JPH08500963A

JPH08500963A - ヒューマンｃｒａｂｐ−▲ｉ▼及びｃｒａｂｐ−▲ｉｉ▼

Info

Publication number: JPH08500963A
Application number: JP5519455A
Authority: JP
Inventors: アストロム，アンダース; ヴアヒーズ，ジョン，ジェー; ペターソン，ウルリカ; タヴァコル，アミール
Original assignee: ザ・リージェンツ・オブ・ザ・ユニヴァーシティー・オブ・ミシガン
Priority date: 1992-04-28
Filing date: 1993-04-27
Publication date: 1996-02-06
Also published as: AU4118393A; EP0640093A4; WO1993022331A1; CA2134550A1; EP0640093A1

Abstract

(57)【要約】人間セルラーレチノイックアシッドバインディングプロテイン（CRABP）の２つのアイソフォームをエンコードするシーケンス、即ちCRABP-IとCRABP-IIが、クローン化されシーケンス化される。また、それらに対応（一致）するシーケンスID NO.1-4 でのアミノ酸シーケンスも示されている。人間CRABP 核酸及びアミノ酸シーケンスを識別すると、組換え型の人間CRABP ベクタ及び発現構造の構造のためのベースが提供される。人間CRABP はまた、例えば細菌性或いは他の生成システム（系）において、生体外で合成され又は生成され得る。リガンド（配位子）バインディング検査、（これは組換え型及びキメラレセプターレポータ検査を含む）、及びここで述べられた人間CRABP シーケンスを用いるダイレクト且つ競争交配検査は、レチノイドが影響を与えられる病理学に対してレチノイック誘発とティッシュ特異性とのための薬品を試験するのに用いられ得る。人間CRABPに対して生成される抗体及び結合断片を利用した免疫学的検査もまた、識別及びモニター処理のために、存在に対する患者ティッシュ及びCRABP のレベルをテストするために用いられ得る。人間のCRABP-I とCRABP-IIとに対する核酸及びアミノ酸シーケンスの同定識別もまた、レチノイドバインディングプロテインの機能及び相互作用の解明に寄与する。CRABP-II遺伝子（これは人間胎盤ゲノミックライブラリから分離される）は、６kilobases におよび且つ４エクソンを含む。１の主要な転写開始位置は、ATG 開始コドンの上流でＡ残基137 ヌクレオチドに位置づけられる。CRABP-II mRNA は、レチノイクアシッドによる培養中で２から６時間以内で急速に誘発される。これは主に、継続する合成（統合）を必要とする転写の増加率のためである。このように、人間CRABP-II遺伝子は、新規に合成された調節プロテインによって明らかに転写的に規制される。一度CRABP-IIが生成されれば、メッセージ安定が、mRNA における上昇されたCRABP-IIが維持（保存）されるための手段を提供するであろう。

Description

【発明の詳細な説明】ヒューマンＣＲＡＢＰ−Ｉ及びＣＲＡＢＰ−II 発明の分野本発明は広くはセルラーレチノイックアシッドバインディングプロテイン（ce llula retinoic acid binding proteins）（ＣＲＡＢＰ）に係り、特にヒューマン（人間の）ＣＲＡＢＰ−Ｉ及びＣＲＡＢＰ−IIと、これらをエンコードするシーケンスと、スクリーニング（screening）及び診断に用いたり治療用に用いたりする場合の種々の検査・分析システム（assay system）におけるこれらの用途・使用法等に関する。関連出願本願は米国特許出願第07/874,847号（発明の名称「ヒューマンＣＲＡＢＰ−Ｉ及びＣＲＡＢＰ−II」出願日1992年4月28日、発明者Voorheesその他）の継続出願であり、これは米国特許出願第751,893号（発明の名称「ヒューマンＣＲＡＢＰ−Ｉ及びＣＲＡＢＰ−II」出願日1991年8月30日、発明者Voorheesその他）の一部付属出願である。これらの開示内容は、この引用により本明細書に記載されたこととする。遺伝子銀行受入れ情報遺伝子受入番号ヒューマンＣＲＡＢＰ−II Ｍ６８８６７発明の背景レチノイド（retinoid）は上皮細胞生長・成長及び細胞分化（派生）・変異（ cellular differentiation）の基本的な、根本的なレギュレータ（essential re gulator）であり、皮膚は通常及び病理(pathological)状態の（における）主要ターゲットである Spom,M.B.et al.,Cancer Res.43:3034-3040(1983);Kopan,R. etal.,J.CellBiol.109:295-307(1989);Asselineau,D.et al.,Dev.Biol.133:322- 335(1989);及びLippman,S.M.et al.,Pharmacol.Ther.40:107-122(1989)）。レチノイドは皮膚ガンを防止し、人間の悪性の・有害な及び前ガン状態の皮膚の疾患・異常・不調(disorder)における（に対する）エージェント（作用物・薬剤）として有効であることが知られてる（Asselineau,D.et al.,Dev.Biol.133:322-3 35(1989)）。また、レチノイドは多くの過度の急増殖・繁殖セルライン(hyper-p roliferating cell lines)において生長・成長抑制を引起こすことも示されている（知られている）（抗腫瘍の及び抗乾癬(anti-psoriatice)エージェントとして基本的に関心のあるコンパウド(compound of fundamental interest)を作る特徴である）（Sporn,M.B.et al.,Cancer Res.43:3034-3040(1983)；及びAsseline au,D.et al.,Dev.Biol.133:322-335(1989)）。レチノイドはまた、脊椎動物の胴体・頭部から突出している部分（腕、脚、ひれ、翼等）(vertebrate limbs)の生長・進化(development)及び発生の間、セル(cell）の空間的構成(spatial organ ization)を方向づける・決定する（directing）際に基本的な役割を果たす（Eic hele,G.Trends Genet 5:246-251(1989)；及びSummerbell,D.et al.,Trends Neur oscl.13:142-147(1990)）。セルの生長・成長及び分化・変異(differentiation)における複雑な生物学的プロセス(biological processes)におけるレチノイドの作用の説明・解明には、レチノイド信号変換・形質導入システム(transduction system)の特定のコンポーネントの認識・識別と、このシステムによって直接調節し（レギュレート）される遺伝子の認識・識別とが必要である。いくつかの細胞内でのレチノイドバインディングプロテインは既に認識されている（これらには、細胞レチノールバインディングプロティン(cellular retinol-binding protein:ＣＲＢＰ)と、細胞核（の）レチノイックアシッドレセプタ（nuclear retinoic acid receptor:ＲＡＲ）と、細胞レチノイドアシッドバインディングプロテイン（ＣＲＡＢＰ）と、最も最近のものとしては、ＲＸＲとが含まれる。ＲＸＲは遺伝子の細胞核（の）レセプタスーパーファミリ（上科、超科）（superfamily）に属する（Sundeli n,J.et al.,J.Biol.Chem.260:6488-6493(1985);Li,E.et al.,PNAS(USA)83:5779- 5783(1986);Nilsson,M.H.L.et al.,Eur.J.Biochem.173:45-51(1988):Stoner,C,M ,et al.,Cancer Res.49;1497-1504(1989);Giguere,V.et al.,PNAS(USA)87:6233- 6237(1990);Petkovich,M.et al.,Nature 330:444-450(1987);Brand,N.et al.,Na ture 332:850-853(1988):Benbrook,D.et al.,Nature 333:669-672(1988);Zele nt,A.et al.,Nature 339:714-717(1989);Krust,A.et al.,PNAS(USA)86:5310-531 4(1989)；及びNangelsdorf,D.J.et al.,Nature 345：224-229(1990)）。細胞レチノイックアシッドバインディングプロテイン（ＣＲＡＢＰ）は人間の皮膚に存在する低分子重量プロテインであり、乾癬障害・外傷（psoriatic lesi on）において高レベルで見つけられると共に、外的及びシステミック（systemic ：全身的な，系統・体系の）レチノイド処理（treatment）の後に高いレベル
で見つけられる（Siegenthaler,G,et al.,J.Invest.Dermatol.86:42-45(1986):Hir schel-Scholz,S.et al.,Eur.J.Clin.Invest.19:220-227(1989)；及びand Siegen thaler,G.et al.,Arch.Dermatol.123:1690-1692(1987)）。ＣＲＡＢＰは低カルシウム媒体(medium)で生長・成長したケラチン性（角質）の細胞（keratinocytes）では検知・検出できないが、（ＣＲＡＢＰは）より分化・変異された（more differentiated）フェノタイプ（ｐhenotype：表現型）が、生長により誘発されると発現される（expressed）。上記生長とは高い細胞外（extracellular）カルシウム濃度が存在する状態で融合・某合・合流（confl uence）が生ずる状態に生長することをいう。（Siegenthaler,G.et al.,Exp Cel l Res.178:114-126(1988)）。レチノイックアシッド（ＲＡ）アクションにおけるＣＲＡＢＰの正確・精密な役割は判明していないが、ＣＲＡＢＰはシャトル（shuttle）プロテインとして作用するかもしれないと考えられる。シャトルプロテインとして作用し、ＲＡの核(nucleus)への動きを容易にする・促進する。また、ＣＲＡＢＰはＲＡを隔離・隠退・封鎖(sequester)するかもしれないかと考えられる。この場合、細胞レスポンスを減少させる（Takase,S.et al.,Arch.Biochem.Biophys.247:328-334(1 9886);Maden，M.et al.,Nature 335:733-735(1988)）。最近の研究では、Ｆ９の全ての生物学的にアクティブなＲＡ類似たい・物質（analogs）はＲＡＲに結合する(bind)一方で、それらの内の２つはＣＲＡＢＰに結合しないことが発見された。Benbrook,D.et al.,Nature 333:669-672(1988)。このことはＲＡに結合するレチノイド（必ずしもＣＲＡＢＰに結合する必要はない）が、セル分化・変異を誘発するのに必要であることを示唆している。遺伝子情報の転写（gene transcription）に対するレチノイックアシッドの効果は、レチノイックアシッドレセプタ（ＲＡＲ）及びレチノイドＸレセプタ（ＲＸＲ）によって媒介・取次ぎ・調停される（Leed,M.et al.,Cell 68:377-395(19 92);Mangelsdorf,D.J.et al.,Genes Dev.6:329-344(1992)）。ＲＡＲはレチノックアシッド（ＲＡ）を高い親和性（度）で結合する一方、ＲＸＲはこのリガンド（ligand）については全く親和性を有さない（Mangelsdorf,D.J.et al.,Nature 345:224-229(1990)）。しかし、最近、９−ｃｉｓＲＡが高い親和度でＲＸＲ− αに結合できることが実証された（Levin,A.A.et al.,Nature 355:359-361(1992 );Heyman,R.A.et al.,Cell68:397-406(1992)）。ＣＲＡＢＰは高い親和度でＲＡを結合することが示されているが、その作用・機能はあまり理解されていない。しかし、最近、ＣＲＡＢＰはＲＡのチトクロームＰ−４５０物質交代・新陳代謝・代謝作用・変態（cytochrome P-450 metabolism）にかかわっているのではないかということが実証された（Fiorella,P.D.et al.,J.Biol.Chem.266:16572-16 579(1991)）。ＣＲＡＢＰの２つの同質異性体(isoform)、ＣＲＡＢＰ−Ｉ及びIIが認識・識別され、マウス(mouse)でクローン化された(cloned)（Stoner,C.M.et al.,Cance r Res.49:1497-1504(1989);Giguere,V.et al.,PNAS(USA)87:6233-6237(1990);Ni lsson,M.H.L.et al.,Eur.J.Biochem.173:45-51(1988)）。同質異性体（であること）によって意味されるもの（こと）は、ほぼ同じシーケンスの（を有す）２つのアミノ酸シーケンスである。ウシ属のＣＲＡＢＰ−Ｉも順番に並べられており、ラット（rat）及びチキン（chicken）ＣＲＡＢＰ−ＩのＮＨ２ターミナルリージョン（terminal region：末端区域）も最近判明された。（Bailey,J.S.et a 1.,J.Biol.Chem.263:9326-9332(1988);Kitamoto.J.et al.,Biochem.Biophys.Res .Comm.157：1302-1308(1988)）。しかし、人間のＣＲＡＢＰは、従来分離（isol ated）もしくはクローン化されていない。発明の開示人間の細胞レチノイックアシッドバインディングプロテインの２つの同質異性体をエンコードするシーケンス、即ちＣＲＡＢＰ−ＩとＣＲＡＢＰ−II、並びにＣＲＡＢＰ−IIのための遺伝子がクローン化され順番に並べられた・シーケンス化された（sequenced）。これらの核酸及び対応するアミノ酸シーケンスは、本願の請求の範囲の前のシーケンスリストに示されている。人間のＣＲＡＢＰ−II の発現（expression）（ＣＲＡＢＰ−Ｉではない）は、生体内条件で（in vivo ）人間の皮膚において著しく増大し、また、レチノイックアシッド（ＲＡ）を用いて処理した後の及び、ケラチン性細胞分化を誘発する処理の後の生体外条件の（in vitro）スキンファイブロブラスト（skin fibroblast）で著しく増大した。一旦転写（transcription）が起きた後の誘発レベルで（の）ＣＲＡＢＰ−II メッセージを検索する・記号解をつける（keying）ためのＲＡ依存ｍＲＮＡ安定化の重要性も説明・記載されている。人間のＣＲＡＢＰのクローン化及びシーケンス化は、人間のＣＲＡＢＰ−Ｉ及びIIのウイルス性の（viral）無核細胞（prokaryotic）及び真核細胞（eukaryot ic）発現ベクタ（vector：保菌生物）の構成・構造並びに組換え型発現構成物（ recombinatnt expression constructs）のベース・基礎（basis）を提供する。よって、人間のＣＲＡＢＰは合成的にもしくは生体外で（人間の体の外で）造ることができる。それは、例えばバクテリアに（中で）フュージョン（fusion）プロテインを造り、及びその後それからＣＲＡＢＰを細胞分裂（cleavage）して純化（purification）することによって造られる。人間のＣＲＡＢＰシーケンスを用いたリガントバインディングの研究により、リガンドバインディング親和度が判定可能であり、人間のＣＲＡＢＰの他の人間のレチノイドバインディングプロテインとの相互作用（interaction）が判定可能である。また上記研究は、病理学用に（のために）ティシュに特徴のある・が特異なドラッグ（tissue-specific）ドラッグ（drug）（この場合、レチノイドが関係している）をよりうまく識別・認識するのに用いることができる。色々な検査・分析目的（例えば、リポータ検査システム（reporter assay system）、直接及び競合（争）ハイブリッド化（direct and competition hybridization）、並びにバインディング検査）では、ここに開示された拡散及びアミノ酸シーケンスを採用する。抗体とこれのバインディングフラグメント（fragments）（人間のＣＲＡＢＰに造られるもの）は、診断及び処理のモニタリング（monitoring）のために、ＣＲＡＢＰレベルで（の）患者のティシュの免疫学的検定（法）にも用いることができる。純化されたもしくは合成の人間ＣＲＡＢＰはまた、補充セラピ（su pplementation therapy）にも用いることができる。本発明のその他の特徴及び利点は、添付図面と共に読まれるべき以下の詳細な説明及び添付の請求の範囲から明らかになる。図面の簡単な説明図１は、人間ＣＲＡＢＰのクローン化に用いられるフォワード（forward）及びリバース退化・変質・縮退（reverse degenerate）プライマ（primer）のシーケンスを示している。図２は人間、マウス、ラット及びチキンのＣＲＡＢＰを比較する図である。パネルＡ（図２Ａ）は人間（ｈ）としてマウス（ｍ）のＣＲＡＢＰのアミノ酸シーケンスを比較している。ダッシュはシーケンスアイデンティを示す。残余・残基１１８のアスタリスクは、最大アライメント（整合、整列）のためにＣＲＡＢＰ −Ｉシーケンスに導入されたギャップ（gap）を示す。パネルＢ（図２Ｂ）は人間（ｈ）と、マウス（ｍ）と，ラット（ｒ）と、チキン（ｃ）のＣＲＡＢＰのＮＨ₂ターミナルエンドのシーケンスの比較を示している。４角形でかこまれている(boxed)残基は、人間のＣＲＡＢＰ−IIに似ていないものを示している。図３は３つの人間（individuals）からの（derived from）ＲＮＡブロット（b lots）のオートラジオグラム（autoradiogram）であり、典型的に用いられるレチノイドアシッド（ＲＡ）により人間の皮膚においてＣＲＡＢＰ−IIｍＲＮＡが誘導される様子を示している。レーン（ａ）は無処理、レーン（ｂ）はＲＡ媒介物・伝達物（vehicle）、レーン（ｃ）は閉塞、吸蔵（occlusion）下でのＲＡ媒介物における０．１％クリームを示す。図４は９個の独立した実験のＲＮＡブロットハイブリッド化の結果を示す棒グラフ（レーザ濃度計（Laser densitometry）によって数量化されたものである）。３つの全数の・２倍性の（diploid）人間の肺のファイブロブラストラインと、３人の人間（individuals）から用意された５つの皮膚の（dermal）ファイブロブラストラインを含む。この結果は、肺のファイブロブラストと比較した場合の、人間の皮膚のファイブロブラストにおける人間のＣＲＡＢＰ−IIｍＲＮＡの誘導発を示している。挿入画（inset）は、２つの代表実施例からの関連オートラジオグラフィックバンド（band）を示し、皮膚及び肺のファイブロブラストを比較している。図５は、種々の条件下での培養されたケラチン性の細胞におけるＣＲＡＢＰ− IIｍＲＮＡの発現を示している。図５Ａは７つの独立したケラチン性細胞ストレイン（strains）について得られた結果を示す棒グラフである。また、人間のＣＲＡＢＰ−IIｍＲＮＡレベルに対する融合・合流の効果が示されている。エラーバー（error bar）は±ＳＥ^**ｐ＜0.005，^*** ｐ＜0.0005を示している（セルに対して）（２日前融合(2days Cprecomfluence)）。図５Ｂは融合後のケラチン性細胞におけるＲＡと増加カルシウム濃度の、人間ＣＲＡＢＰ−IIｍＲＮＡレベルに対する効果を示している。検知できなかった。低いＲＡ濃度（３×１０^-9Ｍ）で時間を延長して処理した。図５Ｃは、高い濃度のＲＡ（３×１０^-6Ｍ）で融合後の（postconfluent）ケラチン性細胞をの延長処理することにより、ＣＲＡＢＰ−IIｍＲＮＡが検知できないレベルに減少・低下したことを示している。図６は、レチノイックアシッドレセプタ（ＲＡＲ）−ＣＲＡＢＰもしくはＲＸＲ−ＣＲＡＢＰの同時（共）トランスフェクション測定（cotransfection assay ）の概略図である。図７は人間の胎盤ゲノミックライブラリ（library）から分離されたバクテリオファージラムダクローン（λ２．１）の制限・限定マップ（restrition map）である。人間のＣＲＡＢＰ−II遺伝子はエクソンを有している（黒く塗りつぶされた４角（Ｉ）〜（IV）で示されている）。図８はヌクレオチドシーケンスを示しており、ヌクレオチドシーケンスの上に示されているのは、人間のＣＲＡＢＰ−II遺伝子での推論されたアミノ酸シーケンスである。図９はプライマエクステンション（primer extension）分析によって判定・判断された人問のＣＲＡＢＰ−II遺伝子内での転写開始位置を示している。主な転写位置は矢印で示されており、シーケンスの対応するベース（base:塩基）はアスタリスクで示されている。図１０は、レチノイックアシッドで処理された培養人間皮膚ファイブロブラストから分離されたヌクレイ（nuclei）を用いた細胞核断続・流出（nuclear run- ofｆ）検査を示している。図１１は、フォスフォリメイジィング（phosphorimagting）による量子化（数量化）及びサイクロフィリン・シクロフィリン（cyclophilin）へのノーマライゼーション（normalization：標準化）の後の、ＣＲＡＢＰ−IIのｍＲＮＡレベルと転写速度を示している。図１２はシクロヘキシミド（cycloheximide）もしくはアンチノマイシン（ant inomycin）Ｄの、ＣＲＡＢＰ−IIｍＲＮＡ発現の誘発に対する効果を示すオートラジオグラムである。図１３は細胞核追加・継続（run-on）検査により判定されたＣＲＡＢＰ−II転写速度に対するシクロヘキシミドの効果を示す棒グラフである。好適実施例の詳細な説明概要２つの人間ＣＲＡＢＰｃＤＮＡのクローン化及びシーケンス化によって、予想（predicted）アミノ酸シーケンス（99.3％マウス及びウシ属のＣＲＡＢＰ−Ｉと同じ）を有する１つのもの（第１のもの）が判明し、予想アミノ酸シーケンス（93.5％マウスＣＲＡＢＰ−IIと同じ）を有する第２のものが判明した。ここに記載開示されるＣＲＡＢＰ−IIは、マウスＣＲＡＢＰ−IIと同じ人間ＣＲＡＢＰ −IIである。なぜなら、両者は大人の皮膚に発現し、したがってそのように示されるからである。ウシ属と、マウスと、人間ＣＲＡＢＰ−Ｉの間に見られる高いアミノ酸同一性は、この同質異性体が進化の過程で、ＣＲＡＢＰ−IIよりも保存されてきたことを示している（図２Ａ参照）。これは特に、ラット、チキン、マウス及び人間のＣＲＡＢＰ−Ｉ及びIIの間のＮＨ₂ターミナルシーケンスが比較された場合明らかになった。ＣＲＡＢＰ−Ｉ同士の間では何の違いも見られなかったが、ＣＲＡＢＰ−II同士の間ではいくつかの違いが存在する。ＣＲＡＢＰ−Ｉ転写は、ＲＮＡブロットハイブリッド化によっては大人の人間の表皮において検出不可能であったが、ＣＲＡＢＰ−IIｃＲＮＡプローブ（prob e）は約１．２キロベース（ｋｂ）のｍＲＮＡ転写を検知した。１６時間人体内条件で０．１％レチノイックアシッドクリームを外から付与すると、１６フォールド（fold）誘発のＣＲＡＢＰ−IIができた（が、ＣＲＡＢＰ−Ｉはできなかった）。ＣＲＡＢＰ−IIｍＲＮＡはまた、人間の皮膚から培養されたファイブロブラストのレチノイックアシッド処理によって大きく増大した（＞１５フォールド）。一方、人間の肺のファイブロブラストでは、ＣＲＡＢＰ−IIｍＲＮＡの顕著な誘発は観察されなかった。人間のＣＲＡＢＰ−II（ＣＲＡＢＰ−Ｉではない）ｍＲＮＡは、人体外条件でケラチン性細胞の分化・変異を誘発する処理によって著しく誘発された。大きく増大したレベルのＣＲＡＢＰ−IIＲＮＡが乾癬表皮において見つけられた（１０人の異なる患者について通常の表皮と比較した場合）。一方、ＣＲＡＢＰ−Ｉメッセージレベルは、通常の及び乾癬皮膚の双方において、非常に低いか検出不可能である（データは図面に示されていない）。自然・天然の及び合成のレチノイド並びにこれらの増大したレベル（ケラチン性細胞分化時間のもの）によるＣＲＡＢＰの誘発の従来の研究は、本願の研究で見られたＣＲＡＢＰ−IIメッセージの発現と合致するが、ＣＲＡＢＰ−Ｉの発現とは合致しない。この考察・研究はしたがって（このように）、大人の人間の皮膚において発現され易くＲＡにより調整される同質異性体としてＣＲＡＢＰ−IIを認識・識別する。この研究において用いられる皮膚生検（biopsies）から分離されるｍＲＮＡは、ケラチン性細胞からのもの（derived from）が約９５％であるので（Voorhees ,J.J.et al.,Arch.Dermatol.105：695-701(1972)参照）、生体内条件で見られるＣＲＡＢＰ−IIのＲＡ誘発のほとんど（図３参照）は、皮膚のファイブロブラスト（dermal fibroblast）からの（derived from）ｍＲＮＡの存在によっては説明できない。これは、生体外条件でのケラチン性細胞（keratinocytes）における高濃度のＲＡに反応して観察できるＣＲＡＢＰ−II転写の減少とは対称物である（図５Ｃ参照）。ここで用いられたのと同じ条件下で後融合・集合（状態）に生長させると、人間のケラチン性細胞では、インボリュークリン（involucrin）含有量及びトランスグルタミナーゼ（transglutaminase）アクティビティ（ターミナル分化・変異の間の、角質化された（cornified）エンベロープフォーメーションの２つの重要な決定子（determinants）である）において同等増加（doordinate increase）が生ずる（Pillai,S.et al.,Cell.Physiol.143：294-302(1990)）。さらに、細胞外のカルシウム濃度が１．２もしくは２．４ｍＭに増加したとき、これらの出来事（events）は加速され融合・集合の前に始まる（Pillai,S.et al .,Cell.Physiol.143：294-302(1990)）。ＣＲＡＢＰ−IIｍＲＮＡレベルは、同じように融合・集合と外部カルシウムに対応する（図５参照）。これらの結果は表皮の層状構造及び／または皮膚・真皮の存在が体内条件におけるＣＲＡＢＰ− II調節（regulation）の重要な決定子であること、また、これらが体内及び体外条件でのケラチン性細胞のＲＡへの異なる応答性を説明するのに役立つのではないかという考えを強く肯定する。体外条件（in vitro）で見られるＣＲＡＢＰ− II発現に対する高濃度ＲＡの負の（好ましくない）影響・効果は、このコンパウンドの培養ケラチン性細胞でのトランスグルタミナーゼタイプＩのｍＲＮＡレベルに対する影響に似ている（Floyd,E.E.et al.,Mol.Cell.Biol.9：4846-4851(19 89)）。人間のＣＲＡＢＰ−II遺伝子のＲＡ誘発が転写レベルで起こるのか、及び、このレギュレーションが特定の細胞核レセプタによって媒介される（mediated）のかは、さらに研究しなければならない点である。人間の皮膚及び培養された人間の皮膚ファイボブラストはＲＡＲ−γを発現することがわかっている。（Krust, A.et al.,PNAS(USA).86:5310-5314(1989):及びElder,J.T.et al.,J.Invest.Derm atol.96 425-433(1991)）。しかし、このことは、培養された人間の肺ファイボブラスト及びケラチン性細胞（これもＲＡＲ−γを発現するものとして知られている）において見られるＣＲＡＢＰ−IIｍＲＮＡのＲＡ誘発の不存在を説明するものではない（Elder,J.T.et al.,J.Invest.Dermatol.96:425-433(1991)）。もしＣＲＡＢＰ−II遺伝子がＲＡＲによってレギュレートされると、別のティシュもしくはセルに特徴にある（が特異な）ファクタがＲＡ誘発に必要となってくるだろう。レセプタの細胞核（nuclear）上科（superfamily）のメンバは二重体としてそれの応答要素・塩素（responsive elements）と相互作用する（interact）ことが知られている（Glass,C.K.et al.,Cell 59:697-708(1989)）。また、ＲＡＲは、このファミリの他のメンバ（即ち、甲状腺ホルモンレセプタ）と相互作用し、ヘテロダイマ（heterodimer:異なる二重体）を形成することが知られている（Gl ass,C.K.et al.,Cell59:697-708(1989)）。最も注目すべき最近の発見の１つは、甲状線ホルモンレセプタが生長ホルモン遺伝子の甲状線ホルモン応答要素・元素（element）と相互作用するためには補助・補足プロテイン（auxiliary prote in）（ＴＲＡＰ）を必要とすることである（O´Donell,A.L et al.,Mol.Endocri nol.5:94-99(1991)）。ＴＲＡＰは明らかに，見たところでは、多分（apparently）、応答元素の甲状腺ホルモンレセプタと共にヘテロダイマを形成している。細胞核レセプタとその他の転写ファクタとの間のこのような二重体化は、ティシュに特徴のある（tissue -specific）レギュレーションを説明できるかもしれない。もしＲＡＲを用いてヘテロダイマを形成するような皮膚に特徴のあるファクタがあれば、それによって、なぜＣＲＡＢＰ−II遺伝子が皮膚ファイブロブラスト中の（肺ファイブロブラストではなく）ＲＡによって誘発されるのかを説明できるかもしれない。以上まとめると、我々は、ＣＲＡＢＰ−IIが生体内条件で人間の皮膚に発現されることを実証し、また、ＣＲＡＢＰ−II遺伝子が、生体内条件での皮膚内の及び生体外条件での培養皮膚ファイブロブラスト内のＲＡによってレギュレートされているだろうことを実証した。しかし、ＣＲＡＢＰ−IIは培養された肺ファイボブラスト中のＲＡによっては誘発されなかった（この遺伝子のセルに特徴のあるレギュレーションを実証している）。一方で、ＣＲＡＢＰ−ＩはＲＡによってレギュレートされていないようである。ＣＲＡＢＰ−Ｉは生体内条件での人間の皮膚には非常に低いレベルもしくは検出不可能なレベルで存在し、また、ケラチン性細胞やファイブロブラストにおいても同様である。このことは、ＣＲＡＢＰ −IIが、皮膚中でのセル変異・分化に対するＲＡのアクションを制御する調節（ regulatory）フィードバックメカニズムに参加していることを示唆している。人間のＣＲＡＢＰ，ＲＡＲ及びＲＸＲの認識（化）・識別によって、後述するように、ＲＡアクションの複雑な分子及び細胞（cellula）メカニズムにおけるこれらファミリのメンバ間での相互作用に関する研究ができるようになった。人間のＣＲＡＢＰ−Ｉ及びＣＲＡＢＰ−IIの核酸及びアミノ酸シーケンスの識別によって、多種の組換え型（recombinant）プロダクトのベースが提供される（これには、人間のＣＲＡＢＰｃＤＮＡシーケンスを有するベクタや、このベクタによって感染したり（infected）同時トランスフェクションされた（cotransf ected）発現構成体（constructs）が含まれる）。例えば、人間のＣＲＡＢＰｃＤＮＡを有するウイルス性のベクタもしくはプラスミドが構築され、レセプタ欠陥ＣＶ−１のサルの腎臓セルを同時トランスフェクトもしくは同時感染するのに用いられる。ＣＶ−１組換え型発現構生物・体を用いるリポータ検査システム（人間のＣＲＡＢＰｃＤＮＡを含む）や、レチノイド反応元素・要素（element）を含むリポータ元素・要素や、リポータ遺伝子（好ましくは、内部制御シーケンス）（例えばAstrom.A.et al.,Biochem.Biophys.Res.Comm.173：339-345(1990) に概略が示されているもの）も、構築することができる。米国特許第4,981,784 号（発明者エヴァンスその他）に示されているようなキメラの（chimeric）レセプタプロテインも合成することができ、リポータ検査に用いることができる。別のレチノイドバインディングプロテインとの関連で人間のＣＲＡＢＰを用いる検査システムも、本発明の範囲内のものである。例えば、図６に概略が示されているように、人間のＣＲＡＢＰを有するウイルス性（例えば、ＳＶ４０）のベクタ、レチノイド反応元素を有するリポータ（reporter）プラスミド（例えば、ＲＲＥ₃−ｔｋ−ＣＡＴ）、感心のある人間のＲＸＲやＲＡＲを有するウイルス性（例えば、ＳＶ４０）のベクタ、及び内部制御用のβガラクトシダーゼベクタ（ｐｃＨ１００）が同時感染もしくは同時トランスフェクトされてＣＶ−１セルになる。図６に示されているように、組換え型ＣＶ−１構成体は感心のあるバイディングリガンド（配位子）（例：レチノイド）にさらされる（exposed）。リガンドによって意味されるものは、レセプタバインディングプロテインをバインドすると共に、感心のある遺伝子の発現を誘発する分子である。この検査システムでは、リポータ遺伝子の誘発は、レセプタプロテインへのリガンドバインディングの際の検査（assay）に用いられる。その他の調節要件は何もないので、機能的リガンドはＲＡＲもしくはＲＸＲをバインドするかもしれない。その結果、レポータ遺伝子（ＣＡＴ）の発現（及び移動（translation)）を刺激する。システムにおいて人間のＣＲＡＢＰを誘発することによって、ＣＲＡＢＰと、ＲＡＲもしくはＲＸＲもしくはその他のバインディングレセプタとの間の相互作用が決定される（を判定することができる）。例えば、もしＣＲＡＢＰが細胞盾（cytopl asm）中のＲＡを隔離する・封鎖する（sequester）と、より少ないリガンドが細胞核に到達し、したがって、レポータ遺伝子のＲＡＲもしくはＲＸＲ媒介刺激が減少する。人間のＣＲＡＢＰのシーケンス化によって、抗体もしくはバインディングフラグメント（例：Ｆ ´（ａｂ）の構築・増大・生産もできる。これは、バインディングをさらに特徴づけたり、診断目的において免疫測定（法）に用いることができ、さらに患者の処理の経過・順（course）をモニタする場合にも用いることができる。例えば、患者のティシュは、人間のＣＲＡＢＰの存在及びレベルを見るために検査・測定される（レチノイドが関係する特定の条件、状態を診断するために）。また、患者のティシュはＣＲＡＢＰの患者レベルを変化させる場合のドラッグ及びその他の処理の効果をモニタするために検査・測定される。人間のティシュもしくはセルから直接純化されたＣＲＡＢＰ（培養の場合もしくは合成的に造られた人間のＣＲＡＢＰの場合もしくは生体外条件の場合）は、また、必要なときに、サプリメンテーションセラピ（supplementation therapy）を提供する。人間のセルラーレチノイックアシッドバインディングプロテイン（ＣＲＡＢＰ −II）用の遺伝子がクローン化されシーケンス化された。それは人間の胎盤ゲノミックライブラリから分離され、１つのバクテリオファージクローンに含まれている。遺伝子は６キロベースにわたり、４つのエクソンと３つのイントロンとから構成されている（これは、疎水性のリガンドバインディングプロテイン遺伝子ファミリのその他のメンバと同様である（Wei,L.N.et al.,DNA Cell Biol,9；47 1-478(1990)）。マウスのＣＲＡＢＰ−Ｉ遺伝子は以前にクローン化され、異なるイントロンを立証している（しかし、同じようなエクソン構成・配置（arrang ement）である（Wei,L.N.et al.,DNA Cell Biol,9；471-478(1990)）。１つの大きな転写位置は、ＡＴＧ開始コドン（initiation codon）の上流のＡ残基１３７（Ａ residue137）へ位置づけされた（mapped）。ＣＲＡＢＰ−II遺伝子の上流域のシーケンスはどちらかというとＧＣリッチであり、−３１及び転写ファクタとして幾つかの可能性のあるバインディング箇所においてＴＡＴＡボックス（bo x）を有する。特に感心があるのは、５´フランキング（flanking）域に、潜在的な（potent ial）ＡＰ２（ＣＣＣ／ＧＣＡ／ＧＧＧＣ）箇所が存在することである。ＡＰ２は転写ファクタＫＥＲ１と同一であることが示されている。これは一般に表皮（性）遺伝子調節（regulation）に含まれていると考えられている（Leask,A.et a l.,PNAS(USA)88:7948-7952(1991)）。ＣＲＡＢＰ−IIは大人のマウスの皮膚に優先的に，支配的に（predominantly）発現し、我々は最近、ＣＲＡＢＰ−II（ＣＲＡＢＰ−Ｉではない）が人間の皮膚に発現されることを実証した（Giguere,V. et al.,PNAS(USA)87:6233-6237(1990)Astrom,A.et al.,J.Biol.Chem.266:17662- 17666(1991)）。また、ＡＰとＣＲＡＢＰ−IIｍＲＮＡの双方がＲＡによって誘発されることが示された。（Astrom,A.et al.,J.Biol.Chem.266:17662-17666(19 91);Luscher,B.et al.,Genes Dev.3:1507-1517(1989)）。ＡＰ２が皮膚に特徴のある発現及びＣＲＡＢＰ−II遺伝子のＲＡ誘発に含まれる・かかわっているか否かは今後，判明すべき点である。図８に示されるように、上流域は、ＴＡＴＡボックスに近い高い親和度のＳｐ１バインディング箇所・位置（ＧＧＧＧＣＧＧＡＧＣ）も含んでいると共に、Ｋｒｏｘ−２４バインディング箇所・位置と同じ２つのシーケンス（ＧＣＧＧＧＧＧＣＧ）も含んでいる。（Kadonaga,J.T.et al., Trends Bichem.Sci.11:20-23(1986).Lemaire,P.et al.,Moi.Cell.Biol.10:3456- 3467(1990)）。Ｋｒｏｘ−２４は早期の（early）反応・応答遺伝子ファミリのメンバであり、セル純化及び変異・分化のレギュレーションにかかわりがあると示唆されている。（Lemaire,P.et al.,Mol.Cell.Bioi.10:3456-3467(1990);Edwa rds,S.A.et al.,D ev.Biol.148:165-173(1991)）。Ｅｇｒ−１Ｋｒｏｘ−２４が初期の（embryon al）Ｐ１９セル中のＲＡによって誘発されることが最近示された。これらセル中のＲＡによるＥｇｒ−１プロテインの誘発は一時的な５フォールド（５−fold）増加を引起こした（３０〜６０分位のピークで）。そして６０〜９０分の間で、ベイシックレベルに戻った。よって、図１１に示されるように、ＲＡによるＥｇｒ−１プロテインの誘発はＣＲＡＢＰ−II遺伝子転写の直前に起きる。しかし、皮膚ファイブロブラストでのＣＲＡＢＰ−II遺伝子のＲＡ誘発転写レギュレーションにＥｇｒ−１が関与していることは希である。なぜなら、Ｅｇｒ−１はシクロヘキシミドを用いてセルを処理することによって誘発されることが発見されており、その一方で、この研究におけるＣＲＡＢＰ−IＩ遺伝子発現は、図１２及び図１３に示されているように、このコンパウンドによって抑制・抑止されることが発見されたからである。（Edwards,S.A.et al.,Dev.Biol.148:165-173(1991 )）。ＣＲＡＢＰ−II遺伝子の上流域（upstream region）はまた、ＲＡＲ−β２プロモータにおいて見つけられたＲＡＲＥと同じ１つのヌクレオチドによって隔離されたダイレクトリピート（Ｇ／ＡＧＴＴＣＡ）を含んでいる（但し、ＲＡＲ −β２ＲＡＲＥは５つのヌクレオチドによって隔離されている）（Umesono,K.et al.Cel165：1255-1266(1991)）。遺伝子の疎水性リガンドバインディングファミリの２つの他のメンバが、それらのプロモータの中にＲＡＲＥ（ＣＲＢＰ−Ｉ）とＲＸＲＥ（ＣＲＢＰ−II）を含んでいることが最近示された。（Smith,W.C. et al.,EMBO J.10:2223-2230(1991);Mangelsdorf,D.J.et al.,Cell66:555-561(1 991)）。このダイレクトリピート（direct repeat）が機能し得るのかは判明していない。ＣＲＡＢＰ−IIのＲＡ誘発が転写可能かを判定・決定するために、細胞核追加（run-on）検査が行われた。図１０及び図１１に見られるように、ＲＡを用いて培養人間皮膚ファイブロブラストを処理すると、早い（rapid）一時的な６フォールド増加の転写が得られた。その後、ＣＲＡＢＰ−IIｍＲＮＡレベルの６フォールド誘発が起きた。したがって、ＣＲＡＢＰ−II遺伝子は主にＲＡによって転写活性される（transcriptionally activated）。ＣＲＡＢＰ−IIｍＲＮＡはレチノックアシッドによって、培養人間皮膚ファイブロブラスト中で２〜６時間以内に急速に誘発された。そして、６時間の処理の後に安定状態（plateau）に達した。しかし、１２時間後に媒体（medium）からレチノイックアシッドを取除くと、ＣＲＡＢＰ−IIｍＲＮＡレベルが急激に降下した・傾いた。ＣＲＡＢＰ−IIメッセージの急速な増加の主な原因は転写速度の増大である。このことは、図１０に示されるような細胞核追加（run-on）実験によって判明した。転写の増加はＲＡの添加後１時間という短時間で検知することができた。２時間後にピークがあり、６時間以内に基本的なレベルに戻った。また、図１２に示されるようなメッセージの蓄積（accumulation）と、図１３に示されるような転写の誘発（ＲＡによるもの）の双方が、シクロヘキシドによって抑制（止）された。このことは、ＣＲＡＢＰ−II遺伝子が、転写に関しては、新たに合成されたプロテインによってレギュレートされていることを示唆している。一旦転写が起こると、メッセージは安定状態に達し、ＲＡが媒体から除去されるまで降下しない（傾かない）。転写における一時的な増加のためには継続的な（on-going）プロテイン合成が必要であった。なぜなら、誘発はシクロヘキシミドによってブロックされる（blocke d）からである。見えるＣＲＡＢＰ−IIｍＲＮＡの減少が遺伝子の転写の減少の結果であることはほとんどなかった。なぜなら、転写のＲＡ誘発は一時的なものであり、６時間以内に制御レベルに戻るからである。より正しそうな説明としては、ＲＡはＣＲＡＢＰ−IIメッセージの安定化に関与したと考えられる。ＣＲＡＢＰ−IIｍＲＮＡは不安定の場合が多い。なぜなら、それは３´非移動（untran slated）域においてＡＵリッチシーケンスを含んでいるからである。（Giguere, V.etal.,PNAS(USA)87:6233-6237(1990);Astrom,A.et al.,J.Biol.Chem.266:1766 2-17666(1991)）。多くの一時的に発現される遺伝子（例えば、リンカフォカイン遺伝子、ｃ−ｍｙｃ及びｃ−ｆｏｓ）はそれら（遺伝子）の３´非移動域にＡＵリッシーケンスを含んでいること示されている。また、これらシーケンスの存在は急速なｍＲＮＡ減成・崩壊・退化・劣化（degradation）と相関関係があることが示されている（Cleveland,D.W.et al.,New Biol.1:121-126)）。ＣＲＡＢＰ−IIｍＲＮＡ安定化を引起こすメカニズムは、ＲＡによってセルを処理した後のファクタ（factor）の生成に関係している（含む）か、すでに存在しているファクタとＲＡとの相互作用に関係している（含む）（このことによりメッセージが安定す）。シクロヘキシミドが遺伝子のＲＡ誘発転写（その結果として、メッセージの誘発をブロックしたので）、可能性は識別不可能であった。人間のＣＲＡＢＰ−II遺伝子は転写については、人間の皮膚のファイブロブラスト中のＲＡによって一時的に誘発されることが実証されており、また、この誘発が継続的なプロテイン合成に依存することも実証されている。転写の初期の誘発の後に、ＣＲＡＢＰ−IIメッセージレベルが急激に増加する（これは、ＲＡが媒体から除去されるまで減少しない）。このことは、ＲＡ依存のｍＲＮＡ安定化を示唆している。本発明のヌクレオチド及びアミノ酸シーケンスは、「シーケンスリスト」に示されたシーケンスによって代表されたシーケンス及びその相補性の補完的なシーケンスから考えられる（派生する）いくつかのバリエーションも含むことができる。しかし、「シーケンスリスト」に示されたシーケンスによって実質的に示されたものか、それらの実質上相補的なシーケンスでなければならない。「実質的に示された」もしくは「実質上相補的な」という表現は、いかなるバリエーションも、シーケンスの機能を多きく損なわないことを意味している。本出願では、Ａはアデニン，Ｔはチミン，Ｇはグアニン，Ｃはシトシンを示している（特に指定・指示がない限り）。特定の例特定の例１：人間のＣＲＡＢＰのクローン化及びシーケス化物質及び方法ポリメラーザ連鎖反応（ＰＣＲ）により人間の皮膚からＣＲＡＢＰをクローン化すること Elder,J.T.et al.,J.Invest.Dermatol.94:19-25(1990)に記載されているように全ＲＮＡが人間の角化腫瘍（keratoma）バイオプシー（biopsy）から分離された。また、ｃＤＮＡがManlatis,T.et al.,Molecular Cloning:Alaboratory Manu al,cold Springu Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY(1982)に記載されているように逆（リバース）転写によって合成された。マウス及びウシ属のＣＲＡＢＰ−Ｉからの（derived from）縮退プライマ（degenerate primer）は、コーディング（coding）域を増幅（amplify）するようにデザインされた。ｂａｌ及びＢａｍＨＩの箇所・位置は、それぞれフォワード及びリバースプライマに含まれていた（図１Ａに示されている）。ｃＤＮＡがＰＣＲ用のテンプレート（template）として用いられた（９２℃で２分間変性し、４２℃で２分間アニール（annealing）し、７２℃で２分間増幅し（amplifiaction）、１０分間最終伸張（extension）した）。４０サイクル後、増幅されたＤＮＡの長さは１．５％アガローズゲル（上）で判定された。ＣＲＡＢＰの増幅された４３６−ｂｐ域はゲルから分離され、ブルースクリプト（Bl uescript）ファージミッド（phagemid）にサブクローン化され、後述するようにシーケンス化された。ｃＤＮＡクローンのスクリーニング及びシーケンス化ポリＡ（ｐｏｌｙＡ）＋ＲＮＡがElder,J.T.et al.,J.Invest.Dermatol.94：19-25(1990)に記載されているように、人間の皮膚から準備され（造られ）、ラムダザップII（Lambda Zap II）中にｃＤＮＡライブラリを準備するのに用いられた（Stratagene inc.,La J olla,CA）。このライブラリは１．０×１０⁷の一時・主要組換え型（primary re combinants）を含んでいた。４３６−ｂｐＰＣＲプロダクトは、ランダムなヘキサマ（hexamer）プライミング（priming）によってラベル・標識付けされ，（Bo oringer Mannheim,Indianapolis,IN）、大人の人間の全皮膚（whole skin）ｃＤＮＡライブラリ及びλｇｔ１１中の人間の皮膚のファイブロブラストｃＤＮＡライブラリをスクリーンするのに用いられた（Ciontech,Palo Alto,CA）。２つの（duplicate）ニトロセルローズフィルタが、５×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝150ｍＭＮａＣｌ，１５ｍＭクエン酸ナトリウム）と、１×デンハーヅ（Denhardt´s ）(0.02％フィコル（Ficoll）／０．０２％ウシ属血清アルブミン／0.02％ポリビニルピロリドン）と、０．１％ＳＤＳ（硫酸ドデシルナトリウム）と、２００ μｇ／ｍｌ・ｔＲＮＡとを含む５０％フォルムアシド中で１６時間ハイブリッド化された。そして、フィルタは２回０．２×ＳＳＣ（０．２％ＳＤＳ）中で２０分間洗浄され、１回０．２×ＳＳＣ（０．１％ＳＤＳ）中で５５℃で２０分間洗浄された。２つのポジティブなクローンが皮膚ライブラリから分離され、５つのクローンが皮膚ファイブロブラストライブラリから分離された。皮膚ライブラリからのクローンは解放・救助された（resucued）が、ファイブロブラストライブラリからのクローンはブルースクリプトファージミッドにサブクローン化された（subc loned）。（Stratagene inc.,La Jolla,CA）。 Sanger,F.et al.,PNAS(USA)74:5463-5467(1977)に概略が示されているディデオキシ（dideoxy）チェーンターミネーション（chain termination）によって、両ストランド（strand）に対してＤＮＡシーケンス分析が行われた。この場合、改良（modified）Ｔ７ポリメラーゼ（Sequenase,U.S.Biochemical Corp）及び合成オリゴヌクレオチドを用いた。セル培養通常の人間のケラチン性細胞の一次培養（primary culture）がBoyce,S.T.et al.,in in Vitro Models for Cancer Research(Weber,M.M.and Sekely,L,I.,eds ）Vol.3,pp.245-274,CRC Press,Boca Raton,FL(1986)．に示されているように容易された。二次培養がケラチン性細胞生長媒体（keratinocyte grouth meduim：ＫＧＭ）内で拡張された（expanded)Cloneics,San Diego,CA）。人間の皮膚のファイブロブラスト培養は尻の皮膚のパンチ（punch）バイオプシから容易され（H arper,R.A.et al.,Science 204:526-527(1979）を参照）、改良（modified）マッコイ（McCoy´s）５Ａ媒体（１０％の子牛（calf）血清を含む）中で繁殖された（propagated）。人間の肺のファイブロブラストはアメリカタイプ培養コレクション（American Type Culture Collection：ＡＴＣＣ）（Rockville,ＭＤ）から入手し、同じ媒体内で生長させた。ｍＲＮＡのノーザンアナリシス（northern analysis）ＲＮＡはケラトマ（keratome）バイオプシから分離され、（Elder,J .T.et al.,J.Invest.Dermatol.94:19-25(1990)）にすでに記載されているように、グアニジニウムイソチオシアネートリーシス（guahidinium isothiocyanate l ysis）及び超遠心分離によってセルを培養した。レチノイックアシッド処理を含む研究のために、０．１％ＲＡクリーム（レチン−Ａ（Retin−Ａ），Ortho Pha rmaceutical Corp.Raritan,NJ）が一度皮膚に適用され（ａpplied）、バイオプシの前に４時間〜９６時間プラスチックラップ（plastic wrap）下で保持された。近傍の場所（部分）はレチン−Ａ伝達物・媒質（vehicle）で処理されたが、何も処理されなかった。４時間後、１２時間後、１６時間後もしくは９６時間後に、ケラトマ（keratome）バイオプシが得られＲＮＡ分離に用いられた。ＲＮＡ濃度は吸光度２６０ｎｍで判定され、非変性の（nondenaturing）アガロースゲル電気泳動及びエチジウム臭化物（bromide）着色・染色（stainig）によって（Thompson,C.B.et al.,Nature 314：363-366(1985)に記載されている）。同じ量の全ＲＮＡが１％フォルムアルデヒドーアガロースゲル（０．５μｇ／ｍｌエチジウム臭化物を含む）内で電気泳動的に分離（separated）され、派生（derivatized）ナイロン膜に移された。（Zeta-Probe,BioRad,Richmond,CA)Eld er,J.T.etal.,J.Invest.Dermatol.94:19-25(1990)and Maniaties,T.et al./Mole cular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spr ing Harbor NY(1982)。フィルタは２時間８０℃で真空中で（in vaco）ベーキングされ（baked）、その後、５０％フォルムアミド（５×ＳＳＣ５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、１×デンハード溶液（Denhardt's solution）、２５０μｇ／ｍｌイースト（yeast）ｔＲＮＡ、１００μｇ／ｍｌ超音波分解された（sonicated）ニシンの精子のＤＮＡ、及び１％ＳＤＳを含む）内で２〜４時間４２℃で予備・前ハイブリッド化された（prehybridized）。ハイブリッド化は１８〜２４時間４２℃で同じバッファ（buffer）（１０％硫酸塩（dextran sulfate)）内で行われた。フィルタは２回１０分間２×ＳＳＣ（０．１％ＳＤＳ）中で室温で洗浄され、その後２回２０分間０．１×ＳＳＣ（０．１％ＳＤＳ）中で５６℃で洗浄された。オートラジオグラフィ（autoratiography）は、−７０℃の増感スクリーン（intensifying screens）を用いて行われた。フィルタは０．１×ＳＳＣ（０．５％ＳＤＳ）中で２×１０分間ボイルすること（boiling ）によってストリップ化された。ハイブリッド化プローブは、ランダムプライミング（priming）によって容易された（Feinberg,A.P.et al.,Anal.Biochem.132: 6-13(1983)を参照）。上記ランダムプライミングは、ラットサイクロフィリン（ rat cyclophilin），ＣＲＡＢＰ−Ｉ・ｃＤＮＡ（λｆ１．１）及び人間のＣＲＡＢＰ−Ｉ・ＰＣＲプロダクト低溶融（low melting）アガロース純化（agarose-purified）インサートフラグメント（insert fragment）のランダムプライミングである（Danielson,P.E .et a1.,DNA7:261-267(1988)参照）。オートラジオグラムは、ヒューレット・パッカード（Hewlett-Packard)3390A インテグレータに連結されたレーザ濃度計（laser densitometer）（ＬＫＢＭｏｄｅ１２２０２）を用いて数量化された（quantitated）。リニアレンジ（ran ge）の濃度レスポンスの露光・照射（exposure）のみが用いられた。適切なときは、オートラジオグラフィック強度がサイクロフィリンに標準化された（normal ized）。Elder,J.T.et al.,J.Invest.Dermatol.94：19-25(1990)データの統計的分析が、シェフェスコレクション（Scheff correction）を用いて分散・平方偏差（variance）の一方向分析（one way analysis）により行われた。この分析は、複数比較（maltiple comparison）及び両側仮定（two-tailed hypothesis）についてのために行われた。結果人間のＣＲＡＢＰ−Ｉ及びＣＲＡＢＰ−IIのクローン化ウシ属及びマウスのＣＲＡＢＰ−Ｉからの（derived）縮退（degenerate）プライマ及びＰＣＲを用いて、４３６ベースペア（塩基対：base pair:bp）プロダクトが得られ、サブクローン化され、シーケンス化された。ＰＣＲプロダクトの予期された（predeicted）アミノ酸シーケンスは９９．３％マウス及びウシ属のＣＲＡＢＰ−Ｉシーケンスと同じであった。Nilsson,M.H.L.et al.,Eur.J.Bioch em.173:45-51(1988);and Stoner,C.M.et al.,Cancer Rea.49:1497-1504(1989)。ＰＣＲプロダクトは人間の皮膚のライブラリ及び人間の皮膚のファイブロブラストライブラリをスクリーンするのに用いられた。５つのクローンが皮膚ファイブロブラストライブラリから分離（isolated）された（λf1.1, λf3.1, λf5.1, λf5.4及びλf5.6）。２つのクローン（λf1.1，λf3.1）はシーケンス化され、同一であることがわかった。これらクローンの予期されたアミノ酸シーケンスは７７．４％人間のＣＲＡＢＰ−Ｉに類似しており（similar to）、また、９３．５％最近クローン化されたマウスのＣＲＡＢＰ−Ｉに類似していることがわかった（Giguere,V.et al.,PNAS(USA)87:6233-6237(1990)参照）。マウスのＣＲＡＢＰ−IIに非常に似ているため（ので）、クローンλｆ１．１は人間のＣＲＡＢＰ −IIとして示された（designated）。第３のクローンλｆ５．１は部分的にシーケンスされたところ短いクローンであることがわかった（シーケンスは人間のＣＲＡＢＰ−IIと同一）。ＣＲＡＢＰ−Ｉがない（を有さない）クローンは、皮膚のファイブロブラストライブラリから分離された。２つのクローンは皮膚ライブラリから分離されたところ、短いインサート（shorter inserts）を含んでいることがわかった（１つのクローンのシーケンスは人間のＣＲＡＢＰ−II（λｓ２．１）と同じ。もう１つのクローンのシーケンスは人間のＣＲＡＢＰ−II（λｓ３．１）と同じ）。シーケンスリストのシーケンスＩＤナンバ１と２は、人間のＣＲＡＢＰ−IIのｃＤＮＡヌクレオチドと、予期されたアミノ酸シーケンスとを代表している（示している。移動開始点（translation initiation site）は、ヌクレオチド９９ −１０１に対応する第１のメチオニンコードン（codon）に割当てられた。１３８アミノ酸のオープンリーディングフレーム（open-reading frame）が見つかった。このことにより、Ｍｒ１５，６９３のポリペプチドが予想される。３´非移動域（untranslated region）がポリアデニレーション信号（polyadenylation s ignal）（ＡＴＴＡＡＡ）と、１（λｆ１．１）〜２５（λｆ５．１）のポリ（Ａ）トラクト（tract）とを含んでいることがわかった。シーケンスＩＤナンバ３と４はＣＲＡＢＰ−ＩのｃＤＮＡヌクレオチドと、予期されたアミノ酸シーケンスとを示している。ＣＲＡＢＰのアミノ酸シーケンスの比較ＣＲＡＢＰ−ＩとＣＲＡＢＰ−IIのアミノ酸シーケンスの比較が図２に示されている。パネルＡは、人間（ｈ:human）とマウス（ｍ:mouse）のＣＲＡＢＰについてのアミノ酸シーケンスの比較を示している。マウス及び人間のＣＲＡＢＰ− Ｉと、マウスのＣＲＡＢＰ−IIの予期されたアミノ酸シーケンスは、人間のＣＲＡＢＰ−IIと整列している（aligned）。ダッシュ（−）は人間のＣＲＡＢＰ−I Iと同じであることを示している。１つのギャップ（gap）がアスタリスク（＊）で示されているが、このギャップは人間及びマウスのＣＲＡＢＰ−Ｉシーケンスに導入された（最大（の）アライメントのために）。図２のパネルＢは、人間（ｈ）、マウス（ｍ）、ラット（ｒ）、ＣＲＡＢＰ−Ｉ及びＣＲＡＢＰ−IIのＮＨ２ターミナルエンドのシーケンス比較である。人間のＣＲＡＢＰ−IIに似ていない残基は四角で囲まれている。図２に示されたアミノ酸シーケンスの比較（即ち、パネルＡ）は、マウスのＣＲＡＢＰ−ＩとＣＲＡＢＰ−IIとの間（Stoner,C.M.et al.,Cancer Res.49:1497 -1504(1989);Giguere,V.et al.,PNAS(USA)87:6233-6237(1990)並びに人間のＣＲＡＢＰ−Ｉと人間のＣＲＡＢＰ−IIとの間に７３．７％の全体的な一致があることを示している。人間のＣＲＡＢＰ−ＩとマウスのＣＲＡＢＰ−Ｉとは、全体として９９．３％の一致がある（１つのアミノ酸の置換（subsritution）がある）（アミノ酸残基８６．Ｐｒｏの代わりにＡｌａ）。一方で、人間のＣＲＡＢＰ− IIとマウスのＣＲＡＢＰ−IIは、９３．５％同一である（一致する）。人間及びマウスのＣＲＡＢＰ−IIには、９個のアミノ酸の相違がある。即ち、人間の方のシーケンスの下記アミノ酸についてである。残基19-Leu,22-Val,27-Val,29-Leu, 48-Gly,68-Val,91-Glu,99-Lys及び111-THr。人間のＣＲＡＢＰ−IIとマウスのＣＲＡＢＰ−IIとの間に見られる９個のアミノ酸の相違のうちの６個において（即ち、残余・残基１９，２９，４８，６８，９１及び１１１において）、人間のシーケンスはＣＲＡＢＰ−Ｉと同一であった。鶏（チキン）の胎児（Kitamoto,T.et al.,Biochem.Biophys.Res.Comm.157:130 2-1308(1988)と新生児のラット（Bailey,J.S.et al.,J.Biol.Chem.263:9326-932 2(1988)）からの２つのＣＲＡＢＰのＮＨ₂ターミナルアミノ酸シーケンスが報告されており、これらは人間のＣＲＡＢＰ−ＩとＣＲＡＢＰ−IIと比較された。図２のパネルＢに示されるように、ラットとチキンと、マウスと、人間のＣＲＡＢＰ−ＩのＮＨ２ターミナル域の間にはアミノ酸の相違は何もなかった。一方、ＣＲＡＢＰ−II同士の間ではいくつかの違いがあった。特定の例２人間のＣＲＡＢＰの発現生体条件での人間の皮膚における人間のＣＲＡＢＰの発現複数のボランティアの人が、閉塞・吸蔵（occlusion）下で種々のタイムインターバルで、制御処理もしくは０．１％ＲＡクリームによる処理を受けた。主に表皮から成るケラトマ（keratome）バイオプシが得られ（Voorthees,J.J.et al. ,Arch.Dermatol.105：695-701(1972)、全（トータルＲＮＡを用意した（ブロットハイブリッド化によって連続的に（順次）分析される）。３人の人間から得られたＲＮＡブロット（blot）のオートラジオグラムが図３に示されている。全ＲＮＡ（４０μｇ／レーン）が人間のＣＲＡＢＰ−IIもしくはサイクロフィリンｃＤＮＡプローブに対して（against）ハイブリッド化された（上述のように）。各ボランティアは次のように、バイオプシの前に典型的には１６時間処理された。即ち、（ａ）は何も処理されない。（ｂ）はＲＡ媒質（vehicle）で処理した。（ｃ）はプラスチックラップを用いて、閉塞条件下でＲＡ媒質中の０．１％ＲＡクリームで処理した。リボゾーム（ribosomal）ＲＮＡの移動性・移り易さ（m obility）はブロットの左側に示されている。図３に示されるように、ＣＲＡＢＰ−II転写（transcripts）は未処理の皮膚及び媒質（vehicle）で処理された皮膚には検知されなかった。ＣＲＡＢＰ−II 転写は、未処理の皮膚について・対して処理されたＲＡにおいて顕著に（marked ly）（１６．１フォールド）且つ大きく（ｐ＜0.004，ｎ＝４）誘発された。同じような（しかし、それ程顕著ではないが）誘発が４日間のＲＡ処理の後に観察された（８．３±２．９フォールド，Ｎ＝６）。誘発は４時間後には起きなかったが、１２時間の処理の後にははっきりと現われた。人間の皮膚のＲＮＡから（の）ＣＲＡＢＰ−Ｉを増幅する我々の能力と一致するように、弱い・かすかな（ faint）（ＣＲＡＢＰ−Ｉプローブハイブリッドがいくつかのブロットで観察されたが、人間の皮膚のＲＮＡサンプルの全てのブロットでは観察されなかった（延長してオートラジオグラフ露光をした後）（データは図面に示されていない）。しかし、ＣＲＡＢＰ−Ｉ転写は通常は、１０μｇの人間のゲノミックＤＮＡから１つのコピーＤＮＡシーケンスを検知するのに十分な感度を有する露光条件の下では、検知不可能であった。ＣＲＡＢＰ−Ｉ及びＣＲＡＢＰ−IIｃＤＮＡプローブは、ＢａｍＨＩ，ＥｃｏＲＩ，ＨｉｎｄIII及びＰｓｔｌで温浸・熟成した（digested）ゲノミックＤＮＡを用いてはっきりとした（distinct）バンドパターン（ｂand pa tterns）を検知した。このことは、我々のハイブリッド化条件下でのこれらプローブの特殊性を立証している（データは図面に示されていない）。人間のファイブロブラスト中でのＣＲＡＢＰの発現ＲＡを用いて人間の表皮ファイブロブラストを処理すると、顕著な（約１５フォールド）且つ大きな（Ｐ＜0.04）の人間のＣＲＡＢＰ−IIｍＲＮＡの誘発が起こった。これは、５つの独立した表皮ファイブロブラストストレイン（strains ）を３×１０^-7もしくは３×１０^-6ＭＲＡで２４もしくは４８時間処理した後のことである（図４に示すように）。図示された結果は９個の独立した実験から得られたものである（これには、上述のように３人の人間から容易された５つの表皮ファイブロブラストラインと、３つの全数の（deploid）人間の肺のファイブロブラストラインとを用いている（に関連している）（ＬＬ４７，ＣＣＤ−１８Ｌｕ及びＣＣＤ−１６Ｌｕ）。ＲＮＡブロットハイブリッド化（２０μｇ全ＲＮＡ／レーン）はレーザ濃度計により量的に表わされ（quantitated）、制御遺伝子（サイクロフィリン）に標準化された（Elder,J.T.et al.,J.Invest.Dermatol .94:19-25(1990)に記載されているように）。合流点では（時には、媒体（mediu m）が換えられ、セル（cells）がジメチルスルフォキシド（dimethyl sulfoxide ）に溶かされたＲＡによって処理された。そのときの濃度及び時間は図の下に示されている。データはフォールド誘発±ＳＥＭで表されている（ジメチルスルフォキシドのみで４時間処理された２つの皿（duplicate dishes）の平均に対して（^* ｐ＜0.05,^**Ｐ＜0.005）。表皮と肺のファイブロブラストを比較する２つの代表的な実験からの関連オートラジオグラフィックバンドが挿入画内に示されている。図４に示されるように、ＣＲＡＢＰ−IIｍＲＮＡは人間の肺のファイブロブラストの３つのストレイン中のＲＡによっては大きく誘発されなかった。このことは、このレスポンスがティシュに特徴のあるもの（tissue specific）ということを示唆している。ＲＡによる人間のＣＲＡＢＰ−II転写の誘発は、３×１０^-1 ０〜３×１０^-7ＭＲＡの範囲では投写量・摂取量（dose）に依存していた（データは図示されていない）。これとは反対に、ＣＲＡＢＰ−Ｉ転写は表皮及び肺のファイブロブラストでは検知できなかった。また、この転写はＲＡによって誘発されなかった。一方、パラレルで（に）ハイブリッド化されたゲノミックＤＮＡブロットはポジティブだった。図５に示されるようにセルが合流に至ったとき、ＣＲＡＢＰ−IIｍＲＮＡは顕著に（markedly）且つ大きく（significantly）、培養された大人の人間のケラチン性細胞中で（に）誘発された。また、後合流（postconfluent）状態のときは、上昇したままでいた。図５Ａは７個の独立のケラチン性細胞のストレインについて得られた結果をまとめたものである。第３の通路（passage）の正常な（n ormal）大人の人間のケラチン性細胞は０．１５ｍＭＣａＣｌ₂を含むＫＧＭ中で生長した。媒体（medium）は一日おきに変えられた。示された日数のときに（合流前もしくは合流後）、全ＲＮＡが用意され、ブロットハイブリッド化及び濃度計によって人間のＣＲＡＢＰ−IIｍＲＮＡについての分析が行われた。データは、全ての与えられたストレインのケラチン性細胞について、パーセント最大表示で示されている（人間のＣＲＡＢＰ−IIｍＲＮＡの絶対レベルはストレインによって変わるので）。エラーバー（error bars）は±ＳＥＭ^**Ｐ＜0.005、^***Ｐ＜0.0005を示している（２日間の前合流におけるセルに対して）。ＣＲＡＢＰ−IIｍＲＮＡはまた、媒体（medium）中のカルシウム濃度を0.15ｍＭから２ｍＭに上げることによって、準合流培養（subconfluent cultures）において顕著に誘発された。図５Ｂに、代表的なストレインのケラチン性細胞について示されている。２０−３０％合流では、媒体（medium)がＫＧＭもしくは２ｍＭＣａＣｌ₂を含むＫＧＭに換えられた（３×１０^-9ＭＲＡが存在する場合が前者で存在しない場合が後者）。そして、示された日数保持された。媒体の変換は一日おきである。２８Ｓ及び１８ＳソボゾームＲＮＡの移動性（mobility）は左に示されている。図５Ｃは、ＣＲＡＢＰ−IIｍＲＮＡレベルに対する、高濃度で延長して処理した場合の効果を示している。図５Ｂに関して説明したのと同じ実験が上で行われた。但し、セルは３×１０^-6ＭＲＡを用いてもしくは用いずに２〜５日間処理された（オートラジオグラムの上に示されている）。２８及び１８ＳリボゾームＲＮＡの移動性は左に示されている。図５Ａと図５Ｂは、４つの独立した実験を代表する結果を示している。図５Ｂに示されるように、低い濃度のＲＡ（３×１０^-9Ｍ）で時間延長してケラチン性細胞を処理した場合は、ＣＲＡＢＰ−IIｍＲＮＡレベルに対しては検知できる効果・影響は出なかった。しかし、図５Ｃに示されるように、高い濃度のＲＡ（３×１０^-6Ｍ）で準合流ケラチン性細胞を時間延長して処理すると、ＣＲＡＢＰ−IIｍＲＮＡが検知不可能なレベルに減少した。ＣＲＡＢＰ−Ｉに対して同じブロットをハイブリッド化すると（ＣＲＡＢＰ−IIに対してハイブリッド化する前に）、ＣＲＡＢＰ−Ｉ転写が検知できなかった。一方、パラレルでハイブリッド化されたゲノミックＤＮＡブロットはポジティブだった（データは図示せず）。特定の例３、代替（alternate）クローン化スキーム（scheme）ＣＲＡＢＰ−IIｃＤＮＡプローブは、図１に示されるＣＲＡＢＰ−II変質・縮退（degenerate）プライマを用いて（マウスＣＲＡＢＰ−IIｍＲＮＡシーケンスからのもの(derived)）、レチノイックアシッド（ＲＡ）処理された人間の皮膚からＰＣＲによってクローン化された。（Giguere,V.et al.,PNAS(USA)87：6233 -6237(1990)を参照）。ＢａｍＨＩ制限（restriction）箇所（sites）は、次の（連続する）クローン化を補助すべく、フォワード及びリバースプライマに含まれている。ＲＡ処理された人間の皮膚は、リバース転写及びＰＣＲ増幅のためにＲＮＡのソース（source）として用いられた。全ＲＮＡは（Elder,J.T.et al.,J.Invest. Dermatol.94:19-25(1990)に記載されている表皮（epidermal）ケラトマから抽出され、また、Manlatis,T.et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY(1982)に記載されているようにリバース転写された。各ＰＣＲサイクルの間、サンプルは１分間（で）９４℃ に加熱され、３０秒間保持され、第１アニーリング（annealing）として５０℃ に冷却され、その後、１分間で７２℃に加熱、その温度でさらに３０秒間保持され、テンプレートが伸張するように（template extension）した。ＰＣＲプロダクトはさらに、純化され（Geneclear,BI0101 Inc）、ＢａｍＨＩで熟成され（di gested）、ＰＧＥＭ３Ｚプラスミドで熟成されたＢａｍＨＩにクローン化された（Promega inc.,Madison,W1）。ＰＣＲフラグメントは、最初は、Ｐｓｔｌ制限（vestriction）エンチーム（enzyme）を用いた熟成（digestion）によってＣＲＡＢＰ−IIとして認識された。このエンチームは、マウスのＣＲＡＢＰ−IIｍＲＮＡで記載されたのと同じ位置でＤＮＡを裂く。クローンはシーケンス化され、マウスのＣＲＡＢＰ−IIと同じ大人の人間の大部分・主要部分（major portion ）を示すことがわかった。ｃＤＮＡプローブは、典型的にはＲＡで４及び１２時間処理されたボランティアの人の皮膚から用意された人間のＲＮＡにハイブリッド化された。ＣＲＡＢＰ−IIｍＲＮＡの誘発は、１２時間ＲＡ処理された皮膚において観察されたが、４時間しか処理されなかった皮膚では観察されなかった（データは図示せず）。特定の例４ＣＲＡＢＰ哺乳動物発現ベクタ及び構生物（constructs）ＣＲＡＢＰ−Ｉはブルースクリプトファージミド（stratagene）クローン化ベクタ（cloning vector）から削取られ・摘出され（excised）、フォワード方向（ｐＳＶＬＣＲＡＢＰ−Ｉ）で（の）真核細胞発現ベクタｐＳＶＬ（Pharmacia ）のＸｂａｌ及びＢａｍＨＩ箇所の間に挿入された。ＣＲＡＢＰ−IIはブルースクリプトファージミド（Stratagene）クローン化ベクタから抽出され、フォワード方向（ｐＳＧ５ＣＲＡＢＰ−II）もしくはリバース方向（ｐＳＧ５ＣＲＡＢＰ −IIＡＳ）で（の）真核細胞発現ベクタｐＳＧ５（Stratagene）のＥｃｏＲＩ箇所に挿入される。インサート（insert）の方向は制限分析によって制定・決定された。ＣＶ−１セルは、１０％胎児子牛血清を含むダルベッコの（Dulbecco´s）改良（modified）イーグルス媒体（Eagles medium）（ＤＭＥＭ）中で生長する。ＣＶ−１は、ＣＶ−１セルラインから派生する（derived from）サルの腎臓セルである（これはＴセル抗原を発現しない）。トランスフェクション（transfecti on）の前の日、セルは、ＤＭＥＭ（１０％チャコール（charcoal）処理胎児子牛血清を含む）（ｃｈＦＣＳ）中のティシュ培養皿上に種付けされる（seeded）。セルは、Rosenthal,N.,Meth.Enzymol.152:704-720(1987)に記載されたのとほぼ同じリン酸カルシウム共沈技術によってCRABP-IpSVLCRABP-I）もしくはCRABp-II （pSGSCRABP -II）発現ベクタを用いてコントランスフェクトされる（contransufected）。トランスフェクションの２４時間後、セルはトリプシナイズされ（trypsinized）、媒体（medium）中で懸濁され（suspended）、ペレット化され（pelleted）、４０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃ１（ｐＨ７．６で、１５０ｍＭＮａＣｌと１ｍＭＥＤＴＡを含む）で一度洗浄される。シトゾリックフラクション（cytosolic fraction）は、１時間100,000×ｇの遠心分離により、セル溶解物（cell lysates）上に用意される。特定の例５人間のＣＲＡＢＰのバクテリア生成（bacterial production）ＣＲＡＢＰ−Ｉについては、ＣＲＡＢＰ−Ｉのヌクレオチドシーケンスは位置９（ＴからＧ）と位置１３（ＧからＴ）で変えられ、スツール箇所（stul site ）を形成する。この場合、合成オリゴヌクレオチド及びポリメラーゼ連鎖反応を使う。ＣＲＡＢＰ−IIについては、ＣＲＡＢＰ−IIのヌクレオチドシーケンスは位置１００（ＴからＧ）及び位置１０４（ＣからＴ）で変えられ、スツール箇所を形成する。この場合、合成オリゴヌクレオチド及びポリメラーゼ連鎖反応を使う。次に変化された（mutated）ＣＲＡＢＰｃＤＮＡがスツールで（with stul）カットされ、バクテリア発現ベクタｐＭＡＬ−ｃ（New England Biolabs）のスツール及びＥｃｏＲＩ箇所にくくられる（ligated）。バクテリアは形を変えられ（trasformed）、マルトースバインディング（maltose-binding）プロテイン（（ＭＢＰ）−ＣＲＡＢＰ融合（fusion）プロテインが大量に発現される。ＭＢＰ−ＣＲＡＢＰ融合プロテインは親和性クロマトグラフィ（affinity chromatog raphy）によって、任意のアミロースコラム（amylose column）上に純化される（New England Biolabs）。第１メチオニン（first methionine）をロックする（locking）ＣＲＡＢＰは、ファクタＸａ（New England Biolabs）を用いた熟成（digestion）によってＭＢＰから解放され、第２通路（passage）によってＭＢＰからアミロースコラム（overamylose column）へ純化される。分光螢光計（spectrofluorimetric）方法は、色々なリガンド（ligands）について、純化された人間のＣＲＡＢＰ−Ｉ及びＣＲＡＢＰ−IIの親和性及びバインディング化学量論（stoichiometries）を研究するのに用いられる。ＣＲＢＰ− ＩもしくはＣＲＡＢＰ−IIに結合（bind）するリガンドの容量・能力（capacity ）は、このプロテインの元来の(native)螢光発光(fluorescence)を消滅させるそれらの能力(ability) を監視することによって査定される。特定の例６抗体の生成ＣＲＡＢＰ−Ｉ及びＣＲＡＢＰ−IIプロテインのアミノ酸９４−１０４に対応するペプチドはPosnett,D.N.et al.,Meth.Enzymol.178:739-746(1989)にほぼ記載されている複数光源ペプチド方法(multiple antigenic peptite method)を用いて合成された。これにより、キャリアプロテインへの接合・結合(conjugation )が不要になった。２つのＣＲＡＢＰのこの区域は低い同一性を有し、疎水性及び表面確率計算(surface probability calculations)に基づいてプロテインの外に位置されることが最も多いであろう。ペプチドは、エッグ(egg)ＩｇＹを作るためにチキン内にインジェクションされた。その結果生まれる抗体は、もし特異なものでなければ、ペプチドに吸着される（ＣＲＡＢＰ−IIペプチドに対するＣＲＡＢＰ−Ｉ抗体及びその反対）。ペプチドは、セファローズゲル(sepharose gel)に固定され、特異性(specificity) を強化する。一旦、単一特異な抗体が得られると、人間の皮膚細胞(cell)並びに皮膚内のＣＲＡＢＰ−Ｉ及びＣＲＡＢＰ−IIプロテインの発現及び調節（レギュレーション）が、ウエスタンブロット分析(western blot analysis)によって定量的に試験されまた、免疫細胞化学（法）によって準定量的に試験される。通常及び乾癬(psoriatic)皮膚のＲＡによるＣＲＡＢＰ−II（及びＣＲＡＢＰ−Ｉ）の発現及び調節のパターンが、ＣＲＡＢＰの機能・作用に関する洞察を与えている。ＣＲＡＢＰ−Ｉ及びＣＲＡＢＰ−IIに対する抗体、もしくはそのバインディングフラグメント（例：Ｆ´（ａｂ））、及び上述のようにして得られる純化された(purified)プロテインは、当業者には公知の免疫学的技術を用いることにより、通常及び異状（病理）状態のＣＲＡＢＰ−Ｉ及びＣＲＡＢＰ−IIのレベルを監視するのに使用することができる。例えば、患者の皮膚細胞(tissue)は、人間のＣＲＡＢＰ−ＩもしくはＣＲＡＢＰ−IIに特有の（特異な）抗体を用いて検査・測定(assay) することができる。よって、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット分析もしくは免疫化学法によって、ＣＲＡＢＰの存在及びレベルを決定・判定することができる（このことはBusch,C.et al.,Meth.Enzymol.189:315-324(1990) にほぼ記載されている）。特定の例７リポータ検査システムＣＶ−１セルは、１０％胎児子牛血清を含むダルベッコの改良イーグル媒体(D ulbecco´s madified eagles medium:DMEM)中で生長される。トランスフエクシヨンの前日、セルは、１０％チャコール処理胎児子牛血清(charcoal treated fe tala calf serum:CHFCS)を含むＤＭＥＭ内で (の) ティシュ培養された皿の上に種付けされる。セルは、リン酸カルシウム共沈技術を用いてコントランスフェクトされる(contransfected)。この場合０．６ｍｇの人間のレチノイックアシッドリポータ（ｈＲＡＲ）発現ベクタ（ｈＲＡＲαＯ，ｈＲＡＲβＯもしくはｈＲＡＲλＯ）、リポータプラスミド及びβガラクトシダーゼ発現ベクタ（ｐｃＨ１１０，Pharmacia）（トランスフェクションの変化・バリエーションに対して標準化するための内部コントロールとして用いる）（Astrom,A.et al.,Biochem.Biop hys.Res.Comm.173:339-345(1990）にほぼ記載されているを用いる。セルはまた、コントロールとしてpSVL（Pharmacia）のＣＲＡＢＰ−Ｉ（pSVLCRABP-1）もしくはCRABP-II（pSG5CRABP-II）発現ベクタを用いて同時トランスフェクトされる（cotransfected）。リポータプラスミド（ＴＥＲ）₃ -tk-ＣＡＴは、合成オリゴヌクレオチドを結ぶ・くくる(ligate)することによって構成される。この合成オリゴヌクレチドは、３つのパリンドロミックな（palindromic）甲状腺ホルモン応答元素（responsive elements）（ＴＲＥ）（TCAFFTCATGACCTGA）₃）をエンコードするものであり、上記応答元素は５´及び３´端部のＨｉｎｄIII及びＢａｍＨＩ位置(sites)でそれぞれ側面に位置している。リポータプラスミドは、プラスミドｐＢＬＣＡＴ２のＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩクローン化箇所にクローン化される。トランスフェクションの２４時間後、セルは一度ＤＭＥＭで洗浄され、異なる濃度のリガンド（ligands）を含む媒体（medium）（DMEM,10%ChFCS）がセルに加えられる。２４時間後、セルはトリプシナイズされ(trypsinized) 、媒体中で懸濁され(suspended) 、ペレット化され(pelleted)、４ＯｍＨＴｒｉｓ −Ｃ１（ｐＨ７．６で、１５０ｍＭＮａｃｌと１ｍＭＥＤＴＡを含む）で一度洗浄される。セル溶解物は３つの連続する結氷融解サイクルによって用意され、βがラクトシダーゼ及びＣＡＴアクティビティがキシレン(xylene)抽出方法によって判定される。よって、異なるリガンドについての、ＲＡＲ転写活性化(activation)に対するＣＲＡＢＰ− ＩもしくはＣＲＡＢＰ−IIの共・同時発現(coexpression)の効果は、以下に説明されるように判定することができる。代わりのリポータ検査（この検査では再結合(recombinant)アデノウイルスシステムが培養中のセルを同時感染(coinfect)するのに用いられる）は、レチノイドによって転写活性化を測定するのに採用することもできる（ほぼShin,E.et al ., Mol.Endocrinol.5:300-309(1991）に記載されている通り）。このようなシステムでは、２つの互いに存在する（し合う）ウイルス（１つはレセプタ転写ユニットを含んでおり、第２の方は遺伝子応答要素を含んでいる）が、ＣＶ−１のようなレセプタに欠陥のあるセルに同時感染される。例えば、２つの互いに依存しているアデノウイルス（１つは人間のグルコルチコイドレセプタ転写ユニットを有し、他方はホタルルシフェラーゼ（発光酸素）遺伝子にリンクしているグルココルチコイド応答元素を含んでいる。あるいは１つはラットの甲状腺ホルモンレセプタαを含み、他方は発光酸素遺伝子を含む）を、検査の実施において使用することができる。そして、ホルモン誘発転写は、補完的な(complementary) ウイルス対によって同時感染されたセルからの感染の後、定量化される。特定の例８リガンドバイディング検査ＣＲＡＢＰ−ＩとＣＲＡＢＰ−IIの間のアミノ酸の同一性は７７％しかないので、これら２つのプロテインのリガンドバインディング特性を判定することは重要である。レチノイドのＣＲＡＢＰに対する親和性と生物学的活動(biologicala ctivity) の間には相関関係がないといういくつかの報告書がある(Darmon,M.eta l.,Skin Pharmacol.1:161-175(1988) 。これらの研究のほとんどは、ＣＲＡＢＰのソース(source)として、ほとんどラットのＣＲＡＢＰ−Ｉから成るラットの精巣・こう丸（testis）からの抽出物を用いている。これに対し、我々は、ＣＲＡＢＰ−ＩとＣＲＡＢＰ−IIｃＤＮＡは噛乳動物の細胞(cell)に発現することができるということを示そうとししている。クローン化された人間のＣＲＡＢＰ−Ｉ及びIIが入手可能であると、ティシュに特徴のある（が特異の）リガンドの識別のための従来のシステムを改良することができる。このことはまた、細胞核レセプタに加え、可能なＣＲＡＢＰと相互作用するリガンドの識別も可能にする。テスト用のリガンドは、ディデヒドロＲＡ（didehydoro−ＲＡ) 、ＲＡ及びその代謝産物（metabolites）を含む（但し、これらに限られない）（代謝産物には、４ヒドロキシＲＡ（４−hydoroxy−ＲＡ）、４オクソＲＡ（４−oxo−ＲＡ）及び５．６エポキシＲＡがある）と共に、ＣＲＡＢＰとは結合しないと従来報告されているコンパウンド（例：ＣＤ−３９４）も含む。（Darmon,M.et al.,Skin Pharmacol.1:161-175(1988）ＣＲＡＢＰアミノ酸シーケンスもしくはプロテインが入手可能であると、フォトエージング(photoaging)皮膚、乾癖、アクネ、皮膚ガン、白血病、角質化の病気、大理石骨病(osteoperosis)、リューマチ硬化症(rheumatoid sclerosis)及びその他の状態の改善(repair)用に、より細胞 (tissue) に特徴のある薬を選択する手段が提供されることになる。上述のように得られたＣＲＡＢＰ−Ｉ（ｐＳＶＬＣＲＡＢＰ−Ｉ）もしくはＣＲＡＢＰ−II（ｐＳＧ５ＣＲＡＢＰ−II）発現ベクタを用いてトランスフェクトされたＣＶ−１セルからの可溶の(soluble)プロテインは、４℃で一昼夜［³ Ｈ］レチノイックアシッドで培養・保温された(incubated)。フリー(free)リガンドはは、サイズ分別・細分(size fractionation)によって、ＦＰＬＣシステム(P harmacia)に接続されたＧＦ２５Ｏコラム(DuPont Pharmaceuticals)にバウンド( bound) リガンドから分離される。特異バイディング(specific binding)の量は、サンプルを冷たい(cold)レチノイックアシッドが多い状態で培養・保温することによって判明する。レチノイックアシッドについてのＣＲＡＢＰ−Ｉの親和性は、増大する量の［³ Ｈ］レチノイックアシッドで滴定めすることによって判明する。その他のリガンドについての相対的な親和性は、同じシステム内での競争検査 (competition assay)において判明する。固定量のＣＲＡＢＰ−Ｉもしくは［³ Ｈ］レチノイックアシッドは、ＣＶ−１セルからの可溶（溶性）プロテインと共に培養・保温される。するとＣＲＡＢＰ−IIが発現し、同時に、その他の可能性のあるリガンドの量が増加する。特定の例９ハイブリッド化検査クローン化された人間のＣＲＡＢＰ−Ｉ及びＣＲＡＢＰ−IIｃＤＮＡが入手可能であるのえ、通常及び異常（病理）状態で（の）これら２つの遺伝子の相対的発現を判定することができる。例えば、ＲＮＡが細胞(tissue)バイオプシから分離され、グアニジウムイソチオシアネートリーシス及び超遠心分離によってセルを培養した（Elder,et al.,J.Invest.Dermatol.94:19-25(1990).においてすでに説明されている）。同量の全ＲＮＡを１％フォルムアルデヒド・アガロースゲルの上に分離し、ナイロン膜(membranes)に写すことができる。８０℃で２時間ベーキング(baking )をした後、フィルタをハイブリッド化して、アガロース純化( agarose-purified)ＣＲＡＢＰ−ＩもしくはＣＲＡＢＰ−IIｃＤＮＡ（ランダムプライミング(priming)によって標識付けされている）にすることができる。ティシュ内のＣＲＡＢＰｍＲＮＡの量は、レーザ濃度計によりオートラジオグラムを数量化した後に判定することができる(Elder,et al.,J.Invest.Dermatol.94:1 9-25)。に記載されているように）。ＣＲＡＢＰ−Ｉ及びIIのオリゴヌクレオチド（典型的には８−１５残基長）は、もし補完シーケンス(complementary seque nces) を結合するのに十分な長さを有していれば、ハイブリッド化検査においてプローブとして用いることができる。特定の例１０人間のＣＲＡＢＰの機能の試験レセプタ検査ＣＲＡＢＰに関する最も重要で難しい解決すべき問題は、それらの機能である。ＣＲＡＢＰはＲＡを細胞核に運ぶのではないかといわれていた（Takase S.et al.,Arch.Biochem.Biophys.247:328-334(1986)）あるいは、ＣＲＡＢＰは細胞室に居残り、ＲＡが細胞核へ移動するのを防止しているともいわれている。(Maden , M.et al.,Nature 335:733-735(1988))）。この問題に取組む１つの方法は、上述のように、レチノイックアシッド応答元素を含むリポータ遺伝子とＲＡＲと共に、ＣＶ−１細胞(cell)中のＣＲＡＢＰ−ＩとＣＲＡＢＰ−IIの量を増加させること（増加することを示すこと）である。もしＣＲＡＢＰがＲＡを細胞核に移送するのなら、低濃度のＲＡでリポータ遺伝子の活動が活発・強化されるであろう。一方、もしＣＲＡＢＰがＲＡを封鎖する(sequester) のなら、反応が減少するはずである。過度の発現(overexpression) ＣＲＡＢＰ−ＩとＣＲＡＢＰ−IIはファイブロブラストとケラチン性細胞(k
er atinosytes)において（中で）過度に発現される。セルは上述のようにＣＲＡＢＰ発現ベクタ（ｐＳＶＬＲＡＢＰ−ＩもしくはｐＳＧ５ＣＲＡＢＰ−II）と共にトランスフェクトされる。この場合、ほぼ製造会社の指示するように、リプフェクチン(Lipofectin)（ＢＲＬ）を用いる。ファイブロブラストの場合、ＲＡによるＲＡＲ−β遺伝子の誘発に対するＣＲＡＢＰの過度の発現の効果が研究される。ＲＡＲ−βｍＲＮＡは皮膚のファイブロブラスト中のＲＡによって誘発されることは示されており、また、この遺伝子が直接、ＲＡＲによって調節されることも知られている。DeThe,H.et al.,Nature 343:177-180(1990) 。ＲＡＲ−β遺伝子は、ＲＡＲ誘発に関しては「内生（内因）性リポータ遺伝子(endogeous repor ter gene)」として作用する。ケラチン性細胞を増殖する場合の、変質・分子(di fferentiahtion)のマーカ(markers)に対するＣＲＡＢＰの過度の発現の効果は研究中である。移動阻止(translation blocking) リバース方向にＣＲＡＢＰ−IIｃＤＮＡを有する発現ベクタ構成物(construct )を用いてセルをトランスフェクトすることによってｃＲＡＢＰ−IIの移動はファイブロブラスト及びケラチン性細胞においてブロックされる。これは、アンチセンス(anti-sense)ｍＲＮＡを作る。このアンチセンスｍＲＮＡは内生ＣＲＡＢＰ−IIｍＲＮＡにハイブリッド化することができ、よって、移動をブロックする。ファイブロブラスト及びケラチン性細胞におけるアンチセンス発現の効果は、過度の発現の場合と同じような手法で研究されている。ＲＡ（新陳代謝）に対するＣＲＡＢＰの効果レチノール(retinol)を、ラットの肝臓微粒体(liver microsomes)の適切な代謝酵素に運ぶ際に、細胞(cellular)レチノールバインディングプロテイン（ＣＲＢＰ）が関与していることは知られている（Ong,D.E.et al.,J.Biol.Chem.263:5 789-5796(1988)）。ＣＲＡＢＰがＣＲＢと同じバインディングプロテインのファミリに属しているので、これらは自分のリガンドの代謝にかかわることもできる。ＲＡは、小胞体に存在するシトクロムＰ−４５０モノオキシゲナーゼ(monooxy genase) システムによって代謝される。Bossche,H.et al.,Skin Pharmacal.1:17 6-185(1988)．ＣＲＡＢＰは、シトクロムＰ−４５０とのＲＡの相互作用を増大させることにより、機能するかもしれない。別の可能性としては、ＲＡはＣＲＡＢＰ−IIに関しては天然の（自然の）リガンドではなく、代謝産物（代謝に必要な物質）の１つではないかとも考えられる。もし例えばＣＲＡＢＰ−IIがＲＡよりも高い親和度で４ヒドロキシＲＡ（４−hydroxy−ＲＡ）（リガンド・バインディング研究で判定したように）をバインドしたとすると、ＣＲＡＢＰ−IIは、プロダクト濃度を下げることによって、チトクロムＰ−４５０媒介(mediated)代謝を増大することができる。ＣＲＡＢＰ（Ｓ）がＲＡ代謝に関与しているか否かは、皮膚の微粒体を、増大する量のＲＡ及び増大する量の発現され純化されたＣＲＡＢＰ−ＩもしくはＣＲＡＢＰ−IIによって培養・保温すること(incubating) によってテストすることができる。ＲＡ代謝に対するＣＲＡＢＰの効果はＨＰＬＣによって検査される。特定の例１１人間のＣＲＡＢＰ−II遺伝子のクローン化及びシーケンス化並びに転写の研究人間のＣＲＡＢＰ−II遺伝子のクローン化ＣＲＡＢＰ−II遺伝子を分離するために、ラムダＦＩＸII(Stratagene inc.La Jolla,CA)の人間の胎盤のゲノミックＤＮＡライブラリから約５×１０⁵ 組換え型が、人間のＣＲＡＢＰ−IIｃＤＮＡをプローブとして用いて、スクリーニング（選択）された(screened)(Astrom,A.et al.,J.Biol.Chem.266:17662-17666(199 1)。１つのポジティブなクローンが分離され、純化され、制限マッピングされた (restriction mapped)。インサート(insert)の一部はブルースクリプトフアージミドＳＫ(Stratagene inc.LaJo1la,CA)にサブクローン化された(subcloned)。遺伝子のシーケンスは、改良(modified)Ｔ７ポリメラーゼ(Sequenase,U.S.Bioch emical Corp.)と合成オリゴヌクレオチドを用いて、ディデオキシ(dideoxy)チェーンターミネーションによりＭ１３ベクタヘサブクローン化した後、両ストランド(strands)について決定・判定された（Sanger,F.et al.,PNAS(USA)74:5463-54 67(1977)）。エクソン位置は、制限マッピング及びシーケンス化(sequencing)によって決定・判定された。セル培養人間の皮膚のファイブロブラスト培養は、尻の皮膚のパンチバイオプシ(punch biopsies)から用意され、１０％の子牛血清を含むダルベッコの改良イーグルズ媒体(Dulbecco's modified Eagle's medium)中で繁殖された（Harper,R.A.et al .,Science 204・526-527(1979)）。ｍＲＮＡのノーザンアナリシス(Northerm analysis) ＲＮＡは、上述のようにグアニジウムイソチオシアネートリーシスと超遠心分離によって、培養された人間の皮膚のファイブロブラストから分離された(Elder ,J.T.et al.,J.invest.Dermatol 94:19-25(1990)。ＲＮＡ濃度は２６０ｎｍの吸光度・吸収度(absorbance)で判定され、等量の全ＲＮＡが１％フォルアルデヒドーアガロースゲル（０．５μｇ／ｍｌのエチジウムブロマイド(ethidium bromid e)を含む中で電気泳動的に分離された。ＲＮＡは上述のようにナイロン膜(Zeta- Probe,BioRad,Richmond,CA)に写された(Elder,J.T.et al.,J.Invest.Dermatol 9 4:19-25(1990);Maniatis,T.et al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual(C old Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY)(1982)。フィルタは真空中で８０℃で２時間暖められ(basked )、その後、２〜４時間４２℃で５０％フォルムアミド（５×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝１５０ｍＭＮａＣｌ，１５Ｍｍクエン酸ナトリム）と、５０ｍＭリン酸ナトリウムと、ｐＨ７．０の１×デンハード溶液(Denhardt-s solution)と、２５０μｇ／ｍｌイースト(yeast)ｔＲＮＡと、１００μｇ／ｍｌの超音波処理されたニシン精子ＤＮＡと、１％ＳＤＳとを含む）中で予備ハイブリッド化(prehybridized)された。ハイブリッド化は１８〜２４時間４２℃で同じバッファ(buffer)中で行われた。フィルタは一度室温の０．２×ＳＳＣ（０．１％ＳＤＳ）中で洗浄され、その後、２度２０分間５６ ℃の０．２×ＳＳＣ（０．１％ＳＤＳ）中で洗浄され、最後に１度２０分間５６ ℃の０．１×ＳＳＣ（０．１％ＳＤＳ）中で洗浄された。オートラジオグラフ化（処理は−７０℃の増加スクリーン(intensifying screens)を用いて行われた。フィルタは０．１×ＳＳＣ（０．１％ＳＤＳ）中で２×１０分ボイリングすることによってストリップされた(stripped)。ハイブリッド化プローブは、人間のＣＲＡＢＰ−IIｃＤＮＡ（λｆ１．１）ラットサイクロフィリン(cyclophlin)及びＲＡＲ−γからの純化インサートフラグメントのランダムプライミング (random primingu) (Boeringer Mannheim)によつて用意された。Astrom,A..et al.,J.Bio l.Chem.266:17662-17666(1991);Danielson,P.E.et al.,DNA7:261-267;Elder,J.T .et al.,J.Invest.Dermatol 96:425-433(1991)。ｍＲＡレベルの数量化はフオスフオリメーガ(phosphorimager)(Molecular Dynamics)を用いて行われた。プライマ(primer extension)分析ＲＮＡはAstrom,A.et al.,J.Biol.Chem.266:17662-17666(1991) に記載されているように、未処理及びＲＡ処理された皮膚のファイブロブラストから分離された。遺伝子中の位置８０−１０４に３´相補性の合成オリゴヌクレオチド５´CT AGGCTGGAGCACTGGACACTGTC （synthetic oligonucleotide 5´CTAGGCTGGAGCACTG GACACTGTC 3´complementary to position 80-104 in the gene）が伸張プライマとして用いられた。１０μｇの全ＲＮＡが１０分間７０℃で３２Ｐ５´端部標識付プライマ(end-labelled primer) と共に加熱された。この混合部は３０分間に３０℃に冷却され、その後３０℃でさらに３０分間保持された。この混合物には、(終濃度)50mM Tris-HCL(pH8.3),75mM KCL及び3mM MgCl₂（ｍＭＤＤＴ及び２５０ｍＭのｄＡＴＰ，ｄｃＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）（４０μｌ全体積で）が加えられた。反応(reactions)は２００μスーパースクリプト(superscript)ＲＮａｓｅＨ´(GIBCO,Bethesda Research Laboratories)の添加より開示され９０分間４２℃で培養・保温された(incubated)。サンプルはフェノール／クロロフォルム抽出され、エタノール沈澱され、フォルムアミド染料(dye)中で再懸濁され( resuspended) 、３０分間７５℃に加熱した後、６％シーケンシングゲル(seque ncing gel)上に分離された。転写分析培養された人間の皮膚のファイブロブラストは、上述のように、１５０ｎｍティシュ培養皿(dish)上で合流（confluency）に生長された。Astrom,A.et al.,J. Biol.Chem.266:17662-17666(1991)．その後セルは，予備加熱 (pre-warmed)され且つ平行状態のダルベッコの改良イーグル媒体（１０％胎児子牛血清を含む）中で１μＭＲＡを用いて色々なタイムポイントについて（おいて）処理された。各タイムポイントの（で）細胞核は、上述のように、０．５％ＮＰ−４０を含むリーシスバッファ(lysis buffer)中での培養・保温の後、４つの皿から分離された。Greenberg,M.E.et al.,Nature311:433-438(1984)細胞核ランオン(run-on:継続 )実験は、上述のように、［α−³²Ｐ］ＵＴＰ（DuPont-New England Nuclear,BO OCi/mmol）を用いて行われた。Antras,J.et al.,J.Biol.Chem.266:1157-1161(19 91)．等量の放射能（０．５−１×１０⁷ｃｐｍ）が、５μｇの核プラスミドを含むニトロセルロースフィルタ(nitrocellulose filters)にハイブリッド化された。４２℃で７２時間ハイブリッド化した後、フィルタは２回３７℃の２×ＳＳＣで１５分間洗浄され、５μｇ／ｍｌＲＮａｓｅＡを含む２×ＳＳＣ中で３８℃ で３０分間処理された。その後フィルタ（フェルト）は２回１５分間２×ＳＳＣ（０．５％ＳＤＳ）で４２℃で洗浄され、１回３０分間０．５×ＳＳＣ（０．５％ＳＤＳ）（４２℃）で洗浄された。最終洗浄は０．１×ＳＳＣ（０．１％ＳＤＳ）で３０分間５５℃で行われた。核スロット(slot)に存在する放射能の量は、一晩の露光の(over-night exposure) フオスフオリメーガ(Molecular Dynamics) を用いて判定され、オートラジオグラムが４〜５日間７９℃で増感スクリーンを用いて露光された(exposed)。結果人間のＣＲＡＢＰ−II遺伝子のクローン化及び特徴付(characterization) 人間のＣＲＡＢＰ−IIｃＤＮＡをプローブとして用いて、１つのバクテリオフアージラムダクローン(bacteriophage lambda clone)が分離された（λ２．１）。制限マッピング及びケーシングによって、このクローンがＣＲＡＢＰ−II遺伝子全体を含んでいることがわかった。λ２．１の制限マップ(vestrichron map)が図７に示されている。遺伝子は４つのエクソンから構成されており、１つの大きなイントロンと２つの小さなイントロンによって隔離(interrupted)されている。遺伝子の全体の的な）サイズは約６ｋｂである。人間のＣＲＡＢＰ−II遺伝子のＤＮＡシーケンスＣＲＡＢＰ−II遺伝子を特徴付けるため、遺伝子全体にわたる（またがる）フラグメント（但し、最初のイントロンは除く）が、シーケンス分析のためにＭ１３ベクタにサブクローン化された。ヌクレオチドシーケンス及び推論（推理）されたアミノ酸シーケンスは図８に示されている。最初の３つのエクソンは小さい。そのサイズは１１７〜２０７ｂｐの範囲である。そして、図８に示されるように、４つのエクソンが４６６ｂｐのところで最も大きい。エクソンシーケンスは、公開された(published) ｃＤＮＡシーケンスと同じであることがわかった。As trom,A.et al.,J.Biol.Chem.266:17662-17666(1991) 。全てのスプライスジャンクション (splice junctions: 接合部分）は、期待していたＧＴスプライズドナー(ｄonor)とＡＴスプライスアクセプタ(acceptor)を含んでいた。人間のＣＲＡＢＰ−II遺伝子の５´端部の分析最初の（第１の）エクソン５´境界部（線）は、プライマ伸張分析(primer ex tension analysis)によって判定された。位置８０−１０４に相補的なオリゴヌクレオチドプライマを用いて、優勢な反応生成物(predominant reation product )が、未処理の培養された人間の皮膚のファイブロブラストからのｍＲＮＡが用いられた場合に、認識された（図９参照）。同じプライマを起源とするシーケンシング反応と、伸張プロダクトとを比較すると、主な（大部分の）転写開始箇所 (sites)は、ＡＴＧの上流のＡ残基１３７ｂｐに割当てられなければならないことがわかった。ファイブロブラストが１μＭＲＡで２４時間処理されると、Ａ残基での開始が増加した（することがある）。さらに、同じ強さ(intensity)の第２の開始プロダクト(initiation product)も−１のところで（時々）見ることができた。上流域のシーケンス分析によって、−３１のところでＴＡＴＡボックス(box) （ＴＡＴＡＡＡ）が見つかり、また、−６３１と−４０２のところで２つの潜在的な(potential)ＡＰ２バインディング箇所を含むと共に、−８９のところで１つの潜在的なＳＰＩ個所を含む幾つかの潜在的調節元素(regulatory elements) が見つかった（図８）。Mitchell,P.J.et al.,Cell50:847-861(1987);,Kadonaga ,J.T.et al.,Trends Biochem.Sci.11:20-23(1986) 。また、−５７９と−１１６のところで初期生長(early growth)反応遺伝子Ｋｒｏｘ−２４（Ｅｇｒ−１，ｚｉｆ２６８もしくはＮＧＦＩ−Ａ）について（の）バインディング個所にぴったりとマッチする２つのシーケンスが見つかった。Lemaire,P.et al.,Mol.Cell.Bi ol.10:3456-3467(1990) 。さらに、１ｂｐだけ隔てられたダイレクトリピート(d irect repeat)（ＡＧＴＴＣＡｇＧＧＴＴＣＡ）が、−４５４のところで遺伝子の上流域において見つけられる。これは、ＲＡＲ−β₂遺伝子で見つけられるレチノイックアシッド反応元素と同じである(Umesono,K.et al.,Cell 65;1255-126 6)。ＣＲＡＢＰ−II転写速度及びｍＲＮＡレベルに対するＲＡの効果培養された人間の皮膚のファイバブロブラストに見られるＣＲＡＢＰ−IIｍＲＮＡのＲＡ誘発が転写の増加によるものか否かを判定するために、種々の時間（機関）について、ＲＡで処理された培養された人間の皮膚のファイブロブラストから分離された細胞核を用いて細胞核ランオン検査が行われた。図１０に示されるように、ＲＡはＣＲＡＢＰ−II転写において急速な一時的な増加を引起こした（それは２時間目にピークを有し、６時間目に制御レベルにほぼ戻った。）。しかし、ＲＡＲ−γとサイクロフィリン転写においては何の変化もなかった。これら２つの遺伝子は、図１０に示されているように、皮膚のファイブロブラストのＲＡによっては影響されない(uneffected)ことが知られているElder,J.T.et al. ,J.Invest.Dermatol.96:425-433(1991) 。数量化及びサイクロフィリンへの標準化(normalization)によって、ＣＲＡＢＰ−II転写は、２時間のＲＡ処理の後に約６フォールド誘発されることがわかった（図１１参照）。転写におけるこの増加によって、２４時間の処理の後にＣＲＡＢＰ−IIｍＲＮＡの６フォールドが誘発されることを説明することができる（図１１参照）。ＣＲＡＢＰ−IIｍＲＮＡの誘発は、セルにＲＡを加えた後、２時間という短時間で検知することができる（６〜２４時間の処理で安定化する）。しかし、２４〜４８時間では小さな(smaller)増加が見られる。転写が起きた後に誘発された（ＲＡＢＰ−IIメッセージレベルを維持するためにはＲＡが媒体(medium)中に存在しなければならないのかを判定するために、人間の皮膚のファイブロブラストがＲＡで１２時間処理された。その後セルは２回洗浄され、ＲＡを加えることなく媒体と交換された。図１１に示されるように、媒体からＲＡを取除くと、ＣＲＡＢＰ−IIメッセージが減少する(decline)（ＲＡで処理されたセルと比較して（実験全体において）。ＣＲＡＢＰIIメッセージの誘導におけるシクロヘキシ（イ）ミド又はアクチノマイシンの影響転写又は翻訳の阻害体（阻害遺伝子）の付加が、ＲＡによって生成されるＣＲＡＢＰ−IIｍＲＮＡの増加を規制するかどうかを測定するための実験が行われた。シクロヘキシミド（１０μｇ／ｍｌ）又はアクチノマイシンＤ（２μｇ／ｍｌ）がＲＡ（１μＭ）に同時に付加されると共に、ＣＲＡＢＰ−IIレベルは２時間後に測定された。図１２に示すように、シクロヘキシミドは、基礎ＣＲＡＢＰ− IIの発現を低く規制する(down-regulated)と共にＲＡ誘導を妨げた。シクロヘキシミドはＲＡＲ−γの発現或いはＲＡＲ−βのＲＡ誘導に影響をもたず（図１２）、これはNirri,C.et al.,Ce1lGrowth Dift.1:535-542(1990) 及びDethe,W et al.,EMBO J.8:429-433 において過去に報告されている通りである。アクチノマイシンＤはＣＲＡＢＰ−IIメッセージの基礎レベルに影響をもたないが、ＲＡによって誘導を完全に妨げる。対象標準の如く(as controls)、ＲＡＲ−ｙがアクチノマイシンＤによって低く制御されることが発見され、ＲＡＲ−ｙがアクチノマイシンＤによって低く制御されることが発見され、ＲＡＲ−βのＲＡ誘導は、過去の報告即ちNirri,C.et al.,Cell Growth Dift.1:535-542(1990) 及びDethe, H.etal.,EMBO J.8:429-433(1989) に一致して完全に妨げられた。ＣＲＡＢＰ−II転写比におけるシクロヘキシ（イ）ミドの影響シクロヘキシミドがＣＲＡＢＰ−IIｍＲＮＡのＲＡ誘導を妨げることから、プロテイン合成体(poritein synthesis)が転写の誘導に必要であるかどうかを確認すべく継続実験が行なわれた。図１３に示すように、時刻０でのシクロヘキシミドの付加は、ＣＲＡＢＰ−II遺伝子転写のＲＡ誘導を完全に妨げる。以上の説明は本発明の実施例を単に示したに過ぎない。これらの説明および図面、請求の範囲から、当業者においては請求の範囲により規定される本発明の趣旨から外れない範囲で様々な変更、変形がなされるべきであろう。ここで引用された全ての出版物及び出願内容は、参照によって本出願に包含されるものとする。シーケンスリスト（１）一般情報：（ｉ）出願人：ヴアヒーズ，ジョン，ジェーアストロム，アンダースペターソツ，ウルリカタヴァコル，アミール（ii）発明の名称：ヒューマンＣＲＡＢＰ−Ｉ及びＣＲＡＢＰ−ＩＩ（iii）シーケンスの数：６（iv）郵送住所（Ａ）名宛人：ハーネス，ディッキーアンドピアス（Ｂ）ストリート：ピーオーボックス８２８（Ｃ）シティー：ブルームフィールド・ヒルズ（Ｄ）州：ミシガン（Ｅ）国：アメリカ合衆国（Ｆ）郵便番号：４８０１３（ｖ）コンピューター・リーダブル・フォーム（Ａ）ミディアムタイプ：フロッピーディスク（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭＰＣコンパチブル（Ｃ）オペレイティングシステム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ（Ｄ）ソフトウエア：パテントインリリース＃１．０ヴァージョン＃１．２５（vi）現出願データ（Ａ）出願番号：（Ｂ）出願日：（Ｃ）分類：（viii）弁理士／代理人情報（Ａ）氏名：リーワック，アンナ，エム（Ｂ）登録番号：３３００６（Ｃ）参照番号：２１１５００６７６ＰＯＢ（ix）通信情報（Ａ）電話；（３１３）６４１−１６００（Ｂ）ＦＡＸ：（３１３）６４１−０２７０（Ｃ）テレックス：２８７６３７（２）シーケンスＩＤＮｏ．１の情報（ｉ）シーケンスキャラクタリスティックス（Ａ）長さ：９２４塩基対 (base pairs) （Ｂ）タイプ：核酸（Ｃ）ストランド (STRANDEDNESS)：ダブル（Ｄ）トポロジイ (TOPOLOGY)：リニア（ii）分子タイプ：ｃＤＮＡからｍＲＮＡまで（iii ）ハイポセチカル（HYPOTHETICAL）：なし（ＮＯ）（iv）アンチセンス（ANTI-SENSE）：なし（ＮＯ）（vi）オリジナルソース：（Ａ）オーガニズム（ORGANISM）：ホモサピエンス（Homo sapien）（Ｆ）ティッシュタイプ（TISSUE TYPE）：スキン（skin）（Ｇ）セルタイプ（CELL TYPE）：ファイブロブラスト（fibroblast ）（vii）イミディエットソース（IMMEDIATE SOURCE）：（Ａ）ライブラリー：ヒューマンスキンファイブロブラストラムダＧＴ１１（HUMAN SKIN FIBROBLAST LAMBDA GT11 ）（Ｂ）クローン：ラムダＦ１．１（ix）フィーチャー（FEATURE）：（Ａ）ネーム／キイ：ＣＤＳ（Ｂ）ロケーション：９９．．５１５（Ｄ）その他の情報：／コドンスタート（codon start）＝９９サイテーション（citation）＝（［１］）（ix）フィーチャー（FEATURE）：（Ａ）ネーム／キイ：ポリＡサイト（polyA_-site）（Ｂ）ロケーション：９２４（Ｄ）その他の情報：／サイテーション（citation）＝（［１］）（ix）フィーチャー（FEATURE）（Ａ）ネーム／キイ：５'ユーティーアール（5'UTR）（Ｂ）ロケーション：１．．９８（Ｄ）その他の情報：／サイテーション（citation）＝（［１］）（ix）フィーチャー（FEATURE）：（Ａ）ネーム／キイ：３'ユーティーアール（3'UTR）（Ｂ）ロケーション：５１６．．９２４（Ｄ）その他の情報：／サイテーション（citation）＝（［１］）（ix）フィーチャー（FEATURE）：（Ａ）ネーム／キイ：ポリＡシグナル（polyA_signal）（Ｂ）ロケーション：９１１．．９１６（Ｄ）その他の情報：／サイテーション（citation）＝（［１］）（ix）フィーチャー（FEATURE）：（Ａ）ネーム／キイ：ターミネーター（terminator）（Ｂ）ロケーション：５１３．．５１５（Ｄ）その他の情報：／サイテーション（citation）＝（［１］）（x ）公開情報：（Ａ）著者：アストロム，アンダースタヴァコル，アミールペターソン，ウルリカクロミー，マシューエルダー，ジェイムズ，ティーヴアヒーズ，ジョン，ジェー（Ｂ）題名：Molecular Cloning of Two Human Cellular Retinoic Acid-Proteins（CRABP）（Ｃ）機関誌名：J. B i o l. C h e m. （Ｇ）日付：１９９１年（Ｋ）シーケンスＩＤＮｏ．１の関連残基（RESIDUES）：１から９２４まで（x ）公開情報：（Ａ）著者：アストロム，アンダースタヴァコル，アミールエルダー，ジェイムズ，ティーペターソン，ウルリカクロミー，マシユーヴアヒーズ，ジヨン，ジエー（Ｂ）題名：Cloning of CRABPII cDNA from Human Skin： Retinoic Acid Induces Expression of CRABPII but Not CRABPI in Human Skin in Vivo and in Dermal but Not Lung Fibroblasts in Vitro （Ｃ）機関誌名：Ｊ. Ｉｎｖｅｓｔ. Ｄｅｒｍａｔｏｌ（Ｄ）巻：９６（Ｆ）ページ：５４７−５４７（Ｇ）日付：１９９１年４月（xi）シーケンスディスクリプション：シーケンスＩＤＮｏ．１：（２）シーケンスＩＤＮｏ．２の情報（ｉ）シーケンスキャラクタリスティックス（Ａ）長さ：１３８アミノ酸（Ｂ）タイプ：アミノ酸（Ｃ）ストランド：シングル（Ｄ）トポロジイ：リニア（ii）分子タイプ：ペプチド（iii ）ハイポセチカル（HYPOTHETICAL）：あり（ＹＥＳ）（vi）オリジナルソース：（Ａ）オーガニズム（ORGANISM）：ホモサピエンス（Homo sapien）（x ）公開情報：（Ａ）著者：アストロム，アンダースタヴァコル，アミールペターソン，ウルリカクロミー，マシューエルダー，ジェイムズ，ティーヴアヒーズ，ジョン，ジェー（Ｂ）題名：Molecular Cloning of Two Human Cellular Retinoic Acid-Proteins(CRABP) （Ｃ）機関誌名：J. B i o l. C h e m. （Ｇ）日付：１９９１年（Ｋ）シーケンスＩＤＮｏ．２の関連残基（RESIDUES）：１から１３８まで（x ）公開情報：（Ａ）著者：アストロム，アンダースタヴァコル，アミールエルダー，ジェイムズ，ティーペターソン，ウルリカクロミー，マシューヴアヒーズ，ジョン，ジェー（Ｂ）題名：Cloning of CRABPII cDNA from Human Skin: Retinoic Acid Induces Expression of CRABPII but Not CRABPI in Human Skin in Vivo and in Dermal but Not Lung Fibroblasts in Vitro （Ｃ）機関誌名：J. Invest.Dermatol. （Ｄ）巻：９６（Ｆ）ページ：５４７−５４７（Ｇ）日付：１９９１年４月（xi）シーケンスディスクリプション：シーケンスＩＤＮｏ．２：（２）シーケンスＩＤＮｏ．３の情報（ｉ）シーケンスキャラクタリスティックス（Ａ）長さ：５２５塩基対（base pairs）（Ｂ）タイプ：核酸（Ｃ）ストランド：ダブル（Ｄ）トポロジイ：リニア（ii）分子タイプ：ｃＤＮＡからｍＲＮＡまで（iii ）ハイポセチカル（HYPOTHETICAL）：なし（ＮＯ）（iv）アンチセンス（ANTI-SENSE）なし（ＮＯ）（vi）オリジナルソース：（Ａ）オーガニズム（ORGANISM）：ホモサピエンス（Homo sapien）（Ｆ）ティッシュタイプ（TISSUE TYPE）：スキン（Ｇ）セルタイプ（CELL TYPE）：ファイブロブラスト（fibroblast ）（vii ）イミディエットソース（IMMEDIATE SOURCE）：（Ａ）ライブラリー：ヒューマンスキンラムダザップＩＩ（human skin Lambda ZapII）（Ｂ）クローン：ラムダｓ３．１（ix）フィーチャー（FEATURE）：（Ａ）ネーム／キイ：ＣＤＳ（Ｂ）ロケーション：８．．４１８（Ｄ）その他の情報：／コドンスタート（codon start）＝８サイテーション（citation）＝（［１］）（ix）フィーチャー（FEATURE）：（Ａ）ネーム／キイ：５ユーティーアール（5'UTR）（Ｂ）ロケーション：１．．７（Ｄ）その他の情報：／サイテーション（citation）＝（［１］）（ix）フィーチャー（FEATURE）：（Ａ）ネーム／キイ：３ユーティーアール（3'UTR）（Ｂ）ロケーション：４１９．．５２５（Ｄ）その他の情報：／サイテーション（citation）＝（［１］）（ix）フィーチャー（FEATURE）：（Ａ）ネーム／キイ：ターミネーター（terminator）（Ｂ）ロケーション：４１９．．４２１（Ｄ）その他の情報：／サイテーション（citation）＝（［１］）（x ）公開情報：（Ａ）著者：アストロム，アンダースタヴァコル，アミールペターソン，ウルリカクロミー，マシューエルダー，ジェイムズ，ティーヴアヒーズ，ジョン，ジェー（Ｂ）題名：Molecular Cloning of Two Human Cellular Retinoic Acid-Proteins（CRABP）（Ｃ）機関誌名：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ. （Ｇ）日付：１９９１年（Ｋ）シーケンスＩＤＮｏ．３の関連残基（RESIDUES）：１から５２５まで（x ）公開情報：（Ａ）著者：アストロム，アンダースタヴァコル，アミールエルダー，ジェイムズ，ティーペターソン，ウルリカクロミー，マシューヴアヒーズ，ジョン，ジェー（Ｂ）題名：Cloning of CRABPII cDNA from Human Skin： Retinoic Acid Induces Expression of CRABPII but Not CRABPI in Human Skin in Vivo and in Dermal but Not Lung Fibroblasts in Vitro （Ｃ）機関誌名：J. Invest. Dermatol．（Ｄ）巻：９６（Ｆ）ページ：５４７−５４７（Ｇ）日付：１９９１年４月（xi）シーケンスディスクリプション：シーケンスＩＤＮｏ．３：（２）シーケンスＩＤＮｏ．４の情報（ｉ）シーケンスキャラクタリスティックス（Ａ）長さ：１３７アミノ酸（Ｂ）タイプ：アミノ酸（Ｃ）ストランド：シングル（Ｄ）トポロジイ：リニア（ii）分子タイプ：ペプチド（iii ）ハイポセチカル（HYPOTHETICAL）：あり（ＹＥＳ）（vi）オリジナルソース：（Ａ）オーガニズム（ORGANISM）：ホモサピエンス（Homo sapien）（x ）公開情報：（Ａ）著者：アストロム，アンダースタヴァコル，アミールペターソン，ウルリカクロミー，マシューエルダー，ジェイムズ，ティーヴアヒーズ，ジョン，ジェー（Ｂ）題名：Molecular Cloning of Two Human Cellular Retinoic Acid-Proteins（CRABP）（Ｃ）機関誌名：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（Ｇ）日付：１９９１年（Ｋ）シーケンスＩＤＮｏ．４の関連残基（RESIDUES）：１から１３７まで（x ）公開情報：（Ａ）著者：アストロム，アンダースタヴァコル，アミールエルダー，ジェイムズ，ティーペターソン，ウルリカクロミー，マシューヴアヒーズ，ジョン，ジェー（Ｂ）題名：Cloning of CRABPII cDNA from Human Skin： Retinoic Acid Induces Expression of CRABPII but Not CRABPI in Human Skin in Vivo and in Dermal but Not Lung Fibroblasts in Vitro （Ｃ）機関誌名：J. Invest. Dermatol. （Ｄ）巻：９６（Ｆ）ページ：５４７−５４７（Ｇ）日付：１９９１年４月（xi）シーケンスディスクリプション：シーケンスＩＤＮｏ．４：（２）シーケンスＩＤＮｏ．５の情報（ｉ）シーケンスキャラクタリスティックス（Ａ）長さ：１３２２塩基対（base pairs）（Ｂ）タイプ：核酸（Ｃ）ストランド：ダブル（Ｄ）トポロジイ：リニア（ii）分子タイプ：ＤＮＡ（ゲノム）（genomic）（iii ）ハイポセチカル（HYPOTHETICAL）：なし（ＮＯ）（iv）アンチセンス（ANTI-SENSE）：なし（ＮＯ）（vi）オリジナルソース：（Ａ）オーガニズム（ORGANISM）：ホモサピエンス（Homo sapiens）（Ｆ）ティッシュタイプ（TISSUE TYPE）：胎盤（placenta）（vii ）イミディエットソース（IMMEDIATE SOURCE）：（Ａ）ライブラリー：ヒューマンプラセンタゲノミックライブラリー（human placenta genomic library）（Ｂ）クローン：ラムダ２．１（ix）フィーチャー（FEATURE）：（Ａ）ネーム／キイ：ティーエーティーエーシグナル（TATA_signal ）（Ｂ）ロケーション：１００８．．１０１３（ix）フィーチャー（FEATURE）：（Ａ）ネーム／キイ：エクソン（exon）（Ｂ）ロケーション：１０３９．．１２４５（ix）フィーチャー（FEATURE）：（Ａ）ネーム／キイ：イントロン（intron）（Ｂ）ロケーション：１２４６．．１３２２（x ）公開情報：（Ａ）著者：アストロム，アンダースペクターソン，ウルリカヴアヒーズ，ジョン，ジェー（Ｂ）題名：Structure of the human cellular retinoic acid-binding protein II（CRABP-II） gene: Early transcriptional regulation by retinoic acid （Ｃ）機関誌名：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ. （Ｇ）日付：１９９２年（Ｋ）シーケンスＩＤＮｏ．５の関連残基(RESIDUES) : １から１３２２まで（xi）シーケンスディスクリプション：シーケンスＩＤＮｏ．５：（２）シーケンスＩＤＮｏ．６の情報（ｉ）シーケンスキャラクタリスティックス（Ａ）長さ：１７１７塩基対（base pairs）（Ｂ）タイプ：核酸（Ｃ）ストランド：ダブル（Ｄ）トポロジイ：リニア（ii）分子タイプ：ＤＮＡ（ゲノム）（genomic）（iii ）ハイポセチカル（HYPOTHETICAL）：なし（ＮＯ）（iv）アンチセンス（ANTI-SENSE）：なし（ＮＯ）（vi）オリジナルソース：（Ａ）オーガニズム（ORGANISM）：ホモサピエンス（Homo sapiens）（Ｆ）ティッシュタイプ（TISSUE TYPE）：胎盤（placenta）（vii ）イミディエットソース（IMMEDIATE SOURCE）：（Ａ）ライブラリー：ヒューマンプラセンタゲノミック（human placenta genomic）（Ｂ）クローン：ラムダ２．１（ix）フィーチャー（FEATURE）：（Ａ）ネーム／キイ：エクソン（exon）（Ｂ）ロケーション：１７８．．３５６（ix）フィーチャー（FEATURE）：（Ａ）ネーム／キイ：イントロン（intron）（Ｂ）ロケーション：３５７．．５７１（ix）フィーチャー（FEATURE）：（Ａ）ネーム／キイ：エクソン（exon）（Ｂ）ロケーション：５７２．．６８８（ix）フィーチャー（FEATURE）：（Ａ）ネーム／キイ：イントロン（intron）（Ｂ）ロケーション：６９９．．１１５２（ix）フィーチャー（FEATURE）：（Ａ）ネーム／キイ：エクソン（exon）（Ｂ）ロケーション：１１５３．．１６１８（x ）公開情報：（Ａ）著者：アストロム，アンダースペターソン，ウルリカヴアヒーズ，ジョン，ジェー（Ｂ）題名：Structure of the human cellular retinoic-acid binding protein (CRABP-II) gene: Early transcriptional regulation by retinoic acid （Ｃ）機関誌名：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（Ｇ）日付：１９９２年（Ｋ）シーケンスＩＤＮｏ．６の関連残基（RESIDUES）：１から１７１７まで（xi）シーケンスディスクリプション：シーケンスＩＤＮｏ．６：

【手続補正書】特許法第１８４条の７第１項【提出日】１９９３年９月３０日【補正内容】補正書の写し（翻訳文） (1) 請求の範囲を以下の如く補正する。「請求の範囲１．シーケンスＩＤＮＯ．６で実質的に表わされた核酸であって、人間ＣＲＡＢＰ−IIにエンコードすると共に、人間の細胞から分離され或いは生体内起源で人間から構成されないことを特徴とする核酸。２．人間ＣＲＡＢＰ−IIにエンコードするシーケンスＩＤＮＯ．６に実質的に相補するシーケンスを有し、人間の細胞から分離され或いは生体起源内で人間から構成されないことを特徴とする核酸。３．Ｔで表わされる残基がウラシル残基である請求項１記載の核酸。４．Ｔで表わされる残基がウラシル残基である請求項２記載の核酸。５．シーケンスＩＤＮＯＳ．１，５及び６からなるグループから選択されたシーケンスで実質的に表わされ、人間ＣＲＡＢＰ−II，Ｉ及びII，それぞれにエンコードすると共に、人間の細胞から分離され或いは生体起源内で人間から構成されないことを特徴とする核酸。６．人間ＣＲＡＢＰ−II又はＩにエンコードする核酸に実質的に相補すると共に、シーケンスＩＤＮＯＳ．１，５及び６からなるグループから選択されるシーケンスを有し、人間の細胞から分離され或いは生体起源内で人間から構成されないことを特徴とする核酸。７．Ｔで表される残基がウラシル残基である請求項５記載の核酸。８．Ｔで表される残基がウラシル残基である請求項６記載の核酸。９．シーケンスＩＤＮＯ．２に実質的に類似し、人間の細胞から分離され或いは生体起源内で人間から構成されないことを特徴とするアミノ酸。１０．シーケンスＩＤＮＯ．２に実質的に類似するアミノ酸シーケンスの少なくとも一部に生じた抗体或いはその結合断片。１１．人間ＣＲＡＢＰ−II，Ｉ及びII，それぞれにエンコードするシーケンスＩＤＮＯＳ．１，５及び６からなるグループから選択されるシーケンスで表わされる核酸シーケンスの少なくとも一部分を備えたシーケンスを有する核酸からなるプローブであって、上記部分が厳重な（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ）条件下で相補シーケンスに交雑するのに十分な長さを有し、Ｔで表わされる残基がチミン及びウラシルからなるグループから選択されることを特徴とするプローブ。１２．請求項１１記載のプローブに相補するシーケンスを有する核酸。１３．以下のステップからなることを特徴とする人間ＣＲＡＢＰ−IIの発現に対する試料（サンプル）をスクリーニングする方法。ａ）シーケンスＩＤＮＯ．１で表わされる核酸シーケンスの一部分に相補する核酸プローブであって、Ｔで表わされる残基がチミン或いはウラシルからなるグループから選択される核酸プローブであり、厳重な条件下で相補シーケンスと交雑するのに十分な長さを有する核酸プローブを形成する第１のステップ、ｂ）試料をプローブの交雑に適した条件下で、核酸の相補シーケンスに試料中で接触させる第２のステップ、ｃ）交雑を検出するための手段を形成する第３のステップ、ｄ）交雑を検出し、人間ＣＲＡＢＰ−ＩＩの発現が検出される第４のステップ。１４．以下のステップをさらに備えた請求項１３記載の方法。ｅ）相補シーケンスに対する上記プローブの交雑を計量するための手段を形成する第５のステップ、ｆ）交雑を計量するための上記手段を用る、人間ＣＲＡＢＰ−IIの発現が検出される第６のステップ。１５．以下のステップからなることを特徴とする人間ＣＲＡＢＰ−IIの存在に対する試料をスクリーニングする方法、ａ）ＣＲＡＢＰ−IIに対する抗体或いは結合断片を形成する第１のステップ。ｂ）試料を抗体或いは結合断片の結合に適した条件下で、ＣＲＡＢＰ−IIに試料中で接触させる第２のステップ、ｃ）結合を検出するための手段を形成し且つ用いる第３のステップ。１６．以下のステップをさらに備えた請求項１５記載の方法。ｄ）ＣＲＡＢＰ−IIに対する抗体或いは断片の結合を計量するための手段を形成し且つ用いる第４のステップ。１７．シーケンスＩＤＮＯ．３で実質的に表わされるシーケンスを有し、人間ＣＲＡＢＰ−Ｉにエンコードすると共に、人間の細胞から分離され或いは生体起源内で人間から構成されないことを特徴とする核酸。１８．人間ＣＲＡＢＰ−ＩにエンコードするシーケンスＩＤＮＯ．３で表わされる核酸に実質的に相補し、人間の細胞から分離され或いは生体起源内で人間から構成されないことを特徴とする核酸。１９．Ｔで表わされる残基がウラシル残基である請求項１８記載の核酸。２０．Ｔで表わされる残基がウラシル残基である請求項１９記載の核酸。２１．人間ＣＲＡＢＰ−ＩにエンコードするシーケンスＩＤＮＯ．３で実質的に表わされるシーケンス及びこれに実質的に相補するシーケンスを有する核酸からなるグループから選択される核酸の少なくとも一部分からなる核酸プローブであって、Ｔで表わされる残基がチミン及びウラシルからなるグループから選択される核酸プローブであり、上記部分が厳重な条件下でそれの相補シーケンスに交雑するのに十分な長さを有することを特徴とする核酸プローブ。２２．シーケンスＩＤＮＯ．４で実質的に表わされると共に残基がアラニンであり、人間の細胞から分離され或いは生体起源内で人間から構成されないことを特徴とするアミノ酸シーケンス。２３．請求項２２記載のアミノ酸シーケンスの少なくとも一部分に生じた抗体或いはその結合断片。２４．シーケンスＩＤＮＯ．１で実質的に表わされるシーケンス、或いはこれに実質的に相補するシーケンス、或いはこれら両者を含むプラスミド又はウイルスからなることを特徴とするＣＲＡＢＰ−IIベクター。２５．シーケンスＩＤＮＯ．３で実質的に表わされるシーケンス、或いはこれに実質的に相補するシーケンス、或いはこれら両者を含むプラスミド又はウイルスからなることを特徴とするＣＲＡＢＰ−Ｉベクター。２６．レチノイドバインディングプロテインに遺伝情報を指定する核酸シーケンスからなり、該シーケンスがシーケンスＩＤＮＯ．１で実質的に表わされ且つ細胞内に機能的（有機的）に包含されることを特徴とする組換え型の発現構成体。２７．レチノイド反応性要素とこれに機能的に結合するレポーター（ｒｅｐｏｒｔｅｒ）遺伝子とからなるレポーター要素をさらに備えた請求項２６記載の構成体。２８．少なくとも第２のレチノイドバインディングプロテインのＤＮＡ結合領域のための核酸シーケンスをさらに備えた請求項２６記載の構成体。２９．上記第２のレチノイドバインディングプロテインがＲＡＲ又はＲＸＲである請求項２６記載の構成体。３０．シーケンスＩＤＮＯ．３で実質的に表わされるシーケンスを包含すると共にレポーター遺伝子に機能的に結合されるレチノイド反応性要素を包含するレポーター要素をさらに備えた細胞からなることを特徴とする組換え型の発現構成体。３１．ＣＲＡＢＰ−IIの発現ベクターと追加のレチノイドバインディングプロテインのための（に対する）発現ベクターとに同時トランスフェクション（ｃｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ）されるＣＶ−１と、上記発現ベクターに機能的に合致すると共にレチノイド反応性要素に機能的に結合されるレポーター遺伝子からなるレポーター要素とからなることを特徴とするレポーター検査システム（系統）（ｒｅｐｏｒｔｅｒａｓｓａｙｓｙｓｔｅｍ）。３２．上記レチノイドバインディングプロテインがＲＡＲである請求項３１記載のレポーター検査。３３．上記レチノイドバインディングプロテインがＲＸＲである請求項３１記載のレポーター検査。３４．以下のステップからなることを特徴とするレポータープロテインへの推定リガンド（ｐｕｔａｔｉｖｅｌｉｇａｎｄ）の結合を検査するための方法、ａ）トランスフェクションのための細胞を形成するための第１ステップ、ｂ）シーケンスＩＤＮＯ．１で実質的に表わされるシーケンス、シーケンスＩＤＮＯ．２で実質的に表わされるシーケンス及びこれらに実質的に相補するシーケンスからなるグループから選択される核酸シーケンスを含むプラスミド又はウイルスからなるベクターを形成する第２のステップ、ｃ）上記細胞を上記第２のステップのベクターにトランスフェクションする第３のステップ、ｄ）レチノイド反応性要素を形成する第４のステップ、ｅ）上記細胞を上記レチノイド反応性要素にトランスフェクションする第５のステップ、ｆ）上記ベクター及び上記反応性要素にトランスフェクションされた細胞を結合に適した条件下で推定リガンドにさらす第６のステップ、ｇ）結合を検出するための手段を形成し且つ用いる第７のステップ。３５．検出のための手段がレチノイド反応性要素に機能的に結合されたレポーター遺伝子からなり、検出のための手段を用いることが、レポーター遺伝子生成物の存在を検査することからなる請求項３４記載の方法。３６．人間ＣＲＡＢＰ−ＩにエンコードするシーケンスＩＤＮＯ．３で表わされる核酸シーケンスの少なくとも一部分を備え、該部分が厳重な条件下でそれの相補シーケンスに交雑するのに十分な長さを有し、Ｔで表わされる残基が、チミン及びウラシルからなるグループから選択されることを特徴とする核酸プローブ。３７．請求項３６記載のプローブに相補するシーケンスを有する核酸。３８．シーケンスＩＤＮＯ．６によってエンコードされた細胞レチノイックアシッドバインディングプロテイン。」

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｑ 1/68 Ａ 9453−4ＢＧ０１Ｎ 33/53 Ｄ 8310−2Ｊ 33/566 8310−2Ｊ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＫ，ＬＵ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ (72)発明者ペターソン，ウルリカアメリカ合衆国ミシガン州アン・アーバウィスパーウッド・ドライブ3070 アパートメント428 (72)発明者タヴァコル，アミールアメリカ合衆国ミシガン州アン・アーバウィルトシャー1845

Claims

【特許請求の範囲】１．シーケンスＩＤＮＯ．６で実質的に表わされた核酸シーケンスであって、上記シーケンスが、人間の細胞から分離されたシーケンスか、或いは人間生体内起源のものではないことを特徴とする核酸シーケンス。２．シーケンスＩＤＮＯ．６に実質的に相補的な拡散シーケンスであって、上記相補的シーケンスが、人間の細胞から分離されたか或いは人間生体内起源のものではないことを特徴とする核酸シーケンス。３．Ｔで表される残基がウラシル残基である請求項１記載の核酸シーケンス。４．Ｔで表される残基がウラシル残基である請求項２記載の核酸シーケンス。５．シーケンスＩＤＮＯＳ．１，５及び６から基本的になるグループから選択されたシーケンスで実質的に表わされ、人間の細胞から分離され或いは生体起源内で人間から構成されないことを特徴とする核酸シーケンス。６．シーケンスＩＤＮＯＳ．１，５及び６から基本的になるグループから選択されたシーケンスに実質的に相補し、人間の細胞から分離され或いは生体起源内で人間から構成されないことを特徴とする核酸シーケンス。７．Ｔで表される残基がウラシル残基である請求項５記載の核酸シーケンス。８．Ｔで表される残基がウラシル残基である請求項６記載の核酸シーケンス。９．シーケンスＩＤＮＯ．２に実質的に類似し、人間の細胞から分離され或いは生体起源内で人間から構成されないことを特徴とするアミノ酸。１０．シーケンスＩＤＮＯ．２に実質的に類似するアミノ酸シーケンスの少なくとも一部に生じた抗体或いはその結合断片。１１．シーケンスＩＤＮＯＳ．１，５及び６から基本的になるグループから選択されるシーケンスで表わされる核酸シーケンスの少なくとも一部分を備えた核酸プローブであって、上記部分が相補シーケンスに交雑するのに十分な長さを有し、Ｔで表わされる残基がチミン及びウラシルからなるグループから選択されることを特徴とする核酸プローブ。１２．請求項１１記載のプローブの相補シーケンス。１３．以下のステップからなることを特徴とする人間のＣＲＡＢＰ−IIの発現に対する試料（サンプル）をスクリーニングする方法、ａ）シーケンスＩＤＮＯ．１で表わされる核酸シーケンスの一部分に相補する核酸プローブであって、Ｔで表わされる残基がチミン或いはウラシルからなるグループから選択される核酸プローブであり、それの相補シーケンスと交雑するのに十分な長さを有する核酸プローブを形成する第１のステップ、ｂ）試料をプローブの交雑に適した条件下で、核酸の相補シーケンスに試料中で接触させる第２のステップ、ｃ）交雑を検出するための手段を形成する第３のステップ、ｄ）交雑を検出する第４のステップ。１４．以下のステップをさらに備えた請求項１３記載の方法、ｅ）相補シーケンスに対する上記プローブの交雑を計量するための手段を形成する第５のステップ、ｆ）交雑を計量するための上記手段を用いる第６のステップ。１５．以下のステップからなることを特徴とする人間ＣＲＡＢＰ−IIの存在に対する試料をスクリーニングする方法、ａ）ＣＲＡＢＰ−IIに対する抗体或いは結合断片を形成する第１のステップ、ｂ）試料を抗体或いは結合断片の結合に適した条件下で、ＣＲＡＢＰ−IIに試料中で接触させる第２のステップ、ｃ）結合を検出するための手段を形成し、且つ用いる第３のステップ。１６．以下のステップをさらに備えた請求項１５記載の方法。ｄ）ＣＲＡＢＰ−IIに対する抗体或いは断片の結合を計量するための手段を形成し且つ用いる第４のステップ。１７．シーケンスＩＤＮＯ．３に実質的に類似し、人間の細胞から分離され或いは生体起源内で人間から構成されないことを特徴とする核酸シーケンス。１８．シーケンスＩＤＮＯ．３で表わされるシーケンスに実質的に相補し、人間の細胞から分離され或いは生体起源内で人間から構成されないことを特徴とする核酸シーケンス。１９．Ｔで表わされる残基がウラシル残基である請求項１８記載の核酸シーケンス。２０．Ｔで表わされる残基がウラシル残基である請求項１９記載の核酸シーケンス。２１．シーケンスＩＤＮＯ．３で実質的に表わされるシーケンス及びこれに実質的に相補するシーケンスからなるグループから選択される核酸シーケンスの少なくとも一部分からなる核酸プローブであって、Ｔで表わされる残基がチミン及びウラシルからなるグループから選択される核酸プローブであり、上記部分がそれの相補シーケンスに交雑するのに十分な長さを有することを特徴とする核酸プローブ。２２．シーケンスＩＤＮＯ．４で実質的に表わされると共に残基がアラニンであり、人間の細胞から分離され或いは生体起源内で人間から構成されないことを特徴とするアミノ酸シーケンス。２３．請求項２２記載のアミノ酸シーケンスの少なくとも一部分に生じた抗体或いはその結合断片。２４．シーケンスＩＤＮＯ．１で実質的に表わされるシーケンス、或いはこれに実質的に相補するシーケンス、或いはこれら両者を含むプラスミド又はウイルスからなることを特徴とするＣＲＡＢＰ−IIベクター。２５．シーケンスＩＤＮＯ．３で実質的に表わされるシーケンス、或いはこれに実質的に相補するシーケンス、或いはこれら両者を含むプラスミド又はウイルスからなることを特徴とするＣＲＡＢＰ−Ｉベクター。２６．レチノイドバインディングプロテインに遺伝情報を指定する核酸シーケンスからなり、該シーケンスがシーケンスＩＤＮＯ．１で実質的に表わされ且つ細胞内に機能的（有機的）に包含されることを特徴とする組換え型の発現構成体。２７．レチノイド反応性要素とこれに機能的に結合するレポータ（ｒｅｐｏｒｔｅｒ）遺伝子とからなるレポータ要素をさらに備えた請求項２６記載の構成体。２８．少なくとも第２のレチノイドバインディングプロテインのＤＮＡ結合領域のための核酸シーケンスをさらに備えた請求項２６記載の構成体。２９．上記第２のレチノイドバインディングプロテインがＲＡＲ又はＲＸＲである請求項２６記載の構成体。３０．シーケンスＩＤＮＯ．３で実質的に表わされるシーケンスを包含すると共にレポーター遺伝子に機能的に結合されるレチノイド反応性要素を包含するレポーター要素をさらに備えた細胞からなることを特徴とする組換え型の発現構成体。３１．ＣＲＡＢＰ−IIの発現ベクターと追加のレチノイドバインディングプロテインのための（に対する）発現ベクターとに同時トランスフェクション（ｃｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ）されるＣＶ−１と、上記発現ベクターに機能的に合致すると共にレチノイド反応性要素に機能的に結合されるレポーター遺伝子からなるレポーター要素とからなることを特徴とするレポーター検査システム（ｒｅｐｏｒｔｅｒａｓｓａｙｓｙｓｔｅｍ）。３２．上記レチノイドバインディングプロテインがＲＡＲである請求項３１記載のレポーター検査。３３．上記レチノイドバインディングプロテインがＲＸＲである請求項３１記載のレポーター検査。３４．以下のステップからなることを特徴とするレポータープロテインへの推定リガンド（ｐｕｔａｔｉｖｅｌｉｇａｎｄ）の結合を検査するための方法、ａ）トランスフェクションのための細胞を形成するための第１ステップ、ｂ）シーケンスＩＤＮＯ．１で実質的に表わされるシーケンス、シーケンスＩＤＮＯ．２で実質的に表わされるシーケンス及びこれらに実質的に相補するシーケンスからなるグループから選択される核酸シーケンスを含むプラスミド又はウイルスからなるベクターを形成する第２のステップ、ｃ）上記細胞を上記第２のステップのベクターにトランスフェクションする第３のステップ、ｄ）レチノイド反応性要素を形成する第４のステップ、ｅ）上記細胞を上記レチノイド反応性要素にトランスフェクションする第５のステップ、ｆ）上記ベクター及び上記反応性要素にトランスフェクションされた細胞を結合に適した条件下で推定リガンドにさらす第６のステップ、ｇ）結合を検出するための手段を形成し且つ用いる第７のステップ。３５．検出のための手段がレチノイド反応性要素に機能的に結合されたレポーター遺伝子からなり、検出のための手段を用いることが、レポーター遺伝子生成物の存在を検査することからなる請求項３４記載の方法。３６．シーケンスＩＤＮＯ．３で表わされる核酸シーケンスの少なくとも一部分を備え、該部分がそれの相補シーケンスに交雑するのに十分な長さを有し、Ｔで表わされる残基が、チミン及びウラシルからなるグループから選択されることを特徴とする核酸プローブ。３７．請求項３６記載のプローブの相補シーケンス。３８．シーケンスＩＤＮＯ．６によってエンコードされた細胞レチノイックアシッドバインディングプロテイン。