KR101440681B1

KR101440681B1 - 색전용 마이크로스피어의 제조방법

Info

Publication number: KR101440681B1
Application number: KR1020120096590A
Authority: KR
Inventors: 이재휘; 곽병국; 이가현
Original assignee: 중앙대학교 산학협력단
Priority date: 2012-08-31
Filing date: 2012-08-31
Publication date: 2014-09-17
Also published as: KR20140031463A

Abstract

본 발명은 동결건조된 색전용 마이크로스피어의 회복성 최적화 공정에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 마이크로스피어의 안정된 보관을 위한 동결건조 처리 전에 동결건조 보호제로 트레할로스(trehalose)를 첨가하고, 동결건조 처리된 마이크로스피어를 와동시켜 재수화하는 회복성 최적화 공정에 관한 것이다. 본 발명에 따른 최적화 공정을 이용하면, 색전용 마이크로스피어의 동결건조 처리 후에도 물리적 성질, 형태, 및 약물 방출정도를 유지할 수 있는 장점이 있다.

Description

색전용 마이크로스피어의 제조방법 {Methods of producing embolic microspheres}

본 발명은 색전용 마이크로스피어의 제조방법에 관한 것으로, 동결 건조 후 색전용 마이크로스피어를 원래 형태로 회복시키기 위한 공정을 포함한다.

색전술(embolization) 또는 색전치료(embolotherapy)는 종양 조직에 산소와 영양분을 전달하는 혈액을 차단하기 위해, 특정 물질을 혈관에 삽입하여 종양을 치료하는 기술이다. 일반적으로 색전용 삽입물은 생체적합(biocompatible), 친수성, 비독성(non-toxicity), 및 생분해성(biodegradability) 조건을 갖추어야 하는데, 주로 키토산, 전분, 젤라틴, 알부민, 소듐알긴산 등과 같은 마이크로스피어(microsphere)가 색전용 물질로 연구되고 있다. 특히, Contour^®(폴리비닐 알코올, Target사, USA), Ivalon^®(Laboratoire Ingenor사, Paris)과 같은 폴리비닐알콜(PVA) 입자가 시장의 80% 이상을 점유하는 주된 색전 마이크로스피어의 재료로서 수년간 사용되어져 왔다. 그러나 상기 폴리비닐알콜 입자들은 불규칙한 모양에 의해 균일한 크기를 얻기 곤란하여 색전술의 효능을 저하시키고 여러 부작용을 불러일으키는 문제점이 있다.

색전 마이크로스피어는 색전술에 사용될 뿐만 아니라, 약물 유전자 등의 전달체로도 연구되고 있으며, 약물을 함유하고 있는 다기능 색전 마이크로스피어는 우수한 항암치료 효능을 가지고 있다. 이러한 마이크로스피어는 체내에 삽입시 액체에 담겨져 사용되지만, 안정한 보관을 위해서는 고체 상태로 유지하는 것이 바람직하며, 이를 위한 방법으로는 동결건조 공정이 가장 선호된다.

약제에 있어서 동결건조란, 수용액이나 수분을 함유한 재료를 동결시키고 감압하여 얼음을 승화시켜 수분을 제거하여 건조물을 얻는 방법으로, 불안정한 생물학적 활성이 있는 시료를 상온에서 장기간 보존할 수 있게 한다.

또한, 색전용 마이크로스피어에 있어서 변형이 쉬운 탄력성이 있는 입자가 더 뛰어난 색전효과를 나타낸다는 것은 익히 알려져 있다(Trisacryl gelatin microspheres for therapeutic embolization, Ⅱ: Preliminary Clinical evaluation in tumors and arteriovenous malformaitions, Beaujeux et al, Am J Neuroradiol, 1996; 17:541-548).

그러나 종래의 마이크로스피어들은 동결건조 후에 입자가 본래대로 회복되기가 힘들었기 때문에, 크기 및 형태가 불규칙하여 색전 효과가 저하되었고, 생물학적 활성이 저하되어 약물방출량이 유지되지 않았다.

따라서 동결건조 처리 후에도 마이크로스피어가 물리적 안정도 및 초기 약물방출을 유지할 수 있도록 하는 동결건조 방법이 요구되고 있는 실정이다.

본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 색전 시술용 마이크로스피어의 동결건조 과정 후에도 입자의 물성과 약물 방출 양상을 그대로 유지할 수 있도록 하는 최적화된 동결건조 방법을 제공하고자 노력한 결과, 트레할로스를 동결건조보호제로 사용하고, 재수화 방법으로 와동(vortex)을 선택함으로써, 마이크로스피어가 동결건조 전과 유사하게 회복될 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

즉, 본 발명의 목적은 동결건조 후 색전용 마이크로스피어가 회복성을 가질 수 있도록 하는 최적화된 동결건조 방법 및 재수화 방법을 제공하는 것에 있다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 a) 마이크로스피어 현탁액에 트레할로스(trehalose)를 첨가하여 주는 단계; b) 상기 현탁액을 영하 50℃ 내지 영하 100℃에서 동결건조 시켜 건조 마이크로스피어를 제조하는 단계; 및 c) 상기 건조 마이크로스피어를 물 또는 완충 용액(buffer)에 첨가하고, 와동(vortexing)시키는 단계를 포함하는 색전용 마이크로스피어의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 일구현예로, 상기 마이크로스피어의 재료는 키토산, 알지네이트, 키틴, 폴리 N-이소프로필아크릴아미드(PNIPam), 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리L-락트산(PLLA), 폴리D,L-락트산(PDLLA), 폴리글리콜산(PGA), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리하이드록시알카노에이트, 폴리다이옥산온(PDS), 폴리트라이메틸린카보네이트, 폴리락트산-co-글리콜산(PLGA), 폴리L-락트산-co-카프로락톤(PLCL), 폴리글리콜산-co-카프로락톤(PGCL), 히알루론산, 콘드로이틴 설페이트, 더마탄(dermatan) 설페이트, 카르복시메틸셀룰로오스, 헤파란 설페이트, 헤파린, 케라탄 설페이트, 카르복시메틸하이드록시에틸셀룰로오스, 셀룰로오스 설페이트, 셀룰로오스 포스페이트, 카르복시메틸구아르, 카르복시메틸하이드록시프로필구아르, 카르복시메틸하이드록시에틸구아르, 잔탄검, 겔란검(gellan gum), 웰란검(welan gum), 람산검(rhamsangum), 아가로스, 푸르셀라란(furcellaran), 펙틴, 아라비아 고무, 트라가칸트 고무(gum tragacanth), 카라기난(carrageenans), 스타치 포스페이트, 스타치 숙시네이트, 글리코아미노글리칸, 폴리사카라이드, 폴리펩타이드, 아크릴아미드, N-비닐피롤리돈, 디메틸아크릴아미드, 아크릴산, 메타크릴산, 무수말레인산, 비닐설폰산, 스티렌카르복실산 2-아크릴아미도-2-메틸-프로판설폰산, 비닐포스폰산, 2-메틸아크릴로일옥시에틸설폰산, 젤라틴, 및 콜라겐으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 트레할로스는 마이크로스피어 현탁액의 부피대비 6% 내지 20%로 가해주는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또다른 구현예로, 상기 c)단계는 조영제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또다른 구현예로, 상기 조영제는 MRI(magnetic resonance imaging) 조영제, CT(computed tomography) 조영제, SPECT(single photon emission computed tomography) 조영제, PET(positron emission tomography), BL(bioluminescence) 조영제, 광학 조영제, X-ray 조영제, 및 초음파 조영제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또다른 구현예로, 상기 와동은 5분 내지 20분 동안 수행되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또다른 구현예로, 상기 방법을 통해 제조되는 마이크로스피어는 약물 방출이 가능한 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또다른 구현예로, 상기 약물은 암치료용 약물인 것을 특징으로 한다.

본발명의 또다른 구현예로, 상기 암치료용 약물은 독소루비신인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 색전 마이크로스피어의 동결건조 방법을 이용하면, 동결건조 후에도 안정적인 물성을 가지는 마이크로스피어를 제조할 수 있다. 상기 방법을 통해 만들어진 마이크로스피어는, 균일한 구형이고, 500μm 이하의 크기를 가지며, 삽입 후 동결건조 전의 형태로 빠르게 복구되는 특징이 있어, 색전술에 유용하게 사용할 수 있는 장점이 있다.

또한, 본 발명의 방법을 통해 처리된 색전 마이크로스피어는, 독소루비신이나 시스플라틴 등과 같은 항암 약물의 방출이 가능한 전달체로서 유용하게 활용 가능한 효과가 있다.

이에 더하여, 기존에 발명된 제품들이 색전 시술 직전에 마이크로스피어에 약물 탑재를 위하여 1시간 내지 2시간의 공정을 거쳐야 하는 것(예: DC Beads^®, Biocompatibles사, UK)과는 다르게, 본 발명의 색전 마이크로스피어는 약물이 처음부터 탑재되어 있는 상태로 제조 되므로, 별도의 약물 탑재 시간이 필요하지 않다는 장점이 있다.

궁극적으로, 본 발명의 색전 마이크로스피어는 안정한 보관을 위한 동결건조 후에도 원래의 물성으로 빠르게 회복되며, 색전 입자의 암세포 혈관 폐색으로 인한 항암효과 및 항암 약물의 방출로 인해 효과적인 항암작용을 나타내는 장점이 있다.

도 1은 4가지 종류의 동결보호제에 따른 효과 및 와동(vortexing) 처리 시간에 따른 효과를 비교하기 위해 입자의 크기 분포를 나타낸 도면이다.
도 2는 와동(vortexing) 처리 시간에 따른 키토산 입자의 평균 직경과 구형성의 관계를 나타내는 도면이다.
도 3은 4가지 종류의 동결보호제에 따른 효과를 비교하기 위해 원래의 입자 크기로 회복한 입자의 중량 분율을 측정한 결과를 보여주는 도면이다.
도 4는 트레할로스(trehalose)를 공정 중에 가하여 주는 방법 및 그 농도에 따른 효과를 비교하기 위해 원래의 입자 크기로 회복한 입자의 중량 분율을 측정한 결과를 보여주는 도면이다.
도 5는 약물의 탑재가 동결건조 한 후 회복시킨 입자의 크기 분포에 미치는 영향을 평가한 도면이다.
도 6은 동결건조 전후와 약물 탑재 유무에 따른 키토산 입자의 형태를 100배율로 확대하여 보여주는 도면이다.
도 7은 입자의 회복을 위한 와동과정 유무에 따른 입자의 탄력성 비교를 위하여 물성분석기를 이용하여 압축시험을 한 결과를 나타내는 도면이다.
도 8은 동결건조 전후 입자의 탄력성 비교를 위하여 물성분석기를 이용하여 압축시험을 한 결과를 나타내는 도면이다.
도 9는 동결건조 전후 키토산 입자로부터 독소루비신이 방출되는 양상을 측정한 결과를 나타내는 도면이다.

본 발명은 색전 시술용 마이크로스피어의 안정된 보관을 위해 동결건조 처리 후에도, 동결건조 전의 신속하게 형태로 복구될 수 있도록 하는 최적화된 동결건조 방법 및 재수화 방법에 관한 것이다.

본 발명자들은 동결건조 처리한 후에도 원래 형태를 유지하여 색전술에 용이하게 사용될 수 있고, 약물 방출에 영향을 받지 않는 최적의 동결건조 조건을 확립하기 위해, 키토산 마이크로스피어에 최적의 동결건조 보호제, 동결건조 조건, 및 재수화 방법을 연구하였다.

그 결과, 트레할로스를 동결건조 처리 전에 보호제로 첨가하고 와동(vortex)시키면, 동결건조처리 전의 키토산 마이크로스피어와 유사한 크기 및 일정한 구형의 형태로 회복된다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명은,

a) 마이크로스피어 현탁액에 트레할로스(trehalose)를 첨가하여 주는 단계;

b) 상기 현탁액을 영하 50℃ 내지 영하 100℃에서 동결건조 시켜 건조 마이크로스피어를 제조하는 단계; 및

c) 상기 건조 마이크로스피어를 물 또는 완충 용액(buffer)에 첨가하고, 와동(vortexing)시키는 단계;를 포함하는 색전용 마이크로스피어의 제조 방법을 제공하는 것에 그 특징이 있다.

본 발명에서의 용어 “와동(vortex)”이란, 어떤 중심을 주위로 유체를 회전운동시키는 것을 의미하며, 본 발명의 일실시예에서는 와동기(VM-96B, Jeio Tech, Korea)를 사용하여 와동시켰으나 상기 기기에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서의 용어 “구형성(spherical)”이란, 어느 입자의 구형에 가까운 정도를 말하는 것으로 입자 상의 최장 길이와 최단 길이의 비로 구해진다. 즉, 구형에 가까울수록 1에 가깝게 표현된다. 또한, 본 발명에서의 “실질적으로 구형”이라는 것은 일반적으로, 최소 외부 표면적을 나타내는 부피로서 정의되는, 즉, 완전한 구에 가까운 형태를 의미한다. 구체적으로, 본 발명에서 “실질적으로 구형”은 마이크로스피어의 임의의 단면을 보았을 때, 큰 직경과 작은 직경 간의 차이가 20% 미만, 10% 미만, 또는 5% 미만임을 의미한다

색전용 마이크로스피어의 최적화된 동결 건조 및 회복조건을 수립하기 위하여, 본 발명의 실시예에서는 먼저 키토산 마이크로스피어를 제조하고, 동결건조 시켰는데, 상기 동결건조 온도는 영하 50℃ 내지 100℃에서 수행될 수 있으나, 바람직하게는 60℃ 내지 80℃일 수 있고, 가장 바람직하게는 70℃에서 수행될 수 있다. 본 발명에서는 동결건조기(FD 8508, Ilshin Biobase Co. Ltd, Dongduchun, Korea)를 사용하여 동결건조 시켰으나, 상기 기기에 한정되는 것은 아니다.

동결건조 후 마이크로스피어의 재수화 방법을 선정하기 위해, 먼저 생리식염수와 조영제를 첨가하고, 진탕항온수조를 이용한 재수화 방법과 와동을 이용한 재수화 방법을 비교하여 와동을 이용하는 재수화방법이 더 바람직함을 발견하였다(실시예 3 참조). 상기 와동은 바람직하게는 5분 내지 20분 동안 수행될 수 있으나, 더욱 바람직하게는 8분 내지 12분일 수 있고, 가장 바람직하게는 10분일 수 있다.

또한, 동결보호제를 선정하기 위해, 글루코오스(glucose), 락토오스(lactose), 수크로오스(sucrose), 및 트레할로스(trehalose)의 비교를 실시하였다. 그 결과, 트레할로스를 마이크로스피어 현탁액의 제조 후 가해주고, 동결건조를 수행하는 방법이 가장 바람직함을 발견하였다(실시예 4 참조). 상기 트레할로스는 마이크로스피어 현탁액의 6% 내지 20% 첨가됨이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 10%로 첨가될 수 있다.

상기 마이크로스피어의 재료는 생체 적합성이고, 체내 삽입시 색전효과를 가지는 것으로, 키토산, 알지네이트, 키틴, 폴리 N-이소프로필아크릴아미드(PNIPam), 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리L-락트산 (PLLA), 폴리D,L-락트산(PDLLA), 폴리글리콜산(PGA), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리하이드록시알카노에이트, 폴리다이옥산온(PDS), 폴리트라이메틸린카보네이트, 폴리락트산-co-글리콜산(PLGA), 폴리L-락트산-co-카프로락톤(PLCL), 폴리글리콜산-co-카프로락톤(PGCL), 히알루론산, 콘드로이틴 설페이트, 더마탄(dermatan) 설페이트, 카르복시메틸셀룰로오스, 헤파란 설페이트, 헤파린, 케라탄 설페이트, 카르복시메틸하이드록시에틸셀룰로오스, 셀룰로오스 설페이트, 셀룰로오스 포스페이트, 카르복시메틸구아르, 카르복시메틸하이드록시프로필구아르, 카르복시메틸하이드록시에틸구아르, 잔탄검, 겔란검(gellan gum), 웰란검(welan gum), 람산검(rhamsangum), 아가로스, 푸르셀라란(furcellaran), 펙틴, 아라비아 고무, 트라가칸트 고무(gum tragacanth), 카라기난(carrageenans), 스타치 포스페이트, 스타치 숙시네이트, 글리코아미노글리칸, 폴리사카라이드, 폴리펩타이드, 아크릴아미드, N-비닐피롤리돈, 디메틸아크릴아미드, 아크릴산, 메타크릴산, 무수말레인산, 비닐설폰산, 스티렌카르복실산 2-아크릴아미도-2-메틸-프로판설폰산, 비닐포스폰산, 2-메틸아크릴로일옥시에틸설폰산, 젤라틴, 또는 콜라겐 등일수 있고, 바람직하게는 키토산, 알지네이트, 또는 키틴일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 키토산일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 마이크로스피어는, 혈관에서의 색전효과를 잘 구별할 수 있도록 하는 조영제를 추가로 포함할 수 있는데, 상기 조영제는 MRI(magnetic resonance imaging) 조영제, CT(computed tomography) 조영제, SPECT(single photon emission computed tomography) 조영제, PET(positron emission tomography), BL(bioluminescence) 조영제, 광학 조영제, X-ray 조영제, 또는 초음파 조영제 등이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 본 발명에서 사용된 X-ray 조영제 일수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 실시예에서는 약물을 탑재하지 않은 색전 마이크로스피어와 약물을 탑재한 색전 마이크로스피어의 회복성 평가를 수행하여, 본 발명의 방법을 통해 제조되는 마이크로스피어가 약물 방출이 가능함을 확인하였다(실시예 6 참조).

본 발명에서 사용되는 “약물”의 종류는 항암 색전술을 위해 주입되는 것으로, 바람직하게는 암치료용 약물일 수 있다. 상기 암치료용 약물은 다우노루비신, 아드리아마이신, 독소루비신, 아클라루비신, 에피루비신, 발루비신, 아이다루비신, 미톡산트론, 미토마이신 C, 피라루비신, 루비도마이신, 카르시노마이신, N-아세틸아드리아마이신, 루비다존, 다우노릴린, 블레오마이신, 시스플라틴, 닥티노마이신, 또는 파클리탁셀 등을 포함할 수 있으며, 가장 바람직하게는 본 발명의 실시예에서 사용한 독소루비신 일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

상기로부터, 본 발명은 색전용 키토산 마이크로스피어가 동결건조 처리 후에도 물리적 성질 및 약물방출에 영향을 받지 않고, 동결건조 전의 형태로 복구될 수 있도록 하는 동결건조 방법을 제공할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 키토산 마이크로스피어의 제조 및 동결건조

본 발명의 실시예에서는 색전 시술용 마이크로스피어의 재료로 키토산을 사용하였으며, 키토산 마이크로스피어의 제조는 본 발명자들이 이전에 개발한 방법을 이용하였다(대한민국 등록특허 제 10-1058196호). 먼저 키토산(약 85%가 디아세틸화됨)을 5% (v/v) 아세트산 수용액에 용해시켜 4% (w/v) 농도의 키토산 용액을 제조하였으며, 점성이 있는 상기 키토산 용액에 키토산 대비 폴리에틸렌글리콜(PEG, 분자량 20,000 g/mol)을 3대 7의 중량비율(w:w)로 혼합되도록 넣어주고, 실온에서 폴리에틸렌글리콜이 완전히 녹을 때까지 60분 정도를 교반하여 섞어주었다. 상기 용액에 독소루비신을 가하여 주고 트리폴리포스페이트를 가하여 60분 동안 겔화 과정을 거쳤다. 유동파라핀과 석유에테르를 7:5의 부피비율로 혼합하여준 용액 60ml에 유화제로 소르비탄 세스퀴올레이트(sorbitan sesquioleate)를 6ml 가하여 준 용액과 상기 겔화 과정을 거친 키토산/폴리에틸렌글리콜 용액을 6ml를 가하여 10분 동안 1000rpm 으로 교반시켜 유화 시켜주었다. 그리고 가교화(cross-linking)를 위하여 글루타르알데히드(glutaraldehyde) 포화 톨루엔(toluene) 8ml를 천천히 적가하여 준 후 60분 동안 1000rpm 으로 교반시켜 주었다. 가교된 키토산 마이크로스피어는 그 후 남은 유기용매들을 제거하기 위해 석유에테르로 3회, 아세톤으로 1회 세척되었고, 다시 물로 3회 세척하였다. 상기 세척된 마이크로스피어는 다공성 구조가 되도록 실온으로 유지되는 진탕항온수조에서 24시간 동안 방치하여 친수성인 폴리에틸렌글리콜을 추출하였다. 그 결과 400㎛ 내외의 구형인 키토산 마이크로스피어가 제조되었다.

본 발명에서의 동결 건조는 상기 과정을 통해 제조된 키토산 마이크로스피어 현탁액 3ml를 20ml 유리 바이알에 담아 영하 70℃에서 동결시킨 후 동결건조기(FD 8508, Ilshin Biobase Co.Ltd, Korea)에서 건조하였으며, 동결보호제는 제조된 마이크로스피어 현탁액에 동결 건조 전에 투입되었다.

실시예 2. 동결건조한 마이크로스피어의 재수화 방법 평가

동결건조 처리된 키토산 마이크로스피어를 재수화 하는데 가장 적절한 조건을 선정하기 위하여 진탕항온수조(BS-21, Jeio Tech, Korea)와 와동(vortexing) (VM-96B, Jeio Tech, Korea)을 이용한 방법을 시간별로 평가하였다. 재수화할 때는 색전용 입자를 주입할 때 가장 빈번하게 사용되는 용액인 생리식염수와 X-ray 조영제(Iobrix injection, Taejoon Pharm Co. Ltd. Korea) 부피비율로 1:1로 혼합한 용액을 동결건조 전의 부피와 동일하게 3ml 가하여 준 후 수행하였다.

2-1) 진탕항온수조를 이용한 방법 평가 결과

12시간, 24시간 동안 진탕항온수조를 이용하여 키토산 마이크로스피어를 재수화 한 후 회복성 평가를 위하여 체를 이용해 입자크기 분포를 평가하였고, 현미경을 통해 입자의 형태를 관찰하고 평균 입자 크기 및 구형성을 측정하였다. 이 때 무작위로 50개의 키토산 마이크로스피어를 선택해 크기와 구형성을 측정하였으며, 이미지 분석 소프트웨어(Scopephoto, Hangzhou, China)를 사용하였다. 구형성은 입자의 가장 긴 길이와 짧은 길이의 비로 구하여졌고, 구형일수록 1에 가까운 수로 표현이 되었다. 동결건조 전 마이크로스피어의 평균 크기에 비해 동결건조 후 진탕항온수조를 이용하여 50 rpm으로 12시간 또는 24시간 동안 재수화 시킨 입자의 평균크기는 작아졌으며 키토산 마이크로스피어의 형태가 매우 불규칙하였다. 이는 느린 물 침투 속도로 인해 느린 속도로 입자가 회복 된 것으로 생각된다.

2-2) 와동(vortexing)을 이용한 방법 평가 결과

와동 처리 시간에 따른 효과 및 동결보호제의 종류에 따른 효과를 비교하여 도 1에 나타내었다. 5분 동안 와동시킨 키토산 마이크로스피어의 크기 분포를 도 1의 (A)에 나타내었는데, 200 내지 500 사이에 고르게 결과가 가져, 동결건조 전의 키토산 마이크로스피어의 크기인 400.5±42.0μm와 큰 차이를 보였다. 도 1의 (b)는 10분 동안 와동한 결과로써, 300 내지 500의 결과를 보여, 와동시킨 후의 키토산 마이크로스피어의 크기가 동결건조 전 원래의 입자 크기인 400.5±42.0μm와 유사해졌다는 것을 확인할 수 있다. 도 1의 (C)는 15분 동안 와동한 결과로, 15분의 시간동안 와동되면서 충분히 회복된 입자 간 과도한 충돌을 일으킴으로 인해 입자의 크기가 전체적으로 균일하지 못하게 나타났다.

와동 처리 시간에 따른 키토산 마이크로스피어의 구형성(sphericity) 및 평균 직경(mean diameter)을 비교하여 도 2에 나타내었다. 동결건조 전 마이크로스피어의 구형성은 1.008±0.015로, 10분 간 와동시킨 키토산 마이크로스피어가 가장 가까운 값을 가졌다.

상기 결과를 통해, 키토산 마이크로스피어를 회복시키는 방법으로 10분의 와동이 가장 바람직하다는 것을 확인하였다.

실시예 3. 최적의 동결보호제 및 그 농도, 제조 방법 선정을 위한 평가

가장 효과적인 동결보호제를 선정하고, 선정된 동결보호제를 가하여 주는 방법과 가장 적절한 농도를 선정하기 위한 평가를 실시하였다.

3-1) 동결보호제의 종류에 따른 회복성 평가 결과

가장 효과적인 동결보호제를 선정하기 위하여 글루코오스(glucose), 락토오스(lactose), 수크로오스(sucrose), 트레할로스(trehalose) 4가지 종류의 당을 키토산 마이크로스피어 현탁액에 최종적으로 5% (w/v)의 농도가 되도록 가한 후에 동결건조 하여 재수화 한 후 회복성 평가를 위하여 체를 이용해 원래의 입자 크기인400.5±42.0μm의 범위인 300 내지 500μm로 회복된 입자의 중량분율을 측정하여 도 3에 나타었다, 또한 현미경을 통해 마이크로스피어의 형태를 관찰하고 평균 마이크로스피어의 크기 및 구형성을 측정하였다. 도 3에서 볼 수 있는 것처럼, 300 내지 500μm 범위 내의 글루코오스는 50%에 가까운 값으로, 동결보호제를 가하지 않은 키토산 마이크로스피어와 통계학적으로 유의한 차이가 없는 유사한 크기 회복성을 나타내었고, 락토오스는 53%, 수크로오스는 65%를 보였다. 트레할로스를 가한 입자는 73%에 가까운 값으로, 상기 보호제들에 비하여 확연히 뛰어난 회복성을 나타내었다. 따라서 표 1에서 확인할 수 있는 것처럼, 동결건조 보호제로 트레할로스를 사용할 때 키토산 마이크로스피어가 가장 뛰어난 회복성을 나타내었으므로 이후의 평가에서는 트레할로스를 사용하였다.

	5분간 와동		10분간 와동		15분간 와동
	평균 직경 (㎛)	구형성	평균 직경 (㎛)	구형성	평균 직경 (㎛)	구형성
동결건조 전	400.5±42.0	1.008±0.015	400.5±42.0	1.008±0.015	400.5±42.0	1.008±0.015
no cyoprotectant	352.0±40.3	1.056±0.033	381.9±23.4	1.058±0.047	362.6±27.3	1.061±0.041
5% Glucose	359.8±44.0	1.058±0.04	382.2±27.3	1.051±0.039	362.4±28.1	1.058±0.044
5% Lactose	388.2±44.0	1.042±0.031	390.7±28.4	1.037±0.032	384.4±29.4	1.084±0.035
5% Sucrose	370.8±34.9	1.056±0.055	381.8±27.8	1.042±0.044	382.8±35.6	1.043±0.025
5% Trehalose	370.5±46.0	1.050±0.041	399.8±25.6	1.025±0.026	382.0±27.5	1.029±0.023

3-2) 트레할로스를 가하는 방법에 따른 회복성 평가 결과

최적의 동결보호제로 선정된 트레할로스를 제조된 키토산 마이크로스피어 현탁액에 가하여 주는 방법(method 1)과 키토산 마이크로스피어를 제조하는 과정 중에 가하여 주는 방법(method 2)을 비교하기 위하여 체를 이용해 원래의 입자 크기로 회복된 입자의 중량 분율을 측정하여 도 4에 나타내고, 현미경을 통해 입자의 형태를 관찰하고 평균 입자 크기 및 구형성을 측정하였다. 그 결과 제조된 키토산 입자 현탁액에 트레할로스를 가하여 주는 방법(method 1)을 사용하였을 때 300 내지 500μm의 값을 가지는 키토산 마이크로스피어가 60% 내지 75%의 중량분율을 차지하여 현저하게 뛰어남을 알 수 있었고, 제조과정 중에 트레할로스를 가하여 주는 방법을 사용하였을 때는 오히려 입자의 회복능이 감소하는 경향이 관찰되었다. 따라서 하기 평가에서는 트레할로스를 입자 제조후 현탁액에 가하여주는 방법을 사용하여 평가를 진행하였다.

3-3) 트레할로스의 농도에 따른 회복성 평가 결과

트레할로스의 농도에 따른 회복성을 평가하기 위하여 키토산 마이크로스피어 현탁액에 트레할로스를 3, 5, 10 그리고 15% (w/v) 가한 후 동결건조 하여 재수화 한 후 체를 이용해 원래의 입자 크기로 회복된 입자의 중량분율을 측정하였고, 현미경을 통해 입자의 형태를 관찰하고 평균 입자 크기 및 구형성을 측정하였다. 원래 입자 크기로 회복된 분율을 측정하였을 때 5% 이상의 농도에서는 72% 내지 75%로 모두 유사한 분율을 가지고 있음을 도 4를 통해 확인할 수 있다. 하지만 현미경으로 입자의 형태를 관찰하였을 때 10% 이상의 농도일 때가 5% 일 때 보다 입자의 표면이 훨씬 매끄럽고 구형성이 좋은 것을 관찰 할 수 있었다. 10%와 15%의 회복능이 유사한 것으로 측정이 되었으므로 이후의 평가에서는 트레할로스 10% 농도를 사용하여 평가하였다.

3-4) 약물의 탑재 유무에 따른 회복능 평가

약물을 탑재하지 않은 색전용 입자를 대상으로 한 상기의 평가들을 통해 선정된 최적의 공정을 항암제인 독소루비신(doxorubicin)을 탑재한 입자에도 동일하게 적용하여 같은 회복능을 가지는지 평가하였다. 먼저 동결건조 전 약물 탑재 유무에 따른 입자의 물리적 성질을 비교 평가하기 위하여 현미경을 통해 관찰하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었는데, 약물을 탑재하지 않은 입자의 색상은 노란색이었고, 약물을 탑재한 입자의 색상은 독소루비신 고유의 색상으로 인한 붉은빛을 띄는 것으로 나타난 점 외의 다른 물리적 성질은 모두 동일한 것으로 평가되었다. 동결건조 후 회복성 평가를 위하여 체를 이용해 입자크기 분포를 평가하여 도 5에 나타내었고, 현미경을 통해 입자의 형태를 관찰하고 평균 입자 크기 및 구형성을 측정하여 표 2에 나타내었다. 그 결과 약물 탑재하더라도 키토산 마이크로스피어의 크기는 300 내지 500μm로, 약물 탑재가 동결건조 과정 및 회복성에 영향을 미치지 않고 동일한 결과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

	키토산 마이크로스피어		독소루비신 포함 키토산마이크로스피어
	평균직경(㎛)	구형성	평균직경(㎛)	구형성
동결건조 전	400.5±42.0	1.008±0.015	400.8±46.6	1.012±0.010
동결건조 후	401.5±35.1	1.028±0.019	391.7±16.9	1.037±0.022

실시예 4. 재수화 한 키토산 마이크로스피어의 탄력성 평가

변형이 쉬운 탄력성 있는 입자가 더 뛰어난 색전효과를 나타낸다는 선행연구의 결과에 따라 동결건조 전후의 입자의 탄력성 평가를 실시하였다. 키토산 마이크로스피어의 탄력성 비교를 위하여 물광분석기(TA plus, Lloyd Instrument Ltd., UK) 를 이용하여 압축시험을 수행하였다. 물광분석기 프로브(probe)는 단면이 평평하고 지름 5mm, 길이 50mm인 것을 사용하였고, 100N 로드셀(load cell)을 사용하였다. 입자의 크기가 마이크로 단위로 매우 작기 때문에 약 150개의 입자를 단층으로 펼쳐놓고 공기 중 노출에 의한 입자의 건조를 막기 위해 생리식염수에 담겨있는 상태로 평가를 진행하였다. 물광분석기 프로브(probe)가 입자와 맞닿기 직전인 상태에서 평가를 시작하여 1 ㎛/s의 속도로 압축하여 마이크로스피어의 직경이 30-50% 변형될 때 까지 실험을 진행하였다. 선행연구에 따라 측정된 전체 압축력을 전체 입자의 개수로 나누어 개개의 입자에 가하여지는 압축력을 측정하였다.

4-1) 재수화 방법에 따른 키토산 마이크로스피어의 탄력성 평가

재수화 방법에 따른 입자의 탄력성 평가를 위하여 10% 농도의 트레할로스를 입자 현탁액에 가하여 동결건조 후 최적의 재수화 방법으로 선정된 10분간 와동하는 공정을 거친 입자와 와동 공정 없이 10분간 생리식염수에 방치해둔 입자의 압축력을 측정하여 비교해 탄력성을 평가하였다. 그 결과를 도 7 에 나타내었는데, 미세구의 직경이 20% 변형되었을 때의 압축력을 측정한 결과 10분간 와동 공정을 거친 입자의 압축력은 2.96 ± 0.40 (×10^-3 N)이었고, 10분간 방치해 둔 입자의 압축력은 6.17 ± 1.04 (×10^-3 N)로 현저히 높은 것으로 측정되었다. 압축력이 높을수록 입자가 단단하다는 것을 의미하며, 이는 입자의 탄력성과 반비례한다. 결과적으로, 재수화 공정을 거치지 않은 입자는 색전시술시 필요한 조건인 변형능이 낮은 것으로 사료되었다. 상기 결과는 와동 공정을 거친 입자가 훨씬 부드럽고 탄력성을 회복했다는 것을 의미한다. 변위에 따른 압축력 변화 양상에 있어서도 재수화 공정 유무에 따라 입자의 물성이 확연한 차이가 있었으며, 따라서 10분간 와동 공정이 입자의 회복을 촉진시킨다는 것을 한번 더 확인 할 수 있었다.

4-2) 동결건조 전후의 키토산 마이크로스피어 탄력성 비교 평가 결과

상기 평가의 목적은 발명한 회복성 최적화 공정을 거친 입자가 동결건조 하기전의 입자와 유사한 물성으로 회복이 된다는 것을 확인하기 위한 것으로, 그 결과를 도 8에 나타내었는데, 미세구의 직경이 20% 변형되었을 때의 압축력을 측정한 결과, 동결건조 전 입자는 2.56 ± 0.30 (x10^-3 N)으로 측정되었고, 동결건조 후 회복시킨 입자는 2.96 ± 0.40 (x10^-3 N)으로 압축력이 근소하게 증가하였으나 통계학적으로 유의한 차이가 없었다. 즉, 탄력성의 변화가 없이 원래의 상태로 회복 된 것으로 판단 할 수 있다. 또한, 압축 실험 전후의 구형성 변화를 측정한 결과, 통계적으로 유의한 변화가 없었으며, 이는 입자의 탄력성으로 인해 압축실험 이후 입자가 원래의 형태를 회복하였기 때문으로 사료된다.

실시예 5. 동결건조 전후 키토산 마이크로스피어의 약물 방출 양상 비교 평가

약물 방출 양상을 평가하기 위한 매질은 라이소자임(lysozyme) 140,000 유닛을 포함한 pH 6.0인 인산완충식염수(phosphate buffered saline)를 사용하였고, 4일 동안 약물 방출 양상을 관찰하였다. 150mg의 입자를 투석 주머니 (MW cut-off = 12-14,000)에 넣고 매질 30ml가 담겨있는 코니칼 튜브(conical tube)에 담아 진탕항온수조에서 37±0.5℃로 유지하고 80rpm으로 진탕하여주었다. 0.5, 1, 2, 4, 6 시간 그리고 1, 2, 4일 간격으로 방출 매질 0.2ml를 취하여 분석하였으며, 취한 직후에 똑같은 조성의 매질 0.2ml를 새로 가하여 주었다. 방출된 독소루비신의 분석은 마이크로 플레이트 리더(microplate reader)(Synergy H1 Hybrid Reader, Bio Tek, Korea)로 이루어졌으며, 여기(excitation) 파장은 480nm, 발포(emission) 파장은 550nm로 측정하였다. 그 결과를 도 9에 나타내었는데, 제조 직후에 취한 동결건조 전의 입자와 동결건조 후 회복시킨 입자의 약물 방출 양상이 유사함을 확인할 수 있었으며, 최종적으로 4일 동안 방출된 양도 유사하게 측정이 되었다.

상기 결과를 통해 동결건조 후 회복성 최적화 공정을 거친 마이크로스피어는 마이크로스피어의 성상 및 물성 뿐 만이 아니라 약물 방출 양상도 원래대로 회복을 하였다는 것을 확인할 수 있었다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야 한다.

Claims

a) 키토산 마이크로스피어 현탁액에 트레할로스(trehalose)를 첨가하여 주는 단계;
b) 상기 현탁액을 영하 50℃ 내지 영하 100℃에서 동결건조 시켜 건조 키토산 마이크로스피어를 제조하는 단계; 및
c) 상기 건조 키토산 마이크로스피어를 물 또는 완충 용액(buffer)에 첨가하고, 와동(vortexing)시키는 단계;
를 포함하는 색전용 마이크로스피어의 제조 방법.
삭제
제 1항에 있어서,
상기 트레할로스는 마이크로스피어 현탁액의 부피대비 6%(w/v) 내지 20%(w/v)로 첨가해주는 것을 특징으로 하는, 색전용 마이크로스피어의 제조방법.
제 1항에 있어서,
상기 c)단계는 조영제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 색전용 마이크로스피어의 제조방법.
제 4항에 있어서,
상기 조영제는 MRI(magnetic resonance imaging) 조영제, CT(computed tomography) 조영제, SPECT(single photon emission computed tomography) 조영제, PET(positron emission tomography), BL(bioluminescence) 조영제, 광학 조영제, X-ray 조영제, 및 초음파 조영제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 색전용 마이크로스피어의 제조방법.
제 1항에 있어서,
상기 와동은 5분 내지 20분 동안 수행되는 것을 특징으로 하는, 색전용 마이크로스피어의 제조방법.
제 1항에 있어서,
상기 방법을 통해 제조되는 마이크로스피어는 약물 방출이 가능한 것을 특징으로 하는, 색전용 마이크로스피어의 제조 방법.
제 7항에 있어서,
상기 약물은 암치료용 약물인 것을 특징으로 하는, 색전용 마이크로스피어의 제조 방법.
제 8항에 있어서,
상기 암치료용 약물은 독소루비신인 것을 특징으로 하는, 색전용 마이크로스피어의 제조 방법.