JP2015526510A - 塞栓用のミクロスフェアの製造方法及び薬物含有ナノ輸送体が結合されたミクロスフェアの製造方法 - Google Patents

塞栓用のミクロスフェアの製造方法及び薬物含有ナノ輸送体が結合されたミクロスフェアの製造方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、凍結乾燥された塞栓用ミクロスフェアの回復性の最適化工程及び薬物含有ナノ輸送体が結合されたキトサンミクロスフェアに関するものであり、より具体的には、ミクロスフェアの安定された保管のための凍結乾燥処理の前に、凍結乾燥保護剤としてトレハロース（trehalose）を添加し、凍結乾燥処理されたミクロスフェアをボルテックスさせて、再水和する回復性の最適化工程及び薬物/キトサンの比率によって薬物含有ナノ輸送体が結合されたキトサンミクロスフェアから放出される薬物の量が調節されるので、精密に薬物放出調節が可能となるようにしたミクロスフェア及びその製造方法に関するものである。本発明による最適化工程を用いれば、塞栓用のミクロスフェアの凍結乾燥処理後にも物理的性質、形態、及び薬物放出の程度を維持できるメリットがあり、本発明による薬物含有ナノ輸送体が結合されたキトサンミクロスフェアは、血管内で安定的に塞栓を起こし、薬物の放出が精密に調節されるので、化学療法（抗がん剤治療）に用いることができる。【選択図】図９

Description

本発明は、塞栓用のミクロスフェアの製造方法及び薬物含有ナノ輸送体が結合されたミクロスフェアの製造方法に関するものである。
塞栓術（embolization）または塞栓療法（embolotherapy）は、腫瘍組織に酸素と栄養を提供する血液を遮断するために、特定の物質を血管に挿入して腫瘍を治療する技術である。一般的に、塞栓用の挿入物は、 生物的適合性 （biocompatible）、親水性、非毒性（non-toxicity）、及び生分解性（biodegradability）の条件を満たさなければならないが、主にキトサン、デンプン、ゼラチン、アルブミン、アルギン酸ナトリウムなどのようなミクロスフェア（microsphere）が塞栓用の物質として研究されている。特に、Contour（ポリビニルアルコール、Target社、USA）を、Ivalon（Laboratoire Ingenor社、Paris）のようなポリビニルアルコール（PVA）の粒子が市場の80％以上を占める主な塞栓ミクロスフェアの材料として長年使用されてきた。しかし、上記のポリビニルアルコールの粒子は、不規則な形状によって均一なサイズを得るのが困難であり、塞栓術の効能を低下させて、複数の副作用を呼び起こす問題点がある。
塞栓ミクロスフェアは、塞栓術に使用されるだけでなく、薬物遺伝子などの伝達体としても研究されており、薬物を含有している多機能塞栓ミクロスフェアは、優れた抗癌治療の効能を有している。これらのミクロスフェアは、体内に挿入する時に液体に込められて用いられるが、安定な保管のためには、固体の状態で維持することが好ましく、そのための方法としては、凍結乾燥の工程が最も好まれる。
薬剤において凍結乾燥とは、水溶液や水分を含有した材料を凍結させ減圧して、氷を昇華させて水分を除去して、乾燥物を得る方法で、不安定な生物学的活性のある試料を常温で長期間保存できるようにする。
また、塞栓用のミクロスフェアにおいて変形しやすい弾力性のある粒子がより優れた塞栓効果を示すことは広く知られている（Trisacryl gelatin microspheres for therapeutic embolization、II：Preliminary Clinical evaluation in tumors and arteriovenous malformaitions、Beaujeux et al、 Am J Neuroradiol、1996;17：541-548）。
しかし、従来のミクロスフェアは、凍結乾燥の後に粒子がそのまま回復されるのが難しかったので、サイズや形態が不規則であって、塞栓の効果が低下し、生物学的活性が低下されて、薬物の放出量が維持されなかった。
一方、最近の薬物放出が可能な塞栓用のミクロスフェアへの関心が高まっている。しかし、従来のミクロスフェアは、薬物を含有させるために薬物溶液に浸し、イオン交換過程を経なければならなかったし、また、体内に挿入されたときにも、血液の中のイオンと、ミクロスフェアの中の薬物イオンとの間のイオン交換反応によって薬物が伝達される方法を有していた。したがって、体内のイオンを調節しない限り、薬物放出の制御は事実上不可能であるという短所があった。
キトサンは、薬物含有のため、主に用いられる塞栓物質として、非毒性（non-toxicity）、生物的適合性（biocompatibility）、及び生分解性（biodegradability）を条件として備えているが、塞栓のために血管の内で膨潤する過程で、簡単に壊れる問題を有している。韓国登録特許10-0478227でキトサンミクロスフェアの製造方法を提供しているが、抗がん剤の含有のためにキトサンミクロスフェアにエタノールを添加して真空下で2回置換して、塩酸ドキソルビシンを添加してキトサンの分子鎖の間にイオン交換反応を介して塩酸ドキソルビシンを吸着させて固定されるようにする方法を提示している。しかし、キトサンミクロスフェアに塩酸ドキソルビシンを吸着させた後、蒸留水洗浄工程で消失される塩酸ドキソルビシンの量が比較的多く、薬物含有量の調節が難しいという問題がある。
また、韓国登録特許10-1157260には、化学塞栓術のための組成物での薬物含有が可能なポリビニルアルコール粒子を用いた水-不溶性及び水-膨張性である合成陰イオンポリマーを提供している。上記の合成陰イオンポリマーは、ドキソルビシン水溶液に24時間浸し、イオン交換反応を用いて、ミクロスフェアの中にドキソルビシンを含有させた後、化学塞栓術に使用することを記載しているが、やはり、体内での薬物放出を精密に制御することができないという点で限界を有している。
したがって、凍結乾燥処理の後にも、ミクロスフェアが物理的安定度及び初期薬物放出を維持できるようにする凍結乾燥方法が求められており、これに加えて薬物放出の精密な調節が可能で、物性が優れた新しいミクロスフェアの開発が求められている実情である。
本発明は、上記のような従来技術上の問題点を解決するために案出されたものであって、塞栓施術用ミクロスフェアの凍結乾燥過程の後にも粒子の物性と薬物放出の様相をそのまま維持できるように最適化された凍結乾燥方法を提供しようと努力した結果、トレハロースを凍結乾燥保護剤として用いて、再水和する方法でボルテックス（vortex）を選択することにより、ミクロスフェアが、凍結乾燥前と同様に回復されることを発見した。
また、薬物放出の精密な調節が可能でありながら物理化学的に安定した性質を有する塞栓用の挿入物の製造方法を提供しようと研究した結果、薬物をナノ輸送体の中に封入させて、これをキトサンミクロスフェアと乳化架橋法を介して連結させることで、薬物含有ナノ輸送体が結合されたキトサンミクロスフェアを製造して、製造されたキトサン微細球が薬物とキトサンの添加割合によって薬物放出が精密に調節されることと発見して、本発明を完成することに至った。
すなわち、本発明の目的は、凍結乾燥の後の塞栓用のミクロスフェアが回復性を有することができるように最適化された凍結乾燥方法及び再水和方法を提供することにあり、また、ナノ輸送体の中に癌治療用の薬物を封入させて薬物含有ナノ輸送体を製造し、上記のナノ輸送体を乳化。架橋作用を利用して、ミクロスフェアと結合させることにより、体内で薬物放出の正確な制御が可能な特徴を有する薬物含有ナノ輸送体が結合されたミクロスフェアを提供しようとすることにある。
しかし、本発明が解決しようとする技術的課題は、以上で言及した課題に制限されず、言及されていない他の課題は、以下の記載から当業者に明確に理解されるだろう。
上記の目的を達成するために、本発明は、a）ミクロスフェア懸濁液にトレハロース（trehalose）を添加する段階；b）上記の懸濁液を氷点下50℃ないし氷点下100℃で凍結乾燥させて、乾燥ミクロスフェアを製造する段階；及びc）上記の乾燥ミクロスフェアを、水または緩衝溶液（buffer）に添加して、ボルテックス（vortexing）させる段階を含む塞栓用のミクロスフェアの製造方法を提供する。
上記のミクロスフェアの材料は、キトサン、アルギン酸塩、キチン、ポリN-イソプロピルアクリルアミド（PNIPam）、ポリエチレングリコール（PEG）、ポリ乳酸（PLLA）、ポリDL-乳酸（PDLLA）、ポリグリコール酸（PGA）、ポリカプロラクトン（PCL）、ポリヒドロキシアルカノエート、ポリジオキサノン（PDS）、ポリトリメチレンカーボネート、 ポリ乳酸・グリコール酸（PLGA）、ポリL-乳酸-co-カプロラクトン（PLCL）、 ポリグリコール酸−co−カプロラクトン（PGCL）、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン（dermatan）硫酸、カルボキシメチルセルロース、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ケラタン硫酸、カルボキシメチルヒドロキシエチルセルロース、セルロース硫酸、セルロースホスフェート、カルボキシメチルグアル、カルボキシメチルヒドロキシプロピルグアル、カルボキシメチルヒドロキシエチルグアル、キサンタンガム、ゲランガム（gellan gum）、ウェランガム（welan gum）、ラムサンガム（rhamsan gum）、アガロース、 ファーセレラン（furcellaran）、ペクチン、アラビアガム、タラカントガム（gum tragacanth）、カラギーナン（carrageenans）、スターチホスフェート、デンプンコハク酸、グリコサミノグリカン、ポリサッカライド、ポリペプチド、アクリルアミド、N-ビニルピロリドン、ジメチルアクリルアミド、アクリル酸、メタクリル酸、無水マレイン酸、ビニルスルホン酸、スチレンカルボン酸2-アクリルアミド-2-メチル-プロパンスルホン酸、ビニルホスホン酸、2-メチルアクリロイルオキシエチルスルホン酸、ゼラチン、及びコラーゲンよりなる群から選択されることを特徴とする。
本発明の他の実施例では、上記のトレハロースは、ミクロスフェア懸濁液の体積比3％ないし20％に添加することを特徴とする。
本発明の別の実施例では、 上記のc）の段階は、造影剤をさらに含むことを特徴とする。
本発明の別の実施例では、上記の造影剤は、MRI（magnetic resonance imaging）造影剤、CT（computed tomography）造影剤、SPECT（single photon emission computed tomography）造影剤、PET（positron emission tomography）、BL（bioluminescence）造影剤、光学造影剤、X-ray造影剤、及び超音波造影剤よりなる群から選択されることを特徴とする。
本発明の別の実施例では、上記のボルテックスは5分〜20分の間に実行されることを特徴とする。
本発明の別の実施例では、上記の方法で製造されるミクロスフェアは、薬物放出が可能であることを特徴とする。
本発明の別の実施例では、上記の薬物は、癌治療用の薬物であることを特徴とする。
本発明の別の実施例では、 上記の癌治療用の薬物は、ドキソルビシンであることを特徴とする。
また、本発明は、 a）ナノ輸送体に薬物を導入するの段階；b）上記の薬物が導入されたナノ輸送体をキトサン溶液に入れて混合溶液を作って攪拌させる段階；c）上記の攪拌させた混合溶液を、オイル及び有機溶媒を混合した溶液に入れて、界面活性剤を投入して攪拌する乳化の段階；及びd）上記の乳化された混合溶液に、グルタルアルデヒド飽和トルエンまたはゲニピンを点滴した後、攪拌する架橋の段階；を含むキトサンミクロスフェアの製造方法を提供する。
本発明の一実施例で、 上記のナノ輸送体は、リポソーム、脂質ナノ粒子、ナノカプセル、ナノエマルジョン及びナノ構造体よりなる群から選択されることを特徴とする。
本発明の他の実施例で、上記のナノ輸送体は、リポソームであることを特徴とする。
本発明の別の実施例では、上記の薬物は、癌治療用の薬物であることを特徴とする。
本発明の別の実施例では、上記の癌治療用の薬物は、ドキソルビシンであることを特徴とする。
本発明の別の実施例に、上記のオイルはパラフィンオイル(paraffin oil)、α-ビサボロール(α-bisabolol)、グリチルレチン酸ステアリル (stearyl glycyrrhetinate)、サリチル酸(salicylic acid)、トコフェリル酢酸 (tocopheryl acetate)、パンテノール(panthenol)、ステアリン酸グリセリル(glyceryl stearate)、 オクタン酸セチル(cetyl octanoate)、イソプロピルミリステート(isopropyl myristate)、ペラルゴン酸エチル(ethyl pelargonate)、ジ−Ｃ１２−１３リンゴ酸ジアルキル(di-c12-13 alkyl malate)、オクタン酸セテアリル(cetearyl octanoate)、ジ（カプリル／カプリン酸）ＢＧ (butylene glycol dicaptylate/dicaprate)、イソノニル・イソステアリン酸(isononyl isostearate)、イソステアリル・イソステアリン酸(isostearyl isostearate)、オクタン酸セチル(cetyl octanoate)、ミリスチン酸2-オクチルドデシル(octyldodecyl myristate)、セチルエステル(cetyl esters)、 脂肪酸（Ｃ１０−３０）（コレステロール／ラノステロール）エステル(c10-30 cholesterol/lanosterol ester)、 水素化ヒマシ油 (hydrogenated castor oil)、モノグリセリド(mono-glycerides)、ジグリセリド(diglycerides)、トリグリセリド(triglycerides)、 ビーズワックス(beeswax)、カルナウバ・ワックス(carnauba wax)、 ジステアリン酸スクロース(sucrose distearate)、ＰＥＧ−８ビーズワックス(PEG-8 beeswax)、 キャンデリラワックス(candelilla(euphorbia cerifera)wax)、ミネラルオイル、スクアレン(squalene)、スクアルラン(squalane)、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセライド、中鎖グリセリド、ミグリオール(miglyol)、及びクレモフォール (cremophor)よりなる群から一つ以上選択されることを特徴とする。
本発明の別の実施例として、上記の有機溶媒は石油エーテル、エチルエーテル、酢酸イソプロピル、n-プロピルアセテート、イソブチルアセテート、n-酢酸ブチル、イソ酪酸イソブチル、2-エチルヘキシルアセテート、エチレングリコールジアセテート、C-9 アセテート、 C-10 アセテート、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、イソアミルメチルケトン、メチルn-アミルケトン、ジブチルケトン、シクロヘキサノン、イソホロン、アセトアルデヒド、n-ブチルアルデヒド、クロトンアルデヒド、2-エチルヘキサアルデヒド、イソブチルアルデヒド、プロピオンアルデヒド、エチル3-エトキシプロピオネート、トルエン、キシレン、トリクロロエタン、プロピレングリコールモノメチルエーテルアセタート、エチレングリコールモノエチルエーテルアセテート、エチレングリコールモノブチルエーテル、ジエチレングリコールモノブチルエーテルアセテート、フタル酸ジブチル、フタル酸2−エチル、フタル酸ジメチル、フタル酸ジオクチル、テレフタル酸ジオクチル、フタル酸ブチルオクチル、フタル酸ブチルベンゼン、ジオクチルアジペート、トリエチレングリコールジ-２‐エチルヘキサノアート、トリオクチルトリメチラート、グリセリルトリアセテート、グリセリル・トリプロピオニン、及び2,2,4-トリメチル-1 3-ペンタンジオールジイソブチレートよりなる群から一つ以上選択されることを特徴とする。
本発明の別の実施例として、 上記の界面活性剤は、セスキオレイン酸ソルビタン、ステアリン酸グリセリル、ポリソルベート60、ポリソルベート80、ソルビタントリオレホスフェート、ステアリン酸ソルビタン、イソステアリン酸PEG−20グリセリル、セテス−25、PEG-60 水素化ヒマシ油、ノノキシノール15、PEG-6デシルテトラデセス-20、ジメチコンコポリオール、ジイソステアリン酸グリセリル、セテス−24、セテアリルアルコール、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル、PEG-40 水素化ヒマシ油、セチルジメチルチコンコポリオール、ポリグリセリル-3メチルグルコースジステレート、 PEG-100ステアレート、イソステアリン酸ソルビタン、ラウロイルグルタミン酸ナトリウム、ココアンホジ酢酸2Na、ラウリン酸ジエタノールアミド、ヤシ油脂肪酸ジエタノールアミド、 N,N-ビス(2-ヒドロキシエチル)-コカミド、及びコカミドプロピルベタインより構成される群から1つ以上選択されることを特徴とする。
また、本発明は 薬物含有のナノ輸送体に乳化架橋法により付着されたキトサンミクロスフェアを有効成分として含む塞栓施術用の組成物を提供する。
本発明の一実施例において、上記の薬物は、癌治療のための薬物であることを特徴とする。
本発明の他の実施例において、 上記の癌治療のための薬物は、ドキソルビシンであることを特徴とする。
本発明の塞栓用のミクロスフェアの凍結乾燥方法を利用すれば、凍結乾燥の後にも安定した物性を有するミクロスフェアを製造することができる。上記の方法を通じて作られたミクロスフェアは、均一な球状であり、500μm以下のサイズを有し、挿入の後、凍結乾燥の前の形態で迅速に回復されている特徴があり、塞栓術に有用に使うことができるメリットがある。
また、本発明の方法を通じて処理された塞栓用のミクロスフェアは、ドキソルビシンやシスプラチンなどのような抗がん薬物の放出が可能な伝達体として有用に活用できる効果がある。
これに加えて、従来に発明された製品が塞栓施術の直前に、ミクロスフェアに薬物搭載のために1時間ないし2時間の工程を経なければならないもの（例えば、DC Beads、Biocompatibles社、UK）とは異なって、本発明の塞栓用のミクロスフェアは、薬物が最初から搭載されている状態で製造されるので、別の薬物搭載の時間を必要としないメリットがある。
最終的には、本発明の塞栓用のミクロスフェアは、安定な保管のための凍結乾燥の後にも、以前の物性に迅速に回復されて、塞栓粒子の癌細胞の血管閉塞による抗がん効果と抗がん薬物の放出により効果的な抗がん作用を示すというメリットがある。
一方、従来の抗がん薬物を含有するミクロスフェアは、イオン交換によってキトサンに抗がん薬物を結合させるために、ミクロスフェアをイオン交換樹脂でコーティングして、薬物と化学的結合をさせる方法で製造された。上記のイオン交換方式は、時間がかかりすぎるし、薬物の導入量が調節されておらず、準備過程は非常に面倒な問題があった。
また、本発明者の登録特許第10-1058196号の方法でキトサンミクロスフェアを作る場合は、キトサンと抗がん薬物との間の相互作用が比較的に低いため、蒸留水洗浄工程でドキソルビシンが容易に消失される問題があった。
しかし、本発明の薬物含有ナノ輸送体が結合されたキトサンミクロスフェアは、乳化架橋法に薬物含有ナノ輸送体とキトサンミクロスフェアを付着させて、相互粘度が増加して洗浄過程で薬物が消失される量が著しく低くてミクロスフェアの物理的強度もさらに増加する。
したがって、本発明の薬物含有ナノ輸送体が結合されたキトサンミクロスフェアを用いれば、キトサンミクロスフェアの薬物放出量をより正確に調整することができる。したがって、キトサンミクロスフェアの薬物放出効率も大幅に増加して、キトサンミクロスフェアの物理的な強度が増加し、優れた塞栓治療効果を有するメリットがある。
したがって、本発明による薬物含有ナノ輸送体が結合されたキトサンミクロスフェアは、薬物放出の正確な調節が可能な特異性を有しているので、これを用いれば、従来の薬物放出ミクロスフェアと比較して優れた効果を示すので、ターゲット腫瘍に対して選択的な薬物放出の調節が可能であって、塞栓効果の優れた新しい抗がん治療用の塞栓用の挿入物として使用することができる。
図1は、4つの種類の凍結保護剤による効果及びボルテックス（vortexing）処理時間による効果を比較するために、粒子のサイズ分布を示す図面である。 図2は、ボルテックス（vortexing）処理時間によるキトサン粒子の平均直径と球形性の関係を示す図面である。 図3は、4つの種類の凍結保護剤による効果を比較するために、元の粒子のサイズに回復した粒子の重量分率を測定した結果を示す図面である。 図4は、トレハロース（trehalose）を工程の中に加える方法及びその濃度による効果を比較するために、元の粒子のサイズに回復した粒子の重量分率を測定した結果を示す図面である。 図5は、薬物の搭載が凍結乾燥した後、回復させた粒子のサイズの分布に及ぼす影響を評価した図面である。 図6は、凍結乾燥前の後と薬物搭載の有無によるキトサン粒子の形態を100倍率で拡大して見せる図面である。 図7は、粒子の回復のためのボルテックス過程の有無による粒子の弾力性の比較のために物性分析機を用いて圧縮試験を行った結果を示す図面である。 図8は、凍結乾燥前後の粒子弾力性の比較のために物性分析機を用いて圧縮試験を行った結果を示す図面である。 図9は、凍結乾燥の前後のキトサン粒子からドキソルビシンが放出される面を測定した結果を示す図面である。 図10は、ドキソルビシン含有リポソーム、ドキソルビシン含有キトサンミクロスフェア、ドキソルビシンリポソーム含有キトサン塞栓微細球の組成及び特性を示す図面である。 図11は、ドキソルビシン含有キトサン塞栓微細球を得るための最適の攪拌（stirring）速度（B）と、それに基づいて生成されたキトサンミクロスフェアのサイズの比率（A）を示す図面である。 図12は、本発明によるドキソルビシン含有キトサンミクロスフェア及びドキソルビシンリポソーム含有キトサンミクロスフェアから放出されるドキソルビシンの時間による放出量を示す図面である。
本発明は、塞栓施術用のミクロスフェアの安定な保管のために凍結乾燥処理の後にも、凍結乾燥前の形態に迅速に回復することができるようにする最適化された凍結乾燥方法及び再水和する方法に関するものである。
本発明者は、凍結乾燥を処理した後にも、元の形態を維持して塞栓術に容易に用いられることができて、薬物放出に影響を受けない最適の凍結乾燥条件を確立するために、キトサンミクロスフェアに最適の凍結乾燥保護剤、凍結乾燥条件、及び再水和する方法を研究した。
その結果、トレハロースを凍結乾燥処理の前に保護剤として添加してボルテックス（vortex）させると、凍結乾燥処理前のキトサンミクロスフェアと同じようなサイズ及び一定の球形の形態で回復されることを確認して、本発明を完成した。
したがって、本発明は、
a）ミクロスフェアの懸濁液にトレハロース（trehalose）を添加してくれるの段階;
b）上記の懸濁液を氷点下50℃ないし氷点下100℃で凍結乾燥させて乾燥ミクロスフェアを製造する段階;及び
c）上記の乾燥ミクロスフェアを、水または緩衝溶液（buffer）に添加し、ボルテックス（vortexing）させる段階;を含む塞栓用のミクロスフェアの製造方法を提供することにその特徴がある。
本発明での用語「ボルテックス（渦、vortex）」とは、ある中心の周りに流体を回転運動させることを意味して、本発明の一実施例では、ボルテックス機（VM-96B、Jeio Tech、Korea）を用いてボルテックスさせたが、上記の機器に限定されるものではない。
本発明での用語「球形性（spherical）」とは、ある粒子の球形に近い程度のことをいうものであり、粒子上の最長の長さと最短の長さの比で求められる。つまり、球形に近いほど1に近く表現される。また、本発明での「実質的な球状」というのは、一般的に、少なくとも外部表面積を示す体積として定義される、すなわち、完全な球に近い形態を意味する。具体的には、本発明の「実質的な球形」は、ミクロスフェアの任意の断面を見たとき、大きな直径と小さな直径の差が20％未満、10％未満、または5％未満であることを意味する。
塞栓用のミクロスフェアの最適化された凍結乾燥及び回復条件を確立するために、本発明の実施例では、まず、キトサンミクロスフェアを製造して、凍結乾燥させたところ、上記の凍結乾燥温度は氷点下50℃ないし氷点下100℃で行うすることができるが、好ましくは氷点下60℃ないし氷点下80℃であることができる。最も好ましくは、氷点下70℃で行うことである。本発明では、凍結乾燥機（FD8508、Ilshin Biobase Co. Ltd、Dongduchun、Korea）を使用して凍結乾燥させたが、上記の機器に限定されるものではない。
凍結乾燥の後、ミクロスフェアの再水和方法を選定するために、まず、生理食塩水と造影剤を添加して、振盪恒温水槽を用いた再水和する方法とボルテックスを利用した再水和する方法を比較して、ボルテックスを利用する再水和する方法がより好ましいことを発見した（実施例1.3参照）。上記のボルテックスは、好ましくは5分ないし20分の間に行われることがことができるが、より好ましくは8分ないし12分であるし、最も好ましくは10分である。
また、凍結保護剤を選定するために、グルコース（glucose）、ラクトース（lactose）、スクロース（sucrose）、及びトレハロース（trehalose）の比較を実施した。その結果、トレハロースを、ミクロスフェアの懸濁液の製造の後に加えて、凍結乾燥を行う方法が最も望ましいことを発見した（実施例1.4参照）。上記トレハロースは、ミクロスフェアの懸濁液の3％ないし20％添加されるが好ましく、さらに好ましくは10％で添加することができる。
上記のミクロスフェアの材料は、生物的適合性であり、体内挿入の時に塞栓効果を有するものであり、キトサン、アルギン酸塩、キチン、ポリN-イソプロピルアクリルアミド（PNIPam）、ポリエチレングリコール（PEG）、ポリ乳酸（PLLA）、ポリDL-乳酸（PDLLA）、ポリグリコール酸（PGA）、ポリカプロラクトン（PCL）、ポリヒドロキシアルカノエート、ポリジオキサノン（PDS）、ポリトリメチレンカーボネート、 ポリ乳酸・グリコール酸（PLGA）、ポリL-乳酸-co-カプロラクトン（PLCL）、 ポリグリコール酸−co−カプロラクトン（PGCL）、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン（dermatan）硫酸、カルボキシメチルセルロース、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ケラタン硫酸、カルボキシメチルヒドロキシエチルセルロース、セルロース硫酸、セルロースホスフェート、カルボキシメチルグアル、カルボキシメチルヒドロキシプロピルグアル、カルボキシメチルヒドロキシエチルグアル、キサンタンガム、ゲランガム（gellan gum）、ウェランガム（welan gum）、ラムサンガム（rhamsan gum）、アガロース、 ファーセレラン（furcellaran）、ペクチン、アラビアガム、タラカントガム（gum tragacanth）、カラギーナン（carrageenans）、スターチホスフェート、デンプンコハク酸、グリコサミノグリカン、ポリサッカライド、ポリペプチド、アクリルアミド、N-ビニルピロリドン、ジメチルアクリルアミド、アクリル酸、メタクリル酸、無水マレイン酸、ビニルスルホン酸、スチレンカルボン酸2-アクリルアミド-2-メチル-プロパンスルホン酸、ビニルホスホン酸、2-メチルアクリロイルオキシエチルスルホン酸、ゼラチン、及びコラーゲンであり、好ましくは、キトサン、アルギン酸塩、またはキチンであることができるし、より好ましくはキトサンであるが、これに限定されるものではない。
本発明のミクロスフェアは、血管で塞栓効果をよく区別できるようにする造影剤をさらに含むことができるが、上記の造影剤は、MRI（magnetic resonance imaging）造影剤、CT（computed tomography）造影剤、SPECT（single photonemission computed tomography）造影剤、PET（positron emission tomography）、BL（bioluminescence）造影剤、光学造影剤、X-ray造影剤、または超音波造影剤などが使用できるし、好ましくは本発明で用いられたX-ray造影剤であるが、これに限定されるものではない。
また、本発明の実施例では、薬物を搭載しない塞栓用のミクロスフェアと薬物を搭載した塞栓用のミクロスフェアの回復性の評価を行って、本発明の方法を通じて製造されるミクロスフェアが、薬物放出が可能であることを確認した（実施例1.5参照）。
本発明で用いられる「薬物」の種類は、抗がん塞栓術のために注入されることであり、好ましくは癌治療用の薬物である。上記の癌治療用の薬物は、ダウノルビシン、アドリアマイシン、ドキソルビシン、アクラルビシン、エピルビシン、バルルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、マイトマイシンC、ピラルビシン、ルビドマイシン、カルシノマイシン、N-アセチルアドリアマイシン、ルビダゾン、ダウノリリン、ブレオマイシン、シスプラチン、ダクチノマイシン、またはパクリタキセルなどを含むことができる、最も好ましくは、本発明の実施例で使用したドキソルビシンであるが、これに限定されるものではない。
上記から、本発明は、塞栓用のキトサンミクロスフェアが凍結乾燥処理の後にも物理的性質及び薬物放出に影響を受けず、凍結乾燥前の形態に回復できるようにする凍結乾燥方法を提供することができる。
これに加えて、本発明者は前述したように、薬物放出の正確な制御が可能でありながら、生体に適したミクロスフェアを製造する方法を研究するために、薬物をナノ輸送体の中に含有させてキトサンミクロスフェアに結合させた。
その結果、薬物含有ナノ輸送体が結合されたキトサンミクロスフェアを用いれば、薬物含有量をより精密に調整することができるし、キトサンミクロスフェアの塞栓施術効果も著しく増加する効果があることを確認して、本発明を完成した。
したがって、本発明は、キトサンミクロスフェアに乳化架橋法を使用して付着された薬物含有ナノ輸送体を有効成分として含む塞栓施術用の組成物を提供することにその特徴がある。
本発明で用いられる用語「乳化架橋法」とは、二種類以上の溶液を攪拌してエマルジョンを形成するようにする乳化過程と形成されたエマルジョンを化学的に共有結合を形成するようにする架橋過程を経る工程を意味する。
本発明の実施例によれば、本発明が提供する塞栓施術用の組成物は、薬学上の許容可能な溶液の中で膨潤性を有して、膨潤前の直径は100ないし600μmで薬物送達に適していることを確認した。
本発明の実施例では、ナノ輸送体としてリポソームを用いてリポソーム懸濁液を製造した後、抗がん用の薬物であるドキソルビシンを添加してドキソルビシンリポソームを製造した。そして、上記のドキソルビシンリポソームに封入されないドキソルビシンを分離しあて、その蛍光を測定したところ、測定した値で封入されないドキソルビシンの量を判別して、ドキソルビシンがリポソームに投入される正確な量を調べることができる（実施例2.2参照）。
また、ドキソルビシンリポソームを、ミクロスフェアと乳化架橋法を用いて結合させた（実施例2.3参照）。上記でドキソルビシンがリポソームに封入される正確な量を分かったので、ミクロスフェアに封入されるドキソルビシンの量も調べることができる。
本発明の実施例では、上記のように、ナノ輸送体としてリポソームを、癌治療用の薬物としてドキソルビシンを選択したが、これに限定されるものではない。
したがって、本発明は、下記の段階を含むキトサンミクロスフェアを製造する方法を提供する。
a）ナノ輸送体に薬物を導入する段階;
b）上記の薬物が導入されたナノ輸送体をキトサン溶液に入れて混合溶液を作って攪拌させる段階;
c）上記の攪拌させた混合溶液をオイル及び有機溶媒を混合した溶液に入れて、界面活性剤を投入して攪拌する乳化工程;及び
d）上記の乳化された混合溶液に、グルタルアルデヒド飽和トルエンまたはゲニピンを点滴した後、攪拌する架橋段階。
上記のナノ輸送体は、脂質系の素材または高分子素材として、表面に架橋剤を活用して、薬物を結合することができる。したがって、本発明のナノ輸送体は、薬物伝達体として使用されるものであって、リポソーム、脂質ナノ粒子、ナノカプセル、ナノエマルジョン、またはナノ構造体などであって、好ましくは、リポソームまたは脂質ナノ粒子であり、最も好ましくは本発明の実施例で使用されるリポソームであるが、これに限定されるものではない。
本発明で使用されるグルタルアルデヒド飽和トルエンまたはゲニピン（genipin）は架橋のために使用されているもので、これに限定されずに、架橋剤として使用できるものであればどれでも可能である。
本発明で使用される「薬物」の種類は、抗がん塞栓術のために導入されるものであり、好ましくは癌治療用の薬物である。従って、上記の癌治療用の薬物はダウノルビシン、アドリアマイシン、ドキソルビシン、アクラルビシン、エピルビシン、バルルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、マイトマイシンC、ピラルビシン、ルビドマイシン、カルシノマイシン、N-アセチルアドリアマイシン、ルビダゾン、ダウノリリン、ブレオマイシン、シスプラチン、ダクチノマイシン、またはパクリタキセルなどを含むことができる、最も好ましくは、本発明の実施例で使用したドキソルビシンであるが、これに限定されるものではない。
本発明において、上記のオイルはナノ輸送体とキトサンミクロスフェアを乳化させるために使用することができて、望ましくはパラフィンオイル(paraffin oil)、α-ビサボロール(α-bisabolol)、グリチルレチン酸ステアリル (stearyl glycyrrhetinate)、サリチル酸(salicylic acid)、トコフェリル酢酸 (tocopheryl acetate)、パンテノール(panthenol)、ステアリン酸グリセリル(glyceryl stearate)、 オクタン酸セチル(cetyl octanoate)、イソプロピルミリステート(isopropyl myristate)、ペラルゴン酸エチル(ethyl pelargonate)、ジ−Ｃ１２−１３リンゴ酸ジアルキル(di-c12-13 alkyl malate)、オクタン酸セテアリル(cetearyl octanoate)、ジ（カプリル／カプリン酸）ＢＧ (butylene glycol dicaptylate/dicaprate)、イソノニル・イソステアリン酸(isononyl isostearate)、イソステアリル・イソステアリン酸(isostearyl isostearate)、オクタン酸セチル(cetyl octanoate)、ミリスチン酸2-オクチルドデシル(octyldodecyl myristate)、セチルエステル(cetyl esters)、 脂肪酸（Ｃ１０−３０）（コレステロール／ラノステロール）エステル(c10-30 cholesterol/lanosterol ester)、 水素化ヒマシ油 (hydrogenated castor oil)、モノグリセリド(mono-glycerides)、ジグリセリド(diglycerides)、トリグリセリド(triglycerides)、 ビーズワックス(beeswax)、カルナウバ・ワックス(carnauba wax)、 ジステアリン酸スクロース(sucrose distearate)、ＰＥＧ−８ビーズワックス(PEG-8 beeswax)、 キャンデリラワックス(candelilla(euphorbia cerifera)wax)、ミネラルオイル、スクアレン(squalene)、スクアルラン(squalane)、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセライド、中鎖グリセリド、ミグリオール(miglyol)、及びクレモフォール (cremophor)であり、最も望ましくは本発明の実施例で用いられたパラフィンオイルであるが、これに限定されるものではない。
本発明において、上記の有機溶媒はナノ輸送体とミクロスフェアの混合のために用いられる溶媒として、石油エーテル、エチルエーテル、酢酸イソプロピル、n-プロピルアセテート、イソブチルアセテート、n-酢酸ブチル、イソ酪酸イソブチル、2-エチルヘキシルアセテート、エチレングリコールジアセテート、C-9 アセテート、 C-10 アセテート、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、イソアミルメチルケトン、メチルn-アミルケトン、ジブチルケトン、シクロヘキサノン、イソホロン、アセトアルデヒド、n-ブチルアルデヒド、クロトンアルデヒド、2-エチルヘキサアルデヒド、イソブチルアルデヒド、プロピオンアルデヒド、エチル3-エトキシプロピオネート、トルエン、キシレン、トリクロロエタン、プロピレングリコールモノメチルエーテルアセタート、エチレングリコールモノエチルエーテルアセテート、エチレングリコールモノブチルエーテル、ジエチレングリコールモノブチルエーテルアセテート、フタル酸ジブチル、フタル酸2−エチル、フタル酸ジメチル、フタル酸ジオクチル、テレフタル酸ジオクチル、フタル酸ブチルオクチル、フタル酸ブチルベンゼン、ジオクチルアジペート、トリエチレングリコールジ-２‐エチルヘキサノアート、トリオクチルトリメチラート、グリセリルトリアセテート、グリセリル・トリプロピオニン、及び2,2,4-トリメチル-1 3-ペンタンジオールジイソブチレート又はこれらの混合物であって、望ましくは 石油エーテル、エチルエーテルまたは酢酸イソプロピルなどであり、さらに望ましくは本発明の実施例による石油エーテルであるが、これに限定されるものではない。
また、本発明において、上記の界面活性剤は、乳化過程においてキトサンミクロスフェア、ナノ輸送体、オイル及び有機溶媒がよく混じるように添加するものとして、
セスキオレイン酸ソルビタン、ステアリン酸グリセリル、ポリソルベート60、ポリソルベート80、ソルビタントリオレホスフェート、ステアリン酸ソルビタン、イソステアリン酸PEG−20グリセリル、セテス−25、PEG-60 水素化ヒマシ油、ノノキシノール15、PEG-6デシルテトラデセス-20、ジメチコンコポリオール、ジイソステアリン酸グリセリル、セテス−24、セテアリルアルコール、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル、PEG-40 水素化ヒマシ油、セチルジメチルチコンコポリオール、ポリグリセリル-3メチルグルコースジステレート、 PEG-100ステアレート、イソステアリン酸ソルビタン、ラウロイルグルタミン酸ナトリウム、ココアンホジ酢酸2Na、ラウリン酸ジエタノールアミド、ヤシ油脂肪酸ジエタノールアミド、 N,N-ビス(2-ヒドロキシエチル)-コカミド、及びコカミドプロピルベタインなどを用いることができるし、望ましくはセスキオレイン酸ソルビタン、ステアリン酸グリセリルまたはステアリン酸ソルビタンであり、さらに望ましくは本発明の実施例によってセスキオレイン酸ソルビタンであるが、これに限定されるものではない。
また、本発明の実施例では、ドキソルビシン含有キトサンミクロスフェアとドキソルビシンリポソーム含有キトサンミクロスフェアの薬物放出を比較する実験を実施して、ドキソルビシンリポソームを含有するキトサンミクロスフェアを利用すれば、薬物放出を精密に調整することができることを確認した（実施例2.5参照）。
上記から、本発明は、薬物含有ナノ輸送体に乳化架橋法に結合されたキトサンミクロスフェアを有効成分として含む塞栓施術用の組成物を提供することができる。
以下、本発明の理解を助けるために好ましい実施例を提示する。しかし、下記の実施例は、本発明をより理解しやすくするために提供されているものであり、下記の実施例により本発明の内容が限定されるものではない。
実施例１．塞栓用のミクロスフェアの製造
１．１．キトサンミクロスフェアの製造及び凍結
本発明の実施例では塞栓施術用のミクロスフェアの材料としてキトサンを使用しており、キトサンミクロスフェアの製造は本発明者が以前開発した方法を利用した(大韓民国登録特許第10-1058196号)。まずキトサン(約85%がジアセチル化された)を5%(v/v)酢酸水溶液に溶解させて4%(w/v)濃度のキトサン溶液を製造しており、粘性のある上記のキトサン溶液にキトサン比ポリエチレングリコール(PEG、分子量20,000 g/mol)を3対7の重量比率(w:w)で混合されるように入れて、室温でポリエチレングリコールが完全に解けるまで60分程度を攪拌して混ぜた。上記の溶液にドキソルビシンを加えてトリポリりん酸塩を加えて、60分間、ゲル化過程を経た。流動パラフィンと石油エーテルを7:5の体積比率で混合した溶液60mlに乳化剤としてセスキオレイン酸ソルビタン(sorbitan sesquioleate)を6ml加えた溶液と上記のゲル化過程を経たキトサン/ポリエチレン・グリコールの溶液を6mlを加えて、10分間、1000rpmで攪拌させて乳化させた。 そして架橋化(cross-linking)のためにグルタルアルデヒド(glutaraldehyde)飽和トルエン(toluene)8mlをゆっくり適加えた後60分間、1000rpmで攪拌させた。架橋されたキトサンミクロスフェアはその後、残った有機溶媒を除去するために、石油エーテルで3回、アセトンで1回洗浄されて、また水で3回洗浄した。上記の洗浄されたミクロスフェアは多孔性の構造になるように室温で維持される振盪恒温水槽で24時間放置して親水性であるポリエチレングリコールを抽出した。その結果、400μm前後の球形のキトサンミクロスフェアが製造された。
本発明での凍結乾燥は上記の過程を通じて製造されたキトサンミクロスフェアの懸濁液3mlを20mlガラスバイアルに浸して氷点下70℃で凍結させた後、凍結乾燥機(FD 8508、Ilshin Biobase Co.Ltd、Korea)で乾燥して、凍結保護剤は製造されたミクロスフェア懸濁液に凍結乾燥の前に投入された。
１．２．凍結乾燥したミクロスフェアの再水和方法の評価
凍結乾燥処理されたキトサンミクロスフェアを再水和するのに最も適切な条件を選定するため振盪恒温水槽（BS-21、Jeio Tech、Korea）とボルテックス(vortexing)(VM-96B、Jeio Tech、Korea)を利用した方法を時間別に評価した。再水和する際には、塞栓用の粒子を注入する際に最も頻繁に使用される溶液である生理食塩水とX-ray造影剤(Iobrix injection、Taejoon Pharm Co.Ltd.Korea)の体積比率で1:1に混合した溶液を凍結乾燥前の体積と同様に3ml加えた後行った。
１．２．１．振盪恒温水槽を利用した方法の評価結果
12時間、24時間の間、振盪恒温水槽を用いてキトサンミクロスフェアに再水和した後、回復性の評価のために篩を用いて粒子サイズ分布を評価して、顕微鏡を通じて粒子の形態を観察し、平均粒子サイズ及び球形性を測定した。この際に、ランダムに50個のキトサンミクロスフェアを選択して、サイズと球形性を測定し、画像解析ソフトウェア（Scopephoto、Hangzhou、China）を使用した。球状性の粒子の最も長い長さと短い長さの比で求められて、球形に近いほど1に近い数字が表現された。凍結乾燥前のミクロスフェアの平均サイズに比べて凍結乾燥した後、振盪恒温水槽を用いて50 rpmで12時間または24時間の間再水和させた粒子の平均サイズは小さくなって、キトサンミクロスフェアの形態が非常に不規則であった。これは、遅い水の浸透速度のために遅い速度で粒子が回復されたと考えられる。
１．２．２．ボルテックス（vortexing）を利用した方法の評価結果
ボルテックスの処理時間による効果及び凍結保護剤の種類による効果を比較して図1に示した。5分間ボルテックスさせたキトサンミクロスフェアのサイズ分布を図1の（A）に示した。200ないし500の間に均等な結果を取得、凍結乾燥前のキトサンミクロスフェアのサイズである400.5±42.0μmとは大きな差を見せた。図1の（b）は、10分間ボルテックスした結果として、300ないし500の結果を示し、ボルテックスさせた後のキトサンミクロスフェアのサイズが凍結乾燥前の元の粒子のサイズである400.5±42.0μmと同様になったということを確認できる。図1の（C）は、15分間ボルテックスした結果で、15分の時間の間ボルテックスされて、十分に回復された粒子の間に過度な衝突を起こすことにより、粒子のサイズが全体的に均一ではなかった。
ボルテックスの処理時間によるキトサンミクロスフェアの球形性（sphericity）及び平均直径（mean diameter）を比較して図2に示した。凍結乾燥前のミクロスフェアの球形性は1.008±0.015で、10分間ボルテックスさせたキトサンミクロスフェアが最も近い値を有する。
上記の結果を通じて、キトサンミクロスフェアを回復させる方法で10分のボルテックスが最も望ましいことを確認した。
１．３．最適の凍結保護剤及びその濃度、製造方法の選定のための評価
最も効果的な凍結保護剤を選定し、選定された凍結保護剤を加える方法と、最も適切な濃度を選ぶための評価を実施した。
１．３．１．凍結保護剤の種類による回復性の評価結果
最も効果的な凍結保護剤を選定するためにグルコース(glucose)、ラクトース(lactose)、スクロース(sucrose)、トレハロース(trehalose)の4種類の糖をキトサンミクロスフェアの懸濁液に最終的に5%(w/v)の濃度になるように加えた後に凍結乾燥して再水和した後、回復性の評価のために篩を利用し、元の粒子のサイズである400.5±42.0μmの範囲である300ないし500μmに回復された粒子の重量分率を測定して図3に示した。また、顕微鏡を通じてミクロスフェアの形態を観察し、平均ミクロスフェアのサイズや球形性を測定した。 図3で見られるように、300ないし500μm範囲内のグルコースは50%に近い値であり、凍結保護剤を加えなかったキトサンミクロスフェアと統計学的に有意な差がない類似したサイズの回復性を示した。ラクトースは53%、スクロースは65%を見せた。トレハロースを加えた粒子は73%に近い値であり、上記の保護剤に比べて明確に優れた回復性を示した。 したがって、表1で確認できるように、凍結乾燥保護剤でトレハロースを使用する際に、キトサンミクロスフェアが最も優れた回復性を示したので、この後の評価ではトレハロースを使用した。
１．３．２．トレハロースを加える方法による回復性の評価結果
最適な凍結保護剤として選定されたトレハロースを、製造されたキトサンミクロスフェアの懸濁液に加える方法（method1）とキトサンミクロスフェアを製造する過程で加える方法（method2）を比較するために篩を利用して、元の粒子のサイズに回復された粒子の重量分率を測定して図4に示して、顕微鏡を通じて粒子の形態を観察し、平均直径と球形性を測定した。その結果、製造されたキトサン粒子懸濁液にトレハロースを加える方法（method1）を使用した際に300ないし500μmの値を有するキトサンミクロスフェアが60％ないし75％の重量分率を占めており、著しく優れていることが分かった。製造過程の中にトレハロースを加える方法を使用した際には、むしろ粒子の回復機能が減少する傾向が観察された。したがって、下記の評価では、トレハロースを粒子製造の後の懸濁液に加える方法を使用して評価を行った。
１．３．３．トレハロースの濃度による回復性の評価結果
トレハロースの濃度による回復性を評価するために、キトサンミクロスフェアの懸濁液にトレハロースを3、5、10及び15％（w/ v）加えた後、凍結乾燥して再水和した後、ふるいを用いて元の粒子のサイズに回復された粒子の重量分率を測定して、顕微鏡を通じて粒子の形態を観察して、平均粒径と球形性を測定した。元の粒子のサイズに回復された割合を測定した際に、5％以上の濃度では、72％ないし75％にすべて同じような割合を有していることを、図4を通じて確認することができる。しかし、顕微鏡で粒子の形態を観察した際に、10％以上の濃度である場合、5％の場合よりも粒子の表面が非常に滑らかで球形性が良いであることが観察できた。10％と15％の回復能が似ていると測定がされたので、この後の評価では、トレハロース10％の濃度を使用して評価した
１．３．４．薬物の搭載の有無による回復能の評価
薬物を搭載しない塞栓用の粒子を対象とした上記の評価を通じて選定された最適の工程を抗がん剤であるドキソルビシン（doxorubicin）を搭載した粒子にも同様に適用して、同じ回復能を有するのかを評価した。まず、凍結乾燥前の薬物搭載の有無による粒子の物理的性質を比較評価するために顕微鏡を通じて観察した。その結果を図6に示したが、薬物を搭載しない粒子の色は黄色であり、薬物を搭載した粒子の色は、ドキソルビシン固有の色により赤い光を表すことが示されたという点以外の他の物理的性質はすべて同じものと評価された。凍結乾燥後の回復性の評価のために篩を用いて粒子サイズ分布を評価して図5に示した。顕微鏡を通じて粒子の形態を観察し、平均直径と球形性を測定して表2に示した。その結果、薬物搭載してもキトサンミクロスフェアのサイズは、300ないし500μmで、薬物の搭載が凍結乾燥過程及び回復性に影響を与えずに同じ結果を示すことが確認できた。
１．４．再水和したキトサンミクロスフェアの弾力性の評価
変形しやすい弾力性のある粒子がより優れた塞栓効果を示すというのは先行研究の結果に基づいて凍結乾燥前後の粒子の弾力性評価を実施した。キトサンミクロスフェアの弾力性の比較のためにテクスチャーアナライザー（TA plus、Lloyd Instrument Ltd.、UK）を用いて圧縮試験を行った。テクスチャーアナライザープローブ（probe）は、断面が平らで直径5mm、長さ50mmのものを使用し、100Nロードセル（load cell）を使用した。粒子のサイズは、マイクロ単位で非常に小さいため、約150個の粒子を単層に広げておいて、空気中の露出による粒子の乾燥を防ぐために生理食塩水に浸している状態で評価を行った。テクスチャーアナライザープローブ（probe）が粒子と接する直前の状態で評価を開始して1μm/ sの速度で圧縮して、ミクロスフェアの直径が30ないし50％変形するまで実験を行った。先行研究に基づいて測定された全圧縮力を全体の粒子の数で割って個々の粒子に加えられる圧縮力を測定した。
１．４．１．再水和方法によるキトサンミクロスフェアの弾力性の評価
再水和方法による粒子の弾力性評価のために10％濃度のトレハロースを粒子懸濁液に加えて凍結乾燥した後、最適の再水和する方法で選ばれた10分間ボルテックスする工程を経た粒子とボルテックス工程なしに10分間生理食塩水に放置しておいた粒子の圧縮力を測定し比較して弾力性を評価した結果を図7に示したが、微細球の直径が20％変形したときの圧縮力を測定した結果、10分間ボルテックス工程を経た粒子の圧縮力は、2.96±0.40（×10-3N）であって、10分間放置して置いた粒子の圧縮力は、6.17±1.04（×10-3 N）で著しく高いことが測定された。圧縮力が高いほど、粒子が堅いことを意味し、これは粒子の弾力性と反比例する。結果として、再水和工程を経ていない粒子は、塞栓施術時に必要な条件である変形能が低いものと思われた。上記の結果は、ボルテックス工程を経た粒子がはるかに柔らかくて弾力性を回復したことを意味する。変位に伴う圧縮力変化の様相にも再水和工程の有無により、粒子の物性が大きく差があり、したがって、10分間ボルテックス工程が、粒子の回復を促進させることをもう一度確認することができる。
１．４．２．凍結乾燥の前後のキトサンミクロスフェアの弾力性の評価結果
上記の評価の目的は、発明した回復性を最適化工程を経た粒子が凍結乾燥する前の粒子と同様の物性に回復がされることを確認するためのもので、その結果を図8に示した。微細球の直径が20％変形された時の圧縮力を測定した結果、凍結乾燥前の粒子は、2.56±0.30（x10-3 N）で測定されて、凍結乾燥の後に回復させた粒子は、2.96±0.40（x10-3N）に圧縮力が僅かに増加したが統計学的に有意な差はなかった。つまり、弾力性の変化がなく、元の状態に回復されたと判断することができる。また、圧縮実験前後の球形性の変化を測定した結果、統計的に有意な変化がなかったし、これは粒子の弾力性によって、圧縮実験の後、粒子が元の形態を回復したからであると思われる。
１．５．凍結乾燥の前後のキトサンミクロスフェアの薬物放出様相の比較評価
薬物放出様相を評価するための媒質はリゾチーム（lysozyme）140,000ユニットを含むpH6.0のリン酸緩衝生理食塩水（phosphate buffered saline）を使用して、4日間、薬物放出様相を観察した。150mgの粒子を透析袋（MW cut-off=12-14,000）に入れて、媒質30mlの入ったコニカルチューブ（conical tube）に入れて振盪恒温水槽で37±0.5℃に維持して、80rpmで振盪した。 0.5、1、2、4、6時間、そして1、2、4日間隔で放出媒質0.2mlを取って分析し、取った直後に同じ組成の媒質0.2mlを新たに加えた。放出されたドキソルビシンの分析は、マイクロプレートリーダー（microplate reader）（Synergy H1 Hybrid Reader、Bio Tek、Korea）で行われて、励起 （excitation）波長は480nm、発泡（emission）波長は550nmで測定した。その結果を図9に示した。製造直後にとった凍結乾燥前の粒子と凍結乾燥後の回復させた粒子の薬物放出様相が似ていることが確認できて、最終的に4日間、放出された量も同様に測定された。
上記の結果から、凍結乾燥後の回復性の最適化工程を経たミクロスフェアは、ミクロスフェアの性状及び物性だけでなく、薬物放出様相も元に回復をしたということが確認できた。
実施例２．ドキソルビシンリポソーム含有のミクロスフェアの製造
２．１．ドキソルビシンリポソームの製造
メタノールとクロロホルムを1：1の割合で混ぜて混合溶液を作って、上記の混合溶液にリン脂質である大豆ホスファチジルコリン（soybean phosphatidylcholine）を入れて溶解させた。回転減圧蒸発器（rotary vacuum evaporator）を使用して溶媒を蒸発させた後に残った薄い脂質薄膜を250mMの硫酸アンモニウム（ammonium sulfate）溶液に水和させた。生成されたリポソームを押出機（extruder）を使用してサイズを調節した後、20％（w/ v）スクロース（sucrose）溶液に4回透析してリポソーム内外の硫酸アンモニウム濃度勾配（transmembrane ammonium sulfate gradient）を構成した。ドキソルビシン水溶液を上記で作ったリポソーム懸濁液に添加してドキソルビシン濃度が1 mg/ mlになるようした後、37±0.5℃で2時間振盪培養機（shaking incubator）を用いてドキソルビシンをリポソームに封入した。その後封入されていないドキソルビシンは遠心分離して分離した（2,000g、30分）。
２．２．ドキソルビシンリポソームの薬物封入効率（drug loading efficiency）、薬物封入量（drug loading amount）の測定
上記のドキソルビシンリポソームで標本を取って分画分子量（molecular weight cut-off、MWCO）が100Kであるフィルターを搭載した容器に入れて30分間2,000gで遠心分離して、封入されていないドキソルビシンを分離した。分離されたドキソルビシンを480nmの励起波長（excitation wavelength）と550nmの発光波長（emission wavelength）で蛍光を測定し、その量を計算した。その後、測定された値に基づいて薬物封入効率と薬物封入量を計算した。その結果、ドキソルビシン結合キトサンミクロスフェアは、薬物封入効率が56.74％、薬物封入量は2.84％であり、ドキソルビシン含有リポソーム10mgと結合したキトサンミクロスフェアは、薬物封入効率が60.73％、薬物封入量は0.19％であって、ドキソルビシン含有リポソーム30mgと結合したキトサンミクロスフェアは、薬物封入効率が91.09％、薬物封入量は1.09％であり、ドキソルビシン含有リポソーム50mgと結合したキトサンミクロスフェアは、薬物封入効率が93.91％、薬物封入量は1.88％であった。
（数学式１）
薬物封入効率（％）＝（（全体ドキソルビシンの質量−封入されないドキソルビシン）／全体ドキソルビシンの質量）×１００
（数学式２）
薬物封入量（％）＝（（封入されたドキソルビシン質量）／（リポソーム質量＋封入されたドキソルビシン質量））×１００
上記の結果を使用して、ドキソルビシンがリポソーム内に含有される正確な量を求めることができることを確認できた。したがって、ナノ輸送体の中に薬物が含有される正確な量を得ることができることが分かる。
２．３．ドキソルビシン含有キトサンミクロスフェアとドキソルビシンリポソーム含有ミクロスフェアの製造
比較のためのドキソルビシン含有キトサンミクロスフェア（Dox-CSMS）とドキソルビシンリポソーム含有ミクロスフェアを乳化架橋法（emulsification-crosslinking method）で製造した。
ガラスバイアルにキトサンを5％酢酸溶液に4％になるように溶かした後、ドキソルビシンとドキソルビシンリポソームを入れて1時間攪拌した。図10で示したように、ドキソルビシンキトサンミクロスフェアの製造の際にドキソルビシンを6mg、キトサンミクロスフェアは、120mgとして製造し、ドキソルビシンリポソームが10mg含有されたキトサンミクロスフェア（LDox10-CSMS）の製造の際にドキソルビシンリポソームを0.5 mg、キトサンミクロスフェアは、120mgとして製造し、ドキソルビシンリポソームが30mg含有されたキトサンミクロスフェア（LDox30-CSMS）の製造の際にドキソルビシンリポソームを1.5mg、キトサンミクロスフェアは、120mgとして製造し、ドキソルビシンリポソームが50mg含有されたキトサンミクロスフェア（LDox50-CSMS）の製造の際にドキソルビシンリポソームを2.5mg、キトサンミクロスフェアは120mgで製造した。
その後パラフィンオイル(paraffin oil)及び石油エーテル(petroleum ether)をそれぞれ7:5の割合で混ぜた溶液30mlに上記で作ったドキソルビシンキトサン、ドキソルビシンリポソームキトサン溶液をそれぞれ3mlずつ入れ、界面活性剤としてセスキオレイン酸ソルビタン(sorbitan sesquioleate)を、各容器に3mlずつ入れた後、ドキソルビシン含有キトサンミクロスフェアは620rpm、10mgのドキソルビシンが封入されたリポソーム含有キトサンミクロスフェアは750rpm、30mgのドキソルビシンが封入されたリポソーム含有キトサンミクロスフェアは785rpm、50mgのドキソルビシンが封入されたリポソーム含有キトサンミクロスフェアは850rpmにして、20分間攪拌して、乳化(emulsification)させた。この際に攪拌速度の決定は、図11を参照して実施された。 図11のAはドキソルビシン含有キトサンミクロスフェアとドキソルビシンリポソーム含有キトサンミクロスフェアの製造の後、篩を利用して各サイズの範囲に入るキトサンミクロスフェアを分離した結果を示したものである。本発明では肝臓癌治療のための塞栓術に用いられる最適のミクロスフェアのサイズである300ないし500μm範囲に入るミクロスフェアをなるべく多く得られるように攪拌速度を調節した。図11のBは300ないし500μmサイズの範囲に入いるドキソルビシン含有キトサンミクロスフェアを効率的に製造するため、最適化された 攪拌速度を探した結果を示したものである。表示された各ミクロスフェアのサイズの割合は、最適化された攪拌速度で各キトサンミクロスフェアを製造した結果である。代表的にドキソルビシンリポソーム30mgを含有したキトサンミクロスフェアに該当する結果を示した。ドキソルビシンリポソームを含有したキトサン溶液の場合、ドキソルビシンを含有したキトサン溶液より、その粘度が高いため、乳化する過程で攪拌速度をさらに高めて、300ないし500μmサイズの範囲に入るキトサンミクロスフェアをより多く得られた。 図11Bに現れたように攪拌速度を増加させるほど、300ないし500μmサイズの範囲に入るキトサンミクロスフェアの比率が増加したことを確認することができる。
上記の結果を通じて、本発明のミクロスフェアが体内で最適のサイズを持つように製造されるので、血管内で安定的に膨潤されるということを確認することができた。
その後25%グルタルアルデヒド飽和トルエン(glutaraldehyde saturated toluene、GST)4mlを一滴ずつ点滴してくれた後再び1時間の間攪拌して、キトサンミクロスフェアを架橋(crosslinking)させた。
架橋が終わった後、生成されたキトサンミクロスフェアを石油エーテルで3回、アセトンで1回、蒸留水で3回洗浄した。
２．４．ドキソルビシン含有キトサンミクロスフェアとドキソルビシンリポソーム含有キトサンミクロスフェアの薬物封入効率、薬物封入量の測定
上記の過程で架橋化まで終えた後、油状を取って封入されていないドキソルビシンの量を蛍光度を測定して計算した。この値を求めた後、上記の数学式1を利用してキトサンミクロスフェアの薬物封入効率を計算して、下記の数学式3を利用して薬物封入量を計算し、その結果を図10に示した。Dox-CSMSの薬物封入効率性は56.74%、 薬物封入量は2.84%であって、LDox10-CSMSの薬物封入効率性は60.73%、薬物封入量は0.19%で、LDox30-CSMSの薬物封入効率性は91.09%、薬物封入量は1.09%であり、LDox50-CSMSの薬物封入効率性は93.91%、 薬物封入量は1.88%であった。上記の結果を通じ、ドキソルビシンリポソームを含有するキトサンミクロスフェアの薬物封入効率が著しく高いことを確認することができた。
（数学式３）
薬物封入量（％）＝（（封入されたドキソルビシン質量）／（キトサンの質量＋封入されたドキソルビシン質量 ））×１００
２．５．イン・ビトロ（in vitro）放出試験
製造したドキソルビシン含有キトサンミクロスフェアとドキソルビシンリポソーム含有キトサンミクロスフェアをそれぞれ20mgずつ透析ビニールバックに入れてPBS buffer(pH=6.0、lysozyme 50,000units含有)が30mlずつ浸しているコニカルチューブ(conical tube)に上の透析ビニールバックを入れた。各コニカルチューブを振盪培養器に入れて37±0.5℃、80rpmに放出試験条件を設定した後、放出試験を施行して、各30分、1時間、2時間、4時間、6時間、24時間、及び48時間に0.2mlずつ溶液を採取した後、蛍光度を測定して放出されたドキソルビシンの量を測定した。0.2mlの溶液を採取した後には、すぐ同じ条件の溶媒を0.2mlずつコニカルのチューブに入れた。その結果を図12に示した。ドキソルビシンキトサンミクロスフェア(Dox-CSMS)の場合、24時間経過時140μgの放出量、ドキソルビシンリポソームが10mg含まれたキトサンミクロスフェア(LDox10-CSMS)の場合24時間経過時3μg、ドキソルビシンリポソームが30mg含まれたキトサンミクロスフェア(LDox30-CSMS)の場合24時間経過時18μg、ドキソルビシンリポソームが50mg含まれたキトサンミクロスフェア(LDox50-CSMS)の場合24時間経過時44μgの結果を見せた。ドキソルビシンリポソームの添加量によって薬物放出量が調節されることを見ることができて、結果的に、薬物を含有したナノ輸送体の添加量によって薬物放出が調節できることを確認した。
前述した本発明の説明は例示のためのものであり、本発明が属する技術分野の通常の知識を有する者は、本発明の技術的思想や必須の特徴を変更せず、他の具体的な形で容易に変形が可能であることを理解することができるある。したがって、以上で記述した実施例は、すべての面で例示的なものであり限定的ではないことを理解する。
本発明の塞栓、ミクロスフェアの凍結乾燥方法を利用すれば、凍結乾燥後も安定した物性を持つミクロスフェアを製造することができる。上記の方法を使用して作成されたミクロスフェアは、均一な球状であり、500μm以下のサイズを有し、挿入後凍結乾燥前の形で迅速に回復されている特徴があり、塞栓術に有用に使うことができる長所がある。また、本発明に係る薬物含有ナノ輸送体結合されたキトサンミクロスフェアは、薬物放出の正確な調節が可能な特異性を持っているので、これを利用すれば、従来の薬物放出ミクロスフェアと比較して優れた効果を示すので、ターゲット腫瘍のオプションの薬物放出の調節が可能で、塞栓効果が優れているので、抗がん剤治療産業の発展に寄与することができる。

Claims (20)

  1. a）ミクロスフェア懸濁液にトレハロース（trehalose）を添加する段階；
    b）上記の懸濁液を氷点下50℃ないし氷点下100℃で凍結乾燥させて、乾燥ミクロスフェアを製造する段階；及び
    c）上記の乾燥ミクロスフェアを、水または緩衝溶液（buffer）に添加して、ボルテックス（vortexing）させる段階；を含む塞栓用のミクロスフェアの製造方法。
  2. 上記のミクロスフェアの材料は、キトサン、アルギン酸塩、キチン、ポリN-イソプロピルアクリルアミド（PNIPam）、ポリエチレングリコール（PEG）、ポリ乳酸（PLLA）、ポリDL-乳酸（PDLLA）、ポリグリコール酸（PGA）、ポリカプロラクトン（PCL）、ポリヒドロキシアルカノエート、ポリジオキサノン（PDS）、ポリトリメチレンカーボネート、 ポリ乳酸・グリコール酸（PLGA）、ポリL-乳酸-co-カプロラクトン（PLCL）、 ポリグリコール酸−co−カプロラクトン（PGCL）、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン（dermatan）硫酸、カルボキシメチルセルロース、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ケラタン硫酸、カルボキシメチルヒドロキシエチルセルロース、セルロース硫酸、セルロースホスフェート、カルボキシメチルグアル、カルボキシメチルヒドロキシプロピルグアル、カルボキシメチルヒドロキシエチルグアル、キサンタンガム、ゲランガム（gellan gum）、ウェランガム（welan gum）、ラムサンガム（rhamsan gum）、アガロース、 ファーセレラン（furcellaran）、ペクチン、アラビアガム、タラカントガム（gum tragacanth）、カラギーナン（carrageenans）、スターチホスフェート、デンプンコハク酸、グリコサミノグリカン、ポリサッカライド、ポリペプチド、アクリルアミド、N-ビニルピロリドン、ジメチルアクリルアミド、アクリル酸、メタクリル酸、無水マレイン酸、ビニルスルホン酸、スチレンカルボン酸2-アクリルアミド-2-メチル-プロパンスルホン酸、ビニルホスホン酸、2-メチルアクリロイルオキシエチルスルホン酸、ゼラチン、及びコラーゲンよりなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の塞栓用のミクロスフェアの製造方法。
  3. 上記のトレハロースは、ミクロスフェア懸濁液の体積比3％ないし20％に添加することを特徴とする、請求項１に記載の塞栓のミクロスフェアの製造方法。
  4. 上記のc）の段階は、造影剤をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の塞栓用のミクロスフェアの製造方法。
  5. 上記の造影剤は、MRI（magnetic resonance imaging）造影剤、CT（computed tomography）造影剤、SPECT（single photon emission computed tomography）造影剤、PET（positron emission tomography）、BL（bioluminescence）造影剤、光学造影剤、X-ray造影剤、及び超音波造影剤よりなる群から選択されることを特徴とする、請求項４に記載の塞栓用のミクロスフェアの製造方法。
  6. 上記のボルテックスは5分〜20分の間に実行されることを特徴とする、請求項４に記載の塞栓用のミクロスフェアの製造方法。
  7. 上記の方法で製造されるミクロスフェアは、薬物放出が可能であることを特徴とする、請求項１に記載の塞栓用のミクロスフェアの製造方法。
  8. 上記の薬物は、癌治療用の薬物であることを特徴とする、請求項７に記載の塞栓用のミクロスフェアの製造方法。
  9. 上記の癌治療用の薬物は、ドキソルビシンであることを特徴とする、請求項８に記載の塞栓用のミクロスフェアの製造方法。
  10. a）ナノ輸送体に薬物を導入するの段階；
    b）上記の薬物が導入されたナノ輸送体をキトサン溶液に入れて混合溶液を作って攪拌させる段階；
    c）上記の攪拌させた混合溶液を、オイル及び有機溶媒を混合した溶液に入れて、界面活性剤を投入して攪拌する乳化の段階；及び
    d）上記の乳化された混合溶液に、グルタルアルデヒド飽和トルエンまたはゲニピンを点滴した後、攪拌する架橋の段階；を含むキトサンミクロスフェアの製造方法。
  11. 上記のナノ輸送体は、リポソーム、脂質ナノ粒子、ナノカプセル、ナノエマルジョン及びナノ構造体よりなる群から選択されることを特徴とする、請求項１０に記載のキトサンミクロスフェアの製造方法。
  12. 上記のナノ輸送体は、リポソームであることを特徴とする、請求項１１の記載のキトサンミクロスフェアの製造方法。
  13. 上記の薬物は、癌治療用の薬物であることを特徴とする、請求項１０の記載のキトサンミクロスフェアの製造方法。
  14. 上記の癌治療用の薬物は、ドキソルビシンであることを特徴とする、請求項１３の記載のキトサンミクロスフェアの製造方法。
  15. 上記のオイルはパラフィンオイル(paraffin oil)、α-ビサボロール(α-bisabolol)、グリチルレチン酸ステアリル (stearyl glycyrrhetinate)、サリチル酸(salicylic acid)、トコフェリル酢酸 (tocopheryl acetate)、パンテノール(panthenol)、ステアリン酸グリセリル(glyceryl stearate)、 オクタン酸セチル(cetyl octanoate)、イソプロピルミリステート(isopropyl myristate)、 ペラルゴン酸エチル(ethyl pelargonate)、ジ−Ｃ１２−１３リンゴ酸ジアルキル(di-c12-13 alkyl malate)、オクタン酸セテアリル(cetearyl octanoate)、ジ（カプリル／カプリン酸）ＢＧ (butylene glycol dicaptylate/dicaprate)、イソノニル・イソステアリン酸(isononyl isostearate)、イソステアリル・イソステアリン酸(isostearyl isostearate)、オクタン酸セチル(cetyl octanoate)、ミリスチン酸2-オクチルドデシル(octyldodecyl myristate)、セチルエステル(cetyl esters)、 脂肪酸（Ｃ１０−３０）（コレステロール／ラノステロール）エステル(c10-30 cholesterol/lanosterol ester)、 水素化ヒマシ油 (hydrogenated castor oil)、モノグリセリド(mono-glycerides)、ジグリセリド(diglycerides)、トリグリセリド(triglycerides)、 ビーズワックス(beeswax)、カルナウバ・ワックス(carnauba wax)、 ジステアリン酸スクロース(sucrose distearate)、ＰＥＧ−８ビーズワックス(PEG-8 beeswax)、 キャンデリラワックス(candelilla(euphorbia cerifera)wax)、ミネラルオイル、スクアレン(squalene)、スクアルラン(squalane)、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセライド、中鎖グリセリド、ミグリオール(miglyol)、及びクレモフォール (cremophor)よりなる群から一つ以上選択されることを特徴とする、請求項１０に記載のキトサンミクロスフェアの製造方法。
  16. 上記の有機溶媒は石油エーテル、エチルエーテル、酢酸イソプロピル、n-プロピルアセテート、イソブチルアセテート、n-酢酸ブチル、イソ酪酸イソブチル、2-エチルヘキシルアセテート、エチレングリコールジアセテート、C-9 アセテート、 C-10 アセテート、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、イソアミルメチルケトン、メチルn-アミルケトン、ジブチルケトン、シクロヘキサノン、イソホロン、アセトアルデヒド、n-ブチルアルデヒド、クロトンアルデヒド、2-エチルヘキサアルデヒド、イソブチルアルデヒド、プロピオンアルデヒド、エチル3-エトキシプロピオネート、トルエン、キシレン、トリクロロエタン、プロピレングリコールモノメチルエーテルアセタート、エチレングリコールモノエチルエーテルアセテート、エチレングリコールモノブチルエーテル、ジエチレングリコールモノブチルエーテルアセテート、フタル酸ジブチル、フタル酸2−エチル、フタル酸ジメチル、フタル酸ジオクチル、テレフタル酸ジオクチル、フタル酸ブチルオクチル、フタル酸ブチルベンゼン、ジオクチルアジペート、トリエチレングリコールジ-２‐エチルヘキサノアート、トリオクチルトリメチラート、グリセリルトリアセテート、グリセリル・トリプロピオニン、及び2,2,4-トリメチル-1 3-ペンタンジオールジイソブチレートよりなる群から一つ以上選択されることを特徴とする、請求項１０に記載のキトサンミクロスフェアの製造方法。
  17. 上記の界面活性剤は、セスキオレイン酸ソルビタン、ステアリン酸グリセリル、ポリソルベート60、ポリソルベート80、ソルビタントリオレホスフェート、ステアリン酸ソルビタン、イソステアリン酸PEG−20グリセリル、セテス−25、PEG-60 水素化ヒマシ油、ノノキシノール15、PEG-6デシルテトラデセス-20、ジメチコンコポリオール、ジイソステアリン酸グリセリル、セテス−24、セテアリルアルコール、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル、PEG-40 水素化ヒマシ油、セチルジメチルチコンコポリオール、ポリグリセリル-3メチルグルコースジステレート、 PEG-100ステアレート、イソステアリン酸ソルビタン、ラウロイルグルタミン酸ナトリウム、ココアンホジ酢酸2Na、ラウリン酸ジエタノールアミド、ヤシ油脂肪酸ジエタノールアミド、 N,N-ビス(2-ヒドロキシエチル)-コカミド、及びコカミドプロピルベタインより構成される群から1つ以上選択されることを特徴とする、請求項１０に記載のキトサンミクロスフェアの製造方法。
  18. 薬物含有のナノ輸送体に乳化架橋法により付着されたキトサンミクロスフェアを有効成分として含む塞栓施術用の組成物。
  19. 上記の薬物は、癌治療のための薬物であることを特徴とする、請求項１８に記載の塞栓施術用組成物
  20. 上記の癌治療のための薬物は、ドキソルビシンであることを特徴とする、請求項１９に記載の塞栓施術用組成物。
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