KR100478227B1 - 키틴 및/또는 키토산으로 구성되는 혈관 색전 물질의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 카테타를 혈관 내에 삽입하고 색전 물질을 카테타를 통하여 주입하여 대상 혈관을 색전할 때 사용하는 혈관 색전 물질 및 그 제조 방법에 관한 것으로서, 평균 입경 50∼1000㎛의 키틴 및/또는 키토산 입자 또는 평균 입경 50∼1000㎛의 실질적으로 구형체인 키토산 비드로 구성되는 색전 물질이고, 키토산 비드의 제조 방법은 캐필러리 주위의 불활성 기류 하에 키토산 용액을 가압하 캐필러리를 통과시켜 미소 액적화 하는 단계 및 상기한 미소 액적을 응고액 중에 침적시켜 비드화하는 단계로 구성되며, 본 발명의 색전 물질은 생체 친화성이 높은 실질적으로 구형체인 혈관 색전 물질로서 생체와의 이물 반응이 적고 완벽한 색전술을 구현할 수 있으며 모세 혈관을 통과하지 않고, 혈관 조영제나 항암제 등의 약물을 흡착 고정화시킬 수가 있으며, 혈관 내에서 분해성 또는 비분해성으로 만들 수가 있고, 규정된 범위 내에서 비교적 균일한 크기로 제조 가능하며, 발암성이 없고, 혈관 내에서 어느 정도 염증성이다.

Description

키틴 및/또는 키토산으로 구성되는 혈관 색전 물질의 제조방법{PREPARING METHOD FOR EMBOLIC MATERIALS COMPRISING OF CHITIN AND/OR CHITOSAN}

본 발명은 키틴 및/또는 키토산으로 구성되는 혈관 색전 물질의 제조방법에 관한 것이며, 더욱 상세하게는, 인체에 무해하고 면역 활성이 있으며 혈관 내에서 서서히 가수분해될 수 있음과 아울러, 조영제나 항암제 등의 고정화가 가능한 키틴 및/또는 키토산으로 구성되는 기능성 혈관 색전 물질의 제조방법에 관한 것이다.

색전술 또는 전색술이란, 일반적으로, 임상학적으로 기관이나 조직 내의 혈관 폐쇄나 맥관절제(devascularization)가 필요한 경우 카테타(catheter)를 해당 혈관 내에 삽입하고 색전 물질을 카테타를 통하여 주입하여 대상 혈관을 막는 것을 이른다. 색전 물질은 원하는 부위의 혈관을 효과적으로 폐색시켜야 하며, 카테타를 통해서 쉽게 주입할 수 있어야 하고, 모세 혈관을 통과하는 일이 없어야 한다.

최근, 폴리비닐알코올(PVA)(상품명 Contour, Target 사, USA)이 입자 색전 물질로서 세계 시장의 80% 이상을 점유하고 있다. 그러나, PVA는 인체 내에서 흡수되지 않는 영구 색전 물질이지만 혈관 재개통이 일어나고, 불규칙한 모양이어서 균일한 크기를 얻기 곤란하며, 카테타의 막힘 현상과 가격이 비싸다는 단점이 있다. 이러한 혈관 재개통은 병변의 재발을 일으킬 수 있고, PVA와 같이 색전 물질의 크기가 균일하지 못하면 원하는 혈관의 색전이 어렵고 병변 혈관을 통과하여 먼 장기 혈관(주로 폐동맥)을 색전시켜 환자가 사망할 수 있다. 실제로, PVA를 색전 물질로 사용하여 색전술을 시행한 후 환자가 사망한 임상례가 보고되어 있다. 따라서 균일한 형태를 가지는 구형이며, 색전 효과가 뚜렷하면서도 가격이 싼 구형 및 타원형 또는 입자성 색전 물질의 개발이 당업계에 요청되고 있다.

식품 산업에서 배출되는 게 또는 새우 들과 같은 갑각류의 껍질은 다량의 천연 다당질을 함유하고 있다. 이러한 다당질은 연간 1,000억 톤이 만들어져 지구상 생물에 의하여 다시 분해되는 천연 고분자 재료로서 알려져 있다. 이러한 갑각류의 외피로부터 추출되는 키틴 및 키토산은 생체 친화성이 높고, 항원성이 거의 없는 물질로서 체내의 효소에 의하여 쉽게 분해되며, 또한 쉽게 구할 수 있는 천연 재료로서 생산 비용이 적게 들고, 암 유발 등과 생체 독성이 없어 색전 물질의 조건을 필요충분적으로 갖춘 물질로서, 최근 의료용 재료로서의 이용에 많은 관심이 집중되고 있다.

키틴은 갑각류의 외피, 균류의 세포막 구성 물질로서 존재하는 함질소 다당류로서 뮤코 다당이다. 생체 내에서는 당단백질 형태로 존재하며, 알칼리 처리에 의해 단백질을 제거하고 얻어지는 물질이 키틴이며, 물, 유기 용매, 알칼리 용액에는 녹지 않고, 산을 이용하여 가수분해하면 단당이나 올리고당이 만들어진다. 키틴은 β-(1→4)결합으로 축중합한 폴리-N-아세틸-D-글루코사민이다.

한편, 키토산은 β-폴리-N-아세틸-D-글루코사민을 진한 알칼리 용액과 가열, 또는 알칼리 용융하여 아세틸을 이탈시킨 생성물인 β-폴리-D-글루코사민이며, 무색의 비결정질 분말로써 물에 용해되지 않는 물질이다.

우리 나라는 양질의 키틴 및 키토산 자원이 풍부하며, 폐기물로써 버려지는 물질을 자원으로 활용한다는 것은 환경 보호에 일조하는 것임과 아울러, 새로운 고기능성 및 고부가 가치성 물질의 새로운 용도를 개발한다는 차원에서 매우 중요한 의미를 지니고 있다. 지금까지의 다양한 연구 결과를 살펴보면, 키토산은 항균성, 암전이 억제, 항 AIDS활성, 항 혈액응고활성, 혈중 콜레스테롤 저하, 화상 치료 효능 등이 있는 것으로 보고되어 있다. 오징어 뼛속에 있는 키틴질도 과거에는 상처를 입었을 때 그 분말을 지혈제 내지 치료제로서 사용해 왔을 정도로 생체 친화력이 대단히 높다. 그러나, 현재는 일본, 러시아 등지에서 화상 치료제와 생체 흡수성 봉합사로서 임상적으로 사용되고 있는 정도이며, 향후 그 적용 가능성의 폭은 더욱 확장될 것으로 기대된다.

근래 널리 사용되고 있는 전형적인 색전 물질의 예로서는, 젤폼, PVA (polyvinyl alcohol), 코일, 분리형 풍선, 무수 에탄올, NBCA(N-butyl 2-cyano acrylate) 등을 들 수 있다. 색전 물질의 선택은 질환의 종류에 따라 원하는 혈관 의 폐색 기간, 색전 물질의 성상, 예컨대, 액상 또는 고체상 입자, 동반 가능성 있는 합병증의 유형, 색전술 시술상의 용이성 등, 다양한 매개 변수들을 고려하여야 할 필요가 있다. 그러나, 이러한 이상적인 조건을 모두 만족시킬 수 있는 색전 물질은 현재까지 보고되어 있는바 없다. 현재로서는, 폴리비닐알코올(PVA)이 임상적으로 가장 널리 적용되고 있는 것으로 보고되어 있는바, 임상적 적용예에 있어서는, PVA 괴상체(塊狀體)를 분쇄하여 입자의 크기를 일정하게 한 것을 사용하고 있다. 가장 널리 사용되고 있는 상품화된 PVA의 전형적인 예로서는, 세계 시장의 80% 이상을 점유하고 있는 Contour^R(폴리비닐 알코올, Target사, USA)와 Ivalon^R (Laboratoire Ingenor사, Paris)을 들 수 있다. 이러한 종류의 색전 물질은 생체 내에서 흡수되지 않는 영구 입자 색전 물질로서, 불규칙한 모양을 하고 있으므로 구형체에 비하여 상대적으로 정확한 평균 입자 크기 분포를 얻기 어렵고, 따라서 원하는 혈관에 색전을 달성하기가 더욱 곤란한 문제점이 있다. 크기의 불균일성으로 인하여 야기될 수 있는 문제점은, 색전 물질이 먼 장기(주로 폐동맥)로 이동하여 색전을 유발함으로써 결과적으로서 환자가 사망하게 된 임상례가 보고되어 있다. 고체상의 입자상 색전 물질로서 생체 내에 흡수 가능한 것으로서는 자가 혈전, 젤폼 등을 들 수 있고, 생체 내에 흡수되지 않는 영구적인 색전 물질로서는 폴리비닐알코올(PVA), 실리콘 구(球), 유리등을 들 수 있다. 그러나, 이러한 고체상 입자 색전 물질들은 카테타 용액 내에서의 응집, 카테타의 폐색, 크기의 불균일성 등과 같은 여러 문제점을 지니고 있다.

따라서, 본 발명의 첫 번째 목적은, 혈관 내에서 완전하고도 효과적인 색전 효과를 얻을 수 있는 상대적으로 균일한 입자 크기를 갖는 타원형 또는 구형의 색전 물질을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 두 번째 목적은, 생체 친화성이 높으며 암을 유발할 가능성이 없는 재료를 사용함으로써 부작용이 없는 높은 생체 적합성을 지닌 색전 물질을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 세 번째 목적은, 카테타를 통하여 원활하게 주입할 수 있도록 식염수 중에서 응집되지 않고 개별 입자로써 부유 가능한 색전 물질을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 네 번째 목적은, 캐리어로써의 이송 용액 중에서 카테타를 통하여 용이하게 이송 가능한 색전 물질을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 다섯 번째 목적은, 색전 대상 혈관을 효율적으로 폐색시킬 수가 있는 색전 물질을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 여섯 번째 목적은, 모세 혈관을 통과하지 않는 색전 물질을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 일곱 번째 목적은, 혈관 내에서 어느 정도 염증을 유발함으로써 혈관 색전을 용이하게 수행할 수가 있는 혈관 색전 물질을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 여덟 번째 목적은, 색전 시술 후 일정 기간이 경과된 후에는 색전 물질의 분해 흡수가 가능하거나 또는 가능치 않은 혈관 색전 물질을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 아홉 번째 목적은, 조영제 및/또는 항암제 등의 고정화가 가능한 기능성 색전 물질을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 열 번째 목적은, 상기한 첫 번째 내지 아홉 번째 목적에 따른 본 발명의 색전 물질의 제조방법을 제공하기 위한 것이다.

상기한 본 발명의 첫 번째 내지 아홉 번째 목적을 달성하기 위한 본 발명의 바람직한 일 양태(樣態)에 따르면, 키토산으로 구성되는 실질적으로 구형체인 혈관 색전 물질이 제공된다.

본 발명의 두 번째 내지 아홉 번째 목적을 달성하기 위한 다른 바람직한 양태에 따르면, 키틴 및/또는 키토산 입자로 구성되는 혈관 색전 물질이 제공된다.

본 발명의 또 다른 바람직한 일 양태에 따르면, 키토산 및/또는 키틴으로 구성되는 실질적인 구형체에 조영제 및/또는 항암제가 고정화된 기능성 혈관 색전 물질이 제공된다.

본 발명의 상기한 열 번째 목적에 따른 바람직한 일 양태에 따르면, 젖산, 초산, 또는 염산 중의 키토산 용액을 캐필러리를 통하여 공기를 불어 넣으면서 가압하 통과시킴으로써 소정 사이즈의 키토산 미소 액적을 응고액 중에 포함시킴으로써 키토산이 일정한 평균 크기로 응고된 키토산 비드(beads)를 형성시키는 것으로 구성되는 키토산 비드의 제조 방법이 제공된다.

이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다.

본 발명에 따른 키토산 및/또는 키틴으로 구성되는 혈관 색전 물질은 자연으로부터 유래하는 천연 고분자 물질로써 인체에 무해하고 면역 활성이 있으며 혈관 내에서 지연적인 가수분해성이다.

본 발명에 사용되는 키틴 및 키토산 입자에 관하여 언급하면, 키틴의 수평균 분자량은 제한적인 것은 아니나 약 2만-40만 정도, 바람직하게는 약 2만-5만의 범위이다. 또한, 본 발명에 있어서 제한적인 것은 아니나, 키토산의 탈아세틸화도 60% 이상, 바람직하게는 60% 이상 84% 이하인 것이 바람직하게 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 키토산 비드의 제조시 수평균 분자량이 약 2만 미만인 경우에는 비드 형성이 원활치 않게 될 염려가 있다. 키토산 비드 형성시의 키토산의 점도는 2-100cps의 범위, 바람직하게는5-86cps 범위, 가장 바람직하게는 5∼20cps 범위이며, 키토산 농도는 0.5%-10.0%(w/v) 범위， 바람직하게는 1.5-5.5%(w/v) 범위, 가장 바람직하게는 4.0-5.5%(w/v) 범위이다. 상기한 본 발명의 범위를 현저히 벗어나는 경우에는 부유성이 열등하거나 구형체의 비드가 만들어지지 않을 우려가 있다.

본 발명에 따른 키토산 및/또는 키틴으로 구성되는 혈관 색전 물질은, 구체적으로는, 규정된 범위 내에서 비교적 균일한 평균 직경을 갖는 키토산 및/또는 키틴 입자, 바람직하게는 규정된 범위 내에서 비교적 균일한 평균 직경을 갖는 구형체의 키토산 비드로서, 식염수 또는 조영제나 항암제가 포함된 식염수 용액 중에서 일정 시간 이상 부유 가능하며, 부유 입자들이 상호 응집하지 않고, 카테타의 통과가 용이하며, 원하는 색전 대상 혈관의 폐색이 용이하고, 모세 혈관을 통과하지 않는 특성이 있다.

상기한 본 발명에 따른 키토산 및/또는 키틴으로 구성되는 혈관 색전 물질은 키토산 및/또는 키틴의 연마 후 시빙을 통하여 일정한 크기 범위를 갖는 키토산 및/또는 키틴 입자로 형성될 수 있으며, 바람직하게는 키토산을 적당한 용매 중에 용해시키는 것에 의하여 규정된 범위 내에서 비교적 균일한 직경을 갖는 구형체의 비드로서 형성될 수 있다.

본 발명에 따른 혈관 색전 물질 및 그 제조 방법에 관하여 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명에 사용되는 키틴 및/또는 키토산으로 이루어지는 입자의 평균 직경은 제한적인 것은 아니나, 50∼1000㎛의 범위, 150∼500㎛의 범위, 또는 150∼250㎛의 범위, 또는 250∼355㎛의 범위, 또는 355∼500㎛의 범위이다. 이러한 키틴 및/또는 키토산 입자는 연마 후 시빙에 의해 일정한 범위의 평균 입자 크기를 갖도록 선별될 수 있으며, 이는 당업자라면 구체적인 설명이 없더라도 용이하게 실시할 수 있는 것이므로 이에 대한 부연 설명은 생략하기로 한다.

또한, 본 발명에 있어 바람직하게 사용될 수 있는 키토산 비드를 제조함에 있어서의 키토산의 점도와 농도는 구형의 색전 물질을 형성시킴에 있어 중요한 인자이며, 그 범위는 전술한 바와 같다. 본 발명에 따른 비드 형태의 색전 물질은 수산화나트륨 용액과 같은 응고제를 제거하기 위하여 증류수로 수회 수세하는 것이 바람직하다. 또한, 본 발명에 따른 색전 물질은 -20℃∼-80℃의 온도 범위, 또는 액체 질소 중에서 동결 건조시키는 것에 의하여 보관 안정성 및 사용 편리성을 제고시킬 수도 있다.

도 1A 및 도 1B는, 각각, 본 발명에 따른 혈관 색전 물질의 제조방법을 설명하는 전반적 개략도 및 요부 개략도로서, 본 발명에 따른 혈관 색전 물질을 제조 하기 위한 장치는, 예컨대, 용액 저장조(미도시), 키토산 용액 이송 라인(3), 공기 이송 라인(6), 상기한 라인(3)으로부터 다중 분기된 미세 니들형 캐필러리(5), 응고조(8) 등으로 구성될 수 있다. 본 발명에 따른 색전용 키토산 비드(1)는 일정 범위의 탈아세틸화도 및 점도를 갖는 키토산을 1∼10%(w/v)의 농도로 젖산, 초산, 또는 염산 용액 중에서 용해하여 여과시킨 용액(10)을 펌프(2)에 의하여 라인(3)과 이로부터 다중 분기되는 내경 50∼1000㎛의 미세 니들형 캐필러리(5)를 통하여 강제 이송시킨다. 이 때, 공기 이송 라인(6)을 통하여 공기(11)(또는 질소나 아르곤과 같은 불활성 기체)를 강제 송풍시킴으로써 상기한 캐필러리(5)로 밀려나오는 용액을 액적화함과 동시에 비드의 사이즈 조절을 할 수 있다. 공기의 주입량이 커지면 비드의 사이즈는 상대적으로 작아지며 역으로 공기의 주입량이 작아지면 비드의 크기는 상대적으로 커지게 된다. 도면 중 미설명 부호 4는 캐필러리 지지체이다. 상기한 캐필러리(5)를 통과한 본 발명에 따른 색전용 키토산 비드(1)는 이어서 응고조(8) 내로 적하된다. 상기한 응고조(8) 내의 응고 용액의 선택에 있어서는 키토산의 응고 속도가 높고 이들을 보다 완전한 구형으로 구체화(球體化)할 수 있는 단독의 용액, 또는 혼합 용매를 선택할 필요가 있다. 그 바람직한 예로서는, 물, 에탄올 및, 수산화나트륨 또는 수산화칼륨의 혼합 용매가 바람직하게 사용될 수 있으나, 본 발명은 이에 한정되는 것은 아니며, 이들 적절한 용매를 단독 또는 임의의 조합으로 사용할 수도 있다. 수산화 나트륨, 에탄올 및 물의 혼합 용매를 사용하는 경우, 그 혼합비는 1:0∼18:4∼24의 범위일 수 있다. 상기한 키토산 용액(10)은 응고조(8) 내에서 응고되어 본 발명에 따른 색전용 비드를 형성하게 된다. 본 발명에 따른 비드의 평균 직경은 제한적인 것은 아니나, 50∼1000㎛의 범위, 150∼500㎛의 범위, 또는 150∼250㎛의 범위, 또는 250∼355㎛의 범위, 또는 355∼500㎛의 범위일 수 있다.

본 발명에 따른 키토산 비드는 식염수, 식염수와 조영제 및/또는 항암제와의 혼합액 중에서의 부유성이 우수하여야 할 필요가 있으며, 우수한 부유성은 카테타에서의 양호한 통과성을 보장할 수 있게 된다. 본 발명에 따른 키토산 비드 색전 물질은 비드 직경 50-350㎛인 경우에는 생리 식염수 용액 중에서 30분 이상의 부유능, 350-500㎛ 또는 그 이상의 사이즈에서는 5분 이상 부유능을 보유하는 것이 바람직하다. 또한, 본 발명에 따른 키토산 비드 제조시의 키토산 용액의 바람직한 점도 범위는 5-86cps이며, 키토산의 농도는 각각의 점도에 따라 다르기는 하지만, 일반적으로 1.5-5.5% 범위가 바람직하다. 또한, 색전 물질은 생리 식염수 용액 또는 다른 물질과의 그 혼합 용매 중에서의 응집성이 낮은 것이 바람직하며, 본 발명에 따른 색전 물질은 생리 식염수 용액 및 그 조영제와의 혼합 용액 중에서 응집성을 나타내지 않는다.

한편, 본 발명에 따른 키틴 및/또는 키토산 입자는 원칙상 비정형성이나 캐리어로써의 이송 용액중에서 카테타를 잘 통과하며 응집성이 없으며, 그 이유는 입자의 내부로 수분 침투가 용이하지 않고 아미노기가 외부로 나와 있지 않아서 정전기적 부하가 작기 때문인 것으로 믿어진다.

또한, 목적하는 바에 따라, 혈관 내에서 비(非)가수분해성 또는 난(難)가수분해성으로 만들기 위하여, 예컨대, 헥사메틸렌 디이소시아네이트, 글루타알데하이드(Glutaaldehyde), 에피클로로히드린(Epichlorohydrine), 또는 그 혼합물 등과 같은 가교제를 이용하여 가교시킬 수 있으며, 가장 바람직한 것은 헥사메틸렌 디이소시아네이트이다.

가교제로서 헥사메틸렌 디이소시아네이트를 사용하는 경우, 가교제의 양은 키틴 및/또는 키토산의 10중량% 범위 이내로 사용할 수 있다. 보다 구체적으로는, 예컨대, 키토산 및/또는 키틴 색전 물질의 일정량을 에탄올로 치환한 후, 다시 디메틸 포름아미드(DMF)로 수회 치환한 다음, DMF의 존재 하에서 헥사메틸렌 디이소시아네이트(HDMC)를 첨가하여 간헐적으로 교반하면서 2∼48 시간 정도 침적시킨 다음, 키토산 및/또는 키틴 색전 물질을 에탄올과 물의 혼합 용매로 충분히 세정하여 살균하고, 필요하다면 동결 건조하고 시빙(sieving)하여 사이즈 별로 세분화시킬 수도 있다.

가교제로서 글루타알데하이드를 사용하는 경우에는, 키토산 비드를 초산 용액 중에 첨가한 후 글루타알데하이드를 첨가하여 24시간 정도 실온에서 교반하고, NaBH₄를 pH가 중성으로 될 때까지 첨가하여 시프베이스를 환원시키는 것에 의하여 가교시킬 수 있다.

가교제로서 에피클로로히드린을 사용하는 경우에는, 키토산 비드를 수산화나트륨 용액 중에 첨가한 후 에피클로로히드린를 첨가하여 24시간 정도 실온에서 교반하는 것에 의해 가교시킬 수가 있다.

또한, 본 발명에 따른 키토산 및/또는 키틴 색전 물질은 다양한 종류의 혈관 조영제나 항암제를 흡착시킨 기능성 색전 물질로 제조하는 것도 가능하다. 예컨대, 키토산 및/또는 키틴을 일부 양이온화시킨 다음, 에탄올로 치환하고 여기에 소정량의 조영제나 항암제를 첨가한 다음, 진공 또는 감압하 에탄올을 제거하는 것에 의하여 본 발명에 따른 색전 물질에 조영제를 흡착 고정화시킴으로써 방사선 조사시 색전 물질의 방사선 사진을 얻거나 또는 항암제를 흡착 고정시키는 것이 가능하다. 당해 기술 분야에 통상의 지식을 가진 자라면, 상기한 예로부터 다양한 변화 및 수정을 가하는 것이 가능함은 물론이며, 이 또한 본 발명의 영역 내임을 이해하여야만 할 것이다.

이하, 본 발명을 실시예 및 시험예와 비교예를 통하여 더욱 구체적으로 설명하기로 하나, 이들 실시예 등은 본 발명을 예증하기 위한 것일 뿐, 본 발명을 제한하고자 하는 것이 아님을 이해하여야만 할 것이다.

(실시예)

실시예 1:

키틴과 키토산을 플래이크 상태로 구입하고 잔존하는 단백질을 수산화나트륨용액 중에서 5시간 끓여서 제거하고 수세한 후, 2% 에틸렌디아민테트라아세트산 나트륨(Sodium ethylene diamine tetraacetate, EDTA-4Na)을 이용하여 잔존할 수도 있는 중금속을 5시간 동안 제거한 후, 중성으로 수세하고 건조하여 분쇄기(후드믹서 FM-681, 한일전기주식회사, 한국)로 간헐적으로 분쇄한 후 마이크로 시브(청계상공사, 한국)로 체거름하여 사이즈가 균일한 입자를 얻었다. 이 입자를 고압 증기 멸균하였다.

150∼250㎛의 평균 직경을 갖는 키토산 입자 및 키틴 입자를 얻었다.

얻어진 키토산 입자 및 키틴 입자에 대한 현미경 확대 사진을 도 3A 및 도 3B에 각각 나타낸다.

비교예 2 :

색전 물질로서 종래 가장 널리 사용되고 있는 폴리비닐알코올(PVA)(상품명 Contour, Target 사, USA)(평균 입경 150∼250㎛)을 상업적으로 구입하였으며, 이에 대한 현미경 사진을 도 2A에 나타낸다.

도 2A로부터 확인되는 바와 같이 PVA는 불규칙한 모양을 하고 있음을 확인할 수 있다.

실시예 2∼18:

도 1A 및 도 1B에 도시한 바와 같은 키토산 비드 제조 기구를 이용하여, 키토산 수평균 분자량 20,000 이상, 탈아세틸화도 60% 이상, 키토산 농도 1.5%-5.5%(w/v) 범위， 초산 농도 ４％, 키토산 점도 범위 5-86cps 범위의 다양한 키토산 용액을 이용하였으며, 응고제로서는 수산화나트륨/에탄올/물=4/20/76 (w/v/v)의 혼합 용매를 사용하여 키토산 비드 또는 키토산 응집체를 제조하였으며, 이들 각각을 실시예 2∼18로 하였다.

얻어진 실시예 2∼18의 키토산 응집체에 대한 젖은 상태에서의 형상, 건조 후의 환원 형상, 10% 초산용액 중에서 중에서의 용해성, 부유성, 카테타 통과성, 사이즈 등에 대해 조사하였으며 그 결과를 하기의 표 1에 나타낸다.

형상에 대한 표시 X는 비드를 형성하지 못한 경우를, O는 비드를 형성한 경우를 나타내며, 부유성은 생리 식염수 용액(2.5ml)과 조영제(2.5ml, 상품명 Hexabrix, 소디움 이옥사글레이트 함유, 320mg I/ml, 태준제약, 한국)를 1;1의 비율로 혼합하여 5㎖ 시린즈 내에서의 부유 시간을 조사하여 판정하였으며 평균 직경 50-350㎛의 크기 경우는 부유 시간 30분 이상인 경우에 O를 평균 직경 350㎛ 이상인 경우에는 부유 시간 5분 이상인 경우에 O를 부여하였다. 또한, 카테타 통과성은 카테타 내에서의 응집으로 인한 막힘 현상을 초래하는 일없이 통과되는가의 여부로 판정하였다.

실시예 13의 키토산 비드 현미경 확대 사진 및 나안 사진을 도 4A 및 도 4B에 각각 나타낸다.

	초산중키토산농도(w/v)	점도(cps)	젖은상태에서의 형상	건조후 환원 형상	용해성	부유성	카테타통과성	사이즈(㎛)
실시예 2	1.5%	86	X	-	X	O	O	50-1000
실시예 3	1.8%	86	O	X	X	O	O	50-1000
실시예 4	2%	86	O	X	X	O	O	50-1000
실시예 5	2.5%	86	O	X	X	O	O	50-1000
실시예 6	3%	10	X	-	X	O	O	50-1000
실시예 7	3.3%	9.4	O	O	X	O	500㎛이하통과	150이하/150-212/212-250
실시예 8	3.5%	9.4	O	O	X	O	500㎛이하통과	150이하/150-212/212-250/250-355
실시예 9	3.7%	9.4	O	O	X	O	500㎛이하통과	150이하/150-212/212-250
실시예 10	4%	5.8	X	-	X	O	O	50-1000
실시예 11	4%	9.8	O	X	X	O	O	50-1000
실시예 12	4%	6.4	X	-	X	O	O	50-1000
실시예 13	4.5%	10.2	O	O	X	O	500㎛ 이하통과	50-1000
실시예 14	4.5%	9.8	O	O	X	O	500㎛ 이하통과	50-1000
실시예 15	4.5%	6.4	X	O	X	O	-	250-355/355-500
실시예 16	5%	10.2	O	O	X	O	500㎛ 이하통과	250-355/355-500
실시예 17	5%	9.8	O	O	X	O	500㎛ 이하 통과	50-150/150-250/250-355/355-500/500-710
실시예 18	5.5%	10.2	X	-	-	-	-	-

실시예 19∼25 및 비교예 2:

점도 9.8cps인 키토산으로 키토산 농도 4%(w/v) 및 초산 농도 4%(v/v) 용액을 이용하여, 응고제로서 하기의 표 2에 나타낸 바와 같은 조성을 사용한 것을 제외하고는, 실시예 2 내지 18에서와 동일한 방법에 따라 제조하였다.

응고제의 조성 및 조성비와 판정 결과를 하기의 표 2에 나타낸다.

	실시예 19	실시예 20	실시예 21	실시예 22	실시예 23	실시예 24	실시예 25	실시예 11	비교예2
에탄올	0	10	20	30	40	50	60	70	80
물	96	86	76	66	56	46	36	26	16
수산화 나트륨 또는 칼륨	4	4	4	4	4	4	4	4	4
결과	양호	양호	양호	양호	양호	양호	양호	양호	부적합

시험예 1: 토끼 신장에 대한 색전

체중 2.0-3.5Kg의 건강한 뉴질랜드산 화이트(New Zealand White) 토끼 24 마리를 암수 구분 없이 각 군당 6마리씩 4군으로 나누어 실험하였다. 1군은 대조군으로 비교예 1의 150-250㎛ Contour^R(polyvinyl alcohol, Target, USA)를 사용하였고, 2군은 실시예 2에서의 150-250㎛ 키틴 입자, 3군은 실시예 2에서의 250-355㎛ 키토산 입자, 4군은 실시예 7에서의 150-250㎛ 키토산 비드, 5군은 실시예 8에서의 250-355㎛ 키토산 비드, 6군은 실시예 16에서의 355-500㎛ 키토산 비드를 실시예 27에 나타낸 바와 동일하게 가교시킨 키토산 비드로 색전하였다.

토끼를 케타라^R(케타민, 유한, 서울) 35mg/kg, 럼픈^R(Xylazine, 바이엘코리아, 서울) 5mg/kg으로 근육주사하여 마취하였다. 우측 대퇴동맥을 통하여 4F 혈관조영 코브라 카테타(Terumo, Tokyo, Japan)를 삽입하여 우측 신동맥을 선택하였다. 방사선 투시하에 조영제를 주입하며 혈관조영 검사를 하였다. 이어서 준비된 색전물을 신동맥의 혈관 폐색이 완전히 될 때까지 색전하였다. 실험 후 3일에 걸쳐 세프테졸나트륨^R(신풍, 서울)을 100mg/kg을 하루 1회씩 근육주사하였다.

각 토끼를 1일, 3일, 1주, 2주, 4주, 8주에 1 마리씩 희생하였다. 양쪽 신장을 적출하여 10% 포르말린 용액에 고정하여 HE 염색을 하였다. 색전 전과 희생시 토끼의 혈액을 채취하여 혈액학 검사(CBC)와 생화학 검사를 하였다. 혈액학 검사는 백혈구, 적혈구, 혈소판, 적혈구 용적(hematocrit), 헤모글로빈, 그리고 백혈구의 백분율(differential count)을 구하였고 생화학 검사는 BUN, 크레아틴, 총 빌리루빈, GOT, GPT, 알칼린 포스파타제, 총 단백질, 알부민, A/G 비율, LDH, CPK, 포도당, 총 콜레스테롤, 아밀라아제, 전해질(Na, K, Cl)을 검사하였다.

그 결과 1군, 2군, 3군은 시술 도중과 시술 후 카테타 검사에서 전혀 색전물질에 의한 카테타의 막힘이 없었다. 4군의 경우 1 예(16%)에서 시술 후 카테타 검사에서 카테타 막힘이 관찰되었다. 전체 24 마리에서 성공적으로 색전하였다. 육안 병리 소견 특징은 PVA(1군)의 경우 2주부터 단단하고 위축된 콩팥이 되었다. 키토산 비드의 경우 2군은 4주, 3군은 8주, 4군은 4주에 관찰되었다.

색전물질들은 8주까지 흡수되지 않았다. 혈관은 색전물질로 막혔고, 급성염증변화와 기질화 그리고 다시 혈관내에 재개통과 같은 소견을 보였다. 신실질은 응고괴사를 보이고 석회화와 섬유화를 만들며 수축되었다. PVA(1군)와 비교할 때 키토산 비드 군(2군, 3군, 4군)에서 응고 괴사가 늦게 나타났고, 비드 형태들은 염증반응이 늦게 나타나며 PVA보다 심한 혈관염을 보였다. 비드 크기에 따른 차이는 크게 없었다. 20주 후부터는 색전된 신장 내부에 키토산 비드가 관찰되지 않음으로써 혈관 내에서 키토산이 분해되는 것을 알았다.

혈액생화학 검사에서 BUN, 크레아틴은 콩팥의 기능을 보는 것으로 4개 군 모두에서 시술 1주까지 증가된 것이 관찰되었으며, 이것은 시술시 역류로 반대측 콩팥에도 색전이 있던 경우와 일치하였다. 총 빌리루빈, GOT, GPT, 알칼린 포스파타제는 모두 정상 소견을 보였다. CPK, LDH는 증가되었으나 PVA에서도 같은 정도로 증가하였다. 알레르기 때 증가 할 수 있는 호염구(eosinophil)의 증가는 없었다.

이상의 결과로부터 제조한 키토산 비드를 사용하여 토끼의 우축 대퇴동맥을 통해서 카테타를 삽입하고 색전 물질을 주입하여 혈류의 흐름을 차단하는 것에 성공하였고 그 시험의 결과 색전된 토끼 신장을 도 6A 내지 도 6E에 나타내며, 토끼 신장에 대한 병리학적 소견 결과를 하기의 표 3 및 표 4에 나타낸다.

천연 생체 고분자인 본 발명에 따른 키틴 및/또는 키토산 입자와, 키토산 비드는 면역 활성이 있으므로 혈관 내에 색전을 위해 주입시 4주에서 8주 사이에 백혈구 수가 증가하는 반면, PVA의 경우는 역으로 감소하는 결과를 나타낸다.

또한, PVA의 경우는 1주일 정도의 시간 경과에 따라 혈관 재개통이 일어나는 반면, 본 발명의 색전 물질의 경우는 이러한 혈관 재개통 현상이 나타나지 않거나 또는 나타나더라도 그 정도가 미약하며, 본 발명의 색전 물질, 특히 키토산 비드의 경우는 혈관염을 유발하여 시간의 경과에 따라 혈관벽의 비후가 일어나 혈관 내강이 점점 협착 폐쇄되는 소견을 나타내고 있으므로, 색전 물질이 의도하는 혈관 페쇄를 더욱 영구적으로 할 수가 있다.

본 발명에 따른 키틴 및/또는 키토산 입자와, 키토산 비드는 천연 생체 고분자로서 생체 친화성이 높고 면역 활성이 있으며 생분해성이고, 특히 키토산 비드의 경우는 구형체이므로 모세 혈관 불통과성이 특히 우수하며 사이즈가 일정하므로 원하는 개소를 용이하게 색전시킬 수가 있다. 더욱이, 카테타 통과성(사용성)도 우수하다.

색전 신장의 육안 병리학적 판정 결과

기간 그룹	1일	3일	1주	2주	4주	8주	24주	32주
그룹 1PVA(150-250㎛)	팽윤약간변색 연질평활	팽윤약간변색 연질평활	정상변색연질평활	수축변색경질결절	수축변색경질결절	수축변색경질결절	수축변색경질결절	수축변색경질결절
그룹 2키틴입자(150-250㎛)	팽윤약간변색 연질평활	팽윤약간변색 연질평활	정상변색연질평활	정상변색연질평활	수축변색경질결절	수축변색경질결절	수축변색경질결절	수축변색경질결절
그룹 3키토산입자(150-250㎛)	팽윤약간변색 연질평활	팽윤약간변색 연질평활	정상변색연질평활	약간수축변색경질연질결절	수축변색경질연질결절	수축변색경질결절	수축변색연질위축성결절	수축변색경질결절
그룹 4키토산비드(150-250㎛)	정상약간변색연질평활	팽윤변색연질평활	팽윤변색연질평활	약간수축변색연질경질약간결절	수축변색연질경질결절	수축변색경질결절	수축변색경질결절	수축변색연질위축성결절
그룹 5키토산비드(250-355㎛)	팽윤 변색없음연질평활	팽윤약간변색 연질평활	약간작아짐약간변색연질평활	약간작아짐약간변색연질평활	약간작아짐약간변색연질평활	수축변색경질결절	수축변색경질결절	수축변색경질결절
그룹 6가교키토산비드(355-500㎛)	팽윤 변색없음연질평활	팽윤 약간변색연질평활	팽윤변색연질평활	약간작아짐변색연질연질결절	수축변색경질결절	수축변색경질결절	수축변색경질결절	수축변색경질결절

색전 신장의 현미경적 병리학적 판정 결과

기간 그룹	1일	3일	1주	2주	4주	8주	24주	32주
PVA(150-250㎛)	PMN 출혈응고괴사	PMN 기질출혈혈관염응혈조직화	응혈조직화혈관재개통만성반응섬유화거대세포확산성괴사	응혈조직화혈관재개통섬유화석회화섬유조직확산성괴사	응혈조직화혈관재개통섬유화석회화섬유조직확산성괴사	확산성수축섬유조직	혈관재개통거대세포	전체적인 괴사섬유조직
키틴입자(150-250㎛)	확산성출혈급성반응혈관염응고괴사	혈관염급성반응응고괴사	쐐기형괴사혈관염	석회화(+)	석회화(++)	이물육아종(+++)	FB(거대세포)황색종세포혈관내막하 섬유형성내강폐색	FB반응황색종세포
키토산입자(150-250㎛)	울혈성출혈혈관염응고괴사 비발견	급성세포 반응부가응고 괴사	명확한쐐기형괴사응혈조직화혈관재개통석회화 만성반응	응혈조직확산성괴사	이물반응전체적괴사	이물반응(++)비드흡수	거대세포 혈관내막하 섬유형성내강 협착병소적혈관재개통비드흡수	전체적인 괴사섬유조직
키토산비드(150-250㎛)	세포반응없음	혈관염응고괴사	괴사성혈관염쐐기형괴사경색	이물반응(+)응혈조직화(-)	수축성석회화	확산성섬유화	전체적인 괴사 및섬유화만성염증세포침윤거대세포비드흡수	전체적인 괴사 및 섬유조직화황색종세포비드흡수
키토산비드(250-355㎛)	세포반응 없음내강출혈	괴사성 혈관염경색없음	괴사성혈관염쐐기형괴사석회화	혈관염확산성괴사	확산성괴사섬유조직화 없음	급만성반응비드흡수	혈관내막하 섬유형성내강협착비드흡수	FB반응없음혈관내막하섬유형성내강협착비드흡수
가교키토산비드(355-500㎛)	세포반응 없음	혈관염국소출혈	괴사성혈관염석회화응고괴사	혈관염석회화응고괴사	확산성괴사섬유화없음	확산성괴사	FB 반응혈관재개통비드 흡수	FB반응없음비드흡수

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실시예 26 : 동결 건조한 키토산 색전 물질의 제조 방법

실시예 17에서 제조한 키토산 색전 물질은 습윤 상태의 키토산 색전 물질 제조 방법을 나타내었고 보관의 편리성을 위하여 -40℃에서 동결 건조한 다음, 시빙하여 사이즈 별로 분류하였다.

실시예 27 : 가교된 키토산 색전 물질의 제조

실시예 26에서 제조한 비드를 물로 pH가 중성으로 되도록 세정하고 에탄올로 치환한 후 50ml를 취하여 건조하였다. 그 건조 무게는 1.6g이었다. 이 비드는 강도가 약하고 동결 건조후 원형의 모양으로 복원성이 약하며, 또한 산성용액에서 용해되므로 가교할 필요가 있다. 가교를 위하여 에탄올로 치환한 비드를 디메틸포름아미드(DMF)로 치환하고 키토산의 아미노기 1mol 당 0.1mol의 헥사메틸렌 디이소시아네이트(HMDC)를 첨가하여 실온에서 12시간 동안 천천히 교반하였다. DMF와 물로써 충분히 세정하여 잔여물을 제거하였다. 이 비드는 10% 초산 용액 중에서 비용해성 이었고 가교제 도입은 ¹³C-NMR의 스펙트로로 확인하였다. 일정량의 키토산 비드에 대한 가교 전후의 무게 변화량에 의해 계산된 가교도는 약 10%이었다. 이 결과로부터 첨가한 HMDC의 전량이 가교에 사용된 것으로 추정하였다.

실시예 28 : 이옥사글린산(상품명;Hexabrix, 주요성분;이옥사글린산, 혈관 조영제, 320mg I/ml, 태준제약, 한국)를 고정화한 키토산 혈관 색전 물질의 제조

키토산은 자체만으로는 방사선 사진을 얻을 수 없기 때문에 이 키토산 색전 물질에 소디움 이옥사글레이트 혈관 조영제를 첨가하여 흡착시켜 키토산 색전 물질 방사선 사진을 얻었다. 실시예 26에서의 키토산 색전 물질 100mg에 8ml의 에탄올로 진공하에서 3회 치환하고 여기에 Hexabrix 10ml를 첨가하여 진공 분위기에서 에탄올과 수분을 제거하는 것에 의하여 키토산 색전 물질에 소디움 이옥사글레이트가 흡착 고정화된 색전 물질을 얻었다. 이 혈관 조영제는 키토산의 아미노기와 조영제의 카르복실기가 이온 교환 작용에 의하여 흡착된다. 실시예 17과 27의 키토산 비드도 동일하게 적용된다.

실시예 29 : 이옥시탈라민산(상품명;텔레브릭스, 주요성분;이옥시탈라민산, 300mg I/ml, 태준제약, 한국) 혈관 조영제를 고정화한 키토산 혈관 색전 물질의 제조

실시예 17, 26, 27에서의 키토산 색전 물질 100mg에 5ml의 에탄올을 첨가하고 진공하에서 2회 치환하고 여기에, 6ml의 텔레브릭스를 첨가하여 진공 분위기 하에서 에탄올과 수분을 제거하는 것에 의하여 키토산 색전 물질에 이옥시탈라민산이 고정화된 색전 물질을 얻었다. 이 혈관 조영제는 키토산의 아미노기와 조영제의 카르복실기가 이온 교환 작용에 의하여 흡착된다. 실시예 17과 27의 키토산 비드도 동일하게 적용된다.

실시예 30 : 이오헥솔(상품명;Omnipaque, 주요성분;Iohexol, 350mg I/ml, 나이코메드 이미징 에이에스, 한국 ) 혈관 조영제를 고정화한 키토산 혈관 색전 물질의 제조

실시예 17, 26, 27에서의 키토산 색전 물질 100mg에 3ml의 에탄올을 첨가하여 진공하에서 1회 치환하고, 여기에 5ml의 옴니파끄(Omnipaque)를 첨가하고 진공 분위기 하에서 에탄올과 수분을 제거하여 키토산 색전 물질에 옴니파끄가 고정화된 색전 물질을 얻었다. 이 혈관 조영제는 키토산의 분자 사이에 조영제가 흡착 작용에 의하여 고정된다. 실시예 17과 27의 키토산 비드도 동일하게 적용된다.

실시예 31 : 수소화요오드산(Hydroiodic acid, 와코퓨어케미칼, 일본)을 고정화한 키토산 혈관 색전 물질의 제조

실시예 17, 26, 27에서의 키토산 색전 물질 100mg에 3ml의 에탄올을 첨가하여 진공하에서 3회 치환하고, 여기에 320mg I/ml 농도의 수소화요오드산 5ml를 첨가하고 진공 분위기 하에서 에탄올과 수분을 제거하고 물로써 중성이 될 때까지 세척하여 키토산 색전 물질에 수소화요오드산이 고정화된 색전 물질을 얻었다. 이 혈관 조영제는 키토산의 아미노기에 수소화요오드산의 수소이온이 결합되어 요오드와 키토산의 아미노기가 이온 교환작용에 의하여 고정된다. 실시예 17과 27의 키토산 비드도 동일하게 적용된다.

실시예 32 : 염산독솔루비신(상품명;일동아드리아마이신 피·에프·에스주, 주요성분; 염산독솔루비신, 10mg 염산독솔루비신/5ml, 일동제약, 한국) 및 염산에피루비신(상품명;일동파모루비신 피·에프·에스주, 주요성분;염산에피루비신, 10mg 염산에피루비신/5ml, 일동제약, 한국 ) 고정화 기능성 키토산 색전 물질의 제조

실시예 17, 26, 27에서의 키토산 색전 물질 100mg에 3ml 의 에탄올을 첨가하여 진공하에서 2회 치환하고, 여기에 5ml의 염산독솔루비신을 첨가하여 진공 분위기하에서 에탄올과 수분을 제거하여 키토산 색전 물질에 염산독솔루비신이 고정화된 색전 물질을 얻었다. 이 혈관 조영제는 키토산의 분자쇄 사이에 염산독솔루비신에 흡착되어 고정된다. 실시예 17과 27의 키토산 비드도 동일하게 적용되며 염산에피루비신도 같은 방법으로 고정화했다.

전술한 바와 같이, 본 발명에 따른 키틴 및/또는 키토산 색전 물질은, 생체 친화성이 높은 혈관 색전 물질로서 생체와의 이물 반응이 적고 완벽한 색전술을 구현할 수 있으며 모세 혈관을 통과하여 폐로 흘러가지 않으므로 안정성이 높고, 혈관 조영제를 색전 물질 내에 흡착시킴으로써 색전 물질 자체의 방사선 영상을 얻을 수가 있으며, 혈관 내에서 분해성이므로 색전 후 일정 시간이 경과되면 혈관 재소통이 이루어질 수 있고, 규정된 범위 내에서 비교적 균일한 크기로 제조 가능함으로 원하는 사이즈의 혈관을 효과적으로 막을 수가 있으며, 발암성이 없고, 혈관 내에서 색전 물질로 인하여 어느 정도의 염증을 유발하므로 색전에 유리하며, 항암제를 혈관 색전 물질에 고정화시키는 경우 항암제를 일정한 농도로 장시간 동안 방출시킬 수가 있는 서방성 혈관 색전 물질로 제조함으로써 암치료에 효과적으로 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

본 발명에 따른 키토산 비드 색전 물질은 신혈관을 막아 응고괴사를 유발, 색전 효과를 나타내며, 기존의 PVA 입자와 비교하여 혈액 및 생화학 검사에서도 대등한 정도의 변화를 나타내므로 색전 물질로서 그 효과를 기대할 수가 있고, 저가로 공급 가능하다.

도 1A 및 도 1B는, 각각, 본 발명에 따른 혈관 색전 물질의 제조방법을 설명하는 전반적 개략도 및 요부 개략도이다.

도 2는 150∼250㎛의 평균 크기를 갖는 종래의 폴리비닐알코올 입자를 나타내는 현미경 확대 사진이다.

도 3A 및 도 3B는, 각각, 본 발명에 따른 150∼250㎛의 평균 직경을 갖는 키틴 입자 및 키토산 입자를 나타내는 현미경 확대 사진이다.

도 4A 및 도 4B는 각각 본 발명에 따른 150∼250㎛의 평균 직경을 갖는 키토산 비드의 현미경 확대 사진 및 나안 사진이다.

도 5는 항암제로서의 염산독솔루비신을 포접하여 고정화시킨 본 발명에 따른 기능성 키토산 색전 물질의 확대 사진이다.

도 6A 내지 도 6E는 각각 시험예 7의 결과를 나타내는 토끼 신장의 병리 소견 사진이다.

- 도면의 주요부에 대한 부호의 설명 -

1 : 키토산 미소 액적 2 : 펌프

3 : 키토산 용액 이송 라인 4 : 캐필러리 지지체

5 : 미세 니들형 캐필러리 6 : 공기 이송 라인

7 : 공기 필터 8 : 응고조

9 : 교반기 10 : 키토산 용액

11 : 공기

Claims (12)

1. 삭제
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 삭제
7. 삭제
8. 삭제
9. 캐필러리 주위의 불활성 기류 하에 키토산 용액을 가압하 캐필러리를 통과시켜 미소 액적화 하는 단계 및 상기한 미소 액적을 수산화나트륨 또는 수산화칼륨/에탄올/물의 혼합 용매로 된 응고액 중에 침적시켜 비드화하는 단계로 구성되는 키토산 비드의 제조 방법에 있어서, 상기 키토산으로는 탈아세틸화도 60% 이상 84% 이하인 것, 점도는 5 내지 86cps인 것, 수평균 분자량은 20,000 이상 50,000 이하인 것, 농도는 1.5 내지 5.5%(w/v)인 키토산을 사용하여서 제조되는 것을 특징으로 하는 키토산 비드 색전 물질의 제조 방법.
10. 삭제
11. 제9 항에 있어서, 상기한 응고액인 수산화나트륨 또는 수산화 칼륨:에탄올:물의 혼합 용매의 혼합비율은 1:0∼18:4∼24의 범위인 것을 특징으로 하는 키토산 비드 색전 물질의 제조 방법.
12. 삭제