JP2015503524A5

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Publication number: JP2015503524A5
Application number: JP2014549204A
Authority: JP
Filing date: 2012-12-18
Publication date: 2017-06-15
Anticipated expiration: 2032-12-18

Description

代替的には、本発明は、（ａ）関心ポリペプチドおよび種々の混入物を含む組成物を、陽イオン交換膜に通し、前記ポリペプチドのｐＩを約１から約５ｐＨ単位下回るｐＨを有するバッファ、および、約４０ｍＳ／ｃｍ以下の伝導率を含む操作条件で、前記ポリペプチドおよび前記膜は反対電荷を有して、前記ポリペプチドおよび少なくとも１つの前記混入物を前記膜に結合させ、（ｂ）前記関心ポリペプチドを含む、前記イオン交換膜からの分画を採取し、（ｃ）前記ポリペプチドを含む前記組成物について１つまたはそれ以上のさらなる精製工程を行い、（ｄ）前記精製ポリペプチドを前記溶出液から回収することを含む、タンパク質の精製のための下流のクロマトグラフィー工程の効率を高める方法に関する。

さらに代替的には、本発明は、（ａ）関心ポリペプチドおよび種々の混入物を含む組成物を、陰イオン交換膜に通し、前記ポリペプチドのｐＩを約１から約５ｐＨ単位上回るｐＨを有するバッファ、および、約４０ｍＳ／ｃｍ以下の伝導率を含む操作条件で、前記ポリペプチドおよび前記膜は反対電荷を有して、前記ポリペプチドおよび少なくとも１つの前記混入物を前記膜に結合させ、（ｂ）前記関心ポリペプチドを含む、前記イオン交換膜からの分画を採取し、（ｃ）前記ポリペプチドを含む前記組成物について１つまたはそれ以上のさらなる精製工程を行い、（ｄ）前記精製ポリペプチドを前記溶出液から回収することを含む、タンパク質の精製のための下流のクロマトグラフィー工程の効率を高める方法に関する。

オーバーロードモードにおける膜陽イオン交換クロマトグラフィーのランに関し、ロードする物質のｐＨは、抗体のｐＩを約１から約５ｐＨ単位下回って調製され、ロードする物質の伝導率は、ｐＨに応じて約４０ｍＳ／ｃｍ以下に調節され、抗体は、その後、膜を通って放出される。いくつかの実施形態では、ロードする物質のｐＨは、抗体のｐＩを約１から約４ｐＨ単位、約１から約３ｐＨ単位、約１から約２ｐＨ単位、または約１ｐＨ単位、下回って調製される。他の実施形態では、ロードする物質の伝導率は、ｐＨに応じて、約２０ｍＳ／ｃｍ以下または約１０ｍＳ／ｃｍ以下に調節される。ロードのｐＨは抗体のｐＩよりも低いので、抗体は（正に帯電しており）最初には通過しないであろう。さらに、抗体は、陽イオン交換の負の官能基に静電気的に結合しているであろう。これは、抗体（正）および膜（負）が反対電荷を有しているからである。プロテインＡアフィニティクロマトグラフィー中に抗体とともに溶出する、多くの混入物、例えば、ＣＨＯＰまたはＥＣＰのような宿主細胞のタンパク質、ゲンタマイシンのようなアミノグリコシド系抗生物質、およびポリエチレンイミン（ＰＥＩ）のようなイオンポリマー添加物、のｐＩは、抗体のｐＩとは少しだけ異なっている、つまり、それらのｐＩは約０．０５から約０．２ｐＩ単位だけ異なり得るので、「塩基性」の抗体のようなこれらの混入物もまた、膜に結合するであろう。プロテインＡクロマトグラフィーを使用しない精製スキームでは、ゲンタマイシンもしくはＰＥＩまたは他の不純物は、膜が使用されない限り、ＩＥＸカラムの性能を妨害するのに十分に高い濃度で留まるであろう。理論に拘束されることなく、最小限のイオン遮蔽により電荷を誘発するｐＨおよび伝導率条件での、オーバーロードモードの膜陽イオン交換クロマトグラフィーのランに関し、競合吸着が発生し、混入物は優先的に膜に結合し、または、さもなければ、効果的に抗体を膜から「移動」させ（ＲＲＤｒａｇｅｒ，ＦＥＲｅｇｎｉｅｒ，ＪＣｈｒｏｍａｔｏｇｒ．３５９：１４７−５５（１９８６））、結合後に、抗体をマトリックスまたはフロースルーから「溶出」させて、溶出液に回収することを可能にするようである。

オーバーロードモードにおける膜陰イオン交換クロマトグラフィーのランに関し、ロードする物質のｐＨは、抗体のｐＩを約１から約５ｐＨ単位上回って調製され、ロードする物質の伝導率は、ｐＨに応じて約４０ｍＳ／ｃｍ以下に調節され、抗体は、その後、膜を通って放出される。いくつかの実施形態では、ロードする物質のｐＨは、抗体のｐＩを約１から約４ｐＨ単位、約１から約３ｐＨ単位、約１から約２ｐＨ単位、または約１ｐＨ単位、上回って調製される。他の実施形態では、ロードする物質の伝導率は、ｐＨに応じて、約２０ｍＳ／ｃｍ以下または約１０ｍＳ／ｃｍ以下に調節される。ロードのｐＨは抗体のｐＩよりも高いので、抗体は（負に帯電しており）最初には通過しないであろう。さらに、抗体は、陰イオン交換の正の官能基に静電気的に結合しているであろう。これは、抗体（負）および膜（正）が反対電荷を有しているからである。プロテインＡアフィニティクロマトグラフィー中に抗体とともに溶出する、多くの混入物、例えば、ＣＨＯＰのような宿主細胞のタンパク質のｐＩは、抗体のｐＩとは少しだけ異なっている、つまり、それらのｐＩは約０．０５から約０．２ｐＩ単位だけ異なり得るので、「酸性」の抗体のようなこれらの混入物もまた、膜に結合するであろう。理論に拘束されることなく、最小限のイオン遮蔽により電荷を誘発するｐＨおよび伝導率条件での、オーバーロードモードの膜陰イオン交換クロマトグラフィーのランに関し、競合吸着が発生し、混入物は優先的に膜に結合し、または、さもなければ、効果的に抗体を膜から「移動」させ（ＲＲＤｒａｇｅｒ，ＦＥＲｅｇｎｉｅｒ，ＪＣｈｒｏｍａｔｏｇｒ．３５９：１４７−５５（１９８６））、結合後に、抗体をマトリックスまたはフロースルーから「溶出」させて、溶出液に回収することを可能にするようである。

スモールスケール陰イオン交換膜収率
比較対象に関し、ｍＡｂ２は、７．７の等電点を超えて陰イオン交換膜を使用する試験のために選択された。タンパク質は高いｐＨでは脱アミドおよび凝集する傾向があるので、類似の試験はｍＡｂ１では行わなかった。ｐＨ５．５および９ｍＳ／ｃｍでの陽イオン交換プールは、１．５Ｍトリス塩基を用いて、ｐＨを８．０に調節した。フィードストックは、その後、３つの分離プールに分けられ、精製水を用いて伝導率が調節された。最初のプールは１０ｍＳ／ｃｍであり、２番目および３番目のプールは７ｍＳ／ｃｍおよび４ｍＳ／ｃｍにそれぞれ調節された。全ての３つのプールは、ｐＨ８．０に維持された。各フィードストリームは、その後、スモールスケールの０．３５ｍＬムスタング（商標）Ｑで６００ＭＶ／時の一定流速にて処理された。ｍＡｂ３はｐＨ８．０で、ｐＩを０．３ｐＨ単位上回り、よって、抗体は負に帯電した。ロードおよびフロースループールは、抗体濃度に関して分析された。図４は、収率が全ての３つのｐＨ濃度に類似し、最初に２００ｇ／Ｌの負荷密度下で急激に増加し、約１０００ｇ／Ｌの負荷密度のあとに９６％以上であることを示す。

スモールスケール陽イオン交換膜の不純物クリアランス
陽イオン交換膜の不純物クリアランスを評価するために、ｐＨ５．５かつ３．２ｍＳ／ｃｍでのｍＡｂ３プロテインＡプールは、スモールスケールの０．１８ｍＬムスタング（商標）Ｓ膜で１３３３ＭＶ／時の一定流速にて処理された。ｍＡｂ３のロードは、算出されたｐＩを３．４単位下回り、よって、抗体は正に帯電した。ロード、フロースルー分画、および溶出サンプルが分析され、ＣＨＯＰに関する結果は図５に示される。データは、ムスタング（商標）Ｓが、最初に４３８から１０９ｐｐｍまでＣＨＯＰを低減することを示す。負荷密度が５５，３００ｇ／Ｌに達した時、ＣＨＯＰは３１８ｐｐｍに増加した。高い塩を含む溶液を用いて膜を溶出した。塩のイオンは、電荷を遮蔽するために使用され、よって、静電的相互作用を妨害し、タンパク質を膜表面から離脱させて、移動相中に自由に移動させる。溶出プールの分析は、静電力による膜へのＣＨＯＰ結合を裏付ける、不純物の濃縮を示す。

吸着材性能をさらに評価するために、ｐＨ５．５かつ６．０ｍＳ／ｃｍでのｍＡｂ３陰イオン交換プールは、スモールスケールの０．１８ｍＬムスタング（商標）Ｓ膜で６６７ＭＶ／時の一定流速にて処理された。ｍＡｂ３のｐＨは、ｐＩを３．４ｐＨ単位下回り、よって抗体は正に帯電した。フィードおよびフロースルーグラブサンプルは、ｍＡｂ、ＣＨＯＰ、およびゲンタマイシン濃度について分析された。フィードおよびグラブサンプル濃度を比較するために、膜負荷密度の関数としての、Ｃ／Ｃ_０のグラフ（グラブサンプル／ロード）が生成された。図６に示されるように、ｍＡｂのＣ／Ｃ_０値は、２〜１６ｋｇ／Ｌの負荷密度で１．０に近く、グラブサンプル濃度がロードした濃度とほぼ同一であり、改めて収率が高くなるであろうことが示唆される。逆に、ＣＨＯＰおよびゲンタマイシンのＣ／Ｃ_０値は低く、０．２以下で２〜１６ｋｇ／Ｌの負荷密度であることから、グラブサンプル濃度がロードした濃度よりもかなり低く、ｍＡｂによるオーバーロードにも関わらず、ムスタング（商標）Ｓがこれらの不純物の大部分を取り除いていることが示唆される。

Claims

抗体の精製のための下流のクロマトグラフィー工程の効率を高める方法であって、
ａ．関心の抗体およびイオンポリマー混入物を含む組成物を、イオン交換膜に通し、前記抗体のｐＩとは１から５ｐＨ単位異なるｐＨを有するバッファを含む操作条件で、前記抗体および前記膜は反対電荷を有して、前記抗体の前記電荷およびバッファイオンによる電荷の遮蔽を防止するのに有効な低イオン強度を高め、前記抗体および少なくとも１つのイオンポリマー混入物を前記膜に結合させ、
ｂ．工程ａの前記少なくとも１つの混入物が前記膜に結合したままで、前記関心の抗体が主に溶出液中にあるように、前記イオン交換膜を１０００〜５０００ｇ／Ｌの負荷密度にオーバーロードさせ、
ｃ．前記関心の抗体を含む、前記イオン交換膜からの前記溶出液を採取し、
ｄ．前記関心の抗体を含む、前記膜溶出液に対して、先の膜と類似の電荷のイオン交換クロマトグラフィー工程を行い、
ｅ．精製された前記抗体を、帯電させた前記イオン交換クロマトグラフィー工程の前記溶出液から回収することを含む、方法。
前記イオン交換膜は、０．１から１００μｍのポアサイズを有する、請求項１に記載の方法。
前記イオン交換膜はモノリスまたはデプスフィルターにより置き換えられる、請求項１に記載の方法。
抗体の精製のための下流のクロマトグラフィー工程の効率を高める方法であって、
ａ．関心の抗体およびイオンポリマー混入物を含む組成物を、陽イオン交換膜に通し、前記抗体のｐＩを１から５ｐＨ単位下回るｐＨを有するバッファ、および、４０ｍＳ／ｃｍ以下の伝導率を含む操作条件で、前記抗体および前記膜は反対電荷を有して、前記抗体および少なくとも１つのイオンポリマー混入物を前記膜に結合させ、
ｂ．工程ａの前記少なくとも１つの混入物が前記膜に結合したままで、前記関心の抗体が主に溶出液中にあるように、前記陽イオン交換膜を１０００〜５０００ｇ／Ｌの負荷密度にオーバーロードさせ、
ｃ．前記関心の抗体を含む、前記陽イオン交換膜からの前記溶出液を採取し、
ｄ．前記関心の抗体を含む、前記膜の溶出液に対して、陽イオン交換クロマトグラフィー精製工程を行い、
ｅ．精製された前記抗体を、前記陽イオン交換クロマトグラフィー精製工程の前記溶出液から回収することを含む、方法。
ｐＨが、抗体のｐＩを１から４ｐＨ単位下回る、請求項４に記載の方法。
ｐＨが、抗体のｐＩを１から３ｐＨ単位下回る、請求項４に記載の方法。
ｐＨが、抗体のｐＩを１から２ｐＨ単位下回る、請求項４に記載の方法。
ｐＨが、抗体のｐＩを１ｐＨ単位下回る、請求項４に記載の方法。
前記伝導率は２０ｍＳ／ｃｍ以下である、請求項４に記載の方法。
前記伝導率は１０ｍＳ／ｃｍ以下である、請求項４に記載の方法。
前記陽イオン交換膜は、陽イオン交換モノリスまたはデプスフィルターである、請求項４に記載の方法。
抗体の精製のための下流のクロマトグラフィー工程の効率を高める方法であって、
ａ．関心の抗体およびイオンポリマー混入物を含む組成物を、陰イオン交換膜に通し、前記抗体のｐＩを１から５ｐＨ単位上回るｐＨを有するバッファ、および、４０ｍＳ／ｃｍ以下の伝導率を含む操作条件で、前記抗体および前記膜は反対電荷を有して、前記抗体および少なくとも１つの前記イオンポリマー混入物を前記膜に結合させ、
ｂ．工程ａの少なくとも１つの前記混入物が前記膜に結合したままで、前記関心の抗体が主に溶出液中にあるように、前記陰イオン交換膜を１０００〜５０００ｇ／Ｌの負荷密度にオーバーロードさせ、
ｃ．前記関心の抗体を含む、前記陰イオン交換膜からの前記溶出液を採取し、
ｄ．前記関心の抗体を含む、前記膜の溶出液に対して、陰イオン交換クロマトグラフィー精製工程を行い、
ｅ．精製された前記抗体を、前記陰イオン交換クロマトグラフィー精製工程の前記溶出液から回収することを含む、方法。
ｐＨが、抗体のｐＩを１から４ｐＨ単位上回る、請求項１２に記載の方法。
ｐＨが、抗体のｐＩを１から３ｐＨ単位上回る、請求項１２に記載の方法。
ｐＨが、抗体のｐＩを１から２ｐＨ単位上回る、請求項１２に記載の方法。
ｐＨが、抗体のｐＩを１ｐＨ単位上回る、請求項１２に記載の方法。
前記伝導率は２０ｍＳ／ｃｍ以下である、請求項１２に記載の方法。
前記伝導率は１０ｍＳ／ｃｍ以下である、請求項１２に記載の方法。
前記陰イオン交換膜は、陰イオン交換モノリスまたはデプスフィルターに置き換えられる、請求項１２に記載の方法。
前記膜は混合モードの吸着材である、請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。
前記イオンポリマーはポリエチレンイミン（ＰＥＩ）である、請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
前記抗体はモノクローナル抗体である、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
ポリペプチドを含む前記組成物を、１以上のさらなる精製工程に供することを更に含む、請求項１から２１の何れか一項に記載の方法。
前記さらなる精製工程がイオン交換クロマトグラフィーを含む、請求項２３に記載の方法。
前記ａからｅの工程の間に、さらなる前記精製工程が継続的に行われ、前記精製工程はイオン交換クロマトグラフィーである、請求項２３に記載の方法。
前記イオン交換クロマトグラフィーは陽イオン交換カラムを含む、請求項２４または請求項２５に記載の方法。
前記イオン交換クロマトグラフィーは陰イオン交換カラムを含む、請求項２４または請求項２５に記載の方法。
精製した前記抗体を薬学的に許容可能な担体と組み合わせることにより、薬学的組成物を調製することをさらに含む、請求項１から２７のいずれか一項に記載の方法。