JP2014521313A5 - - Google Patents

Description

「同質遺伝子的」の語は、本発明の文脈において、本発明を特徴付けるその中に組み込まれたエレメント、例えば、ＤｓｂＣをコードする組換えポリヌクレオチド及びＣＤ１５４に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド、及び任意選択によってＴｓｐタンパク質の発現の低減又は非存在をもたらす修飾、及び任意選択によって変異ｓｐｒ遺伝子を除いて、細胞が野生型細胞と比べて同じ又は実質的に同じ核酸配列（単数又は複数）を含むことを意味する。この実施形態では、本発明の細胞はこれ以上天然に存在しない又はそのゲノムに遺伝的に操作された変化を含まない。

好ましい実施形態では、ＤｓｂＣをコードする組換えポリヌクレオチド及びＣＤ１５４に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド、並びに任意選択によってＴｓｐプロテアーゼ活性を低減させる変異、並びに任意選択によってｓｐｒ遺伝子又はその変異体以外は、細胞は野生型大腸菌細胞に対して同質遺伝子的である。

一実施形態では、ＤｓｂＣ及びＣＤ１５４に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントを発現するのに適したプラスミドを用いて使用するための、低減したＴｓｐ活性及びｓｐｒ遺伝子又はその変異体を有する以外は、大腸菌Ｗ３１１０系統に対して同質遺伝子的な細胞が提供される。

さらに好ましくは、本発明の細胞は、ＤｓｂＣをコードする組換えポリヌクレオチド及びＣＤ１５４に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド以外は、大腸菌Ｗ３１１０系統に対して同質遺伝子的である。

Claims (13)

1. 組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞であって；
   ａ）ノックアウト変異Ｔｓｐ遺伝子である、変異Ｔｓｐ遺伝子、
   ｂ）アミノ酸Ｃ９４にミスセンス変異を有する、ｓｐｒ遺伝子、並びに
   ｃ）ＤｓｂＣをコードする組換えポリヌクレオチド、及び
   ＣＤ１５４に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド
   を含む発現ベクター、
   を含み；
   ここで細胞が、上記変異Ｔｓｐ及びｓｐｒ遺伝子以外は、野生型大腸菌細胞に対して同質遺伝子的であるゲノムを有する、
   上記細胞。
2. ＤｓｂＣがＮ末端又はＣ末端でヒスチジンタグを含む、請求項１に記載の細胞。
3. 発現ベクターが配列番号４５又は配列番号５１で与えられる配列を有するポリヌクレオチドを含む、請求項１又は２に記載の細胞。
4. 抗体又はその抗原結合フラグメントが、ＣＤＲＨ１として配列番号１、ＣＤＲＨ２として配列番号２及びＣＤＲＨ３として配列番号３で与えられる配列を有する３つのＣＤＲを含む重鎖可変ドメイン並びにＣＤＲＬ１として配列番号４、ＣＤＲＬ２として配列番号５及びＣＤＲＬ３として配列番号６で与えられる配列を有する３つのＣＤＲを含む可変ドメイン軽鎖を含む、請求項１から３までのいずれか一項に記載の細胞。
5. 前記１つ又は複数のポリヌクレオチドが、配列番号８で与えられる軽鎖可変領域配列及び配列番号１０で与えられる重鎖可変領域を含む抗体をコードする、請求項４に記載の細胞。
6. 抗体がＦａｂ又はＦａｂ’フラグメントである、請求項１から５までのいずれか一項に記載の細胞。
7. 前記Ｆａｂ又はＦａｂ’フラグメントが、配列番号１２で与えられる配列を有する軽鎖及び配列番号１４又は１６で与えられる配列を有する重鎖を含む、請求項６に記載の細胞。
8. 変化したｓｐｒタンパク質をコードするポリヌクレオチド内の変異により、９４位でアミノ酸システインからアラニンへの変化（Ｃ９４Ａ）が生じている、請求項１から７までのいずれか一項に記載の細胞。
9. 発現ベクターが、ＤｓｂＣをコードする組換えポリヌクレオチド及びＣＤ１５４に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントを生成するためのジシストロン性メッセージを含み、上流シストロンが前記抗体の軽鎖をコードするＤＮＡを含有し、下流シストロンが対応する重鎖をコードするＤＮＡを含有し、ジシストロン性メッセージがＩＧＳ１（配列番号３３）、ＩＧＳ２（配列番号３４）、ＩＧＳ３（配列番号３５）及びＩＧＳ４（配列番号３６）から選択される配列を含むことを特徴とする、請求項１から８までのいずれか一項に記載の細胞。
10. ＣＤ１５４に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントを生成するための方法であって、
    ａ）請求項１から９までのいずれか一項に記載の組換え大腸菌細胞を培養培地中、ＣＤ１５４に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント及びＤｓｂＣをコードする組換えポリヌクレオチドを発現するのに効果的な条件下で培養するステップと、
    ｂ）ＣＤ１５４に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントを、組換え大腸菌細胞のペリプラズム及び／又は培養培地から回収するステップと
    を含む上記方法。
11. 前記抗体の重鎖及び／又は軽鎖のＣ末端終端の又は近くのアミノ酸に、
    抗悪性腫瘍薬、薬物、毒素、酵素、他の抗体又は抗体フラグメント、ポリマー、核酸、放射性核種、及びレポーターグループからなる群から選択されるエフェクター分子を結合させるステップをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
12. エフェクター分子がポリ（エチレングリコール）又はメトキシポリ（エチレングリコール）を含む、請求項１１に記載の方法。
13. 前記方法が、前記重鎖のＣ末端終端のシステイン残基のうちの１つに、リシル−マレイミド基を結合させるステップを含み、リシル残基のそれぞれのアミノ基が２０，０００Ｄａの分子量を有するメトキシポリ（エチレングリコール）残基を共有結合させている、請求項１２に記載の方法。