JP2014502147A - α‐L‐イズロニダーゼ(IDUA)への天然アンチセンス転写物の阻害によるIDUA関連疾患の治療 - Google Patents
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Abstract
【選択図】図1
Description
配列番号1:ヒトα‐L‐イズロニダーゼ(IDUA)、転写変異体3、mRNA(NCBI登録番号NM_000203);配列番号2:天然のIDUAアンチセンス配列(Hs. 656285);配列番号3:天然のIDUAアンチセンス配列(CR626108);配列番号4:天然のIDUAアンチセンス配列(DN334757);配列番号5:天然のIDUAアンチセンス配列:(DN876121);配列番号6:天然のIDUAアンチセンス配列(DN744190);配列番号7:天然のIDUAアンチセンス配列(DN330918);配列番号8:天然のIDUAアンチセンス配列(DN876121−伸長);配列番号9:伸長されたヒト天然のIDUAアンチセンス配列;配列番号10〜配列番号28:アンチセンスオリゴヌクレオチド。*はホスホチオアート結合を示す;配列番号29〜配列番号45:UniGeneクラスターHs656285。
本明細書で使用される用語の選択は、特定の実施形態を説明する目的でされたものであり、本発明を限定することを意図するものではない。本明細書で使用される場合、単数形の「a」、「an」、及び「the」は文脈において明らかに別記されない限り、複数形の内容も含むものとする。さらに、用語「含む」、「含める」、「有する」、「もつ」またはその変化形は、本明細書および/または添付の請求項において使用される場合、用語「包含する」と同様に非排他的な意味で用いられるものとする。
標的:一実施形態において、該標的は、限定することなくIDUAに関連するセンスおよび/またはアンチセンスの非コードおよび/またはコード配列を含んだα‐L‐イズロニダーゼ(IDUA)およびその類似型の核酸配列を含む。
外来性核酸の宿主細胞または生体内への輸送は、細胞中または生体中の核酸を直接検出するステップによって評価され得る。そのような検出は、当技術分野において周知のいくつかの方法によって達成し得る。例えば、外来性核酸の存在は、サザンブロットまたは核酸に関連するヌクレオチド配列を特異的に増幅するプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応(PCR)技術によって検出し得る。外来性核酸の発現も遺伝子発現分析を含む従来の方法を使用して測定し得る。例えば外来性核酸から生成されるmRNAはノーザンブロットおよび逆転写PCR(RT−PCR)を使用して検出および定量し得る。
本発明の化合物は、診断、治療および予防のためにならびに研究用試薬およびキットの構成要素として利用され得る。さらに、優れた特異性をもって遺伝子発現を阻害できるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、当業者によって特定の遺伝子の機能を解明するため、または生物学的経路の種々のメンバー間の機能を区別するために使用されることが多い。
本発明のオリゴヌクレオチドの他の修飾は、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布または細胞への取り込みを増強する1以上の成分またはコンジュゲートへのオリゴヌクレオチドの化学的連結を含む。これらの成分またはコンジュゲートは、1級または2級ヒドロキシル基などの官能基に共有結合したコンジュゲート基を含み得る。本発明のコンジュゲート基は、干渉物質、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマーの薬力学特性を増強する基、およびオリゴマーの薬物動態特性を増強する基を含む。典型的なコンジュゲート基は、コレステロール、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、および色素を含む。本発明の文脈において薬力学特性を増強する基は、取り込みを改善し、分解への耐性を増強し、および/または標的核酸との配列特異的ハイブリダイゼーションを強化する基を含む。本発明の文脈において薬物動態特性を増強する基は、本発明の化合物の取り込み、分散、代謝または排出を改善する基を含む。代表的コンジュゲート基は、1992年10月23日出願の国際特許出願PCT/US92/09196および米国特許第6,287,860号、「Antisense inhibition of MEKK2 expression」において開示されており、これらはともに参照により本明細書に組み込まれる。コンジュゲート成分は、以下に限定されないが、コレステロール成分、コール酸、チオエーテル(例えばヘキシル−S−トリチルチオール)、チオコレステロール、脂肪族鎖(例えばドデカンジオールまたはウンデシル残基)、リン脂質(例えばジ−ヘキサデシル−rac−グリセロールまたはトリエチルアンモニウム1,2−ジ−O−ヘキサデシル−rac−グリセロ−3−H−ホスホネート)、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖、あるいはアダマンタン酢酸、パルミチル成分、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール成分などを含む。本発明のオリゴヌクレオチドは、活性原薬、例えばアスピリン、ワルファリン、フェニルブタゾン、イブプロフェン、スプロフェン、フェンブフェン、ケトプロフェン、(S)−(+)−プラノプロフェン、カプロフェン、ダンシルサルコシン、2,3,5−トリヨード安息香酸、フルフェナム酸、フォリン酸、ベンゾチアジアジド、クロロチアジド、ジアセピン、インドメチシン、バルビツール酸、セファロスポリン、サルファ剤、抗糖尿病薬、抗菌剤または抗生物質ともコンジュゲート形成され得る。
本発明の化合物は、取り込み、分散および/または吸収の補助ために、例えばリポソーム、受容体−標的分子、経口、直腸、局所または他の製剤として、他の分子、分子構造または化合物と、混合物と混合、封入、コンジュゲート化または他の方法で結合され得る。そのような取り込み、分散および/または吸収を補助する製剤の調製について記載した代表的米国特許としては、以下に限定されないが、米国特許第5,108,921号;第5,354,844号;第5,416,016号;第5,459,127号;第5,521,291号;第5,543,165号;第5,547,932号;第5,583,020号;第5,591,721号;第4,426,330号;第4,534,899号;第5,013,556号;第5,108,921号;第5,213,804号;第5,227,170号;第5,264,221号;第5,356,633号;第5,395,619号;第5,416,016号;第5,417,978号;第5,462,854号;第5,469,854号;第5,512,295号;第5,527,528号;第5,534,259号;第5,543,152号;第5,556,948号;第5,580,575号;および第5,595,756号が挙げられ、それぞれが本明細書に参照として組み込まれる。
治療用組成物の処方およびそれらの続く投与(投薬)は、当業者の技能の範囲内であると考えられる。投薬は、数日間から数カ月間継続する、または治療が効果的になるかもしくは病態の減退が達成されるまでの治療過程において、治療される病態の重症度および応答性に応じて決まる。最適な投薬レジメンは、患者の身体での薬剤蓄積の測定値から算出され得る。当業者であれば、最適投与量、投薬方法および反復頻度を容易に決定できる。最適な投与量は、個々のオリゴヌクレオチドの相対的効力に応じて変動し得、通常体外および生体内動物モデルにおいて効果的であると判明したEC50に基づいて推定され得る。通常投与量は、体重1kgあたり0.01μg〜約10mgであり、1日に、1週間に、1カ月にもしくは1年に1回もしくは複数回またはさらに2〜20年ごとに1回である場合がある。当業者であれば、測定された滞留時間および体液または組織における薬剤の濃度に基づいて投薬の反復頻度を容易に推定できる。治療の成功に続いて、病態の再発を予防するために患者に維持療法を受けさせることが望ましい場合があり、ここでオリゴヌクレオチドは維持投与において体重1kgあたり0.01μg〜約10mg、1日1回または複数回から2〜20年ごとに1回の範囲で投与される。
実施例
上記の通り用語「に特異的なオリゴヌクレオチド」または「オリゴヌクレオチド標的」は、(i)標的遺伝子の一部分と安定な複合体を形成できる配列、または(ii)標的遺伝子のmRNA転写物の一部分と安定な2重鎖を形成できる配列を有するオリゴヌクレオチドを指す。
実施例2に使用される全てのアンチセンスオリゴヌクレオチドを、実施例1に記載されているように設計した。この製造者(IDT Inc.のCoralville, IA)は、設計されたホスホロチオエート結合のオリゴヌクレオチドを製造するよう支持され、表1に示されているように、設計されたホスホロチオエート類似体が提供された。ヌクレオチド間のアスタリスクは、ホスホロチオエート結合が存在することを表している、実施例2における実験に必要とされるオリゴヌクレオチドは、例えば、IDT:5ミクロンに調節された孔型のガラスビーズ(CPG)などの固体の支持上にて、ホスホラミダイトモノマー(AおよびCおよびG上のN−2イソブチリル上のベンゾール、糖上のトリチル基などのタンパク基により保護される全ての活性基を備えた正常なヌクレオチド)を使用する、IDTにより使用される方法などの、いずれかの既知の方法のいずれかの適切な状態を使用して合成することができる。タンパク基は、オリゴヌクレオチドの合成中、必要としない反応を防ぐ。タンパク基は、合成プロセスの終わりに除去される。最初のヌクレオチドは、3´炭素を通して固体支持体に結合され、この3´から5´方向へと合成が進む。オリゴヌクレオチド鎖の増殖に対する新しい塩基の追加は、4つのステップにて起こる。1)タンパク基は、トリクロロ酢酸を用いて固定化されたヌクレオチドの5´酸素から除去される。2)固定化されたヌクレオチドおよび次の配列のヌクレオチドは、テトラゾールを使用して結合する。この反応は、テトラゾールホスホラミダイト中間体を通して進む。3)反応しない遊離ヌクレオチドおよび反応の副産物は、洗浄され、反応しない固定化されたオリゴヌクレオチドは、次の合成段階に関与することを防ぐために、キャッピングされる。キャッピングは、無水酢酸およびN‐メチルイミダゾールを使用して、遊離5´ヒドロキシルをアセチル化することにより達成される。4)もし、リン酸ジエステル結合が作成され、またはBeaucage試薬(3H−1,2−ベンゾジチオール−1−1,1−二酸化物)が作成される場合、もしくは、ホスホロチオエート結合が望まれている場合、ヌクレオチド間の結合を安定化させるために、リンは、ヨウ素および水を用いて酸化される。2つの酸化剤を変性させることにより、キメラの骨格が形成される。上記に記載された4つのステップサイクルは、配列において全てのヌクレオチドが繰り返される。相補的な配列が合成される時、オリゴヌクレオチドは、固体支持体から分割され、高温度の水酸化アンモニウムを使用して脱保護される。タンパク基は、淡水により洗浄され、残ったオリゴヌクレオチドは、凍結乾燥される。
実施例2において設計された実験を行うために、ATCC (cat# HB−8065)からのHepG2細胞を、増殖培地(MEM/EBSS(Hyclone cat#SH30024またはMediatech cat#MT−10−010−CV)+10%FBS(Mediatech cat#MT35−011−CV)+ペニシリン/ストレプトマイシン(Mediatech cat#MT30−002−CI))中、37℃、5%CO2で増殖させた。実験の1日前に、該細胞を6穴ブレートに0.5×104/mlの密度で再播種し、37℃、5%CO2で一晩インキュベートした。実験当日に6穴プレート中の培地を新鮮な増殖培地に交換した。
この実施例では、IDUA−特異的天然のアンチセンス転写物を標的とする、異なる化学的性質のSK−N−ASアンチセンスオリゴヌクレオチド類は、最終濃度20nMにてヒト神経芽細胞腫のSK−N−AS細胞培養株をスクリーニングした。
ATCC (cat# CRL−2137)からの、SK−N−AS細胞培養株、SK−N−AS神経芽細胞腫は、37℃および5%のCO2の増殖培地(DMEM (Mediatech cat# 10−013−CV) +10% FBS (Mediatech cat# MT35−011−CV)+ペニシリン/ストレプトマイシン(Mediatech cat# MT30−002−CI)+非必須アミノ酸類(NEAA)(HyClone SH30238.01))にて増殖した。この細胞は、以下の方法の内の1つを使用してアンチセンスオリゴヌクレオチド類を処置した。次の日の方法のため、この実験の前日に、細胞は、約3x105ウェルの密度にて増殖培地中の6ウェルプレートへ再播種され、一晩37℃、CO25%にてインキュベートされた。次の日、6ウェルプレートの培地は、新鮮な増殖培地(1.5ml/ウェル)に変えられ、この細胞は、アンチセンスオリゴヌクレオチド類を投与される。すべてのアンチセンスオリゴヌクレオチド類は、IDT Inc. (Coralville, IA)もしくはExiqon (Vedbaek,デンマーク)により製造された。すべてのオリゴヌクレオチド類の配列は、表1に示されている。オリゴヌクレオチド類の原液は、DNAse/RNAse−free sterile waterにて20μMの濃度に希釈された。1つのウェルに投与するために、この溶液1μlを、室温にて20分間、200μlOpti−MEM培地(Gibco cat#31985−070) および2μlのLipofectamine 2000 (Invitrogen cat# 11668019)とインキュベートし、細胞と共に、24ウェルプレートの1つのウェルに液滴適用した。オリゴヌクレオチド溶液の変わりに1μlの水を含む類似の混合物が、モックトランスフェクトの対照として使用された。37℃および5%のCO2で18時間インキュベートした後、この培地は、新鮮な培地へと変えられた。アンチセンスオリゴヌクレオチド類の添加から48時間後、製造者の指示に従って、Promega (cat # Z3105)からSV Total RNA Isolation Systemを使用して細胞から、RNAが抽出された。600ナノグラムの精製された総RNAは、製造者の手順に記載されているInvitrogen (cat#11754−250)からのSuperScript VILO cDNA Synthesis Kitを使用して行われる逆転写反応に加えられた。この逆転写反応からのcDNAは、ABI Taqman Gene Expression Mix (cat#4369510)およびABI (assays Hs00164940_m1)により設計されたプライマー/プローブを使用するリアルタイムPCRによる遺伝子発現を管理した。3つすべてのアッセイを使用して得られた結果は非常に類似していた。以下の、(Biosystemsを適用した)ステップワンプラスリアルタイムPCRシステム(StepOne Plus Real Time PCR system)を使用して、50℃を2分、95℃を10分、(95℃を15秒、60℃を1分)を40回といったPCRの周期が使用された。18Sのアッセイは、ABI (cat# 4319413E)により製造された。アンチセンスオリゴヌクレオチド類との処置後の遺伝子発現の倍率変化は、処置されたサンプルおよびモックトランスフェクトサンプルの間の18−S標準化dCt値の差異に基づき計算された。
結果
リアルタイムPCRは、SK−N−AS細胞のIDUAのmRNA値が、アンチセンスオリゴヌクレオチド類のCUR−1976、CUR1978およびヒトIDU天然のアンチセンスHs.656285に対するCUR−1987を処置した48時間後での増加傾向を示す結果となる。(図4)
この実験の目的は、イヌのIDUAのアンチセンスDN876121の知られた配列をすべての配列を配列決定することにより伸長することである。この元となるDN876121
RNA転写物は、イヌの負レンズおよび角膜組織から得られた。直接クローン化されたcDNAライブラリは、Laurel MD によるBioserve Biotechnology のpCMVSport6ベクター(Invitrogrn)にて調製された。この実験は、2005年の4月に行われた。このDN876121クローンは、Open Biosystems (Open Biosystems Products, Huntsville, AL)にて現在利用可能である。2005年4月、DN876121クローンは、完全に配列決定されなかった。OPKO−CURNAは、DN876121クローンおよび配列決定されたすべてのインサートを得た。このことを達成するために、DN876121インサートを備えたプラスミドを含むバクテリアのクローンが、Open Biosystemsから要求され、個々のコロニーを同定するために、アンピシリンを含むLuria Bertani (LB)−寒天プレート内に播種された。その後、コロニーは、5mlのLBブロース内にて増幅された。DN876121インサートを含むこのプラスミドは、これらのバクテリアから同定され、Davis Sequencing (Davis, CA)に、配列決定されるために送られた。
凍結されたDN876121プラスミドを含むバクテリアの懸濁液は、Open Biosystems (Open Biosystems Products, cat# NAE04B03)から購入され、1:10、1:100、1:1000、1:10000、1:100000倍に希釈された後、100 μg/mlのアンピシリンを含むLuria Bertani (LB) (BD, cat# 244520)寒天培地(Falcon, cat#351005)上に播種される。15時間後、それぞれ20個のバクテリアのコロニーが、1:100000希釈でプレートから分離され、5mlのLBブロース(Fisher Scientific, cat# BP1426−2)中にてそれぞれ15時間〜24時間増殖された。この時に、バクテリアがペレットとして沈殿し、(DN876121 RNA転写物からのcDNAを含む)プラスミドが、製造者の手順に従ってPromega (Promega, cat#A1222)からのPureYieldTM Plasmid Miniprep System kitを使用することにより分離された。この分離されたDNAは、200ng/mlに希釈され、各コロニーからの12μlのプラスミドは、配列決定のためにDavis Sequencing (Davis, CA)へ送られた。
結果
Davis Sequencingから得られた配列は、図5に示される知られたDN876121配列の実質的な伸長を示した。
結論
578のヌクレオチドによる知られたDN876121配列の成功した伸長は、イヌのIDUAの潜在的な天然のアンチセンス転写物DN876121−伸長型(配列番号8)のオリゴヌクレオチド類を設計する基礎となるものである。
この実験の目的は、IDUAの酵素活性を使用して異なる細胞におけるIDUAの活性をアップレギュレートする能力により化合物を順位づけることである。この方法は、IDUA活性を増加させる能力のために、IDUA mRNA(およびIDUAタンパク質)をアップレギュレートするために知られているIDUAの天然のアンチセンスに相補的なオリゴヌクレオチドを順位づけるために使用することができる。患者の繊維芽細胞の増殖のプロトコルに関するこの手順は、患者に対しての処置としてこのオリゴヌクレオチドを提供する前にIDUAの活性を増加させることができるIDUAの天然のアンチセンスに相補的な正しいオリゴヌクレオチドを生体外にて配列決定することができる。
物質および方法
細胞は、lipofectamine TM 2000を使用して、0〜80nMのIDUAの天然のアンチセンスに相補的なオリゴヌクレオチドにて処置される。24時間後、この培地は廃棄され、新鮮な培地が、24時間から最大72時間まで添加される。その時に、培地は貯蔵され、IDUAが調べられる。このIDUA活性は、アッセイバッファー(50 mM NaOAc, 150 mMNaCl, 0.02% Brij−35 (w/v) pH3.5)中にて連続的に(最大0.2μg/mL濃度にて)希釈された(R&D systems Inc. Minneapolis MNからの)対照の組み換えヒトIDUAとして使用するために測定される。200μMのアッセイバッファー中のIDUA基質(4−メチルウンベリフェリル‐α‐L‐イズロン酸塩)を備えたアッセイバッファー中の等量の組み換えヒトIDUAは、96ウェルプレート(100μ濾過反応溶液)中にて混合される。室温にて10分間インキュベートされる。発達バッファー(0.1M Tris pH9.0)内の組み換えヒトIDUAの混合物を蛍光アッセイプレートへ最大0.005μg/mLに希釈する。この溶液は、365nmおよび445nmにて記録される。この特異的な活性は、以下のように計算(pモル/分/μg)される。
この実験の目的は、酵素‐連結免疫吸着剤アッセイ(ELISA)と呼ばれる技術を使用して異なる細胞におけるIDUAタンパク質発現をアップレギュレートする能力による化合物を順位づけするものである。
物質および方法
細胞により産生されたIDUAタンパク質量は、ELISAにより定量される。このことを達成するために、この細胞は、適切な増殖条件を使用して24ウェルプレート内にて増殖する。微小な化合物を添加して48時間後、この培地は除去され、カルシウムおよびマグネシウムのないダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(PBS) (Mediatech cat# 21−031−CV)で3回洗浄し、その後、PBSは廃棄され、この細胞は、20℃で15分間、100%のメタノールを100μl使用して24ウェルプレート内にて固定化される。この細胞は、メタノールを除去した後、PBSで洗浄され、3%の過酸化水素(Fisher Chemical cat#H325−100)にて、21℃で5分間、インキュベートする。この細胞は、PBSで5分間、3回洗浄した後、21℃で30分間、0.1%のPBSにて100μlのウシ血清アルブミン(BSA)(Sigma cat# A−9647)にてインキュベートされる。PBSで5分間、3回洗浄した後、300μlのAvidin溶液(Vector Laboratories cat# SP−2001)にて21℃で30分間、インキュベートした。この細胞は、PBSで短時間にすすがれた後、300μlビオチン溶液(Vector Laboratories cat# SP−2001)にて21℃で30分間インキュベートされた。この細胞は、PBSで3回洗浄された後、0.1%PBS/BSA内のヒトIDUA (Abcam cat# ab103949)のアミノ酸244−274の内部配列領域内の100μlのウサギの抗体を使用して、4℃で一晩インキュベートした。21℃で5分間、プレートを平衡化した後、この細胞は、PBSで5分間洗浄された後、21℃で30分間、0.1%のPBS/BSAで1:200に希釈したヤギ‐抗‐ウサギ抗体でインキュベートした。この細胞は、PBSで5分間、3回洗浄された後、Vectastain Elite ABC試薬A+B 溶液(Vector Laboratories cat# PK−6101)で30分間、インキュベートした。このVectastain Elite ABC試薬A+B 溶液は、試薬Aを2滴、5mlのPBS、試薬Bを2滴連続的に添加し、混合することによって、細胞とインキュベートする前に、30分、21℃で調製された。この細胞は、21℃で5分間、PBSで3回洗浄された後、テトラメチルベンジジン(TMB)ペルオキシダーゼ基質溶液(Thermo Scientific cat#N301)でインキュベートした。上清が青く変化した後、新しい96ウェルELISAプレート(Greiner bio one cat #65121)に移動させ、1Mの硫酸が添加される。この吸光度は、Multiskanスペクトル分光光度計(Thermo Scientific)を使用して450nmにて記録される。第1の抗体としてウサギ抗‐マウスIgGで染色されたウェルにて記録されるこのバックグラウンドシグナルは、全てのIDUAおよびアクチンの読み取りから除去される。Abcam (cat# ab1801)からのウサギ抗‐アクチン抗体が使用される。このIDUAシグナルは、各条件のアクチンシグナルを標準化し、各実験変異体に標準値が比較される。
この実験の目的は、免疫組織化学と呼ばれる技術を使用して、異なる細胞のIDUAタンパク質の発現をアップレギュレートする能力により、化合物を順位づけるものである。
物質および方法
IDUAタンパク質は、免疫組織化学により、細胞の内部を検出する。このことを達成するために、この細胞は、適切な増力条件を使用して、24プレート内にて増殖する。微小な化合物を添加して48時間後、培地が除去され、この細胞は、カルシウムおよびマグネシウムのないダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(PBS) (Mediatech cat# 21−031−CV)で、3回洗浄される。その後、PBSは廃棄され、この細胞は、20℃で15分間、100%のメタノールを300μl使用して24ウェルプレート内に固定化される。メタノールを除去し、PBSで洗浄した後、この細胞は、3%の過酸化水素(Fisher Chemical cat#H325−100)で、5分間、21℃でインキュベートした。この細胞は、PBSで5分間、3回洗浄された後、21℃で30分間、PBS中で0.1%である300μlのウシ血清アルブミン(BSA) (Sigma cat# A−9647)でインキュベートされた。この細胞は、PBSで5分間、3回洗浄された後、300μlのアビジン溶液(Vector Laboratories cat# SP−2001)で21℃、30分間インキュベートした。この細胞は、短時間に、3回PBSですすがれた後、ビオチン溶液(Vector Laboratories cat# SP−2001)で21℃、30分間インキュベートした。この細胞は、PBSで3回洗浄された後、0.1%のPBS/BSA中のヒトIDUA (Abcam cat# ab103949)の内部配列アミノ酸244から274内の領域に生じるウサギ抗体を、ウェルあたり300μlと共に、4℃で一晩インキュベートした。21℃で5分間このプレートを平衡化した後、この細胞は、PBSでそれぞれ5分間、3回洗浄した後、0.1%のPBS/BSAで、1:200に希釈されたヤギ抗‐ウサギ抗体で、21℃、30分間インキュベートした。この細胞は、PBSで 5分間、3回洗浄された後、300μlのVectastain Elite ABC試薬A+B 溶液(Vector Laboratories cat# PK−6101)で、30分間インキュベートされた。このVectastain Elite ABC試薬A+B 溶液は、試薬Aを2滴、5mlのPBS、試薬Bを2滴連続的に添加し、混合することによって、細胞とインキュベートする前に、30分、21℃で調製された。この細胞は、21℃で、それぞれ5分間の洗浄を3回行い、その後、ジアミノベンジジン(DAB)ペルオキシダーゼ基質溶液(Vector Laboratories cat# SK−4105)で、細胞が染色するまでインキュベートした。このDABペルオキシダーゼ基質溶液は、30μ1のImmPACT(登録商標) DAB色素源の濃縮体と1mlのImmPACT(登録商標)の希釈剤を混合することによって、細胞に添加される前に再構成される。この時間、細胞は、PBSで短時間に3回洗浄され、300μlのPBSは、各ウェルに残される。この細胞の染色は、Dell Latitude D630 laptopのスクリーン上に備えられたNikon Digital−Sight 装置に連結したNikon DS−Ri1カメラが備えられたNikon Eclipse TS100倒立顕微鏡を使用して、この24ウェルプレートの内部を直接分析する。それぞれのウェルの写真は、Nikonカメラ、NIS−Elements D 3.0.にて提供されるソフトウェアを使用して作成される。
この実験の目的は、正しい患者の集団における、IDUAのmRNAをアップレギュレートするために知られている正しいオリゴヌクレオチドを同定するものである。IDUA変異は、同様に、この患者の皮膚繊維芽細胞に存在する。生体外でこのような細胞を投与することにより、IDUAの天然のアンチセンスに相補的なオリゴヌクレオチドが、この革新的な処置にて患者を助けることができることを同定する可能性がある。
物質および方法
皮膚生検は、IDUAの天然のアンチセンスに相補的なオリゴヌクレオチドを生体外で検査するための細胞培養における患者の皮膚繊維芽細胞を拡大するために、患者の同意を得て、FDA調節により実行される。この生検は、この皮膚細胞を分離するためにコラゲナーゼにて処置され、この細胞の懸濁液は、2mlのダルベッコ変法イーグル培地/F−12(Invitrogen cat#10565)と、(GIBO/Invitrogen Cat. #35−011CVからの)20%のウシ胎児血清との栄養素混合物中の6ウェルプレート内に播種される。この細胞がm、70%の集密に達するとき、これらは、2mlダルベッコ変法イーグル培地/F−12(Invitrogen cat#10565)と、(GIBO/Invitrogen Cat. #35−011CVからの)20%のウシ胎児血清との栄養素混合物中に1;4にて分けられる。これらの細胞は、IDUAのmRNAのアップレギュレートを検査するために、上記に記載されたものと同一の手順に従って、IDUAの天然のアンチセンスと相補的なオリゴヌクレオチド類を投与される。合計の細胞のmRNAは、IDUAの天然のアンチセンス転写物に相補的なオリゴヌクレオチド類を投与した後、IDRAのmRNAのアップレギュレートが確認される。これらの細胞の上清は、IDUAの天然のアンチセンス転写物に相補的なオリゴヌクレオチド類を投与した後、IDUA活性をアップレギュレートしたことが確認。
Claims (44)
- 生体系におけるα‐L‐イズロニダーゼ(IDUA)ポリヌクレオチドの機能および/または発現を調節する方法であって、
前記生体系を、5〜30個のヌクレオチドの長さの少なくとも1つのアンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させるステップであって、前記少なくとも1つのオリゴヌクレオチドが、α‐L‐イズロニダーゼ(IDUA)ポリヌクレオチドの天然のアンチセンスに対する逆相補配列と少なくとも50%の配列同一性を有する、接触させるステップを含み、
それによって、前記α‐L‐イズロニダーゼ(IDUA)ポリヌクレオチドの機能/または発現を調節する、方法。 - 請求項1に記載の生体系におけるα‐L‐イズロニダーゼ(IDUA)ポリヌクレオチドの機能および/または発現を調節する方法であって、
前記生体系を、5〜30個のヌクレオチドの長さの少なくとも1つのアンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させるステップであって、前記少なくとも1つのオリゴヌクレオチドが、天然のアンチセンス転写物ヌクレオチドの配列番号2の1番目〜2695番目または配列番号3の1番目〜2082番目または配列番号4の1番目〜322番目または配列番号5の1番目〜677番目または配列番号6の1番目〜配列番号716番目または配列番号7の1番目〜466番目または配列番号8の1番目〜1255番目または配列番号9の1番目〜2739番目範囲内の5〜30個の連続したヌクレオチドを含むポリヌクレオチドの逆相補配列と少なくとも50%の配列同一性を有する、接触させるステップを含み、
それによって、前記α‐L‐イズロニダーゼ(IDUA)ポリヌクレオチドの機能および/または発現を調節する、請求項1に記載の方法。 - 生体内または体外で患者の細胞または組織におけるα‐L‐イズロニダーゼ(IDUA)ポリヌクレオチドの機能および/または発現を調節する方法であって、
前記細胞または組織を、5〜30個のヌクレオチドの長さの少なくとも1つのアンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させるステップであって、前記オリゴヌクレオチドが、α‐L‐イズロニダーゼ(IDUA)ポリヌクレオチドのアンチセンスオリゴヌクレオチドと少なくとも50%の配列同一性を有する、接触させるステップを含み、
それによって生体内または体外で患者の細胞または組織における前記α‐L‐イズロニダーゼ(IDUA)ポリヌクレオチドの機能および/または発現を調節する、方法。 - 請求項3に記載の患者の細胞または組織におけるα‐L‐イズロニダーゼ(IDUA)ポリヌクレオチドの機能および/または発現を調節する方法であって、
前記生体系を、5〜30個のヌクレオチドの長さの少なくとも1つのアンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させるステップであって、前記少なくとも1つのオリゴヌクレオチドが、天然のアンチセンス転写物ヌクレオチドの配列番号2の1番目〜2695番目または配列番号3の1番目〜2082番目または配列番号4の1番目〜322番目または配列番号5の1番目〜677番目または配列番号6の1番目〜配列番号716番目または配列番号7の1番目〜466番目または配列番号8の1番目〜1255番目または配列番号9の1番目から2739番目の範囲内の5〜30個の連続したヌクレオチドを含むポリヌクレオチドの逆相補配列と少なくとも50%の配列同一性を有する、接触させるステップを含み、
それによって、前記α‐L‐イズロニダーゼ(IDUA)ポリヌクレオチドの機能および/または発現を調節する、請求項3に記載の方法。 - 生体系におけるα‐L‐イズロニダーゼ(IDUA)の機能および/または発現を調節する方法であって、前記生体系を、α‐L‐イズロニダーゼ(IDUA)ポリヌクレオチドの天然のアンチセンスオリゴヌクレオチドの領域を標的にする少なくとも1つのアンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させるステップを含み、それによって前記α‐L‐イズロニダーゼ(IDUA)ポリヌクレオチドの機能および/または発現を調節する、方法。
- 前記α‐L‐イズロニダーゼ(IDUA)の機能および/または発現が、対照と比較して生体内または体外で増加する、請求項5に記載の方法。
- 前記少なくとも1つのアンチセンスオリゴヌクレオチドが、α‐L‐イズロニダーゼ(IDUA)ポリヌクレオチドの天然のアンチセンス配列を標的とする、請求項5に記載の方法。
- 前記少なくとも1つのアンチセンスオリゴヌクレオチドが、α‐L‐イズロニダーゼ(IDUA)ポリヌクレオチドのコード核酸配列および/または非コード核酸配列を含む核酸配列を標的とする、請求項5に記載の方法。
- 前記少なくとも1つのアンチセンスオリゴヌクレオチドが、α‐L‐イズロニダーゼ(IDUA)ポリヌクレオチドの重複配列および/または非重複配列を標的とする、請求項5に記載の方法。
- 前記少なくとも1つのアンチセンスオリゴヌクレオチドが、少なくとも1つの修飾糖部分、少なくとも1つの修飾ヌクレオチド間結合、少なくとも1つの修飾ヌクレオシド、およびそれらの組み合わせから選択された1以上の修飾を含む、請求項5に記載の方法。
- 前記1以上の修飾が、2’−O−メトキシエチル修飾糖部分、2’−メトキシ修飾糖部分、2’−O−アルキル修飾糖部分、二環糖部分、およびそれらの組み合わせから選択された少なくとも1つの修飾糖部分を含む、請求項10に記載の方法。
- 前記1以上の修飾が、ホスホロチオエート、2’−O−メトキシエチル(MOE)、2’−フルオロ、アルキルホスホナート、ホスホロジチオアート、アルキルホスホノチオアート、ホスホルアミダート、カルバメート、炭酸塩、リン酸トリエステル、アセトアミダート、カルボキシメチルエステル、およびそれらの組み合わせから選択された少なくとも1つの修飾ヌクレオシド間結合を含む、請求項10に記載の方法。
- 前記1以上の修飾が、ペプチド核酸(PNA)、ロックド核酸(LNA)、アラビノ核酸(FANA),類似体、誘導体、およびそれらの組み合わせから選択された少なくとも1つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項10に記載の方法。
- 前記少なくとも1つのオリゴヌクレオチドが、配列番号10乃至配列番号28に記載するオリゴヌクレオチド配列を少なくとも1つ含む、請求項1に記載の方法。
- 生体内または体外で哺乳動物の細胞または組織におけるα‐L‐イズロニダーゼ(IDUA)遺伝子の機能および/または発現を調節する方法であって、
前記細胞または組織を、5〜30個のヌクレオチドの長さの少なくとも1つの低分子干渉RNA(siRNA)オリゴヌクレオチドと接触させるステップであって、前記少なくとも1つのsiRNAオリゴヌクレオチドが、α‐L‐イズロニダーゼ(IDUA)ポリヌクレオチドのアンチセンスポリヌクレオチドに対して特異的であり、前記少なくとも1つのsiRNAオリゴヌクレオチドが、前記α‐L‐イズロニダーゼ(IDUA)ポリヌクレオチドのアンチセンス核酸分子および/またはセンス核酸分子の少なくとも約5個の連続した核酸の相補配列と少なくとも50%の配列同一性を有する、接触させるステップと、
生体内または体外で哺乳動物の細胞または組織におけるα‐L‐イズロニダーゼ(IDUA)の機能および/または発現を調節するステップとを含む、方法。 - 前記オリゴヌクレオチドが、前記α‐L‐イズロニダーゼ(IDUA)ポリヌクレオチドの前記アンチセンス核酸分子および/またはセンス核酸分子に相補的な連続した少なくとも約5個の核酸の配列と少なくとも80%の配列同一性を有する、請求項15に記載の方法。
- 生体内または体外で哺乳動物の細胞または組織におけるα‐L‐イズロニダーゼ(IDUA)の機能および/または発現を調節する方法であって、
前記細胞または組織を、α‐L‐イズロニダーゼ(IDUA)ポリヌクレオチドのセンス鎖および/または天然のアンチセンス鎖の非コード配列および/またはコード配列に対して特異的な、約5〜30個のヌクレオチドの長さの少なくとも1つのアンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させるステップであって、前記少なくとも1つのアンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号1〜配列番号9に記載の少なくとも1つの核酸配列と少なくとも50%の配列同一性を有する、接触させるステップと、
生体内または体外で哺乳動物の細胞または組織における前記α‐L‐イズロニダーゼ(IDUA)の機能および/または発現を調節するステップとを含む、方法。 - 合成された修飾オリゴヌクレオチドであって、少なくとも1つの修飾を含み、
前記少なくとも1つの修飾が、少なくとも1つの修飾糖部分、少なくとも1つの修飾ヌクレオチド間結合、少なくとも1つの修飾ヌクレオチド、およびそれらの組み合わせから選択され、
前記オリゴヌクレオチドが、生体内または体外でα‐L‐イズロニダーゼ(IDUA)遺伝子にハイブリダイズし、通常の対照と比較してその機能および/または発現を調節するアンチセンス化合物であり、および
前記オリゴヌクレオチドが、前記α‐L‐イズロニダーゼ(IDUA)ポリヌクレオチドおよびアレル、ホモログ、アイソフォーム、変異型、誘導体、突然変異体、断片、またはそれらの組み合わせのアンチセンス核酸分子および/またはセンス核酸分子に相補的な少なくとも約5個の連続した核酸の配列と、少なくとも50%の配列同一性を有する、合成された修飾オリゴヌクレオチド。 - 前記オリゴヌクレオチドが、5〜30個のヌクレオチドの長さであり、かつIDUA遺伝子の天然のアンチセンス転写物内に5〜30個の連続したヌクレオチドの逆相補配列と少なくとも50%の配列同一性を有する、請求項18に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記少なくとも1つの修飾が、ホスホロチオエート、アルキルホスホナート、ホスホロジチオアート、アルキルホスホノチオアート、ホスホルアミダート、カルバメート、炭酸塩、リン酸トリエステル、アセトアミダート、カルボキシメチルエステル、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されたヌクレオチド間結合を含む、請求項19に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記オリゴヌクレオチドが、少なくとも1つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む、請求項19に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記オリゴヌクレオチドが、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合の骨格を含む、請求項19に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記オリゴヌクレオチドが少なくとも1つの修飾されたヌクレオチドを含み、該修飾されたヌクレオチドは、ペプチド核酸、ロックド核酸(LNA)、類似体、誘導体、およびそれらの組み合わせから選択されたものである、請求項19に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記オリゴヌクレオチドが複数の修飾を含み、前記複数の修飾は、ホスホロチオエート、アルキルホスホナート、ホスホロジチオアート、アルキルホスホノチオアート、ホスホラミダート、カルバメート、炭酸塩、リン酸トリエステル、アセトアミダート、カルボキシメチルエステル、およびそれらの組み合わせから選択された修飾ヌクレオチドを含む、請求項19に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記オリゴヌクレオチドが複数の修飾を含み、前記複数の修飾は、ペプチド核酸、ロックド核酸(LNA)、類似体、誘導体、およびそれらの組み合わせから選択された修飾ヌクレオチドを含む、請求項19に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記オリゴヌクレオチドが2’−O−メトキシエチル修飾糖部分、2’−メトキシ修飾糖部分、2’−O−アルキル修飾糖部分、二環糖部分、およびそれらの組み合わせから選択された少なくとも1つの修飾糖部分を含む、請求項19に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記オリゴヌクレオチドが複数の修飾を含み、前記複数の修飾は、2’−O−メトキシエチル修飾糖部分、2’−メトキシ修飾糖部分、2’−O−アルキル修飾糖部分、二環糖部分、およびそれらの組み合わせから選択された修飾糖部分を含む、請求項19に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記オリゴヌクレオチドが、約5〜30個のヌクレオチドの長さであり、かつα‐L‐イズロニダーゼ(IDUA)ポリヌクレオチドのアンチセンス鎖および/またはセンス鎖にハイブリダイズし、
前記オリゴヌクレオチドが、α‐L‐イズロニダーゼ(IDUA)ポリヌクレオチドのアンチセンスおよび/またはセンスコード核酸配列および/または非コード核酸配列の少なくとも5個の連続した核酸の相補配列と少なくとも約60%の配列同一性を有する、請求項19に記載のオリゴヌクレオチド。 - 前記オリゴヌクレオチドが、α‐L‐イズロニダーゼ(IDUA)ポリヌクレオチドのアンチセンスおよび/またはセンスコード核酸配列および/または非コード核酸配列の連続した少なくとも5個の核酸の配列に相補的な配列に対して、少なくとも約80%配列同一性を有する、請求項19に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記オリゴヌクレオチドが、生体内または体外でα‐L‐イズロニダーゼ(IDUA)ポリヌクレオチドにハイブリダイズし、通常の対照と比較してその機能および/または発現を調節する、請求項19に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記オリゴヌクレオチドが、配列番号10乃至配列番号28に記載する配列を含む、請求項19に記載のオリゴヌクレオチド。
- 医薬組成物であって、請求項18に記載の1以上のα‐L‐イズロニダーゼ(IDUA)ポリヌクレオチドに特異的な1以上のオリゴヌクレオチドと、医薬的に許容される賦形剤とを含む、医薬組成物。
- 前記オリゴヌクレオチドが、配列番号10乃至配列番号28に記載するヌクレオチド配列のいずれか1つと比較して、少なくとも約40%の配列同一性を有する、請求項32に記載の組成物。
- 前記オリゴヌクレオチドが、配列番号10乃至配列番号28に記載するヌクレオチド配列を含む、請求項32に記載の組成物。
- 配列番号10乃至配列番号28に記載する前記オリゴヌクレオチドが、1以上の修飾または置換を含む、請求項34に記載の組成物。
- 前記1以上の修飾が、ホスホロチオエート、メチルホスホナート、ペプチド核酸、ロックド核酸(LNA)分子、およびそれらの組み合わせから選択されたものである、請求項35に記載の組成物。
- 少なくとも1つのα‐L‐イズロニダーゼ(IDUA)ポリヌクレオチドおよび/または少なくとも1つのそのコードされた生成物に関連する疾患を予防または治療する方法であって、
少なくとも1つのα‐L‐イズロニダーゼ(IDUA)ポリヌクレオチドの天然のアンチセンス配列に結合し、かつ前記少なくとも1つのα‐L‐イズロニダーゼ(IDUA)ポリヌクレオチドの発現を調節する、少なくとも1つのアンチセンスオリゴヌクレオチドを治療上有効な用量を患者に投与するステップを含み、
それによって、前記少なくとも1つのα‐L‐イズロニダーゼ(IDUA)ポリヌクレオチドおよび/または少なくとも1つのそのコードされた生成物に関連する疾患を予防または治療する、方法。 - 前記少なくとも1つのα‐L‐イズロニダーゼ(IDUA)ポリヌクレオチドに関連する疾患が、α‐L‐イズロニダーゼ;ムコ多糖症I(MPS)の異常機能および/または発現に関連する疾患または障害、へパラン硫酸およびデルマタン硫酸の異常値に関連する疾患または障害、神経性疾患または障害、神経変性疾患または障害、長期記憶障害、ハーラー症候群、ハーラー・シャイエ症候群、シャイエ症候群などから選択されたものである、請求項37に記載の方法。
- 生体内投与のための選択された標的ポリヌクレオチドとして、IDUA遺伝子の天然のアンチセンス転写物に対して選択的な少なくとも1つのオリゴヌクレオチドを特定して、選択する方法であって、
前記選択された標的ポリヌクレオチドに対してアンチセンスであるポリヌクレオチドと少なくとも部分的に相補的な、少なくとも5個の連続したヌクレオチドを含む、少なくとも1つのオリゴヌクレオチドを特定するステップと、
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下での、前記標的ポリヌクレオチドまたは前記選択された標的ポリヌクレオチドに対してアンチセンスであるポリヌクレオチドとアンチセンスオリゴヌクレオチドとのハイブリッドの熱融解温度を測定するステップと、
得られた情報に基づいて、生体内投与のための少なくとも1つのオリゴヌクレオチドを選択するステップとを含む、方法。 - 処置する必要のある患者のIDUAポリヌクレオチドの発現もしくは発現産物を増加させる方法であって、前記患者の前記IDUAポリヌクレオチドの天然のアンチセンス転写物と逆相補的に、少なくとも50%同一であるオリゴヌクレオチドを投与することを含み、対照と比較したIDUA発現における増加は、約10パーセント以上である、方法。
- 対照と比較した発現における前記増加が、約15パーセント以上である、請求項1に記載の方法。
- 対照と比較した発現における前記増加が、約19パーセント以上である、請求項1に記載の方法。
- 対照と比較した発現における前記増加が、約25パーセント以上である、請求項1に記載の方法。
- IDUAの機能の欠損を有する患者を同定することと、、IDUAの機能の欠損を有する患者から細胞もしくは組織を選択することと、複数のオリゴヌクレオチド類で前記細胞もしくは組織を処置することと、前記細胞もしくは組織におけるIDUA発現の増加のパーセンテージを決定することと、前記患者に投与する前記オリゴヌクレオチドを選択することを含む、IDUA関連疾患もしくは障害の処置の必要のある患者を治療するオリゴヌクレオチドを同定し、選択する方法。
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