JP2014534231A - ウイルス感染の治療のためのプリン誘導体 - Google Patents

Abstract

本発明は、式（Ｉ）【化１】のプリン誘導体、それらの調製のための方法、医薬組成物、およびウイルス感染の治療におけるそれらの使用に関する。

Description

本発明は、プリン誘導体、それらの調製のための方法、医薬組成物、およびウイルス感染の治療におけるそれらの使用に関する。

本発明は、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）の調節、または活性化作用（ａｇｏｎｉｓｍ）が関与する、ウイルス感染、免疫疾患または炎症性疾患の治療におけるプリン誘導体の使用に関する。Ｔｏｌｌ様受容体は、細胞外ロイシンに富んだ領域および保存領域を含む細胞質拡張を特徴とする主要な膜貫通タンパク質である。自然免疫系は、特定のタイプの免疫細胞の細胞表面上で発現されるこれらのＴＬＲを介して病原体関連分子パターンを認識し得る。外来病原体の認識により、サイトカインの産生および食細胞における共刺激分子の上方制御が活性化される。これにより、Ｔ細胞挙動が調節される。

ほとんどの哺乳類種は、１０〜１５種のＴｏｌｌ様受容体を有すると推定されている。（ＴＬＲ１〜ＴＬＲ１３と命名された）１３種のＴＬＲが、ヒトおよびマウスでともに認識されており、これらの多くの同等の形態が、他の哺乳類種において見出された。しかしながら、ヒトに見られる特定のＴＬＲに相当するものが、全ての哺乳動物において存在するわけではない。例えば、ヒトにおけるＴＬＲ１０と類似したタンパク質をコードする遺伝子が、マウスにおいて存在するが、過去のどこかの時点で、レトロウイルスによって損傷されたようである。一方、マウスは、ヒトにおいては示されないＴＬＲ１１、１２、および１３を発現する。他の哺乳動物は、ヒトに見られないＴＬＲを発現し得る。他の非哺乳類種は、トラフグに見られるＴＬＲ１４によって示されるような、哺乳動物と異なるＴＬＲを有し得る。これにより、ヒト先天性免疫のモデルとして実験動物を使用するプロセスが複雑になり得る。

Ｔｏｌｌ様受容体の概説については、例えば、以下の学術論文：Ｈｏｆｆｍａｎｎ，Ｊ．Ａ．，Ｎａｔｕｒｅ，４２６，ｐ３３−３８，２００３を参照されたい。

国際公開第２００６／１１７６７０号パンフレットにおいてプリン誘導体、国際公開第９８／０１４４８号パンフレットおよび国際公開第９９／２８３２１号パンフレットにおいてアデニン誘導体、および国際公開第２００９／０６７０８１号パンフレットにおいてピリミジンなどの、Ｔｏｌｌ様受容体に対する活性を示す化合物が既に記載されている。

しかしながら、先行技術の化合物と比較して、好ましい選択性、より高い効力、より高い代謝的安定性、より高い溶解性および向上した安全性プロフィールを有する新規なＴｏｌｌ様受容体モジュレータに対する強い必要性がある。

本発明によれば、式（Ｉ）

（式中、
Ｙが、（Ｃ_１〜４）アルキレンであり、
Ｒ_１が、ヘテロアリール^１であり、
Ｒ_２が、アリール^２またはヘテロシクリルである）
の化合物、またはその薬学的に許容できる塩、溶媒和物もしくは多形体が提供される。

ヘテロアリール^１という用語は、イミダゾリル、ピリジル、ピリミジル、ピロリル、ピラゾリル、フリル、オキサゾリル、オキサジアゾリル、イソオキサゾリル、ピラジニルまたはチアゾリルを意味する。ヘテロアリール^１は、ヒドロキシル、Ｃ_１〜６アルキル、Ｃ_１〜４アルコキシ、トリフルオロメチル、Ｃ_３〜６シクロアルキル、フェニル、ハロゲン、ヒドロキシル−Ｃ_１〜４アルキル、Ｃ_１〜４−アルコキシ−Ｃ_１〜４−アルキル−、またはＣ_１〜４アルキル−ジエトキシホスホリルから独立して選択される１つまたは複数の置換基によって任意に置換される。

アリール^２という用語は、フェニル、ナフチル、アントラセニルおよびフェナントレニルを含み、好ましくはフェニルである。アリール^２は、ヒドロキシル、Ｃ_１〜６アルキル、Ｃ_１〜４アルコキシ、トリフルオロメチル、ＣＯ_２Ｒ_３、Ｒ_４Ｒ_５Ｎ−Ｃ_１〜４−アルキル−、ハロゲン、ヒドロキシル−Ｃ_１〜４アルキル−、ＮＲ_６Ｒ_７、Ｃ（Ｏ）Ｒ_６、Ｃ（Ｏ）ＮＲ_６Ｒ_７、Ｃ_１〜４アルキル−ジエトキシホスホリルまたはＣ_１〜４アルキル−ホスホン酸から独立して選択される１つまたは複数の置換基によって任意に置換される。

Ｒ_３が、ＨおよびＣ_１〜６アルキルから選択される。

Ｒ_４およびＲ_５が、それらが両方とも結合される窒素と一緒になって、以下のものからなる群から選択される複素環を形成する：

Ｒ_６およびＲ_７がそれぞれ、独立して、Ｈ、Ｃ_１〜６−アルキルまたはＣ_１〜４アルコキシから選択される。

「ヘテロシクリル」という用語は、テトラヒドロピランおよびヘテロアリール^２を指す。

ヘテロアリール^２という用語は、ピリジル、テトラヒドロイソキノリニル、イミダゾピリジニル、キノリニル、イソキノリニル、ピラジニル、ピリミジル、ナフチリジニル、ピリダジニル、ベンズイミダゾリル、ベンゾチアゾリル、ピラゾリル、チアゾリル、イミダゾリル、インダゾリルを含む。ヘテロアリール^２は、ハロゲン、ヒドロキシル、Ｃ_１〜６アルキル、Ｃ_１〜４アルコキシ、オキシ−Ｃ_１〜４アルキルアミンまたはピロリジニル−メタノンから独立して選択される１つまたは複数の置換基によって任意に置換される。

さらなる実施形態において、本発明は、式（Ｉ）（式中、Ｒ_１が、ハロゲン、ヒドロキシル、Ｃ_１〜６アルキル、Ｃ_１〜４アルコキシまたはＣ_３〜６シクロアルキルから独立して選択される１つまたは複数の置換基によってそれぞれ任意に置換される、イミダゾリル、ピラゾリルまたはピリジニルを含む群から選択される）の化合物を包含する。

本発明に係る好ましい化合物は、以下の数字：１、４、９、２３、２４、２５、２６、３５、３６、４８、４９、５０、５１および５４の見出しでそれぞれ表１および表２に列挙される化合物である。

さらに、本発明には、１つまたは複数の薬学的に許容できる賦形剤、希釈剤または担体とともに、式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容できる塩、溶媒和物もしくは多形体を含む医薬組成物が含まれる。

本発明の一部は、薬剤として使用するための、上述した式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容できる塩、溶媒和物もしくは多形体または上述の医薬組成物でもある。

本発明は、ＴＬＲ７の調節が関与する疾患の治療に使用するための、上述した式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容できる塩、溶媒和物もしくは多形体または医薬組成物にも関する。

「アルキル」という用語は、規定数の炭素原子を含有する直鎖状または分枝鎖状飽和脂肪族炭化水素を指す。

「ハロゲン」という用語は、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素を指す。

「シクロアルキル」という用語は、規定数の炭素原子を含有する炭素環を指す。

「アルコキシ」という用語は、例えばメトキシ基またはエトキシ基のような、酸素に単結合されたアルキル（炭素および水素鎖）基を指す。

式（Ｉ）の化合物の薬学的に許容できる塩は、その酸付加塩および塩基塩を含む。好適な酸付加塩は、非毒性塩を形成する酸から形成される。好適な塩基塩は、非毒性塩を形成する塩基から形成される。

本発明の化合物はまた、非溶媒和および溶媒和形態で存在してもよい。「溶媒和物」という用語は、本発明の化合物および１つまたは複数の薬学的に許容できる溶媒分子、例えば、エタノールを含む分子錯体を表すために、本明細書において使用される。

「多形体」という用語は、本発明の化合物が２つ以上の形態または結晶構造で存在する能力を指す。

本発明の化合物は、互変異性化と呼ばれる化学反応によって容易に相互変換される有機化合物の異性体を指すいわゆる「互変異性体」形態で存在し得る。この反応は、単結合および隣接する二重結合の切り替えを伴う、水素原子またはプロトンのホルマール移動をもたらす。

本発明の化合物は、結晶性または非晶質製品として投与され得る。それらは、沈殿、結晶化、凍結乾燥、噴霧乾燥、または蒸発乾燥などの方法によって、例えば、固体プラグ、粉末、またはフィルムとして得られる。それらは、単独でまたは本発明の１つまたは複数の他の化合物と組み合わせて、または１つまたは複数の他の薬剤と組み合わせて投与され得る。一般に、それらは、１つまたは複数の薬学的に許容できる賦形剤とともに製剤として投与されるであろう。「賦形剤」という用語は、本発明の化合物以外の任意の成分を表すために、本明細書において使用される。賦形剤の選択は、具体的な投与形態、溶解性および安定性に対する賦形剤の影響、および剤形の性質などの要因に大きく左右される。

本発明の化合物またはその任意のサブグループは、投与のために様々な医薬品形態へと製剤化され得る。適切な組成物として、薬剤を全身投与するのに通常用いられる全ての組成物が挙げられ得る。本発明の医薬組成物を調製するために、活性成分として、任意に付加塩形態の、有効量の特定の化合物が、薬学的に許容できる担体と緊密に混合して組み合わされ、その担体は、投与のために必要な製剤の形態に応じて様々な形態を取り得る。これらの医薬組成物は、例えば、経口、直腸、または経皮投与に好適な単一の剤形であるのが望ましい。例えば、経口剤形の組成物を調製する際、例えば、懸濁剤、シロップ、エリキシル剤、乳剤、および液剤（ｓｏｌｕｔｉｏｎ）などの経口液体製剤の場合、水、グリコール、油、アルコールなど；または粉剤、丸薬、カプセル剤、および錠剤の場合、でんぷん、糖、カオリン、希釈剤、潤滑剤、結合剤、崩壊剤などの固体担体などの通常の医薬品媒体のいずれも用いられ得る。投与しやすさのため、錠剤およびカプセル剤が、最も有利な経口投薬単位形態であり、その場合、固体医薬担体が明らかに用いられる。使用の直前に、液体形態に変換され得る固体形態製剤も含まれる。経皮投与に好適な組成物において、担体は、皮膚に大きな有害作用を与えない、少ない割合の任意の性質の好適な添加剤と任意に組み合わされた、浸透促進剤および／または好適な湿潤剤を任意に含む。前記添加剤は、皮膚への投与を容易にすることができ、および／または所望の組成物を調製するのに役立ち得る。これらの組成物は、様々な方法で、例えば、経皮パッチとして、スポットオン剤（ｓｐｏｔ−ｏｎ）として、軟膏として投与され得る。本発明の化合物はまた、この方法による投与のための当該技術分野において用いられる方法および製剤によって、吸入または注入（ｉｎｓｕｆｆｌａｔｉｏｎ）によって投与され得る。したがって、一般に、本発明の化合物は、液剤、懸濁剤または乾燥粉末の形態で肺に投与され得る。

投与しやすさおよび投与量の均一性のために、単位剤形で上記の医薬組成物を製剤化するのが特に有利である。本明細書において使用される際の単位剤形は、単一の投薬として好適な物理的に別個の単位を指し、各単位は、所要の医薬担体とともに所望の治療効果を生じるように計算された所定の量の活性成分を含有する。このような単位剤形の例は、錠剤（分割錠またはコーティング錠を含む）、カプセル剤、丸薬、粉末パケット、カシェ剤（ｗａｆｅｒ）、坐剤、注射用液剤または懸濁剤など、およびそれらの分割された複数のもの（ｓｅｇｒｅｇａｔｅｄ ｍｕｌｔｉｐｌｅ）である。

感染症の治療の当業者は、以下に示される試験結果から有効量を決定することができるであろう。一般に、有効な一日当たりの量は、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ体重であろうと考えられる。１日を通して適切な間隔で、２回、３回、４回またはそれ以上の分割用量（ｓｕｂ−ｄｏｓｅ）として必要な用量を投与するのが適切なことがある。前記分割用量は、例えば、単位剤形当たり１〜１０００ｍｇ、特に、５〜２００ｍｇの活性成分を含有する単位剤形として製剤化され得る。

正確な投薬量および投与の頻度は、当業者に周知のように、使用される式（Ｉ）の特定の化合物、治療される特定の病態、治療される病態の重症度、特定の患者の年齢、体重および全身的な身体状態ならびに個体が摂取している可能性のある他の薬剤に応じて決まる。さらに、有効量が、治療される被験体の応答に応じて、および／または本発明の化合物を処方する医師の評価に応じて、減少または増加され得ることが明らかである。したがって、上記の有効量の範囲は、指針に過ぎず、本発明の範囲または使用を、いかなる程度であれ限定することは意図されていない。

実験項：
最終的な化合物の調製における全体スキーム（方法１）

中間体Ａ−１の調製
ジアミノマレオニトリル（６ｇ、５５ｍｍｏｌ）およびオルトギ酸トリエチル（９．２ｍＬ、５５ｍｍｏｌ）を、１，４−ジオキサン（９５ｍＬ）中で組み合わせて、６５ｍＬの１，４−ジオキサン／エタノールが収集されるまで蒸留条件下で加熱した。反応混合物を室温に冷まし、溶媒を減圧下で蒸発させた。石油エーテルから石油エーテル中２５％の酢酸エチルの勾配を用いたカラムクロマトグラフィーによって残渣を精製したところ、５ｇのＡ−１が得られた。

中間体Ｂ−１の調製
ベンジルアミン（２．８６ｍＬ、２６．３ｍｍｏｌ）を、１０℃で撹拌しながら、エタノール（８０ｍＬ）中のＡ−１（４．１ｇ、２５ｍｍｏｌ）およびアニリン塩酸塩（５０ｍｇ）の溶液に滴下して加えた。反応混合物を室温で１８時間撹拌した。反応混合物を、１０℃で撹拌しながら、１ＭのＮａＯＨ（５０ｍＬ）に滴下して加え、得られた懸濁液を室温で１８時間撹拌した。固体をろ過によって収集し、水で洗浄し、減圧下で乾燥させた。表題化合物が、オフホワイトの固体、Ｂ−１（４ｇ）として得られた。

中間体Ｃ−１の調製
Ｎ−ブロモスクシンイミド（４ｇ、２２ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ（５０ｍＬ）中のＢ−１（４ｇ、２０ｍｍｏｌ）の懸濁液に、何回かに分けて（ｐｏｒｔｉｏｎｗｉｓｅ）加え、反応混合物を室温で１０分間撹拌した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を、酢酸エチル（３００ｍＬ）とＮａＨＣＯ_３（５０ｍＬ）の飽和水溶液から抽出し、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥させ、固体をろ過によって除去し、ろ液の溶媒を減圧下で除去した。ジクロロメタンからジクロロメタン中５％のメタノールの勾配を用いたカラムクロマトグラフィーによって、残渣を精製した。最良の画分を集め、溶媒を減圧下で除去したところ、ピンク色の固体、Ｃ−１（３ｇ）が得られた。

中間体Ｄ−１の調製
トリクロロアセトニトリル（４．８ｇ、１７．３ｍｍｏｌ）を、トルエン（５０ｍＬ）中のＣ−１（４ｇ、１４．４ｍｍｏｌ）およびＣｓ_２ＣＯ_３（９．４ｇ、２９ｍｍｏｌ）の懸濁液に加え、反応混合物を室温で４８時間撹拌した。混合物を水（１００ｍＬ）に注ぎ、酢酸エチル（３×５０ｍＬ）で抽出し、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥させ、固体をろ過によって除去し、ろ液を減圧下で濃縮した。残渣をエタノール（２０ｍＬ）に懸濁させ、室温で２時間撹拌した。得られた固体をろ過によって収集し、メタノールで洗浄したところ、オフホワイトの固体、Ｄ−１（２．７ｇ）が得られた。

中間体Ｆ−１の調製
ナトリウムメトキシド（２．４ｇ、０．０６ｍｏｌ）を、メタノール（１００ｍＬ）中のＤ−１（５ｇ、１２ｍｍｏｌ）の懸濁液に加え、反応混合物を１６時間にわたって還流状態で加熱した。混合物を氷水浴中で冷却し、水でクエンチした。メタノールを減圧下で蒸発させ、残渣を酢酸エチルで抽出した。有機層を乾燥させ、濃縮したところ、Ｆ−１（４．６ｇ、粗生成物）が得られた。

中間体Ｇ−１の調製
中間体Ｆ−１（４．６ｇ、１５ｍｍｏｌ）を、６ＮのＨＣｌ（水溶液）（７５ｍＬ）に懸濁させ、反応混合物を室温で３２時間撹拌した。混合物をアンモニアで中和し、得られた沈殿物をろ過によって収集し、水で洗浄したところ、Ｇ−１（３．２ｇ）が得られた。

中間体Ｈ−１の調製
２ＮのＮａＯＨ（水溶液）を、メタノール（５０ｍＬ）中のＧ−１（１ｇ、３．３４ｍｍｏｌ）の溶液に加え、反応混合物を室温で２時間撹拌した。メタノールを減圧下で除去し、反応混合物を、２ＮのＨＣｌ（水溶液）を用いてｐＨ２になるまで酸性化した。得られた沈殿物をろ過によって収集し、水で洗浄したところ、Ｈ−１（０．９５ｇ）が得られた。

中間体Ｉ−１の調製
ピリジン（１０ｍＬ）中の、Ｈ−１（５００ｍｇ、１．４ｍｍｏｌ）と、アミノケトン２（２８４ｍｇ、１．６ｍｍｏｌ）と、ＥＤＣＩ（４６０ｍｇ、２．４ｍｍｏｌ）との混合物を、マイクロ波中、０．５時間にわたって１１０℃まで加熱した。混合物を濃縮して、粗生成物を得て、それを、アセトニトリル（１０ｍＬ）および冷水で洗浄したところ、中間生成物Ｉ−１が、オフホワイトの固体（０．５ｇ）として得られた。

化合物１

ＮＨ_４ＯＡｃ（５ｇ）を、バイアルに加え、溶融されるまで油浴中で加熱した。次に、Ｉ−１（１００ｍｇ）を加え、反応混合物を、マイクロ波中１８０℃で１時間加熱した。混合物を水に注ぎ、混合された有機溶媒（ジクロロメタン：イソプロパノール３：１、２×６０ｍＬ）で抽出し、乾燥させ、濃縮した。粗生成物を、分取ＨＰＬＣによって精製したところ、黄色の固体、１（１０５ｍｇ）が得られた。

化合物２

化合物１（２３０ｍｇ）を合成するための手順にしたがって、化合物２を合成した。

化合物３

化合物１（２０５ｍｇ）を合成するための手順にしたがって、化合物３を合成した。

アミノケトンの調製のための一般的な手順
一般的な化学スキーム：

カルボン酸（１）を、塩化チオニルによって対応する酸塩化物２に転化する。他の塩素化剤、例えば塩化オキサリルまたはオキシ塩化リン）を用いることも可能である。酸塩化物（２）を、より低い温度で、ジアゾメタンで処理すると、ジアゾケトン（３）が得られる。低温での塩酸の添加によって、ジアゾケトン（３）を、そのα−クロロケトン（４）に転化する。α−クロロケトン（４）の塩素を、通常、双極性非プロトン性溶媒、例えばＤＭＳＯの存在下で、アジ化ナトリウムのような適切なアジド源からのアジドで置換する。

アミノケトン１の調製
反応スキーム：

工程１
トルエン（５０ｍＬ）中のＡ（１５ｇ、０．１３ｍｏｌ）の溶液に、ＳＯＣｌ_２（１５ｍＬ）を加えた。反応混合物を３時間還流させた。トルエンを減圧下で除去した。酸塩化物生成物が、褐色の液体（１６ｇ）として得られ、それを次の工程に直接使用した。

工程２
ジエチルエーテル（１００ｍＬ）中のＢ（１６ｇ、０．１２ｍｏｌ）の溶液に、ＣＨ_２Ｎ_２（２００ｍＬ）を０℃で加えた。反応混合物をこの温度で２時間撹拌した。エーテルを、室温で、減圧下で除去した。生成物を、フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、溶離剤：石油エーテル：酢酸エチル１０：１）によって精製したところ、Ｃ（１２ｇ）が得られた。
^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３、４００ＭＨｚ）：δ（ｐｐｍ）５．１８（ｂｒ．ｓ．，１Ｈ）、２．６５（ｂｒ．ｓ．，１Ｈ）、１．４５〜１．８１（ｍ，８Ｈ））。

工程３
ＴＨＦ（６５ｍＬ）中のＣ（１２ｇ、０．０９６ｍｏｌ）の溶液に、４ＮのＨＣｌ／ジオキサンを０℃で滴下して加えた。反応をＴＬＣによって監視した。反応物を、ＮａＨＣＯ_３（飽和水溶液）で中和した。混合物を、酢酸エチル（２×１５０ｍＬ）で抽出し、乾燥させ、濃縮したところ、Ｄ（１１ｇ）が得られた。この生成物を、すぐに次の工程に使用した。
^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３、４００ＭＨｚ）：δ（ｐｐｍ）４．１０（ｓ，２Ｈ）、３．０４（ｑｕｉｎ，Ｊ＝７．３Ｈｚ、１Ｈ）、１．５４〜１．８７（ｍ，８Ｈ）

工程４
ＤＭＳＯ（３０ｍＬ）中のＤ（７．３ｇ、０．０５ｍｏｌ）の溶液に、ＮａＮ_３（３．９ｇ、０．０６ｍｏｌ）を加えた。反応物を一晩撹拌し、ＴＬＣによって監視した。反応物を水（５０ｍＬ）に注ぎ、酢酸エチル（２×１００ｍＬ）で抽出し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、固体をろ過によって除去し、ろ液の溶媒を減圧下で除去した。石油エーテルから酢酸エチルの勾配を用いたシリカゲルクロマトグラフィーによって粗生成物を精製したところ、Ｅ（５．２８ｇ）が得られた。
^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３、４００ＭＨｚ）：δ（ｐｐｍ）３．９３（ｓ，２Ｈ）、２．８３（ｑｕｉｎ，Ｊ＝７．３Ｈｚ、１Ｈ）、１．５６〜１．８４（ｍ，８Ｈ）

工程５
３０ｍＬのメタノール中の、Ｅ（３．２８ｇ、０．０２ｍｏｌ）と、濃ＨＣｌ（１．８ｍＬ、０．０２ｍｏｌ）と、１ｇのＰｄ／Ｃ（１０％）との混合物を、５０ｐｓｉの水素雰囲気下で一晩撹拌した。反応混合物をろ過し、濃縮したところ、アミノケトン−１（２ｇ）が得られた。
^１Ｈ ＮＭＲ（ＭｅＯＤ、４００ＭＨｚ）：δ（ｐｐｍ）４．０３（ｓ，２Ｈ）、３．０１〜３．１２（ｑｕｉｎ，Ｊ＝７．３Ｈｚ、１Ｈ）、１．６７〜１．９８（ｍ，８Ｈ）

アミノケトン−２

アミノケトン−１を調製するための手順にしたがって、アミノケトン−２を調製した。

アミノケトン３

アミノケトン−１を調製するための手順にしたがって、アミノケトン−３を調製した。

最終生成物の調製のための全体スキーム（方法２）

化合物４の調製：

ＮＨ_３／ＭｅＯＨ（７Ｎ）（６０ｍＬ）中の、Ｃ−１（１．６ｇ、５．７８ｍｍｏｌ）（その合成自体が、５アミノ−１−ベンジル−２−ブロモ−１Ｈ−イミダゾール−４−カルボニトリルを得るために国際公開第２００６０１１７６７０号パンフレットの５９〜６０頁：「Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ６，７ ａｎｄ ８」にそれぞれ記載される）と、２−シアノ−イミダゾール（５９２ｍｇ、６．３５ｍｍｏｌ）との混合物を、圧力容器反応器中、１４０℃で４８時間撹拌した。溶媒を蒸発させた。ＤＣＭ／ＭｅＯＨ／ＮＨ_４ＯＨ ９７／３／０．５→９５／５／０．５）中のシリカゲルカラム（１５〜４０μｍ、４０ｇ）におけるカラムクロマトグラフィーによって、粗化合物を精製したところ、化合物４（７８ｍｇ、４．４％の収率）が得られた。

化合物１の代替的な合成：

工程１：
ＥｔＯＮａ（９０４ｍｇ；１３．３ｍｍｏｌ）を、ＥｔＯＨ（３０ｍＬ）中の２−シアノ−イミダゾールＩ−１（０．７ｇ；２．６６ｍｍｏｌ）および中間体Ｃ−１（７３６ｍｇ；２．６６ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。混合物を９０℃で１６時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去した。粗生成物を、分取ＬＣ（不定形ＳｉＯＨ ４５ｇのＭｅｒｃｋ、移動相９７／３／０．１〜９５／５／０．５）によって精製したところ、０．５１ｇのＳＥＭ−保護されたエトキシ中間体が淡黄色の固体（３８％の収率）として得られた。
ＨＰＬＣ Ｒｔ（分）＝７．４５；ＭＳ Ｍ＋（Ｈ^＋）：５０６方法（ｖ２００３ｖ２００２）

工程２：
ＮａＦ（１７０ｍｇ；４．０５ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ（２８ｍＬ）、ＨＣｌ（Ｈ_２Ｏ中３７％）（２８ｍＬ）およびＭｅＯＨ（１０ｍＬ）中のＳＥＭ−保護されたエトキシ中間体（０．４１ｇ；０．８１１ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。混合物を４０℃で１６時間撹拌した。混合物を室温に冷まし、溶液のｐＨが塩基性になるまでＫ_２ＣＯ_３の１０％の溶液を加えた。水層を、Ｋ_２ＣＯ_３粉末で飽和し、生成物をＤＣＭ／ＭｅＯＨ（５％）で（３回）抽出した。組み合わされた有機層を、ＭｇＳＯ_４上で乾燥させ、ろ過し、溶媒を減圧下で除去した。粗生成物を、分取ＬＣ（不定形ＳｉＯＨ１５〜４０μｍ、移動相ＤＣＭ／ＭｅＯＨ／ＮＨ_３水溶液９５／５／０．５〜９０／１０／０．５）によって精製したところ、１２０ｍｇの化合物１が白色の粉末（４３％の収率）として得られた。

２−シアノ−イミダゾール中間体の合成：
中間体Ｊ−１の合成：

ＮａＣＮ（３６０ｍｇ；７．３５ｍｍｏｌ）を、ＥｔＯＨ（２００ｍＬ）中のシクロプロパン−カルボキシアルデヒド（５ｇ；７１．３ｍｍｏｌ）およびトシルメチル−イソシアニド（１３．７ｇ；６９．９ｍｍｏｌ）の懸濁液に加えた。得られた混合物を室温で１時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、残渣をヘプタン／エーテル（１：１）の混合物で洗浄した。ベージュ色の乾燥粉末を、ＮＨ_３／ＭｅＯＨ ７Ｎ（４８０ｍＬ；３．３６ｍｏｌ）中で撹拌し、混合物を、スチールボム（ｓｔｅｅｌ ｂｏｍｂ）中で、１００℃で１６時間撹拌した。混合物を室温に冷まし、溶媒を減圧下で蒸発させた。ｉＰｒ_２Ｏ残渣に加え、固体をろ過した。ろ液を蒸発乾固させ、粗生成物を、（不定形ＳｉＯＨ２０〜４５μｍ １０００ｇのＤＡＶＩＳＩＬ）、移動相（０．５％のＮＨ_４ＯＨ、９４％のＤＣＭ、６％のＭｅＯＨ）における分取ＬＣによって精製した。純粋な画分を収集し、蒸発させたところ、４．９ｇの中間体Ｊ−１ａが褐色の油（６５％の収率）として得られた。
^１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６、４００ＭＨｚ）：δ（ｐｐｍ）８．６０（ｂｒ．ｓ．，１Ｈ）、７．５８（ｓ，１Ｈ）、６．７６（ｓ，１Ｈ）、１．８５（ｍ，１Ｈ）、０．８６（ｍ，２Ｈ）、０．７１（ｍ，２Ｈ）。

ＴＨＦ（６０ｍＬ）中のＪ−１ａ（４．８４ｇ；４４．８ｍｍｏｌ）を、Ｎ_２下で、０℃でＴＨＦ（２００ｍＬ）中のＮａＨ（１．９７ｇ；４９．２ｍｍｏｌ）の懸濁液に滴下して加えた。混合物を室温で３０分間撹拌し、ＴＨＦ（２０ｍＬ）中のＳＥＭ−Ｃｌ（９．９ｍＬ；５５．９ｍｍｏｌ）を、０℃で滴下して加えた。混合物を、室温で、Ｎ_２下で１６時間撹拌した。水を加え、生成物をＤＣＭで抽出した。有機層をＭｇＳＯ_４上で乾燥させ、ろ過し、減圧下で濃縮した。粗生成物を、分取ＬＣ（不定形ＳｉＯＨ２０〜４５μｍ、１５０ｇのＭｅｒｃｋ、５０％のＤＣＭ、５０％のヘプタンから１００％のＤＣＭへの移動相勾配）によって精製した。純粋な化合物を含有する画分を組み合わせて、溶媒を減圧下で除去したところ、６．６ｇのＪ−１ｂが黄色の油（６２％）として得られた。

２つの位置異性体の混合物：７０／３０
副位置異性体：
^１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６、４００ＭＨｚ）：δ（ｐｐｍ）７．６４（ｓ，１Ｈ）、６．５６（ｓ，１Ｈ）、５．３４（ｓ，１Ｈ）、３．４５（ｔ，Ｊ＝８．０８Ｈｚ、２Ｈ）、１．７３〜１．７８（ｍ，１Ｈ）、０．８０〜０．８６（ｍ，２Ｈ）、０．７２〜０．７４（ｍ，２Ｈ）、０．５２〜０．５７（ｍ，２Ｈ）、−０．０４（ｓ，９Ｈ）。
主位置異性体：
^１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６、４００ＭＨｚ）：δ（ｐｐｍ）７．５６（ｓ，１Ｈ）、６．９４（ｓ，１Ｈ）、５．２０（ｓ，１Ｈ）、３．４３（ｔ，Ｊ＝８．０８Ｈｚ、２Ｈ）、１．７３〜１．７８（ｍ，１Ｈ）、０．８０〜０．８６（ｍ，２Ｈ）、０．７２〜０．７４（ｍ，２Ｈ）、０．５６〜０．６２（ｍ，２Ｈ）、−０．０４（ｓ，９Ｈ）。

ＢｒＣＮ（６．１１ｇ；５７．７ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（６０ｍＬ）中のＤＭＡＰ（７．０５ｇ；５７．７ｍｍｏｌ）の溶液に１０℃で加えた。反応物は、３５℃になるまで発熱し、淡黄色沈殿物が形成された。混合物を１０℃に冷却し、Ｊ−１ｂ（５．５ｇ；２３．１ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を４０℃で６時間撹拌した。水を加え、生成物を、Ｅｔ_２Ｏで（２回）抽出した。組み合わされた有機層を、塩水で洗浄し、ＭｇＳＯ_４上で乾燥させ、ろ過し、溶媒を減圧下で除去した。
粗生成物を、分取ＬＣ（不定形ＳｉＯＨ１５〜４０μｍ ２２０ｇのｇｒａｃｅ、移動相ヘプタン／ＤＣＭ５０／５０〜１０／９０）によって精製して、２．２ｇの不純物Ｊ−１を得て、それを、分取ＬＣ（不定形ＳｉＯＨ１５〜４０μｍ ９０ｇのＭｅｒｃｋ、移動相ヘプタン／ＤＣＭ３０／７０）によってさらに精製したところ、０．９４ｇのＪ−１が２つの位置異性体の混合物（１５％の収率）として得られた。
ＨＰＬＣ Ｒｔ（分）＝６．１１；ＭＳ Ｍ＋（Ｈ^＋）：２６４（方法Ｖ１００４Ｖ１０１２）

中間体Ｊ−１の代替的な合成：

ＢｕＬｉ（ヘキサン中１．６Ｍ）（１１ｍＬ；１７．６ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ（６０ｍＬ）中のＪ−１ｂ（３．５ｇ；１４．７ｍｍｏｌ）の溶液に−５０℃で加えた。混合物を、同じ温度で３０分間撹拌し、ＤＭＦ（１．７ｍＬ；２２ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を、１時間で室温になるまでゆっくりと温め、ＮＨ_２ＯＨ・ＨＣｌ（９７０ｍｇ；２９．４ｍｍｏｌ）を加え、混合物を室温で１６時間撹拌した。水を加え、生成物をＤＣＭで（３回）抽出し、塩水で洗浄し、ＭｇＳＯ_４上で乾燥させ、溶媒を減圧下で除去したところ、４．１ｇ（定量的収量）の異性体Ｋ−１の混合物が黄色の油として得られた。
ＨＰＬＣ Ｒｔ（分）＝５．３０、５．４１および５．９０；ＭＳ Ｍ＋（Ｈ^＋）：２８２（方法Ｖ２００２Ｖ２００２）

Ｋ−１（３．１ｇ；１１ｍｍｏｌ）を、室温でＤＣＭ（１８ｍＬ）およびピリジン（１９ｍＬ）に溶解させた。混合物を０℃に冷却し、ＴＦＡＡ（４．６ｍＬ；３３ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で２４時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、残渣をＡｃＯＥｔに溶解させた。有機層を水および塩水で洗浄し、ＭｇＳＯ_４上で乾燥させ、ろ過し、溶媒を減圧下で除去した。粗生成物を、分取ＬＣ（不定形ＳｉＯＨ１５〜４０μｍ ９０ｇのｍｅｒｃｋ、移動相ヘプタン／ＤＣＭ３０／７０〜ＤＣＭ１００％）によって精製したところ、２．１４ｇの中間体Ｊ−１（７３％）が２つの異性体の混合物として得られた。
ＨＰＬＣ Ｒｔ（分）＝６．５１；ＭＳ Ｍ＋（Ｈ^＋）：２６４（方法Ｖ２００２Ｖ２００２）

最終生成物の調製のための全体スキーム：（方法３）

中間体Ｎ−１の合成

ＣＥＭマイクロ波オーブン中で、ＤＭＳＯ（１００ｍＬ）中の、Ｍ−１（その合成自体が、６−アミノ−９−ベンジル−２−クロロ−７，９−ジヒドロ−プリン−８−オンを得るために国際公開第２００６１１７６７０号パンフレットの５７〜５８頁「Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ １−４」にそれぞれ記載される）（９．７ｇ、３７．３５１ｍｍｏｌ）と、ＮａＣＮ（３．１１ｇ、６３．５０ｍｍｏｌ）との混合物を、１５０℃で４時間撹拌した。混合物を水に注ぎ、沈殿物をろ過して取り除き、水で洗浄し、６０℃で、減圧下で乾燥したところ、８．６ｇの中間体Ｎ−１が得られた。
ＨＰＬＣ Ｒｔ（分）＝５．２３；ＭＳ Ｍ＋（Ｈ^＋）：２５１（方法Ｖ２００３Ｖ２００２）

中間体Ｏ−１の合成

ＦｅＣｌ_３（チップスパチュラ（ｔｉｐ ｓｐａｔｕｌａ））を、ＣＨＣｌ_３（６０ｍＬ）中のＮ−１（３．７０ｇ、１４７．８４ｍｍｏｌ）とＮＢＳ（２６．２ｇ、１４７．８４５ｍｍｏｌ）との混合物に加えた。混合物を撹拌し、３時間還流させ、次に、室温に冷ました。沈殿物をろ過して取り除いた。ろ液を蒸発させ、シリカゲル（１５〜４０μｍ、１２０ｇ、ＣＨ_２Ｃｌ_２／ＣＨ_３ＯＨ ９９−１）におけるフラッシュクロマトグラフィーによって精製したところ、４．５ｇの不純な中間体Ｏ−１が得られた。画分をＣＨ_２Ｃｌ_２に取り込み、沈殿物をろ過して取り除いたところ、１．８ｇの中間体Ｏ−１が得られた。
ＨＰＬＣ Ｒｔ（分）＝５．７７；ＭＳ Ｍ＋（ＨＣＨ_３ＣＮ^＋）：３７０−３７２（方法Ｖ２００３Ｖ２００２）

中間体Ｐ−１の合成

ＭｅＯＨ（１５ｍＬ）中の、Ｏ−１（０．８２ｇ、２．４９１ｍｍｏｌ）と、ＭｅＯＮａ／ＭｅＯＨ（３０重量％の溶液）（１．１５ｍＬ、６．２２８ｍｍｏｌ）と混合物を、５０℃で２時間撹拌した。ＮＨ_４Ｃｌ（３３３ｍｇ、６．２２８ｍｍｏｌ）を加え、混合物を撹拌し、２時間還流させた。溶媒を減圧下で蒸発させた。粗生成物を、シリカゲル（１５〜４０μｍ、９０ｇ、ＣＨ_２Ｃｌ_２／ＣＨ_３ＯＨ／ＮＨ_４ＯＨ：８５−１４−１）におけるフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。純粋な画分を収集し、減圧下で濃縮したところ、０．５５ｇの中間体Ｐ−１（７４％の収率）が得られた。
ＨＰＬＣ Ｒｔ（分）＝４．４６；ＭＳ Ｍ＋（Ｈ^＋）：２９８（方法Ｖ２００３Ｖ２００２）

中間体Ｑ−１の合成

２−ブロモ−１−シクロプロピル−プロパン−１−オン（１０４ｍｇ、０．５８９ｍｍｏｌ）を、ＥｔＯＨ（５ｍＬ）中のＰ−１（１７５ｍｇ、０．５８９ｍｍｏｌ）とＤＢＵ（０．２６４ｍＬ、１．７６６ｍｍｏｌ）との混合物に滴下して加えた。混合物を撹拌し、５時間還流させた。溶媒を減圧下で濃縮した。粗生成物を、シリカゲル（１５〜４０μｍ、４０ｇ、ＣＨ_２Ｃｌ_２／ＣＨ_３ＯＨ／ＮＨ_４ＯＨ：９５／５／０．１）におけるフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。純粋な画分を収集し、減圧下で濃縮したところ、４０ｍｇの中間体Ｑ−１が得られた。粗化合物を次の工程に直接使用した。
ＨＰＬＣ Ｒｔ（分）＝５．３５；ＭＳ Ｍ＋（Ｈ^＋）：３７６（方法Ｖ１００５Ｖ１０１２）

最終的な化合物５の合成：

ＨＣｌ ６Ｎ（１ｍＬ）およびジオキサン（１ｍＬ）中のＱ−１（４０ｍｇ、０．１０７ｍｍｏｌ）の混合物を、室温で６時間撹拌した。混合物を、減圧下で半分蒸発させた（ｈａｌｆ−ｅｖａｐｏｒａｔｅｄ）。溶液を０℃に冷却し、ＮａＨＣＯ_３を用いて塩基性化し、ＥｔＯＡｃ−ＣＨ_３ＯＨ（９０−１０）で抽出した。組み合わされた有機層を、ＭｇＳＯ_４上で乾燥させ、ろ過し、溶媒を減圧下で蒸発させた。粗生成物を、シリカゲル（１５〜４０μｍ、１０ｇ、ＣＨ_２Ｃｌ_２／ＣＨ_３ＯＨ／ＮＨ_４ＯＨ：８８−１２−０．５）におけるフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。純粋な画分を収集し、減圧下で濃縮した。得られた固体（３５ｍｇ）を、Ｅｔ_２Ｏから結晶化したところ、２５ｍｇの化合物５（６４％の収率、ＭＰ＞２６０℃）が得られた。

最終生成物の調製における全体スキーム：（方法４）

中間体Ｔ−１の合成：

Ｓ−１（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９６，３９，１３，２５８６−２５９３に記載される合成）（１．１４ｇ；９．３３ｍｍｏｌ）を、ＥｔＯＨ（３０ｍＬ）中の、Ｒ−１（国際公開第２００６／１１７６７０号パンフレットに記載される合成）（１．４６ｇ；８．８９ｍｍｏｌ）およびアニリン・ＨＣｌ（１８ｍｇ；０．１４ｍｍｏｌ）の溶液に１０℃で滴下して加えた。反応混合物を室温で２０時間撹拌した。ＮａＯＨ ３Ｍ（３０ｍＬ）の水溶液を、溶液に１０℃で加え、得られた混合物を室温で１時間撹拌した。水層をＤＣＭで（３回）抽出した。組み合わされた有機層を、ＮａＨＣＯ_３の飽和水溶液で洗浄し、ＭｇＳＯ_４上で乾燥させ、ろ過し、減圧下で濃縮したところ、１．２０ｇのＴ−１が褐色の固体（６３％の収率）として得られた。Ｔ−１を、さらに精製せずに次の工程に使用した。
ＨＰＬＣ Ｒｔ（分）＝４．４５；ＭＳ Ｍ＋（Ｈ^＋）：２１４（方法Ｖ１０１０Ｖ１０１２）

中間体Ｕ−１の合成：

ＴＨＦ（１０ｍＬ）中のＮＣＳ（４７５ｍｇ；３．５６ｍｍｏｌ）の溶液を、ＴＨＦ（３５ｍＬ）中のＴ−１（６９０ｍｇ；３．２４ｍｍｏｌ）の溶液に滴下して加えた。溶液を、Ｎ_２流れ下で、室温で２０時間撹拌した。ＴＨＦ（５ｍＬ）中のＮＣＳ（２６０ｍｇ；１．９４ｍｍｏｌ）の溶液を、溶液に滴下して加えた。溶液を、Ｎ_２流れ下で、室温で１６時間撹拌した。混合物をＤＣＭに取り込み、ＮａＨＣＯ_３の飽和水溶液で洗浄し、塩水で洗浄し、ＭｇＳ０_４上で乾燥させ、ろ過し、減圧下で蒸発させたところ、９５０ｍｇの褐色の固体が得られた。粗生成物を、分取ＬＣ（不定形ＳｉＯＨ１５〜４０μｍ、４０ｇのＧｒａｃｅ、液体試料、移動相：９８％のＤＣＭ、２％のＭｅＯＨ〜９０％のＤＣＭ、１０％のＭｅＯＨ）によって精製した。純粋な化合物を含有する画分を組み合わせて、溶媒を減圧下で除去したところ、２００ｍｇのＵ−１が褐色の固体（２５％の収率）として得られた。
ＨＰＬＣ Ｒｔ（分）＝５．１３；ＭＳ Ｍ＋（Ｈ^＋）：２４８−２５０（方法Ｖ２０１２Ｖ２００２）

中間体Ｗ−１の合成：

ＥｔＯＮａ（３９８ｍｇ；５．８５ｍｍｏｌ）を、ＥｔＯＨ（１５ｍＬ）中のＵ−１（２９０ｍｇ；１．１７ｍｍｏｌ）およびＶ−１（２７０ｍｇ；１．２１ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。混合物を９０℃で１６時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去した。粗生成物を、分取ＬＣ（不定形ＳｉＯＨ１５〜４０μｍ、５０ｇのＭｅｒｃｋ、固体試料、移動相９７／３／０．１）によって精製した。純粋な化合物を含有する画分を組み合わせて、溶媒を除去したところ、２１０ｍｇのＷ−１が淡黄色の固体（３７％の収率）として得られた。
ＨＰＬＣ Ｒｔ（分）＝６．６８；ＭＳ Ｍ＋（Ｈ^＋）：２４８−２５０（方法Ｖ１０１０Ｖ１０１２）

化合物９の合成：

ＮａＦ（９１ｍｇ；２．１８ｍｍｏｌ）を、水中３７％のＨＣｌ（１５ｍＬ）およびＭｅＯＨ（１０ｍＬ）中のＷ−１（２１０ｍｇ；０．４４ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。混合物を４０℃で１６時間撹拌した。混合物を室温に冷まし、Ｋ_２ＣＯ_３の１０％の水溶液を、塩基性のｐＨになるまで加えた。水層を、Ｋ_２ＣＯ_３粉末で飽和し、生成物をＤＣＭ／ＭｅＯＨ（９５／５）で（３回）抽出した。組み合わされた有機層を、ＭｇＳＯ_４上で乾燥させ、ろ過し、溶媒を減圧下で除去した。粗生成物を、分取ＬＣ（不定形ＳｉＯＨ１５〜４０μｍ、Ｍｅｒｃｋ１０ｇ、移動相ＤＣＭ／ＭｅＯＨ／ＮＨ_３水溶液９３／３／０．１〜８５／１５／１）によって精製した。純粋な化合物を含有する画分を組み合わせて、溶媒を減圧下で除去し、表題化合物を、６０℃で１６時間、減圧下で乾燥させたところ、９．８ｍｇの化合物９（６％）が薄茶色の固体として得られた。融点＞２６０℃。

最終生成物の調製のための全体スキーム：（方法５）

中間体Ｙ１の合成：

ナトリウムメトキシド（ＭｅＯＨ中３０重量％）（１５．６ｍＬ、８４．１７２ｍｍｏｌ）を、室温でＭｅＯＨ（１５０ｍＬ）中のＸ１（Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１１，２００３，５５０１−５５０８に記載される合成）（５．７ｇ、１６．８３４ｍｍｏｌ）の混合物に滴下して加えた。混合物を６０℃で６時間撹拌し、次に、室温に冷ました。沈殿物をろ過して取り除き、乾燥させたところ、３．２５ｇのＹ１が得られた。粗化合物を次の工程に使用した。
ＨＰＬＣ Ｒｔ（分）＝５．５３；ＭＳ Ｍ＋（Ｈ^＋）：２９０−２９２（方法Ｖ２００３Ｖ２００２）

中間体Ｚ−１の合成：

Ｂｏｃ_２Ｏ（３．０ｇ、１３．８０６ｍｍｏｌ）を、室温でＴＨＦ（１０ｍＬ）中の、Ｙ−１（１．０ｇ、３．４５２ｍｍｏｌ）と、ＤＭＡＰ（４２ｍｇ、０．３４５ｍｍｏｌ）との混合物にＮ_２流れ下で加えた。混合物を８０℃で２時間撹拌した。混合物を水に注ぎ、ＥｔＯＡｃで抽出した。有機層を水で洗浄し、ＭｇＳＯ_４上で乾燥させ、ろ過し、溶媒を蒸発させた。粗生成物を、（不定形ＳｉＯＨ２０〜４５μｍ ４５０ｇのＭＡＴＲＥＸ）、移動相（９８％のＤＣＭ、２％のＡｃＯＥｔから９５％のＤＣＭ、５％のＡｃＯＥｔへの勾配）における分取ＬＣによって精製したところ、０．８２５ｇのＺ−１（４９％の収率、ＭＰ＝１５９℃）が得られた。
ＨＰＬＣ Ｒｔ（分）＝４．４３；ＭＳ Ｍ＋（Ｈ^＋）：４９０−４９２（方法Ｖ２０１５Ｖ２００７）

中間体Ｂ−２の合成：

ジオキサン／水（４／１）（３ｍＬ）中の、Ｚ−１（３００ｍｇ、０．６１２ｍｍｏｌ）、Ａ−２（２５５ｍｇ、０．９１８ｍｍｏｌ）およびＮａＨＣＯ_３（２５７ｍｇ、３．０６ｍｍｏｌ）の溶液を、Ｎ_２を１０分間バブリングすることによって脱気した。テトラキス−（トリフェニルホスフィン）−パラジウム（１４２ｍｇ、０．１２２ｍｍｏｌ）を加え、混合物を１００℃で５時間撹拌した。水およびＥｔＯＡｃを加え、層をデカントした。水層をＥｔＯＡｃで抽出した。有機層を組み合わせて、ＭｇＳＯ_４上で乾燥させ、ろ過し、溶媒を、さらに精製せずに、次の工程において蒸発させた。

最終的な化合物２３の合成：

ＨＣｌ ６Ｎ（１０ｍＬ）を、０℃でジオキサン（７ｍＬ）中のＢ−２（０．７ｇ、１．１５ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。混合物を室温で１２時間撹拌し、次に、０℃に冷却し、Ｋ_２ＣＯ_３を用いて塩基性化した。混合物をＥｔＯＡｃ＋ＣＨ_３ＯＨ（９０−１０）で抽出した。組み合わされた有機層を、ＭｇＳＯ_４上で乾燥させ、ろ過し、溶媒を蒸発させた。粗生成物を、（安定性シリカ（Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ Ｓｉｌｉｃａ）５μｍ １５０×３０．０ｍｍ）、移動相（０．３％のＮＨ４ＯＨ、９７％のＤＣＭ、３％のＭｅＯＨから１．４％のＮＨ４ＯＨ、８６％のＤＣＭ、１４％のＭｅＯＨへの勾配）における分取ＬＣによって精製したところ、ＣＨ_３ＯＨからの結晶化の後に６７ｍｇの最終的な化合物２３（１９％の収率）が得られた。

最終生成物の調製のための全体スキーム：（方法６）

中間体Ｃ−２の合成：

ＨＣｌ ６Ｎ（５ｍＬ）およびジオキサン（５ｍＬ）中のＹ−１（０．５３ｇ、１．８２９ｍｍｏｌ）の混合物を、室温で１８時間撹拌した。沈殿物をろ過して取り除き、最低限のジオキサンで洗浄し、乾燥させたところ、０．２８ｇの粗生成物Ｃ−２が得られ、それを、さらに精製せずに次の工程に使用した。
ＨＰＬＣ Ｒｔ（分）＝４．９６；ＭＳ Ｍ＋（Ｈ^＋）：２７６−２７８（方法Ｖ２００３Ｖ２００２）

中間体Ｄ−２の合成：

ＮＥｔ_３（０．１８７ｍＬ、１．３４５ｍｍｏｌ）、次に、Ｂｏｃ_２Ｏ（０．２１５ｇ、０．９８７ｍｍｏｌ）を、室温でＴＨＦ（３ｍＬ）中のＣ−２（０．２８ｇ、０．８９７ｍｍｏｌ）とＤＭＡＰ（１１ｍｇ、０．０８９７ｍｍｏｌ）との混合物に加えた。混合物を８０℃で２時間撹拌した。水およびＥｔＯＡｃを加えた。層をデカントした。有機層をＭｇＳＯ_４上で乾燥させ、ろ過し、溶媒を蒸発させたところ、０．１８ｇの中間体Ｄ−２が得られた。粗化合物を次の工程に直接使用した。
ＨＰＬＣ Ｒｔ（分）＝６．３１；ＭＳ Ｍ＋（Ｈ^＋）：３７６−３７８（方法Ｖ２００２Ｖ２００２）

最終的な化合物２０の合成：

ジオキサン／水（４／１）（３．２ｍＬ）中の、Ｄ−２（２４０ｍｇ、０．６４ｍｍｏｌ）、Ｅ−２（１０７ｍｇ、０．９６ｍｍｏｌ）およびＮａＨＣＯ_３（２６９ｍｇ、３．２ｍｍｏｌ）の溶液を、Ｎ_２を１０分間バブリングすることによって脱気した。テトラキス−（トリフェニルホスフィン）−パラジウム（１４８ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）を加え、混合物を１００℃で１６時間撹拌した。水およびＥｔＯＡｃを加え、層をデカントした。水層をＥｔＯＡｃで抽出した。有機層を組み合わせて、ＭｇＳＯ_４上で乾燥させ、ろ過し、溶媒を蒸発させた。粗生成物を、逆相において精製したところ、１３ｍｇの最終的な化合物２０（６％の収率）が得られた。

最終生成物の調製のための全体スキーム：（方法７）

最終的な化合物３６の合成：

Ｚ−１（３００ｍｇ、０．６１２ｍｍｏｌ）とピラゾール（４１７ｍｇ、６．１２３ｍｍｏｌ）との混合物を、１８０℃で１時間撹拌した（マイクロ波バイオタージ（ｍｉｃｒｏｗａｖｅ ｂｉｏｔａｇｅ））。粗化合物を、ＣＨ_２Ｃｌ_２／ＭｅＯＨ／ＮＨ_４ＯＨ９６／４／０．５中のシリカゲルカラム（１５〜４０μｍ、２５ｇ）におけるクロマトグラフィーによって精製したところ、ジイソプロピルエーテル中での結晶化および８０℃での減圧下での乾燥の後、８５ｍｇの最終的な化合物３６が得られた。

最終生成物の調製のための全体スキーム：（方法８）
中間体Ｇ−２の合成：

ＴＦＡ（２１０ｍＬ）中のＦ−２（５０ｇ、３１６．０９ｍｍｏｌ）の溶液を、室温で３０分間撹拌した。混合物を５℃に冷却し、次に、発煙ＨＮＯ_３（１９．５ｍＬ、４２６．７３ｍｍｏｌ）を５℃で滴下して加えた。添加中、温度を１０〜１５℃に維持した。氷浴を除去し、温度が２０℃に達したら、激しい発熱事象が起こった（５秒間で２０℃から４５℃まで）。混合物を室温で１６時間撹拌した。混合物を水と氷との混合物に注いだ。沈殿物をろ過して取り除き、水で洗浄した。沈殿物を、５０℃で、減圧下で乾燥させたところ、４２ｇ（６５％の収率）の中間体Ｇ−２が得られた。この中間体を、さらに精製せずに次の工程に直接使用した。

中間体Ｈ−２の合成：

Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン（７６．７ｍＬ、０．６１ｍｏｌ）を、０℃でＰＯＣｌ_３（９３．７ｍＬ、１．０１ｍｏｌ）に滴下して加えた。Ｇ−２（４１ｇ、２０１．７９ｍｍｏｌ）を、０℃で何回かに分けて加え、次に、混合物を２時間にわたって１００℃まで温めた。溶液を減圧下で濃縮し、残りのＰＯＣｌ_３を、トルエンとともに（３回）共沸蒸発することによって除去した。得られた油を、ＣＨ_２Ｃｌ_２−ヘプタン（７０−３０）の溶液に取り込み、ＳｉＯ_２のガラスフィルタを通してろ過した。ろ液を濃縮し、残渣を、（不定形ＳｉＯＨ２０〜４５μｍ １０００ｇのＤＡＶＩＳＩＬ）、移動相（８０％のヘプタン、２０％のＣＨ_２Ｃｌ_２）における分取ＬＣによって精製した。純粋な画分を収集し、濃縮したところ、３７．８ｇ（７８％の収率）の中間体Ｈ−２が得られた。

中間体Ｉ−２の合成：

ｉＰｒＯＨ（１１５ｍＬ、２２９．３１ｍｍｏｌ）中のＮＨ_３の２Ｍの溶液を、ＴＨＦ（３６０ｍＬ）中のＨ−２（３６．７ｇ、１５２．８７ｍｍｏｌ）およびＥｔ_３Ｎ（２３．４ｍＬ、１６８．１６ｍｍｏｌ）の溶液に滴下して加えた（添加中、氷水浴を用いて温度を室温に維持した）。反応混合物を室温で５時間撹拌した。混合物を蒸発乾固させた。水およびＥｔＯＡｃを残渣に加えた。層を分離し、水層をＥｔＯＡｃで（２回）抽出した。組み合わされた有機層を、ＭｇＳＯ_４上で乾燥させ、ろ過し、溶媒を減圧下で除去したところ、３４．５ｇ（１００％の収率）の中間体Ｉ−２が得られた。

中間体Ｊ−２の合成：

クロロギ酸エチル（１３．５ｍＬ、１３８．９０ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ（１３００ｍＬ）中のＩ−２（３９．８ｇ、１２６．２７ｍｍｏｌ）およびＥｔ_３Ｎ（２６．５ｍＬ、１８９．４０ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。混合物を室温で６時間撹拌し、溶媒を、減圧下で部分的に蒸発させた。残渣を、ＣＨ_２Ｃｌ_２および水に取り込んだ。層を分離し；水層をＣＨ_２Ｃｌ_２で（２回）抽出した。組み合わされた有機層を、ＭｇＳＯ_４上で乾燥させ、ろ過し、溶媒を減圧下で除去した。残渣を、（不定形ＳｉＯＨ２０〜４５μｍ １０００ｇのＤＡＶＩＳＩＬ）、移動相（８５％のヘプタン、１５％のＡｃＯＥｔから８０％のヘプタン、２０％のＡｃＯＥｔへの勾配）における分取ＬＣによって精製した。純粋な画分を収集し、濃縮したところ、３５ｇ（９５％の収率）の中間体Ｊ−２が得られた。

中間体Ｌ−２の合成：

アセトン（１３０ｍＬ）中の、Ｊ−２（５ｇ、１７．０ｍｍｏｌ）、Ｋ−２（３．９１ｇ、１７．０ｍｍｏｌ）、Ｋ_２ＣＯ_３（５．９０ｇ、４２．７ｍｍｏｌ）およびＮａＩ（２．５６ｇ、１７．０ｍｍｏｌ）を、室温で１８時間撹拌した。溶液をろ過し、ろ液を減圧下で蒸発させた。粗化合物を、分取ＬＣ（不定形ＳｉＯＨ１５〜４０μｍ、１２０ｇのｍｅｒｃｋ、固体試料、移動相：ヘプタン／ＥｔＯＡｃ１００／０〜８０／２０）によって精製したところ、中間体Ｌ−２が淡黄色の固体（６９％の収率）として得られた。

中間体Ｍ−２の合成：

２．７ｇのＬ−２の２つのバッチで、反応を行った。

これが、２．７ｇの１つのバッチのプロトコルである：
密閉管中で、Ｌ−２（２．７０ｇ、６．１２ｍｍｏｌ）を、室温で２時間、ＮＨ_３（ＭｅＯＨ中７Ｍ）（５０ｍＬ）およびＴＨＦ（５０ｍＬ）中で撹拌した。２つのバッチを混合した。混合物を減圧下で蒸発させ、残渣を、ＥｔＯＨとともに（２回）共沸蒸留することによって乾燥させたところ、黄色の固体が得られた。水およびＥｔＯＡｃを加え、層を分離し、水層をＥｔＯＡｃで（２回）抽出した。組み合わされた有機層を、ＭｇＳＯ_４上で乾燥させ、ろ過し、減圧下で蒸発させたところ、４．９ｇの中間体Ｍ−２が黄色の固体（９０％の収率）として得られた。

中間体Ｎ−２の合成：

ｍＣＰＢＡ（１．４６ｇ、５．９３ｍｍｏｌ）を、０℃でＣＨ_２Ｃｌ_２（６０ｍＬ）中のＭ−２（１ｇ、２．３７ｍｍｏｌ）の溶液に何回かに分けて加えた。混合物を、室温で２０時間撹拌した。Ｎａ_２Ｓ_２Ｏ_３の水溶液を混合物に加えた。層を分離し、水層をＣＨ_２Ｃｌ_２で（２回）抽出した。組み合わされた有機層を、ＮａＨＣＯ_３の飽和水溶液で洗浄し、ＭｇＳＯ_４上で乾燥させ、ろ過し、溶媒を減圧下で除去したところ、９８０ｍｇの中間体Ｎ−２が黄色の固体（９１％の収率）として得られた。中間体Ｎ−２を、さらに精製せずに次の工程に使用した。

中間体Ｏ−２の合成：

Ｎ−２（５００ｍｇ、１．１０ｍｍｏｌ）とピラゾール（７５０ｍｇ、１１．０ｍｍｏｌ）との混合物を、８０℃で４５分間撹拌した。得られた混合物を、ＥｔＯＡｃおよびＨＣｌの１Ｍの水溶液に取り込んだ。層を分離し、有機層をＭｇＳＯ_４上で乾燥させ、ろ過し、減圧下で乾燥させたところ、５５０ｍｇの黄色の固体が得られた。粗化合物を、分取ＬＣ（不定形ＳｉＯＨ１５〜４０μｍ、２５ｇのＧｒａｃｅ、固体試料、移動相勾配：ＣＨ_２Ｃｌ_２／ＭｅＯＨ／ＮＨ_３水溶液９７／３／０．０３〜８０／２０／０．３）によって精製したところ、３７０ｍｇの中間体Ｏ−２が白色の固体（７６％の収率）として得られた。

最終的な化合物３７の合成：

Ｆｅ（２８０ｍｇ、５．０１ｍｍｏｌ）を、ＡｃＯＨ（１７ｍＬ）および水（１．８ｍＬ）中のＯ−２（３６５ｍｇ、８２７μｍｏｌ）の混合物に加えた。混合物を、室温で６４時間激しく撹拌した。反応混合物を、セライトのパッド上でろ過し、減圧下で濃縮し、トルエンとともに（２回）共蒸発させたところ、暗色の残渣が得られた。粗生成物を、分取ＬＣ（不定形ＳｉＯＨ１５〜４０μｍ、２５ｇのＭｅｒｃｋ、固体試料、移動相勾配：ＣＨ_２Ｃｌ_２／ＭｅＯＨ／ＮＨ_３水溶液９６／４／０．４〜８０／２０／３）によって精製したところ、２５０ｍｇの白色の固体が得られ、それを、分取ＬＣ（不定形ＳｉＯＨ１５〜４０μｍ、２５ｇのＭｅｒｃｋ、固体試料、移動相勾配：ＣＨ_２Ｃｌ_２／ＭｅＯＨ／ＮＨ_３水溶液９６／４／０．４〜８０／２０／３）によって再度精製したところ、１１０ｍｇの画分１が白色の固体（３６％）としておよび２５ｍｇの画分２が白色の固体（８％）として得られた。全体収率：４５％。８ｍｇの画分２を、４０℃で１６時間、減圧下で乾燥させたところ、６ｍｇの最終的な化合物３７が白色の固体として得られた。

最終的な化合物３８の合成：

ＬｉＯＨ（９ｍｇ、１２３μｍｏｌ）を、ＴＨＦ（４ｍＬ）および水（５ｍＬ）中の３７（１５ｍｇ、４１．１μｍｏｌ）の懸濁液に加えた。反応混合物を、室温で１６時間撹拌した。Ｋ_２ＣＯ_３の１０％の水溶液を、塩基性のｐＨになるまで加えた。水層を、Ｋ_２ＣＯ_３粉末で飽和し、生成物をＣＨ_２Ｃｌ_２／ＭｅＯＨ（９／１）で（３回）抽出した。組み合わされた有機層を、ＭｇＳＯ_４上で乾燥させ、ろ過し、溶媒を減圧下で除去したところ、２００ｍｇが得られた。粗生成物を、（Ｘ−Ｂｒｉｄｇｅ−Ｃ１８ ５μｍ ３０^＊１５０ｍｍ、移動相：勾配Ｈ_２Ｏ（０．１％のギ酸）／ＭｅＣＮ９０／１０〜０／１００）における分取ＬＣによって精製したところ、１２ｍｇの最終的な化合物３８が白色の固体（８３％）として得られた。

最終的な化合物３９の合成：

Ｄｉｂａｌ−Ｈ（トルエン中１．２Ｍ）（０．２ｍＬ、２４０μｍｏｌ）を、０℃で、窒素下で、ＴＨＦ（３ｍＬ）およびトルエン（１ｍＬ）中の３７（３０ｍｇ、８２．１μｍｏｌ）の溶液に滴下して加えた。溶液を０℃で２時間撹拌した。Ｄｉｂａｌ−Ｈ（０．２ｍＬ、２４０μｍｏｌ）を加え、溶液を室温で２時間撹拌した。酒石酸カリウムナトリウムの飽和水溶液を、反応物を中和するために加えた。混合物を、ＥｔＯＡｃで希釈した後、３０分間激しく撹拌した。有機層を水層から分離し、塩水で洗浄し、ＭｇＳＯ_４上で乾燥させ、ろ過し、減圧下で濃縮したところ、４０ｍｇが得られた。粗生成物を、分取ＬＣ（不定形ＳｉＯＨ１５〜４０μｍ、４ｇのＧｒａｃｅ、固体試料、移動相勾配：ＣＨ_２Ｃｌ_２／ＭｅＯＨ／ＮＨ_３水溶液９６／４／０．０４〜８０／２０／２）によって精製したところ、白色の固体が得られた。得られた白色の固体を、４０℃で１６時間、減圧下で乾燥させたところ、８ｍｇの最終的な化合物３９（２９％）が白色の固体として得られた。

最終的な化合物４０の合成：

３９（４５ｍｇ、１３３μｍｏｌ）を、ＨＢｒ（ＡｃＯＨ中３０％）（１０ｍＬ）中で可溶化した。混合物を室温で１時間撹拌した。溶媒を蒸発させ、ＡｃＯＨを、トルエンとともに（２回）共沸蒸留したところ、７５ｍｇの中間体Ｐ−２が褐色の固体として得られ、それを、さらに精製せずに次の工程に使用した。

ＴＨＦ（４ｍＬ）中のＮａＨ（５３ｍｇ、１．３３ｍｍｏｌ）の懸濁液に、室温で亜リン酸ジエチル（０．１３０ｍＬ、１．３３ｍｍｏｌ）を滴下して加えた。混合物を室温で１時間撹拌した。混合物に、ＴＨＦ（４ｍＬ）中のＰ−２（６４ｍｇ、１３３μｍｏｌ）の溶液を加えた。混合物を、室温で１６時間撹拌した。ＴＨＦ（４ｍＬ）中のＮａＨ（５３ｍｇ、１．３３ｍｍｏｌ）の懸濁液に、室温で亜リン酸ジエチル（０．１３０ｍＬ；１．３３ｍｍｏｌ）を滴下して加えた。得られた混合物を反応混合物に加えた。得られた反応混合物を室温で１時間撹拌した。水およびＥｔＯＡｃを加え、層を分離し、有機層を、ＮａＨＣＯ_３の水溶液および塩水で洗浄し、ＭｇＳＯ_４上で乾燥させ、ろ過し、減圧下で濃縮したところ、７５ｍｇの透明の油が得られた。粗生成物を、分取ＬＣ（不定形ＳｉＯＨ１５〜４０μｍ、２５ｇのＭｅｒｃｋ、乾式充填、移動相勾配：ＣＨ_２Ｃｌ_２／ＭｅＯＨ１００／０〜８５／１５）によって精製したところ、３８ｍｇの白色の固体が得られ、それをペンタン中で研和した。得られた固体をろ過し、５０℃で１６時間、減圧下で乾燥させたところ、２８ｍｇの最終的な化合物４０が白色の固体（４０％の収率）として得られた。

最終的な化合物４１の合成：

４０（５９０ｍｇ、１．２９ｍｍｏｌ）を、ＨＣｌ（水中３７％）（６０ｍＬ）中で可溶化した。混合物を１００℃で１６時間撹拌した。溶媒を蒸発させ、Ｈ_２Ｏを、ＥｔＯＨとともに（２回）共沸蒸留したところ、６０５ｍｇの最終的な化合物４１が白色の固体（１００％の収率）として得られた。

分析方法
全ての化合物を、ＬＣ−ＭＳによって特性評価した。以下のＬＣ−ＭＳ方法を使用した：

方法ＶＩＬＬＡ：
全ての分析を、デガッサを備えたバイナリポンプ、オートサンプラ、サーモスタットカラムコンパートメントおよびダイオードアレイ検出器からなるＡｇｉｌｅｎｔ １１００シリーズの液体クロマトグラフィー（ＬＣ）システムに連結されたＡｇｉｌｅｎｔ １１００シリーズのＬＣ／ＭＳＤ四重極を用いて行った。質量分析計（ＭＳ）を、正イオンモードでの大気圧エレクトロスプレーイオン化（ＡＰＩ−ＥＳ）源を用いて操作した。キャピラリ電圧を３０００Ｖに設定し、フラグメンタ電圧を７０Ｖに設定し、四重極温度を１００℃に維持した。乾燥ガス流量および温度値はそれぞれ、１２．０Ｌ／分および３５０℃であった。３５ｐｓｉｇの圧力で、窒素を噴霧器ガスとして使用した。データ収集を、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｃｈｅｍｓｔａｔｉｏｎソフトウェアを用いて行った。

一般的な手順に加えて、２．６ｍＬ／分の流量で、３５℃でＹＭＣ ｐａｃｋ ＯＤＳ−ＡＱ Ｃ１８カラム（５０ｍｍの長さ×４．６ｍｍの内径；３μｍの粒子）において分析を行った。勾配溶離を、９５％（水＋０．１％のギ酸）／５％のアセトニトリルから５％（水＋０．１％のギ酸）／９５％のアセトニトリルへと４．８０分間で行い、次に、最終的な移動相組成物を、さらに１．００分間保持した。標準的な注入量は２μＬであった。収集範囲を、ＵＶ−ＰＤＡ検出器では１９０〜４００ｎｍおよびＭＳ検出器では１００〜１４００ｍ／ｚに設定した。

方法Ｂ ＳＱＤ−検出器を備えたＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣシステム
移動相：Ａ：メタノール、Ｂ：９０％の水中１０ｍＭの酢酸アンモニウムおよび１０％のアセトニトリル
カラム：カラムのタイプ：Ａｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８ １．７μｍ ２．１×５０ｍｍのカラム（Ｗａｔｅｒｓ Ｎｏ １８６００２３５０）、温度：７０℃。勾配スケジュール（Ｇｒａｄｉｅｎｔ ｔｉｍｅｔａｂｌｅ）。流量：０．７ｍｌ／分、収集停止：１．８分。停止時間：２分。

注入量：０．７５μｌ。注入タイプ：ニードルオーバーフィルを用いたパーシャルループ（Ｐａｒｔｉａｌ Ｌｏｏｐ Ｗｉｔｈ Ｎｅｅｄｌｅ Ｏｖｅｒｆｉｌｌ）
開始波長：２１０ｎｍ。終了波長：４００ｎｍ。分解能：１．２ｎｍ。サンプリングレート：２０点／秒
ＭＳ−方法：
機能１：イオンモード：ＥＳ＋、データ形式：セントロイド
開始質量：１６０。終了質量：１０００
走査時間（秒）：０．１、開始時間（分）：０．０、終了時間（分）：２．０、コーン電圧（Ｖ）：３０
機能２：
イオンモード：ＥＳ−、データ形式：セントロイド、開始質量：１６０、終了質量：１０００
走査時間（秒）：０．１、開始時間（分）：０．０、終了時間（分）：２．０、コーン電圧（Ｖ）：３０、ＭＳにおける流量：７００μｌ／分

一般的な手順ＶＤＲ１（方法Ｖ１００ｘＶ１０ｘｘ．ｏｌｐおよびＶ２００ｘＶ２０ｘｘ．ｏｌｐのための）
デガッサを備えたクォータナリポンプ、オートサンプラ、ダイオードアレイ検出器（ＤＡＤ）および以下のそれぞれの方法で指定されるカラムを含むＡｌｌｉａｎｃｅ ＨＴ ２７９５（Ｗａｔｅｒｓ）システムを用いて、ＨＰＬＣ測定を行った。カラムを３０℃の温度に保持する。カラムからの流れを、ＭＳ分光計に分けた。ＭＳ検出器は、エレクトロスプレーイオン化源とともに構成されていた。キャピラリ針電圧は３ｋＶであり、イオン化源温度を、ＬＣＴ（方法Ｖ１００ｘＶ１０ｘｘ．ｏｌｐのための、Ｗａｔｅｒｓ製のＴｉｍｅ ｏｆ Ｆｌｉｇｈｔ Ｚｓｐｒａｙ（商標）質量分析計）において１００℃に、およびＺＱ（商標）（方法Ｖ２００ｘＶ２０ｘｘ．ｏｌｐのための、Ｗａｔｅｒｓ製の単一四重極型Ｚｓｐｒａｙ（商標）質量分析計）において１１０℃で３．１５ｋＶに維持した。窒素を噴霧器ガスとして使用した。データ収集を、Ｗａｔｅｒｓ−Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ ＭａｓｓＬｙｎｘ−Ｏｐｅｎｌｙｎｘデータシステムを用いて行った。

一般的な手順ＶＤＲ２（方法Ｖ３００ｘＶ３０ｘｘ．ｏｌｐのための）
デガッサを備えたバイナリポンプ、オートサンプラ、ダイオードアレイ検出器（ＤＡＤ）および以下のそれぞれの方法で指定されるカラムを含むＵＰＬＣ（超高性能液体クロマトグラフィー（Ｕｌｔｒａ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ））Ａｃｑｕｉｔｙ（Ｗａｔｅｒｓ）システムを用いて、ＬＣ測定を行った。カラムを、４０℃の温度に保持する。カラムからの流れを、ＭＳ検出器に提供した。ＭＳ検出器は、エレクトロスプレーイオン化源とともに構成されていた。キャピラリ針電圧は３ｋＶであり、イオン化源温度を、Ｑｕａｔｔｒｏ（Ｗａｔｅｒｓ製のトリプル四重極型質量分析計）において１３０℃に維持した。窒素を噴霧器ガスとして使用した。データ収集を、Ｗａｔｅｒｓ−Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ ＭａｓｓＬｙｎｘ−Ｏｐｅｎｌｙｎｘデータシステムを用いて行った。

方法Ｖ１００５Ｖ１０１２
一般的な手順ＶＤＲ１に加えて：０．８ｍｌ／分の流量で、Ｗａｔｅｒｓ Ｘ−ｂｒｉｄｇｅ Ｃ１８カラム（３．５μｍ、４．６×１００ｍｍ）において、逆相ＨＰＬＣを行った。２つの移動相（移動相Ａ：１００％の７ｍＭの酢酸アンモニウム；移動相Ｂ：１００％のアセトニトリル）を用いて、８０％のＡおよび２０％のＢ（０．５分間保持）から９０％のＢへと４．５分間、９０％のＢで４分間の勾配条件を実施し、３分間にわたって初期条件で再度平衡化した。５μｌの注入量を使用した。コーン電圧は、正および負イオン化モードで２０Ｖであった。０．３秒間のスキャン間遅延を用いて、０．４秒間で１００から１０００へと走査することによって、質量スペクトルを取得した。

方法Ｖ１００４Ｖ１０１２
一般的な手順ＶＤＲ１に加えて：０．８５ｍｌ／分の流量で、Ｋｒｏｍａｓｉｌ Ｃ１８カラム（３．５μｍ、４．６×１００ｍｍ）において、逆相ＨＰＬＣを行った。３つの移動相（移動相Ａ：１００％の７ｍＭの酢酸アンモニウム；移動相Ｂ：１００％のアセトニトリル；移動相Ｃ：０．２％のギ酸＋９９．８％の超純水）を用いて、３５％のＡ、３０％のＢおよび３５％のＣ（１分間保持）から１００％のＢへと３分間、１００％のＢで４．５分間の勾配条件を実施し、３分間にわたって初期条件で再度平衡化した。５μｌの注入量を使用した。コーン電圧は、正および負イオン化モードで２０Ｖであった。０．３秒間のスキャン間遅延を用いて、０．４秒間で１００から１０００へと走査することによって、質量スペクトルを取得した。

方法Ｖ１０１０Ｖ１０１２
一般的な手順ＶＤＲ１に加えて：０．８ｍｌ／分の流量で、Ｗａｔｅｒｓ Ａｔｌａｎｔｉｓ Ｃ１８カラム（５μｍ、３．９×１００ｍｍ）において、逆相ＨＰＬＣを行った。３つの移動相（移動相Ａ：１００％の７ｍＭの酢酸アンモニウム；移動相Ｂ：１００％のアセトニトリル；移動相Ｃ：０．２％のギ酸＋９９．８％の超純水）を用いて、５０％のＡおよび５０％のＣ（１．５分間保持）から１０％のＡ、８０％のＢおよび１０％のＣへと４．５分間の勾配条件を実施し、４分間保持し、３分間にわたって初期条件で再度平衡化した。５μｌの注入量を使用した。コーン電圧は、正および負イオン化モードで２０Ｖであった。０．３秒間のスキャン間遅延を用いて、０．４秒間で１００から１０００へと走査することによって、質量スペクトルを取得した。

方法Ｖ２００２Ｖ２００２＋ＬＣｐｏｓ＿ｃｏｕｒｔ．ｏｌｐ
一般的な手順ＶＤＲ１に加えて：０．８ｍｌ／分の流量で、Ｋｒｏｍａｓｉｌ Ｃ１８カラム（３．５μｍ、４．６×１００ｍｍ）において、逆相ＨＰＬＣを行った。３つの移動相（移動相Ａ：１００％の７ｍＭの酢酸アンモニウム；移動相Ｂ：１００％のアセトニトリル；移動相Ｃ：０．２％のギ酸＋９９．８％の超純水）を用いて、３５％のＡ、３０％のＢおよび３５％のＣ（１分間保持）から１００％のＢへと４分間、１００％のＢで４分間の勾配条件を実施し、２分間にわたって初期条件で再度平衡化した。１０μｌの注入量を使用した。コーン電圧は、正および負イオン化モードで２０Ｖであった。０．３秒間のスキャン間遅延を用いて、０．４秒間で１００から１０００へと走査することによって、質量スペクトルを取得した。

方法Ｖ２００３Ｖ２００２
一般的な手順ＶＤＲ１に加えて：０．８ｍｌ／分の流量で、Ｘ−Ｂｒｉｄｇｅ Ｃ１８カラム（３．５μｍ、４．６×１００ｍｍ）において、逆相ＨＰＬＣを行った。２つの移動相（移動相Ａ：１００％の７ｍＭの酢酸アンモニウム；移動相Ｂ：１００％のアセトニトリルを用いて；８０％のＡ、２０％のＢ（０．５分間保持）から１０％のＡ、９０％のＢへと４．５分間の勾配条件を実施し、１０％のＡおよび９０％のＢで４分間保持し、３分間にわたって初期条件で再度平衡化した。１０μｌの注入量を使用した。コーン電圧は、正および負イオン化モードで２０Ｖであった。０．３秒間のスキャン間遅延を用いて、０．４秒間で１００から１０００へと走査することによって、質量スペクトルを取得した。

方法Ｖ２０１２Ｖ２００２
一般的な手順ＶＤＲ１に加えて：０．８ｍｌ／分の流量で、Ｗａｔｅｒｓ Ａｔｌａｎｔｉｓ Ｃ１８カラム（５μｍ、３．９×１００ｍｍ）において、逆相ＨＰＬＣを行った。３つの移動相（移動相Ａ：１００％の７ｍＭの酢酸アンモニウム；移動相Ｂ：１００％のアセトニトリル；移動相Ｃ：０．２％のギ酸＋９９．８％の超純水）を用いて、５０％のＡ、０％のＢおよび５０％のＣ（１．５分間保持）から１０％のＡ、８０％のＢおよび１０％へと３．５分間の勾配条件を実施し、これらの条件で４分間保持し、３分間にわたって初期条件で再度平衡化した。１０μｌの注入量を使用した。コーン電圧は、正および負イオン化モードで２０Ｖであった。０．３秒間のスキャン間遅延を用いて、０．４秒間で１００から１０００へと走査することによって、質量スペクトルを取得した。

方法Ｖ２０１５Ｖ２００７
一般的な手順ＶＤＲ１に加えて：０．７ｍｌ／分の流量で、Ｓｕｐｅｌｃｏ Ａｓｃｅｎｔｉｓ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｃ１８カラム（２．７μｍ、３．０×５０ｍｍ）において、逆相ＨＰＬＣを行った。２つの移動相（移動相Ａ：１００％の７ｍＭの酢酸アンモニウム；移動相Ｂ：１００％のアセトニトリル）を用いて、８０％のＡおよび２０％のＢ（０．５分間保持）から５％のＡおよび９５％のＢへと２．５分間の勾配条件を実施し、４．５分間保持し、１．５分間で初期条件に戻し、１分間保持した。５ｍｌの注入量を使用した。コーン電圧は、正および負イオン化モードで２０Ｖであった。０．３秒間のスキャン間遅延を用いて、０．４秒間で１００から１０００へと走査することによって、質量スペクトルを取得した。

方法Ｖ３０１８Ｖ３００１
一般的な手順ＶＤＲ２に加えて：０．３４３ｍｌ／分の流量で、Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＢＥＨ（架橋されたエチルシロキサン／シリカハイブリッド）Ｃ１８カラム（１．７μｍ、２．１×１００ｍｍ）において、逆相ＵＰＬＣを行った。２つの移動相（移動相Ａ：９５％の７ｍＭの酢酸アンモニウム／５％のアセトニトリル；移動相Ｂ：１００％のアセトニトリル）を用いて、８４．２％のＡおよび１５．８％のＢ（０．４９分間保持）から１０．５％のＡおよび８９．５％のＢへと２．１８分間の勾配条件を実施し、１．９４分間保持し、０．７３分間で初期条件に戻し、０．７３分間保持した。２μｌの注入量を使用した。コーン電圧は、正および負イオン化モードで２０Ｖであった。０．１秒間のスキャン間遅延を用いて、０．２秒間で１００から１０００へと走査することによって、質量スペクトルを取得した。

方法Ｖ３０１４Ｖ３００１
一般的な手順ＶＤＲ２に加えて：０．３５ｍｌ／分の流量で、Ｗａｔｅｒｓ ＨＳＳ（高強度シリカ）Ｔ３カラム（１．８μｍ、２．１×１００ｍｍ）において、逆相ＵＰＬＣを行った。２つの移動相（移動相Ａ：９５％の７ｍＭの酢酸アンモニウム／５％のアセトニトリル；移動相Ｂ：１００％のアセトニトリル）を用いて、９９％のＡ（０．５分間保持）から１５％のＡおよび８５％のＢへと４．５分間の勾配条件を実施し、２分間保持し、０．５分間で初期条件に戻し、１．５分間保持した。２□ｌの注入量を使用した。コーン電圧は、正および負イオン化モードで２０Ｖであった。０．１秒間のスキャン間遅延を用いて、０．２秒間で１００から１０００へと走査することによって、質量スペクトルを取得した。

式（Ｉ）の化合物の生物学的活性
生物学的アッセイの説明
ＴＬＲ７活性の評価のためのレポーターアッセイ（２４時間）
化合物がヒトＴＬＲ７を活性化する能力を、ＴＬＲ７またはＴＬＲ８発現ベクターおよびＮＦκＢ−ｌｕｃレポーター構築物で一過的にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞を用いた細胞レポーターアッセイで評価した。一例として、ＴＬＲ発現構築物は、それぞれの野生型配列またはＴＬＲの２番目のロイシンリッチリピート（ｄｌＲＲ２）の欠失を含む変異配列を発現する。このような変異ＴＬＲタンパク質は、アゴニスト活性化の影響をより受けやすいことが既に示されている（米国特許第７，４９８，４０９号明細書）。

簡潔に述べると、ＨＥＫ２９３細胞を、培養培地（１０％のＦＣＳおよび２ｍＭのグルタミンが補充されたＤＭＥＭ）中で成長させた。１０ｃｍの皿における細胞のトランスフェクションのために、細胞をトリプシン−ＥＤＴＡで剥がし、ＣＭＶ−ＴＬＲ７またはＴＬＲ８プラスミド（７５０ｎｇ）と、ＮＦκＢ−ｌｕｃプラスミド（３７５ｎｇ）と、トランスフェクション試薬との混合物でトランスフェクトし、加湿した５％のＣＯ２雰囲気中３７℃で、それぞれ２４時間または４８時間インキュベートした。次に、トランスフェクトされた細胞をトリプシン−ＥＤＴＡで剥がし、ＰＢＳ中で洗浄し、１．６７×１０５個の細胞／ｍＬの密度で培地に再懸濁させた。次に、３０マイクロリットルの細胞を、４％のＤＭＳＯ中の１０μＬの化合物が既に存在する、３８４ウェルプレートにおける各ウェル中に計量分配した。３７℃、５％のＣＯ２で６時間のインキュベーションの後、１５μｌのＳｔｅａｄｙ Ｌｉｔｅ Ｐｌｕｓ基質（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を各ウェルに加えることによって、ルシフェラーゼ活性を測定し、ＶｉｅｗＬｕｘ ｕｌｔｒａＨＴＳマイクロプレートイメージャー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）において読み取りを行った。４通りに行った測定から用量反応曲線を作成した。アッセイの標準偏差より少なくとも２倍高い効果を誘発する濃度として定義される最低有効濃度（ＬＥＣ）値を、各化合物について求めた。３８４ウェルプレートにおいて、ＣＭＶ−ＴＬＲ７構築物のみ（１．６７×１０５個の細胞／ｍＬ）でトランスフェクトされた、ウェル当たり３０μＬの細胞とともに同様の希釈系列の化合物を用いて、化合物の毒性を、並行して決定した。ウェル当たり１５μＬのＡＴＰ ｌｉｔｅ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を加え、ＶｉｅｗＬｕｘ ｕｌｔｒａＨＴＳマイクロプレートイメージャー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）において読み取ることによって、３７℃、５％のＣＯ２で６時間のインキュベーションの後の細胞生存率を測定した。データをＣＣ５０として報告した。

ヒトＰＢＭＣ（ＰＢＭＣ−ＨＵＨ７＿ＥＣ５０）におけるインターフェロン産生の測定
ヒトＴＬＲ７の活性化により、ヒト血液中に存在する形質細胞様樹枝状細胞によってインターフェロンの強力な産生が得られる。化合物がインターフェロンを誘導する可能性を、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からの馴化培地を用いたインキュベーションの際のＨＣＶレプリコンシステムにおける抗ウイルス活性を調べることによって評価した。ＨＣＶレプリコンアッセイは、Ｋｒｉｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（２００１）７５：４６１４−４６２４）によって記載される修正とともに、Ｌｏｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９９）２８５：１１０−１１３；Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（２００３）７７：３００７−１５ ３０１９）によって記載される２シストロン性発現構築物に基づくものである。このアッセイは、レポーター遺伝子（ホタルルシフェラーゼ）および選択可能なマーカー遺伝子（ｎｅｏＲ、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ）が前にある、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）からの内部リボソーム侵入部位（Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｒｉｂｏｓｏｍｅ Ｅｎｔｒｙ Ｓｉｔｅ）（ＩＲＥＳ）から翻訳されるＨＣＶ １ｂ型の野生型ＮＳ３−ＮＳ５Ｂ領域を含む２シストロン性発現構築物をコードするＲＮＡを有する安定的にトランスフェクトされた細胞株Ｈｕｈ−７ ｌｕｃ／ｎｅｏを用いた。構築物には、ＨＣＶ １ｂ型からの５’および３’ＮＴＲ（非翻訳領域）が隣接している。Ｇ４１８（ｎｅｏＲ）の存在下におけるレプリコン細胞の培養の継続は、ＨＣＶ ＲＮＡの複製に依存する。特にルシフェラーゼをコードするＨＣＶ ＲＮＡを自律的にかつ高いレベルで複製する安定的にトランスフェクトされたレプリコン細胞を、馴化された細胞培養培地のプロファイリング（ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ）に使用した。簡潔に述べると、標準的なＦｉｃｏｌｌ遠心分離プロトコルを用いて、少なくとも２供与体の軟膜からＰＢＭＣを調製した。単離されたＰＢＭＣを、１０％のヒトＡＢ血清が補充されたＲＰＭＩ培地に再懸濁させ、２×１０５個の細胞／ウェルを、化合物（７０μＬの全体積）を含む３８４ウェルプレート中に計量分配した。一晩のインキュベーションの後、１０μＬの上清を、３０μＬ中２．２×１０３個のレプリコン細胞／ウェルを含む３８４ウェルプレート（前日に平板培養された）に移した。２４時間のインキュベーションの後、４０μＬ／ウェルのＳｔｅａｄｙ Ｌｉｔｅ Ｐｌｕｓ基質（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いてルシフェラーゼ活性を評価することによって、複製を測定し、ＶｉｅｗＬｕｘ ｕｌｔｒａＨＴＳマイクロプレートイメージャー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて測定した。Ｈｕｈ７−ｌｕｃ／ｎｅｏ細胞に対する各化合物の阻害活性を、ＥＣ５０値として報告した。ＥＣ５０値は、規定量のＰＢＭＣ培養培地の移入（ｔｒａｎｓｆｅｒ）に対するレプリコンＲＮＡの複製の程度を示すルシフェラーゼ活性の５０％の低下をもたらすＰＢＭＣに適用される化合物濃度として定義される。組み換えインターフェロンα−２ａ（Ｒｏｆｅｒｏｎ−Ａ）を標準的な対照化合物として使用した。全ての化合物は、上記のＨＥＫ ２９３ ＴＯＸアッセイにおいて、２４μＭを超えるＣＣ５０を示した。

ヒトＰＢＭＣ（ＰＢＭＣ ＨＥＫ−ＩＳＲＥ−ｌｕｃ ＬＥＣ）におけるインターフェロン産生の測定
ヒトＴＬＲ７の活性化により、ヒト血液中に存在する形質細胞様樹枝状細胞によってインターフェロンの強力な産生が得られる。化合物がインターフェロンを誘導する可能性を、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からの馴化培地におけるインターフェロンの測定によって評価した。インターフェロン刺激応答領域（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｅｌｅｍｅｎｔ）（ＩＳＲＥ）−ｌｕｃレポーター構築物を安定的に発現するインターフェロンレポーター細胞株を用いて、試料におけるインターフェロンの存在を決定した。配列ＧＡＡＡＣＴＧＡＡＡＣＴを有するＩＳＲＥ領域は、ＳＴＡＴ１−ＳＴＡＴ２−ＩＲＦ９転写因子に対する反応性が高く、ＩＦＮ受容体へのＩＦＮ−Ｉの結合の際に活性化される。簡潔に述べると、標準的なＦｉｃｏｌｌ遠心分離プロトコルを用いて、少なくとも２供与体の軟膜からＰＢＭＣを調製した。単離されたＰＢＭＣを、１０％のヒトＡＢ血清が補充されたＲＰＭＩ培地に再懸濁させ、２×１０５個の細胞／ウェルを、化合物（７０μＬの全体積）を含む３８４ウェルプレート中に計量分配した。化合物によるＰＢＭＣの一晩のインキュベーションの後、１０μＬの上清を、３０μＬ中５×１０３個のＨＥＫ−ＩＳＲＥ−ｌｕｃ細胞／ウェルを含む３８４ウェルプレート（前日に平板培養された）に移した。２４時間のインキュベーションの後、４０μＬ／ウェルのＳｔｅａｄｙ Ｌｉｔｅ Ｐｌｕｓ基質（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いてルシフェラーゼ活性を評価することによって、ＩＳＲＥ領域の活性化を測定し、ＶｉｅｗＬｕｘ ｕｌｔｒａＨＴＳマイクロプレートイメージャー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて測定した。ＨＥＫ−ＩＳＲＥ−ｌｕｃ細胞に対する各化合物の刺激活性を、ＬＥＣとして報告した。ここで、ＬＥＣは、規定量のＰＢＭＣ培養培地の移入に対するＩＳＲＥ活性化の程度を示す。組み換えインターフェロンα−２ａ（Ｒｏｆｅｒｏｎ−Ａ）を標準的な対照化合物として使用した。

ＨＥＫ２９３ ＴＬＲ８−ＮＦ□Ｂ−ｌｕｃおよびＨＥＫ２９３ ＮＦ□Ｂ−ｌｕｃにおける表２中の化合物のＬＥＣ値は、最高試験濃度より高かった（化合物６では＞１０μＭおよび全ての他の化合物では＞２５μＭ）。

全ての化合物を、ＴＬＲ８活性の評価のためのレポーターアッセイで試験したところ、ＬＥＣ＞１７μＭを示した。

Claims (5)

1. 式（Ｉ）
   

   

   
   （式中、Ｙが、（Ｃ_１〜４）アルキレンであり、Ｒ_１が、ヘテロアリール^１であり、Ｒ_２が、アリール^２またはヘテロシクリルである）
   の化合物、またはその薬学的に許容できる塩、溶媒和物もしくは多形体。
2. Ｒ_１が、ハロゲン、ヒドロキシル、Ｃ_１〜６アルキル、Ｃ_１〜４アルコキシまたはＣ_３〜６シクロアルキルから独立して選択される１つまたは複数の置換基によってそれぞれ任意に置換される、イミダゾリル、ピラゾリルまたはピリジニルを含む群から選択される、請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物。
3. １つまたは複数の薬学的に許容できる賦形剤、希釈剤または担体とともに、請求項１または２に記載の式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容できる塩、溶媒和物もしくは多形体を含む医薬組成物。
4. 薬剤として使用するための、請求項１または２に記載の式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容できる塩、溶媒和物もしくは多形体、または請求項３に記載の医薬組成物。
5. ＴＬＲ７の調節が関与する疾患の治療に使用するための、請求項１または２に記載の式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容できる塩、溶媒和物もしくは多形体、または請求項３に記載の医薬組成物。