JP6614566B2 - 皮膚老化抑制素材のスクリーニング方法、及び皮膚老化抑制方法 - Google Patents

Description

本発明は、皮膚老化抑制素材をスクリーニングする方法、及び該スクリーニングにより得られた素材を含む皮膚老化抑制組成物を摂取するステップを含む皮膚老化抑制方法、に関する。

肌のしわ形成予防、肌のたるみの形成予防等、いわゆる皮膚老化抑制に関する研究が進められている。例えば、皮膚真皮の構成成分であるエラスチンやコラーゲンは、肌の張りや弾力を保つ働きをするところ、エラスターゼやＭＭＰ−１といったこれらの成分を分解する酵素が加齢や紫外線などにより過剰に誘導されることで、真皮においてエラスチンやコラーゲンの分解が進み、皮膚老化の原因となることが知られている（非特許文献１〜３参照）。

他方、タンパク質をコードしていない塩基数２００ｎｔ以上のＲＮＡであるＬｎｃＲＮＡが知られており、ＬｎｃＲＮＡは８２００種ほど存在すると予想されているが（非特許文献４参照）、その機能は現在のところあまり解明されていない。
ＬｎｃＲＮＡに関しては、近年、若齢および老齢ドナー５名ずつの前腕内側から皮膚を採取し、発現量を比較したところ、いくつかのＬｎｃＲＮＡの量が加齢により変化していたことが報告されている（非特許文献５参照）。

Takeuchi H. et al., J. Dermatol. Sci. (2010), 60, 151-158 Tsuji N. et al., Photochem. Photobiol. (2001) 74(2), 283-290 Matsuda M. et al., J. Invest Dermatol. (2012) online (doi: 10.1038/jid.2012.383) Moran N. Cabili et al. (2011) Integrative annotation of human large intergenic noncoding RNAs reveals global properties and specific subclass. GENES & DEVELOPMENT, Online. Chang ALS. et al. (2012) Rejuvenation of Gene Expression Pattern of Aged Human Skin by Broadband Light Treatment: A Pilot Study. J. Invest. Dermatol. 287, online

本発明では、ＬｎｃＲＮＡを用いて、皮膚老化抑制素材をスクリーニングする新たな方法を提供することを課題とする。

本発明者らはＬｎｃＲＮＡについて研究を進め、加齢に伴い発現量が変動する特定のＬｎｃＲＮＡが、皮膚老化に関係する因子の発現量に影響を及ぼすことを見出した。そして当該知見をもとに、特定のＬｎｃＲＮＡを指標とすることで、皮膚の老化を抑制する効果を有する素材をスクリーニングできることに想到した。
すなわち本発明は、加齢に伴い発現量が変動するＬｎｃＲＮＡを選定するステップ、及び
被験物質を添加した細胞での前記ＬｎｃＲＮＡの発現量が、被験物質を添加しなかった細胞における前記ＬｎｃＲＮＡの発現量と比較して変化した被験物質を選択するステップ
、
を含む、皮膚老化抑制素材のスクリーニング方法である。

また、本発明の別の態様は、上記スクリーニング方法により得られた皮膚老化抑制素材を含む皮膚老化抑制組成物を調製するステップ、及び
調製された皮膚老化抑制組成物を摂取するステップ、を含む皮膚老化抑制方法である（但し、医療行為を除く）。

本発明により、ＬｎｃＲＮＡを指標とした、新たな皮膚老化抑制素材のスクリーニング法が提供される。

実験２で用いた、Ｘ−ｇａｌを加えることで呈色反応を起こすことによる、老化の抑制または促進に関与するＬｎｃＲＮＡの存在を示す図である（図面代用写真）。 実験２において、呈色反応を示す細胞数をカウントした結果を示すグラフである。 加齢に伴い量が変動するＬｎｃＲＮＡの老化関連因子への影響を示すグラフである。

以下、本発明について、具体的に行った実験を示して説明するが、本発明が具体的な実施態様にのみ限定されないことはいうまでもない。

＜実験１：加齢に伴い量が変動するＬｎｃＲＮＡ＞
若齢由来（２０代）および老齢由来（６０〜７０代）の正常ヒト皮膚線維芽細胞を、２４穴プレ−ト（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ社製）に４５０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになる様に播種し、１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ（ＦＢＳ：ハナ・ネスコバイオ社製、ＤＭＥＭ：シグマアルドリッチ社製）で２４時間培養した。ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いＲＮＡを抽出し、ＮａｎｏＤｒｏｐ（ＬＭＳ社製）およびＢｉｏａｎａｌｙｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）にてＲＮＡ純度を測定した。得られたＲＮＡをＬｏｗ Ｉｎｐｕｔ Ｑｕｉｃｋ Ａｍｐ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（1色用）（アジレント社製）を用いてラベル化ｃＲＮＡに変換し、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（アジレント社製）によりＳｕｒｅＰｒｉｎｔ Ｇ３ Ｈｕｍａｎ ＧＥ ８ｘ６０Ｋ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ（アジレント社）にハイブリダイズさせ、発現量を測定した。結果を表１に示す。表１の結果より、加齢に伴って量が変化するＬｎｃＲＮＡが存在することがわかる。

本実施態様に係るスクリーニング法では、加齢に伴い発現量が変動するＬｎｃＲＮＡを選定するステップを有し、上記表１中から１種以上のＬｎｃＲＮＡを選定することができる。
また、上記表１以外のＬｎｃＲＮＡであっても、実験１と同様の方法、または実験１に準ずる方法により加齢に伴い発現量が変動するＬｎｃＲＮＡであると判別されたものを、本ステップで選定してもよい。

加齢に伴う発現量の変動は、その程度は特段限定されず、発現量の正の変化では、通常１０歳以上の加齢幅において、好ましくは２０歳以上の加齢幅において、より好ましくは３０歳以上の加齢幅において、通常１０％以上の発現量の増加があり、好ましくは２０％以上の発現量の増加があり、より好ましくは３０％以上の発現量の増加がある。また、５０％以上の発現量の増加があってもよく、１００％以上の発現量の増加があってもよく、２００％以上の発現量の増加があってもよい。
また、発現量の負の変化では、通常１０歳以上の加齢幅において、好ましくは２０歳以上の加齢幅において、より好ましくは３０歳以上の加齢幅において、通常１０％以上の発現量の減少であり、好ましくは２０％以上の発現量の減少があり、より好ましくは３０％以上の発現量の減少がある。また、５０％以上の発現量の減少があってもよく、６０％以上の発現量の減少があってもよく、７０％以上の発現量の減少があってもよい。好ましいＬｎｃＲＮＡとしては、NESPAS、HOTAIR、FLJ46906、SNHG5、LOC100292680、及びIPWからなる群から選択される１種以上を含む。

＜実験２：加齢に伴い発現量が変動するＬｎｃＲＮＡの老化への影響評価＞
正常ヒト皮膚線維芽細胞を、２４穴プレ−ト（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ社製）に３００００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになる様に播種し、１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ（ＦＢＳ：ハナ・ネスコバイオ社製、ＤＭＥＭ：シグマアルドリッチ社製）で２４時間培養した。次いで該ＬｎｃＲＮＡに対するｓｉＲＮＡ（キアゲン社製、配列非公開）をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ２０００（ライフテクノロジーズ製）を用いてトランスフェクションした。なお、コントロールとしてＡｌｌｓｔａｒ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ（キアゲン社製）を同手法にてトランスフェクションした細胞も用意し、それぞれ所定時間（２４〜１２０時間）培養した。
ここで、細胞老化に伴い、細胞内のＳｅｎｅｓｃｅｎｃｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ β-Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ活性が上昇することが知られており、老化状態の評価としてＳｅｎｅｓｃｅｎｃｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄβ-Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅの基質で
あるＸ−ｇａｌを加えることで呈色反応を起こす方法が広く知られている。本実験でもこの手法を用い、Ｘ−ｇａｌを加えた後に位相差顕微鏡で細胞を観察し、撮像した結果を図１に示す。また、撮影像内の全細胞数に対する呈色細胞のパーセンテージをカウントし、
それを３回繰り返した時の平均を図２に示す。
図１では、Ｘ−ｇａｌを培養後に得られた細胞に添加することで、細胞が呈色反応を示しており、図２では、有意差を持って呈色細胞数が増加していることを示している。このことは細胞内Ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ β-Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ活性の上昇を示唆している。よって、老化の抑制または促進に関与するＬｎｃＲＮＡが存在することが理解できる。

また、同様に培養した細胞からＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いＴｏｔａｌＲＮＡを抽出し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＶＩＬＯ ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ライフテクノロジーズ製、配列非公開）を用いてｃＤＮＡを合成し、Ｓｔｅｐ Ｏｎｅ Ｐｌｕｓ（ライフテクノロジーズ製）にてＭＭＰ−１、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−９、Ｅｌａｓｔｉｎ、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８プライマー（キアゲン社製、配列非公開）を用いてｍＲＮＡの発現量を解析した。図３にその結果を示す。図３から、老化の抑制または促進に関与するＬｎｃＲＮＡが存在することが理解できる。

本実施態様に係るスクリーニング法は、被験物質を添加した細胞でのＬｎｃＲＮＡの発現量が、被験物質を添加しなかった細胞におけるＬｎｃＲＮＡの発現量と比較して変化した被験物質を選択するステップを有する。
発現量の変化は、選択するＬｎｃＲＮＡの種類によりＬｎｃＲＮＡの発現抑制であってもよく、発現亢進であってもよい。当業者は、上記実験２の結果、及び実験２に準じた実験の結果に基づき、発現量の変化がＬｎｃＲＮＡの発現抑制であるかＬｎｃＲＮＡの発現亢進であるか判断できる。
具体的に例示すると、ＬｎｃＲＮＡの発現量が被検物質を添加しなかった細胞に対して８０％未満の場合には、上記ステップにおける発現量の変化が発現抑制である。
ＬｎｃＲＮＡの発現量が被検物質を添加しなかった細胞に対して１２０％以上の場合には、上記ステップにおける発現量の変化が発現亢進である。

本発明のスクリーニング方法が対象とする被験物質は、純物質、動植物由来の抽出物、又はそれらの混合物等のいずれであってもよい。
動植物由来の抽出物は、動物又は植物由来の抽出物自体のみならず、抽出物の画分、精製した画分、抽出物乃至は画分、精製物の溶媒除去物の総称を意味するものとし、植物由来の抽出物は、自生若しくは生育された植物、漢方生薬原料等として販売されるものを用いた抽出物、市販されている抽出物等が挙げられる。
抽出操作は、植物部位の全草を用いるほか、植物体、地上部、根茎部、木幹部、葉部、茎部、花穂、花蕾等の部位を使用することできるが、予めこれらを粉砕あるいは細切して抽出効率を向上させることが好ましい。抽出溶媒としては、水、エタノール、イソプロピルアルコール、ブタノールなどのアルコール類、１，３−ブタンジオール、ポリプロピレングリコールなどの多価アルコール類、アセトン、メチルエチルケトンなどのケトン類、ジエチルエーテル、テトラヒドロフランなどのエーテル類等の極性溶媒から選択される１種乃至は２種以上が好適なものとして例示することができる。具体的な抽出方法としては、例えば、植物体等の抽出に用いる部位乃至はその乾燥物１質量に対して、溶媒を１〜３０質量部加え、室温であれば数日間、沸点付近の温度であれば数時間浸漬し、室温まで冷却し後、所望により不溶物及び／又は溶媒除去し、カラムクロマトグラフィー等で分画精製する方法が挙げられる。

本発明のスクリーニング方法によりスクリーニングした皮膚老化抑制素材は、シワ防止効果、たるみ防止効果、シミ形成防止効果、くすみ防止効果から選択される１種以上の効果を奏し、後述するように化粧料、医薬部外品、食品などに配合されることで、アンチエージング効果を奏する。

本発明の別の実施態様は、上記スクリーニング方法により得られた皮膚老化抑制素材を含む皮膚老化抑制組成物を調製するステップ、及び調製された皮膚老化抑制組成物を摂取するステップ、を含む皮膚老化抑制方法である。ただし、本実施態様は、医療行為を除くものである。

皮膚老化抑制組成物は、化粧料、医薬部外品、食品等として適用され、化粧料の場合には肌に化粧料を塗布することで皮膚老化抑制組成物の摂取を行い、食品の場合には、経口により摂取する。
本実施態様における、皮膚老化抑制組成物中の皮膚老化抑制素材の含有量（配合量）は、通常、０．００００１質量％以上、好ましくは０．０００１質量％以上、より好ましくは０．００１質量％以上であり、通常８０質量％以下、好ましくは３０質量％以下、より好ましくは１０質量％である。上記範囲とすることで、好適にアンチエージング効果を奏する皮膚老化防止組成物とすることができる。
また、皮膚老化防止組成物に含有させる皮膚老化抑制素材の種類は、１種類のみでなく２種類以上であってもよい。

皮膚老化抑制組成物は、化粧品、医薬部外品、食品に適用することが可能であり、それぞれの用途に応じて、適宜必要な成分を含有させることができる。
このうち、特に化粧料に適用させることが好ましい。
化粧料に適用される場合、通常化粧料に使用される成分を広く配合することが可能であり、また、その剤形や用途についても、何ら限定されない。以下、化粧料に適用される場合、化粧料中に含有させることができる成分について説明する。

有効成分としては、美白成分、シワ改善成分、抗炎症成分、動植物由来の抽出物等が挙げられる。なお、上記説明した本発明の実施態様に係る皮膚老化抑制素材と重複して配合してもよい。
美白成分としては、一般的に化粧料に用いられているものであれば特に限定はない。例えば、４−ｎ−ブチルレゾルシノール、アスコルビン酸グルコシド、３−О−エチルアスコルビン酸、トラネキサム酸、アルブチン、１−トリフェニルメチルピペリジン、１−トリフェニルメチルピロリジン、２−（トリフェニルメチルオキシ）エタノール、２−（トリフェニルメチルアミノ）エタノール、２−（トリフェニルメチルオキシ）エチルアミン、トリフェニルメチルアミン、トリフェニルメタノール、トリフェニルメタン及びアミノジフェニルメタン、Ｎ−（p−トルイル）システイン酸、Ｎ−（p−メトキシベンゾイル）システイン酸等が挙げられる。更にその他の美白成分として、Ｎ−ベンゾイル−セリン、Ｎ−（ｐ−メチルベンゾイル）セリン、Ｎ−（ｐ−エチルベンゾイル）セリン、Ｎ−（ｐ−メトキシベンゾイル）セリン、Ｎ−（ｐ−フルオロベンゾイル）セリン、Ｎ−（ｐ−トリフルオロメチルベンゾイル）セリン、Ｎ−（２−ナフトイル）セリン、Ｎ−（４−フェニルベンゾイル）セリン、Ｎ−（ｐ−メチルベンゾイル）セリン メチルエステル、Ｎ−（ｐ−メチルベンゾイル）セリン エチルエステル、Ｎ−（２−ナフトイル）セリン メチルエステル、Ｎ−ベンゾイル−Ｏ−メチルセリン、Ｎ−（ｐ−メチルベンゾイル）−Ｏ−メチルセリン、Ｎ−（ｐ−メチルベンゾイル）−Ｏ−アセチルセリン、Ｎ−（２−ナフトイル）−Ｏ−メチルセリン等があげられる。
これらの美白成分は、既に市販されているものもあれば、合成により入手することもできる。例えば、３−О−エチルアスコルビン酸は、特開平８−１３４０５５号公報に記載の公知の方法で合成することが出来る。市販品（日本精化製「ＶＣエチル」）もあるので、これらを入手して使用することが可能である。１−トリフェニルメチルピペリジン、１−トリフェニルメチルピロリジン、２−（トリフェニルメチルオキシ）エタノール、２−（トリフェニルメチルアミノ）エタノール、２−（トリフェニルメチルオキシ）エチルアミン、トリフェニルメチルアミン、トリフェニルメタノール、トリフェニルメタン、アミノジフェニルメタンは特許文献ＷＯ２０１０／０７４０５２号パンフレットに、Ｎ−（ｏ
−トルオイル）システイン酸、Ｎ−（ｍ−トルオイル）システイン酸、Ｎ−（ｐ−トルオイル）システイン酸、Ｎ−（ｐ−メトキシベンゾイル）システイン酸、Ｎ−（４−フェニルベンゾイル）システイン酸、Ｎ−（ｐ−トルオイル）ホモシステイン酸、はＷＯ２０１１／０５８７３０号パンフレットに、Ｎ−ベンゾイル−セリン、Ｎ−（ｐ−メチルベンゾイル）セリン、Ｎ−（ｐ−エチルベンゾイル）セリン、Ｎ−（ｐ−メトキシベンゾイル）セリン、Ｎ−（ｐ−フルオロベンゾイル）セリン、Ｎ−（ｐ−トリフルオロメチルベンゾイル）セリン、Ｎ−（２−ナフトイル）セリン、Ｎ−（４−フェニルベンゾイル）セリン、Ｎ−（ｐ−メチルベンゾイル）セリン メチルエステル、Ｎ−（ｐ−メチルベンゾイル）セリン エチルエステル、Ｎ−（２−ナフトイル）セリン メチルエステル、Ｎ−ベンゾイル−Ｏ−メチルセリン、Ｎ−（ｐ−メチルベンゾイル）−Ｏ−メチルセリン、Ｎ−（ｐ−メチルベンゾイル）−Ｏ−アセチルセリン、Ｎ−（２−ナフトイル）−Ｏ−メチルセリン等はＷＯ２０１１／０７４６４３号パンフレットに、それぞれその合成方法が公開されているので、該開示に従い合成することができる。
化粧料における美白成分の含有量は、通常０．０１〜３０質量％であり、０．１〜１０質量％が好ましく、１〜５質量％がより好ましい。

シワ改善成分としては、一般的に化粧料に用いられているものであれば特に限定はない。例えば、ビタミンA又はその誘導体が、レチノール、レチナール、レチノイン酸、トレチノイン、イソトレチノイン、レチノイン酸トコフェロール、パルミチン酸レチノール、酢酸レチノールやウルソール酸ベンジルエステル、ウルソール酸リン酸エステル、ベツリン酸ベンジルエステル、ベンジル酸リン酸エステルが挙げられる。化粧料におけるシワ改善成分の含有量は、通常０．０１〜３０質量％であり、０．１〜１０質量％が好ましく、１〜５質量％がより好ましい。

動植物由来の抽出物としては、一般的に医薬品、化粧料、食品等に用いられているものであれば特に限定はない。例えば、アケビエキス、アスナロエキス、アスパラガスエキス、アボガドエキス、アマチャエキス、アーモンドエキス、アルニカエキス、アロエエキス、アロニアエキス、アンズエキス、イチョウエキス、インドキノエキス、ウイキョウエキス、ウドエキス、エイジツエキス、エゾウコギエキス、エンメイソウエキス、オウゴンエキス、オウバクエキス、オウレンエキス、オタネニンジンエキス、オトギリソウエキス、オドリコソウエキス、オレンジエキス、カキョクエキス、カッコンエキス、カモミラエキス、カロットエキス、カワラヨモギエキス、カンゾウエキス、キウイエキス、キューカンバーエキス、グアバエキス、クジンエキス、クチナシエキス、クマザサエキス、クララエキス、クルミエキス、グレープフルーツエキス、黒米エキス、クロレラエキス、クワエキス、ケイケットウエキス、ゲットウヨウエキス、ゲンチアナエキス、ゲンノショウコエキス、紅茶エキス、ゴボウエキス、コメエキス、コメ発酵エキス、コメヌカ発酵エキス、コメ胚芽油、コケモモエキス、サルビアエキス、サボンソウエキス、ササエキス、サンザシエキス、サンシャエキス、サンショウエキス、シイタケエキス、ジオウエキス、シコンエキス、シソエキス、シナノキエキス、シモツケソウエキス、シャクヤクエキス、ショウキョウエキス、ショウブ根エキス、シラカバエキス、スギナエキス、ステビアエキス、ステビア発酵物、セイヨウキズタエキス、セイヨウサンザシエキス、セイヨウニワトコエキス、セイヨウノコギリソウエキス、セイヨウハッカエキス、セージエキス、ゼニアオイエキス、センキュウエキス、センブリエキス、ソウハクヒエキス、ダイオウエキス、ダイズエキス、タイソウエキス、タイムエキス、タンポポエキス、茶エキス、チョウジエキス、チンピエキス、甜茶エキス、トウガラシエキス、トウキエキス、トウキンセンカエキス、トウニンエキス、トウヒエキス、ドクダミエキス、トマトエキス、納豆エキス、ニンジンエキス、ニンニクエキス、ノバラエキス、ハイビスカスエキス、バクモンドウエキス、ハスエキス、パセリエキス、バーチエキス、ハマメリスエキス、ヒキオコシエキス、ヒノキエキス、ビワエキス、フキタンポポエキス、フキノトウエキス、ブクリョウエキス、ブッチャーブルームエキス、ブドウエキス、ブドウ種子エキス、ヘチマエキス、ベニバナエキス
、ペパーミントエキス、ボダイジュエキス、ボタンエキス、ホップエキス、マツエキス、マロニエエキス、ミズバショウエキス、ムクロジエキス、メリッサエキス、モズクエキス、モモエキス、ヤグルマギクエキス、ユーカリエキス、ユキノシタエキス、ユズエキス、ユリエキス、ヨクイニンエキス、ヨモギエキス、ラベンダーエキス、緑茶エキス、リンゴエキス、ルイボス茶エキス、レイシエキス、レタスエキス、レモンエキス、レンギョウエキス、レンゲソウエキス、ローズエキス、ローズマリーエキス、ローマカミツレエキス、ローヤルゼリーエキス、ワレモコウエキス等のエキスが好ましいものとして挙げられる。
化粧料中における動植物由来抽出物の含有量は、通常０．０１〜３０質量％であり、０．１〜１０質量％が好ましく、１〜５質量％がより好ましい。
食品中における動植物抽出物の含有量は、通常０．０１〜８０質量％であり、０．１〜５０質量％が好ましく、１〜３０質量％がより好ましい。

抗炎症成分としては、クラリノン、グラブリジン、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸、パントテニルアルコール等が挙げられ、好ましくは、グリチルリチン酸及びその塩、グリチルレチン酸アルキル及びその塩、並びに、グリチルレチン酸及びその塩である。
化粧料中における抗炎症成分の含有量は、通常０．０１〜３０質量％であり、０．１〜１０質量％が好ましく、１〜５質量％がより好ましい。

油性成分としては、極性油、揮発性炭化水素油等が挙げられる。
極性油としては、合成エステル油として、ミリスチン酸イソプロピル、オクタン酸セチル、ミリスチン酸オクチルドデシル、パルミチン酸イソプロピル、ステアリン酸ブチル、ラウリン酸ヘキシル、ミリスチン酸ミリスチル、オレイン酸デシル、ジメチルオクタン酸ヘキシルデシル、乳酸セチル、乳酸ミリスチル、酢酸ラノリン、ステアリン酸イソセチル、イソステアリン酸イソセチル、１２−ヒドロキシステアリル酸コレステリル、ジ−２−エチルヘキシル酸エチレングリコール、ジペンタエリスリトール脂肪酸エステル、モノイソステアリン酸Ｎ−アルキルグリコール、ジカプリン酸ネオペンチルグリコール、リンゴ酸ジイソステアリル、ジ−２−ヘプチルウンデカン酸グリセリン、トリ−２−エチルヘキシル酸トリメチロールプロパン、トリイソステアリン酸トリメチロールプロパン、テトラ−２−エチルヘキシル酸ペンタンエリスリトール、トリ−２−エチルヘキシル酸グリセリン、トリイソステアリン酸トリメチロールプロパンを挙げることができる。

さらに、セチル２−エチルヘキサノエート、２−エチルヘキシルパルミテート、トリミリスチン酸グリセリン、トリ−２−ヘプチルウンデカン酸グリセライド、ヒマシ油脂肪酸メチルエステル、オレイン酸オイル、セトステアリルアルコール、アセトグリセライド、パルミチン酸２−ヘプチルウンデシル、アジピン酸ジイソブチル、Ｎ−ラウロイル−Ｌ−グルタミン酸−２−オクチルドデシルエステル、アジピン酸ジ−２−ヘプチルウンデシル、エチルラウレート、セバチン酸ジ−２−エチルヘキシル、ミリスチン酸２−ヘキシルデシル、パルミチン酸２−ヘキシルデシル、アジピン酸２−ヘキシルデシル、セバチン酸ジイソプロピル、コハク酸２−エチルヘキシル、酢酸エチル、酢酸ブチル、酢酸アミル、クエン酸トリエチル、オクチル メトキシシンナメート等も挙げられる。

また、天然油として、アボガド油、ツバキ油、タートル油、マカデミアナッツ油、トウモロコシ油、ミンク油、オリーブ油、ナタネ油、卵黄油、ゴマ油、パーシック油、小麦胚芽油、サザンカ油、ヒマシ油、アマニ油、サフラワー油、綿実油、エノ油、大豆油、落花生油、茶実油、カヤ油、コメヌカ油、シナギリ油、日本キリ油、ホホバ油、胚芽油、トリグリセリン、トリオクタン酸グリセリン、トリイソパルミチン酸グリセリン等が挙げられる。

揮発性炭化水素油としては、イソドデカン、イソヘキサデカン等が挙げられる。

界面活性剤としては、脂肪酸セッケン（ラウリン酸ナトリウム、パルミチン酸ナトリウム等）、ラウリル硫酸カリウム、アルキル硫酸トリエタノールアミンエーテル等のアニオン界面活性剤類、塩化ステアリルトリメチルアンモニウム、塩化ベンザルコニウム、ラウリルアミンオキサイド等のカチオン界面活性剤類、ベタイン系界面活性剤（アルキルベタイン、アミドベタイン、スルホベタイン等）、イミダゾリン系両性界面活性剤（２−ココイル−２−イミダゾリニウムヒドロキサイド−１−カルボキシエチロキシ２ナトリウム塩等）、アシルメチルタウリン等の両性界面活性剤類、ソルビタン脂肪酸エステル類（ソルビタンモノステアレート、セスキオレイン酸ソルビタン等） 、グリセリン脂肪酸類（モノステアリン酸グリセリン等）、プロピレングリコール脂肪酸エステル類（モノステアリン酸プロピレングリコール等）、硬化ヒマシ油誘導体、グリセリンアルキルエーテル、ＰＯＥソルビタン脂肪酸エステル類（ＰＯＥソルビタンモノオレエート、モノステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン等）、ＰＯＥソルビット脂肪酸エステル類（ＰＯＥ−ソルビットモノラウレート等）、ＰＯＥグリセリン脂肪酸エステル類（ＰＯＥ−グリセリンモノイソステアレート等）、ＰＯＥ脂肪酸エステル類（ポリエチレングリコールモノオレート、ＰＯＥジステアレート等） 、ＰＯＥアルキルエーテル類（ＰＯＥ２−オクチルドデシルエーテル等）、ＰＯＥアルキルフェニルエーテル類（ＰＯＥノニルフェニルエーテル等）、プルロニック型類、ＰＯＥ・ＰＯＰアルキルエーテル類（ＰＯＥ・ＰＯＰ２−デシルテトラデシルエーテル等）、テトロニック類、ＰＯＥヒマシ油・硬化ヒマシ油誘導体（ＰＯＥヒマシ油、ＰＯＥ硬化ヒマシ油等）、ショ糖脂肪酸エステル、アルキルグルコシド等の非イオン界面活性剤類、等が挙げられる。

多価アルコールとしては、ポリエチレングリコール、グリセリン、１，３−ブチレングリコール、エリスリトール、ソルビトール、キシリトール、マルチトール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、ジグリセリン、イソプレングリコール、１，２−ペンタンジオール、２，４−ヘキシレングリコール、１，２−ヘキサンジオール、１，２−オクタンジオール等が挙げられる。

増粘剤としては、グアガム、クインスシード、カラギーナン、ガラクタン、アラビアガム、ペクチン、マンナン、デンプン、キサンタンガム、カードラン、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、メチルヒドロキシプロピルセルロース、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、グリコーゲン、ヘパラン硫酸、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸ナトリウム、トラガントガム、ケラタン硫酸、コンドロイチン、ムコイチン硫酸、ヒドロキシエチルグアガム、カルボキシメチルグアガム、デキストラン、ケラト硫酸、ローカストビーンガム、サクシノグルカン、カロニン酸，キチン、キトサン、カルボキシメチルキチン、寒天、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アルキル変性カルボキシビニルポリマー、ポリアクリル酸ナトリウム、ポリエチレングリコール、ベントナイト等が挙げられる。

粉体類としては、表面を処理されていても良い、マイカ、タルク、カオリン、合成雲母、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、無水ケイ酸（シリカ）、酸化アルミニウム、硫酸バリウム等の粉体類、表面を処理されていても良い、ベンガラ、黄酸化鉄、黒酸化鉄、酸化コバルト、群青、紺青、酸化チタン、酸化亜鉛の無機顔料類、表面を処理されていても良い、雲母チタン、魚燐箔、オキシ塩化ビスマス等のパール剤類、レーキ化されていても良い赤色２０２号、赤色２２８号、赤色２２６号、黄色４号、青色４０４号、黄色５号、赤色５０５号、赤色２３０号、赤色２２３号、橙色２０１号、赤色２１３号、黄色２０４号、黄色２０３号、青色１号、緑色２０１号、紫色２０１号、赤色２０４号等の有機色素類、ポリエチレン末、ポリメタクリル酸メチル、ナイロン粉末、オルガノポリシロキサンエラストマー等の有機粉体類、が挙げられる。

紫外線吸収剤としては、パラアミノ安息香酸系紫外線吸収剤、アントラニル酸系紫外線
吸収剤、サリチル酸系紫外線吸収剤、桂皮酸系紫外線吸収剤、ベンゾフェノン系紫外線吸収剤、糖系紫外線吸収剤、２−（２'−ヒドロキシ−５'−ｔ−オクチルフェニル)ベンゾトリアゾール、４−メトキシ−４'−ｔ−ブチルジベンゾイルメタン等の紫外線吸収剤類
、等が挙げられる。

また、化粧料として適用される場合の剤型は、通常知られているローション剤形、乳液剤形、エッセンス剤形、クリーム剤形、粉体含有剤形の何れをも取ることが出来る。

以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は、その要旨を超えない限り、以下の実施例に限定されるものではない。

＜被験物質＞
本技術分野において、抗老化効果が既に知られている、ＹＡＣエキス（例えば特開２０１０−１３８１５２参照）、アマチャエキス（例えば特開２０１４−２１４１３９参照）、ヤグルマソウエキス（例えば、特開２００６−０２８０９９参照）、ＮＡＯエキス（「ファレロール」とも称する。例えばＷＯ２００７/０９４３８４参照）を被験物質として準備した。これらを表２に示す。なお、各エキスの濃度は、それぞれ、次の通りである。ＹＡＣエキス：特開２０１０−１３８１５２のアモルファス「分画７」として、１．０質量％（溶媒：３５％エタノール）。
アマチャエキス：特開２０１４−２１４１３９の製造例により得られた固形分の植物抽出物として、１．０質量％（溶媒：５５％エタノール）。
ヤグルマソウエキス：特開２００６−０２８０９９の製造例２により得られたアモルファスとして、１．０質量％（溶媒：５５％１、３ブチレングリコール）。
ＮＡＯエキス：ファレロールとして、０．０１質量％（溶媒：８５％１、３ブチレングリコール）。

＜実施例１＞
正常ヒト皮膚線維芽細胞を、２４穴プレ−ト（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ社製）に５００００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになる様に播種し、１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ（ＦＢＳ：ハナ・ネスコバイオ社製、ＤＭＥＭ：シグマアルドリッチ社製）で２４時間培養する。その後表２に示すそれぞれの被検物質を所定濃度にてそれぞれ０.５ｍL加え、さらに２４時間培養し、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いＴｏｔａｌＲＮＡを抽出し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＶＩＬＯ ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ライフテクノロジーズ製、配列非公開）を用いてｃＤＮＡを合成し、Ｓｔｅｐ Ｏｎｅ Ｐｌｕｓ（ライフテクノロジーズ製）にてＩＰＷのプライマー（キアゲン社製、配列非公開）を用いてＩＰＷの発現量を解析した。得られたＩＰＷの発現量と、被験物質を添加しなかったコントロールの発現量を比較し、その変化を確認した。
その結果、ＩＰＷの発現量が変化した被験物質を、皮膚老化抑制素材として選択した。結果を下記表３に示す。

＜実施例２〜５＞
実施例１のスクリーニング方法において、ＩＰＷの代わりに、それぞれＬｏｃ１００２９２６８０（実施例２）、ＳＮＨＧ５（実施例３）、ＨＯＴＡＩＲ（実施例４）、ＮＥＳＰＡＳ（実施例５）を用いて、同様のスクリーニングを行った。

なお、本発明のスクリーニング方法において、コントロールと比較して変化ありとの評価（表３中「○」）は、加齢により発現が抑制されるＬｎｃＲＮＡを用いた場合はコントロールに比べて発現量が１．２倍以上である場合をいう。又、加齢により発現が亢進されるＬｎｃＲＮＡを用いた場合はコントロールに比べて発現量が０．８倍以下である場合をいう。即ち、加齢により発現が抑制されるＬｎｃＲＮＡの発現量がコントロールの１．２倍未満である場合、又は加齢により発現が亢進されるＬｎｃＲＮＡの発現量がコントロールの０．８倍を超える場合には、コントロールと比較して変化なしとの評価（表３中「×」）がなされる。
実施例１〜３は加齢により発現が抑制されるＬｎｃＲＮＡを用いており（表１参照）、実施例４及び５は、加齢により発現が亢進されるＬｎｃＲＮＡを用いている（表１参照）。

＜被験物質の抗老化効果＞
前記特開２０１０−１３８１５２の実施例を参照すれば、ＹＡＣ化合物を配合した化粧料は、皮膚の紅斑抑制効果、即ち光損傷抑制効果を奏することが示されている。前記特開２０１４−２１４１３９の実施例を参照すれば、アマチャエキスを配合した皮膚外用剤はシワ改善効果を発揮することが示されている。特開２００６−２８０９９の実施例を参照すれば、ヤグルマソウエキスを配合した皮膚外用剤は、抗炎症効果を奏することが示されている。又、前記ＷＯ２００７/０９４３８４の実施例を参照すれば、ＮＡＯエキス（ファレロール）を含有する皮膚外用剤は、シワ改善効果を奏することが示されている。
従って、本発明のスクリーニング方法で皮膚老化抑制素材として選択されたものは、皮膚老化抑制効果を示すことが確認できる。

本発明により、ＬｎｃＲＮＡを指標として、新たな皮膚老化抑制素材のスクリーニング方法を提供できる。

Claims (3)

1. 被験物質を添加したヒト皮膚線維芽細胞での、加齢に伴い発現量が変動するＬｎｃＲＮＡの発現量が、被験物質を添加しなかったヒト皮膚線維芽細胞における前記ＬｎｃＲＮＡの発現量と比較して変化した被験物質を選択するステップを含む皮膚老化抑制素材のスクリーニング方法であって、
   前記変動が減少であり、かつ前記変化がＬｎｃＲＮＡの発現亢進であり、
   前記ＬｎｃＲＮＡがLOC100292680である、皮膚老化抑制素材のスクリーニング方法。
2. 前記皮膚老化抑制が、しわ防止、たるみ防止、シミ形成防止、及びくすみ防止からなる群から選択される１種以上を含む、請求項１に記載の皮膚老化抑制素材のスクリーニング方法。
3. 請求項１又は２に記載のスクリーニング方法により皮膚老化抑制素材を選択するステップ、及び前記皮膚老化抑制素材を含有させるステップを含む、皮膚老化抑制用組成物の設計方法。