JP2014051497A - ナイセリアタンパク質のハイブリッドおよびタンデム発現 - Google Patents

Abstract

【課題】ナイセリアタンパク質の発現のための代替アプローチおよび改良されたアプローチの提供。
【解決手段】ハイブリッドタンパク質であって、以下の化学式：ＮＨ_２−Ａ−［−Ｘ−Ｌ−］_ｎ−Ｂ−ＣＯＯＨを有するハイブリッドタンパク質。［Ｌは任意のリンカーアミノ酸配列、Ａは任意のＮ末端アミノ酸配列、Ｂは任意のＣ末端アミノ酸配列、およびｎは１よりも大きな整数であり、ならびにＸは：（ａ）特定の配列からなるｏｒｆアミノ酸配列；（ｂ）（ａ）由来のアミノ酸配列と配列同一性を有するアミノ酸配列；または、（ｃ）（ａ）由来のアミノ酸配列のフラグメントを含むアミノ酸配列、のいずれかである］
【選択図】なし

Description

本明細書中で引用される全ての文献は、その全体が参考として援用される。

本発明は、タンパク質発現の分野における発明である。特に、ナイセリア属（例えば、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅまたは好ましくは、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来のタンパク質の発現に関連する。

参考文献１および２は、参考文献３〜６に開示されたナイセリアタンパク質の発現のための代替アプローチおよび改良されたアプローチを開示している。そのような方法の一つは、２以上のナイセリアタンパク質が単一のポリペプチド鎖として発現される「ハイブリッド」タンパク質の産生である。このアプローチは、２つの利点を提供する。第１に、単独では不安定であり得るか、またはほとんど発現されないかもしれないタンパク質は、この問題を克服する適切なハイブリッドパートナーの付加によって補助され得る。第２に、商業製造は、別個に有用な２種のタンパク質を産生するために、１つの発現および精製のみを用いることを必要とするので、単純化される。

本発明の目的は、ナイセリアタンパク質の発現のための代替アプローチおよび改良されたアプローチをさらに提供することである。

（発明の開示）
本発明により、以下が提供される：
（項目１）
ハイブリッドタンパク質であって、該ハイブリッドタンパク質は、以下の化学式：
ＮＨ_２−Ａ−［−Ｘ−Ｌ−］_ｎ−Ｂ−ＣＯＯＨ
を有し、ここで、Ｌは任意のリンカーアミノ酸配列、Ａは任意のＮ末端アミノ酸配列、Ｂは任意のＣ末端アミノ酸配列、およびｎは１よりも大きな整数であり、ならびにＸは以下：
（ａ）ｏｒｆ１アミノ酸配列、ｏｒｆ４アミノ酸配列、ｏｒｆ２５アミノ酸配列、ｏｒｆ４０アミノ酸配列、ｏｒｆ４６．１アミノ酸配列、ｏｒｆ８３アミノ酸配列、ＮＭＢ１３４３アミノ酸配列、２３０アミノ酸配列、２３３アミノ酸配列、２８７アミノ酸配列、２９２アミノ酸配列、５９４アミノ酸配列、６８７アミノ酸配列、７３６アミノ酸配列、７４１アミノ酸配列、９０７アミノ酸配列、９１９アミノ酸配列、９３６アミノ酸配列、９５３アミノ酸配列、９６１アミノ酸配列または９８３アミノ酸配列；
（ｂ）（ａ）由来のアミノ酸配列と配列同一性を有するアミノ酸配列；または、
（ｃ）（ａ）由来のアミノ酸配列のフラグメントを含むアミノ酸配列、
のいずれかである、ハイブリッドタンパク質。
（項目２）
ハイブリッドタンパク質であって、該ハイブリッドタンパク質は、以下の化学式：
ＮＨ_２−Ａ−［−Ｘ−Ｌ−］_ｎ−Ｂ−ＣＯＯＨ
を有し、ここで、Ｘはアミノ酸配列、Ｌは任意のリンカーアミノ酸配列、Ａは任意のＮ末端アミノ酸配列、Ｂは任意のＣ末端アミノ酸配列、およびｎは１よりも大きな整数であり、ここで、第１のＸ部分（−Ｘ_ａ−）は以下のアミノ酸配列：
（ｄ）参考文献３に開示される４４６個の配列番号の偶数のもの（すなわち、２、４、６、．．．、８９０、８９２）；
（ｅ）参考文献４に開示される４５個の配列番号の偶数のもの（すなわち、２、４、６、．．．、８８、９０）；
（ｆ）参考文献５に開示される１６７４個の配列番号２〜３０２０の偶数のもの、配列番号３０４０〜３１１４の偶数のもの、および配列番号３１１５〜３２４１のすべて；
（ｇ）参考文献７からの２１６０アミノ酸配列ＮＭＢ０００１〜ＮＭＢ２１６０；もしくは、
（ｈ）参考文献１または参考文献２に開示されるアミノ酸配列
のいずれかならびに第２のＸ部分（−Ｘ_ｂ−）を有し、ここで、−Ｘ_ｂ−は−Ｘ_ａ−と配列同一性を有するおよび／または−Ｘ_ｂ−は−Ｘ_ａ−のフラグメントを含む、ハイブリッドタンパク質。
（項目３）
項目１または項目２に記載のハイブリッドタンパク質であって、ここでｎ＝２である、ハイブリッドタンパク質。
（項目４）
項目２に記載のハイブリッドタンパク質であって、−Ｘ_ａ−はｏｒｆ４６．１アミノ酸配列、２３０アミノ酸配列、２８７アミノ酸配列、７４１アミノ酸配列、９１９アミノ酸配列、９３６アミノ酸配列、９５３アミノ酸配列、９６１アミノ酸配列または９８３アミノ酸配列である、ハイブリッドタンパク質。
（項目５）
項目２に記載のハイブリッドタンパク質であって、Ｘ_１、．．．、Ｘ_ｎは全て互いと配列同一性を有する、ハイブリッドタンパク質。
（項目６）
項目１〜５のいずれか１項に記載のハイブリッドタンパク質であって、ここでｎ＝２であり、かつ前記Ｘ部分は以下：
ΔＧ２８７および２３０；ΔＧ２８７および９３６；ΔＧ２８７および７４１；９６１ｃおよび２８７；９６１ｃおよび２３０；９６１ｃおよび９３６；９６１ｃＬおよび２８７；９６１ｃＬおよび２３０；９６１ｃＬおよび９３６；ＯＲＦ４６．１および９３６；ＯＲＦ４６．１および２３０；２３０および９６１；２３０および７４１；９３６および９６１；９３６および７４１；ΔＧ７４１および７４１；またはΔＧ２８７および２８７
である、ハイブリッドタンパク質。
（項目７）
項目１〜６のいずれか１項に記載のハイブリッドタンパク質であって、Ｌは、２０以下のアミノ酸を有する、ハイブリッドタンパク質。
（項目８）
項目１〜７のいずれか１項に記載のハイブリッドタンパク質であって、Ｌは、ポリグリシンリンカーである、ハイブリッドタンパク質。
（項目９）
項目１〜８のいずれか１項に記載のハイブリッドタンパク質であって、Ａは、４０以下のアミノ酸を有する、ハイブリッドタンパク質。
（項目１０）
項目１〜９のいずれか１項に記載のハイブリッドタンパク質であって、Ｂは、４０以下のアミノ酸を有する、ハイブリッドタンパク質。
（項目１１）
項目１〜１０のいずれか１項に記載のハイブリッドタンパク質であって、−Ｘ−部分は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｂにおいて見出されたアミノ酸配列を有する、ハイブリッドタンパク質。
（項目１２）
項目１〜１１のいずれか１項に記載のハイブリッドタンパク質であって、少なくとも１つの−Ｘ−部分は、１以上のドメインが欠失した９６１アミノ酸配列である、ハイブリッドタンパク質。
（項目１３）
配列番号１番〜３８番からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、タンパク質。
（項目１４）
項目１〜１３のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする、核酸。
（項目１５）
項目１〜１４のいずれか１項に記載のタンパク質または核酸を含む、組成物。
（項目１６）
組成物であって、２以上の以下のタンパク質：
（１）２８７
（２）７４１
（３）ＯＲＦ４６．１
（４）９６１
（５）ＮＨ_２−Ａ−［−Ｘ−Ｌ−］_ｎ−Ｂ−ＣＯＯＨであり、ここでｎ＝２、Ｘ_１＝２８７、Ｘ_２＝９５３である
（６）ＮＨ_２−Ａ−［−Ｘ−Ｌ−］_ｎ−Ｂ−ＣＯＯＨであり、ここでｎ＝２、Ｘ_１＝２８７、Ｘ_２＝９１９である
（７）ＮＨ_２−Ａ−［−Ｘ−Ｌ−］_ｎ−Ｂ−ＣＯＯＨであり、ここでｎ＝２、Ｘ_１＝２８７、Ｘ_２＝９６１である
（８）ＮＨ_２−Ａ−［−Ｘ−Ｌ−］_ｎ−Ｂ−ＣＯＯＨであり、ここでｎ＝２、Ｘ_１＝２８７、Ｘ_２＝７４１である
（９）ＮＨ_２−Ａ−［−Ｘ−Ｌ−］_ｎ−Ｂ−ＣＯＯＨであり、ここでｎ＝２、Ｘ_１＝９３６、Ｘ_２＝７４１である
を含む、組成物。
（項目１７）
項目１６に記載の組成物であって、タンパク質（４）（５）および（９）を含む、組成物。
（項目１８）
項目１７に記載の組成物であって、ここで、タンパク質（４）は配列番号３１を含み、タンパク質（５）は配列番号２８または配列番号２９を含み、タンパク質（９）は配列番号３０を含む、組成物。
（項目１９）
項目１５〜１８のいずれか１項に記載の組成物であって、さらに、以下：
−Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のタンパク質抗原；
−Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の外膜小胞（ＯＭＶ）調製物；
−Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の糖類抗原；
−Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来の糖類抗原；
−Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、および／もしくはＣ型肝炎ウイルス由来の抗原；
−Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ由来の抗原；
−ジフテリア抗原；
−破傷風抗原；
−Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ由来のタンパク質抗原；
−Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ由来の糖類抗原；
−Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ由来の抗原；
−Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来の抗原；
−Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ由来の抗原；
−Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ由来の抗原；
−ポリオ抗原；
−狂犬病抗原；
−はしか抗原、耳下腺炎抗原、および／もしくは風疹抗原；
−インフルエンザ抗原；
−Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ由来の抗原；
−Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ由来の抗原；
−Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来の抗原；ならびに／または、
−Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ由来の抗原、
を含む、組成物。
（項目２０）
項目１５〜１９のいずれか１項に記載の組成物であって、さらに、薬学的に受容可能なキャリアを含む、組成物。
（項目２１）
項目２０に記載の組成物であって、医薬として使用するための、組成物。
（項目２２）
患者を処置する方法であって、治療的有効量の項目２０に記載の組成物を患者に投与する工程を包含する、方法。

（ハイブリッドタンパク質）
本発明は、２以上（例えば、３、４、５、６またはそれより多く）のナイセリアタンパク質の同時発現のための方法を提供し、この方法では、前記の２以上のタンパク質が単一のポリペプチド鎖として翻訳されたように結合している。一般に、本発明のハイブリッドタンパク質は、以下の式：ＮＨ_２−Ａ−［−Ｘ−Ｌ−］_ｎ−Ｂ−ＣＯＯＨ
によって表され得、ここで、Ｘはアミノ酸配列であり、Ｌは任意のリンカーアミノ酸配列であり、Ａは任意のＮ末端アミノ酸配列であり、Ｂは任意のＣ末端アミノ酸配列であり、そしてｎは１よりも大きな整数である。

ｎの値は、２とｘとの間であり、このｘの値は、典型的には、３、４、５、６、７、８、９または１０である。好ましくは、ｎは２、３または４である；さらに好ましくは、２または３である；最も好ましくは、ｎ＝２である。

（−Ｘ−部分）
本発明によるハイブリッドタンパク質には、主要な２群がある。これらの２群は相互に排他的ではない。

第１の群において、各−Ｘ−部分は、
（ａ）ｏｒｆ１アミノ酸配列、ｏｒｆ４アミノ酸配列、ｏｒｆ２５アミノ酸配列、ｏｒｆ４０アミノ酸配列、ｏｒｆ４６．１アミノ酸配列、ｏｒｆ８３アミノ酸配列、ＮＭＢ１３４３アミノ酸配列、２３０アミノ酸配列、２３３アミノ酸配列、２８７アミノ酸配列、２９２アミノ酸配列、５９４アミノ酸配列、６８７アミノ酸配列、７３６アミノ酸配列、７４１アミノ酸配列、９０７アミノ酸配列、９１９アミノ酸配列、９３６アミノ酸配列、９５３アミノ酸配列、９６１アミノ酸配列または９８３アミノ酸配列；
（ｂ）（ａ）由来のアミノ酸配列に対する配列同一性を有するアミノ酸配列；または、
（ｃ）（ａ）由来のアミノ酸配列のフラグメントを含有するアミノ酸配列、
である。

（ａ）の好ましいサブセットは：ｏｒｆ４６．１、２３０、２８７、７４１、９１９、９３６、９５３、９６１および９８３である。（ａ）のさらに好ましいサブセットは：ｏｒｆ４６．１、２８７、７４１および９６１である。図３は、好ましいハイブリッドタンパク質を示す。

第２の群において、ハイブリッドタンパク質は、第１の−Ｘ−部分（−Ｘ_ａ−）および第２の−Ｘ−部分（−Ｘ_ｂ−）を含有する。この−Ｘ_ａ−部分は、以下のアミノ酸配列の１つを有する：
（ｄ）参考文献３に開示の４４６の偶数配列番号（すなわち、２、４、６、．．．、８９０、８９２）；
（ｅ）参考文献４に開示の４５の偶数配列番号（すなわち、２、４、６、．．．、８８、９０）；
（ｆ）参考文献５に開示の１６７４の偶数配列番号２〜３０２０、偶数配列番号３０４０〜３１１４、および全配列番号３１１５〜３２４１；
（ｇ）参考文献７由来の２１６０のアミノ酸配列ＮＭＢ０００１〜ＮＭＢ２１６０；または、
（ｈ）参考文献１もしくは参考文献２に開示のアミノ酸配列。

−Ｘ_ｂ−部分は、以下のように−Ｘ_ａ−に関連する：
（ｉ）−Ｘ_ｂ−は−Ｘ_ａ−に対する配列同一性を有し、および／または
（ｊ）−Ｘ_ｂ−は−Ｘ_ａ−のフラグメントを含有する。

この第２のタイプのハイブリッドタンパク質の例は、２種以上の−Ｘ−部分が同一であるようなタンパク質、またはこれらが同じタンパク質の改変体（例えば、同じタンパク質の２種の多型形態は、−Ｘ_ａ−Ｘ_ｂ−として発現され得、そして３種の多型形態は−Ｘ_ａ−Ｘ_ｂ−Ｘ_ｃ−として発現され得るなど）であるようなタンパク質を含む。

−Ｘ_ａ−および−Ｘ_ｂ−部分は、Ｎ末端からＣ末端までのいずれかの順番で存在し得る。

−Ｘ_ａ−部分は、好ましくは、ｏｒｆ１アミノ酸配列、ｏｒｆ４アミノ酸配列、ｏｒｆ２５アミノ酸配列、ｏｒｆ４０アミノ酸配列、ｏｒｆ４６．１アミノ酸配列、ｏｒｆ８３アミノ酸配列、ＮＭＢ１３４３アミノ酸配列、２３０アミノ酸配列、２３３アミノ酸配列、２８７アミノ酸配列、２９２アミノ酸配列、５９４アミノ酸配列、６８７アミノ酸配列、７３６アミノ酸配列、７４１アミノ酸配列、９０７アミノ酸配列、９１９アミノ酸配列、９３６アミノ酸配列、９５３アミノ酸配列、９６１アミノ酸配列または９８３アミノ酸配列である。−Ｘ_ａ−部分は、さらに好ましくは、ｏｒｆ４６．１アミノ酸配列、２３０アミノ酸配列、２８７アミノ酸配列、７４１アミノ酸配列、９１９アミノ酸配列、９３６アミノ酸配列、９５３アミノ酸配列、９６１アミノ酸配列または９８３アミノ酸配列である。−Ｘ_ａ−部分は、最も好ましくは、ｏｒｆ４６．１、２８７アミノ酸配列、７４１アミノ酸配列または９６１アミノ酸配列である。

ｎ個の−Ｘ−部分の各々が、互いの−Ｘ−部分に対する配列同一性を共有するタンパク質において、そのタンパク質は「タンデムタンパク質」といわれる。ｎ＝２であるタンデムタンパク質が好ましい。

（ｂ）および（ｉ）に言及された「配列同一性」の程度は、好ましくは、５０％より大きい（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％以上、１００％まで）。これは、変異体、ホモログ、オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）、対立遺伝子、改変体などを含む［例えば、参考文献８を参照のこと］。同一性は、好ましくは、ギャップオープンペナルティー＝１２およびギャップ伸長ペナルティー＝１のパラメータを用いたアフィンギャップ検索を使用して、ＭＰＳＲＣＨプログラム（Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）で履行されるＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムによって決定される。典型的には、２つのタンパク質間において、５０％以上の同一性は機能的等価性の指標と見なされる。

（ｃ）および（ｊ）に示された「フラグメント」は、（ａ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）または（ｈ）のアミノ酸配列由来の最低ｍ個連続したアミノ酸からなるべきであり、特定の配列によって、ｍは７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００またはそれより多く）である。

好ましくは、このフラグメントは、（ａ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）または（ｈ）のアミノ酸配列由来のエピトープを含有する。好ましいフラグメントは、参考文献９および１０に開示されたフラグメントである。

好ましい（ｃ）および（ｊ）のフラグメントは、Ｃ末端短縮物および／またはＮ末端短縮物（例えば、Δ１−２８７、Δ２−２８７など）である。

好ましい（ｂ）、（ｃ）、（ｉ）および（ｊ）の配列は、ポリグリシン配列が削除されている。これは、発現を補助することが見出されている［参考文献２］。ポリグリシン配列は、（Ｇｌｙ）_ｇと表され得、ここで、ｇ≧３（例えば、４、５、６、７、８、９またはそれより多く）である。もし−Ｘ−部分が、その野生型形態においてポリグリシン配列を含有するならば、本発明のハイブリッドタンパク質において、この配列を削除するのが好ましい。これは、（Ｇｌｙ）_ｇを（欠失（例えば、ＣＧＧＧＧＳ→ＣＧＧＧＳ、ＣＧＧＳ、ＣＧＳまたはＣＳ）によって、置換（例えば、ＣＧＧＧＧＳ→ＣＧＸＧＧＳ、ＣＧＸＸＧＳ、ＣＧＸＧＸＳなど）によって、および／または挿入（例えば、ＣＧＧＧＧＳ→ＣＧＧＸＧＧＳ、ＣＧＸＧＧＧＳ、など）によって）破壊または除去することによって行われ得る。（Ｇｌｙ）_ｇの欠失が好ましく、ポリグリシン配列まで、およびこの配列を含むタンパク質Ｎ末端部分の欠失（例えば、配列番号１における残基１〜３２の欠失）を、本明細書中で「ΔＧ」と呼ぶ。ポリグリシンの削除は、タンパク質２８７、タンパク質７４１、タンパク質９８３およびＴｂｐ２にとって特に有用である（ΔＧ２８７、ΔＧ７４１、ΔＧ９８３およびΔＧＴｂｐ２−参考文献１および２）。

好ましい（ｃ）および（ｊ）フラグメントは、完全なタンパク質ドメインが削除されている。これは、タンパク質９６１、タンパク質２８７、およびＯＲＦ４６にとって特に有用である。一旦タンパク質がドメインへ概念的に分割されると、（ｃ）および（ｊ）フラグメントは、これらのドメインの１つ以上を削除し得る（例えば、２８７Ｂ、２８７Ｃ、２８７ＢＣ、ＯＲＦ４６_{１−４３３}、ＯＲＦ４６_{４３４−６０８}、９６１ｃ−参考文献２；本明細書中の図４および図５）。

２８７タンパク質は、３ドメインへ概念的に分割され、それらはＡ、ＢおよびＣと呼ばれる（参考文献２の図５を参照のこと）。ドメインＢはＩｇＡプロテアーゼと整列し、ドメインＣはトランスフェリン結合タンパク質と整列し、ドメインＡはデータベースの配列との強い整列は見られなかった。２８７の多型形態の整列は、参考文献８に開示されている。

ＯＲＦ４６は、２ドメインへ概念的に分割される−第１のドメイン（アミノ酸１〜４３３；ＯＲＦ４６．１）は、種間および血清群間でよく保存されており、第２のドメイン（アミノ酸４３４〜６０８）は、あまり保存されていない。第２のドメインは、好ましくはＯＲＦ４６．１を残して欠失される。ＯＲＦ４６の多型形態の整列は、参考文献８に開示されている。

９６１タンパク質は、いくつかのドメインへ概念的に分割される（図４）。

もし−Ｘ−部分が、その野生型形態においてリーダーペプチド配列を含有するならば、本発明のハイブリッドタンパク質において、この配列は包含または削除され得る。リーダーペプチドが削除される場合、これは（ｃ）および（ｊ）の中のアミノ酸配列の好ましい例である。１つの実施形態において、リーダーペプチドは、ハイブリッドタンパク質のＮ末端に位置する−Ｘ−部分のリーダーペプチド以外は欠失される。すなわち、Ｘ_１のリーダーペプチドは保持されるが、Ｘ_２．．．Ｘ_ｎのリーダーペプチドは削除される。これは、全てのリーダーペプチドを欠失し、Ｘ_１のリーダーペプチドを部分−Ａ−として使用することと等価である。

ｎ＝２のとき、−Ｘ−部分の好ましいペアは：ΔＧ２８７および２３０；ΔＧ２８７および９３６；ΔＧ２８７および７４１；９６１ｃおよび２８７；９６１ｃおよび２３０；９６１ｃおよび９３６；９６１ｃＬおよび２８７；９６１ｃＬおよび２３０；９６１ｃＬおよび９３６；ＯＲＦ４６．１および９３６；ＯＲＦ４６．１および２３０；２３０および９６１；２３０および７４１；９３６および９６１；９３６および７４１である。ｎ＝２のとき、タンデムタンパク質にとって好ましい−Ｘ−部分のペアは：ΔＧ７４１および７４１；ΔＧ２８７および２８７である。さらに詳細には、ｎ＝２のとき以下のＸ_１およびＸ_２の組み合わせが好ましい：

２８７が全長形態で用いられる場合、ハイブリッドタンパク質のＣ末端に位置するのが好ましい；もしＮ末端で用いられるべき場合、２８７のΔＧ形態を用いるのが好ましい。同様に、７４１が全長形態で用いられる場合、ハイブリッドタンパク質のＣ末端に位置するのが好ましい；もしＮ末端で用いられる場合、７４１のΔＧ形態を用いるのが好ましい。

（−Ｌ−部分）
［−Ｘ−Ｌ−］の各ｎ例について、リンカーアミノ酸配列−Ｌ−は、存在してもよく、存在しなくてもよい。例えば、ｎ＝２のとき、ハイブリッドはＮＨ_２−Ｘ_１−Ｌ_１−Ｘ_２−Ｌ_２−ＣＯＯＨ、ＮＨ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−ＣＯＯＨ、ＮＨ_２−Ｘ_１−Ｌ_１−Ｘ_２−ＣＯＯＨ、ＮＨ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｌ_２−ＣＯＯＨ、などであり得る。

リンカーアミノ酸配列−Ｌ−は、典型的に短い（例えば、２０またはもっと少数のアミノ酸、すなわち１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１）。例としては、クローニングを容易にする短いペプチド配列、ポリグリシンリンカー（すなわちＧｌｙ_ｎであって、ここでｎ＝２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多く）およびヒスチジンタグ（すなわちＨｉｓ_ｎであって、ここでｎ＝３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多く）を含有する。その他の適切なリンカーアミノ酸配列は、当業者に明らかである。有用なリンカーは、ＧＳＧＧＧＧ（配列番号２７）であり、Ｇｌｙ−ＳｅｒジペプチドがＢａｍＨＩ制限酵素部位から形成されており、従って、クローニングおよび操作を補助しており、そして、Ｇｌｙ_４テトラペプチドは典型的なポリグリシンリンカーである。

もし、Ｘ_ｎ＋１がΔＧタンパク質であり、且つＬ_ｎがグリシンリンカーである場合、これは、Ｘ_ｎ＋１がΔＧタンパク質ではなく、且つＬ_ｎが不在であることと等価であり得る。

（−Ａ−部分）
−Ａ−は、任意のＮ末端アミノ酸配列である。これは、典型的には短い（例えば、４０またはもっと少数のアミノ酸、すなわち３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１）。例としては、タンパク質の輸送を導くためのリーダー配列、または、クローニングもしくは精製を容易にする短いペプチド配列（例えば、ヒスチジンタグ、すなわちＨｉｓ_ｎであって、ここでｎ＝３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多く）が挙げられる。その他の適切なＮ末端アミノ酸配列は、当業者に明らかである。Ｘ_１がそれ自体のＮ末端メチオニンを欠くならば、−Ａ−はメチオニン残基であり得る。

（−Ｂ−部分）
−Ｂ−は、任意のＣ末端アミノ酸配列である。これは、典型的には短い（例えば、４０またはもっと少数のアミノ酸、すなわち３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１）。例としては、タンパク質の輸送を導くための配列、クローニングもしくは精製を容易にする短いペプチド配列（例えば、ヒスチジンタグ、すなわちＨｉｓ_ｎであって、ｎ＝３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多くを含む）、またはタンパク質の安定性を高める配列が挙げられる。その他の適切なＣ末端アミノ酸配列は、当業者に明らかである。

（タンパク質の多型形態）
本発明は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの任意の株由来のアミノ酸配列を使用し得る。従って、特定のタンパク質（例えば、「２８７」または「ＯＲＦ４６．１」）に対する言及は、任意の株由来のそのタンパク質を含む。株間の配列バリエーションは、（ｂ）、（ｃ）、（ｉ）および（ｊ）に含まれる。

Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｂ由来の参照配列は、以下を含む：

参考文献８は、タンパク質ＯＲＦ４、タンパク質ＯＲＦ４０、タンパク質ＯＲＦ４６、タンパク質２２５、タンパク質２３５、タンパク質２８７、タンパク質５１９、タンパク質７２６、タンパク質９１９およびタンパク質９５３の多型形態を開示している。９６１の多型形態は、参考文献１１および１２に開示されている。これらの多型形態のいずれもが、本発明に従って使用され得る。

本明細書中の配列表は、タンパク質７４１の多型形態（配列番号１〜２２）およびタンパク質ＮＭＢ１３４３の多型形態（配列番号２３〜２４）を包含し、それらは同定されている。

（血清群および株）
本発明の好ましいタンパク質は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｂにおいて見出されたアミノ酸配列を有する−Ｘ−部分を含有する。本発明の１つのタンパク質の中で、個々の−Ｘ−部分は１以上の株由来であり得る。例えば、ｎ＝２の場合、Ｘ_２は、Ｘ_１と同じ株由来または異なる株由来であり得る。ｎ＝３の場合、その株は、（ｉ）Ｘ_１＝Ｘ_２＝Ｘ_３、（ｉｉ）Ｘ_１＝Ｘ_２≠Ｘ_３、（ｉｉｉ）Ｘ_１≠Ｘ_２＝Ｘ_３、（ｉｖ）Ｘ_１≠Ｘ_２≠Ｘ_３、（ｖ）Ｘ_１＝Ｘ_３≠Ｘ_２、などであり得る。

血清群Ｂの中で、好ましい−Ｘ−部分は、株２９９６、株ＭＣ５８、株９５Ｎ４７７、または株３９４／９８由来である。株９５Ｎ４７７は、その電気泳動タイプにより、本明細書中で時々「ＥＴ３７」と呼ばれる。株３９４／９８は、ニュージーランド株であるので、本明細書中で時々「ｎｚ」と呼ばれる。

２８７の形態が使用される場合、これは、好ましくは、株２９９６由来または株３９４／９８由来である。

７４１の形態が使用される場合、これは、好ましくは、血清群Ｂの株ＭＣ５８、２９９６、３９４／９８、または９５Ｎ４７７由来、もしくは血清群Ｃの株９０／１８３１１由来である。

９６１の形態が使用される場合、これは、好ましくは、株２９９６由来である。

株は、下付き文字として表示され、例えば、７４１_ＭＣ５８は、株ＭＣ５８由来のタンパク質７４１である。他に言及しない限り、本明細書中に記載されたタンパク質（例えば、下付き文字の無いタンパク質）は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ株２９９６由来であり、この株は「基準」株と解釈され得る。しかしながら、本発明は、一般に株によって制限されないと認識される。前述のように、タンパク質（例えば、「２８７」、「９１９」など）に対する一般的言及は、任意の株由来のそのタンパク質を包含すると解釈され得る。これは、典型的に、２９９６に対する９０％以上（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれより上）の配列同一性を有する。

（タンパク質９６１のドメインに基づいた表現）
参考文献１および２は、どのようにタンパク質が概念的にドメインに分割され得、そしてどのようにこれらのドメインに基づいて操作され得るかを開示している。本発明は、タンパク質９６１（「ＮａｄＡ」としても知られる［１１、１２］）へとこのアプローチの適用を拡大する。

Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｂ株２９９６において、ＮａｄＡは、４０５アミノ酸を有する。このタンパク質は、概念的に以下の９ドメインに分割されている（図４）：

この情報は、他の９６１形態における同じドメインを位置付けるために使用され得る。

これらのドメインは、株２９９６における９６１から種々の様式で欠失している（図５）。好ましい９６１のフラグメントは、これらの９ドメインのうち１つ以上（例えば以下：
−９６１−２〜９６１−５（「９６１ａ」）
−９６１−６〜９６１−９（「９６１ｂ」）
−９６１−１〜９６１−８（「９６１ｃＬ」）
−９６１−２〜９６１−８（「９６１ｃ」）
−９６１−２〜９６１−６および９６１−７ドメイン由来のアミノ酸２８７−３２５（「９６１ｄ」）
−９６１−２〜９６１−８および９６１−９ドメイン由来のアミノ酸３５１−３８３（「９６１Δ１」）
−９６１−１〜９６１−８および９６１−９ドメイン由来のアミノ酸３５１−３８３（「９６１Δ１Ｌ」）
−９６１−１〜９６１−７および９６１−８ドメイン由来のアミノ酸３３１−３４３（「９６１ｃＬ−Δａｒｏ」）
−９６１−１〜９６１−６および９６１−７ドメイン由来のアミノ酸２８７−３１５（「９６１ｃＬ−Δｃｃ」）
−９６１−１〜９６１−５（「９６１ａＬ」）
−９６１−１〜９６１−４（「９６１ａＬ−Δ１」）
−９６１−１〜９６１−３（「９６１ａＬ−Δ２」）
−９６１−１〜９６１−２（「９６１ａＬ−Δ３」）
）を省略する。

これらの１３のフラグメント（および、片側または両側の末端で１、２、３、４または５アミノ酸を欠失しているサブフラグメント）は、好ましい（ｃ）フラグメントおよび（ｊ）フラグメントであるが、それらはまた、本発明のハイブリッドタンパク質の形態ではなく、本来の状態で発現され得る。従って、本発明は、これらのフラグメントの１つを含有するタンパク質を提供するが、ただし、そのタンパク質は全長の９６１ではなく、参考文献１または参考文献２に明確に開示されたタンパク質ではない。このタンパク質は、融合タンパク質（例えば、ＧＳＴ−融合物またはＨｉｓ−ｔａｇ融合物）であり得る。

（配列）
本発明はまた、配列番号１〜２４のアミノ酸配列を有するタンパク質も提供する。本発明はまた、これらと配列同一性を有するタンパク質および核酸も提供する。前述のように、「配列同一性」の程度は、好ましくは５０％より大きい（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれ以上）。

本発明はまた、そのようなタンパク質をコードしている核酸も提供する。

さらに本発明は、好ましくは「高いストリンジェンシー」条件下（例えば、０．１％×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ中、６５℃）で、この核酸とハイブリダイズし得る核酸を提供する。

本発明はまた、本発明によるタンパク質をコードしている核酸も提供する。

本発明が、前述の配列と相補的な配列を含有する核酸を提供することも、理解されるべきである（例えば、アンチセンスまたはプローブの目的のために）。

本発明による核酸は、もちろん、多様な方法（例えば、化学合成によって、ゲノムまたはｃＤＮＡライブラリー由来、生物体自身由来、など）で調製され得、また、種々の形態（例えば、一本鎖、二本鎖、ベクター、プローブ、など）をとり得る。

さらに、用語「核酸」は、ＤＮＡおよびＲＮＡならびにそれらの修飾された骨格を含むアナログ、ならびにペプチド核酸（ＰＮＡ）なども含む。

（混合物）
本発明はまた、以下のタンパク質のうちの２つ以上（すなわち、２、３、４、５、６、または７）を含有する組成物も提供する：
（１）２８７
（２）７４１
（３）ＯＲＦ４６．１
（４）９６１
（５）ＮＨ_２−Ａ−［−Ｘ−Ｌ−］_ｎ−Ｂ−ＣＯＯＨ（ここで、ｎ＝２、Ｘ_１＝２８７、Ｘ_２＝９５３）
（６）ＮＨ_２−Ａ−［−Ｘ−Ｌ−］_ｎ−Ｂ−ＣＯＯＨ（ここで、ｎ＝２、Ｘ_１＝２８７、Ｘ_２＝９１９）
（７）ＮＨ_２−Ａ−［−Ｘ−Ｌ−］_ｎ−Ｂ−ＣＯＯＨ（ここで、ｎ＝２、Ｘ_１＝２８７、Ｘ_２＝９６１）
前記混合物は、（１）〜（７）の２つ以上との組み合わせ、もしくは（１）〜（７）の１つだけとの組み合わせのいずれかで、以下のタンパク質の１つまたは両方を含有し得る：
（８）ＮＨ_２−Ａ−［−Ｘ−Ｌ−］_ｎ−Ｂ−ＣＯＯＨ（ここで、ｎ＝２、Ｘ_１＝２８７、Ｘ_２＝７４１）
（９）ＮＨ_２−Ａ−［−Ｘ−Ｌ−］_ｎ−Ｂ−ＣＯＯＨ（ここで、ｎ＝２、Ｘ_１＝９３６、Ｘ_２＝７４１）。

タンパク質２８７および７４１が混合物（すなわち、タンパク質１、２、５、６、７または８の中）に含まれる場合、それらのタンパク質は「ΔＧ」の形態であり得る。タンパク質９６１が含まれる場合、好ましくは、Ｎ末端リーダーおよびＣ末端膜アンカーが不在である「９６１ｃ」の形態である［例えば、参考文献１、２、および１１を参照のこと］。

好ましい混合物は、以下の３種のタンパク質を含有する：
（１）９６１ｃ、好ましくは９６１ｃ_２９９６（例えば、本明細書中の配列番号３１）；
（２）ＮＨ_２−Ａ−［−Ｘ−Ｌ−］_ｎ−Ｂ−ＣＯＯＨ（ここで、ｎは２であり、−Ｘ_１−はΔＧ２８７（好ましくはΔＧ２８７_ＮＺ）であり、−Ｘ_２−はリーダーペプチドの欠損した９５３（好ましくは９５３_２９９６）であり、−Ｌ_１−はＧＳＧＧＧＧであり、そして−Ａ−はＮ末端メチオニンを含有する（例えば、−Ａ−はＭまたはＭＡ）である（例えば、本明細書中の配列番号２８および２９））；ならびに
（３）ＮＨ_２−Ａ−［−Ｘ−Ｌ−］_ｎ−Ｂ−ＣＯＯＨ（ここで、ｎ＝２であり、Ｘ_１＝９３６（好ましくは９３６_２９９６）であり、Ｘ_２＝ΔＧ７４１（好ましくはΔＧ７４１_ＭＣ５８）であり、Ｌ_１＝ＧＳＧＧＧＧ（例えば、本明細書中の配列番号３０））である。
前記混合物はまた、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ細菌外膜小胞も含有し得る。

（異種宿主）
本発明のタンパク質の発現は、ナイセリアにおいて起こり得るが、本発明は、好ましくは、異種宿主を利用する。異種宿主は、原核細胞（例えば、細菌）または真核細胞であり得る。異種宿主は、好ましくは、Ｅ．ｃｏｌｉであるが、その他の適切な宿主としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｎｎａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｌａｃｔａｍｉｃａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｃｉｎｅｒｅａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ（例えばＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、酵母などが挙げられる。

（ベクターなど）
本発明は以下を提供する：（ａ）前述のタンパク質をコードしている核酸（ｂ）これらの核酸配列を含有するベクター（ｃ）これらのベクターを含有する宿主細胞（ｄ）本発明のタンパク質または核酸を含有する組成物であって、免疫原性組成物（例えばワクチン）としてまたは診断試薬として適切であり得る組成物（ｅ）医薬として（例えばワクチンとして）または診断試薬として使用するためのこれらの組成物（ｆ）以下：（１）ナイセリア細菌に起因する感染の処置もしくは予防のための医薬（２）ナイセリア細菌の存在もしくはナイセリア細菌に対して惹起された抗体の存在を検出するための診断試薬、および／または（３）ナイセリア細菌に対する抗体を惹起し得る試薬の製造におけるこれらの組成物の使用、ならびに（ｇ）患者の処置の方法であって、治療有効量のこれらの組成物を患者へ投与する工程を包含する方法。

本発明の実施には、典型的に以下の基礎的な工程を包含する：第一のタンパク質をコードしている第一の核酸を獲得する工程；第二のタンパク質をコードしている第二の核酸を獲得する工程；および第一の核酸と第二の核酸とを連結する工程。得られた核酸は、発現ベクターに挿入され得るか、または既に発現ベクターの一部であり得る。

溶解性を改善するために、ハイブリッドタンパク質の精製は、本明細書中に開示された技術の再折り畳みを包含し得る。

（免疫原性の組成物および医薬）
本発明の組成物は、好ましくは、免疫原性の組成物であり、より好ましくはワクチン組成物である。この組成物のｐＨは、好ましくは、６と７との間である。ｐＨは、緩衝液を用いて維持され得る。この組成物は無菌であり得る。

本発明に従うワクチンは、予防薬（すなわち、感染の予防）または治療薬（すなわち、感染の処置）のいずれかであり得、典型的には予防薬である。

本発明はまた、本発明の組成物を医薬として使用するために提供する。この医薬は、好ましくは、哺乳動物において免疫応答を惹起することが可能であり（すなわち、免疫原性の組成物である）、より好ましくは、ワクチンである。

本発明はまた、哺乳動物において免疫応答を惹起するための医薬の製造における本発明の組成物の使用を提供する。その医薬は、好ましくはワクチンである。

本発明はまた、哺乳動物において免疫応答を惹起するための方法を提供し、その方法は、有効量の本発明の組成物を投与する工程を包含する。この免疫応答は、好ましくは防御性である。本方法は、ブースター応答を惹起し得る。

哺乳動物は、好ましくはヒトである。ワクチンの目的が予防的な使用にある場合、ヒトは好ましくは小児（例えば、幼児または乳児）である；ワクチンの目的が予防的な使用にある場合、ヒトは好ましくは成人である。小児を意図するワクチンはまた、例えば、安全性、投薬量、免疫原性などを評価するために、成人にも投与し得る。

これらの使用および方法は、好ましくは、ナイセリアが原因の疾患（例えば、髄膜炎、敗血症、淋病など）の予防および／または治療のためである。細菌性髄膜炎の予防および／または治療が好ましい。

（本組成物のさらなる成分）
本発明の組成物は、代表的には、上記組成物に加え、一つまたはそれ以上の「薬剤的に受容可能なキャリア」を含有し、この組成物を受容した個体に対し、それ自身は有害な抗体の生成を誘導しない任意のキャリアを含む。適切なキャリアは、典型的には、大きく、緩慢に代謝された巨大分子であり、例えば、タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、多量体アミノ酸、アミノ酸コポリマー、トレハロース（ＷＯ００／５６３６５）および脂質集合体（例えば、油滴またはリポソーム）である。そのようなキャリアは、当業者に周知である。これらのワクチンはまた、水、生理食塩水、グリセロール、などのような希釈剤も含有し得る。さらに、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝化物質などのような補助物質も存在し得る。薬剤的に受容可能な賦形剤の徹底的な議論は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓから入手可能である。

ワクチンとして用いられる免疫原性の組成物は、必要に応じて、免疫学的有効量の抗原、および上記成分の他の任意の成分を含有する。「免疫学的有効量」によって、単回投与かまたは一連の投与のうちの一部としてかのいずれかで個体へこの量を投与することが、処置または予防のために有効であることを意味する。この量は、処置を受ける個体の健康状態および身体的条件、年齢、処置を受ける個体の分類学的な群（例えば、非ヒト霊長類、霊長類など）、抗体合成のための個体の免疫系の能力、要求される防御の度合い、ワクチンの調剤、処置する医者の医学的立場の評価、ならびにその他の関連性のある要因に依存して変化する。その量は、慣用的な試験によって決定され得る相対的に広い範囲にあることが期待される。投薬処置は、単回投与スケジュールまたは複数回投与スケジュール（例えば、ブースター投与が挙げられる）であり得る。ワクチンは、他の免疫調節薬剤と共に投与され得る。

ワクチンは、他の免疫調節薬剤と共に投与され得る。

本組成物は、アルミニウム塩に加えて（またはその代わりに）、他のアジュバントを含み得る。組成物の効果を高めるために好ましいアジュバントには以下のものが挙げられるが、それだけに限らない：（１）水中油エマルジョンの処方物（ムラミルペプチド（下記参照）または細菌の細胞壁成分のような他の特定の免疫刺激性の薬剤を伴うかまたは伴わない）、例えば、（ａ）マイクロフルイダイザーを用いてミクロン以下の微粒子にして処方されたＭＦ５９^ＴＭ（ＷＯ９０／１４８３７；参考文献１３の１０章）であって、５％スクワレン、０．５％Ｔｗｅｅｎ８０および０．５％Ｓｐａｎ８５（必要に応じてＭＴＰ−ＰＥを含む）を含むＭＦ５９^ＴＭ、（ｂ）ミクロン以下のエマルジョンにマイクロフルイダイズされたか、または、より大きな微粒子サイズのエマルジョンを生成するために攪拌されたかいずれかのＳＡＦであって、１０％スクワレン、０．４％Ｔｗｅｅｎ８０、５％プルロニック−ｂｌｏｃｋｅｄ ｐｏｌｙｍｅｒ Ｌ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰを含むＳＡＦ、ならびに（ｃ）Ｒｉｂｉ^ＴＭアジュバントシステム（ＲＡＳ）（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＭＴ）であって、２％スクワレン、０．２％Ｔｗｅｅｎ８０およびモノホスホリル脂質Ａ（ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｉｐｉｄ Ａ）（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＭＤ）および細胞壁骨格（ＣＷＳ）からなる群由来の一つまたはそれ以上の細菌細胞壁成分（好ましくは、ＭＰＬ＋ＣＷＳ（Ｄｅｔｏｘ^ＴＭ））を含む、Ｒｉｂｉ^ＴＭアジュバントシステム（ＲＡＳ）；（２）ＱＳ２１またはＳｔｉｍｕｌｏｎ^ＴＭ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、ＭＡ）のようなサポニンアジュバントを用い得、またはＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体）のようなそれらから生成する微粒子であり、そのＩＳＣＯＭは、例えばＷＯ００／０７６２１のような追加の界面活性剤を欠き得る；（３）フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）およびフロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）；（４）サイトカイン（例えば、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２（ＷＯ９９／４４６３６）など）、インターフェロン（例えば、γインターフェロン）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＦＳ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）など）；（５）モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）または３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）（例えばＧＢ−２２２０２２１、ＥＰ−Ａ−０６８９４５４）；（６）３ｄＭＰＬと、例えば、ＱＳ２１および／または水中油エマルジョンとの組み合わせ（例えば、ＥＰ−Ａ−０８３５３１８、ＥＰ−Ａ−０７３５８９８、ＥＰ−Ａ−０７６１２３１）；（７）ＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチド［Ｋｒｉｅｇ Ｖａｃｃｉｎｅ ２０００、１９、６１８−６２２；Ｋｒｉｅｇ Ｃｕｒｒ ｏｐｉｎ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２００１ ３：１５−２４；Ｒｏｍａｎら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、１９９７、３、８４９−８５４；Ｗｅｉｎｅｒら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ、１９９７、９４、１０８３３−１０８３７；Ｄａｖｉｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９８、１６０、８７０−８７６；Ｃｈｕら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９９７、１８６、１６２３−１６３１；Ｌｉｐｆｏｒｄら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９７、２７、２３４０−２３４４；Ｍｏｌｄｏｖｅａｎｕら、Ｖａｃｃｉｎｅ、１９８８、１６、１２１６−１２２４、Ｋｒｉｅｇら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９５、３７４、５４６−５４９；Ｋｌｉｎｍａｎら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ、１９９６、９３、２８７９−２８８３；Ｂａｌｌａｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９６、１５７、１８４０−１８４５；Ｃｏｗｄｅｒｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９６、１５６、４５７０−４５７５；Ｈａｌｐｅｒｎら、Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９６、１６７、７２−７８；Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、１９８８、７９、８６６−８７３；Ｓｔａｃｅｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９６、１５７、２１１６−２１２２；Ｍｅｓｓｉｎａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９１、１４７、１７５９−１７６４；Ｙｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９６、１５７、４９１８−４９２５；Ｙｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９６、１５７、５３９４−５４０２；Ｙｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９８、１６０、４７５５−４７６１；およびＹｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９８、１６０、５８９８−５９０６；国際特許出願 ＷＯ９６／０２５５５、ＷＯ９８／１６２４７、ＷＯ９８／１８８１０、ＷＯ９８／４０１００、ＷＯ９８／５５４９５、ＷＯ９８／３７９１９およびＷＯ９８／５２５８１］（すなわち、少なくとも一つのＣＧジヌクレオチドを含み、シトシンの代わりに必要に応じて５−メチルシトシンが使用されるオリゴヌクレオチド）；（８）ポリオキシエチレンエーテルまたはポリオキシエチレンエステル（例えば、ＷＯ９９／５２５４９）；（９）オクトキシノールと組み合わせた、ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（例えば、ＷＯ０１／２１２０７）あるいはオクトキシノールのような追加の非イオン系界面活性剤の少なくとも一つと組み合わせたポリオキシエチレンアルキルエーテルまたはポリオキシエチレンアルキルエステルの界面活性剤（例えば、ＷＯ０１／２１１５２）；（１０）免疫刺激性のオリゴヌクレオチド（例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド）およびサポニン（例えばＷＯ００／６２８００）；（１１）免疫刺激物および金属塩の粒子（例えば、ＷＯ００／２３１０５）；（１２）サポニンおよび水中油エマルジョン（例えば、ＷＯ９９／１１２４１）；（１３）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋３ｄＭＰＬ＋ＩＬ−１２（必要に応じて＋ステロール）（例えばＷＯ９８／５７６５９）；（１４）本組成物の効果を高める免疫刺激する薬剤として作用するその他の物質。

ムラミンペプチドとしては、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン ＭＴＰ−ＰＥ）などが挙げられる。

（さらなる抗原）
本発明の組成物に含まれ得るさらなる抗原としては、以下が挙げられる：
−参考文献１４、１５、１６、１７などにおいて開示されるような、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｂ由来の膜外小胞（ＯＭＶ）調製物。
−Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５および／またはＹ由来のサッカリド抗原、例えば、参考文献１８において開示された血清群Ｃ由来のオリゴサッカリド［参考文献１９も参照のこと］または参考文献２０のオリゴサッカリド。
−Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来のサッカリド抗原［例えば、参考文献２１、２２、２３］。
−ＣａｇＡ［例えば、２４］、ＶａｃＡ［例えば、２４］、ＮＡＰ［例えば、２５］、ＨｏｘＰ［例えば、２６］、ＨｏｐＹ［例えば、２６］および／またはウレアーゼのような、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ由来のタンパク質抗原。
−不活性ウイルスのような、Ａ型肝炎ウイルス由来の抗原［例えば、２７、２８］。
−表面および／またはコアの抗原のような、Ｂ型肝炎ウイルス由来の抗原［例えば、２８、２９］。
−Ｃ型肝炎ウイルス由来の抗原［例えば、３０］。
−Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ由来の抗原（例えば、ペルタクチン（ｐｅｒｔａｃｔｉｎ）ならびに／または凝集原２および凝集原３との必要に応じて組み合わせた［例えば、参考文献３１および３２］、百日咳ホロトキシン（ＰＴ）およびＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ由来の線維状血球凝集素（ＦＨＡ））。
−ジフテリアトキソイド［例えば、参考文献３３の３章］のようなジフテリア抗原（例えばＣＲＭ_１９７変異体［例えば、３４］）。
−破傷風トキソイド［例えば、参考文献３３の４章］のような破傷風抗原。
−Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｂ由来のサッカリド抗原［例えば、１９］。
−Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ由来の抗原［例えば、３、４、５］。
−Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来の抗原［例えば、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１］。
−Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ由来の抗原［例えば、４２］。
−Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ由来の抗原［例えば、４３］。
−ＩＰＶまたはＯＰＶのような、ポリオ抗原［例えば、４４、４５］。
−凍結乾燥した非活性ウイルス［例えば、４７、ＲａｂＡｖｅｒｔ^ＴＭ］のような狂犬病抗原［例えば、４６］。
−はしか、おたふくかぜおよび／または風疹抗原［例えば、参考文献３３の９章、１０章および１１章］。
−血球凝集素および／またはノイラミニダーゼ表面タンパク質のような、インフルエンザ抗原［例えば、参考文献３３の１９章］。
−Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ由来の抗原［例えば、４８］。
−Ｓｔｒｅｐｔｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ Ｂ群）由来のタンパク質抗原［例えば、４９、５０］。
−Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ由来のサッカリド抗原。
−Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ Ａ群）由来の抗原［例えば、５０、５１、５２］。
−Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ由来の抗原［例えば、５３］。

組成物は、一つ以上のこれらのさらなる抗原を含有し得る。

サッカリドまたは糖質抗原が使用される場合、これは、好ましくは、免疫原性を高めるためにキャリアタンパク質に結合体化される［例えば、参考文献５４〜６３］。好ましいキャリアタンパク質は、ジフテリアトキソイドまたは破傷風トキソイドのような、細菌の毒素またはトキソイドである。ＣＲＭ_１９７ジフテリアトキソイドは、特に好ましい。その他の適切なキャリアタンパクとしては、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ外膜タンパク質［例えば、参考文献６４］、合成ペプチド［例えば、６５、６６］、熱ショックタンパク質［例えば、６７］、百日咳タンパク質［例えば、６８、６９］、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ由来プロラインＤ［例えば、７０］、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ由来の毒素ＡまたはＢ［例えば、７１］などが挙げられる。混合物が血清群ＡおよびＣの両方由来の夾膜サッカリドを含有する場合、ＭｅｎＡサッカリド：ＭｅｎＣサッカリドの比率（ｗ／ｗ）が１よりも大きい（例えば、２：１、３：１、４：１、５：１、１０：１またはそれより高い）ことが好ましい。Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの異なる血清群由来のサッカリドは、同種または異種のキャリアタンパク質に結合体化され得る。

任意の適切な結合反応が使用され得、必要な場合は任意の適切なリンカーが用いられる。

毒性のタンパク質抗原は、必要な場合は無毒化され得る（例えば、化学的手段および／または遺伝学的手段による百日咳毒素の無毒化［３２］）。

ジフテリア抗原が組成物内に含まれる場合、破傷風抗原および百日咳抗原を含むことも好ましい。同様に、破傷風抗原が含まれる場合、ジフテリア抗原および百日咳抗原を含むことも好ましい。同様に、百日咳抗原が含まれる場合、ジフテリア抗原および破傷風抗原を含むことも好ましい。

抗原は、好ましくは、アルミニウム塩（例えば、リン酸塩、水酸化物、ヒドロキシリン酸塩、酸化水酸化物、オルトリン酸塩、硫酸塩）と混合（より好ましくは、吸着）している。この塩は、任意の適切な形態をとり得る（例えば、ゲル、結晶、非結晶など）。

この組成物中の抗原は、典型的には、少なくとも各１μｇ／ｍｌの濃度で存在する。一般的に、任意の所定の抗原の濃度は、その抗原に対する免疫応答を誘発するに充分である。

本発明の組成物中のタンパク質抗原の使用に対する代替物として、その抗原をコードしている核酸が使用され得る［例えば、参考文献７２〜８０］。従って、本発明の組成物のタンパク質成分は、そのタンパク質をコードしている核酸（好ましくは、（例えばプラスミドの形態の）ＤＮＡ）によって置換され得る。

（定義）
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を意味し、例えば、Ｘを「含む」組成物とは、Ｘのみからなっても、Ｘ＋Ｙのように追加の何かを含んでもよい。

数値ｘに関係する用語「約」は、例えば、ｘ±１０％を意味する。

図１は、タンパク質７４１のための２３配列のアラインメントを示す。これらは、配列番号１〜２２番にＭＣ５８由来の配列を加えたものである。 図１は、タンパク質７４１のための２３配列のアラインメントを示す。これらは、配列番号１〜２２番にＭＣ５８由来の配列を加えたものである。 図１は、タンパク質７４１のための２３配列のアラインメントを示す。これらは、配列番号１〜２２番にＭＣ５８由来の配列を加えたものである。 図２は、淋菌（上端；配列番号２５番）および髄膜炎菌（下端；配列番号２６番）由来のＮＭＢ１３４３配列のアラインメントを示している。 図３は、本発明のハイブリッドタンパク質およびタンデムタンパク質を示している。 図４は、９６１_２９９６内の９ドメインを示している。 図５は、これらのドメインがどのように操作されているかを示している。

（ハイブリッドタンパク質−Ｘ_１＝ΔＧ２８７）
参考文献１および２に開示されるタンパク質に加えて、Ｎ末端に株２９９６由来のΔＧ２８７を有する７つのハイブリッドタンパク質を構築した。８つの２８７タンデムタンパク質もまた作製した（以下を参照のこと）。

これらのタンパク質を、フロイントの完全アジュバント（ＦＣＡ）または３ｍｇ／ｍｌミョウバン（ａｌｕｍ）のいずれかでアジュバント化し、マウスの免疫に使用した。得られた血清を、種々のナイセリア株に対して殺菌アッセイを用いて試験した。タンパク質番号３を用いた力価は以下の通りである：

水酸化アルミニウムでアジュバント化したタンパク質番号３を用いる、さらなる試験において、９８４１５０力価およびＢＣＡ力価をそれぞれ超えた抗２８７および抗７４１のＥＬＩＳＡ力価は以下の通りである：

参考文献１および２に開示されるタンパク質で免疫した後に得られた（相同株に対して試験した）結果は、以下の通りである：

（ハイブリッドタンパク質−Ｘ_１＝９６１ｃまたは９６１ｃＬ）
参考文献１および２に開示されるタンパク質に加えて、Ｎ末端に９６１ｃまたは９６１ｃＬ（すなわち、９６１ｃ＋リーダーペプチド）のいずれかを有する８つのハイブリッドタンパク質を構築した：

これらのタンパク質を、フロイントの完全アジュバント（ＦＣＡ）または３．３ｍｇ／ｍｌミョウバンのいずれかでアジュバント化し、マウスの免疫に使用した。得られた血清を、様々なナイセリア株に対し、殺菌アッセイを用いて試験した。タンパク質番号８を用いた力価は、以下の通りである：

９６１ｃ〜７４１［参考文献１および２］で免疫した後に得られた力価は、以下の通りである：

これらの結果は、９６１ｃ〜７４１をＯＲＦ４６．１またはΔＧ２８７〜９１９と混合することによって改善され得た。

参考文献１および２に開示されるタンパク質で免疫した後に得られた（相同株に対して試験した）結果は、以下の通りである：

（ハイブリッドタンパク質−Ｘ_１＝ＯＲＦ４６．１）
参考文献１および２に開示されるタンパク質に加えて、Ｎ末端にＯＲＦ４６．１を有する２つのハイブリッドタンパク質を構築した：

これらのタンパク質をフロイントの完全アジュバント（ＦＣＡ）または３ｍｇ／ｍｌミョウバンのいずれかでアジュバント化し、マウスの免疫に使用した。得られた血清を、相同株に対して殺菌アッセイおよびＥＬＩＳＡによって、試験した。

参考文献１および２に開示されるタンパク質で免疫した後に得られた結果は、以下の通りである：

（ハイブリッドタンパク質−Ｘ_１＝２３０）
参考文献１および２に開示されるタンパク質に加えて、Ｎ末端に２３０を有する４つのハイブリッドタンパク質を構築した：

（ハイブリッドタンパク質−Ｘ_１＝９３６）
参考文献１および２に開示されるタンパク質に加えて、Ｎ末端に９３６を有する７つのハイブリッドタンパク質を構築した：

これらのタンパク質をフロイントの完全アジュバント（ＦＣＡ）または３ｍｇ／ｍｌミョウバンのいずれかでアジュバント化し、マウスの免疫に使用した。得られた血清を、様々なナイセリア株に対して、殺菌アッセイを用いて試験した。タンパク質番号２を用いた力価は、以下の通りである：

タンパク質番号４を用いた力価は、以下の通りである：

タンパク質番号７を用いた力価は、以下の通りである：

参考文献１および２に開示されるタンパク質で免疫した後に得られた（相同株に対して試験した）結果は、以下の通りである：

（ハイブリッドタンパク質の混合物）
マウスを、水酸化アルミニウムでアジュバント化した３つのタンパク質を、以下の単独または３通りの組み合わせのいずれかで免疫した：（１）２８７_ＮＺ〜９５３；（２）９３６〜７４１；および（３）９６１ｃ。この混合物は、様々な株に対して高い殺菌力価を誘導し得た：

個々のマウスを見ると、この混合物は、高くそして一貫した殺菌力価を誘導した：

（タンデムタンパク質）
本発明のハイブリッドタンパク質は、式ＮＨ_２−［−Ｘ−Ｌ−］_ｎ−ＣＯＯＨによって表され得る。ここで、−Ｘ−の全ｎ例は、同じ基礎的なタンパク質（同一タンパク質、あるいは異なる株または種由来の同じタンパク質のいずれか）であり、そのタンパク質は「タンデム」タンパク質と呼ばれる。

１２の特異的なタンデムタンパク質は、以下の通りである：

タンパク質番号１〜５は、Ｅ．Ｃｏｌｉにおいて、可溶型で全て発現された。発現レベルは、培地１リットル当たり０．２４ｍｇと０．５０ｍｇとの間であった。タンデムタンパク質を精製し、リン酸アルミニウムをアジュバントとして混合した。タンデムタンパク質番号２、４および５は、リン酸アルミニウムに容易に吸着した；吸着は、タンデムタンパク質番号１および３にとっては不完全であった。

（対立遺伝子改変体−７４１）
２２個の７４１の多型配列が発見された（配列番号１〜２２）。これらの配列およびＭＣ５８配列を、図１に整列した。

（対立遺伝子改変体−ＮＭＢ１３４３）
様々な血清群の髄膜炎菌４２株においてＰＣＲを用いて、ＮＭＢ１３４３タンパク質をコードする遺伝子は、４２株中２４株において見出され、４２株中１８株では不在であった（表１）。ＮＭＢ１３４３遺伝子を、ＮＭＢ１３４３^＋株のうち１０株において配列決定した（表１、縦列３）。核酸配列（従って、アミノ酸配列番号２３；ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＦ４１７１８）は、１０株全てにおいて同一であった。

ＮＭＢ１３４３はまた、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅの２株（Ｆ６２およびＳＮ４）においても検出された。淋菌由来のアミノ酸配列は、配列番号２４である。髄膜炎菌の配列とのアラインメントは、以下である：

対応するヌクレオチド配列のアラインメントを図２に示す。これは、淋菌の配列がＮＭＢ１３４３遺伝子の５’領域に４マーの挿入を有することを示しており、このことが、フレームシフトおよび５’メチオニン残基の結果的な欠損の原因となっている。

（ドメイン欠失−９６１）
周辺領域は、血清群Ａと血清群Ｂとの間に保存されている（＞９０％）にも関わらず、９６１は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ａゲノム配列に存在しない［８１］。参考文献１１および１２は、９６１の多型を開示する。この遺伝子は、過毒性系統（ｈｙｐｅｒｖｉｒｕｌｅｎｔ ｌｉｎｅａｇｅ）ＥＴ−５、ＥＴ−３７およびクラスターＡ４に属する血清群Ｂ株の９１％に存在することが見出されたが、試験した系統３の全株において不在であった。試験した血清群Ｃ株のほとんどは、たとえ過毒性系統に属さなくとも陽性であった。血清群Ｂ株は、血清型２ａおよび２ｂと同じであった。血清群Ａに関して、亜群ＩＩＩに属する１株は陽性であったのに対し、他方の亜群ＩＶ−１に属する２株は陰性であった。９６１は、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅならびに共生種Ｎ．ｌａｃｔａｍｉｃａおよびＮ．ｃｉｎｅｒｅａにおいて不在であった。

図４および図５は、タンパク質９６１におけるドメインを示す。

タンパク質９６１のアンカー領域（ドメイン９）が欠失し（「９６１ｃＬ」）、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現される場合、そのタンパク質は、ペリプラズム中に運び出され、培地の上清に分泌される。

さらにこれを追究するため、構造上の特色（９６１ｃΔａｒｏ変異体の場合における芳香族残基の欠失、およびその他のコイルドコイル領域の欠失）に基づいて、９６１のＣ末端領域の欠失変異体を構築した（９６１ｃＬ−Δａｒｏ、９６１ｃＬΔｃｃ、９６１ａＬ、９６１ａＬ−Δｌ、９６１ａＬ−Δ２、９６１ａＬ−Δ３）。発現ならびにペリプラズム中および培地上清中への分泌についてこれらを分析した。これらの欠失変異体全てにおいて、このタンパク質は大量に産生され、ペリプラズム画分中に存在し、培地上清中に放出される。

（ΔＧ２８７−交雑株殺菌活性）
２８７を、異なるＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｂ株の５株についてクローン化し、ポリグリシン領域の終末までＮ末端を欠失するため、そしてＣ末端ｈｉｓ−タグを導入するために、操作した。これにより５つのΔＧ２８７タンパク質を得た。これらをＦＣＡでアジュバント化し、マウスの免疫血清を高めるために用い、次いで全５株の血清群Ｂ株ならびに血清群Ａ株およびＣ株に対する殺菌活性を試験した。殺菌力価は、以下の通りである：

（再折り畳み）
いくつかのハイブリッドタンパク質について、可溶性タンパク質のレベルを改善するために、参考文献２に開示された再折り畳みプロトコールに代わる方法を採用した。

封入体（ＩＢ）を以下のように単離した。

１．細胞（湿重量５ｇ）を、２５ｍｌの０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７）、１ｍＭ ＥＤＴＡ中、４℃で、ｕｌｔｒａｔｕｒｒａｘ（１００００ｒｐｍ）を用いてホモジナイズする。

２．細胞１ｇ当たり１．５ｍｇのリゾチームを加え、ｕｌｔｒａｔｕｒｒａｘで手短に混合し、４℃で３０分間インキュベートする。

３．超音波処理または高圧ホモジナイゼーション（Ｆｒｅｎｃｈ ｐｒｅｓｓ）を用いて細胞を破砕する。

４．ＤＮＡを消化するために、ＭｇＣｌ_２を最終濃度３ｍＭおよびＤＮａｓｅを最終濃度１０μｇ／ｍｌで加え、２５℃で３０分間インキュベートする。

５．この溶液に、体積の０．５倍量の６０ｍＭ ＥＤＴＡ、６％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１．５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ７）を加え、４℃で３０分間インキュベートする。

６．封入体を遠心分離（３１０００ｇ（２００００ｒｐｍ）で１０分間、４℃）によって遠沈する。

７．ペレットを、４０ｍｌの０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７）、２０ｍＭ ＥＤＴＡ中に、ｕｌｔｒａｔｕｒｒａｘを用いて再懸濁する。

８．工程６の遠心分離を繰り返す。

９．封入体ペレットは、使用され得るか、または−２０℃で凍結保存され得る。

ハイブリッドタンパク質は、以下のようにＥ．ｃｏｌｉ中に発現された：

このペレットを可溶化し、再折り畳みし、限外濾過し、透析し、次いでタンパク質を精製した。

（ＯＲＦ４６．１−９６１−Ｈｉｓ）
ＩＢを、以下のように可溶化した：ＩＢタンパク質を、４ｍｌの６Ｍ グアニジンＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．５）の緩衝液中に、最終タンパク質濃度が１ｍｇ／ｍｌとなるように再懸濁した。タンパク質の再折り畳みのために、２ｍｌの可溶性タンパク質を４００ｍｌの再折り畳み緩衝液（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、ｌＭ Ｌ−アルギニン、２ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．２））中に希釈し、１５℃で１時間インキュベートした結果、タンパク質濃度は５μｇ／ｍｌとなった。その後、別の２ｍｌの、可溶性タンパク質を添加し、さらに１時間、同じ温度でインキュベートした結果、最終タンパク質濃度は１０μｇ／ｍｌとなった。この物質を３００ｍｌのＡｍｉｃｏｎ限外濾過セル（ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｃｅｌｌ）（８４００）を用いて限外濾過し、３０ｋＤａカットオフのＡｍｉｃｏｎ膜（ＹＭ３０）に３バール圧を適用した結果、最終容量１３０ｍｌを得た。この限外濾過した物質を、１２〜１４ｋＤａカットオフの再生セルロース管状膜（Ｃｅｌｌｕｓｅｐ−Ｓｔｅｐ ｂｉｏ）を用い、１０Ｌの０．１Ｍ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ８．２）の緩衝液で２４時間透析した。２回目の透析は、１０Ｌの３００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）の緩衝液で２４時間行った。この透析した物質は、Ｂｅｃｋｍａｎ遠心分離ローターＪＡ２５．５において、２２０００ｒｐｍで４５分間、４℃で遠心分離した。この遠心分離後に単離した上清を、Ｈｉｓ−タグ精製に使用した。

（ｏｒｆ ４６．１−９６１ｃ−Ｈｉｓ）
ＩＢを、以下のように可溶化した：ＩＢタンパク質を、４ｍｌの６Ｍ グアニジンＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．５）の緩衝液中に、最終タンパク質濃度が１ｍｇ／ｍｌとなるように再懸濁した。タンパク質の再折り畳みのために、２ｍｌの可溶性タンパク質を４００ｍｌの再折り畳み緩衝液（０．５Ｍ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、ｌＭ Ｌ−アルギニン、２ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．２））中に希釈し、１５℃で１時間インキュベートした結果、タンパク質濃度は５μｇ／ｍｌとなった。その後、別の２ｍｌの、可溶性タンパク質を添加し、さらに１時間、同じ温度でインキュベートした結果、最終タンパク質濃度は１０μｇ／ｍｌとなった。この物質を３００ｍｌのＡｍｉｃｏｎ限外濾過セル（８４００）を用いて限外濾過し、３０ｋＤａカットオフのＡｍｉｃｏｎ膜（ＹＭ３０）に３バール圧を適用した結果、最終容量１５０ｍｌを得た。この限外濾過した物質を、１２〜１４ｋＤａカットオフの再生セルロース管状膜（Ｃｅｌｌｕｓｅｐ−Ｓｔｅｐ ｂｉｏ）を用い、１０Ｌの０．１Ｍ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ８．２）の緩衝液で２４時間透析した。２回目の透析は、１０Ｌの３００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）の緩衝液で２４時間行った。この透析した物質は、Ｂｅｃｋｍａｎ遠心分離ローターＪＡ２５．５において、２２０００ｒｐｍで４５分間、４℃で遠心分離した。この遠心分離後に単離した上清を、Ｈｉｓ−タグ精製に使用した。

（９６１ｃ−ｏｒｆ４６．１−Ｈｉｓ）
ＩＢを、以下のように可溶化した：ＩＢタンパク質を、４ｍｌの６Ｍ グアニジンＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．５）の緩衝液中に、最終タンパク質濃度が１ｍｇ／ｍｌとなるように再懸濁した。タンパク質の再折り畳みのために、２ｍｌの可溶性タンパク質を４００ｍｌの再折り畳み緩衝液（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、０．５Ｍ Ｌ−アルギニン、２ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．２））中に希釈し、１５℃で１時間インキュベートした結果、タンパク質濃度は５μｇ／ｍｌとなった。その後、別の２ｍｌの、可溶性タンパク質を添加し、さらに１時間、同じ温度でインキュベートした結果、最終タンパク質濃度は１０μｇ／ｍｌとなった。この物質を３００ｍｌのＡｍｉｃｏｎ限外濾過セル（８４００）を用いて限外濾過し、３０ｋＤａカットオフのＡｍｉｃｏｎ膜（ＹＭ３０）に３バール圧を適用した結果、最終容量１５０ｍｌを得た。この限外濾過した物質を、１２〜１４ｋＤａカットオフの再生セルロース管状膜（Ｃｅｌｌｕｓｅｐ−Ｓｔｅｐ ｂｉｏ）を用い、１０Ｌの０．１Ｍ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ８．２）の緩衝液で２４時間透析した。２回目の透析は、１０Ｌの３００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）の緩衝液で２４時間行った。この透析した物質は、Ｂｅｃｋｍａｎ遠心分離ローターＪＡ２５．５において、２２０００ｒｐｍで４５分間、４℃で遠心分離した。この遠心分離後に単離した上清を、Ｈｉｓ−タグ精製に使用した。

（ｏｒｆ４６．１−７４１−Ｈｉｓ）
ＩＢを、以下のように可溶化した：ＩＢタンパク質を、４ｍｌの６Ｍ グアニジンＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．５）の緩衝液中に、最終タンパク質濃度が１０ｍｇ／ｍｌとなるように再懸濁した。再折り畳みのために、２ｍｌの可溶性タンパク質を４００ｍｌの再折り畳み緩衝液（０．５Ｍ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、０．７Ｍ Ｌ−アルギニン、２ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．２））中に希釈し、１５℃で１時間インキュベートした結果、タンパク質濃度は５０μｇ／ｍｌとなった。その後、別の２ｍｌの、可溶性タンパク質を添加し、さらに１時間、同じ温度でインキュベートした結果、最終タンパク質濃度は１００μｇ／ｍｌとなった。この物質を３００ｍｌのＡｍｉｃｏｎ限外濾過セル（８４００）を用いて限外濾過し、３０ｋＤａカットオフのＡｍｉｃｏｎ膜（ＹＭ３０）に３バール圧を適用した結果、最終容量１２０ｍｌを得た。この限外濾過した物質を、１２〜１４ｋＤａカットオフの再生セルロース管状膜（Ｃｅｌｌｕｓｅｐ−Ｓｔｅｐ ｂｉｏ）を用い、１０Ｌの０．１Ｍ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ８．２）の緩衝液で２４時間透析した。２回目の透析は、１０Ｌの３００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）の緩衝液で２４時間行った。この透析した物質は、Ｂｅｃｋｍａｎ遠心分離ローターＪＡ２５．５において、２２０００ｒｐｍで４５分間、４℃で遠心分離した。この遠心分離後に単離した上清を、Ｈｉｓ−タグ精製に使用した。

参考文献２に記載のように精製したタンパク質と比較して、殺菌活性力価は以下のようであった：

Ｈｉｓ−タグ（「ＯＲＦ４６．１Ｋ」）の発現がない場合、同様の手順をＯＲＦ４６．１に用いて、ＩＢからタンパク質を精製した：

ＩＢタンパク質を、４ｍｌの６Ｍ グアニジンＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．５）の緩衝液中に、最終タンパク質濃度が１０ｍｇ／ｍｌとなるように再懸濁した。再折り畳みのために、２ｍｌの可溶性タンパク質を４００ｍｌの再折り畳み緩衝液（０．５Ｍ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、０．７Ｍ Ｌ−アルギニン、２ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．２））中に希釈し、１５℃で１時間インキュベートした結果、タンパク質濃度は５０μｇ／ｍｌとなった。その後、別の２ｍｌの、可溶性タンパク質を添加し、さらに１時間、同じ温度でインキュベートした結果、最終タンパク質濃度は１００μｇ／ｍｌとなった。この物質を３００ｍｌのＡｍｉｃｏｎ限外濾過セル（８４００）を用いて限外濾過し、３０ｋＤａカットオフのＡｍｉｃｏｎ膜（ＹＭ３０）に３バール圧を適用した結果、最終容量１２０ｍｌを得た。この限外濾過された物質を、１２〜１４ｋＤａカットオフの再生セルロース管状膜（Ｃｅｌｌｕｓｅｐ−Ｓｔｅｐ ｂｉｏ）を用い、１０Ｌの５０ｍＭ リン酸ナトリウム、２ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．２）の緩衝液で１２時間透析した。２回目の透析は、１０Ｌの同緩衝液で２４時間行った。この透析された物質は、Ｂｅｃｋｍａｎ遠心分離ローターＪＡ２５．５において、２２０００ｒｐｍで４５分間、４℃で遠心分離した。この遠心分離後に単離した上清を、陽イオン交換クロマトグラフィーに使用した。この精製は、ＡＫＴＡ診査（ｅｘｐｌｏｒｅｒ）クロマトグラフィーシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）で、５ｍｌ ＨｉＴｒａｐ ＳＰ セファロースＨＰカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて行った。適用した流速は、１．５ｍｌ／分であった。このカラムを、３５ｍｌの５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ ７．２）で洗浄した。直線的勾配（０〜１Ｍ ＮａＣｌ）を、５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ ７．２）を用いて実行した。タンパク質を、９２ｍＭおよび３８０ｍＭのＮａＣｌで、２つのピークにて溶出した。各ピークを構成している画分をプールし、それぞれプール１およびプール２と名付けた。

参考文献２に記載のように精製したタンパク質と比較して、水酸化アルミニウムでアジュバント化した場合の殺菌活性力価は、４未満から１０２４に改善された。再折り畳みタンパク質と共にリン酸アルミニウムアジュバントを使用した力価は２０４８であった。ＥＬＩＳＡ力価は、以下の通りであった：

本発明は、例証としてのみ記述され、改変は、本発明の範囲および精神の範囲内に維持しつつ成され得ることが理解される。

（配列表）

Claims (1)

1. 明細書に記載の、ハイブリッドタンパク質。

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