膚への局所投与を包含する。特定の実施形態においては、1つより多いオリゴヌクレオチドデコイを患者に投与する。投与の好ましい様式は専門家の判断に委ねられ、そして部分的には医学的状態の部位に依存することになる。
併用療法
特定の実施形態においては、オリゴヌクレオチドデコイおよび/またはその医薬組成物はオリゴヌクレオチドデコイを含むがそれに限定されない少なくとも1つの他の治療薬との併用療法において使用できる。オリゴヌクレオチドデコイおよび/またはその医薬組成物および治療薬は相加的、またはより好ましくは相乗的に作用できる。一部の実施形態においては、オリゴヌクレオチドデコイおよび/またはその医薬組成物は別のオリゴヌクレオチドデコイを包含する別の治療薬の投与と同時に投与される。他の実施形態においては、オリゴヌクレオチドデコイまたはその医薬組成物は別のオリゴヌクレオチドデコイを包含する別の治療薬の投与の前または後に投与される。
実験プロトコル
本発明は更に以下の実験プロトコルを参照することにより定義される。材料および方法の両方に対する多くの変更が本発明の範囲を外れることなく実施してよいことは当業者の知る通りである。
・正常な遺伝子発現に関する対照として、無処置;
・後続する基底遺伝子発現の作用を計測するためのオリゴヌクレオチドデコイ処置;
・疼痛遺伝子発現を変えることによるインビボの疼痛状況を模倣するためのプロ炎症メディエーターの処置;および、
・後続する疼痛様状況のモジュレーションのレベルを計測するためのプロ炎症メディエーター+オリゴヌクレオチドデコイの二重処置;
を包含する独立した状況に付してよい。
鎖アニーリング
相補鎖の対よりなるオリゴヌクレオチドデコイの場合、相補鎖は食塩水緩衝液、たとえばTris−EDTA(TE)中において等モル濃度でアニーリングされる。標準的な操作法は、相補鎖に応じて変動してよい時間にわたり高い変性温度(たとえば100℃)に両方の鎖の溶液を維持すること、その後、溶液がアニーリングの低温(たとえば20℃)に到達するまで温度を緩徐に低下させること(たとえば0.3〜1℃/分)を包含する。相補鎖の適切なアニーリングは何れかの適当な標準的な手法、限定しないがたとえば、非変性ポリアクリルアミドゲル上でアニーリングしたオリゴヌクレオチドの試料を未アニーリングのものの隣で泳動させることにより確認して良い。自己アニーリングしているオリゴヌクレオチドデコイに関しては、同じプロトコルを追従する。
細胞培養
DRGおよび/または脊髄の細胞を動物(たとえば哺乳類、たとえばラットまたはマウス)から収集することができ、そしてニューロンは37℃においてコラゲナーゼ(たとえばII型コラゲナーゼ)を用いながら新しく解離させることができる。そのような態様において単離した細胞を適当なペトリ皿(たとえばコラーゲンコーティング)上にプレーティングできる。ニューロンを適切な培地の培養物(たとえばDMEM)中に維持する。細胞系統を解凍し、そして入手元の推奨に従って十分な培地およびペトリ皿中に維持する。細胞は典型的には37℃、5%CO2でインキュベートする。細胞系統は入手元の推奨に従って培養する。
本発明のオリゴヌクレオチドデコイは限定しないが表1に示す配列を包含する。一般的に、オリゴヌクレオチドデコイは表中に示した配列を相補配列にアニーリングすることにより形成する。ミスマッチの2本鎖オリゴヌクレオチドを形成するためには、表中に示した配列を、部分的にのみ相補である配列にアニーリングすることができる。例えば、配列番号43を配列番号46にアニーリングすることにより後述する実施例に記載するミスマッチ配列である配列番号43/46を形成することができる。
EGR1転写因子に結合するように設計されている配列番号3は本発明のオリゴヌクレオチドデコイのクラスに典型的な構造を有している。配列番号3の構造は、5’から3’の順に、5’フランキング配列、第1の転写因子結合部位、リンカー配列、第2の転写因子結合部位、そして3’フランキング配列を包含する。配列番号3と94%の同一性および同じ基本構造を有する配列番号40は、配列番号3よりも良好にEGR1に結合することがインシリコで予測されている。配列番号40の薬理学的分析をEGR1結合の検出に特異的な転写因子のELISAキットを用いながら実施した。転写因子ELISA技術の感度は古典的なEMSA実験よりも10倍高感度であり、転写因子デコイの詳細な薬理学的試験を可能にする。
実施例3:細胞におけるhEGR1転写活性の阻害
ヒト細胞におけるhEGR1転写活性を阻害する配列番号40および配列番号42の能力を、CDK5R1遺伝子発現に対するそれらの作用を介して計測した。CDK5R1はCDK5キナーゼの活性化物質である。両方とも末梢炎症後の疼痛ニューロンにおいてアップレギュレートされ、そして著明にはカプサイシン受容体TRPV1のホスホリル化を介して侵害受容シグナル伝達を調整する。hEGR1はヒトHL60細胞においてCDK5R1プロモーターに直接結合し、そして1,25−ジヒドロキシビタミンD3による細胞分化の後のそのアップレギュレーションを制御する。HL60細胞におけるデコイとして使用される天然のCDK5R1プロモーターのセグメントはCDK5R1の発現を阻害することが既に知られている。本発明者等は、本発明者等のデコイ配列がhEGR1活性を阻害する効率を、HL60細胞分化後にそれらがもたらすCDK5R1の阻害のレベルを計測することにより評価した。CDK5R1mRNA発現レベルはsqRT−PCR(例えば図3A参照)により計測し、そして半阻害濃度IC50は、1,25−ジヒドロキシビタミンD3分化後に計測される最大CDK5R1mRNA発現レベルの50%阻害をもたらすために必要なデコイ濃度を指す。
実施例4:疼痛遺伝子発現の阻害
PC12は、それらがNGFまたはcAMP上昇化合物のようなプロ炎症メディエーターに応答して内因性疼痛ニューロンと同様の態様において多くの疼痛遺伝子を発現および調整することから、疼痛シグナル伝達経路を研究するためのモデルとして広範に使用されている褐色細胞腫細胞である。本発明者等は疼痛遺伝子発現プロファイルに対する配列番号42デコイの処置の作用を計測した。本発明者等は11種の疼痛遺伝子を、(i)多数の疼痛症候群におけるそれらの重要な役割、(ii)疼痛シグナル伝達経路に沿ったそれらの異なる位置、および(iii)内因性疼痛ニューロンの間のそれらの発現の調整とPC12細胞との間の強力な平行性に基づいて選択した。それらは4種の遺伝子のクラス、即ち:イオンチャンネル(Scn9a、Cacna1b)、膜受容体(Grm5、Bdkrb2、P2rx3、Htr3a)、シグナル伝達および神経伝達物質合成酵素および関連の蛋白質(Cdk5r1、Gch1、Pnmt、Nos1)および神経伝達物質(Bdnf)に属する。
実施例5:相補デコイ試験
本発明者等は(i)疼痛遺伝子の発現の柔軟性において重要でありEGR1の役割を補完する最初期遺伝子であるCREB/ATFおよびNFAT、および(ii)ニューロン疼痛遺伝子の基礎発現および組織特異的発現の維持において重要なAML1およびSP1因子を包含する異なる役割を有する転写因子をターゲティングする数種の他のオリゴヌクレオチドデコイ配列を分析した。
Egr1、Creb/AtfおよびNfatを包含する転写ネットワークに関与していると考えられる。これらの因子の単一のものの活性が本発明者等のデコイ配列の1つにより阻害される場合、調整は失われる。これは、所定の遺伝子の発現をその調整に関与する転写因子のすべてをターゲティングすることを必要とせずに抑制してよいため、デコイ法の重要な潜在的な治療上の利点をもたらすものである。
実施例6:複合オリゴヌクレオチドデコイ
重複性の特定のレベルが転写因子活性の間で作動すると考え、本発明者等はEGR1、CREB/ATFおよびNFATの同時疎外のために複合デコイ配列である配列番号45を開発した。そのような配列の利点はニューロン形成性に関与し、そして疼痛の感覚のために重要な補完的シグナル伝達経路を統合している3つの主要な最初期遺伝子の同時阻害である。多くの代謝生成物産生疼痛受容体(例えばNGF受容体NTRK1/NGFR)により活性化されるMAPK/ERK経路のようなシグナル伝達キナーゼはEGR1を動員しつつ、カルシウム−およびカチオン性チャンネルにより動員されたカルシウムシグナル伝達経路はCREBおよびNFATを活性化する。配列番号45の配列は、5’から3’の順に、EGR1、CREB/ATFおよびNFATに対する転写因子結合部位であり、これらの各々は配列番号3(EGR1)、配列番号4(CREB/ATF)、および配列番号15(NFAT)の個々の応答エレメントから選択される。
実施例7:インビボの疼痛処置
炎症は疼痛の主要な発生源である。それは関節炎および術後の疼痛のような多くの疼痛症候群に共通の特徴である。完全フロインドアジュバントモデル(CFA)はヒトの炎症性疼痛の特徴を再現するために一般的に使用されている十分特性化された炎症性疼痛のモデルである。例えば後肢の炎症の後、動物は頑健で長時間持続する機械的異痛(即ち通常は非疼痛性の機械的刺激に応答した疼痛)を発症し、この現象は、術後の状況おける患者の歩行、呼吸および摂食に関わる主要な疼痛発生源および制約要因である。
細胞培養および生物学的試薬
HL60(ヒト末梢血、急性前骨髄球性白血病)およびPC12(ラット副腎、褐色細胞腫細胞)細胞系統をUCSF細胞培養施設(CA,USA)より購入した。HL60細胞は10%熱不活性化ウシ胎児血清および1%ペニシリン−ストレプトマイシン(Invitrogen,CA,USA)を添加したRPMI培地1640+L−グルタミン(Invitrogen,CA,USA)中に生育させた。細胞は、前述の通りデコイトランスフェクションを行うか、行うことなく、1μM1,25−ジヒドロキシビタミンD3の処置前24時間に約200x104細胞/ウェルにおいて6穴プレート(BDBiosciences,USA)中にスプリットした。PC12細胞は、1,000mg/LのD−グルコース、L−グルタミン、25mMHEPES緩衝液、および110mg/Lピルビン酸ナトリウム(Invitrogen,CA,USA)を含有し、そして10%熱不活性化ウシ胎児血清、5%熱不活性化ウマ血清および1%ペニシリン−ストレプトマイシン(Invitrogen,CA,USA)を添加したDMEM中に生育させた。PC12細胞は、デコイトランスフェクションを行うか、行うことなく、100nMNGF(Invitrogen,CA,USA)および5μMフォルスコリン(Sigma−Aldrich,MO,USA)の処置前24時間にCellBindの6穴プレート(Corning,USA)にスプリットした。全細胞を37℃5%CO2で生育させた。死滅細胞の計数はMalassez計数チャンバー上でトリパンブルー(Invitrogen,CA,USA)排出法を用いて実施した。
デコイ配列アニーリング
各デコイ配列に関するフォワードおよびリバースの鎖はIntegratedDNATechnology(IA、USA)が合成し、そして1xTE緩衝液、pH7.4またはpH8の何れかに再懸濁した。各鎖対を50mMのNaClの存在下、7分間95℃の変性工程および0.5℃/分で25℃までの緩徐な冷却によりアニーリングした。アニーリングの成功は相当する1本鎖に対するデュプレックスの遊走速度がより緩徐であることを観察することにより、臭化エチジウムを用いて2.5%アガロースゲル上で確認した。デコイ配列トランスフェクション
デコイ配列のトランスフェクションはオリゴフェクタミン(Invitrogen,CA,USA)を用いながら製造元のプロトコルに従って実施した。HL60実験に関しては、デコイ配列トランスフェクション(250nM、500nM、1000nMおよび2000nM)の直後に1,25−ジヒドロキシビタミンD3(1μM)処置を行った。細胞を48時間後に収集し、そしてRNA抽出用に調製した。PC12細胞に関しては、NGF(100ng/ml)およびフォルスコリン(5μM)をデコイ配列トランスフェクション(500nM)直後に適用した。RNA抽出の24時間後に細胞を収集した。
半定量的逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応(sqRT−PCR)
全RNAは、RNA抽出の間のゲノムDNAの除去を確実に行うRNeasyPlusキット(Qiagen,USA)を用いながら細胞から抽出した。当量のRNAの量を、First鎖cDNA合成キット(GEhealthcare,NJ,USA)またはSuperscript1st鎖系(Invitrogen,CA,USA)の何れかを用いながら条件当たりcDNA内に逆転写し、そして各RTの16分の1をPCR反応当たり使用した。PCRは総量20μl中、Promegaマスターミックス(Promega,WI,USA)を用いながら、以下のサイクル、即ち:95℃1分、55℃1分、72℃1分(ハウスキーピング遺伝子ACTBおよびGapdhに対しては25サイクル、他の遺伝子に対しては35サイクルを行うことにより直線検出範囲においてシグナル飽和まで物質の検出を行う)。使用した全プライマー(表3参照)は依然に報告されている。
転写因子ELISA実験
デコイ配列のそれらの転写因子標的に対する親和性および特異性を比色転写因子ELISA(酵素結合免疫吸着)キット(Panomics,CA,USA)を用いて計測した。慨すれば、ビオチンにカップリングされた所定のデコイ配列を、標的転写因子を発現するTPA刺激K−562細胞に由来する核蛋白質抽出物(Activemotif,CA,USA)とともに30分間インキュベートした。蛋白質およびデコイ配列の混合物をキット中に提供されているストレプトアビジンでコーティングした96穴プレート上にローディングした。各デコイ配列によりキャプチャーされた転写因子の量は、特異的な一次抗体およびセイヨウワサビパーオキシダーゼ(HRP)酵素にカップリングされた二次抗体を用いながら供給元によるプロトコルに従って明らかにした。反応の光学密度(OD)Thermomaxマイクロプレートリーダー(MolecularDevices,CA,USA)を用いて450nMで読み取った。
挙動実験
Sprague−Dawleyラット(雄性、250〜300g)の左後肢の足底表面に150μlの完全フロインドアジュバント(CFA)を注射した(30G針)。1gおよび6gのVonFreyフィラメントを用いて後肢の機械的応答性(即ち異痛)に関して試験した。慨すれば各VonFreyフィラメントを5回適用し、そして肢の撤退の回数を計数した。動物は試験前1時間メッシュ床上に馴化させた。動物の基礎的な機械的感受性を配列番号42およびCFA処置の前に試験した。全実験を盲検的に実施した。
・第0日:配列番号42の第1回注射の後の基礎的VonFrey感受性試験
・第1日:CFA処置前1時間の配列番号42の第2回注射
・第2日:VonFrey試験前1時間の配列番号42の第3回注射
・第5日:VonFrey試験前1時間の配列番号42の第4回注射
対照動物には同じ日程に従ってベヒクルとしてTEのみを注射する。髄腔内注射の場合、ラットは2%イソフルランで麻酔し、動物の背部を剃毛し、そしてベタジンで調製した。次にラットをボトル内に入れることにより背部を湾曲させたままとした。17G1/2針をL6横突起の左側に沿ってそれがL5に到達するまで吻側にスライドさせた。次に尾部の攣縮により示される通り髄腔内空間に到達するまでL5とL6の間に針を挿入した。
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- 明細書に記載のオリゴヌクレオチドデコイの治療有効量を患者に投与すること を含む、該患者における疼痛を処置または予防するための方法。
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