JP2015228829A - 抗菌剤の選択方法 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明は、月経周期に伴う肌状態の悪化を予防・改善に効果を発揮する抗菌剤を選択する方法を提供することを課題とする【解決手段】正常ヒト表皮角化細胞の培養系において、被験物質とプロゲステロンの存在下における抗菌ペプチドの発現量と、プロゲステロンのみの存在下における抗菌ペプチドの発現量とを測定し、前記の被験物質とプロゲステロンの存在下における抗菌ペプチドの発現量がプロゲステロンのみの存在下における抗菌ペプチドの発現量を上回った場合に、該被験物質を抗菌剤として選択する抗菌剤の選択方法。前記抗菌ペプチドがｈＢＤ−３であることが好ましく前記抗菌ペプチドの発現量がｈＢＤ−３ mRNAの発現量であることが好ましい。【選択図】図１

Description

本発明は抗菌剤の選択方法に関する。

従来、化粧料などの皮膚外用剤に用いられる抗菌剤として、パラベン、フェノキシエタノール、多価アルコールが汎用されている。その他、医療用にグルコン酸クロルヘキシジン、塩化ベンザルコニウム等が使用されている。一方、皮膚表面には、外部からの感染を防ぐため、多種の抗菌ペプチドが存在する。

抗菌ペプチドは、生物自らが産生しているものであるため、抗生物質等の化学物質に代わり得るものとして期待されている（例えば、特許文献１及び２参照）。また、薬剤耐性菌が出現し難いと考えられている。抗菌ペプチドは細菌感染汚染を予防するため、食材の、食品加工器具の、食品加工設備の、食材と接触する表面の、医療装置の、病院および手術室における表面の、グラム陰性細菌汚染の処置または予防のための、用いられていることが知られている（例えば、特許文献３参照）。
抗菌ペプチドであるディフェンシンは、細菌、真菌、ならびに多くのエンベロープウイルスおよび非エンベロープウイルスに対して活性を有し、このうちβ-ディフェンシンは幅広い抗菌活性を有するカチオン性のペプチドである。
ディフェンシンファミリーには、ｈＢＤ−１、ｈＢＤ−２、ｈＢＤ−３等の種類が存在し、ｈＢＤ−１、ｈＢＤ−２はヒトのβ-ディフェンシンの代表的な例である。唾液腺、舌、歯茎や頬などの粘膜細胞内でのｈＢＤ−１、ｈＢＤ−２のｍＲＮＡの発現が確認されており、β-ディフェンシンと同じように微生物細菌からの感染防止予防に重要な役割を担っている（例えば、特許文献４参照）。

一方、ニキビは１０代を中心に発症するが、近年、３０代以降でも発症するケースが増え、様々な対応がなされている。ニキビはグラム陽性菌であるアクネ菌（P.acnes）が原因菌とされており、女性では月経周期とニキビとの関連性が言われており、ホルモンとの関連性を指摘する報告もある（例えば、非特許文献１及び２参照）。

特開２００４−１０７２７５号公報 特開２００５−２８１２２５号公報 特表２０１３−５０２２３１号公報 特開２０１３−１５１４４２号公報 Arch Dermatol. 2004;140(4):p423-424 変貌する痤瘡マネジメント（総編集：古江増隆、専門編集：林伸和 中山書店）P94-96

本発明は、このような状況下なされたものであり、月経周期に伴う肌状態の悪化を予防・改善することを目的に、抗菌ペプチドの発現量を指標とした抗菌剤の選択方法を提供することを課題とする。

本発明者らは、月経周期により変化するホルモンによる抗菌ペプチドへの影響を検討し、そのうち、黄体ホルモンであるプロゲステロンにより抗菌ペプチドの発現が低下することを明らかにした。プロゲステロンによるこのような抗菌ペプチド発現の低下を改善する方法を提供すべく研究を進め、さらに、複数の抗菌ペプチドのうちｈＢＤ−３がグラム陽性菌に対し高い抗菌作用を示したことから、ｈＢＤ−３の発現量を指標に、プロゲステロンによる抗菌ペプチド発現低下を改善する抗菌剤を選択することが出来ることを見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は以下に示すとおりである。
＜１＞正常ヒト表皮角化細胞の培養系において、被験物質とプロゲステロンの存在下における抗菌ペプチドの発現量と、プロゲステロンのみの存在下における抗菌ペプチドの発現量とを測定し、前記の被験物質とプロゲステロンの存在下における抗菌ペプチドの発現量がプロゲステロンのみの存在下における抗菌ペプチドの発現量を上回った場合に、該被験物質を抗菌剤として選択することを特徴とする、抗菌剤の選択方法。＜２＞前記抗菌ペプチドがｈＢＤ−３である、＜１＞に記載の抗菌剤の選択方法。＜３＞前記抗菌ペプチドの発現量がｈＢＤ−３ mRNAの発現量であることを特徴とする、＜１＞に記載の抗菌剤の選択方法。＜４＞正常ヒト表皮角化細胞の培養系において、被験物質とプロゲステロンの存在下における抗菌ペプチドの発現量（α）と、プロゲステロンのみの存在下における抗菌ペプチドの発現量（β）と、コントロールとして、被験物質とプロゲステロンを加えない時の抗菌ペプチドの発現量（γ）とを用い、以下の式（１）より算出された値が、５０％以上である時に、被験物質を抗菌剤として選択することを特徴とする、抗菌剤の選択方法。 式（１）（α−β）／（γ−β）×100（％）＜５＞アクネ菌（Propionibacterium acnes:P. acnes）に対する抗菌作用を示す抗菌剤である＜１＞〜＜４＞に記載の抗菌剤の選択方法。＜６＞＜１＞〜＜５＞記載の選択方法により選ばれた抗菌剤。

プロゲステロンによるｈＢＤ−３ｍRNA発現量の低下に対する植物エキスの抑制効果を示すグラフである。 抗菌ペプチドのP.acnesへの抗菌活性を示すグラフである。

以下、本発明の抗菌剤の選択方法について説明する。
本発明の選択方法の実施態様における手順の一例を以下に挙げるが、本発明の趣旨を逸脱しない限り以下の内容に限定されるものではなく、適宜変更して実施することができる。

（１）本発明の抗菌剤の選択方法
ｈＢＤ−３ｍRNA発現量は、任意の方法を用いて測定することができる。例えば、当該遺伝子の配列に特異的に結合する配列を有するＤＮＡ断片をプライマーとして用いてＰＣＲを行い、定量的な検出を行うことが出来る。
具体的には、正常ヒト表皮角化細胞をプレートに播種し、低Ca含有培地にて３７℃、５％ＣＯ_２条件下でする。培養３日後、プロゲステロン、又はプロゲステロン及び被験物質を添加し、高Ca含有培地に交換し、３日間培養する。培養終了後、細胞を回収し、トータルRNAを抽出し、得られたトータルRNAからcDNAを合成する。合成したcDNAをテンプレートとしてリアルタイムPCRを行い、検量線法によりｈＢＤ−３ mRNA発現量を定量することが出来る。
コントロールとして、プロゲステロン及び被験物質を添加しない時のｈＢＤ−３ mRNA発現量を測定し、以下の式（１）から算出した値が５０％以上である場合、被験物質を抗菌剤として選択できる。

式（１）（α−β）／（γ−β）×100（％） αはプロゲステロン及び被験物質を添加した時のｈＢＤ−３ mRNA発現量βはプロゲステロンを添加した時のｈＢＤ−３ mRNA発現量γはプロゲステロン及び被験物質を添加しない時のｈＢＤ−３ mRNA発現量（コントロール）

以下、本発明の抗菌剤について説明する。
本発明の選択方法の実施態様における手順の一例を以下に挙げるが、本発明の趣旨を逸脱しない限り以下の内容に限定されるものではなく、適宜変更して実施することができる。
（２）本発明の抗菌剤
抗菌ペプチドには、ｈＢＤ−１、ｈＢＤ−２、ｈＢＤ−３、ｈＢＤ−４等が存在し、粘膜、皮膚表面において、外部からの感染を防ぐ役割を持つ。
本発明におけるｈＢＤ−３はグラム陽性菌に対する抗菌作用を示し、特にP.acnes（アクネ菌）に対し抗菌作用を示す。
本発明の抗菌剤は抗菌ペプチドの発現量を指標に選択された抗菌剤である。
月経周期により増減するプロゲステロンは、ｈＢＤ−３mRNA発現量を低下させ、結果的にｈＢＤ−３のグラム陽性菌に対する抗菌作用、特にP.acnes（アクネ菌）に対する抗菌作用を低下させる。
本発明の抗菌剤の選択方法により、このような抗菌ペプチドのグラム陽性菌に対する抗菌作用の低下を抑制する抗菌剤を選択し、化粧料、医薬部外品、医薬品、食品などに配合し使用することが出来る。特にアクネ菌に対する抗菌作用を期待する場合は、化粧料、医薬部外品等の皮膚外用剤として使用することが好ましい。

本発明の選択方法が対象とする被験物質は、純物質、動植物由来の抽出物、またはそれらの混合物等のいずれであってもよい。
動植物由来の抽出物は、動物又は植物由来の抽出物自体のみならず、抽出物の画分、精製した画分、抽出物乃至は画分、精製物の溶媒除去物の総称を意味するものとし、植物由来の抽出物は、自生若しくは生育された植物、漢方生薬原料等として販売されるものを用いた抽出物、市販されている抽出物等が挙げられる。中でも、効果の点から、ムラサキ科ムラサキ属の植物抽出物が好ましく、ムラサキ科ムラサキ属の植物としては、シコン、イヌムラサキ、シロバナホタルカズラ、セイヨウムラサキ、ホタルカズラ、ムラサキが例示でき、効果の点からシコンが好ましい。
抽出操作は、植物部位の全草を用いるほか、植物体、地上部、根茎部、木幹部、葉部、茎部、花穂、花蕾等の部位を使用することできるが、予めこれらを粉砕あるいは細切して抽出効率を向上させることが好ましい。抽出溶媒としては、水、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、ブタノールなどのアルコール類、１，３−ブタンジオール、ポリプロピレングリコールなどの多価アルコール類、アセトン、メチルエチルケトンなどのケトン類、ジエチルエーテル、テトラヒドロフランなどのエーテル類等の極性溶媒から選択される１種乃至は２種以上が好適なものとして例示することができる。具体的な抽出方法としては、例えば、植物体等の抽出に用いる部位乃至はその乾燥物１質量に対して、溶媒を１〜３０質量部加え、室温であれば数日間、沸点付近の温度であれば数時間浸漬し、室温まで冷却後、所望により不溶物及び／又は溶媒除去し、カラムクロマトグラフィー等で分画精製する方法が挙げられる。
本発明においては、動植物由来の極性溶媒による抽出物をろ過後、カラムクロマトグラフィーにて分画し、有効成分濃度を高め、前記選択方法にて、より効果の高い画分を選択し肌改善剤として用いることが好ましい。
本発明の抗菌剤を化粧料、医薬部外品等の皮膚外用剤として使用する場合、本発明の抗菌剤は、全量に対し、０．０００１質量％〜１０質量％、より好ましくは、０．００１質量％〜５質量％、さらに好ましくは、０．０１質量％〜３質量％含有することが好ましい。植物抽出物の溶媒除去物を使用する場合は、全量に対し、０．００００００１質量％〜１０質量％、より好ましくは、０．０００１質量％〜５質量％、さらに好ましくは、０．００１質量％〜３質量％含有することが好ましい。これは、下限未満では本発明の皮膚外用剤が有する効果が発揮されず、上限を超えると効果が頭打ちになり、色や臭い等の問題が生じ、皮膚外用剤として使用する場合、自由度を損なう場合が存するためである。

化粧料に適用される場合、通常化粧料に使用される成分を広く配合することが可能であり、また、その剤形や用途についても、何ら限定されない。以下、化粧料に適用される場合、化粧料中に含有させることができる成分について説明する。例えば、炭化水素類、エステル類、トリグリセライド類、脂肪酸、高級アルコール等の油性成分、アニオン界面活性剤類、両性界面活性剤類、カチオン界面活性剤類、非イオン界面活性剤類等の界面活性剤、多価アルコール類、増粘・ゲル化剤、酸化防止剤、紫外線吸収剤、色剤、防腐剤、粉体等を任意に配合することができる。有効成分としては、美白成分、シワ改善成分、抗炎症成分、動植物由来の抽出物等が挙げられる。なお、上記説明した本発明の抗菌剤と併用してもよい。

美白成分としては、一般的に化粧料に用いられているものであれば特に限定はない。例えば、４−ｎ−ブチルレゾルシノール、アスコルビン酸グルコシド、３−О−エチルアスコルビン酸、トラネキサム酸、アルブチン、１−トリフェニルメチルピペリジン、１−トリフェニルメチルピロリジン、２−（トリフェニルメチルオキシ）エタノール、２−（トリフェニルメチルアミノ）エタノール、２−（トリフェニルメチルオキシ）エチルアミン、トリフェニルメチルアミン、トリフェニルメタノール、トリフェニルメタン及びアミノジフェニルメタン、Ｎ−（p−トルイル）システイン酸、Ｎ−（p−メトキシベンゾイル）システイン酸等が挙げられる。更にその他の美白成分として、Ｎ−ベンゾイル−セリン、Ｎ−（ｐ−メチルベンゾイル）セリン、Ｎ−（ｐ−エチルベンゾイル）セリン、Ｎ−（ｐ−メトキシベンゾイル）セリン、Ｎ−（ｐ−フルオロベンゾイル）セリン、Ｎ−（ｐ−トリフルオロメチルベンゾイル）セリン、Ｎ−（２−ナフトイル）セリン、Ｎ−（４−フェニルベンゾイル）セリン、Ｎ−（ｐ−メチルベンゾイル）セリン メチルエステル、Ｎ−（ｐ−メチルベンゾイル）セリン エチルエステル、Ｎ−（２−ナフトイル）セリン メチルエステル、Ｎ−ベンゾイル−Ｏ−メチルセリン、Ｎ−（ｐ−メチルベンゾイル）−Ｏ−メチルセリン、Ｎ−（ｐ−メチルベンゾイル）−Ｏ−アセチルセリン、Ｎ−（２−ナフトイル）−Ｏ−メチルセリン等があげられる。
これらの美白成分は、既に市販されているものもあれば、合成により入手することもできる。例えば、３−О−エチルアスコルビン酸は、特開平８−１３４０５５号公報に記載の公知の方法で合成することが出来る。市販品（日本精化製「ＶＣエチル」）もあるので、これらを入手して使用することが可能である。１−トリフェニルメチルピペリジン、１−トリフェニルメチルピロリジン、２−（トリフェニルメチルオキシ）エタノール、２−（トリフェニルメチルアミノ）エタノール、２−（トリフェニルメチルオキシ）エチルアミン、トリフェニルメチルアミン、トリフェニルメタノール、トリフェニルメタン、アミノジフェニルメタンは特許文献ＷＯ２０１０―０７４０５２号パンフレットに、Ｎ−（ｏ−トルオイル）システイン酸、Ｎ−（ｍ−トルオイル）システイン酸、Ｎ−（ｐ−トルオイル）システイン酸、Ｎ−（ｐ−メトキシベンゾイル）システイン酸、Ｎ−（４−フェニルベンゾイル）システイン酸、Ｎ−（ｐ−トルオイル）ホモシステイン酸、はＷＯ２０１１−０８７００６号パンフレットに、Ｎ−ベンゾイル−セリン、Ｎ−（ｐ−メチルベンゾイル）セリン、Ｎ−（ｐ−エチルベンゾイル）セリン、Ｎ−（ｐ−メトキシベンゾイル）セリン、Ｎ−（ｐ−フルオロベンゾイル）セリン、Ｎ−（ｐ−トリフルオロメチルベンゾイル）セリン、Ｎ−（２−ナフトイル）セリン、Ｎ−（４−フェニルベンゾイル）セリン、Ｎ−（ｐ−メチルベンゾイル）セリン メチルエステル、Ｎ−（ｐ−メチルベンゾイル）セリン エチルエステル、Ｎ−（２−ナフトイル）セリン メチルエステル、Ｎ−ベンゾイル−Ｏ−メチルセリン、Ｎ−（ｐ−メチルベンゾイル）−Ｏ−メチルセリン、Ｎ−（ｐ−メチルベンゾイル）−Ｏ−アセチルセリン、Ｎ−（２−ナフトイル）−Ｏ−メチルセリン等はＷＯ２０１１／０７４６４３号パンフレットに、それぞれその合成方法が公開されているので、該開示に従い合成することができる。
化粧料における美白成分の含有量は、通常０．００１〜１０質量％であり、０．０１〜１０質量％が好ましく、０．１〜５質量％がより好ましい。

本発明の抗菌剤に加え、更にシワ改善成分を含有することができる。シワ改善成分としては、一般的に化粧料に用いられているものであれば特に限定はない。例えば、ビタミンＡ又はその誘導体が、レチノ−ル、レチナ−ル、レチノイン酸、トレチノイン、イソトレチノイン、レチノイン酸トコフェロ−ル、パルミチン酸レチノ−ル、酢酸レチノ−ルやウルソ−ル酸ベンジルエステル、ウルソール酸リン酸エステル、ベツリン酸ベンジルエステル、ベンジル酸リン酸エステルが挙げられる。化粧料におけるシワ改善成分の含有量は、通常０．０１〜３０質量％であり、０．１〜１０質量％が好ましく、１〜５質量％がより好ましい。

動植物由来の抽出物としては、一般的に医薬品、化粧料、食品等に用いられているものであれば特に限定はない。例えば、アケビエキス、アスナロエキス、アスパラガスエキス、アボガドエキス、アマチャエキス、アーモンドエキス、アルニカエキス、アロエエキス、アロニアエキス、アンズエキス、イチョウエキス、インドキノエキス、ウイキョウエキス、ウドエキス、エイジツエキス、エゾウコギエキス、エンメイソウエキス、オウゴンエキス、オウレンエキス、オタネニンジンエキス、オトギリソウエキス、オドリコソウエキス、オレンジエキス、カキョクエキス、カッコンエキス、カモミラエキス、カロットエキス、カワラヨモギエキス、カンゾウエキス、キウイエキス、キューカンバーエキス、グアバエキス、クジンエキス、クマザサエキス、クララエキス、クルミエキス、グレープフルーツエキス、黒米エキス、クロレラエキス、クワエキス、ケイケットウエキス、ゲットウヨウエキス、ゲンチアナエキス、ゲンノショウコエキス、紅茶エキス、ゴボウエキス、コメエキス、コメ発酵エキス、コメヌカ発酵エキス、コメ胚芽油、コケモモエキス、サルビアエキス、サボンソウエキス、ササエキス、サンザシエキス、サンシャエキス、サンショウエキス、シイタケエキス、ジオウエキス、シソエキス、シナノキエキス、シモツケソウエキス、シャクヤクエキス、ショウキョウエキス、ショウブ根エキス、シラカバエキス、スギナエキス、ステビアエキス、ステビア発酵物、セイヨウキズタエキス、セイヨウサンザシエキス、セイヨウニワトコエキス、セイヨウノコギリソウエキス、セイヨウハッカエキス、セージエキス、ゼニアオイエキス、センキュウエキス、センブリエキス、ソウハクヒエキス、ダイオウエキス、ダイズエキス、タイソウエキス、タイムエキス、タンポポエキス、チョウジエキス、チンピエキス、甜茶エキス、トウガラシエキス、トウキエキス、トウキンセンカエキス、トウニンエキス、トウヒエキス、ドクダミエキス、トマトエキス、納豆エキス、ニンジンエキス、ニンニクエキス、ノバラエキス、ハイビスカスエキス、バクモンドウエキス、ハスエキス、ハス胚芽エキス、パセリエキス、バーチエキス、ハマメリスエキス、ヒキオコシエキス、ヒノキエキス、フキタンポポエキス、フキノトウエキス、ブクリョウエキス、ブッチャーブルームエキス、ブドウエキス、ブドウ種子エキス、ヘチマエキス、ベニバナエキス、ペパーミントエキス、ボダイジュエキス、ボタンエキス、ホップエキス、マツエキス、マロニエエキス、ミズバショウエキス、ムクロジエキス、メリッサエキス、モズクエキス、モモエキス、ヤグルマギクエキス、ユーカリエキス、ユキノシタエキス、ユズエキス、ユリエキス、ヨクイニンエキス、ヨモギエキス、ラベンダーエキス、リンゴエキス、ルイボス茶エキス、レイシエキス、レタスエキス、レモンエキス、レンギョウエキス、レンゲソウエキス、ローズエキス、ローズマリーエキス、ローマカミツレエキス、ローヤルゼリーエキス、ワレモコウエキス等のエキスが好ましいものとして挙げられる。なお、本発明の選択方法において選択された抗菌剤が植物抽出物であった場合、上記植物リスティングされた植物抽出物と重畳的に含有させてもよい。化粧料中における動植物由来抽出物の含有量は、通常０．０００１〜３０質量％であり、０．００１〜１０質量％が好ましく、０．０１〜５質量％がより好ましい。

抗炎症成分としては、クラリノン、グラブリジン、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸、パントテニルアルコール等が挙げられ、好ましくは、グリチルリチン酸及びその塩、グリチルレチン酸アルキル及びその塩、並びに、グリチルレチン酸及びその塩である。
化粧料中における抗炎症成分の含有量は、通常０．０１〜３０質量％であり、０．１〜１０質量％が好ましく、１〜５質量％がより好ましい。

油性成分としては、極性油、揮発性炭化水素油等が挙げられる。
極性油としては、合成エステル油として、ミリスチン酸イソプロピル、オクタン酸セチル、ミリスチン酸オクチルドデシル、パルミチン酸イソプロピル、ステアリン酸ブチル、ラウリン酸ヘキシル、ミリスチン酸ミリスチル、オレイン酸デシル、オレイン酸オクチルドデシル、ジメチルオクタン酸ヘキシルデシル、乳酸セチル、乳酸ミリスチル、酢酸ラノリン、ステアリン酸イソセチル、イソステアリン酸イソセチル、１２−ヒドロキシステアリル酸コレステリル、ジ−２−エチルヘキシル酸エチレングリコール、ジペンタエリスリトール脂肪酸エステル、モノイソステアリン酸Ｎ−アルキルグリコール、ジカプリン酸ネオペンチルグリコール、リンゴ酸ジイソステアリル、ジ−２−ヘプチルウンデカン酸グリセリン、トリ−２−エチルヘキシル酸トリメチロールプロパン、トリイソステアリン酸トリメチロールプロパン、テトラ−２−エチルヘキシル酸ペンタンエリスリトール、トリ−２−エチルヘキシル酸グリセリン、トリイソステアリン酸トリメチロールプロパンを挙げることができる。

さらに、セチル２−エチルヘキサノエート、２−エチルヘキシルパルミテート、トリミリスチン酸グリセリン、トリ−２−ヘプチルウンデカン酸グリセライド、ヒマシ油脂肪酸メチルエステル、オレイン酸オイル、セトステアリルアルコール、オレイルアルコール、ステアリルアルコール、オクチルドデカノール、アセトグリセライド、パルミチン酸２−ヘプチルウンデシル、アジピン酸ジイソブチル、Ｎ−ラウロイル−Ｌ−グルタミン酸−２−オクチルドデシルエステル、アジピン酸ジ−２−ヘプチルウンデシル、エチルラウレート、セバチン酸ジ−２−エチルヘキシル、ミリスチン酸２−ヘキシルデシル、パルミチン酸２−ヘキシルデシル、アジピン酸２−ヘキシルデシル、セバチン酸ジイソプロピル、コハク酸２−エチルヘキシル、酢酸エチル、酢酸ブチル、酢酸アミル、クエン酸トリエチル、オクチル メトキシシンナメート等も挙げられる。

また、天然油として、アボガド油、アマニ油、エノ油、オリーブ油、カヤ油、牛脂、ゴマ油、小麦胚芽油、コメヌカ油、サザンカ油、サフラワー油、スクワラン、大豆油、茶実油、ツバキ油、シナギリ油、タートル油、ナタネ油、トウモロコシ油、胚芽油、パーシック油、ヒマシ油、ホホバ油、日本キリ油、マカデミアナッツ油、ミンク油、綿実油、椰子油、落花生油、卵黄油、カルナウバワックス、トリグリセリン、トリオクタン酸グリセリン、トリイソパルミチン酸グリセリン等が挙げられる。

炭化水素油としては、例えば、直鎖状又は分岐状の炭化水素油が挙げられ、揮発性の炭化水素油であっても不揮発性の炭化水素油であってもよい。炭化水素油の具体例としては、合成スクワラン、植物性スクワラン、スクワレン、流動イソパラフィン、軽質イソパラフィン、水添ポリイソブテン、イソドデカン、ステアリン酸、軽質流動イソパラフィン、イソヘキサデカン、流動パラフィン、プリスタン、α−オレフィンオリゴマー、オゾケライト、セレシン、パラフィン、パラフィンワックス、ポリエチレンワックス、ポリエチレン・ポリプロピレンワックス、（エチレン／プロピレン／スチレン）コポリマー、（ブチレン／プロピレン／スチレン）コポリマー、ポリイソブチレン、マイクロクリスタリンワックス、ワセリン等が挙げられる。

界面活性剤としては、脂肪酸セッケン（ラウリン酸ナトリウム、パルミチン酸ナトリウム等）、ラウリル硫酸カリウム、アルキル硫酸トリエタノールアミンエーテル、スルホコハク酸エステルやポリオキシエチレンアルキル硫酸ナトリウム等のアニオン界面活性剤類、塩化ステアリルトリメチルアンモニウム、塩化ベンザルコニウム、ラウリルアミンオキサイド、ジアルキルアンモニウム塩等のカチオン界面活性剤類、ベタイン系界面活性剤（アルキルベタイン、アミドベタイン、スルホベタイン等）、イミダゾリン系両性界面活性剤（２−ココイル−２−イミダゾリニウムヒドロキサイド−１−カルボキシエチロキシ２ナトリウム塩等）、アシルメチルタウリン等の両性界面活性剤類、ソルビタン脂肪酸エステル類（ソルビタンモノステアレート、セスキオレイン酸ソルビタン等） 、グリセリン脂肪酸類（モノステアリン酸グリセリン等）、プロピレングリコール脂肪酸エステル類（モノステアリン酸プロピレングリコール等）、硬化ヒマシ油誘導体、グリセリンアルキルエーテル、ＰＯＥソルビタン脂肪酸エステル類（ＰＯＥソルビタンモノオレエート、モノステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン等）、ＰＯＥソルビット脂肪酸エステル類（ＰＯＥ−ソルビットモノラウレート等）、ＰＯＥグリセリン脂肪酸エステル類（ＰＯＥ−グリセリンモノイソステアレート等）、ＰＯＥ脂肪酸エステル類（ポリエチレングリコールモノオレート、ＰＯＥジステアレート等） 、ＰＯＥアルキルエーテル類（ＰＯＥ２−オクチルドデシルエーテル等）、ＰＯＥアルキルフェニルエーテル類（ＰＯＥノニルフェニルエーテル等）、プルロニック型類、ＰＯＥ・ＰＯＰアルキルエーテル類（ＰＯＥ・ＰＯＰ２−デシルテトラデシルエーテル等）、テトロニック類、ＰＯＥヒマシ油・硬化ヒマシ油誘導体（ＰＯＥヒマシ油、ＰＯＥ硬化ヒマシ油等）、ショ糖脂肪酸エステル、アルキルグルコシド等の非イオン界面活性剤類、等が挙げられる。

多価アルコールとしては、ポリエチレングリコール、グリセリン、１，３−ブタンジオール、エリスリトール、ソルビトール、キシリトール、マルチトール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、ジグリセリン、イソプレングリコール、１，２−ペンタンジオール、２，４−ヘキシレングリコール、１，２−ヘキサンジオール、１，２−オクタンジオール等が挙げられる。

増粘剤としては、グアガム、クインスシード、カラギーナン、ガラクタン、アラビアガム、ペクチン、マンナン、デンプン、キサンタンガム、カードラン、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、メチルヒドロキシプロピルセルロース、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、グリコーゲン、ヘパラン硫酸、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸ナトリウム、トラガントガム、ケラタン硫酸、コンドロイチン、ムコイチン硫酸、ヒドロキシエチルグアガム、カルボキシメチルグアガム、デキストラン、ケラト硫酸、ローカストビーンガム、サクシノグルカン、カロニン酸，キチン、キトサン、カルボキシメチルキチン、寒天、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アルキル変性カルボキシビニルポリマー、ポリアクリル酸ナトリウム、ポリエチレングリコール、ベントナイト等が挙げられる。

粉体類としては、表面を処理されていても良い、マイカ、タルク、カオリン、合成雲母、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、無水ケイ酸（シリカ）、酸化アルミニウム、硫酸バリウム等の粉体類、表面を処理されていても良い、ベンガラ、黄酸化鉄、黒酸化鉄、酸化コバルト、群青、紺青、酸化チタン、酸化亜鉛の無機顔料類、表面を処理されていても良い、雲母チタン、魚燐箔、オキシ塩化ビスマス等のパール剤類、レーキ化されていても良い赤色２０２号、赤色２２８号、赤色２２６号、黄色４号、青色４０４号、黄色５号、赤色５０５号、赤色２３０号、赤色２２３号、橙色２０１号、赤色２１３号、黄色２０４号、黄色２０３号、青色１号、緑色２０１号、紫色２０１号、赤色２０４号等の有機色素類、ポリエチレン末、ポリメタクリル酸メチル、ナイロン粉末、オルガノポリシロキサンエラストマー等の有機粉体類、が挙げられる。

紫外線吸収剤としては、パラアミノ安息香酸系紫外線吸収剤、アントラニル酸系紫外線吸収剤、サリチル酸系紫外線吸収剤、桂皮酸系紫外線吸収剤、ベンゾフェノン系紫外線吸収剤、糖系紫外線吸収剤、２−（２'−ヒドロキシ−５'−ｔ−オクチルフェニル)ベンゾトリアゾール、４−メトキシ−４'−ｔ−ブチルジベンゾイルメタン等の紫外線吸収剤類、等が挙げられる。

また、化粧料として適用される場合の剤型は、通常知られているローション剤形、乳液剤形、エッセンス剤形、クリーム剤形、粉体含有剤形の何れをも取ることが出来る。

本発明に係る皮膚外用剤は、本発明の抗菌剤と任意成分を定法により処理することにより調製することができる。
以下に実施例を挙げて本発明について詳細に説明を加えるが、本発明はかかる実施例にのみ限定されないことは言うまでもない。

（製造例１： 本発明の抗菌剤を含有する皮膚外用剤の製造（ローション））
以下の手順に従い、抗菌剤を含有する皮膚外用剤を調製した。
即ち、表１の処方成分を５０℃にて加熱溶解し、本発明に係る皮膚外用剤１を得た。

（製造例２： 本発明の抗菌剤を含有する皮膚外用剤の製造（エッセンス））
以下の手順に従い、抗菌剤を含有する皮膚外用剤を調製した。
即ち、表１の処方成分を５０℃にて加熱溶解し、本発明に係る皮膚外用剤２を得た。

（試験例１ ｈＢＤ−３ｍRNA発現量の測定）
正常ヒト表皮角化細胞を２４穴プレートに６．０×１０^４cells/well播種し、０．１５mM-Ca含有培地（humedia-KG2、倉敷紡績株式会社）にて３７℃、５％ＣＯ_２条件下で培養した。培養３日後、フェノールレッド、BPE、コルチゾールを除いた１．４５mM-Ca含有Humedia-KG２培地に培地交換した。プロゲステロンおよびシコンエキスを添加（α）、若しくはプロゲステロンのみを添加（β）し、さらに３日間培養した。培養終了後、細胞を回収し、RNeasy Mini Kit (QIAGEN社) を用いてトータルRNAを抽出し、得られたトータルRNAからSuperScript VILO cDNA Synthesis Kit (invitrogen社) を用いてcDNAを合成した。合成したcDNAをテンプレートとしてQuantiFast SYBR Green PCR kit (QIAGEN社) を用いてリアルタイムPCRを行い、検量線法によりｈＢＤ−３ｍRNA発現量を相対定量した。このとき、18S rRNAを内在性コントロールとし、初期遺伝子量を補正した。また、コントロールとして、プロゲステロン、シコンエキスともに添加しない場合のｈＢＤ−３ mRNA発現量を測定し、以下の式（１）よりプロゲステロンによるｈＢＤ−３ｍRNA発現量低下を改善の程度を評価した。結果を表３、図1に示す。

式（１）（α−β）／（γ−β）×100（％）αはプロゲステロン及び被験物質を添加した時のｈＢＤ−３ mRNA発現量βはプロゲステロンを添加した時のｈＢＤ−３ mRNA発現量
γはプロゲステロン及び被験物質を添加しない時のｈＢＤ−３ mRNA発現量

コントロールのｈＢＤ−３ｍRNA発現量を１００としたときのα、βの相対量を示した。

図１、表３の結果より、プロゲステロン添加によりｈＢＤ−３ mRNA発現量が低下するが、そのプロゲステロンによるｈＢＤ−３ mRNAの低下をシコンエキスは抑制する効果があることが認められた。

（試験例２ P.acnes生菌数の測定）
P. acnes (ＡＴＣＣ6919) をＧＡＭ液体培地（日水製薬）にて３日間培養した。１×１０^６CFU/mLになるように20 mMリン酸バッファー（pH6.5、100 nM NaCl含有）に懸濁したP. acnesを96ウェルプレートに播種し、そこにｈＢＤ−１、ｈＢＤ−２、ｈＢＤ−３、ｈＢＤ−４をそれぞれ最終濃度１０μg/mLになるように添加した。３７℃、嫌気性条件下で５時間インキュベートした後、培養液をＧＡＭ寒天培地（日水製薬）に播種して３７℃、嫌気性条件下で３日間培養し、コロニー数をカウントし、P. acnesの生菌数を評価した。結果を図２に示す。

図２の結果より、抗菌ペプチドであるｈＢＤ−１、ｈＢＤ−２、ｈＢＤ−４ではアクネ菌であるP. acnesに対する抗菌作用は認められなかったが、ｈＢＤ−３ではポジティブコントロールである塩化ベンザルコニウムと同程度に、アクネ菌であるP.acnesに対する強い抗菌作用が認められた。

本発明によれば、ｈＢＤ−３ｍRNA発現量の低下を改善する抗菌剤を提供することができる。

Claims (6)

1. 正常ヒト表皮角化細胞の培養系において、被験物質とプロゲステロンの存在下における抗菌ペプチドの発現量と、プロゲステロンのみの存在下における抗菌ペプチドの発現量とを測定し、前記の被験物質とプロゲステロンの存在下における抗菌ペプチドの発現量がプロゲステロンのみの存在下における抗菌ペプチドの発現量を上回った場合に、該被験物質を抗菌剤として選択することを特徴とする、抗菌剤の選択方法。
2. 前記抗菌ペプチドがｈＢＤ−３である、請求項１に記載の抗菌剤の選択方法。
3. 前記抗菌ペプチドの発現量がｈＢＤ−３ mRNAの発現量であることを特徴とする、請求項１に記載の抗菌剤の選択方法。
4. 正常ヒト表皮角化細胞の培養系において、被験物質とプロゲステロンの存在下における抗菌ペプチドの発現量（α）と、プロゲステロンのみの存在下における抗菌ペプチドの発現量（β）と、コントロールとして、被験物質とプロゲステロンを加えない時の抗菌ペプチドの発現量（γ）とを用い、以下の式（１）より算出された値が、５０％以上である時に、被験物質を抗菌剤として選択することを特徴とする、抗菌剤の選択方法。
   式（１）（α−β）／（γ−β）×100（％）
5. アクネ菌（Propionibacterium acnes:P. acnes）に対する抗菌作用を示す抗菌剤である請求項１〜４に記載の抗菌剤の選択方法。
6. 請求項１〜５記載の選択方法により選ばれた抗菌剤

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