JP7021734B2 - 色素沈着抑制剤のスクリーニング方法 - Google Patents

Description

本発明は、色素沈着抑制剤をスクリーニングする方法に関する。

皮膚における日焼け後の色素沈着、シミ、肝斑、老人性色素斑等は、皮膚に存在するメラノサイト（色素細胞）の活性化によりメラニン生成が著しく亢進した状態である。これらの皮膚色素沈着に関連するトラブルの発生や悪化は肌の美しさを妨げるものであるため、従来これらを予防又は改善する作用を有する成分に関する研究が盛んになされており、様々な作用機序に基づく美白成分が創出されている。
例えば、アスコルビン酸類、コロイド硫黄、グルタチオン、ハイドロキノン、カテコール等（非特許文献１）が、美白成分としてよく知られている。さらに近年、新たな作用機序に基づいた美白成分が種々開発されている。メラニン生成抑制を標的とするものとしては、チロシナーゼ関連蛋白阻害剤（特許文献１）、エンドセリン作用抑制剤（特許文献２）、プロトンポンプ阻害剤（特許文献３）、ステムセルファクター結合阻害剤（特許文献４）等がある。また、生成したメラニンの表皮への移動抑制を標的とするものとしては、メラノサイトのデンドライト伸張抑制剤（特許文献５）、メラニン移送又は放出抑制剤（特許文献６）等がある。
今なおより高い効果が得られる美白用化粧料の開発を目指して、色素沈着改善に有効な新たな成分の探索や、色素沈着抑制剤の標的となり得る新たな作用機序の検討がなされている。

特開２０１０－１９５７３２号公報 特開２０１２－０２０９５０号公報 特開２０１１－１７８７６０号公報 特開２００８－０３１０９４号公報 特開２００３－１１３０２７号公報 特開２００８－１４３７９６号公報

メラニン色素の制御と美白剤の開発（フレグランスジャーナル社、臨時増刊）、Ｎｏ．１４、Ｐ．１１８－１２６（１９９５） Ｔ． Ｙａｍａｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｖｏｌｕｍｅ ７３， Ｉｓｓｕｅ ３， Ｍａｒｃｈ ２０１４， Ｐａｇｅｓ ２５１－２５７

ところで、肌のシミの部位では表皮においてメラノサイトが密集して存在することが報告されている（非特許文献２）。そのため、メラノサイトごとにメラニン産生を抑制することで肌色のトーンを全体的に薄くすることはできるが、シミの部位のコントラストは維持されてしまう。また、近くにあるメラノサイト同士は互いに刺激し合い、メラニンの産生が促進され、シミがさらに濃くなったり大きくなったりすることが問題となる。

本発明は、シミの解消に新しい機序でアプローチする、色素沈着抑制剤として有効な成分を探索することを目的とし、そのための新たなスクリーニング法を確立することを課題
とする。

本発明者らは、鋭意研究の結果、黄色人種においてシミ等の色素沈着と相関性の高い遺伝子群を見出し、それらのうちにメラノサイトの細胞移動の制御因子が存在することをも見出した。
そして、シミの部位ではメラノサイトが密集して存在するところ、メラノサイトを移動させて分散させることにより、相対的に肌色が濃くなりシミに見えるのを解消したり、メラニンの過剰産生を抑制したりすることができるだろうと考え、メラノサイトの細胞移動の制御因子の活性を指標とすれば、シミ等の色素沈着を抑制できる素材をスクリーニングできることに想到し、完成するに至った。

すなわち、本発明は以下の通りである。
[１]メラノサイトの細胞移動の制御因子の活性を指標とする、色素沈着抑制剤のスクリーニング方法。
[２]前記制御因子の活性が、該制御因子を構成するタンパク質をコードする遺伝子又は前記タンパク質の発現量であり、被験物質を細胞に添加する工程、及び被験物質を添加した細胞における前記発現量が、被験物質を添加しなかった細胞における発現量と比較して変化する被験物質を選択する工程、を含む、[１]に記載のスクリーニング方法。
[３]前記制御因子がメラノサイトの細胞移動を抑制する因子であり、前記変化が発現量の減少であり、被験物質を添加した細胞における前記発現量が、被験物質を添加しなかった細胞における発現量の９０％以下となる被験物質を選択する、[２]に記載のスクリーニング方法。
[４]前記制御因子が、ＮＣＡＭ２遺伝子、ＡＢＲ遺伝子、ＳＭＹＤ３遺伝子、及びＫＩＡＡ０８２５遺伝子からなる群から選択される、[３]に記載のスクリーニング方法。
[５]前記制御因子がメラノサイトの細胞移動を亢進する因子であり、前記変化が発現量の増大であり、被験物質を添加した細胞における前記発現量が、被験物質を添加しなかった細胞における発現量の１１０％以上となる被験物質を選択する、[２]に記載のスクリーニング方法。
[６]前記細胞がメラノサイトである、[２]～[５]のいずれかに記載のスクリーニング方法。
[７][１]～[６]のいずれかに記載のスクリーニング方法を行う工程、及び前記工程により選択された物質を含有させる工程、を含む、組成物の設計方法。
[８]前記組成物が、美白用化粧料である、[７]に記載の設計方法。

本発明により、メラノサイトの細胞移動の制御因子の活性を指標とした、シミの解消に新しい機序でアプローチする色素沈着抑制剤のスクリーニング方法が提供される。

ＡＢＲ遺伝子の発現を抑制したメラノサイトの２４時間の位置変化を表す顕微鏡写真（（Ａ）コントロール、（Ｂ）ＡＢＲ遺伝子発現抑制）。いずれも４０倍率で、丸印はトラッキング開始時の細胞核の位置を示し、矢印は２４時間での移動経路を示す。 各遺伝子の発現を抑制したメラノサイトの２４時間の移動距離を表すグラフ。（Ａ）ＮＣＡＭ２遺伝子、（Ｂ）ＡＢＲ遺伝子、（Ｃ）ＳＭＹＤ３遺伝子、（Ｄ）ＫＩＡＡ０８２５遺伝子。 ＡＢＲ遺伝子の発現を抑制させる被験物質を添加したメラノサイトの２４時間の移動距離を表すグラフ。

本発明のスクリーニング方法は、メラノサイトの細胞移動の制御因子の活性を指標とする。
前述の通り、シミの部位ではメラノサイトが密集して存在する。そのため、メラノサイトを移動させて分散させることにより、相対的に肌色が濃くなりシミに見えるのを解消したり、メラニンの過剰産生を抑制したりすることができ、かかる作用を有する物質はシミ等の色素沈着抑制剤となり得る。
本発明におけるメラノサイトの細胞移動を制御する因子は、メラノサイトの細胞移動を抑制する方向に制御する因子又は亢進する方向に制御する因子のいずれでもよい。例えば、メラノサイトの細胞移動を抑制する方向に制御する因子としては、本発明者らがシミとの関連を新たに見出した遺伝子である、ＮＣＡＭ２遺伝子、ＡＢＲ遺伝子、ＳＭＹＤ３遺伝子、及びＫＩＡＡ０８２５遺伝子が好ましく挙げられる。これらの遺伝子は、ヒトの皮膚もしくは他の臓器で発現することが知られているが（例えばＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １９８９ Ｎｏｖ １１；１７（２１）：８８２１－３１）、メラノサイトで発現することも、シミ等の皮膚の色素沈着と関連することも知られていなかった。また、これらの遺伝子のヒトの塩基配列及びタンパク質のアミノ酸配列は公知であり、ＧｅｎＢａｎｋ等から取得することができる。しかしながらこれらに限定されず、既知の遺伝子であって、メラノサイトの細胞移動を制御する因子の遺伝子は、本発明のスクリーニング方法においてその活性を指標として用いることができる。

本発明において、前記制御因子の活性とは、好ましくは該制御因子を構成するタンパク質をコードする遺伝子又は前記タンパク質の発現量をいう。
本発明のスクリーニング方法は、通常は、本発明の被験物質を細胞に添加する工程、及び被験物質を添加した細胞における前記発現量が、被験物質を添加しなかった細胞における発現量と比較して変化する被験物質を選択する工程、を含む。

前記制御因子がメラノサイトの細胞移動を抑制する因子である場合、本発明のスクリーニング方法において前記変化は発現量の減少である。ここで発現量の減少の程度は、被験物質を添加した細胞における前記発現量が、被験物質を添加しなかった細胞における発現量と比較して小さければよく、好ましくは被験物質添加後１２または２４時間経過後に９０％以下に減少した場合に変化したとすることができ、より好ましくは８０％以下に減少であり、さらに好ましくは７０％以下に減少である。
前記制御因子がメラノサイトの細胞移動を抑制する因子である場合、例えば、前記制御因子がＮＣＡＭ２遺伝子、ＡＢＲ遺伝子、ＳＭＹＤ３遺伝子、及びＫＩＡＡ０８２５遺伝子から選択される場合、これらの遺伝子の発現抑制と、メラノサイトの細胞移動亢進とが相関し、結果的に色素沈着抑制と相関する。そのため、被験物質を細胞に添加することで、これらの遺伝子の発現抑制が生じた被験物質は、色素沈着抑制作用を有する成分として選択できる。

前記制御因子がメラノサイトの細胞移動を亢進する因子である場合、本発明のスクリーニング方法において前記変化は発現量の増大である。ここで発現量の増大の程度は、被験物質を添加した細胞における前記発現量が、被験物質を添加しなかった細胞における発現量と比較して大きければよく、好ましくは被験物質添加後１２または２４時間経過後に１１０％以上に増大した場合に変化したとすることができ、より好ましくは１２０％以上に増大であり、さらに好ましくは１３０％以上に増大である。
前記制御因子がメラノサイトの細胞移動を亢進する因子である場合、これらの遺伝子の発現亢進と、メラノサイトの細胞移動亢進とが相関し、結果的に色素沈着抑制と相関する。そのため、被験物質を細胞に添加することで、これらの遺伝子の発現亢進が生じた被験物質は、色素沈着抑制作用を有する成分として選択できる。

本明細書において、「色素沈着抑制」作用とは、通常は、メラノサイトが密集して相対
的に肌のその部分の色が濃く見えるのを解消する作用、及び／又はメラニン産生を抑制することにより、皮膚におけるシミ等の色素沈着が生じるのを予防及び／又は改善する作用をいい、結果として肌に対して美白作用をもたらすものである。

メラノサイトの細胞移動の制御因子の発現量は、任意の方法を用いて測定することができる。例えば、該遺伝子の配列に特異的に結合する配列を有するＤＮＡ断片をプライマーとして用いてＰＣＲを行い、定量的な検出を行う。なお、メラノサイトの細胞移動の制御因子が既知の遺伝子である場合、例えば前述したＮＣＡＭ２遺伝子、ＡＢＲ遺伝子、ＳＭＹＤ３遺伝子、又はＫＩＡＡ０８２５遺伝子等については、それらの塩基配列はそれぞれ公開されており、当業者は適宜プライマーを設計してＰＣＲに供することができる。
また、例えば、前記遺伝子によりコードされるタンパク質の細胞内存在量を、常法により定量的に測定して、前記遺伝子の発現量としてもよい。

本発明のスクリーニング方法において、被験物質を添加する細胞は、メラノサイトの細胞移動の制御因子の遺伝子が存在する細胞であれば特段限定されないが、通常はメラノサイトである。

本発明のスクリーニング方法が対象とする被験物質は、純物質、動植物由来の抽出物、又はそれらの混合物等のいずれであってもよい。
動植物由来の抽出物は、動物又は植物由来の抽出物自体のみならず、抽出物の画分、精製した画分、抽出物乃至は画分、精製物の溶媒除去物の総称を意味するものとし、植物由来の抽出物は、自生若しくは生育された植物、漢方生薬原料等として販売されるものを用いた抽出物、市販されている抽出物等が挙げられる。
抽出操作は、植物部位の全草を用いるほか、植物体、地上部、根茎部、木幹部、葉部、茎部、花穂、花蕾等の部位を使用することできるが、予めこれらを粉砕あるいは細切して抽出効率を向上させることが好ましい。抽出溶媒としては、水、エタノール、イソプロピルアルコール、ブタノールなどのアルコール類、１，３－ブタンジオール、ポリプロピレングリコールなどの多価アルコール類、アセトン、メチルエチルケトンなどのケトン類、ジエチルエーテル、テトラヒドロフランなどのエーテル類等の極性溶媒から選択される１種乃至は２種以上が好適なものとして例示することができる。具体的な抽出方法としては、例えば、植物体等の抽出に用いる部位乃至はその乾燥物１質量に対して、溶媒を１～３０質量部加え、室温であれば数日間、沸点付近の温度であれば数時間浸漬し、室温まで冷却し後、所望により不溶物及び／又は溶媒除去し、カラムクロマトグラフィー等で分画精製する方法が挙げられる。

本発明のスクリーニング方法により選択された色素沈着抑制剤は、メラノサイトの細胞移動を亢進させることによりメラノサイトを分散させる作用を有するため、メラノサイトの密集により肌色が相対的に濃く見える部分を解消する作用を有する。また、メラノサイト同士が近接して互いに刺激し合うことによる活性化が抑制されるため、メラニン産生を抑制する作用をも有する。したがって、これらの結果として色素沈着を抑制する作用を有する。
そのため、本発明のスクリーニング方法により選択された色素沈着抑制剤は、化粧料等の美白用組成物に有効成分として好適に配合することができる。

すなわち、本明細書は、本発明のスクリーニング方法を行い、それにより選択された物質（色素沈着抑制剤）を含有させる工程を含む、組成物の設計方法も提供する。そして、かかる組成物は、経皮投与される組成物（例えば、化粧料、医薬部外品、医薬品等の皮膚外用剤）や、経口投与／摂取される組成物（例えば、飲食品、医薬部外品、医薬品等の経口組成物）などの態様とすることができる。
また、組成物の剤型は特に限定されない。例えば、化粧料として設計される場合の剤型
は、通常知られているローション剤型、乳液剤型、エッセンス剤型、クリーム剤型、粉体含有剤型等が挙げられる。

本発明のスクリーニング方法により選択された色素沈着抑制剤を含有する組成物を設計する際、色素沈着抑制剤の含有量（配合量）は、通常、０．００００１質量％以上、好ましくは０．０００１質量％以上、より好ましくは０．００１質量％以上であり、通常８０質量％以下、好ましくは３０質量％以下、より好ましくは１０質量％以下である。上記範囲とすることで、好適に色素沈着抑制効果を奏する組成物とすることができる。
また、該組成物に含有させる色素沈着抑制剤の種類は、１種類のみでなく２種類以上であってもよい。

本発明のスクリーニング方法により選択された色素沈着抑制剤を含有する組成物を設計する際は、前述した態様や用途に応じて、適宜必要な成分を配合するよう、設計してよい。
例えば、化粧料組成物として設計する場合は、通常化粧料に使用される成分を広く配合することが可能であり、また、その剤型や用途についても、何ら限定されない。以下、主に化粧料に適用される場合に化粧料中に含有させることができる成分について説明する。

有効成分としては、他の美白成分、シワ改善成分、抗炎症成分、動植物由来の抽出物等が挙げられる。なお、本発明のスクリーニング方法により選択された色素沈着抑制剤と重複して配合してもよい。
他の美白成分としては、一般的に化粧料に用いられているものであれば特に限定はない。例えば、４－ｎ－ブチルレゾルシノール、アスコルビン酸グルコシド、３－О－エチルアスコルビン酸、トラネキサム酸、アルブチン、エラグ酸、コウジ酸、リノール酸、ニコチン酸アミド、５，５'－ジプロピルビフェニル－２，２'－ジオール、５'－アデニル酸二ナトリウム、トラネキサム酸セチル、４－メトキシサリチル酸カリウム塩、ハイドロキノン、パントテン酸等が挙げられる。
化粧料における美白成分の含有量は、通常０．０１～３０質量％であり、０．１～１０質量％が好ましく、０．３～５質量％がより好ましい。

シワ改善成分としては、一般的に化粧料に用いられているものであれば特に限定はない。例えば、三フッ化イソプロピルオキソプロピルアミノカルボニルピロリジンカルボニルメチルプロピルアミノカルボニルベンゾイルアミノ酢酸ナトリウム、ニコチン酸アミド、ビタミンＡ又はその誘導体（レチノール、レチナール、レチノイン酸、トレチノイン、イソトレチノイン、レチノイン酸トコフェロール、パルミチン酸レチノール、酢酸レチノール等）、ウルソール酸ベンジルエステル、ウルソール酸リン酸エステル、ベツリン酸ベンジルエステル、ベンジル酸リン酸エステルが挙げられる。
化粧料におけるシワ改善成分の含有量は、通常０．０１～３０質量％であり、０．１～１０質量％が好ましく、１～５質量％がより好ましい。

動植物由来の抽出物としては、一般的に医薬品、化粧料、食品等に用いられているものであれば特に限定はない。例えば、アケビエキス、アスナロエキス、アスパラガスエキス、アボカドエキス、アマチャエキス、アーモンドエキス、アルニカエキス、アロエエキス、アロニアエキス、アンズエキス、イチョウエキス、インドキノエキス、ウイキョウエキス、ウドエキス、エイジツエキス、エゾウコギエキス、エンメイソウエキス、オウゴンエキス、オウバクエキス、オウレンエキス、オタネニンジンエキス、オトギリソウエキス、オドリコソウエキス、オレンジエキス、カキョクエキス、カッコンエキス、カモミラエキス、カロットエキス、カワラヨモギエキス、カンゾウエキス、キウイエキス、キューカンバーエキス、グアバエキス、クジンエキス、クチナシエキス、クマザサエキス、クララエキス、クルミエキス、グレープフルーツエキス、黒米エキス、クロレラエキス、クワエキ
ス、ケイケットウエキス、ゲットウヨウエキス、ゲンチアナエキス、ゲンノショウコエキス、紅茶エキス、ゴボウエキス、コメエキス、コメ発酵エキス、コメヌカ発酵エキス、コメ胚芽油、コケモモエキス、サルビアエキス、サボンソウエキス、ササエキス、サンザシエキス、サンシャエキス、サンショウエキス、シイタケエキス、ジオウエキス、シコンエキス、シソエキス、シナノキエキス、シモツケソウエキス、シャクヤクエキス、ショウキョウエキス、ショウブ根エキス、シラカバエキス、スギナエキス、ステビアエキス、ステビア発酵物、セイヨウキズタエキス、セイヨウサンザシエキス、セイヨウニワトコエキス、セイヨウノコギリソウエキス、セイヨウハッカエキス、セージエキス、ゼニアオイエキス、センキュウエキス、センブリエキス、ソウハクヒエキス、ダイオウエキス、ダイズエキス、タイソウエキス、タイムエキス、タンポポエキス、茶エキス、チョウジエキス、チンピエキス、甜茶エキス、トウガラシエキス、トウキエキス、トウキンセンカエキス、トウニンエキス、トウヒエキス、ドクダミエキス、トマトエキス、納豆エキス、ニンジンエキス、ニンニクエキス、ノバラエキス、ハイビスカスエキス、バクモンドウエキス、ハスエキス、パセリエキス、バーチエキス、ハマメリスエキス、ヒキオコシエキス、ヒノキエキス、ビワエキス、フキタンポポエキス、フキノトウエキス、ブクリョウエキス、ブッチャーブルームエキス、ブドウエキス、ブドウ種子エキス、ヘチマエキス、ベニバナエキス、ペパーミントエキス、ボダイジュエキス、ボタンエキス、ホップエキス、マツエキス、マヨナラエキス、マロニエエキス、ミズバショウエキス、ムクロジエキス、メリッサエキス、モズクエキス、モモエキス、ヤグルマギクエキス、ユーカリエキス、ユキノシタエキス、ユズエキス、ユリエキス、ヨクイニンエキス、ヨモギエキス、ラベンダーエキス、緑茶エキス、リンゴエキス、ルイボス茶エキス、レイシエキス、レタスエキス、レモンエキス、レンギョウエキス、レンゲソウエキス、ローズエキス、ローズマリーエキス、ローマカミツレエキス、ローヤルゼリーエキス、ワレモコウエキス等のエキスが好ましいものとして挙げられる。
化粧料中における動植物由来抽出物の含有量は、通常０．０１～３０質量％であり、０．１～１０質量％が好ましく、１～５質量％がより好ましい。
食品中における動植物由来抽出物の含有量は、通常０．０１～８０質量％であり、０．１～５０質量％が好ましく、１～３０質量％がより好ましい。

抗炎症成分としては、クラリノン、グラブリジン、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸、パントテニルアルコール等が挙げられ、好ましくは、グリチルリチン酸及びその塩、グリチルレチン酸アルキル及びその塩、並びに、グリチルレチン酸及びその塩である。
化粧料中における抗炎症成分の含有量は、通常０．０１～３０質量％であり、０．１～１０質量％が好ましく、１～５質量％がより好ましい。

油性成分としては、極性油、揮発性炭化水素油等が挙げられる。
極性油としては、合成エステル油として、ミリスチン酸イソプロピル、オクタン酸セチル、ミリスチン酸オクチルドデシル、パルミチン酸イソプロピル、ステアリン酸ブチル、ラウリン酸ヘキシル、ミリスチン酸ミリスチル、オレイン酸デシル、ジメチルオクタン酸ヘキシルデシル、乳酸セチル、乳酸ミリスチル、酢酸ラノリン、イソノナン酸２－エチルヘキシル、ステアリン酸イソセチル、イソステアリン酸イソセチル、１２－ヒドロキシステアリン酸コレステリル、ジ－２－エチルヘキサン酸エチレングリコール、ジペンタエリスリトール脂肪酸エステル、モノイソステアリン酸Ｎ－アルキルグリコール、ジカプリン酸ネオペンチルグリコール、リンゴ酸ジイソステアリル、ジ－２－ヘプチルウンデカン酸グリセリル、トリ－２－エチルヘキサン酸トリメチロールプロパン、トリイソステアリン酸トリメチロールプロパン、テトラ－２－エチルヘキサン酸ペンタンエリスリトール、トリ－２－エチルヘキサン酸グリセリル、トリイソステアリン酸トリメチロールプロパンを挙げることができる。

さらに、セチル２－エチルヘキサノエート、２－エチルヘキシルパルミテート、トリミ
リスチン酸グリセリル、トリ－２－ヘプチルウンデカン酸グリセライド、ヒマシ油脂肪酸メチルエステル、オレイン酸オイル、セトステアリルアルコール、アセトグリセライド、パルミチン酸２－ヘプチルウンデシル、アジピン酸ジイソブチル、Ｎ－ラウロイル－Ｌ－グルタミン酸－２－オクチルドデシルエステル、アジピン酸ジ－２－ヘプチルウンデシル、エチルラウレート、セバチン酸ジ－２－エチルヘキシル、ミリスチン酸２－ヘキシルデシル、パルミチン酸２－ヘキシルデシル、アジピン酸２－ヘキシルデシル、セバチン酸ジイソプロピル、コハク酸２－エチルヘキシル、酢酸エチル、酢酸ブチル、酢酸アミル、クエン酸トリエチル、オクチルメトキシシンナメート等も挙げられる。

また、天然油として、アボガド油、ツバキ油、タートル油、マカデミアナッツ油、トウモロコシ油、ミンク油、オリーブ油、ナタネ油、卵黄油、ゴマ油、パーシック油、小麦胚芽油、サザンカ油、ヒマシ油、アマニ油、サフラワー油、綿実油、エノ油、大豆油、落花生油、茶実油、カヤ油、コメヌカ油、シナギリ油、日本キリ油、ホホバ油、胚芽油、トリグリセリン、トリオクタン酸グリセリル、トリイソパルミチン酸グリセリル等が挙げられる。

揮発性炭化水素油としては、イソドデカン、イソヘキサデカン等が挙げられる。

界面活性剤としては、脂肪酸セッケン（ラウリン酸ナトリウム、パルミチン酸ナトリウム等）、ラウリル硫酸カリウム、アルキル硫酸トリエタノールアミンエーテル等のアニオン界面活性剤類、塩化ステアリルトリメチルアンモニウム、塩化ベンザルコニウム、ラウリルアミンオキサイド等のカチオン界面活性剤類、ベタイン系界面活性剤（アルキルベタイン、アミドベタイン、スルホベタイン等）、イミダゾリン系両性界面活性剤（２－ココイル－２－イミダゾリニウムヒドロキサイド－１－カルボキシエチロキシ２ナトリウム塩等）、アシルメチルタウリン等の両性界面活性剤類、
ソルビタン脂肪酸エステル類（ソルビタンモノステアレート、セスキオレイン酸ソルビタン等） 、グリセリン脂肪酸エステル類（モノステアリン酸グリセリル等）、プロピレングリコール脂肪酸エステル類（モノステアリン酸プロピレングリコール等）、硬化ヒマシ油誘導体、グリセリンアルキルエーテル、ＰＯＥソルビタン脂肪酸エステル類（ＰＯＥソルビタンモノオレエート、モノステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン等）、ＰＯＥソルビット脂肪酸エステル類（ＰＯＥ－ソルビットモノラウレート等）、ＰＯＥグリセリン脂肪酸エステル類（ＰＯＥ－グリセリンモノイソステアレート等）、ＰＯＥ脂肪酸エステル類（ポリエチレングリコールモノオレート、ＰＯＥジステアレート等）、ＰＯＥアルキルエーテル類（ＰＯＥ２－オクチルドデシルエーテル等）、ＰＯＥアルキルフェニルエーテル類（ＰＯＥノニルフェニルエーテル等）、プルロニック型類、ＰＯＥ・ＰＯＰアルキルエーテル類（ＰＯＥ・ＰＯＰ２－デシルテトラデシルエーテル等）、テトロニック類、ＰＯＥヒマシ油・硬化ヒマシ油誘導体（ＰＯＥヒマシ油、ＰＯＥ硬化ヒマシ油等）、ショ糖脂肪酸エステル、アルキルグルコシド等の非イオン界面活性剤類、等が挙げられる。

多価アルコールとしては、ポリエチレングリコール、グリセリン、１，３－ブチレングリコール、エリスリトール、ソルビトール、キシリトール、マルチトール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、ジグリセリン、イソプレングリコール、１，２－ペンタンジオール、２，４－ヘキシレングリコール、１，２－ヘキサンジオール、１，２－オクタンジオール等が挙げられる。

増粘剤としては、グアーガム、クインスシード、カラギーナン、ガラクタン、アラビアガム、ペクチン、マンナン、デンプン、キサンタンガム、カードラン、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、メチルヒドロキシプロピルセルロース、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、グリコーゲン、ヘパラン硫酸、ヒ
アルロン酸、ヒアルロン酸ナトリウム、トラガントガム、ケラタン硫酸、コンドロイチン、ムコイチン硫酸、ヒドロキシエチルグアガム、カルボキシメチルグアガム、デキストラン、ケラト硫酸、ローカストビーンガム、サクシノグルカン、カロニン酸，キチン、キトサン、カルボキシメチルキチン、寒天、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アルキル変性カルボキシビニルポリマー、ポリアクリル酸ナトリウム、ポリエチレングリコール、ベントナイト等が挙げられる。

粉体類としては、表面を処理されていてもよい、マイカ、タルク、カオリン、合成雲母、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、無水ケイ酸（シリカ）、酸化アルミニウム、硫酸バリウム等の粉体類、表面を処理されていてもよい、ベンガラ、黄酸化鉄、黒酸化鉄、酸化コバルト、群青、紺青、酸化チタン、酸化亜鉛の無機顔料類、表面を処理されていてもよい、雲母チタン、魚燐箔、オキシ塩化ビスマス等のパール剤類、レーキ化されていてもよい赤色２０２号、赤色２２８号、赤色２２６号、黄色４号、青色４０４号、黄色５号、赤色５０５号、赤色２３０号、赤色２２３号、橙色２０１号、赤色２１３号、黄色２０４号、黄色２０３号、青色１号、緑色２０１号、紫色２０１号、赤色２０４号等の有機色素類、ポリエチレン末、ポリメタクリル酸メチル、ナイロン粉末、オルガノポリシロキサンエラストマー等の有機粉体類、が挙げられる。

紫外線吸収剤としては、パラアミノ安息香酸系紫外線吸収剤、アントラニル酸系紫外線吸収剤、サリチル酸系紫外線吸収剤、桂皮酸系紫外線吸収剤、ベンゾフェノン系紫外線吸収剤、糖系紫外線吸収剤、２－（２'－ヒドロキシ－５'－ｔ－オクチルフェニル)ベンゾトリアゾール、４－メトキシ－４'－ｔ－ブチルジベンゾイルメタン等の紫外線吸収剤類、等が挙げられる。

以下、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明は、その要旨を超えない限り、以下の実施例に限定されるものではない。

＜参考例＞各制御因子の遺伝子発現抑制によるメラノサイトの細胞移動への影響
以下の手順で、メラノサイトにおける各制御因子の遺伝子発現をｓｉＲＮＡで阻害することにより、メラノサイトの細胞移動への影響を検討した。
ヒト正常メラノサイト（新生児、Ｄａｒｋ／ＡｆｒｉｃａｎＡｍｅｒｉｃａｎ、Ｌｏｔ. １２２３１５０、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に、ネッパジーン社製ＮＥＰＡ ２１を使用してエレクトロポレーション法にて、表１に記載のｓｉＲＮＡを導入した。コントロールとしてはＮｏｎ－ｃｏｄｉｎｇ ｓｉＲＮＡを用いた。該メラノサイトを２４ウェルプレートに播種し（４．０×１０^４ ｃｅｌｌｓ／ウェル）、Ｍｅｄｉｕｍ２５４＋ＨＭＧＳ培地（Ｇｉｂｃｏ社製）で２４時間３７℃でＯ／Ｎ培養した。
細胞核染色試薬（０．１％ Ｃｅｌｌｓｔａｉｎ Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２ ｓｏｌｕｔｉｏｎ、Ｈ３４２、同仁化学株式会社製）含有Ｍｅｄｉｕｍ２５４＋ＨＭＧＳ培地に交換し、１５分間インキュベートした。細胞核染色試薬含有培地を除去し、Ｍｅｄｉｕｍ２５４＋ＨＭＧＳ培地を添加した（５００μＬ／ウェル）。

顕微鏡（倒立型リサーチ顕微鏡ＩＸ８３、Ｏｌｙｍｐｕｓ株式会社製）及び動画撮影ソフトウェア（Ｍｕｌｔｉ Ｄｉｍｅｎｔｉｏｎａｌ Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ株式会社製）を起動し、２４ウェルプレートをステージに設置した。以下の設定で、メラノサイトのタイムラプス動画を撮影し、撮影開始２４～４８時間後に撮影した動画をＭｕｌｔｉ－ｐｌａｎｅ ＴＩＦＦデータとして保存した。
撮影条件：ＤＡＰＩ、撮影頻度：４分毎、撮影時間：４８時間
動画解析ソフトウェア（Ｍｕｌｔｉ Ｄｉｍｅｎｔｉｏｎａｌ Ｍｏｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ株式会社製）を用いて、前記動画データに対して、細胞核検出感度を最大に、ノイズを最小限に抑えるよう蛍光の閾値を調節し、Ｓｅａｒｃｈ Ｏｐｔｉｏｎｓで以下に示すように各種設定を行い、細胞核のトラッキングを行い、数値データを保存した。該数値データから、撮影した全画像で検出された細胞のうち任意の２１個の細胞を選択し、各細胞の移動距離を測定し、各群の平均値を算出した。
Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ：Ａｕｔｏ－ｆｉｎｄ Ｏｂｊｅｃｔｓ
Ｓｅｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ：Ａｄａｐｔｉｖｅ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ
ＸＹ ｄｉａｍｅｔｅｒ：ｍｉｎ ５， ｍａｘ ３０
Ｌｏｃａｌ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ ａｂｏｖｅ ｂｋｇｄ：１００
Ｓｐｌｉｔ ｔｏｕｃｈｉｎｇ ｏｂｊｅｃｔｓ：有
Ｏｂｊｅｃｔ ｍａｙ ｓｋｉｐ ｆｒａｍｅｓ ａｌｏｎｇ ｐａｔｈ：有

また、前述のｓｉＲＮＡを導入した各メラノサイトについて、前記Ｏ／Ｎ培養後にＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒ（ＱＩＡＧＥＮ株式会社製）及びＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ株式会社製）を用いて細胞を回収し、ＱＩＡｃｕｂｅ（ＱＩＡＧＥＮ株式会社製）にてＲＮＡを抽出した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＶＩＬＯ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製）を用いてｃＤＮＡを合成し、表２に記載の試薬を用いて定法によりＲＴ－ＰＣＲを行い、各遺伝子のｍＲＮＡ量を測定した。

図１に、ＡＢＲ遺伝子の発現を抑制したメラノサイトの２４時間の位置変化を表す顕微
鏡写真を示す。また、図２に、各遺伝子の発現を抑制したメラノサイトの２４時間の移動距離を、コントロール群を１００％としたときの相対値として示す。ＮＣＡＭ２遺伝子、ＡＢＲ遺伝子、ＳＭＹＤ３遺伝子、及びＫＩＡＡ０８２５遺伝子のそれぞれの発現を抑制したメラノサイトにおいて、細胞移動の亢進が認められた。
なお、別途、生体の皮膚のようにケラチノサイトに周囲を取り囲まれた環境にあるメラノサイトにおいても、同様にメラノサイトが移動することが、確認された。
また、ｓｉＲＮＡを導入したメラノサイトにおいて、各遺伝子の発現量が有意に抑制されたことが、ＲＴ－ＰＣＲの結果から確認された（対コントロール：３０～５０％）。

＜実施例１＞培養ヒト正常メラノサイトを用いたＡＢＲ遺伝子のｍＲＮＡ発現量を指標とするスクリーニング
以下の手順で、メラノサイトにおけるＡＢＲ遺伝子のｍＲＮＡ発現量を指標として色素沈着産生抑制剤のスクリーニングを行った。
正常ヒトメラノサイト（新生児、Ｄａｒｋ／ＡｆｒｉｃａｎＡｍｅｒｉｃａｎ、Ｌｏｔ. １２２３１５０、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ株式会社製）を２４ウェルプレートに８．０×１０^４ｃｅｌｌｓ／ウェル播種し、Ｍｅｄｉｕｍ２５４＋ＨＭＧＳ培地培地で２４時間３７℃でＯ／Ｎ培養した。培養後に、最終濃度１．０質量％の被験物質を添加して試験群とし、各被験物質に代えてその溶媒を同量添加したものをコントロール群とし、さらに２４時間３７℃でＯ／Ｎ培養した。培養後に、参考例と同様に、回収したメラノサイトからｍＲＮＡを抽出し、合成したｃＤＮＡを用いてＲＴ－ＰＣＲを行い、各遺伝子のｍＲＮＡ量を測定した。

表３に、メラノサイトにおけるＡＢＲ遺伝子のｍＲＮＡ発現量を、被験物質非添加（コントロール）のメラノサイトにおける同発現量を「１」とした場合の相対値で示した。
ローズマリーエキスにおいて、コントロールの４０％にＡＢＲ遺伝子の発現が抑制されたことが認められ、このエキスがメラノサイトの細胞移動促進作用を有し、その結果色素沈着抑制効果を奏することが示唆された。

＜実施例２＞細胞移動促進作用評価
以下の手順で、ＡＢＲ遺伝子の発現を抑制する物質の、メラノサイトの細胞移動促進効果を評価した。
正常ヒトメラノサイト（新生児、Ｄａｒｋ／ＡｆｒｉｃａｎＡｍｅｒｉｃａｎ、Ｌｏｔ. １２２３１５０、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ株式会社製）を２４ウェルプレートに４．０×１０^４ｃｅｌｌｓ／ウェル播種し、Ｍｅｄｉｕｍ２５４＋ＨＭＧＳ培地で２４時間３７℃でＯ／Ｎ培養した。培養後に、最終濃度１．０質量％の実施例１と同じ被験物質を添加して試験群とし、各被験物質に代えてその溶媒を同量添加したものをコントロール群とした。細胞核染色試薬（０．１％ Ｃｅｌｌｓｔａｉｎ Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２ ｓｏｌｕｔｉｏｎ、Ｈ３４２、同仁化学株式会社製）含有Ｍｅｄｉｕｍ２５４＋ＨＭＧＳ培地に交換し、１５分間インキュベートした。細胞核染色試薬含有
培地を除去し、被験物質含有Ｍｅｄｉｕｍ２５４＋ＨＭＧＳ培地を添加した（５００μＬ／ウェル）。参考例と同様に、細胞のタイムラプス動画を撮影し、細胞移動の解析を行った。

図３に、メラノサイトの２４時間の移動距離を、コントロール群を１００％としたときの相対値として示す。ローズマリーエキスにおいて、有意な細胞移動の亢進が認められた。

本発明により、メラノサイトの細胞移動の制御因子の活性を指標とした、新たな色素沈着抑制剤のスクリーニング方法が提供される。これにより、美白用化粧料等の設計・製造に有用となり得る素材の探索が可能になるので、産業上有用である。

Claims (6)

1. メラノサイトの細胞移動の制御因子の活性の減少を指標とする、色素沈着抑制剤をインビトロでスクリーニングする方法であって、
   前記制御因子が、ＮＣＡＭ２遺伝子、ＡＢＲ遺伝子、ＳＭＹＤ３遺伝子、及びＫＩＡＡ０８２５遺伝子からなる群から選択される因子である、方法。
2. 前記制御因子の活性が、該制御因子を構成するタンパク質をコードする遺伝子又は前記タンパク質の発現量であり、
   被験物質を細胞に添加する工程、及び
   被験物質を添加した細胞における前記発現量が、被験物質を添加しなかった細胞における発現量と比較して減少する被験物質を選択する工程、
   を含む、請求項１に記載の方法。
3. 被験物質を添加した細胞における前記発現量が、被験物質を添加しなかった細胞における発現量の９０％以下となる被験物質を選択する、請求項２に記載の方法。
4. 前記細胞がメラノサイトである、請求項２又は３に記載の方法。
5. 請求項１～４のいずれか一項に記載の方法を行う工程、及び
   前記工程により選択された物質を含有させる工程、
   を含む、組成物の設計方法。
6. 前記組成物が、美白用化粧料である、請求項５に記載の設計方法。

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