JP2013544785A - 軟骨細胞におけるコラーゲン及びプロテオグリカン合成促進方法 - Google Patents

軟骨細胞におけるコラーゲン及びプロテオグリカン合成促進方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、ワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物の投与により、椎間板細胞、関節軟骨細胞及び半月板細胞のような軟骨細胞におけるコラーゲン合成とプロテオグリカン合成が促進されることに基づくものである。

Description

本発明は、ワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物の新規な医薬用途に関するものであり、具体的には椎間板細胞、関節軟骨細胞、半月板細胞等の軟骨細胞におけるコラーゲン及びプロテオグリカンの合成を促進する方法に関する。
「ノイロトロピン」という商品名で販売されている製剤は、有効成分として、非タンパク性のワクシニアウイルス接種家兎炎症皮膚抽出物を含有する。ノイロトロピン（NTP）は帯状疱疹後神経痛や腰痛などの神経障害性疼痛の治療に日本で広く用いられている。動物モデルにおいて、NTPの抗侵害受容作用はモノアミン作動性下行性疼痛抑制系の活性化を原因とすることが示されている。また、NTPはカリクレイン−キニンカスケードの活性化を抑制し、その結果として、in vitro及びin vivoでブラジキニンの産生を抑制することで、疼痛経路を阻害することも示されている。
近年、ヒト椎間板細胞での腫瘍壊死因子α（TNF-α）やシクロオキシゲナーゼ-2（COX-2）のmRNA発現に対するNTPの抑制作用が報告されている。しかしながら、NTPが椎間板細胞の細胞外基質（ECM）合成に対して作用しているのかどうかは明らかではない。
ワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物がウシ髄核細胞又は線維輪細胞のような椎間板細胞、関節軟骨細胞及び半月板細胞のような軟骨細胞におけるコラーゲンとプロテオグリカンの合成を促進するために使用される。発明の態様として、ワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物の薬理学的に有効な量を治療の必要な患者に投与することからなる、当該患者の軟骨細胞におけるプロテオグリカン及び／又はコラーゲン合成を促進させる方法が提供される。本発明のもう一つの態様として、ワクシニアルイルス接種炎症組織抽出物の薬理学的に有効な量を治療の必要な患者に投与することからなる、軟骨細胞の細胞外基質を再生する方法が提供される。
本発明はここに添付される図によってさらに説明される。
図１は、線維輪細胞（AF）である椎間板細胞におけるプロテオグリカン合成に対するワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物の活性を調べた実験結果である。
図２は、ウシ髄核細胞（NP）である椎間板細胞におけるプロテオグリカン合成に対するワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物の活性を調べた実験結果である。
図３は、線維輪細胞（AF）である椎間板細胞におけるコラーゲン合成に対するワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物の活性を調べた実験結果である。
図４は、ウシ髄核細胞（NP）である椎間板細胞におけるコラーゲン合成に対するワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物の活性を調べた実験結果である。
本発明は、正常酸素濃度及び低酸素濃度条件下において、アルギン酸ビーズ中で培養したウシ髄核（NP）細胞及び線維輪（AF）細胞を用い、プロテオグリカン（PG）及びコラーゲンの合成に対するNTPの作用を調べた結果に基づくものである。
本発明のワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物に関しては、ワクシニアウイルスを接種した炎症組織において産生される生理活性物質、該物質を病態組織から抽出する方法並びにそれらの薬理活性などについて既に種々の報告がされている（WO 2009/028605の段落[0008]、EP2191836、日本公開特許公報JP-A-53-101515、JP-A-55-87724、 JP-A-1-265028、 JP-A-1-319422、JP-A-2-28119、JP-A-7-97336、JP-A-8-291077、JP-A-10-194978、 JP-A-11-80005、JP-A-11-139977、JP-A-2000-336034、JP-A-2000-16942及びJP-A-2004-300146、並びに国際公開公報WO2004/039383を参照）。
さらに、ワクシニアウイルス接種家兎炎症皮膚抽出液製剤は医薬品として市販されており、本発明において使用可能である。該製剤は、「日本の医療用医薬品集」〔2010年版、財団法人日本医薬情報センター編集・発行〕の2978乃至2980頁に記載されているように、ワクシニアウイルスを接種した家兎の炎症皮膚組織から抽出分離した非タンパク性の活性物質を含有する薬剤である。該製剤は、腰痛症、頸肩腕症候群、症候性神経痛、肩関節周囲炎、変形性関節症、皮膚疾患（湿疹、皮膚炎、じんま疹）に伴う掻痒、アレルギー性鼻炎、スモン後遺症状の冷感・異常知覚・痛み、帯状疱疹後神経痛等に対して有効であることが知られている。該製剤は皮下、筋注、静注用の注射剤並びに錠剤が医療用医薬品として承認を受けて販売されている。
本発明のワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物は、上述したようなワクシニアウイルス接種炎症組織から抽出した非タンパク性の生体機能調整物質であり、前記の医療用医薬品集に掲載されているワクシニアウイルス接種家兎炎症皮膚抽出液製剤が医薬品の製造承認を受け市販されている。また、上述した特許文献に記載されている種々のワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物を本発明物質として利用でき、それらの製造方法や好ましい投与量等も文献中に説明されている。
本発明のワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物は、以下の方法、すなわちワクシニアウイルスを接種して発痘した炎症組織を破砕し、抽出溶媒を加えて組織片を除去した後、除蛋白処理を行い、これを吸着剤に吸着させ、次いで有効成分を溶出することによって得ることができる。
ワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物は、例えば、以下の工程で製造される。
（a）ワクシニアウイルスを接種したウサギ、マウス等の炎症皮膚組織等を採取し、炎症組織を破砕し、水、フェノール水、生理食塩液またはフェノール加グリセリン水等の抽出溶媒を加えた後、濾過または遠心分離することによって抽出液（濾液または上清）を得る。
（b）前記抽出液を酸性のpHに調整して加熱し、除蛋白処理する。次いで除蛋白した溶液をアルカリ性に調整して加熱した後に濾過または遠心分離する。
（c）得られた濾液または上清を酸性とし活性炭、カオリン等の吸着剤に吸着させる。
（d）前記吸着剤に水等の抽出溶媒を加え、アルカリ性のpHに調整し、吸着成分を溶出することによってワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物を得ることができる。その後、所望に応じて、適宜溶出液を減圧下に蒸発乾固または凍結乾燥することによって乾固物とすることもできる。
ワクシニアウイルスを接種し炎症組織を得るための動物としては、ウサギ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、サル、ラット、マウスなどワクシニアウイルスが感染する種々の動物を用いることができ、炎症組織としてはウサギの炎症皮膚組織が好ましい。
これら炎症組織を採取して破砕し、その1乃至5倍量の抽出溶媒を加えて乳化懸濁液とする。抽出溶媒としては、蒸留水、生理食塩水、弱酸性乃至弱塩基性の緩衝液などを用いることができ、グリセリン等の安定化剤、フェノール等の殺菌・防腐剤、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム等の塩類などを適宜添加してもよい。この時、凍結融解、超音波、細胞膜溶解酵素又は界面活性剤等の処理により細胞組織を破壊して抽出を容易にすることもできる。
得られた乳状抽出液を濾過又は遠心分離等によって組織片を除去した後、除蛋白処理を行う。除蛋白操作は、通常行われている公知の方法により実施でき、例えば、加熱処理、酸、塩基、尿素、グアニジン等の蛋白質変性剤による処理、アセトン等の有機溶媒による処理、等電点沈澱、塩析等の方法を適用することができる。次いで、濾紙（例えばセルロース、ニトロセルロース）、グラスフィルター、セライト、ザイツ濾過板等を用いた濾過、限外濾過、遠心分離などのような不溶物を除去する通常の方法により析出してきた不溶蛋白質を除去する。
こうして得られた有効成分含有抽出液を、塩酸、硫酸、臭化水素酸等の酸を用いて酸性、好ましくはpH3.5乃至5.5に調整し、吸着剤への吸着操作を行う。使用可能な吸着剤としては、活性炭、カオリン等を挙げることができ、抽出液中に吸着剤を添加し撹拌するか、抽出液を吸着剤充填カラムに通過させて、該吸着剤に有効成分を吸着させることができる。抽出液中に吸着剤を添加した場合には、濾過や遠心分離等によって溶液を除去して、有効成分を吸着させた吸着剤を得ることができる。
吸着剤より有効成分を溶出（脱離）させるため、前記吸着剤に溶出溶媒を加え、室温又は適宜加熱して或いは撹拌して溶出し、濾過や遠心分離等の通常の方法で吸着剤を除去する。用いられる溶出溶媒としては、塩基性の溶媒、例えば塩基性のpHに調整した水、メタノール、エタノール、イソプロパノール等又はこれらの適当な混合溶液を用いることができ、好ましくはｐＨ9乃至12に調整した水を使用することができる。
このようにして得られた抽出物（溶出液）は、製剤用原体や医薬品製剤として好ましい形態に適宜調製することができる。例えば、溶液のpHを中性付近に調整して製剤用原体とすることもでき、また濃縮・希釈によって所望の濃度に合せることもできる。さらに注射用製剤として塩化ナトリウムを加えて生理食塩液と等張の溶液に調製することもできる。また、これら溶液を濃縮乾固又は凍結乾燥することによって、錠剤等の原料として利用できる固形物の形態に調製してもよい。
治療の必要な患者に薬学的に有効な量を投与する方法としては、経口投与の他に皮下、筋肉内、静脈内投与等が挙げられる。投与量はワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物の種類によって適宜設定することができる。市販の製剤を医療用医薬品として投与することが認められている量は、前記の「日本の医療用医薬品集」（2978頁）によれば、基本的には内服では1日16NU、注射剤では1日3.6乃至7.2NUである。もっとも、疾患の種類、重症度、患者の個人差、投与方法、投与期間等によって適宜増減可能である（NU：ノイロトロピン単位。ノイロトロピン単位とは、疼痛閾値が正常動物より低下した慢性ストレス動物であるSARTストレスマウスを用い、Randall-Selitto変法に準じて試験を行い、鎮痛効力のED50値をもって規定する。1NUはED50値が100 mg／kgであるときのノイロトロピン製剤の鎮痛活性含有成分1mgを示す活性である。）
以下に、ワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物の製造方法の例、並びに該抽出物の新規な薬理作用、すなわち椎間板細胞におけるコラーゲン及びプロテオグリカン合成促進作用に関する薬理試験結果を示すが、本発明はこれらの実施例の記載によって何ら制限されるものではなく、特に記載のない限り、全ての要素、パーセンテージ及び比率は重量当たりで、全ての温度はセ氏で、及び全ての圧力は大気圧で示す。
実施例１
健康な成熟家兎の皮膚にワクシニアウイルスを接種し、発痘した皮膚を剥出し、これを破砕してフェノール水を加えた。次いでこれを加圧濾過し、得られた濾液を塩酸でpH5に調整した後、90〜100℃で30分間加熱処理した。濾過して除蛋白した後、水酸化ナトリウムでpH9とし、さらに90〜100℃で15分間加熱処理した後濾過した。濾液を塩酸で約pH4.5に調整し、2％の活性炭を加えて2時間撹拌した後、遠心分離した。採取した活性炭に水を加え、水酸化ナトリウムでpH10とし、60℃で1.5時間撹拌した後、遠心分離濾過して上清を得た。採取した活性炭に再び水を加え、水酸化ナトリウムでpH11とし、60℃で1.5時間撹拌した後、遠心分離して上清を得た。両上清を合せて、塩酸で中和し、ワクシニアウイルス接種家兔炎症皮膚抽出物を得た。以下の薬理試験では、該抽出物は実験に適した濃度に適宜調整して使用した。
実施例２
健康な成熟家兎の皮膚にワクシニアウイルスを接種し感染させた後、発痘した皮膚を無菌的に剥出しこれを細切した後フェノール加グリセリン水を加え、ホモゲナイザーで磨砕し乳状とした。次いでこれを濾過し、得られた濾液を塩酸で弱酸性（pH4.5乃至5.5）に調整した後、100℃で加熱処理し濾過した。濾液を水酸化ナトリウムで弱アルカリ性（pH8.5乃至10.0）とし、さらに100℃で加熱処理した後濾過した。濾液を塩酸で約pH4.5とし、約1.5％の活性炭を加えて1乃至5時間撹拌した後濾過した。濾取した活性炭に水を加え水酸化ナトリウムでpH9.4乃至10に調整し、3乃至5時間撹拌した後、濾過し濾液を塩酸で中和した。
実施例３
次に、上記実施例１で得られた本発明ワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物（NTP）を被験薬として用いた椎間板細胞におけるコラーゲンとプロテオグリカンの合成促進活性を示す薬理試験の結果の一例を示す。椎間板細胞におけるプロテオグリカン（PG）及びコラーゲン合成並びに細胞増殖における代謝に対するNTPの作用は以下の記述並びに図１乃至４のとおりである。
１．材料及び方法
14-18月齢のウシ尾部椎間板よりウシ髄核（NP）細胞及び線維輪（AF）細胞を単離し、アルギン酸に封入して（4×106 cells/mL）、正常酸素濃度（21％O2）又は低酸素濃度（5％O2）条件下、10％ウシ胎仔血清（FBS）を含有するDMEM/F12培地で11日間培養した。これらの培養細胞を3種の異なる濃度のNTP(0.001NU/ml, 0.01NU/mL, 及び 0.1NU/mL)で3日間処理した。プロテオグリカンとコラーゲンの合成を評価するために、培養細胞を35S-sulfate又は3H-prolineでそれぞれ最終4時間又は16時間放射線ラベルした。放射線ラベルした後、既に報告されている方法により［Masuda, K. et al., J Orthop Res., 21, 922-930 (2003) and Akeda, K, Spine, 31, 959-966 (2006)］、ビーズと培地を回収してパパインで処理し、培地及びアルギン酸ビーズ中の放射性前駆物質の取り込み量を別々に測定した。細胞増殖については、CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay（Promega, Madison, WI）を用いて評価した。異なるバッチの細胞を用いた3回の実験から得られた全てのデータを各々の実験におけるコントロール群の平均値で標準化した。処理による効果はポストホックテストとしてANOVAを用いたPSLDテストで評価した。
２．結果
1）細胞増殖
酸素濃度及びNTP処理は、7日間及び14日間の両時点において髄核(NP)細胞及び線維輪(AF)細胞の増殖に影響しなかった。
2）プロテオグリカン合成
髄核(NP)細胞において、5％酸素濃度での培養条件下でNTP処理することにより、プロテオグリカンの合成は有意に増加した（図２：0.01NU/ml, +65%, p<0.05、 0.1NU/ml, +66%, p<0.05）。正常酸素濃度での培養条件下では、髄核(NP)細胞におけるプロテオグリカンの合成に有意差は認められなかった。図１に示すように、線維輪(AF)細胞においては、正常酸素濃度条件下及び低酸素濃度条件下とも、NTPはプロテオグリカンの合成レベルに変化をもたらさなかった。
3）コラーゲン合成
5％酸素条件下での髄核(NP)細胞並びに21％酸素条件下での髄核(NP)細胞及び線維輪(AF)細胞におけるコラーゲン合成は、図３及び４に示す通り、NTP処理により濃度依存的に増加した（0.1NU/ml：髄核(NP)細胞, 5%O2, +50%；髄核(NP)細胞, 21%O2, +63%;；線維輪(AF)細胞, 21%O2, +47%で最高刺激）。
以上に示したとおり、本試験において初めて、NTPが椎間板細胞の細胞外基質の合成を刺激し得ることが明らかにされた。興味深いことに、髄核(NP)細胞におけるプロテオグリカン合成に対するNTPの作用は、21％酸素培養条件下より5％酸素培養条件下で、より顕著であった。in vivoでの髄核(NP)細胞の低酸素条件を考慮すると、髄核(NP)細胞は生理学的に関連のある条件下で、NTPの影響を受け得ることが、これらの結果により示唆される。髄核(NP)細胞におけるコラーゲン合成に対するNTPのポジティブな作用は、5％酸素及び21％酸素条件下の両者で観察されたが、線維輪(AF)細胞では21％酸素条件下でしか観察されなかった。NTPによる髄核(NP)細胞におけるプロテオグリカン合成の増加とは違って、線維輪(AF)細胞は、21％酸素条件下でNTPの影響をより受けていた。酸素圧は髄核(NP)細胞より線維輪(AF)細胞において有意に高いので、21％酸素条件で線維輪(AF)細胞がNTPの影響をより大きく受けているのは、至適培養条件も反映しているのかもしれない。
軟骨細胞は関節軟骨（articular cartilage）、椎間板（intervertebral disc）、半月板（meniscus）等の種々の軟骨に存在する。軟骨細胞は分裂増殖をしながら周囲に細胞外基質（extracellular matrix）を産生して軟骨組織を形成する。軟骨は、無定形基質と線維成分の組成比率の違いにより、硝子軟骨、弾性軟骨及び線維軟骨に分類される。細胞外基質の主成分がプロテオグリカン及びコラーゲンである。NTPが椎間板細胞等の軟骨細胞におけるプロテオグリカン及びコラーゲンの合成を促進する作用を有することから、NTPは各種軟骨における軟骨細胞の細胞外基質の再生に効果があることが示唆された。
本発明は、ワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物の新規な医薬用途に関するものであり、具体的にはワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物の椎間板細胞、関節軟骨細胞、半月板細胞等の軟骨細胞におけるコラーゲン及びプロテオグリカンの合成促進方法等に関する。本発明の好ましい実施態様は以下のとおりである。
1．ワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物を治療の必要な患者に投与することからなる、患者の軟骨細胞におけるプロテオグリカン及び／又はコラーゲンの合成を促進させる方法。
2．ワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物を含有してなる軟骨細胞におけるプロテオグリカン及び／又はコラーゲンの合成促進剤。
3．軟骨細胞におけるプロテオグリカン及び／又はコラーゲンの合成を促進させるためのワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物の使用。
4．培養軟骨細胞におけるプロテオグリカン及び／又はコラーゲンの合成促進作用を指標とするワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物の判定又は評価方法。
5．軟骨細胞におけるプロテオグリカン及び／又はコラーゲンの合成促進作用を有するワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物。
6．ワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物を治療が必要な患者に投与することからなる、軟骨細胞の細胞外基質の再生方法。
7．ワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物を含有してなる軟骨細胞の細胞外基質再生剤。
8．軟骨細胞の細胞外基質を再生させるためのワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物の使用。
9．軟骨細胞の細胞外基質再生作用を指標とするワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物の判定又は評価方法。
10．軟骨細胞の細胞外基質再生作用を有するワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物。
11．ワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物を治療が必要な患者に投与することからなる、椎間板細胞（ウシ髄核細胞）におけるプロテオグリカン合成を促進させる方法。
12．ワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物を治療が必要な患者に投与することからなる椎間板細胞（ウシ髄核細胞又は線維輪細胞）におけるコラーゲン合成を促進させる方法。
13．ワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物を含有してなる椎間板細胞（ウシ髄核細胞）におけるプロテオグリカン合成促進剤。
14．ワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物を含有してなる椎間板細胞（ウシ髄核細胞又は線維輪細胞）におけるコラーゲン合成促進剤。
15．椎間板細胞（ウシ髄核細胞）におけるプロテオグリカン合成を促進させるためのワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物の使用。
16．椎間板細胞（ウシ髄核細胞又は線維輪細胞）におけるコラーゲン合成を促進させるためのワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物の使用。
17．培養椎間板細胞（ウシ髄核細胞）におけるプロテオグリカン合成促進作用を指標とするワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物の判定又は評価方法。
18．培養椎間板細胞（ウシ髄核細胞又は線維輪細胞）におけるコラーゲンの合成促進作用を指標とするワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物の判定又は評価方法。
19．椎間板細胞（ウシ髄核細胞）におけるプロテオグリカンの合成促進作用を有するワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物。
20．椎間板細胞（ウシ髄核細胞又は線維輪細胞）におけるコラーゲンの合成促進作用を有するワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物。
21．ワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物を治療が必要な患者に投与することからなる、椎間板細胞の細胞外基質の再生方法。
22．ワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物を含有してなる椎間板細胞の細胞外基質再生剤。
23．椎間板細胞の細胞外基質を再生させるためのワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物の使用。
24．椎間板細胞の細胞外基質再生を指標とするワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物の判定又は評価方法。
25．椎間板細胞の細胞外基質再生作用を有するワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物。
26．ワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物を治療が必要な患者に投与することからなる、変性椎間板の治療又は予防方法。
27．ワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物を含有してなる変性椎間板の治療又は予防剤。
28．変性椎間板を治療又は予防するためのワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物の使用。
29．ワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物を治療が必要な患者に投与することにより椎間板細胞の細胞外基質を再生させる、椎間板変性による疼痛の治療又は予防方法。
30．ワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物を治療が必要な患者に投与することにより椎間板細胞（ウシ髄核細胞）におけるプロテオグリカンの合成を促進させる、椎間板変性による疼痛の治療又は予防方法。
31．ワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物を治療が必要な患者に投与することにより椎間板細胞（ウシ髄核細胞又は線維輪細胞）におけるコラーゲンの合成を促進させる、椎間板変性による疼痛の治療又は予防方法。
32．炎症組織がウサギの皮膚組織である上記の副段落1-31のいずれかに記載の態様。

Claims (26)

  1. ワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物を治療が必要な患者に投与することからなる、軟骨細胞におけるプロテオグリカン及び／又はコラーゲン合成を促進する方法。
  2. 軟骨細胞が椎間板細胞である請求項１記載の方法。
  3. 椎間板細胞がウシ髄核細胞及び／又は線維輪細胞である請求項２記載の方法。
  4. プロテオグリカン合成を促進する請求項２記載の方法。
  5. コラーゲン合成を促進する請求項２記載の方法。
  6. 炎症組織がウサギ皮膚組織である請求項２記載の方法。
  7. 椎間板細胞がウシ髄核細胞である請求項４記載の方法。
  8. 椎間板細胞が線維輪細胞である請求項４記載の方法。
  9. 椎間板細胞がウシ髄核細胞である請求項５記載の方法。
  10. 椎間板細胞が線維輪細胞である請求項５記載の方法。
  11. ワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物による培養軟骨細胞におけるプロテオグリカン及び／又はコラーゲン合成促進作用を指標とする該抽出物の判定又は評価方法。
  12. 軟骨細胞が椎間板細胞である請求項１１記載の方法。
  13. 椎間板細胞がウシ髄核細胞及び／又は線維輪細胞である請求項１２記載の方法。
  14. プロテオグリカン合成を促進する請求項１２記載の方法。
  15. コラーゲン合成を促進する請求項１２記載の方法。
  16. 炎症組織がウサギ皮膚組織である請求項１２記載の方法。
  17. ワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物を治療が必要な患者に投与することからなる、軟骨細胞の細胞外基質修復方法。
  18. 軟骨細胞の細胞外基質が椎間板細胞の細胞外基質である請求項１７記載の方法。
  19. ワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物による軟骨細胞の細胞外基質の再生活性を指標とする該抽出物の判定又は評価方法。
  20. 軟骨細胞の細胞外基質が椎間板細胞の細胞外基質である請求項１９記載の方法。
  21. ワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物を治療が必要な患者に投与することからなる変性椎間板の治療方法。
  22. ワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物を治療が必要な患者に投与することにより椎間板細胞の細胞外基質を再生することからなる、椎間板変性による疼痛の治療方法。
  23. ワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物を治療が必要な患者に投与することにより椎間板細胞におけるプロテオグリカン合成を促進することからなる、椎間板変性による疼痛の治療方法。
  24. ワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物を治療が必要な患者に投与することにより椎間板細胞におけるコラーゲン合成を促進することからなる、椎間板変性による疼痛の治療方法。
  25. ワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物を含有する変性椎間板の治療又は予防剤。
  26. ワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物を含有する椎間板細胞におけるプロテオグリカン及び／又はコラーゲン合成促進剤。
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