JP7131801B2 - 肌状態の変動抑制剤及びそのスクリーニング方法 - Google Patents

Description

本発明は、日々変化する肌状態を安定に保つための皮膚外用剤の有効成分、及びそのスクリーニング方法に関する。

美しい肌、健康的な肌に対する需要は高い。人の肌状態は年単位で大きく変化していくため、加齢により増加する、シミ、シワなどに対する原因や対策等のスキンケアに関する種々の情報はメディアから多く提供され、化粧品、健康食品、美容家電、エステティックなど、様々なスキンケア市場が存在する。また、思春期から若齢成人にかけて悩みの多い、ニキビ、肌荒れに対するスキンケアも多く提案されている。
一方、ある日にはごわついていた肌の触感が翌日にはすべすべだと感じる、週の途中でニキビが現れてまた消える、メイクのりの良い日と悪い日があるなど、程度の差こそあれ日常生活において肌状態の良い日と悪い日が存在することを多くの人が感じている。短期的な肌状態の変化に関しては、多くの人が日常的に好不調を気にしているにも関わらず、美容方法や生活習慣の改善方法についての情報が提供されるのみで、有効な解決手段が存在していなかった。

日間で変動する肌状態としては、乾燥感、しっとり感、ゴワツキ、凹凸感などが挙げられる。これらは皮膚再外層に存在する角層の、水分蒸散を抑制するバリア機能、天然保湿因子や油分の放出、剥離状態や層数、過角化による毛穴や脂腺の詰まりなどに大きく影響される肌状態であることが推測されている。
これらの肌状態の日間での変動は、一般に、仕事の忙しさや子育てなど私生活の負荷が比較的長期的に続いている状態で、さらにストレスを感じた後に実感することが多い。

ストレスを感じた際には、全身性ホルモンであるコルチゾールが増加することが知られている（非特許文献１）。コルチゾールは、表皮角化細胞に対する過剰な角化を誘導する作用（非特許文献２）や表皮角化細胞のヒアルロン酸合成を抑制する作用（非特許文献３）を有することが知られていて、その作用を緩和して肌状態を緩和させることが提案されている（特許文献１）。一方で、コルチゾールは抗炎症作用を有することも知られており、肌荒れを抑制するために皮膚外用剤に配合されてきた。
また、コルチゾールは、細胞胞内で１１βヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼタイプ２（１１β－ＨＳＤ２）により不活性型のコルチゾンに変換されることで、その影響が一過性のものとなるが、１１βヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼタイプ１（１１β－ＨＳＤ１）により、再活性化されコルチゾールとなることで、局所での濃度が高まることが知られている（非特許文献８）。
また、長期的に負荷が続いている人においては、全身性の炎症性サイトカインであるＴＮＦαやＩＬ１－βが増加することが知られている（非特許文献４、非特許文献５）。これらの炎症性サイトカインは、表皮角化細胞の１１β－ＨＳＤ１の遺伝子（ＨＳＤ１１Ｂ１）の発現を増加させることが知られている（非特許文献６、非特許文献７）。さらには、１１β－ＨＳＤ１活性が抑制されると、表皮が角化ではなく増殖方向に変化したり（非特許文献９）、脂腺細胞の脂質合成が抑えられたりする（非特許文献１０）ことも報告されている。

特開２０１０－１５０２１６号公報

McInnis C, Brain. Behav. Immun. 46, 237-248 (2015). Ponec M, In Vitro Cell. Dev. Biol. 24, 764-770 (1988). Agren UM, J. Cell. Physiol. 164, 240-248 (1995). Damjanovic AK, J. Immunol. 179, 4249-4254 (2007). Russell SB, J. Biol. Chem. 264, 13730-13735 (1989). Itoi S, Biochem. Biophys. Res. Commun. 440, 265-270 (2013). Vukelic S, J. Biol. Chem. 286, 10265-10275 (2011). Tomlinson J, Endocr. Rev. 25, 831-866 (2004). Terao M, PLoS One 6, e25039 (2011). Lee SE, Br. J. Dermatol. 168, 47-55 (2013).

本発明は、肌状態の日間変動を抑制する成分をスクリーニングする方法を提供することを課題とする。また、肌状態変動抑制用の組成物を提供することを課題とする。

本発明者らは、ストレス等で日間変動する肌状態を改善するために鋭意研究したところ、ＴＮＦαやＩＬ１－β存在下で表皮角化細胞における１１β－ＨＳＤ１活性を抑制することにより、コルチゾールの再活性化を抑制することができ、ストレスの影響を一過性に留めることができることを見出した。コルチゾールは全身性のホルモンで、従来局所での不活性化又は再活性化に着目した例はなかった。これらの知見に基づき、ＴＮＦα又はＩＬ１－βの存在下で表皮角化細胞における１１β－ＨＳＤ１活性を抑制し得る成分が、肌状態の日間変動を抑制する成分となり得ることに想到し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は以下の通りである。
[１]ＴＮＦα又はＩＬ１－βの存在下での表皮角化細胞における１１βヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼタイプ１（１１β－ＨＳＤ１）の活性を指標とする、肌状態変動抑制剤のスクリーニング方法。
[２]前記１１β－ＨＳＤ１の活性が、１１β－ＨＳＤ１をコードする遺伝子（ＨＳＤ１１Ｂ１）の発現量であり、
ＴＮＦα又はＩＬ１－βの存在下で被験物質を表皮角化細胞に添加する工程、及び
被験物質を添加した表皮角化細胞におけるＨＳＤ１１Ｂ１の発現量が、ＴＮＦα又はＩＬ１－βの存在下で被験物質を添加しなかった表皮角化細胞におけるＨＳＤ１１Ｂ１の発現量と比較して小さくなる被験物質を選択する工程、
を含む、[１]に記載のスクリーニング方法。
[３]ＨＳＤ１１Ｂ１の発現量が２０％以上小さくなる被験物質を選択する、[２]に記載のスクリーニング方法。
[４]さらに、ＴＮＦα又はＩＬ１－βの存在下での表皮角化細胞における１１βヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼタイプ２（１１β－ＨＳＤ２）の活性を指標とする、[１]～[３]のいずれかに記載のスクリーニング方法。
[５]前記１１β－ＨＳＤ１の活性が、１１β－ＨＳＤ１をコードする遺伝子（ＨＳＤ１１Ｂ１）の発現量であり、
前記１１β－ＨＳＤ２の活性が、１１β－ＨＳＤ２をコードする遺伝子（ＨＳＤ１１Ｂ２）の発現量であり、
ＴＮＦα又はＩＬ１－βの存在下で被験物質を表皮角化細胞に添加する工程、及び
被験物質を添加した表皮角化細胞におけるＨＳＤ１１Ｂ１の発現量が、ＴＮＦα又はＩＬ１－βの存在下で被験物質を添加しなかった表皮角化細胞におけるＨＳＤ１１Ｂ１の発現量と比較して小さくなり、かつ
被験物質を添加した表皮角化細胞におけるＨＳＤ１１Ｂ２の発現量が、ＴＮＦα又はＩＬ１－βの存在下で被験物質を添加しなかった表皮角化細胞におけるＨＳＤ１１Ｂ２の発現量と比較して変化しない被験物質、を選択する工程、
含む、[４]に記載のスクリーニング方法。
[６]ＨＳＤ１１Ｂ１の発現量が２０％以上小さくなり、かつ
ＨＳＤ１１Ｂ２の発現量が２０％以上小さくならない被験物質を選択する、[５]に記載のスクリーニング方法。
[７][１]～[６]のいずれかに記載のスクリーニング方法を行う工程、及び
前記工程により選択された物質を含有させる工程、
を含む、組成物の設計方法。
[８]前記組成物が、肌状態変動抑制用の皮膚外用剤である、[７]に記載の設計方法。
[９]アサイヤシ果実抽出物、加水分解エラスチン、加水分解ゴマタンパク、シュードアルテロモナス発酵物抽出物、タモギタケ抽出物、チョウセンゴミシ果実抽出物からなる群より選択される１種または２種以上を含有する、肌状態変動抑制用組成物。
[１０]シュードアルテロモナス発酵物抽出物を含有する、[９]に記載の組成物。
[１１]さらにセンブリ抽出物を含有する、 [１０]に記載の組成物。
[１２]皮膚外用剤である[９]～[１１]のいずれかに記載の組成物。
[１３]化粧料または医薬部外品である、[１２]に記載の組成物。

本発明により、表皮角化細胞における１１β－ＨＳＤ１の活性を指標とする、肌状態変動抑制剤のスクリーニング方法が提供される。また、本発明により、肌状態の日間変動の抑制に有効な組成物が提供される。

被験物質を添加した培養ヒト成人表皮角化細胞におけるＨＳＤ１１Ｂ１遺伝子の発現量を示すグラフ（＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１）。 被験物質を添加した培養ヒト成人表皮角化細胞におけるＨＳＤ１１Ｂ２遺伝子の発現量を示すグラフ（＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１）。 被験物質を添加した培養ヒト成人表皮角化細胞におけるコルチゾールの量を示すグラフ（＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１）。 製剤を５日間使用した肌における経皮水分蒸散量の変動を示すグラフ。 製剤を５日間使用した肌における角層水分量の変動を示すグラフ。 製剤を５日間使用した肌における肌表面のキメの粗さの変動を示すグラフ。 製剤を５日間使用した肌における肌表面の隆起の部分の体積の変動を示すグラフ。

本発明のスクリーニング方法は、ＴＮＦα又はＩＬ１－βの存在下での表皮角化細胞（ケラチノサイト）における１１βヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼタイプ１（１１β－ＨＳＤ１）の活性を指標とする。１１β－ＨＳＤ１は、細胞内で不活性化されたコルチゾール（コルチゾン）を、再活性化する酵素である。
本発明のスクリーニング方法は、さらに、ＴＮＦα又はＩＬ１－βの存在下での表皮角化細胞における１１βヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼタイプ２（１１β－ＨＳＤ２）の活性をも指標とすることが好ましい。１１β－ＨＳＤ２は、細胞内でコルチゾールをコルチゾンに変換することで不活性化する酵素である。

本発明の方法では、ストレス状態（異常時）において増加するＴＮＦαやＩＬ１－βの存在下でスクリーニングを行うことにより、通常はこれらのサイトカインにより増加する１１β－ＨＳＤ１の活性を抑制する、すなわち平常時に戻す物質を探索することができる
。なお、１１β－ＨＳＤ２は、該サイトカイン存在下では特に変動しないことが、本発明者らにより分かっている。
本発明の方法により選択される物質は、ストレス状態で一時的に増加したコルチゾールが、表皮角化細胞で役割を終えてコルチゾンに変換された後に、１１β－ＨＳＤ１により再活性化して持続的にコルチゾールが維持されるのを抑制する作用を有するものである。コルチゾール量を抑えることにより、ストレスの肌状態への影響を一過性にとどめることができる。また、本発明の方法により選択される物質は、好ましくは１１β－ＨＳＤ２の活性には影響を与えない、具体的にはコルチゾールの不活性化を抑制しない作用を有するものである。

なお、１１β－ＨＳＤ１及び１１β－ＨＳＤ２のアミノ酸配列、並びにこれらをコードする遺伝子のＤＮＡ塩基配列は公知であり、ＧｅｎＢａｎｋ等に開示されている。

本発明において、前記酵素（１１β－ＨＳＤ１及び１１β－ＨＳＤ２）の活性とは、好ましくはこれらの酵素を構成するタンパク質をコードする遺伝子又は前記タンパク質の発現量により表される。
あるいは、これらの酵素の反応活性の測定値であってもよく、例えば１１β－ＨＳＤ１活性についてはコルチゾンをコルチゾールに変換する活性を、１１β－ＨＳＤ２活性についてはコルチゾールをコルチゾンに変換する活性を、それぞれ任意の方法で測定した値であってもよい。

本発明のスクリーニング方法は、通常は、ＴＮＦα又はＩＬ１－βの存在下で被験物質を表皮角化細胞に添加する工程、及び被験物質を添加した表皮角化細胞におけるＨＳＤ１１Ｂ１の発現量が、ＴＮＦα又はＩＬ１－βの存在下で被験物質を添加しなかった表皮角化細胞におけるＨＳＤ１１Ｂ１の発現量と比較して小さくなる被験物質を選択する工程を含む。また、好ましくは、被験物質を添加した表皮角化細胞におけるＨＳＤ１１Ｂ２の発現量が、ＴＮＦα又はＩＬ１－βの存在下で被験物質を添加しなかった表皮角化細胞におけるＨＳＤ１１Ｂ２の発現量と比較して変化しない被験物質を選択する工程を含む。
本発明においては、ＨＳＤ１１Ｂ１遺伝子の発現抑制と肌状態変動抑制とが相関する。そのため、被験物質を細胞に添加することで、ＨＳＤ１１Ｂ１遺伝子の発現抑制が生じた被験物質は、肌状態変動抑制作用を有する成分として選択できる。
また、ＨＳＤ１１Ｂ２遺伝子の発現抑制と肌状態変動亢進とが相関する。そのため、被験物質を細胞に添加することで、ＨＳＤ１１Ｂ２遺伝子の発現抑制が生じた被験物質は、肌状態変動抑制作用を有する成分として選択することを控えた方がよい。

本発明のスクリーニング方法において被験物質を表皮角化細胞に添加する工程を行う際のＴＮＦα又はＩＬ１－βの存在量は、１～１００ｎｇ／ｍＬとすることが好ましい。これは、スクリーニング系としてストレス状態（異常時）を模倣するための条件である。なお、非ストレス状態（通常時）のＴＮＦα又はＩＬ１－βの存在量は、一般に１０ｐｇ／ｍＬ未満である。

本発明のスクリーニング方法において、選択される被験物質は、被験物質を添加した表皮角化細胞におけるＨＳＤ１１Ｂ１の発現量が、ＴＮＦα又はＩＬ１－βの存在下で被験物質を添加しなかった表皮角化細胞におけるＨＳＤ１１Ｂ１の発現量と比較して小さければよく、好ましくは被験物質添加後１２または２４時間経過後に２０％以上小さく、より好ましくは３０％以上小さく、さらに好ましくは４０％以上小さいものである。この範囲の発現減少であれば、表現形にも影響を与えることができ、かかる減少を引き起こす物質は十分に肌状態変動抑制効果を示し得ると考えられる。
また、本発明のスクリーニング方法において、選択される被験物質は、被験物質を添加した表皮角化細胞におけるＨＳＤ１１Ｂ２の発現量が、ＴＮＦα又はＩＬ１－βの存在下
で被験物質を添加しなかった表皮角化細胞におけるＨＳＤ１１Ｂ２の発現量と比較して変化しないものが好ましく、より好ましくは被験物質添加後１２または２４時間経過後に２０％以上小さくならない、より好ましくは１５％以上小さくならない、さらに好ましくは１０％以上小さくならないものである。また、ＨＳＤ１１Ｂ２の発現量は、被験物質非添加の場合より大きくなってもよいが（発現亢進）、好ましくは２０％以上大きくならない、より好ましくは１５％以上大きくならない、さらに好ましくは１０％以上大きくならないものである。この範囲の発現変化であれば、コルチゾールの不活性化に与える影響が緩和なものとなるので、ＨＳＤ１１Ｂ１遺伝子の発現抑制効果を打ち消すことがないと考えられる。

ＨＳＤ１１Ｂ１遺伝子又はＨＳＤ１１Ｂ２遺伝子の発現量は、任意の方法を用いて測定することができる。例えば、該遺伝子の配列に特異的に結合する配列を有するＤＮＡ断片をプライマーとして用いてＰＣＲを行い、定量的な検出を行う。なお、既知の複数のメラノサイト活性化因子の制御因子の遺伝子の塩基配列はそれぞれ公開されており、当業者は適宜プライマーを設計してＰＣＲに供することができる。
また、例えば、前記遺伝子によりコードされるタンパク質の細胞内存在量を、常法により定量的に測定して、前記遺伝子の発現量としてもよい。

本発明のスクリーニング方法が対象とする被験物質は、純物質、動植物（微生物を含む）由来の抽出物、又はそれらの混合物等のいずれであってもよい。
動植物由来の抽出物は、動物又は植物由来の抽出物自体のみならず、抽出物の画分、精製した画分、抽出物乃至は画分、精製物の溶媒除去物の総称を意味するものとし、植物由来の抽出物は、自生若しくは生育された植物、漢方生薬原料等として販売されるものを用いた抽出物、市販されている抽出物等が挙げられる。
抽出操作は、植物部位の全草を用いるほか、植物体、地上部、根茎部、木幹部、葉部、茎部、花穂、花蕾等の部位を使用することできるが、予めこれらを粉砕あるいは細切して抽出効率を向上させることが好ましい。抽出溶媒としては、水、エタノール、イソプロピルアルコール、ブタノールなどのアルコール類、１，３－ブタンジオール、ポリプロピレングリコールなどの多価アルコール類、アセトン、メチルエチルケトンなどのケトン類、ジエチルエーテル、テトラヒドロフランなどのエーテル類等の極性溶媒から選択される１種乃至は２種以上が好適なものとして例示することができる。具体的な抽出方法としては、例えば、植物体等の抽出に用いる部位乃至はその乾燥物１質量に対して、溶媒を１～３０質量部加え、室温であれば数日間、沸点付近の温度であれば数時間浸漬し、室温まで冷却し後、所望により不溶物及び／又は溶媒除去し、カラムクロマトグラフィー等で分画精製する方法が挙げられる。

本明細書において、「肌状態」とは、特に限定されないが、肌の乾燥感（かさつき、保湿不足）、しっとり感（水分量、油分量）、ゴワツキ感（肌理）、凹凸感、柔らかさ、ハリ・弾力、肌色などを言い、主観的又は客観的なものを問わない。
また、「肌状態の変動」とは、特に限定されないが、肌状態が日間で好調になったり不調になったりする変化をいう。
また、「肌状態の変動の抑制」とは、特に限定されないが、肌状態が日間で好調になったり不調になったりする変化の幅を小さくすることをいう。
したがって、本発明のスクリーニング方法により選択された肌状態変動抑制剤は、肌状態変動抑制用の組成物の有効成分として好適に配合することができる。

すなわち、本明細書は、本発明のスクリーニング方法を行い、それにより選択された物質（肌状態変動抑制剤）を含有させる工程を含む、組成物の設計方法も提供する。そして、かかる組成物は、経皮投与される組成物（例えば、化粧料、医薬部外品、医薬品等の皮膚外用剤）の態様とすることができ、肌状態変動抑制用の組成物とすることが好ましい。
また、組成物の剤型は特に限定されない。例えば、化粧料として設計される場合の剤型は、通常知られているローション剤型、乳液剤型、エッセンス剤型、クリーム剤型、粉体含有剤型等が挙げられる。

本発明のスクリーニング方法により選択された肌状態変動抑制剤を含有する組成物を設計する際、肌状態変動抑制剤の含有量（配合量）は、通常、０．００００１質量％以上、好ましくは０．０００１質量％以上、より好ましくは０．００１質量％以上であり、通常８０質量％以下、好ましくは３０質量％以下、より好ましくは１０質量％以下である。上記範囲とすることで、好適に肌状態変動抑制効果を奏する組成物とすることができる。
また、該組成物に含有させる肌状態変動抑制剤の種類は、１種類のみでなく２種類以上であってもよい。

本発明の肌状態変動抑制剤としては、アサイヤシ果実抽出物、加水分解エラスチン、加水分解ゴマタンパク、シュードアルテロモナス発酵物抽出物、タモギタケ抽出物、チョウセンゴミシ果実抽出物が好ましく挙げられ、これらの１種または２種以上を肌状態変動抑制用組成物に配合することができる。また、これらのうちシュードアルテロモナス発酵物抽出物が特に好ましい。さらにシュードアルテロモナス発酵物抽出物とセンブリ抽出物とを組み合わせて肌状態変動抑制用組成物に配合することが好ましい。

本発明のスクリーニング方法により選択された肌状態変動抑制剤を含有する組成物を設計する際は、前述した態様や用途に応じて、適宜必要な成分を配合するよう、設計してよい。
例えば、化粧料組成物として設計する場合は、通常化粧料に使用される成分を広く配合することが可能であり、また、その剤型や用途についても、何ら限定されない。以下、主に化粧料に適用される場合に化粧料中に含有させることができる成分について説明する。

有効成分としては、美白成分、シワ改善成分、抗炎症成分、動植物由来の抽出物等が挙げられる。なお、本発明のスクリーニング方法により選択された肌状態変動抑制剤と重複して配合してもよい。
美白成分としては、一般的に化粧料に用いられているものであれば特に限定はない。例えば、４－ｎ－ブチルレゾルシノール、アスコルビン酸グルコシド、３－О－エチルアスコルビン酸、トラネキサム酸、アルブチン、エラグ酸、コウジ酸、リノール酸、ニコチン酸アミド、５，５'－ジプロピルビフェニル－２，２'－ジオール、５'－アデニル酸二ナトリウム、トラネキサム酸セチル、４－メトキシサリチル酸カリウム塩、ハイドロキノン、パントテン酸等が挙げられる。
化粧料における美白成分の含有量は、通常０．０１～３０質量％であり、０．１～１０質量％が好ましく、０．３～５質量％がより好ましい。

シワ改善成分としては、一般的に化粧料に用いられているものであれば特に限定はない。例えば、三フッ化イソプロピルオキソプロピルアミノカルボニルピロリジンカルボニルメチルプロピルアミノカルボニルベンゾイルアミノ酢酸ナトリウム、ニコチン酸アミド、ビタミンＡ又はその誘導体（レチノール、レチナール、レチノイン酸、トレチノイン、イソトレチノイン、レチノイン酸トコフェロール、パルミチン酸レチノール、酢酸レチノール等）、ウルソール酸ベンジルエステル、ウルソール酸リン酸エステル、ベツリン酸ベンジルエステル、ベンジル酸リン酸エステルが挙げられる。
化粧料におけるシワ改善成分の含有量は、通常０．０１～３０質量％であり、０．１～１０質量％が好ましく、１～５質量％がより好ましい。

動植物由来の抽出物としては、一般的に医薬品、化粧料、食品等に用いられているものであれば特に限定はない。例えば、アケビエキス、アスナロエキス、アスパラガスエキス
、アボカドエキス、アマチャエキス、アーモンドエキス、アルニカエキス、アロエエキス、アロニアエキス、アンズエキス、イチョウエキス、インドキノエキス、ウイキョウエキス、ウドエキス、エイジツエキス、エゾウコギエキス、エンメイソウエキス、オウゴンエキス、オウバクエキス、オウレンエキス、オタネニンジンエキス、オトギリソウエキス、オドリコソウエキス、オレンジエキス、カキョクエキス、カッコンエキス、カモミラエキス、カロットエキス、カワラヨモギエキス、キウイエキス、キューカンバーエキス、グアバエキス、クジンエキス、クチナシエキス、クマザサエキス、クララエキス、クルミエキス、グレープフルーツエキス、黒米エキス、クロレラエキス、クワエキス、ケイケットウエキス、ゲットウヨウエキス、ゲンチアナエキス、ゲンノショウコエキス、紅茶エキス、ゴボウエキス、コメエキス、コメ発酵エキス、コメヌカ発酵エキス、コメ胚芽油、コケモモエキス、サルビアエキス、サボンソウエキス、ササエキス、サンザシエキス、サンシャエキス、サンショウエキス、シイタケエキス、ジオウエキス、シコンエキス、シソエキス、シナノキエキス、シモツケソウエキス、シャクヤクエキス、ショウキョウエキス、ショウブ根エキス、シラカバエキス、スギナエキス、ステビアエキス、ステビア発酵物、セイヨウキズタエキス、セイヨウサンザシエキス、セイヨウニワトコエキス、セイヨウノコギリソウエキス、セイヨウハッカエキス、セージエキス、ゼニアオイエキス、センキュウエキス、センブリエキス、ソウハクヒエキス、ダイオウエキス、ダイズエキス、タイソウエキス、タイムエキス、タンポポエキス、茶エキス、チョウジエキス、チンピエキス、甜茶エキス、トウガラシエキス、トウキエキス、トウキンセンカエキス、トウニンエキス、トウヒエキス、ドクダミエキス、トマトエキス、納豆エキス、ニンジンエキス、ニンニクエキス、ノバラエキス、ハイビスカスエキス、バクモンドウエキス、ハスエキス、パセリエキス、バーチエキス、ハマメリスエキス、ヒキオコシエキス、ヒノキエキス、ビワエキス、フキタンポポエキス、フキノトウエキス、ブクリョウエキス、ブッチャーブルームエキス、ブドウエキス、ブドウ種子エキス、ヘチマエキス、ベニバナエキス、ペパーミントエキス、ボダイジュエキス、ボタンエキス、ホップエキス、マツエキス、マヨナラエキス、マロニエエキス、ミズバショウエキス、ムクロジエキス、メリッサエキス、モズクエキス、モモエキス、ヤグルマギクエキス、ユーカリエキス、ユキノシタエキス、ユズエキス、ユリエキス、ヨクイニンエキス、ヨモギエキス、ラベンダーエキス、緑茶エキス、リンゴエキス、ルイボス茶エキス、レイシエキス、レタスエキス、レモンエキス、レンギョウエキス、レンゲソウエキス、ローズエキス、ローズマリーエキス、ローマカミツレエキス、ローヤルゼリーエキス、ワレモコウエキス等のエキスが好ましいものとして挙げられる。
化粧料中における動植物由来抽出物の含有量は、通常０．０１～３０質量％であり、０．１～１０質量％が好ましく、１～５質量％がより好ましい。
食品中における動植物由来抽出物の含有量は、通常０．０１～８０質量％であり、０．１～５０質量％が好ましく、１～３０質量％がより好ましい。

抗炎症成分としては、アラントイン、イソプロピルメチルフェノール、クラリノン、グラブリジン、サリチル酸、トコフェロール酢酸エステル、トコフェロールニコチン酸エステル、トラネキサム酸、ニコチン酸アミド、パントテン酸、パントテニルアルコール等が挙げられ、好ましくは、サリチル酸及びその誘導体、トラネキサム酸及びその誘導体、パントテニルアルコール並びにパントテン酸及びその塩である。
化粧料中における抗炎症成分の含有量は、通常０．０１～３０質量％であり、０．１～１０質量％が好ましく、１～５質量％がより好ましい。

油性成分としては、極性油、揮発性炭化水素油等が挙げられる。
極性油としては、合成エステル油として、ミリスチン酸イソプロピル、オクタン酸セチル、ミリスチン酸オクチルドデシル、パルミチン酸イソプロピル、ステアリン酸ブチル、ラウリン酸ヘキシル、ミリスチン酸ミリスチル、オレイン酸デシル、ジメチルオクタン酸ヘキシルデシル、乳酸セチル、乳酸ミリスチル、酢酸ラノリン、イソノナン酸２－エチルヘキシル、ステアリン酸イソセチル、イソステアリン酸イソセチル、１２－ヒドロキシス
テアリン酸コレステリル、ジ－２－エチルヘキサン酸エチレングリコール、ジペンタエリスリトール脂肪酸エステル、モノイソステアリン酸Ｎ－アルキルグリコール、ジカプリン酸ネオペンチルグリコール、リンゴ酸ジイソステアリル、ジ－２－ヘプチルウンデカン酸グリセリル、トリ－２－エチルヘキサン酸トリメチロールプロパン、トリイソステアリン酸トリメチロールプロパン、テトラ－２－エチルヘキサン酸ペンタンエリスリトール、トリ－２－エチルヘキサン酸グリセリル、トリイソステアリン酸トリメチロールプロパンを挙げることができる。

さらに、セチル２－エチルヘキサノエート、２－エチルヘキシルパルミテート、トリミリスチン酸グリセリル、トリ－２－ヘプチルウンデカン酸グリセライド、ヒマシ油脂肪酸メチルエステル、オレイン酸オイル、セトステアリルアルコール、アセトグリセライド、パルミチン酸２－ヘプチルウンデシル、アジピン酸ジイソブチル、Ｎ－ラウロイル－Ｌ－グルタミン酸－２－オクチルドデシルエステル、アジピン酸ジ－２－ヘプチルウンデシル、エチルラウレート、セバチン酸ジ－２－エチルヘキシル、ミリスチン酸２－ヘキシルデシル、パルミチン酸２－ヘキシルデシル、アジピン酸２－ヘキシルデシル、セバチン酸ジイソプロピル、コハク酸２－エチルヘキシル、酢酸エチル、酢酸ブチル、酢酸アミル、クエン酸トリエチル、オクチルメトキシシンナメート等も挙げられる。

また、天然油として、アボガド油、ツバキ油、タートル油、マカデミアナッツ油、トウモロコシ油、ミンク油、オリーブ油、ナタネ油、卵黄油、ゴマ油、パーシック油、小麦胚芽油、サザンカ油、ヒマシ油、アマニ油、サフラワー油、綿実油、エノ油、大豆油、落花生油、茶実油、カヤ油、コメヌカ油、シナギリ油、日本キリ油、ホホバ油、胚芽油、トリグリセリン、トリオクタン酸グリセリル、トリイソパルミチン酸グリセリル等が挙げられる。

揮発性炭化水素油としては、イソドデカン、イソヘキサデカン等が挙げられる。

界面活性剤としては、脂肪酸セッケン（ラウリン酸ナトリウム、パルミチン酸ナトリウム等）、ラウリル硫酸カリウム、アルキル硫酸トリエタノールアミンエーテル等のアニオン界面活性剤類、塩化ステアリルトリメチルアンモニウム、塩化ベンザルコニウム、ラウリルアミンオキサイド等のカチオン界面活性剤類、ベタイン系界面活性剤（アルキルベタイン、アミドベタイン、スルホベタイン等）、イミダゾリン系両性界面活性剤（２－ココイル－２－イミダゾリニウムヒドロキサイド－１－カルボキシエチロキシ２ナトリウム塩等）、アシルメチルタウリン等の両性界面活性剤類、
ソルビタン脂肪酸エステル類（ソルビタンモノステアレート、セスキオレイン酸ソルビタン等） 、グリセリン脂肪酸エステル類（モノステアリン酸グリセリル等）、プロピレングリコール脂肪酸エステル類（モノステアリン酸プロピレングリコール等）、硬化ヒマシ油誘導体、グリセリンアルキルエーテル、ＰＯＥソルビタン脂肪酸エステル類（ＰＯＥソルビタンモノオレエート、モノステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン等）、ＰＯＥソルビット脂肪酸エステル類（ＰＯＥ－ソルビットモノラウレート等）、ＰＯＥグリセリン脂肪酸エステル類（ＰＯＥ－グリセリンモノイソステアレート等）、ＰＯＥ脂肪酸エステル類（ポリエチレングリコールモノオレート、ＰＯＥジステアレート等）、ＰＯＥアルキルエーテル類（ＰＯＥ２－オクチルドデシルエーテル等）、ＰＯＥアルキルフェニルエーテル類（ＰＯＥノニルフェニルエーテル等）、プルロニック型類、ＰＯＥ・ＰＯＰアルキルエーテル類（ＰＯＥ・ＰＯＰ２－デシルテトラデシルエーテル等）、テトロニック類、ＰＯＥヒマシ油・硬化ヒマシ油誘導体（ＰＯＥヒマシ油、ＰＯＥ硬化ヒマシ油等）、ショ糖脂肪酸エステル、アルキルグルコシド等の非イオン界面活性剤類、等が挙げられる。

多価アルコールとしては、ポリエチレングリコール、グリセリン、１，３－ブチレング
リコール、エリスリトール、ソルビトール、キシリトール、マルチトール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、ジグリセリン、イソプレングリコール、１，２－ペンタンジオール、２，４－ヘキシレングリコール、１，２－ヘキサンジオール、１，２－オクタンジオール等が挙げられる。

増粘剤としては、グアーガム、クインスシード、カラギーナン、ガラクタン、アラビアガム、ペクチン、マンナン、デンプン、キサンタンガム、カードラン、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、メチルヒドロキシプロピルセルロース、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、グリコーゲン、ヘパラン硫酸、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸ナトリウム、トラガントガム、ケラタン硫酸、コンドロイチン、ムコイチン硫酸、ヒドロキシエチルグアガム、カルボキシメチルグアガム、デキストラン、ケラト硫酸、ローカストビーンガム、サクシノグルカン、カロニン酸，キチン、キトサン、カルボキシメチルキチン、寒天、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アルキル変性カルボキシビニルポリマー、ポリアクリル酸ナトリウム、ポリエチレングリコール、ベントナイト等が挙げられる。

粉体類としては、表面を処理されていてもよい、マイカ、タルク、カオリン、合成雲母、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、無水ケイ酸（シリカ）、酸化アルミニウム、硫酸バリウム等の粉体類、表面を処理されていてもよい、ベンガラ、黄酸化鉄、黒酸化鉄、酸化コバルト、群青、紺青、酸化チタン、酸化亜鉛の無機顔料類、表面を処理されていてもよい、雲母チタン、魚燐箔、オキシ塩化ビスマス等のパール剤類、レーキ化されていてもよい赤色２０２号、赤色２２８号、赤色２２６号、黄色４号、青色４０４号、黄色５号、赤色５０５号、赤色２３０号、赤色２２３号、橙色２０１号、赤色２１３号、黄色２０４号、黄色２０３号、青色１号、緑色２０１号、紫色２０１号、赤色２０４号等の有機色素類、ポリエチレン末、ポリメタクリル酸メチル、ナイロン粉末、オルガノポリシロキサンエラストマー等の有機粉体類、が挙げられる。

紫外線吸収剤としては、パラアミノ安息香酸系紫外線吸収剤、アントラニル酸系紫外線吸収剤、サリチル酸系紫外線吸収剤、桂皮酸系紫外線吸収剤、ベンゾフェノン系紫外線吸収剤、糖系紫外線吸収剤、２－（２'－ヒドロキシ－５'－ｔ－オクチルフェニル)ベンゾトリアゾール、４－メトキシ－４'－ｔ－ブチルジベンゾイルメタン等の紫外線吸収剤類、等が挙げられる。

以下、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明は、その要旨を超えない限り、以下の実施例に限定されるものではない。

＜実施例１＞
培養ヒト成人表皮角化細胞（ＮＨＥＫ、クラボウ）を増殖培地とともに２４穴マルチウェルプレートに播種した後、培地を被験物質または溶媒対照を含む培地に交換し、２４時間培養した。その後、表１に示す各被験物質（各０．２５容量％）と１０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦα（Ｒ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭＳ社）を含む培地に交換し２４時間培養した後に培地を除き、ＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒ、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ、ＱＩＡＣｕｂｅ（いずれもＱＩＡＧＥＮ）を用いてＲＮＡを精製し、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＶＩＬＯ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にてｃＤＮＡ化した。ｃＤＮＡから、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ Ｐｒｉｍｅｒ Ａｓｓａｙ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてリアルタイムＰＣＲを行い、ＨＳＤ１１Ｂ１及びＨＳＤ１１Ｂ２の各ｍＲＮＡ量を測定した（ｎ＝３）。内在性コントロールとして、ＨＳＤ１１Ｂ１にはＲＰＬ２７を、ＨＳＤ１１Ｂ２にはＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ量を測定し、内在性コントロールのｍＲＮＡ量に対する比率を解析し、被験物質の値と被験物質を含まずに溶媒の
みを培地に添加した溶媒対照との間で、ＨＳＤ１１Ｂ１及びＨＳＤ１１Ｂ２の遺伝子発現量を比較した。なお、プライマーは表２に記載のもの（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いた。
溶媒対照の平均値と比較して２０％以上のＨＳＤ１１Ｂ１遺伝子発現の減少を示す場合に、該被験試料はＨＳＤ１１Ｂ１遺伝子発現抑制作用を有すると判定することとした。また、溶媒対照の平均値と比較して２０％以上のＨＳＤ１１Ｂ２遺伝子発現の減少を示す場合に、該被験試料はＨＳＤ１１Ｂ２遺伝子発現抑制作用を有すると判定することとした。

被験物質を添加したＮＨＥＫにおけるＨＳＤ１１Ｂ１遺伝子の発現量の解析結果を図１に示す。溶媒対照での発現量を１００としたときの相対値で示し、低値であるほど、ＨＳＤ１１Ｂ１遺伝子の発現が抑制されたことを表す。これまでＨＳＤ１１Ｂ１遺伝子の発現抑制効果の知られていなかった、シュードアルテロモナス発酵物抽出物、加水分解エラスチン、加水分解ゴマタンパク、アサイヤシ果実抽出物、タモギタケ抽出物、チョウセンゴミシ果実抽出物、及びシュードアルテロモナス発酵物抽出物に、ＨＳＤ１１Ｂ１遺伝子発現抑制作用が認められた。さらに、加水分解ゴマタンパク、及びシュードアルテロモナス発酵物抽出物には、有意なＨＳＤ１１Ｂ１遺伝子発現抑制作用を認められた。
被験物質を添加したＮＨＥＫにおけるＨＳＤ１１Ｂ２遺伝子の発現量の解析結果を図２に示す。溶媒対照での発現量を１００としたときの相対値で示し、低値であるほど、ＨＳＤ１１Ｂ２遺伝子の発現が抑制されたことを表す。ＨＳＤ１１Ｂ１の遺伝子発現抑制作用が認められたシュードアルテロモナス発酵物抽出物、加水分解エラスチン、加水分解ゴマタンパク、アサイヤシ果実抽出物、タモギタケ抽出物、及びチョウセンゴミシ果実抽出物には、いずれもＮＨＥＫにおけるＨＳＤ１１Ｂ２遺伝子の発現に対する抑制作用は認められなかった。

＜実施例２＞
以下の手順で、ＨＳＤ１１Ｂ１遺伝子発現の抑制効果を有し、かつＨＳＤ１１Ｂ２遺伝子の発現を抑制しない物質が、表皮角化細胞におけるコルチゾールの再活性化を抑制し得ることを確認した。
ＮＨＥＫを増殖培地とともに９６穴マルチウェルプレートに播種した後、シュードアルテロモナス発酵物抽出物（０．２５容量％）又は溶媒対照を含む培地に交換し２４時間培養した。その後、各被験物質とＴＮＦαと１μＭのコルチゾール（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）を含む培地に交換し、２４時間培養した。その後、再度コルチゾールを含まない各被験物質とＴＮＦαのみを加えた培地に交換し、さらに培養した。２４時間後の培養系に含まれるコルチゾール量をＤｅｔｅｃｔＸ ＣＯＲＴＩＳＯＬ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｋｉｔ （ＡＲＢＯＲ ａｓｓａｙｓ社）にて測定した。該コルチゾール量を、細胞に使用されて不活性化されたコルチゾール変換体であるコルチゾンが、活性型コルチゾールに再生された量であるとして評価した。
シュードアルテロモナス発酵物抽出物を添加したＮＨＥＫでは、溶媒対照よりもコルチゾール量が有意に低く、コルチゾンのコルチゾールへの再活性化が抑制されたことが確認された。

＜実施例３＞
以下の手順で、センブリ抽出物が、シュードアルテロモナス発酵物抽出物の表皮角化細胞におけるコルチゾールの再活性化抑制効果をより高めることを確認した。
被験物質として、シュードアルテロモナス発酵物抽出物（０．２５容量％）、シュードアルテロモナス発酵物抽出物とセンブリ抽出物（香栄興業株式会社）の混合物（各０．２５容量％）、センブリ抽出物（０．２５容量％）を用い、実施例２と同様の方法で活性型コルチゾールの再生量を評価した。
結果を図３に示す。低値を示すほど、コルチゾールが再活性化されていないことを表す。シュードアルテロモナス発酵物抽出物単独では、溶媒対照よりも細胞培養中のコルチゾール量が有意に低いことから、ＨＳＤ１１Ｂ１によるコルチゾンのコルチゾールへの再活性化が抑制されたことが分かる。また、センブリ抽出物単独では、コルチゾール量に影響を及ぼさなかった。一方、シュードアルテロモナス発酵物抽出物とセンブリ抽出物との混合物を添加した場合は、シュードアルテロモナス発酵物抽出物単独よりもコルチゾール再活性化が抑制されることが認められた。これにより、シュードアルテロモナス発酵物抽出物の表皮角化細胞におけるコルチゾールの再活性化抑制作用が、センブリ抽出物により増強されたことが推測された。

＜実施例４＞
表３に示す処方で、水中油型の乳液を調製した。すなわち、成分Ａ及び成分Ｂを８０℃
でそれぞれ加温して混合し、撹拌下でＡにＢを徐々に加え、撹拌冷却して乳液を得た。

＜実施例５＞
実施例４で調製した試験製剤及び比較製剤を、被験者（各群５名、計１０名）に５日間顔面に朝晩２回使用してもらい、肌状態４項目、すなわち経皮水分蒸散量（ＴＥＷＬ）、角層水分量、皮膚表面の粗さ、及び隆起部の体積を毎日同時刻に測定した。ＴＥＷＬはＶａｐｏｍｅｔｅｒ ＳＷＬ５００１ＪＴ（キーストンサイエンティフィック）を用いて、
角層の水分量はＣｏｒｎｅｏｍｅｔｅｒ ＣＭ８２５（Ｃｏｕｒａｇｅ＋Ｋｈａｚａｋａ）を用いて、皮膚表面の粗さと隆起部の体積はＡＮＴＥＲＡ ３Ｄ（Ｍｉｒａｖｅｘ）を用いて、それぞれ測定した。上記肌状態４項目の各日間変動率は、下記式に従い、すなわち各測定日の測定値と１日目の測定値との差の絶対値の、１日目の測定値に対する割合として算出した。
肌状態の変動率（％）＝｛（各日の測定値－１日目の測定値）／１日目の測定値｝×１００
各項目の測定値の各群の平均値及び誤差を、図４～図７に示す。各図において低値を示すほど１日目からの変化が少ないことを表す。比較製剤と比較してシュードアルテロモナス発酵物抽出物及びセンブリ抽出物抽出物を含む試験製剤では、全ての測定項目で概ね変動率が小さく、特に、５日目には全項目で変動率が小さかった。このことから、試験製剤は肌状態の日間変動の抑制に有効であり、連続で使用することにより、より効果を発揮することがわかる。

本発明により、肌状態の日間変動を抑制し得る物質のスクリーニング方法が提供される。これにより、肌状態変動抑制用組成物等の設計・製造に有用となり得る素材の探索が可能になるので、産業上有用である。

Claims (8)

1. ＴＮＦα又はＩＬ１－βの存在下での表皮角化細胞における１１βヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼタイプ１（１１β－ＨＳＤ１）の活性を指標とする、肌状態変動抑制剤のスクリーニング方法。
2. 前記１１β－ＨＳＤ１の活性が、１１β－ＨＳＤ１をコードする遺伝子（ＨＳＤ１１Ｂ１）の発現量であり、
   ＴＮＦα又はＩＬ１－βの存在下で被験物質を表皮角化細胞に添加する工程、及び
   被験物質を添加した表皮角化細胞におけるＨＳＤ１１Ｂ１の発現量が、ＴＮＦα又はＩＬ１－βの存在下で被験物質を添加しなかった表皮角化細胞におけるＨＳＤ１１Ｂ１の発現量と比較して小さくなる被験物質を選択する工程、
   を含む、請求項１に記載のスクリーニング方法。
3. ＨＳＤ１１Ｂ１の発現量が２０％以上小さくなる被験物質を選択する、請求項２に記載のスクリーニング方法。
4. さらに、ＴＮＦα又はＩＬ１－βの存在下での表皮角化細胞における１１βヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼタイプ２（１１β－ＨＳＤ２）の活性を指標とする、請求項１～３のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
5. 前記１１β－ＨＳＤ１の活性が、１１β－ＨＳＤ１をコードする遺伝子（ＨＳＤ１１Ｂ１）の発現量であり、
   前記１１β－ＨＳＤ２の活性が、１１β－ＨＳＤ２をコードする遺伝子（ＨＳＤ１１Ｂ２）の発現量であり、
   ＴＮＦα又はＩＬ１－βの存在下で被験物質を表皮角化細胞に添加する工程、及び
   被験物質を添加した表皮角化細胞におけるＨＳＤ１１Ｂ１の発現量が、ＴＮＦα又はＩＬ１－βの存在下で被験物質を添加しなかった表皮角化細胞におけるＨＳＤ１１Ｂ１の発現量と比較して小さくなり、かつ
   被験物質を添加した表皮角化細胞におけるＨＳＤ１１Ｂ２の発現量が、ＴＮＦα又はＩＬ１－βの存在下で被験物質を添加しなかった表皮角化細胞におけるＨＳＤ１１Ｂ２の発現量と比較して小さくならない被験物質、を選択する工程、
   含む、請求項４に記載のスクリーニング方法。
6. ＨＳＤ１１Ｂ１の発現量が２０％以上小さくなり、かつ
   ＨＳＤ１１Ｂ２の発現量が２０％以上小さくならない被験物質を選択する、請求項５に記載のスクリーニング方法。
7. 請求項１～６のいずれか一項に記載のスクリーニング方法を行う工程、及び
   前記工程により選択された物質を含有させる工程、
   を含む、組成物の設計方法。
8. 前記組成物が、肌状態変動抑制用の皮膚外用剤である、請求項７に記載の設計方法。

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