JP2013543980A5 - 自然放出蛍光をパルス励起、連続脱励起、およびゲート記録するｓｔｅｄ顕微鏡法、ｓｔｅｄ蛍光相関分光法、およびｓｔｅｄ蛍光顕微鏡 - Google Patents

Description

好ましくは、蛍光の自然放出および最大照射強度の脱励起光により誘導される誘導放出の両方により励起状態が減衰する場合、時間分解能は少なくとも蛍光体の励起状態の寿命と同じ高さである。この寿命はまた、脱励起光の強度分布のゼロポイント外で蛍光体が自然放出する蛍光は記録せずに、試料が自然放出する蛍光を励起光の各パルス後に記録開始してもよい時間間隔を決定する。新規の本方法の実施に必要な絶対時間分解能は、求められる寿命の絶対値による。通常、時間分解能は少なくとも２００ピコ秒である。好ましくは、時間分解能は少なくとも１００ピコ秒である。

自然放出蛍光の記録に高時間分解能を利用する効果的で低コストな方法として、励起光の各パルス後に放出される蛍光に対して時間ゲートを設ける。この時間ゲートは自然放出蛍光を記録する検出器に設けてもよく、その場合、検出器は時間ゲートの最中のみ検知動作する。もしくは、このゲートは検出器により記録される蛍光全体から特定の蛍光を分離するために用いてもよい。これを目的として、検出器自体とは別に時間ゲートを設けてもよい。しかしながら、蛍光の記録に用いられる各装置は求められる高時間分解能を有していなければならない。したがって、個別に設けられるゲートも高時間分解能を有する検出器、すなわち、時間ジッタのほとんどない検出器を必要とする。適切なものとして、時間ジッタが１００ピコ秒以下の好適な単一光子計数検出器が市販されている。

Claims (23)

1. 試料（２）内の蛍光体で標識された構造を撮像するＳＴＥＤ蛍光顕微鏡法であって、
   蛍光体を励起して蛍光（９）を放出させるために、少なくとも１個の焦点域に焦点される励起光（３）を前記試料（２）にパルス照射する工程と、
   励起した前記蛍光体を脱励起するために、前記少なくとも１個の焦点域内に強度ゼロポイントを備える脱励起光（１２）を前記試料（２）に連続照射する工程と、
   前記試料（２）内の励起した前記蛍光体が自然放出する蛍光（９）を、前記励起光（３）の各パルス後に、前記脱励起光（１２）の照射を継続した状態で、記録する記録工程と、
   前記パルス照射および連続照射する工程と前記記録工程を前記励起光（３）の焦点域および前記脱励起光（１２）の強度ゼロポイントの異なる位置で繰返し実行する工程と、を備え、
   前記記録工程において、励起した前記蛍光体が自然放出する前記蛍光（９）は前記励起光（３）の繰り返し照射される各パルスの間の時間に記録され、
   前記記録工程において、前記励起光（３）の前記各パルスの後に放出される前記蛍光（９）に対して少なくとも１個の時間ゲートが設けられ、
   前記少なくとも１個の時間ゲートは前記励起光（３）の前記各パルスをトリガー信号として所定の時間間隔で開放および閉鎖されることを特徴とする、方法。
2. 試料（２）に含まれる蛍光体の変動を前記試料（２）の空間的に制限された所定範囲内で観察するＳＴＥＤ蛍光相関分光法であって、
   蛍光体を励起して蛍光（９）を放出させるために、少なくとも１個の焦点域に焦点される励起光（３）を前記試料（２）にパルス照射する工程と、
   励起した前記蛍光体を脱励起し、前記少なくとも１個の焦点域内に強度ゼロポイント備える脱励起光（１２）を前記試料（２）に連続照射する工程と、
   前記試料（２）内の励起した前記蛍光体が自然放出する蛍光（９）を、前記励起光（３）の各パルス後に、前記脱励起光（１２）の照射を継続した状態で、記録する記録工程とを備え、
   前記記録工程において、励起した前記蛍光体が自然放出する前記蛍光（９）は前記励起光（３）の繰り返し照射される各パルスの間の時間に記録され、
   前記記録工程において、前記励起光（３）の前記各パルスの後に放出される前記蛍光（９）に対して少なくとも１個の時間ゲートが設けられ、
   前記少なくとも１個の時間ゲートは前記励起光（３）の前記各パルスをトリガー信号として所定の時間間隔で開放および閉鎖されることを特徴とする、方法。
3. 前記記録工程において、励起した前記蛍光体が放出する前記蛍光（９）は、前記蛍光（９）の自然放出によってのみ減衰する前記蛍光体の励起状態の寿命より高い時間分解能で記録される、請求項１又は請求項２に記載の方法。
4. 前記記録工程において、励起した前記蛍光体が放出する前記蛍光（９）は、少なくとも、前記蛍光（９）の自然放出および最大照射強度の前記脱励起光（１２）による脱励起により減衰する蛍光体の励起状態の寿命と同程度に高い時間分解能で記録される、請求項３に記載の方法。
5. 前記記録工程において、励起した前記蛍光体が放出する前記蛍光（９）は少なくとも２００ピコ秒の時間分解能で記録される、請求項３又は請求項４に記載の方法。
6. 前記記録工程において、励起した前記蛍光体が放出する前記蛍光（９）は少なくとも１００ピコ秒の時間分解能で記録される、請求項５に記載の方法。
7. 前記少なくとも１個の時間ゲートは、前記脱励起光（１２）の強度ゼロポイント外の励起した前記蛍光体の原則的に全てが蛍光を放出した直後に開放される、請求項１〜６のうちいずれか一項に記載の方法。
8. 前記少なくとも１個の時間ゲートは、前記励起光（３）の焦点域内の励起した前記蛍光体の原則的に全てが蛍光を放出する前に閉鎖される、請求項１〜７のうちいずれか一項に記載の方法。
9. 前記記録工程において、さらに補完的時間ゲートが備えられ、前記少なくとも１個の時間ゲートおよび前記補完的時間ゲートは交互に開放および閉鎖される、請求項１〜８のうちいずれか一項に記載の方法。
10. 前記記録工程において、前記励起光（３）の各パルスの後に自然放出される前記蛍光（９）に対して前記少なくとも１個の時間ゲートおよび前記少なくとも１個の時間ゲートの後に位置する第２の時間ゲートが設けられ、前記第２の時間ゲートは、前記試料に含まれる第２の励起蛍光体より短い寿命を有する第１の励起蛍光体の原則的に全てが蛍光を放出した後にのみ開放される、請求項１〜９のうちいずれか一項に記載の方法。
11. 前記励起光（３）のパルス照射工程において、前記励起光（３）の波長は、多光子プロセスを介して蛍光体を励起して蛍光（９）を放出させるよう選択される、請求項１〜１０のうちいずれか一項に記載の方法。
12. 前記励起光（３）のパルス照射工程において、前記励起光（３）の波長は波長のスーパーコンティニウムから選択される、請求項１〜１１のうちいずれか一項に記載の方法。
13. 試料（２）に含まれる蛍光体を励起して蛍光（９）を放出させるために、少なくとも１個の焦点域に焦点される励起光（３）を前記試料（２）にパルス照射するパルス励起光源（４）と、
    励起した前記蛍光体を脱励起するために、前記少なくとも１個の焦点域内に強度ゼロポイントを備える脱励起光（１２）を前記試料（２）に連続照射する脱励起光源（１１）と、
    前記試料（２）内の励起した前記蛍光体が自然放出する蛍光（９）を前記励起光（３）の各パルス後に、前記脱励起光（１２）の照射を継続した状態で、記録する検出器（１０）と、を備えるＳＴＥＤ蛍光顕微鏡（１）であって、
    前記検出器（１０）は、励起した前記蛍光体が自然放出する前記蛍光（９）を前記パルス励起光源（４）から繰り返し照射される各パルスの間の時間に記録し、
    前記検出器（１０）は少なくとも１個の時間ゲート（１５）を備え、
    前記少なくとも１個の時間ゲート（１５）は前記パルス励起光源（４）の前記各パルスにより起動され、
    前記少なくとも１個の時間ゲートは前記励起光（３）の前記各パルスをトリガー信号として所定の時間間隔で開放および閉鎖される、ことを特徴とする顕微鏡（１）。
14. 前記検出器（１０）は、励起した前記蛍光体が放出する前記蛍光（９）を少なくとも２００ピコ秒の時間分解能で記録する、請求項１３に記載の顕微鏡（１）。
15. 前記検出器（１０）は、励起蛍光体が放出する前記蛍光（９）を少なくとも１００ピコ秒の時間分解能で記録する、請求項１４に記載の顕微鏡（１）。
16. 前記検出器（１０）の時間ジッタは２００ピコ秒以下である、請求項１４に記載の顕微鏡（１）。
17. 前記検出器（１０）の時間ジッタは１００ピコ秒以下である、請求項１５に記載の顕微鏡（１）。
18. 前記検出器（１０）は単一光子計数器を含む、請求項１３〜１７のうちいずれか一項に記載の顕微鏡（１）。
19. 前記検出器（１０）は更に補完的時間ゲートを備え、前記少なくとも１個の時間ゲートおよび前記補完的時間ゲートは交互に開放および閉鎖される、請求項１３〜１８のうちいずれか一項に記載の顕微鏡（１）。
20. 前記脱励起光源（１１）は連続波レーザダイオードである、請求項１３〜１９のうちいずれか一項に記載の顕微鏡（１）。
21. 前記パルス励起光源（４）は、前記検出器（１０）が記録する蛍光の波長の約２倍の長さを有する波長の励起光（３）を放出する、請求項１３〜２０のうちいずれか一項に記載の顕微鏡（１）。
22. 前記パルス励起光源（４）は、音響光学変調器を用いて前記励起光（３）の波長を選択するための波長のスーパーコンティニウムを出力する、請求項１３〜２１のうちいずれか一項に記載の顕微鏡（１）。
23. 前記パルス励起光源（４）からの前記励起光（３）の焦点域および前記脱励起光源（１１）からの前記脱励起光（１２）の強度ゼロポイントを用いて前記試料（２）を走査する走査ステージを更に備える、請求項１３〜２２のうちいずれか一項に記載の顕微鏡（１）。