WO2016092161A1 - Procédé et dispositif de mesure optique - Google Patents

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WO2016092161A1
WO2016092161A1 PCT/FR2015/000224 FR2015000224W WO2016092161A1 WO 2016092161 A1 WO2016092161 A1 WO 2016092161A1 FR 2015000224 W FR2015000224 W FR 2015000224W WO 2016092161 A1 WO2016092161 A1 WO 2016092161A1
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PCT/FR2015/000224
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Gabriel Y. Sirat
Lionel Moisan
Clément FALLET
Julien CARON
Maxime Dubois
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Bioaxial Sas
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging
    • G01N21/6458—Fluorescence microscopy
    • G—PHYSICS
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    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
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    • G—PHYSICS
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    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
    • G02B21/002—Scanning microscopes
    • G02B21/0024—Confocal scanning microscopes (CSOMs) or confocal "macroscopes"; Accessories which are not restricted to use with CSOMs, e.g. sample holders
    • G02B21/0052—Optical details of the image generation
    • G02B21/0076—Optical details of the image generation arrangements using fluorescence or luminescence
    • G—PHYSICS
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    • G02B21/002—Scanning microscopes
    • G02B21/0024—Confocal scanning microscopes (CSOMs) or confocal "macroscopes"; Accessories which are not restricted to use with CSOMs, e.g. sample holders
    • G02B21/008—Details of detection or image processing, including general computer control

Definitions

  • the present invention relates to a method and an optical measuring device. It finds applications in all fields of imaging, in particular but not limited to the field of microscopy, including but not limited to the fields of Biology, Medicine, Pharmacy, Semiconductors, Study of materials, metrology, control, measurement and observation and all information acquisition processes from optical observations, in the macroscopic or microscopic domain.
  • An optical microscope is an instrument commonly used to view, analyze, or measure objects that are too small to view with the naked eye.
  • Figure. 1 represents an illustration of the paradigm of Microscopy, 100.
  • Optical microscopy consists of the illumination, by a light source, not shown, using a Microscope, 10, of a biological or non-biological sample, 11, and the measurement as a function of time, at using a visual observation or a detection module, 12, of the light emitted, re-emitted, scattered or reflected or transmitted by the sample.
  • the sample consists of one or a plurality of different biological object entities, 13 and 14, positioned at different positions. Examples of such objects are, inter alia, a cell, a virus, a protein or a DNA fragment.
  • the sample may be, for example, a semiconductor element
  • Microscopy is segmented into different modalities with different characteristics and purposes. Many descriptions of the different modalities, their
  • Microscopy can be segmented in different ways: one of them is to distinguish the microscopic modalities devolved to the visualization of minute point sources from those devolved to the measurement of continuous objects.
  • the case of tiny point sources is a priori much simpler.
  • the object consists of a small number of luminous points; these can be described by a small number of parameters - the descriptors defined later - greatly simplifying the physical problem and the algorithmic complexity.
  • the case of a continuous object, described by a spatial distribution - or spatio-temporal, if one takes into account the continuous dynamics, is different and is also described in this patent application. Fluorescence microscopy
  • Fluorescence microscopy is one of the modalities of microscopy; in many applications it has replaced other microscopy techniques.
  • a fluorescence microscope is an optical microscope used to study the properties of objects, or organic or inorganic substances using fluorescence phenomena instead of, or in addition to other modalities such as reflection and absorption.
  • the sample is illuminated by light of wavelength, or specific wavelengths, which is absorbed by the point sources, thereby inducing light emission at different wavelengths and higher.
  • the illumination light is separated from the emitted fluorescence, which is lower, by the use of a spectral emission filter.
  • Fluorescence microscopy studies light emitted by small point sources, fluorophores. However, when the density of the fluorophores is high, the fluorophores are no longer analyzed individually but treated as a continuous object. It is important to note at this stage that the same system allows the observation of continuous objects, and is not limited to the observation of point sources.
  • Fluorophores have become an important tool in the visualization of biological objects. Activity and biological information with details above the 200-250 nm resolution limit are systematically visualized and measured using fluorescence microscopy. This resolution limit is derived from the Rayleigh criterion, which, in the best case, reaches 200-250 nm in specially designed systems. For a long time, until the emergence of the superresolution techniques described below, it was recognized that optical techniques, including fluorescence microscopy, are unable to visualize details smaller than the Rayleigh criterion, the order of 200 - 250 nm.
  • FIG. 2 is a simplified representation of a confocal fluorescence microscope of the prior art 200.
  • FIG. 2 A confocal fluorescence microscope, FIG. 2, is an optical instrument. Its main hardware components are shown in the figure. 2. They include:
  • a treatment unit not shown.
  • the light source, 20, which may be an arc lamp or a laser, creates light energy necessary for fluorescence.
  • the optomechanical frame is the support for all optical elements and includes auxiliary optics and alignment capabilities. It also comprises optical elements, not shown, capable of shaping the beam, to allow its focusing of a point of minimum size, by means of the objective of the microscope.
  • It may also comprise, in a confocal scanning fluorescence microscope, a scanning mechanism, spatial or angular, not shown to modify the position of the point source with respect to the object to be measured.
  • the filter cube 21, channels the different optical signals and avoids contamination of the fluorescence signal by the excitation light.
  • the filter cube is decomposed into: excitation filter, 210, dichroic mirror, 211, and emission filter, 212.
  • the microscope objective, 22, focuses the light created by the source in the focal plane of the objective, 24, into a light distribution of reduced size, the light distribution considered optimal consisting of an Airy disc.
  • the microscope objective, 22, also makes it possible to collect in return the fluorescent light emitted by the fluorophores.
  • the system can be decanned, ie the back light can pass through the scanning mechanism to compensate for translation due to scanning.
  • a detector lens, 25, creates, in the image plane of the detector 26, a magnified image of the focal plane of the objective, 24.
  • a confocal hole, 27, is theoretically placed in the image plane of the detector, 26. In most practical systems, the confocal hole, 27, is placed in an imaging plane
  • the detector assembly, 23 detects the overall fluorescent intensity in the illuminated volume, and transforms it into a digital signal.
  • the detector assembly consists of a single element detector, such as a PMT or SPAD.
  • the detector assembly consists of a matrix of detection elements, such as a CCD, an EMCCD, a CMOS or a SPAD matrix.
  • All of the components mounted from the light source to the dichroic filter are the light path, 201. All the components mounted from the dichroic filter to the detector assembly are the detection channel , 202.
  • Fluorescence microscopes are available from several manufacturers, such as, for example, Nikon, Zeiss, Leica or Olympus. Fluorescence microscopes can be either standard microscopes suitable for fluorescence or specific microscopes optimized for fluorescence. Modern microscopes are versatile instruments capable of operating in many different modalities, including, but not limited to, fluorescence modalities, using the same optomechanical platform and most components. Most fluorescence microscopes are developed as an open platform, capable of performing several additional features with minimal modifications. Other fluorescence microscopes are dedicated instruments, customized to a specific task, such as medical or pharmaceutical diagnosis.
  • New superresolution techniques provide information beyond the resolution limit.
  • the main problem of all existing superresolution techniques is the performance envelope limit, expressed in terms of resolution, lateral and longitudinal, velocity, light intensity required and phototoxicity in the biological object, and therefore ability to measure different biological objects. This point was also emphasized by Eric Betzig, during his masterly presentation at the ceremony of reception of the Nobel Prize of Chemistry 2014.
  • these instruments can generally observe only a small portion of biological specimens, due to severe operational limitations, such as for some of them a shallow depth of field or very high intensities harmful to the cells.
  • a first aspect of the invention relates to an optical measuring device for determining the spatial distribution or the location of re-emitting sources on a sample, the sample comprising at least one re-emitting source, excited by light and re-emitting light according to a law. determined according to the light projected onto the sample, the device comprising
  • an achromatic projection module containing a laser, whose wavelength is tuned to the excitation wavelength of said at least one re-emitting source, to create either a compact light distribution or a sequence of the compact light distributions of different topology
  • a detection module for detecting the light re-emitted by said at least one re-emitting source of the sample for the or each of the different compact light distributions of topology and for each of the scanning points of the sample;
  • an image acquisition module for acquiring for each scanning point, an image or a sequence of images, for the image sequence, each image corresponding to one of the compact light distributions of different topologies
  • an algorithm module in which the formulation of the reconstruction of the sample and its spatial and / or temporal and / or spectral properties is considered as a Bayesian inverse problem and leads to the definition of a posterior distribution.
  • a posteriori law can combine, thanks to the Bayesian law, the probabilistic formulation of a noise model, as well as possible aprioris on a distribution of light created in the sample by projection.
  • the estimation of the posterior mean is carried out using a Monte Carlo Markov Chain (MCMC) algorithm.
  • MCMC Monte Carlo Markov Chain
  • Another aspect of the invention relates to an optical measuring device for determining the spatial distribution or location of re-emitting sources on a sample, the sample comprising at least one re-emitting source, excited by light and re-emitting light according to a law. determined according to the light projected onto the sample, the device comprising an achromatic projection module, containing a laser, whose wavelength is tuned to the excitation wavelength of said at least one re-emitting source, to create either a compact light distribution or a sequence of the compact light distributions of different topology,
  • a scanning module for optically scanning the sample, integrated or not in the device
  • a detection module for detecting light re-emitted by said at least one re-emitting source of the sample for the or each of the different compact light distributions of topology and for each of the scanning points of the object;
  • an image acquisition module for acquiring for each scanning point, an image or a sequence of images, for the image sequence, each image corresponding to one of the compact light distributions of different topologies
  • the MAP algorithm furthermore contains a frequency-band limitation constraint
  • the MAP algorithm uses a Nesterov accelerated numerical scheme.
  • the redundancy in the frequency information is used, due to the different frequency characteristics of the different distributions projected on the sample, to compensate and greatly reduce the impact of missing points or sweep irregularities.
  • the MAP algorithm is adapted to solve an inverse problem involving a sum of a small number of terms, such as a low-frequency component and a more parsimonious component.
  • the MAP algorithm is adapted to impose a non-local redundancy constraint on the solution, for example by calculating weights on the images or on the different digital masks and the non-local similarity tree. being applied to the solution as a regularization.
  • a mask of variable size is used in the plane of the detector to obtain images having either different axial characteristics or different or optimized stray light rejection capabilities, globally or locally.
  • a computer program configured to implement the embodiments described above.
  • Another aspect of the invention relates to an optical measuring method for determining the spatial distribution or location of re-emitting sources on a sample, the sample having at least one re-emitting source, excited by light and re-emitting light according to a law. determined according to the light projected onto the sample, the method comprising
  • achromatic projection by a laser, whose wavelength is tuned to the excitation wavelength of said at least one re-emitting source, to create either a compact light distribution or a sequence of different compact light distributions of topology ,
  • a posteriori law can combine, thanks to the Bayesian law, the probabilistic formulation of a noise model, as well as possible aprioris on a distribution of light created in the sample by projection.
  • the algorithm comprises
  • the estimation of the posterior mean is carried out using a Monte Carlo Markov Chain (MCMC) algorithm.
  • MCMC Monte Carlo Markov Chain
  • Another aspect of the invention relates to an optical measuring method for determining the spatial distribution or location of re-emitting sources on a sample, the sample having at least one re-emitting source, excited by light and re-emitting light according to a law. determined according to the light projected onto the sample, the method comprising achromatic projection, by a laser, whose wavelength is tuned to the excitation wavelength of said at least one re-emitting source, to create either a compact light distribution or a sequence of different compact light distributions of topology ,
  • the MAP algorithm furthermore contains a frequency-band limitation constraint
  • the MAP algorithm uses an accelerated numerical scheme of Nesterov type
  • the redundancy in the frequency information is used, due to the different frequency characteristics of the different distributions projected on the sample, to compensate and greatly reduce the impact of missing points or sweep irregularities.
  • the MAP algorithm is adapted to solve an inverse problem involving a sum of a small number of terms, such as a low-frequency component and a more parsimonious component.
  • the MAP algorithm is adapted to impose a non-local redundancy constraint on the solution, for example by calculating weights on the images or on the different digital masks and the non-local similarity tree. being applied to the solution as a regularization.
  • a mask of variable size is used in the plane of the detector to obtain images having either different axial characteristics or different or optimized stray light rejection capabilities, globally or locally.
  • a computer program configured to implement the embodiments described above.
  • an optical measurement method is used to determine the spatial distribution or location of re-emitting sources on a sample, the sample comprising at least one re-emitting source, said at least one re-emitting source re-emitting light according to the light projected onto the sample, according to a determined law, by a first light source comprising a first laser, whose length waveform is tuned to the excitation wavelength of the re-emitting source and the re-emitting source may be depleted or activated by the action of one or more light source (s), including at least one second a laser whose wavelength is tuned to the wavelength of depletion or activation of said re-emitting source, the method comprising the two compact light distributions propagating along the same optical path for all the lasers,
  • the compact light distribution of the first excitation laser being of regular topological family, ideally a Gaussian distribution or an Airy spot,
  • the compact light distribution of the depletion or activation laser consisting of a superposition of a singular distribution, of the vortex type, on a first polarization, linear or circular, and a so-called distribution of black sphere or "top-hat” on the polarization orthogonal to the first polarization,
  • said compact light distributions being created by a cascade of at least two conical diffraction crystals, or an assembly of uniaxial crystals, optionally separated by a chromatic polarization control element or not, dynamic or static,
  • the polarization control element described is an optical element consisting of an assembly of one or two quarter-wave achromatic waves and a chromatic wave plate all being designed so that the optical element created, between the two conical crystals or between two uniaxial crystals, a rotation difference of the polarization between the excitation beam and the depletion beam close to 180 degrees and not differing by more than 30 degrees of this value
  • the polarization control element is an optical element whose material has an optical activity property and the thickness of the optical element is selected so that that the natural dispersion of the optical activity of the material created between the two conical crystals or between two uniaxial crystals for a rotation difference of the polarization between the excitation beam and the depletion beam close to 180 degrees and not differing more than 30 degrees of this value
  • no polarization control element is used but the two conical crystals are of different material and the natural dispersion of these two materials compensates for conical diffraction at approximately the same time. excitation wavelength and not at the wavelength of depletion.
  • an optical device is used to determine the spatial distribution or location of re-emitting sources on a sample, the sample having at least one re-emitting source, said at least one re-emitting source re-emitting light in a function of the light projected on the sample, according to a determined law, by a first light source comprising a first laser, the wavelength of which is tuned to the excitation wavelength of the re-emitting source and the re-emitting source capable of being depleted or activated by the action of one or more light source (s), comprising at least one second laser, the wavelength of which is tuned to the depletion or activation wavelength said re-emitting source, the method comprising the two compact light distributions propagating along the same optical path for all the lasers,
  • the compact light distribution of the first excitation laser being of regular topological family, ideally a Gaussian distribution or an Airy spot,
  • the compact light distribution of the depletion or activation laser consisting of a superposition of a singular distribution, of the vortex type, on a first polarization, linear or circular, and a so-called distribution of black sphere or "top-hat” on the polarization orthogonal to the first polarization,
  • said compact light distributions being created by a cascade of at least two conical diffraction crystals, or an assembly of uniaxial crystals, optionally separated by a chromatic polarization control element or not, dynamic or static,
  • the polarization control element described is an optical element consisting of an assembly of one or two quarter-wave achromatic waves and a chromatic wave plate all being designed so that the optical element created, between the two conical crystals or between two uniaxial crystals, a rotation difference of the polarization between the excitation beam and the depletion beam close to 180 degrees and not differing by more than 30 degrees of this value
  • the polarization control element is an optical element whose material has an optical activity property and the thickness of the optical element is selected so that that the natural dispersion of the optical activity of the material created between the two conical crystals or between two uniaxial crystals for a rotation difference of the polarization between the excitation beam and the depletion beam close to 180 degrees and not differing more than 30 degrees of this value
  • Another implementation of this invention describes an optical method for locally evaluating spherical aberration in each sample location, or each location of the object being imaged, using conical diffraction and its phase effects and polarization.
  • the sample is illuminated with a non-uniform light distribution, which may be, for example but not limited to, a black sphere (or top hat) so that the 3D distribution has two lobes of the same intensity below and above above the focal plane. In the presence of spherical aberration in the system, these two lobes are not of the same intensity.
  • By then analyzing the intensity ratio of the two images we can deduce the amount of spherical aberration of the system.
  • Another implementation of this invention describes an optical device for locally evaluating spherical aberration in each sample location, or each location of the object being imaged, using conical diffraction and its phase effects and polarization.
  • the sample is illuminated with a non-uniform light distribution, which may be, for example but not limited to, a black sphere (or top hat) so that the 3D distribution has two lobes of the same intensity below and above above the focal plane. In the presence of spherical aberration in the system, these two lobes are not of the same intensity.
  • By then analyzing the intensity ratio of the two images we can deduce the amount of spherical aberration of the system.
  • Another implementation of this invention describes an optical method for locally evaluating spherical aberration in each sample location, or each location of the object being imaged, using conical diffraction and its phase effects and polarization.
  • the shaping of a light beam by conical diffraction through a cascade of crystals makes it possible to obtain an intensity distribution directly connected to the spherical aberration.
  • This distribution can be obtained, for example but without limitation, between crossed linear polarizers and two biaxial crystals whose optical axes are aligned. A half-wave plate is inserted between the two crystals. Due to its characteristic shape, this distribution will be called "four-leaf clover" or "four-leaf-clover" in English.
  • this distribution consists of four perfectly equal lobes and all in the same focus.
  • Spherical aberration induced by an optical system breaks the symmetry of this distribution both in focus and intensity distribution in the four lobes.
  • a fine measure of the spherical aberration value is possible by a lobe focus offset estimator and intensity ratios at different focus planes.
  • Another implementation of this invention describes an optical device for locally evaluating spherical aberration in each sample location, or each location of the object being imaged, using conical diffraction and its phase effects and polarization.
  • the shaping of a light beam by conical diffraction through a cascade of crystals makes it possible to obtain an intensity distribution directly connected to the spherical aberration.
  • This distribution can be obtained, for example but without limitation, between crossed linear polarizers and two biaxial crystals whose optical axes are aligned. A half-wave plate is inserted between the two crystals. Due to its characteristic shape, this distribution will be called "four-leaf clover" or "four-leaf-clover" in English.
  • this distribution consists of four perfectly equal lobes and all in the same focus.
  • Spherical aberration induced by an optical system breaks the symmetry of this distribution both in focus and intensity distribution in the four lobes.
  • a fine measure of the spherical aberration value is possible by a lobe focus offset estimator and intensity ratios at different focus planes.
  • Another implementation of this invention describes an optical method for real-time calibration of a point tracking beam scanning system generated by a near infrared laser diode.
  • An optical method is carried out making it possible to follow in real time on a camera a scanned point by a beam scanning system (galvanometric mirrors, bidirectional piezoelectric mirror or any other system).
  • a beam scanning system galvanometric mirrors, bidirectional piezoelectric mirror or any other system.
  • Another implementation of this invention describes an optical device for real-time calibration of a point tracking beam scanning system generated by a near infrared laser diode.
  • An optical method is carried out making it possible to follow in real time on a camera a scanned point by a beam scanning system (galvanometric mirrors, bidirectional piezoelectric mirror or any other system).
  • a beam scanning system galvanometric mirrors, bidirectional piezoelectric mirror or any other system.
  • Another implementation of this invention describes an optical method, prism
  • Modified Wollaston for duplicating a set of light distributions without changing the relationships between them, which can be used in the methods described in this invention or in the STED methods described in this invention or other standard STED methods.
  • By using several Wollaston prisms in cascade it is thus possible to separate an incident beam into a large number of emerging beams.
  • the same effect can be achieved by modifying the Wollaston prism, to create the composite Wollaston prism, by adding uniaxial crystal pieces whose index and orientation of the birefringence are appropriately selected. It is thus possible to construct a prism of a single block of uniaxial crystal which can separate an incident beam into 2 n emergent beams (e.g.
  • Another implementation of this invention describes an optical device, modified Wollaston prism, to duplicate a set of light distributions without changing the relationships between them, which can be used in the context of the devices described in this invention or as part of the STED devices. described in this invention or other standard STED devices.
  • By using several Wollaston prisms in cascade it is thus possible to separate an incident beam into a large number of emerging beams.
  • the same effect can be achieved by modifying the Wollaston prism, to create the composite Wollaston prism, by adding uniaxial crystal pieces whose index and orientation of the birefringence are appropriately selected.
  • Another implementation of this invention describes an optical method, and an algorithmic procedure using a Poisson noise property to generate, from a realization of a Poisson VAR of parameter I (the mean), two independent realizations of a Poisson VAR of parameter 1/2, thanks to a posteriori treatment. Thanks to a random or pseudo-random number generation process, a binomial law is simulated.
  • the analysis or reconstruction of the two measurements thus generated called the Split Photon method, provides two independent results in the sense of the probabilities, and the differences between them. two results illustrate the dependence of the reconstruction algorithm on the measurement noise.
  • Another implementation of this invention describes an optical device, and an algorithmic device using a Poisson noise property to generate, from a realization of a Poisson VAR of parameter I (the average), two independent realizations of a Poisson VAR of parameter 1/2, thanks to a posteriori treatment. Thanks to a random or pseudo-random number generation process, a binomial law is simulated.
  • the analysis or reconstruction of the two measurements thus generated called the Split Photon method, provides two independent results in the sense of the probabilities, and the differences between them. two results illustrate the dependence of the reconstruction algorithm on the measurement noise.
  • Another implementation of this invention describes an optical method, and an algorithmic method using the ICE algorithm which replaces the calculation of the expectation of posterior law performed by LSE by the iteration of the explicit calculation of the mean of the law.
  • a posteriori of a pixel conditionally to its neighbors.
  • Another implementation of this invention describes an optical device, and an algorithmic device using the ICE algorithm that replaces the calculation of the expectation of the posterior law performed by LSE by the iteration of the explicit calculation of the mean of the law.
  • a posteriori of a pixel conditionally to its neighbors.
  • Another implementation of this invention describes an optical method, and an algorithmic method for measuring the proportion of signal that belongs well to the region of interest (pinhole), for each image
  • This measurement called Pinhole Ratio
  • Another implementation of this invention describes an optical device, and an algorithmic device for measuring the proportion of signal that belongs well to the region of interest (pinhole), for each image
  • This measurement called Pinhole Ratio
  • Another implementation of this invention describes an optical method, and an algorithmic method for measuring the position of the transmitter using the features of the so-called half-moon dithered distributions, described in this invention, using an appropriate algorithmic method, by a measure of the intensity ratio between the lobes.
  • This 3D location can be used either in projection, that is to say by projecting one or more half-moon distributions offset on the object and using a suitable algorithm, for example the algorithms described in this invention, or in transmission by passing the light emitted by the transmitter through an optical module creating this distribution and by analyzing the PSF back.
  • Another implementation of this invention describes an optical device, and an algorithmic device for measuring the position of the transmitter using the features of the so-called half-moon shifted distributions, described in this invention, using a device algorithmic, by measuring the intensity ratio between the lobes.
  • This 3D location can be used either in projection, that is to say by projecting one or more half-moon distributions offset on the object and using a suitable algorithm, for example the algorithms described in this invention, or in transmission by passing the light emitted by the transmitter through an optical module creating this distribution and by analyzing the PSF back.
  • Another implementation of this invention describes an optical method, and an algorithmic method for measuring the position of the transmitter using the features of the so-called “dark helix" distributions, described in this invention, using an appropriate algorithmic method, by a measure of the angle of the axis connecting the two zeros.
  • This 3D location can be used either in projection, that is to say by projecting one or more half-moon distributions offset on the object and using a suitable algorithm, for example the algorithms described in this invention, or in transmission by passing the light emitted by the transmitter through an optical module creating this distribution and by analyzing the PSF back.
  • Another implementation of this invention describes an optical device, and an algorithmic device for measuring the position of the transmitter using the features of the so-called “dark helix" distributions, described in this invention, using an appropriate algorithmic device, for example a measure of the angle of the axis connecting the two zeros.
  • This 3D location can be used either in projection, that is to say by projecting one or more half-moon distributions offset on the object and using a suitable algorithm, for example the algorithms described in this invention, or in transmission by passing the light emitted by the transmitter through an optical module creating this distribution and by analyzing the PSF back.
  • Fig. 1 is a simplified representation of a confocal fluorescence microscope of the prior art, also used as a support of the invention
  • Fig. 2 is a simplified pictorial representation of a microscopy system of
  • Fig. 3 is a simplified schematic illustration of a conical diffraction module according to an embodiment of the present invention.
  • Fig. 4a to 4f are simplified pictorial representations of the measurement and volume confinement paradigms according to embodiments of the invention and confocal microscopy;
  • Fig. 5 is a simplified pictorial representation of a particular embodiment of the SRCDP microscopy platform
  • Fig. 6a is a simplified schematic illustration of a superresolution side module, in accordance with an embodiment of the present invention.
  • Fig. 6b is a simplified schematic illustration of another embodiment of a superresolution side module, according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. Figures 7a to 7c show light distribution tables of a conical diffraction module as a function of the polarization of the input and output polarizers for several values of the tapered diffraction parameter, po. These light distributions were calculated by simulation of the equations developed by Berry, [2]; Figure 7d completes these distribution tables by showing the variation of so-called half-moon distributions offset as a function of the axial position (z axis). Figure 7e presents a new distribution, "dark helix" including two zeros, whose axis connecting these two zeros turns according to the propagation.
  • Fig.8 is a simplified schematic illustration of one of the embodiments of dark tracking
  • Fig. 9 is a simplified schematic illustration of a fluorophore data superresolution algorithm method, in accordance with an embodiment of the present invention.
  • Fig. 10 is a simplified schematic illustration of the calculation of the descriptors
  • Fig. 11 is a simplified schematic illustration of the control module of the SRCDP platform.
  • Fig. 12 presents the light distributions obtained "Four-leaf-clover" distribution at different spherical aberration values.
  • Microscopy is used in the field of biology, for example, to observe, study and measure biological entities (objects) and their dynamics.
  • artificial vision to describe all applications of measurement, metrology or observation of objects or elements produced or constructed or made by a human being or a machine, for example, to observe, study and measure semiconductors or to characterize materials.
  • phase and polarization polarimetry
  • Jones vectors and matrices Jones vectors and matrices
  • Stokes parameters Jones and Stokes parameter measurement techniques.
  • optical diffraction limit optical diffraction limit
  • Rayleigh criterion Rayleigh criterion
  • Airy disc radius and diameter.
  • supersolution, supersoluble, superresolution imaging and supersensitive microscopy to describe the acquisition of optical data, in imaging, microscopy or artificial vision, at a resolution greater than the optical diffraction limit.
  • fluorescence and for fluorophores are used for fluorescence and for fluorophores.
  • superoscillations are that of Yakir Aaronov and Sir Michael Berry.
  • a super-oscillation is a phenomenon in which a signal that is generally band-limited may contain local segments that oscillate more rapidly than its faster Fourier components.
  • the center or centroid of a light distribution is the center of gravity of the intensity.
  • the diameter of a light distribution is the diameter of the first intensity zero, for regular and singular waves, without taking into account the central zero of the singular wave. Two light distributions are co-located if their centers coincide or are separated by a small spatial value relative to the size of the light distribution.
  • lens whose definition is enlarged, to include all the optical means that transmit, refract or reflect light, optical auxiliary - optical sub-module aimed at interfacing and adjusting either the geometric parameters or the phase and / or polarization parameters between two other submodules or optical modules -, polarizer, analyzer, delay plate, beamsplitter beam splitter in English, polarizing and non-polarizing polarizing, "beam combine" beam combiner in English, polarizing and non-polarizing.
  • REVERSIBLE Saturated OpticaL Fluorescence Transitions grouping the techniques: Stimulated Emission Depletion Microscopy (STED), Ground State Depletion (GSD), Saturated Structured Illumination Microscopy (SSIM) and SPEM (Saturated Pattern Excitation Microscopy), Microscopy Location, (Microscopy of Localization, in English) grouping Photo-Activated Localization Microscopy (PALM), FPALM (3D Localization in Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy), Stochastic Optical Reconstruction Microscopy (STORM), dSTORM (direct STORM), SPDM (Spectral Precision Distance Microscopy) ,
  • a partial polarizer to describe an element or a module whose absorption is different for the two linear polarizations - linear dichroism - or for the two circular polarizations - circular dichroism.
  • dynamic polarization or phase elements include, but are not limited to: rotating wave blades on their axis, light valves based on liquid crystal technologies, electro-optical devices, also known as Pockels cells, cells of Kerr, for example using PLZT material components, resonant electro-optical devices, magneto-optical devices, also known as Faraday cells, acousto- or elasto-optical devices or any combination thereof.
  • polarization or phase dispersive elements we refer to polarization or phase dispersive elements to describe elements whose polarization state depends on the wavelength.
  • the simplest of the polarization dispersive submodules is the multimode or thick waveguide,
  • centroid algorithm we will refer to the "centroid algorithm” to describe the usual procedure for measuring the centroid and possibly the width (FWHM) of a light distribution.
  • Optoelectronics photoelectric detector, CCD, EMCCD, CMOS, SPAD Single Photon Avalanche Diode and SPAD Matrix.
  • an electronic image for describing the spatial distribution of charges for a CCD, current for a CMOS or events for a SPAD, created by the optical image, at a given moment, in a detection plane,
  • microimages images of size substantially equal to a small number of diameters of the Airy disk, typically less than 5 diameters, and / or with a low number of pixels. typically 4 * 4 to 32 * 32.
  • the indices m and n represent the indices of the pixels; the origin of the pixels will be chosen as the projection of the center of the analysis volume defined in a subsequent paragraph.
  • Polarimetry refers to the measurement of the polarization state of the incident light.
  • the state of polarization of the incident light can be described by the Stokes parameters, a set of values, introduced by George Gabriel Stokes in 1852, and used in Optics.
  • the beams can interact with each other or not, be projected
  • beam shaping to describe the transformation of a waveform of given form and topology into a wave of another form or topology, and in particular the transformation of a regular wave into singular and vice versa.
  • a light distribution, punctual, will be deemed compact if it fulfills one of the conditions of compactness defined below, by two alternative and non-exclusive conditions:
  • Singular distributions or waves also called optical vortices, of topological charge (azimuthal order) 1, in which the phase varies from 0 to 2 ⁇ ⁇ , around the direction of propagation, where £ is an integer.
  • Amplitude distributions with azimuthal variation of order i also called Laguerre-Gauss distribution
  • the polarization and optionally phase-shift distributions with C-order azimuthal variation are also radially polarized Laguerre-Gauss modes.
  • the azimuth orders i of the polarization or phase of the two light distributions differs.
  • two light distributions projected on a given volume will be deemed to have different topologies if, in a substantial part of the jointly illuminated surface, the gradients are of reversed direction.
  • a luminous nano-transmitter is a small secondary transmitter, attached to an object; it is substantially smaller in size than a fraction of a wavelength, typically but not limited to less than one fifth of the wavelength; a light nano-transmitter absorbs the incident energy and re-emits light at the same wavelength as the incident light or at different wavelengths; the light emitted by the nanoemitter may be coherent, partially coherent or incoherent with the light absorbed.
  • the main examples of light nanoemitters are fluorophores and nanoparticles, but they also include a large number of other elements.
  • the physical mechanisms that can create a nano-transmitter are numerous; they include but are not limited to absorption, diffusion or reflection, fluorescence, "emission-depletion", [5] for example using RESOLFT techniques, photo activation phenomena and photo depletion, fluorescence with two or more photons, elastic diffusion or not, Raman scattering, or other physical mechanisms known to those skilled in the art.
  • nanoemitters including scattering, absorbing and reflective particles, attached to a biological or organic entity; the action of a scattering particle, reflective or absorbing on the electromagnetic field can indeed be described as the creation with a reverse phase, following the Babinet principle, for an absorbing particle of an auxiliary secondary field, emerging from the particle superimposed on the incident electromagnetic field.
  • a nanoemitter denotes the set of information describing a nanoemitter as a point source at a given time. Since the nano-transmitter is considered as a point source, all the information representing it contains a limited number of parameters, namely: its position in space, its intensity, the spectral characteristics, intensity, coherence , phase and polarization of the light emitted by the fluorophore, depending on the incident light.
  • the object is represented, as usual in image processing, by a matrix of intensities.
  • the rest of the description only refers to the simplest case, that in which the nanoemitter is a fluorophore and the physical interaction is one-photon fluorescence.
  • this description should be understood as a simplified illustration of a general description of the methods and concepts applicable to all light nanoemitters previously mentioned or known to those skilled in the art, whatever the underlying physical phenomenon .
  • the nanoemitter samples the field or the incident intensity at a precise three-dimensional position, without any influence of the whole spatial distribution of the incident intensity.
  • the sampling capacity of the light nanoemitter We will reference this remarkable property in this patent application as the sampling capacity of the light nanoemitter.
  • the embodiment of the invention described also makes it possible to measure structured objects and continuous distributions that do not have the sampling capacity of the light nanoemitter.
  • the Figure. 1 represents a set of nanoemitters or structured objects, positioned on a given biological object, 15 and 16 on the one hand and 17 and 18 on the other hand.
  • the light emitted may consist of a continuous distribution, not shown in Figure 1, or any combination of nanoemitters, structured objects or continuous distribution.
  • the set of nanoemitters, structured objects or continuous distribution is referred to as a set of "luminous biological objects"; they represent a map of the biological object, in the sense defined by Alfred Korzybski in general semantics.
  • the luminous biological object contains many relevant information related to the biological object, mainly spatiotemporal information, the position of the object and its orientation as a function of time, and morphological information, for example in the case of division of a cell in two.
  • the measurement system will make it possible to calculate the measured map, and to evaluate the descriptors of any combination of nanoemitters, structured objects or an evaluation of the spatial distribution of continuous distributions.
  • This measured map differs from the original map due to noise, measurement conditions, system limitations, or measurement uncertainty.
  • This information of the measured map can be elaborated later in different levels of abstraction.
  • This first level of abstraction which describes the direct results of the measurement, does not contain, a priori, any biological information but the results of a physical measurement described by nanoemitters, by structured objects or by continuous distributions, which could moreover, to represent any marked entity.
  • the second level the level of geometric abstraction structures nanoemitters, structured objects or continuous distributions as geometric objects. It consists of a description of luminous objects and their dynamic characteristics, such as their position or orientation, or their morphology.
  • the information is still a physical and geometric information describing a set of objects.
  • Geometric information uses the measured map and auxiliary information, potentially external to the system, on the relationship between light points and objects.
  • the level of biological abstraction allows a certain apprehension of the biological reality thanks to a constitutive relation between the measured objects and biological entities
  • Bio information contains a set of information about the biological object, mainly the position and its dynamics, shape and morphology.
  • Biological information uses the map measured and geometric information, and auxiliary information, potentially external to the system, on the relationship of light points and objects to biological entities. A number of conclusions about the biological functionality of the sample can be obtained at this level.
  • the level of functional abstraction allows an apprehension of the biological reality. It consists of functional information, decorrelated geometric information, and answering questions in terms and biological jargon, such as: "Did the virus penetrate the cell? ".
  • An additional level of information can be defined including the process of control and instrumentation; in fact, a more advanced control and instrumentation process can be defined, making it possible to trace back to a more structured biological information, through an automation of the data acquisition process.
  • An example of such processes is described by Steven Finkbeiner under the name "Robotic Microscopy Systems”.
  • Conical diffraction describes the propagation of a light beam in the direction of the optical axis of a biaxial crystal.
  • biaxial crystals Historically, conical diffraction has been observed in biaxial crystals.
  • a conical crystal to describe an inorganic or organic biaxial crystal exhibiting the conical diffraction phenomenon.
  • biaxial crystals include, Aragonite, KTP, KTA, KBiW, LBO, KNbO3, MDT, YCOB, BIBO, DAST, POM, NPP, LAP, LiInS2 and LiInSe2.
  • effects exist, creating either inherently weak conical diffraction or creating weaker conical diffraction along a shorter optical path. However, these effects can be used within the described devices. These effects include polymers, liquid crystals, and externally induced birefringence effects.
  • the polymers include but are not limited to stretched polymer sheets and cascade polymerization, [10]; the liquid crystals include but are not limited to the thermotropic biaxial nematic phase, [1 1]; the external effects of induced birefringence
  • phase in the vortex created by conical diffraction is a geometrical phase and is therefore intrinsically achromatic.
  • the additional chromatic effects are the dispersion of the optical axis and the dependence of the various parameters present in the equations of the conical diffraction as a function of the wavelength.
  • the chromatic dispersion of the optical axis creates an angle of the optical axis of the crystal, depending on the wavelength, with respect to the optical axis of the system. It is due, in most cases, to the dispersion of the refractive indices.
  • the refractive indices depend on the wavelength, according to the Sellmeier equations.
  • the angle of the optical axis therefore varies according to the wavelength, it creates an angle
  • the angle ⁇ can vary greatly depending on the wavelength in some organic crystals such as DAST.
  • Compensation of the chromatic dispersion of the optical axis can be performed using geometrical optics.
  • the chromatic dispersion of the direction of the optical axis can be compensated by using the natural dispersion of glass or other optical materials, or by using gratings or prisms.
  • the achromatization procedure does not differ in this case from the standard procedure for correcting any chromatic aberration in geometrical optics. This procedure can be designed and optimized using one of the available commercial optical software by defining appropriate target functions.
  • a different concept of achromatization is based on the use of two different materials, having inverse conical diffraction effects, with high and low chromatic dispersions.
  • the fundamental transfer function is identical to the unit and thus trivially independent of the wavelength.
  • the vortex transfer function depends on the wavelength and can be represented by a chromatic factor equal to ⁇ ( ⁇ ).
  • the fundamental wave depends on the wavelength and the vortex wave is almost independent of it. Indeed, the simulations show that the shape of the vortex wave is only slightly modified by a variation of the parameter, ⁇ from 0.5 to 0.75.
  • the shape of the fundamental wave depends on the wavelength and this effect must be taken into account in the design of systems using the two waves, fundamental and vortex.
  • FIG. 3 is a simplified schematic illustration of a configuration of a conical diffraction module 300, in accordance with an embodiment of the present invention.
  • the incident light, 30, is supposed to be collimated, although other conditions may be adapted using simple optical means.
  • the fixture itself includes a first lens, 31, a tapered crystal, 32 and an optional lens 33.
  • the first two lenses, 31 and 33 are preferably configured as a Kepler telescope 1: 1.
  • the numerical representation of the first lens, 31, in the image space, shown below as Uo determines the parameters of the conical effect across the conical radius, defined below.
  • a conical imaging plane 35 is placed at the focal plane of the first lens 31; a polarizer, or partial polarizer, 29, described above, may also be added. However, in some optical systems where the incident light is already polarized, this element is not necessary.
  • a focusing lens, 36 determines the final size of the light spot. It may be an external microscope objective, or may be fused with the second lens 33, as implemented in another embodiment of this invention.
  • the distribution of the projected light on the sample is, as a first approximation, neglecting the vector effects, a reduced image of the distribution of light in the image plane.
  • the influence of vector effects will be discussed below.
  • the scale ratio or magnification is determined by the microscope objective.
  • R spatial variable
  • U wave vector
  • ⁇ the wavelength of light
  • the behavior of the electric field emerging from the conical crystal 32 is entirely characterized by a single parameter, the conical radius, R0; the conical radius depends on the material and the thickness of the crystal.
  • the normalized radial position, p, the normalized wave vector, u, represented in cylindrical coordinates by p, 9R and u, ⁇ , and the conical normalized radius, po, are given by:
  • Uo being the numerical aperture of the system.
  • Low interaction volume diffraction effects have the following properties:
  • linear Raman Nath regime previously referenced, [37]
  • linear thin conical crystal in which a simple surface approximation of the effect can be used, po ⁇ 1 and> 0.5, sinusoidal Raman Nath regime , previously referenced, [37], "sinusoidal thin conical crystal”, in which a surface approximation of the effect can be used, po ⁇ 3 and> 1, intermediate regime, referenced previously, [37], "medium conical crystal” , in which complex effects, coupling the effects of Raman Nath regimes and the Hamilton-Lloyd regime described later,
  • the emergent wave of the thin conical crystal, E (p, 9R), expressed in normalized coordinates for a circularly polarized wave, is constituted by the superposition of two waves, referenced here as the fundamental wave, EF (p), a wave regular, and the vortex wave, Ev (p, 6R), a singular wave; these two waves are coherent with each other, co-localized, circular polarized and inverse chirality:
  • EF (p) is the scalar fundamental amplitude
  • Fv (p) is the reduced vortex scalar amplitude
  • the emerging wave of the conical crystal for a circularly polarized wave, is constituted by the superposition of two waves, the fundamental wave, a regular wave, and the vortex wave, a singular wave.
  • Homogeneous polarization can decompose on the orthogonal basis composed of circular right and left circular polarizations.
  • the incident beam is therefore the coherent superposition of two beams, one polarized in right circular polarization and the second in left circular polarization.
  • the beam emerging is the coherent superposition of four beams; two fundamental waves, the first created by the polarized beam in right circular polarization and the second by the polarized beam in left circular polarization and two vortex waves created by the polarized beams in right and left circular polarization.
  • both fundamental waves have the same spatial distribution and can interfere by keeping their topology, both vortices are opposite chirality and create complex distributions.
  • Different combinations of these waves can be achieved by choosing the polarizations at the input and output, which allows to obtain PSF of different shapes.
  • parsimonious object in English, to describe either a set of parsimonious or sparse transmitters, spot light emitters, or a set of parsimonious objects, parsimony being defined in the references [ 41-43] and not limited to point objects but including, for example, filaments.
  • the limit chosen is a number less than twelve, positioned in a volume whose size, in each of the dimensions, is less than 3 wavelengths, at the emission or reflection wavelength. issuers. The size smaller than 3 wavelengths, which contains the parsimonious object, will be referenced as a small size analysis volume.
  • FIGS. 4a to 4c are a simplified representation of the concept of volume confinement of the confocal microscope.
  • volume confinement The functionality of the volume confinement is to limit, in the three spatial dimensions, the observed region of the sample to a volume of the smallest possible size, the volume of analysis.
  • Volume containment functionality limits the volume of analysis by the combination of two effects: the confinement of light projected onto a small area, ideally the size of the Airy task, 50, and the elimination of defocused light by the confocal hole, 28 of Figure 2. The superposition of these two effects creates a small volume, the analysis volume, 60. This volume determines the size of the elementary region detected by the system.
  • the reference “i” The axes referenced “i” represent a Cartesian coordinate system centered on the center of the analysis volume, 61.
  • the referential "a” represent a Cartesian coordinate system centered, for each light nanoemitter, on the light nanoemitter considered as a discrete point, 62,
  • the center of the vortex will generally be defined as the center of the analysis volume.
  • At least one embodiment of the invention uses conical diffraction to realize the fundamental optical modules of the art.
  • alternative implementations replacing modules based on conical diffraction, by modules based on other optical concepts, are able to provide the same functionalities. They are intrinsically part of the scope of this invention.
  • Alternative optical concepts include but are not limited to uniaxial crystals, subwavelength gratings, structured laser modes, holographic components, and other techniques known to the art.
  • optical and optoelectronic concepts, techniques and devices that can be used in embodiments of the invention are described in for example the book written by D. Goldstein, "Polarized light", [12], the “Handbook of Confocal”. Microscopy ", [13], the” Handbook of Optics ", [14].
  • optical semaphore to describe an optical element, passive or active, capable of channeling the incident light to different channels or detectors as a function of a property of light.
  • the simplest case is a dichroic plate that separates the light into two channels depending on the wavelength.
  • PDOS Position Depends Optical Semaphore
  • the PDOS will be determined by a series of transfer functions, Ti (x, y, z) depending, for each channel or detector i, on the position of the transmitter (x, y, z), in a reference volume.
  • the order of the PDOS will be the number of channels or detectors.
  • the PDOS will be lossless in English, in an analysis volume, if the sum of the transfer functions, Ti (x, y, z) is equal to unity in the analysis volume.
  • the confocal hole, described by Minsky, [15] could be considered in this embodiment of the invention as a degenerate PDOS of order 1.
  • LPDOS dependence is a complex function of lateral and longitudinal positions.
  • LPDOS Longitudinal Position Depends Optical Semaphore
  • optical semaphore dependent on the longitudinal position - to describe an optical semaphore which channels the light in function of the longitudinal position of the emitter point.
  • the LPDOS will be determined by a series of transfer functions, Ti (z) depending, for each channel or detector i, on the longitudinal position of the transmitter (z), in a reference volume.
  • Ti (z) depending, for each channel or detector i, on the longitudinal position of the transmitter (z), in a reference volume.
  • the order of the PDOS will be the number of channels or detectors.
  • the LPDOS will often be coupled to a stop, limiting the lateral field of the system.
  • optical fibers A main use of optical fibers is the exclusive transmission of the TEMoo mode.
  • certain configurations of optical fibers such as FMF or Vortex Fibers, mainly but not exclusively based on fibers called "Photonic Crystal Fiber” (acronym PCF) and fibers called “vortex fiber” allow the transmission simultaneous or not, more complex modes, including vortex modes, with a vorticity equal to or less than 2. It would therefore be possible to deport the optical distributions created by conical diffraction using optical fibers, allowing simplification major part of the optical system.
  • optical fibers allow the application of the embodiments of the invention to many additional applications, for example but not limited to gastric or gastroenterological observation, and observation of the colon and urinary tract.
  • a broad-spectrum laser - called a white laser - may be used.
  • This configuration is simple because one of the main parameters of the system is fixed and well determined.
  • the object can also be illuminated at several wavelengths, either discretely, using for example several lasers, or continuously, for example using a lamp or a laser having a wider spectrum.
  • Many existing superresolution systems measure simultaneously or sequentially at multiple wavelengths. Indeed, it is possible to mark similar or different elements with fluorophores having different spectral responses, to recognize and separate them. It is important to present two different cases:
  • Achromatization is also possible for optical systems based on uniaxial crystals, and for almost all alternative implementations of this invention, with, for each of them, a more or less practical complexity.
  • FRET Förster-Förster energy transfer
  • the light from one or more incident laser beams is separated using a light splitter into two beams, the main beam that will accomplish the functionality of the PSIT system, and an additional weak beam.
  • intensity used to measure the position of the laser beam using a camera or position detector.
  • Ge device makes it possible to measure in real time the position of the laser independently of any error of wobble or other mechanical error with a very high precision.
  • Embodiments of the disclosed invention allow the integration and fusion of additional information external to the described platform, optical or contextual, to obtain an improvement in the accuracy of the information collected from the sample for one.
  • the spectral diversity the information obtained at several wavelengths, the diversity of polarization, and the information obtained by projecting different states of polarization, extends the range of information available.
  • optical integral information the information that could be retrieved from optical or electromagnetic wave measurements, on a target, by an observer, from a given point of view.
  • This information contains many parameters of the object, related to its position, the materials that compose it, its temperature, or its orientation.
  • the optical integral information does not contain, on the other hand, information on regions of the object that do not have an optical path towards the observer, for example an element positioned in an opaque box, or a physical information that does not No optical transcription.
  • Embodiments described in this invention are not limited in resolution. a priori and could ideally - with an infinite number of photons - obtain any resolution, as we will describe later for a specific case. Use of non-linear interactions in the superresolution and family of RESOLFT and STED techniques
  • non-linear interactions include but are not limited to two-photon interaction phenomena, emission-depletion, blinking, and photoactivation effects upon which the RESOLFT family of technology and the family of "localization microscopy" technologies.
  • CW STED the pulsed laser used in the first version of STED is replaced by a continuous laser - simpler.
  • the emitted photons are discriminated according to their emission time to separate the photons emitted from fluorophores that have not received enough time the depletion beam;
  • the "modulated STED” uses an intensity-modulated excitation beam, in combination with synchronous detection dependent on the modulation frequency. This makes it possible to discriminate the fluorescence signal created by the excitation beam of the residual fluorescence caused by the depletion beam.
  • Another variant proposed by Gould et al. [45], uses an SLM to create, either separately or jointly, the lateral and / or axial depletion distributions.
  • phase plate The donut - or vortex - was created, in the first version of the STED, with a spatially varying phase blade, "phase plate" in English.
  • This implementation requires the use two separate optical paths for the two beams, the excitation beam and the depletion beam.
  • This optical assembly is complex, highly dependent on any mechanical drift, and creates complex optical alignments.
  • the developed system requires high technicality and the cost of the system is important.
  • this implementation is chromatic, because the phase plate adapted to a wavelength will not be at another wavelength. Since the optical system is not achromatic, the use of a two-wavelength depletion STED requires an even more complex optical system.
  • Reuss et al. introduces a beamformer placed directly in front of the objective lens.
  • This device is based on the use of birefringent crystals, mounted in the form of a segmented wave plate, consisting of four segments. By choosing the thickness parameter of the blade, it is possible to make a member consisting of a phase plate for depletion and a neutral blade for excitation.
  • the initial laser beams are in the form of a regular distribution and in most cases a Gaussian distribution. These initial laser beams will subsequently be transformed into an excitation beam, a regular wave, and into a depletion beam, a singular wave, by a suitable optical system, described by the various inventors. Co-locating these beams upstream when they are still in Gaussian distribution form is relatively simple. Co-localizing these beams downstream when they have been transformed into a regular and singular wave is much more complex. Co-localizing these beams upstream can be done commercially by laser bench systems using fiber optic techniques. It is therefore relatively easy, as it is also done in all confocal microscopes, to create a set of laser outputs at different wavelengths of the same optical fiber and therefore co-located very precisely.
  • the solution proposed in embodiments of the present invention allows to base on this co-location upstream, greatly simplifying the system and allowing the realization of a STED at several wavelengths, intrinsically.
  • the PSIT module allows the realization of such an optical system that combines the properties of common optical path, achromaticity and beam shaping. To our knowledge, there is in fact no common system, achromatic and allowing a different beam shaping for different beams, in the literature. Such a system certainly improves the simplicity of design and use of STED.
  • PSIT method can also be used to project sequences of light intensities that differ topologically, at two or more wavelengths, sequentially or simultaneously.
  • the SRCDP platform "Super Resolution using Conical Diffraction Platform" is a Microscopy platform using optical modules based on conic diffraction.
  • the SRCDP platform consists mainly of two hardware modules, two new and complementary optical modules, the LatSRCS and LongSRCS optical modules, mounted on a microscope, and an algorithmic module, SRCDA, "Super Resolution using Conical Diffraction Algorithm ", to rebuild
  • the SRCDP platform includes an enhanced detection module, a system control module, and computer and software support.
  • certain embodiments of the invention relate to a large number of alternative implementations of the PSIT and PDOS methods, the SRCD platform, the LatSRCS and LongSRCS optical modules and the algorithmic SRCDA.
  • this figure shows the light distributions, created through a 0.388 standard conic tapered crystal, calculated by a scalar approximation, for different input and output polarization states, including input and output.
  • / or at the output is a circular or linear polarizer or a radial or azimuth polarizer.
  • These light distributions were calculated in an intermediate imaging plane and not at the focal point of the lens to separate conical refraction from vector effects.
  • the polarization states - input and output - are characterized by their angle for linear polarizations and by their chirality for circular polarizations.
  • this figure shows the light distributions, created through a conically standardized tapered crystal of 0.818, calculated by a scalar approximation, for different input and output polarization states, including as input or at the output is a circular or linear polarizer or a radial or azimuth polarizer.
  • input and output polarization states were calculated in an intermediate imaging plane and not at the focal point of the lens to separate conical refraction from vector effects.
  • the input and output polarization states are characterized by their angle for linear polarizations and by their chirality for circular polarizations.
  • tapeered diffraction transfer function the set of transfer functions that can be obtained using a small ( ⁇ 6) number of crystals in cascade, and polarization elements, static or dynamic, uniform or spatially varying
  • the different light distributions are produced by modifying the input or output polarization.
  • the different light distributions follow the same optical path and the optical system creating these distributions is a common path optical system, as we have defined it previously.
  • the elementary light distributions described in Figure 7 can be obtained in several different ways. Moreover, some of them can be obtained as an incoherent superimposition of other elementary light distributions; for example the vortex can be obtained by any sum of two orthogonal "half-moon" light distributions.
  • New light distributions can also be obtained as mathematical combinations of elementary light distributions.
  • the "pseudo-vortex” light distribution calculated from arithmetic combinations of the four “crescent moon” distributions, has the particularity of having a very strong curvature at the origin.
  • the theory developed so far describes the light distribution in the imaging plane of the microscope, 35.
  • the distribution of the light projected onto the sample is, according to the theory of geometrical imaging, a reduced image of the distribution. of light in the image plane.
  • the output bias adaptation sub-module, 74 to control the output bias.
  • the output polarization has a circular symmetry substantially reduces the vector effects and makes it possible to adapt to the direction of the fluorescent dipole.
  • Such polarization can be circular, radial, azimuthal or position-dependent.
  • the output polarization adaptation sub-module 74 is simply a four-wave delay plate.
  • the longitudinal polarization elements have a vortex symmetry and blend harmoniously into the system with only a small change in the shape of Stokes parameters, even for microscope objectives with very high numerical aperture.
  • the output polarization adaptation sub-module, 74 may be variable and / or controllable and adapt to the topology and symmetry of each of the compact light distributions.
  • a Wollaston prism can be used to separate an incident beam into two emerging beams separated by an angle. By using several prisms in cascade, it is thus possible to separate an incident beam into a large number of emerging beams.
  • the same effect can be obtained by modifying the Wollaston prism, to create the composite Wollaston prism, by adding uniaxial crystal pieces whose index and orientation of the birefringence are chosen are appropriately selected. It is thus possible to construct a prism of a single block of uniaxial crystal which can separate an incident beam into 2 n emergent beams (e.g. eight or sixteen) which are contained in a plane, and separated by equal angles.
  • the modified Wollaston prism can be coupled with the methods described in this invention to duplicate all light distributions without changing the relationships between them.
  • the modified Wollaston prism can be coupled to the STED methods described in this invention or other standard STED methods to duplicate all light distributions without changing the relationships between them.
  • the function of the confocal microscope is to limit, in the three spatial dimensions, the observed region of the sample to a volume of the smallest possible size, the volume of analysis.
  • the acquired information is a single intensity value for the entire analysis volume, designed as a single entity. More clearly, the detailed information of the position of the nanoemitters within the analysis volume is not accessible, a priori, in a confocal microscope. It was generally accepted that no additional optical information could be created that would have allowed additional discrimination within the illuminated volume.
  • Figure 4d is a simplified conceptual representation of a measurement paradigm according to at least one embodiment of the invention.
  • the paradigm of measurement is much more ambitious than that of the confocal fluorescence microscope, shown schematically in Figure 4a.
  • an analysis volume, 60 is created at the focal plane of the microscope objective, 22; it contains a parsimonious object, 51, consisting of several nanoemitters, 53 to 59; the result of the system is a reconstructed parsimonious object, 63, and a list of nanoemitters and a list of their attributes, 64.
  • FIG 4e is a simplified conceptual representation of another measurement paradigm, based on STED concepts, according to at least one embodiment of the invention.
  • This paradigm of measurement limits in two (STED 2D) or in the three spatial dimensions (STED 3D), the observed region of the sample to a volume of the smallest possible size, the analysis volume.
  • an analysis volume, 60 is created in the focal plane of the microscope objective, it contains a parsimonious object, 51, comprising several nanoemitters, 53 to 59; one or more depletion waves, 2000, reduce by a depletion effect, the volume of analysis to a smaller volume represented by 2001.
  • the superposition of the set of effects creates a small volume, the analysis volume, 60. This volume determines the size of the elementary region detected by the system.
  • an analysis volume, 60 is created in the focal plane of the microscope objective, it contains a parsimonious object, 51, comprising several nanoemitters, 53 to 59; one or more depletion waves, 2000, reduce by a depletion effect the analysis volume to a smaller volume represented by 2001.
  • this volume contains a parsimonious object, 51, consisting of several
  • a PSIT measurement method according to one embodiment of the invention, a sequence of light distributions of different topologies is projected on the analysis volume.
  • the PSIT measurement method performs the following functions:
  • the transmission sequence consists of at least two point light distributions of different topological families
  • the emission sequence is projected on a biological sample marked by nanoemiters.
  • the emergent light emission of each nanoemitter is dependent, for each nanoemitter, on the intensity, in the incoherent case, or on the electromagnetic field in the coherent case, incidents at the spatial position, three-dimensional luminous nanoemitter aforesaid sampling property of the light nanoemitter previously discussed.
  • the PS1T method according to this embodiment makes it possible to acquire information
  • the PSIT method is implemented by projecting light distributions of different topologies created by conical diffraction and modified by a variation of the input and output polarization states.
  • the PSIT method can also be used to project sequences of light intensities that differ topologically, at two or more wavelengths, sequentially or simultaneously.
  • the PSIT Method was initially designed to allow lateral super-resolution
  • the PSIT method can also be used to obtain the longitudinal position of a nanoemitter. Indeed, some elementary light distributions are relatively insensitive - within reasonable limits - to a variation of the longitudinal position of the nanoemitter, while others are very sensitive. A sequence of compact light distributions, some of them independent and some of them dependent on the longitudinal position, would make it possible to go back to the longitudinal position of the nanoemitters.
  • the PDOS method comprises the distribution by an "optical semaphore" of the light re-emitted by the nanoemitters or by the continuous object between at least two detectors. It has been described by one of the inventors, [37].
  • the function of the optical semaphore is to separate on different detectors different regions of the analysis volume.
  • the optical semaphore creates, for each detector, a transfer function of the light emitted by a light nano-transmitter, depending on the position in the space of the light nano-transmitter and different for the different detectors.
  • the PDOS method is implemented so as to separate on different detectors the collimated, emerging light of nanoemiters positioned at the focal plane of the objective, of the emerging non-collimated light of nanoemitters lying below or beyond the focal plane.
  • the PDOS method makes it possible to acquire essentially longitudinal information, that is to say the longitudinal position of each of the nanoemitters.
  • the method according to embodiments of the invention realizes a transfer function transforming the spatial distribution in the space of the nanoemitters into the raw information consisting of a set of images.
  • the algorithmic performs the opposite operation: it reconstructs the spatial distribution in the space of the nanoemitters from the set of images composing the raw information.
  • the modified PDOS method an optical method for shaping the emission beam, for the axial and / or lateral location of nanoemitters.
  • This method implements a single-channel PDOS method, in which the variation of one of the parameters describing the created distribution is used to measure the axial or lateral parameters.
  • the parameters used can be either an angle parameter for a helical axial variation distribution, or the ratio between the lobes of the distribution - for a two-lobe distribution (or more) with axial variation.
  • This method has a certain similarity with the original PDOS method, described by one of the inventors in [37], but differs in that the variation of the topology of the created distribution is used to measure the axial or lateral parameters and not by an intensity ratio between two detectors, as described in the original version of the PDOS method.
  • This method like the original method, has applications as a complementary method of the PSIT method, but also for the axial location of nanoemitters, for example for the localization modalities, such as, for example, the PALM, STORM or GSDIM modalities or the like. .
  • the PDOS method was initially designed to allow longitudinal superresolution; however, the PDOS method can also be used to obtain the lateral position of a nanoemitter. In fact, the elementary light distributions are also sensitive to a variation of the lateral position of the nanoemitter. For a flat sample, in the case where light projection is not feasible, the PDOS method can replace the PSIT method to make superresolved measurements.
  • the intermediate result is obtained at the end of the detection step.
  • the raw information consists of a set of images A op (m, n), representing for the light distribution o, the image resulting from the detection channel p.
  • the measurement process analyzes a small volume in an object of much larger size. It will therefore require the addition of additional modules, similar to those of a confocal microscope including a scanning process, a software module for integration, analysis and visualization of point data in surfaces and / or in three-dimensional objects.
  • the algorithmic solves an inverse problem or parameter estimation.
  • the equations of the model are known and one has a priori model, parametric or not, on the configuration of nanoemitters.
  • the most natural model is to assume a small number of nanoemitters (parsimonious object), but one can also use continuous models, assuming the presence of one-dimensional structures (lines, curves) or specific patterns. We can then use all the procedures
  • One embodiment of the invention is a hardware and algorithmic platform referenced as the SRCDP platform 500, illustrated in FIG. 5.
  • the SRCDP platform, 500 implements the method according to one embodiment of the invention, either by combining the two methods PSIT and PDOS, original or modified, described above, either using the STED techniques or by combining the techniques. STED with PSIT or PDOS methods, original or modified.
  • the SRCDP platform observes, Figure 5, a biological sample, 1 1, integrating a set of nanoemitters.
  • the result of the observation of the biological sample through the SRCDP platform is the acquisition of information from
  • the SRCDP platform, 500, Figure 5 mainly includes:
  • a confocal microscope 200 adapted or optimized, similar to the confocal microscope, described previously, and comprising all the appropriate components, as previously described.
  • the two novel optical modules are the LatSRCS, 700, and LongSRCS, 800 optical modules, described in detail later with reference to Figures 6 and 8, respectively.
  • the LatSRCS 700 optical module implements the illumination steps necessary for the implementation of the PSIT method according to one embodiment of the invention.
  • the LatSRCS 700 optical module implements the illumination steps necessary for the implementation of a STED or RELSOFT technique, according to another embodiment of the invention.
  • the original or modified LongSRCS optical module, 800 implements the steps of distributing the emerging light intensity into a plurality of images of the PDOS method or implements the variation of the emerging PSF, as a function of lateral or axial parameters, according to one embodiment of the invention and,
  • the detector is a detector consisting of a single element such as a PMT or a SPAD.
  • the acquisition time of the detector is determined by the scanning mechanism.
  • An improved detection module, 65 can be implemented using small-sized, low-pixel detectors. Such a module would not have been feasible ten or twenty years ago, because of the lack of adequate technologies. Today, high-speed, low-pixel, small-size detectors with low noise characteristics are available on a number of technologies. SPAD matrices with a low pixel count, such as 32 * 32, have been recently demonstrated with acquisition rates up to 1 MHz.
  • the improved detector module, 65 can also be implemented using CCD, EMCCD or CMOS sensors. CCD, CMOS or EMCCD sensors with a small number of pixels exist or can be specifically designed. In addition, CCD, CMOS EMCCD detectors can be used by using region of interest, sub-fenestration or "binning" functions, "crop” or "fast kinetics” modes, available for certain detectors.
  • the spatio-temporal information referenced here is the position and the time of the impact of each fluorescent photon.
  • spatio-temporal information is corrupted by detector noise, creating erroneous photons, and inefficient detection, which creates photons that are not detected, reducing performance.
  • SPAD matrices for each photon, the pixel that has detected it and the impact time are received, ie the complete spatio-temporal information is available.
  • CCD, CMOS or EMCCD detectors the acquisition of several frames is necessary to approximate the spatio-temporal information.
  • detectors in many cases the detectors may be either physically separated or consisting of different zones on the same detector, or a combination of the two previous cases.
  • the Control Module, 1,100 using the systemic control procedure, 1101, controls and modifies the optical parameters of the SRCDP platform, 500, the electronic parameters of the enhanced detection set, 65, and the parameters mathematical algorithmic procedures SRCDA, 900, to optimize emerging information, according to criteria defined by the system or by the user.
  • the control is performed by varying the control systems 1 102, 1 103 and 1 104, the various elements of the platform, 600, 800 and 900.
  • the control system, 1 100 will also use, if available information external, 1 105, relayed by the computer support. Note: 1,105 is not present in Figure 1 1
  • Microscopy modalities For example, measurements in confocal or wide-field microscopy, at the same lateral or axial positions, or at different positions may be performed to calibrate certain parameters of the scene model.
  • the direct model is enriched by the fact that
  • FIG. 9 is a simplified schematic illustration 900 of a fluorophore data super-resolution algorithm method, in accordance with one embodiment of the present invention.
  • An algorithm procedure shown in the figure. 9, quantifies the number of fluorophores, retrieves the attributes of each fluorophore and quantifies the accuracy of each output parameter.
  • the pretreatment procedure, 11, rearranges the spatio-temporal information, 1 10, in sets of superresolution images, 112. This operation can be performed using a filter bank procedure.
  • the intermediate data set is then a small series of small images, typically 16 * 16 pixels.
  • the pretreatment procedure applies to a small number of space-time elements of the order of a few thousand, it can be performed in real time and using existing computer equipment.
  • the descriptors include, but are not limited to: the intensity of each image, the presence, like a distribution of light and its characterization as a regular distribution or a vortex, its center of gravity and its moments of order one and more.
  • the third step is a filtering operation, 1 15, in which only the descriptors, which are statistically relevant, are retained.
  • the classification operation, 116 is the last step of the algorithm.
  • the algorithm is able to recognize, on the basis of the set of descriptors, 1 14, and a base of
  • the algorithmic SRCDA can use the classical techniques of the inverse problems.
  • three new algorithmic approaches, the modified MAP algorithm, the E-LSE algorithm and the ICE algorithm are described in this patent application and are deemed to be part of this invention.
  • the optical module, LatSRCS, 700 is an optical module, projecting on a plurality of nanoemitters of a sample, a sequence of compact light distributions of different topology. Each nano-transmitter fluoresces with a sequence of luminous fluorescent intensities depending on the intensity incident on the nanoemitter and characterizing the lateral position of the nanoemitter.
  • compact light distributions of different topologies are created by interference, with varying amplitudes and phases between a regular wave and a singular wave.
  • the regular and singular waves are created by a thin conical crystal.
  • the LatSRCS optical module, 700 is positioned in the illumination path of the confocal microscope 200; it projects a sequence of compact light distributions of different topologies on the sample 11 using the objective of the confocal microscope 200.
  • the incident intensity at a specific position on the sample 1 will be proportional, for each light distribution, to a specific combination of Stokes parameters.
  • the LatSRCS Optical Module, 700 utilizes an inherent feature, described previously, specific to the nanoemitter, which samples the incident light intensity at its precise position (from the nanoemitter) and re-emits a fluorescent light dependent on the incident light. It is remarkable that the measured information is directly related to the position of the nano-transmitter within the compact light distribution. This information is fixed by the functionality of the nanoemitter, its property of absorbing and reemitting light, which break the optical chain. This information is carried by the fluorescent light, in the form of an emerging light distribution, recoverable by a detection assembly 65.
  • the intensity of the fluorescent light re-emitted varies in the same proportions.
  • the sequence of the re-emitted fluorescent light will be proportional to the sequence of compact light distributions of different topologies. From this information, it is possible to recover the position of the nanoemitter, as explained below.
  • the PSIT method refers to the projection of a sequence of compact light distributions of different topologies in a microscope, the interaction with the parsimonious object or the continuous object, the collection of the light re-emitted by the objective of the microscope, 22, the detection of light, fluorescent or not, by the improved detection assembly 65, and the analysis of the information by an appropriate algorithm.
  • the enhanced detection set, 65 consists of a single detector, and only retrieves the overall intensity as a function of time, while in other embodiments, the set of Enhanced detection consists of a small area of pixels and also recovers the spatial distribution of fluorescent light. All of the retrieved information consisting of a plurality of images, designated as the superresolution side images.
  • the contribution of a nanoemitter positioned in the illuminated volume to a specific superresolution side image is proportional to a combination of the Stokes parameters of the incident light at the position of the nanoemitter.
  • This new information makes it possible to refine the position of the nanoemitters or the spatial distribution of the continuous object, to quantify the number of nanoemiters present in the illuminated volume and to differentiate several nanoemitters present in the same volume.
  • FIG. 6a is a simplified schematic illustration of a LatSRCS optical module, 700, in accordance with one embodiment of the present invention.
  • FIG. 6a shows an optical module, LatSRCS, 700, it includes all the components of the conical diffraction module, of FIG. 3, which are implemented in the same way as in the conical diffraction module 300.
  • the optics of FIG. the light source of the scanning confocal microscope is assumed to be achromatic and in infinite conjugation, although other conditions may be adapted using auxiliary optics.
  • the incident light entering from the light source is parallel, 30.
  • the optical module 700 itself comprises a first lens, 31, an achromatic 32, or a sub-assembly achromatically achieving the
  • the first two lenses, 31 and 33 are preferably configured as a 1: 1 Kepler telescope; the conical imaging plane, 35, is placed in the common focal plane of the lenses 31 and 33.
  • the numerical aperture of the first lens, 31, determines the parameters of the conical diffraction effect across the conical standardized radius, defined below.
  • the second objective, 33 restores the parallelism of the light, to inject it under the microscope.
  • It further comprises a polarization control submodule 71, including, for example, a rotating quarter wave plate, a pair of liquid crystal light valves, a Pockels or Kerr cell, 72, and an analyzer.
  • Stokes parameter information can be transformed into sequential information, through a sequence of spatially differentiated light distributions, and bearing sequential information, as described above.
  • the modified LongSRCS module an optical module for shaping the emission beam, for the axial and / or lateral location of nanoemitters.
  • This module implements a single-channel PDOS method, in which the variation of one of the parameters describing the created distribution is used to measure the axial or lateral parameters.
  • the parameters used can be either an angle parameter for a helical axial variation distribution, or the ratio between the lobes of the distribution - for a two-lobe distribution (or more) with axial variation.
  • This module has some similarity with the original LongSRCS module, described by one of the inventors in [37], but differs in that the variation of the topology of the created distribution is used to measure the axial or lateral parameters and not by a ratio of intensity between two detectors, as described in the original version of the LongSRCS module, [37].
  • This module like the original module, has applications as an add-on module of the LatSRCS module, but also for the axial location of nanoemitters, for example for the localization modalities, such as, for example, the PALM, STORM or GSDIM modes or the like.
  • the "dark helix" distribution has a rotation effect of the axis connecting the two zeros along the Z axis.
  • the position of the transmitter can be deduced with great axial precision by a measurement of the axis connecting the two zeros.
  • This 3D location can be used either in projection, that is to say by projecting one or more half-moon distributions offset on the object and using a suitable algorithm, for example the algorithms described in this invention, or in emission by passing the light emitted through an optical module creating this distribution and by analyzing the PSF back.
  • the illumination beam can be shaped using conical diffraction and its phase and polarization effects.
  • the sample is then illuminated with a non-uniform light distribution, which can also be a black sphere (or top hat) so that the 3D distribution has two lobes of the same intensity below and above the focal plane. In the presence of spherical aberration in the system, these two lobes are not of the same intensity.
  • By then analyzing the intensity ratio of the two images we can deduce the amount of spherical aberration of the system.
  • Another approach to measuring spherical aberration uses another variant of systems based on conic diffraction.
  • the shaping of a light beam by conical diffraction through a cascade of crystals makes it possible to obtain an intensity distribution directly connected to the spherical aberration.
  • This distribution is obtained between crossed linear polarizers and two biaxial crystals whose optical axes are aligned. A half-wave plate is inserted between the two crystals. Due to its characteristic form, this distribution will be called “four-leaf clover” or “four-leaf-clover” in English. In the absence of spherical aberration, this distribution consists of four perfectly equal lobes and all in the same focus.
  • Figure 12 describes the symmetry break created in a "Four-leaf-clover" distribution in the presence of spherical aberration.
  • Figure 12 shows the distributions simulated under Matlab for different values of defocus and spherical aberration.
  • Spherical aberration induced by an optical system breaks the symmetry of this distribution both in the focus and intensity distribution in the four lobes as can be seen in the figures below.
  • below representing the "Four-leaf-clover” distribution with different spherical aberration values.
  • a simple qualitative observation allows a binary test presence / absence of spherical aberration.
  • a fine measure of the spherical aberration value is possible by a lobe focus offset estimator and intensity ratios at different focus planes.
  • the optical system described in this invention can incorporate a module for tracking in real time on a camera a scanned point by a beam scanning system (galvanometric mirrors, bidirectional piezoelectric mirror or any other system).
  • a beam scanning system galvanometric mirrors, bidirectional piezoelectric mirror or any other system.
  • multi-image system the set of optical and optoelectronic systems, in which a set of different and differentiated images, coming from the same spatial region of the object, two-dimensional or three-dimensional - are recorded and analyzed through an appropriate algorithm to analyze the spatial - and / or spectral - distribution of the emitting spatial region.
  • This differentiation may be due to the spatially different illumination projection, as previously described; it can also be due to a variation of the spectral content of illumination; it can also be due to a natural movement or imposed from outside objects.
  • the proposed algorithm makes it possible, from the images recorded by the camera (or the cameras) following the excitation of the sample by all the selected illuminations, to reconstruct a high-resolution image, two-dimensional or three-dimensional, of the image. 'sample.
  • This algorithm is based on the combination of several principles:
  • the E-LSE algorithm uses the same Bayesian formulation as the modified MAP algorithm described previously, but exploits the posterior law differently (in a more complete way): in fact, we calculate the average of the posterior distribution and not its maximum value point (which is known to be more suitable for large-scale problems).
  • This approach considered by Besag in 1984 [30], has recently been implemented numerically in the case of image denoising with a total variation type priori [31,32];
  • parsimony a priori by the use of a small number of transmitters is not used and the average of the posterior distribution is calculated on all possible images as in [31,32].
  • Z is a normalization constant - not the light propagation axis - which is not involved in the algorithm
  • Each quantity of type u, (x, y) is determined during the calibration step: it represents the intensity emitted at the pixel y of the camera by an emitter located at the pixel x of the high resolution image, in response to an index illumination i (i therefore encodes here both the position of the illumination signal, but also its shape).
  • the positive real B corresponds to the intensity of the continuous background, which generally results from both the sample (diffuse fluorescence for example) but also from the sensor.
  • the quantities rm (y) simply correspond to the measurements (images recorded by the camera): m, (y) is the intensity measured at the pixel y of the index image, that is to say the image recorded after index illumination).
  • the proposed algorithm consists of changing the emitters represented by the vectors x and X in accordance with the law given by the density ⁇ ( ⁇ , ⁇ ).
  • the algorithm is iterative: at each iteration, one of the transmitters is perturbed (in position or in intensity) and this perturbation is accepted or not according to the principle of the Metropolis-Hastings algorithm [3].
  • the reconstructed image is obtained by averaging, with equal weight for each iteration, the emitters thus constructed. If x, and j respectively correspond to the position and the intensity of the emitters at the iteration j of the algorithm, then the image / reconstructed after N iterations is given by
  • the results of the algorithm can be transmitted to the user either in the form of an image or in the form of digital or graphical data.
  • the same reconstruction algorithm can be used in a second version including a set of additional parameters describing global parameters of spatial region of the object is known a priori is determined a posteriori.
  • This algorithm in both versions, can be used in all multi-image systems, in which a set of different and differentiated images, from the same spatial region of the object, two-dimensional or three-dimensional - are recorded and analyzed.
  • the speed of the transmitters can be taken into account.
  • the ICE algorithm has recently been introduced for image denoising in the case of full variation regularization [39].
  • the ICE algorithm can also be used to solve more complex inverse problems (deblurring, interpolation). This fixed point type algorithm converges very quickly, and the resulting solution is extremely close to that associated with the LSE algorithm for this problem.
  • the principle of the ICE algorithm is to replace the calculation of the expectation of the posterior distribution performed by LSE by the iteration of the explicit calculation of the average of the posterior distribution of a pixel conditional on its neighbors.
  • the application of the ICE algorithm to inverse problems for an image or a multi-image system must be demonstrated.
  • the SRCDA algorithms use as input the measurements made on the sample, but also data inherent in the system that are based on either values theoretical, or on values obtained after a so-called calibration stage.
  • measurements are performed on a reference sample to accurately measure the illumination functions and the return transfer function (PSF) of the optical system.
  • PSF return transfer function
  • the optical process composed according to at least one embodiment of the invention is a logical complement of the SRCDA algorithm. Indeed, the reconstruction obtained by the algorithm SRCDA can lead to the conclusion that an additional image would improve the performance of the measurement.
  • the SRCDP microscopy platform makes it possible to acquire one or more complementary images chosen from a set of light distributions of the PSIT or PDOS methods. Resolution, parsimony, topology of enlightenment and positivity
  • a microscopy system that does not use a nonlinear effect is limited, in the general case, to a superresolution factor of 2 with respect to the limit imposed by optical diffraction [38] and [41].
  • a parsimonious scene real support of the sample substantially smaller than the size of the image area, for example in the case of scenes composed of filaments and / or point sources
  • a continuous background too important (so that a positivity constraint on the reconstructed image is effective)
  • this limit of 2 is no longer valid and can be exceeded [42-44].
  • the achievable resolution for the reconstructed image is not limited by optical diffraction but by the quantity of photons (more precisely, by the signal-to-noise ratio of the measurement).
  • the maximum superresolution factor essentially depends, in addition to the signal-to-noise ratio, on the properties of the scene: number of sources (relative to the number of measurements), distance minimum between two sources, etc. [43-44].
  • the maximum superresolution factor will depend, in addition to the factors described previously, of the selected illuminations.
  • the principle is based on the exploitation of one of the characteristics of the algorithms described above but not only, which is that the signal of interest is located mainly where the excitation light has been projected. It is possible to measure the proportion of signal that belongs to the region of interest (pinhole) for each image, ie each laser position, each light distribution and each orientation of this light distribution.
  • Pinhole Ratio This measure, called Pinhole Ratio, consists in the method we describe, comparing in a spatial region of the object the proportion of photons that are re-emitted and imaged in the region of interest of each image from this region in relation to the total number of photons reemitted by the object in all the images considered.
  • This ratio gives information locally on the nature of the imaged object, whether it verifies a predefined model (for example: planar object) in the sense of the Pinhole Ratio, or if it deviates strongly from this model.
  • a predefined model for example: planar object
  • the criterion defined here can take values between 0 and 1, as well as a nominal value PR ref in the case where the object satisfies the model. Values lower than PR ref are associated with an object that does not completely or not completely check the model according to a theoretical or empirical rule.
  • a property of the Poisson noise is the possibility of generating, from a realization of a Poisson VAR of parameter I (the mean), two independent realizations of a Poisson VAR of parameter 1/2, thanks to a post-treatment.
  • n is equal to the measurement of the initial Poisson variable
  • p is an equal photon separation parameter. at 0.5 in our case.
  • this property illustrates the known fact that if we put a 50/50 splitter mirror in front of the camera that images the fluorescence, and that we place a second camera to image the second fluorescence beam, then both cameras, under identical conditions of image acquisition, acquire a signal of average equal to half of the initial signal and always following a Poisson's law.
  • the analysis or reconstruction of the two measurements thus generated provides two independent results in the sense of the probabilities, and the differences between these two results illustrate the dependence of the reconstruction algorithm on the noise of measurement, although the signal-to-noise ratio is lower in each generated measure than in the original measurement of a factor sqrt (2).
  • the PSIT method can be used as a technique to measure the position of a nano-transmitter with high precision, using a different measuring mechanism complementary to the centroid method.
  • the preprocessing procedure creates two images:
  • a "top hat” image consisting of the sum of the three images of the sequence
  • a vortex image consisting of the sum of the two half-moon images.
  • a first descriptor is the Cartesian position calculated using the centroid algorithm on the "top-hat” image.
  • the radial position p can be measured univocally by measuring a parameter, p a , equal to the normalized tangent arc by a factor ⁇ , of the intensity ratio between the normalized intensity emitted by the a nano-transmitter illuminated by the vortex wave, Iv, and the normalized intensity emitted by the nano-transmitter illuminated by the fundamental wave, IF.
  • a parameter, p a equal to the normalized tangent arc by a factor ⁇ , of the intensity ratio between the normalized intensity emitted by the a nano-transmitter illuminated by the vortex wave, Iv, and the normalized intensity emitted by the nano-transmitter illuminated by the fundamental wave, IF.
  • the normalized intensity emitted by the nanoemitter illuminated by the fundamental wave varies from 1 at the center for the fundamental wave to 0 at the radius of Airy,
  • the azimuth position can be measured by measuring the intensity ratio between the total intensity emitted by the nanoemitter illuminated by the first half-moon distribution, IH, and the total intensity emitted by the nanoemitter illuminated by the second half-moon distribution. , IVE- The relationship between these two intensities is a geometric law in square tangent:
  • This redundancy is a measure of qualifying the object observed as a single point and of separating this case from other objects potentially present on the sample.
  • a direct application of the use of the PSIT method according to one embodiment of the invention for measuring the position of a nanoemitter with high precision is the integration of this measurement technique in a new technique of local stochastic optical reconstruction.
  • One of the limits of the applicability of stochastic techniques is the measurement process, requiring a large number of images and therefore a long measurement time and a strong phototoxicity.
  • the use of the PSIT technique according to at least one embodiment of the invention which makes it possible to measure the position of a light emitter, at a much higher resolution than the Airy disk, at rates that can reach the micro or nanoseconds allows the extension of stochastic techniques to many new applications.
  • the resulting images of using the PSIT method can also be processed using the generalized Hough method, allowing to recognize structured objects, line, circle or others, in an image.
  • centroid will measure the center of gravity of the light distribution, which will be at the origin
  • the descriptors p and ⁇ enable us to measure the characteristics of two points at a resolution much higher than that defined by the Rayleigh criterion. Moreover, using a compound process, it is possible to separate this case from the vast majority of cases of 3 points or more. An additional light distribution may be projected on the sample, a half-moon inclined at an angle ⁇ ; the hypothesis of the presence of two points will be confirmed or invalidated according to the results of this image. Indeed, the measured energy will be zero only for two points, for a line or for a series of points aligned in the direction of the angle ⁇ .
  • the resolution of a system using the PSIT and / or PDOS techniques is therefore, in practice, dependent on the sample observed.
  • the resolution obtained can substantially exceed the factor 2 (locally or even globally).
  • 80 represents the initialization phase, i.e., the detection of the transmitter using a confocal scanner or any other known optical method.
  • 81 represents the positioning phase of the vortex beam on the transmitter;
  • 82 represents the case where the emitter moves with respect to the center of the vortex and is excited by a fraction of the beam creating a fluorescence which can be detected;
  • 83 represents the repositioning of the emitter at the center of the vortex beam such that no fluorescence is created and detected (recorded position Xi, Yi) and 84 corresponds to a feedback loop in which an independent location system reposition the element followed at a corrected position.
  • the light distributions used by this technique are vortices generated by conical diffraction. However, this technique can also use other vortices or other distributions generated by conical diffraction.
  • the molecule of interest has been labeled with one or more fluorophores which can be excited at ⁇ .
  • the position of the molecule is first detected by a classical confocal image at ⁇ .
  • the position of the scanner is then adjusted to stimulate the sample so that the center of the vortex coincides exactly with the position of the emitter.
  • the fluorescence signal is detected by a very sensitive camera (eg EMCCD or sCMOS), or PMT, allowing a detection of the low amplitude signal of the transmitter thanks to a significant quantum efficiency.
  • the localization process is based on the absence of a fluorescent signal when the emitter is exactly in the center of the vortex.
  • the fact that the intensity gradient is important near the center of the vortex allows a precise location of the transmitter. If the transmitter moves slightly, the intensity it absorbs will no longer be zero, and it will emit a fluorescent signal whose position and intensity are deduced from the image.
  • a feedback loop then makes it possible to refocus the vortex on the transmitter and to memorize the position of the transmitter.
  • the feedback loop can be executed at the speed of the camera (up to 1kHz) or the detector (several MHz), allowing tracking of a molecule in real time over a period of time consistent.
  • the localization can be conducted over a long period of time, bleaching being less likely to occur with such small doses of light.
  • the accuracy of the location depends strongly on the signal-to-noise ratio of the image, therefore the background noise (camera noise and auto-fluorescence signal) must be taken into account.
  • a crystal can be adapted to generate a vortex at one wavelength, and a Gaussian beam at another wavelength along the same optical path. This makes it possible to use a simple optical path starting from a fiber that solves many practical problems. Dark-tracking technology can be easily used to investigate many biological issues in which conventional particle-tracking techniques are penalized by particle bleaching.
  • FIG. 6b is a simplified schematic illustration of a modified LatSRCS optical module, achromatic or otherwise, 700, according to an embodiment of the present invention.
  • This module differs from the implementation of a LatSRCS optical module, 700, previously described and shown in Figure 6a, by adding several elements before the module:
  • lasers 79a, 79b and 79c optionally at different wavelengths, optical fibers 78a, 78b and 78c from lasers 79a, 79b and 79c,
  • polarization control sub-modules 77a, 77b and 77c for statically or dynamically changing the polarization of the lasers 79a, 79b and 79c, the polarization control submodules being positionable before or after the fiber.
  • the polarization control sub-modules 77a, 77b and 77c may not be necessary and the polarization of light from the fiber is determined by the relative position of the laser and the fiber,
  • a "laser combiner” (76a), combining two or more laser sources optionally through optical fibers, 78a, 78b and 78c, into a common output fiber, 76b,
  • an optical element, 75 for transforming the light from the fiber into collimated light that can be used by the rest of the LatSRCS module, 700, similarly to that described above.
  • the two optical elements 31 and 75 can be integrated into a single element, or even removed if the output parameters of the common fiber are adequate.
  • the common fiber, 76b may not be necessary for some implementations.
  • the introduction, through a common optical fiber, or directly into light propagating in space, of two or more wavelengths having different polarizations makes it possible to create a method and / or a device able to realize the RESOLFT or STED techniques in all their different modalities.
  • the excitation and depletion waves propagate along a common path and the LatSRCS module, 700, can be totally achromatic, or not in a simplified version, as described above.
  • the excitation and depletion waves propagate along two orthogonal linear polarizations and a quarter-wave plate - optionally achromatic - is positioned at the entrance of the system to transform these polarizations into polarizations.
  • a quarter-wave plate - optionally achromatic - is positioned at the entrance of the system to transform these polarizations into polarizations.
  • the fiber is a birefringent fiber and creates a difference in operation greater than the coherence length of the depletion laser, creating an incoherent superposition of the two polarizations. orthogonal.
  • a polarization submodule (not shown), consisting for example of a thick uniaxial crystal with high birefringence.
  • a polarization submodule (not shown), intensity ratio control can be used. This polarization, intensity ratio control submodule is different from the previous polarization submodule, but can potentially be integrated with it.
  • This intensity ratio control bias sub-module can be used to control the intensity ratio between the two polarizations, and thus, as will be described later, the intensity ratio between the 2D depletion beam (vortex ) and the 3D depletion beam (black sphere).
  • the polarization control sub-modules, 77a, 77b and 77c can be actuated to simultaneously create sequences of light distributions, identical or different, for the excitation path and the depletion path.
  • the intensity of the lasers can be modulated, creating a complex timing diagram of the intensity of each laser, the sequence of excitation light distributions and the sequence of light depletion distributions.
  • the resulting emission image will be called the negative image.
  • the difference image consists of the weighted subtraction of these two images.
  • this difference image may be a digital processing more evolved than a simple arithmetic difference and may incorporate a set of mathematical treatments known to those skilled in the art, making it possible to optimize the resulting image in function, for example, but non-limited, of the frequency content of the two images.
  • This difference image if we choose the right parameters, will have a size - in terms of PSF - finer than a conventional STED, while requiring only a lower intensity of depletion.
  • the purpose of vortex depletion will no longer be to reduce the size of an Airy spot, thus requiring significant energy, as in conventional STED or RESOLFT, but to reduce the excess energy present in the excitation vortex with respect to the Airy distribution or the fundamental one.
  • the depletion of the Airy or of the fundamental will be coupled with the subtraction of the negative image, created by the excitation vortex, which is equivalent to the mathematical subtraction of the two illuminations. Reducing the size of the resulting PSF will be the combination of these two effects.
  • this embodiment may in some cases overcome the need to trigger the excitation as necessary in the "Gated STED". Indeed, the photons arrived before the complete application of the depletion, can be taken into account by an adequate choice of parameters, without requiring the addition of a complex and binding system. Finally, the need to modulate the STED, "ModSted” can also be avoided because the emission photons emitted by the vortex of depletion hardly differs from those emitted by the excitation vortex and can also be compensated.
  • an excitation beam sequence, a depletion beam sequence are simultaneously projected, the two beam sequences being able to differ in their polarization, creating light distributions of different topologies.
  • This device makes it possible to produce a sequence of light distributions of smaller sizes than would have been obtained without the depletion beam.
  • the algorithmic SRCDA will be used in this implementation to determine the spatial distribution or the position of point emitters.
  • coupling the depletion and the algorithmic should allow a suitable compromise between the intensity of the projected depletion beam and the resolution gain.
  • an excitation beam is simultaneously projected in the form of an Airy and a depletion beam in the form of a vortex, the two beams differing in their polarization.
  • This device makes it possible, without dynamic elements, to produce a totally achromatic STED device.
  • STED or STED-3D systems uses an optical distribution of zero intensity at the center point, and remains zero along the axis, along a certain distance.
  • STED-3D the use for STED-3D, of a distribution having a position of zero intensity, this position of zero intensity having a helicoidal spatial variation, as a function of the axial parameter.
  • the preferred implementation of this distribution is the use of conic diffraction using the optical distributions that we have referenced as the Stokes distribution.
  • SLM Spacial Light Modulator
  • segmented mirrors that create phase and / or random distributions. amplitude in the pupil.
  • helical topology distribution to create a zero intensity distribution having a helical motion is considered to be part of this invention.
  • the implementation of these distributions using conical diffraction is one of the preferred implementations of this invention but the implementations of these distributions using an SLM or segmented mirror to create phase distributions or amplitude in the pupil are also considered one of the implementations described in this invention.
  • the integrative two-polarization method the crystal parameters are chosen, such that the fundamental wave creates a black sphere and the vortex wave creates a vortex.
  • the two distributions, orthogonally polarized do not interfere and an incoherent superposition of the two beams allows, with a single input beam to independently create the two beams necessary for STED 3D, the vortex and the black sphere.
  • the ability to create with a single beam of depletion input, the two beams can greatly simplify the optical system. In addition, this system is common way, it can be implemented simply.
  • a polarization sub-module (not shown), static or dynamic, positioned between the optical fiber and the crystal, can be used to control the intensity ratio between the two polarizations, and thus, the intensity ratio between the beam 2D depletion (vortex) and the 3D depletion beam (black sphere).
  • the integrative single-polarization method, a birefringent fiber - or a polarization sub-module - has previously created, as described above, a difference in operation greater than the coherence length of the depletion laser. for a CW laser, and / or at the time of the pulsing, for a pulsed laser or for the gated STED, creating an incoherent superposition of the two orthogonal polarizations.
  • the two distributions do not interfere; the two distributions being of orthogonal polarizations, will create, on the same polarization, the one a fundamental one - which by a choice of parameters of the crystal and the optical system, will be a black sphere, and the other a vortex.
  • These two beams derived from two incoherent distributions, as previously described, do not interfere; this device makes it possible, with a single input beam, before the fiber, to independently create the two beams necessary for the 3D STED the vortex and the black sphere.
  • the ability to create with one single input depletion beam, the two beams greatly simplifies the optical system. In addition, this system is common way, it can be implemented simply.
  • the conical diffraction element is replaced by a sub-diffraction.
  • module consisting of two conical diffraction crystals, of substantially equal conical diffraction parameter value, separated by a polarization submodule.
  • the polarization sub-module is chosen such that at the depletion wavelength, the polarization submodule has no effect, and the action of the crystals are added, creating the vortex and / or the black sphere.
  • the polarization submodule creates a rotation of the polarization of 90 ° or 180 °, the effect of the two crystals is subtracted, and the transmitted beam is identical to the incident beam.
  • This device avoids creating too "exotic" distributions on the excitation beam.
  • the crystals could have different conical diffraction parameter values, to also create an effect on the excitation beam, but with a conical diffraction parameter value different from that of the depletion beam.
  • This variant can be made at several wavelengths of depletion and excitation, using the resources of the polarization modules well known to those skilled in the art.
  • the conical diffraction element is replaced by a cascade of crystals having different spectral properties, such as LBO and KTP (KTA) so as to allow the realization of black sphere at several wavelengths of depletion.
  • KTA KTP
  • the dispersion of the characteristic parameter of the conical diffraction effect, po does not make it possible to carry out certain distributions at several wavelengths, in particular the black sphere, the shape of which depends strongly on this parameter. Compensation of the dispersion of the characteristic parameter of the conical diffraction effect, po, therefore allows the realization of a 3D STED with a common optical path, at two or more wavelengths.
  • the dispersion of the characteristic parameter of the conical diffraction effect, po therefore allows the realization of a 3D STED with a common optical path, at two or more wavelengths.
  • compensation of the characteristic parameter dispersion of the conical diffraction effect, po can be performed over a wide range of wavelengths either as previously described by a combination of crystals, or by spectrally correcting the second-order optical system, ie, by creating a wavelength-dependent digital aperture to either compensate for the dispersion of the characteristic parameter of the tapered diffraction effect, po, or to correct a dispersion compensation of the characteristic parameter of the tapered diffraction effect, po, created by a combination of crystals previously described.
  • an excitation beam sequence, a depletion beam sequence are simultaneously projected, the two beam sequences being able to differ. by their polarization, creating light distributions of different topologies.
  • the LatSRCS module makes it possible to produce a sequence of light distributions of smaller sizes than would have been obtained without the depletion beam.
  • the LongSRCS module implements the PDOS method so as to separate on different detectors the collimated light, emerging from nanoemiters positioned in the focal plane of the objective, of the emerging non-collimated light of nanoemitters lying below or beyond the focal plane.
  • the PDOS method in this implementation, makes it possible to acquire essentially longitudinal information, that is to say the longitudinal position of each of the nanoemitters, complementary to the lateral information obtained using the original or modified LatSRCS module.
  • the algorithmic SRCDA will be used in this implementation to determine the spatial distribution or the position of point emitters.
  • a dynamic polarization element is used before or after the biaxial crystal to correct the dynamic movement of the pupil, which in some cases can to be created during the optical scanning of the confocal microscope.
  • This pupil movement effect being in some implementations STED technologists one of the limits of performance, without the need for an additional scanning system.
  • two or more light distributions located at different wavelengths are projected using an original or modified LatSRCS module.
  • the first light distribution makes it possible to make the scene parsimonious, that is to say to isolate transmitters by means of a physical effect, which dilutes the density of the emitters capable of emitting fluorescence, so as to create regions in which the assumption of parsimony is valid, ie the presence of an isolated transmitter or a small number of transmitters.
  • the physical effects that will achieve this parsimony will be the same or will be derived effects, effects used to create parsimony for single transmitter location microscopy techniques. These techniques include, for example, PALM STORM, DSTORM, FPALM and others.
  • the second light distribution at another wavelength will create a fluorescence whose intensity will be variable over time.
  • This second light distribution will use one of the PSIT techniques, either a discrete distribution sequence or a sequence of continuous distributions.
  • the light will be detected either by a matrix detector or by a single detector.
  • the most likely implementation will be the use of a single detector; in this case the lateral position information xy and potentially the longitudinal distribution information z can be obtained by intensity ratios.
  • harmonic time distributions in which the electro-optical cells are actuated by a sinusoidal voltage.
  • the xy position can be retrieved using a measurement of the temporal harmonics of the signal measured by the detector, which may be a single detector, which indirectly contain the lateral position information.
  • Two cascaded crystals create an effect of adding the effects of the crystals (if they are oriented in the same direction), as described in Reference 46, or subtraction (if they are oriented at 180 °).
  • using the effect of addition of the effects of the crystals one can have two crystals whose effects are added.
  • a chromatic rotator which rotates at different angles, ideally at angles being multiples of 180 °, at different wavelengths, one can have a modulus in which the effects of the two crystals cancel each other out at a different angle. wavelength and add up at the other wavelength.
  • the rotator in question can be a simple crystal (ex: quartz) whose the thickness is optimized according to the rotatory powers of the crystal at the two optimization wavelengths, in order to obtain a difference in the 180 ° rotation between the two beams.
  • the energy ratio in the 3D STED created by a conical crystal is fixed, the vortex energy being carried by a polarization (circular) and the energetic of the black sphere being carried by the other polarization.
  • the use of a dichroic element - in the first sense of dichroic is a selectively absorbing element polarizations - allows to modify this ratio.
  • This element can be either a circular dichroic element - or a linear dichroic element requiring the addition of a polarization element before and optionally after the dichroic.
  • Representative but non-limiting dichroic elements are Brewster's slides or certain dichroic glasses comprising homogeneously oriented elongate metal nanoparticles enclosed in glass surface layers.
  • the described embodiments of the invention can be integrated on a confocal fluorescence microscope.
  • the superresolution system according to embodiments of the invention consists of a new measurement mode, in addition to or in replacement of the Existing modalities of microscopy.
  • the superresolution system according to embodiments of the invention can just as easily be integrated on the other microscopy platforms.
  • These microscopy platforms include but are not limited to: wide field microscopes, "wide field microscope”, dark field microscopes, "dark field microscope”, polarization microscopes, phase difference microscopes , Differential interference microscopes, microscopes
  • the microscope platform that has been described is coupled to an electron microscopy system (CLEM-Correlative Light Electron Microscopy), or any other similar system such as TEM (Transmission Electron Microscopy), or PEBM ( Electron Beam Microscopy), or the SE (Scanning Electron Microscopy)
  • CLEM-Correlative Light Electron Microscopy or any other similar system such as TEM (Transmission Electron Microscopy), or PEBM ( Electron Beam Microscopy), or the SE (Scanning Electron Microscopy)
  • the microscope platform is a complete SRCDP platform, and includes a LongSRCS module, implementing the PDOS method and using the SRCDA algorithm.
  • the microscope platform is a partial SRCDP platform, and uses the algorithm SRCDA.
  • the microscope platform is a partial SRCDP platform, and uses the control module.
  • the microscope platform further comprises a LongSRCS module, implementing the PDOS method
  • optical fibers The advantageous use of optical fibers is the transmission of the fundamental mode, the TEMoo mode and only it.
  • certain configurations of optical fibers mainly but not exclusively based on fibers called "Photonic Crystal Fiber” (in English) allows the simultaneous transmission or not, more complex modes, including vortex modes. It would therefore be possible to deport the optical distributions created by the conical refraction using optical fibers, allowing a major simplification of the optical system.
  • Embodiments of the invention may be applied, by choosing a different optical system, to many medical applications, for example but not limited to ophthalmological observation.
  • This field of application corresponds to the measurement of biological or medical objects of micron resolution, the resolution being between 1 and 10 ⁇ .
  • embodiments of the invention may be applied, as explained later, through an optical fiber. This allows many applications

Abstract

L'invention propose une méthode optique et un procédé optique de mesure, de type STED 3D achromatique, basé sur un effet de diffraction conique ou de propagation de la lumière dans les cristaux uniaxes, comportant une cascade d'au moins deux cristaux de diffraction conique ou uniaxes, créant à partir d'une source laser comportant plusieurs lasers, dont les sorties sont combinés sous forme d'une fibre optique, ( banc laser), ou d'un laser continu, l'ensemble de la lumière se propageant suivant le même chemin optique, ou quasiment suivant le même chemin optique, de la sortie d'un banc optique à l'objectif d'un microscope L'invention propose une méthode optique et un procédé optique de mesure et un appareil optique achromatique pour déterminer la position spatiale d'au moins un nano-émetteur lumineux, d'un objet structuré ou d'une distribution continue sur un échantillon, le procédé comportant : la projection d'une séquence d'au moins deux distributions lumineuses compactes de familles topologiques différentes sur l'échantillon, la détection de la lumière réémise par ledit au moins un nano-émetteur lumineux, objet structuré ou distribution continue de l'échantillon; la génération, d'au moins une image optique pour chaque distribution lumineuse, à partir de la lumière détectée; un module d'algorithme dans lequel la formulation de la reconstruction de l'échantillon et de ses propriétés spatiales et/ou temporelles et/ou spectrales est considérée comme un problème inverse bayésien et conduit à la définition d'une distribution a posteriori, une loi a posteriori combinant, grâce à la loi de Bayes, la formulation probabiliste d'un modèle de bruit, ainsi que d'éventuels aprioris sur une distribution de lumière crée dans l'échantillon par projection. De plus, l'invention propose un procédé optique de mesure et un appareil optique achromatique dans lequel le module d'algorithme est configuré pour estimer la distribution de lumière dans l'échantillon par l'utilisation de nuées d'émetteurs ponctuels permettant de favoriser les solutions parcimonieuses et d'estimer la moyenne a posteriori, et enfin de représenter les résultats, basés sur la moyenne a posteriori, soit sous forme d'une image soit sous forme de données numériques ou graphiques.

Description

PROCEDE ET DISPOSITIF DE MESURE OPTIQUE
INTRODUCTION
La présente invention concerne un procédé et un dispositif de mesure optique. Elle trouve des applications dans tous les domaines de l'imagerie, en particulier mais non limitée au domaine de la Microscopie, incluant mais non limité aux domaines de la Biologie, de la Médecine, de la Pharmacie, des Semi-conducteurs, de l'Etude des matériaux, de la Métrologie, du contrôle, de la mesure et de l'observation et à l'ensemble des processus d'acquisition de l'information à partir d'observations optiques, dans le domaine macroscopique ou microscopique.
De nombreuses définitions, utilisées pour l'ensemble de cette invention, sont regroupées dans un chapitre ultérieur : « Définitions et compléments techniques ».
Microscopie
Un Microscope optique est un instrument utilisé en général pour voir, analyser ou mesurer les objets trop petits pour être visualisés à l'œil nu. On se réfère à la Figure. 1 , qui représente une illustration du paradigme de la Microscopie, 100.
La Microscopie optique consiste en l'illumination, par une source lumineuse, non représentée, à l'aide d'un Microscope, 10, d'un échantillon biologique ou non-biologique, 11, et la mesure en fonction du temps, à l'aide d'une observation visuelle ou d'un module de détection, 12, de la lumière émise, réémise, diffusée ou réfléchie ou transmise par l'échantillon. En Biologie, l'échantillon consiste en une - ou une pluralité - d'entités objets biologiques différentes, 13 et 14, positionnées à différentes positions. Des exemples de tels objets, sont, entre autres, une cellule, un virus, une protéine ou un fragment d'ADN. En vision industrielle artificielle l'échantillon peut être, par exemple, un élément semi-conducteur
La Microscopie est segmentée en différentes modalités ayant des caractéristiques et des finalités différentes. De nombreuses descriptions des différentes modalités, de leurs
caractéristiques et de leurs avantages existent extensivement dans la littérature et se trouvent par exemple sur les sites web des sociétés Zeiss, Leica, Nikon, ou Olympus.
On peut segmenter les applications de Microscopie de différentes manières : l'une d'entre elles est de distinguer les modalités de Microscopie dévolues à la visualisation de sources ponctuelles minuscules de celles dévolues à la mesure d'objets continus.
Le cas des sources ponctuelles minuscules est a priori beaucoup plus simple. L'objet consiste en un petit nombre de points lumineux ; ceux-ci peuvent être décrits par un petit nombre de paramètres - les descripteurs définis par la suite - simplifiant de beaucoup le problème physique et la complexité algorithmique. Le cas d'un objet continu, décrit par une distribution spatiale - ou spatio-temporelle, si on prend en compte la dynamique continue, est différent et est décrit aussi dans cette demande de brevet. Microscopie de fluorescence
La microscopie de fluorescence est une des modalités de la microscopie; elle a remplacé, dans de nombreuses applications, les autres techniques de microscopie. Un microscope à fluorescence est un microscope optique utilisé pour étudier les propriétés d'objets, ou de substances organiques ou inorganiques en utilisant les phénomènes de fluorescence au lieu de, ou en plus d'autres modalités telle que la réflexion et l'absorption.
On se réfère de nouveau à la Figure. 1, décrivant, cette fois, un microscope de fluorescence utilisé soit en Biologie soit en Vision artificielle pour caractériser, par exemple, des matériaux; en microscopie de fluorescence on fixe des sources ponctuelles minuscules, 15 à 18, par exemple des fluorophores basées sur le phénomène physique de la fluorescence à un photon, à des positions spécifiques et prédéterminées des objets, 13 et 14; on observe la lumière émise par les sources ponctuelles en lieu et place d'observer la lumière émise par les objets, 13 et 14, eux-mêmes.
L'échantillon est éclairé par une lumière de longueur d'onde, ou de longueurs d'onde spécifiques, qui est absorbée par les sources ponctuelles, induisant ainsi l'émission de lumière à des longueurs d'onde différentes et plus élevées. Lors de la collecte de la lumière émise, en fluorescence, la lumière d'illumination est séparée de la fluorescence émise, qui est plus faible, par l'utilisation d'un filtre spectral d'émission.
La microscopie de fluorescence étudie la lumière émise par de petites sources ponctuelles, les fluorophores. Toutefois, lorsque la densité des fluorophores est élevée, les fluorophores ne sont plus analysés individuellement mais traités comme un objet continu. Il est important de noter, dès ce stade, que le même système permet l'observation d'objets continus, et n'est pas limité à l'observation de sources ponctuelles.
Les fluorophores sont devenus un outil important de la visualisation d'objets biologiques. L'activité et l'information biologique comprenant des détails au-dessus de la limite de résolution de 200 - 250 nm sont systématiquement visualisés et mesurées en utilisant la microscopie de fluorescence. Cette limite de résolution est dérivée du critère de Rayleigh, qui, dans le meilleur des cas, atteint 200 - 250 nm dans des systèmes conçus spécialement. Pendant longtemps, jusqu'à l'émergence des techniques de superrésolution décrites ci-dessous, il était reconnu que les techniques optiques, y compris la microscopie de fluorescence, sont incapables de visualiser des détails plus petits que le critère de Rayleigh, de l'ordre de 200 - 250 nm.
Les principales implémentations de la microscopie de fluorescence, décrites en détails dans la littérature, sont le microscope confocal, souvent utilisé dans une configuration à balayage ou à disque rotatif et le microscope d'imagerie à grand champ. Microscopie confocale
On se réfère maintenant à la figure 2, qui est une représentation simplifiée d'un microscope confocal à fluorescence de l'art antérieur 200.
Un microscope confocal de fluorescence, Fig. 2, est un instrument optique. Ses principaux composants matériels sont représentés dans la figure. 2. Ils comprennent:
• Une source de lumière, 20,
• un cadre optomécanique non représenté,
• un cube de filtres, 21 ,
• un objectif de microscope 22, et,
• un ensemble détecteur, 23,
• une unité de traitement, non représentée.
La source de lumière, 20, qui peut être une lampe à arc ou un laser, crée de l'énergie lumineuse nécessaire pour la fluorescence.
Le cadre optomécanique, non représenté, est le support de tous les éléments optiques et comprend des optiques auxiliaires et les capacités d'alignement. Il comprend également, des éléments optiques, non représentés, capables de façonner le faisceau, pour permettre sa focalisation d'un point de taille minimale, au moyen de l'objectif du microscope.
Il peut comprendre également, dans un microscope confocal de fluorescence à balayage, un mécanisme de balayage, spatial ou angulaire, non représenté pour modifier la position de la source ponctuelle par rapport à l'objet à mesurer.
Le cube de filtres, 21, canalise les différents signaux optiques et évite la contamination du signal de fluorescence par la lumière d'excitation. Le cube de filtres se décompose en: filtre d'excitation, 210, miroir dichroïque, 211, et filtre d'émission, 212.
L'objectif de microscope, 22, focalise la lumière créée par la source dans le plan focal de l'objectif, 24, en une distribution lumineuse de taille réduite, la distribution lumineuse considérée comme optimale consistant en un disque d'Airy. L'objectif de microscope, 22, permet également de recueillir en retour la lumière fluorescente émise par les fluorophores.
Pour un microscope confocal de fluorescence à balayage le système peut être déscanné, c'est- à-dire que la lumière en retour peut passer par le mécanisme de balayage pour compenser la translation due au balayage.
Une lentille de détecteur, 25, crée, au plan image du détecteur 26, une image magnifiée du plan focal de l'objectif, 24.
Un trou confocal, 27, est théoriquement placé dans le plan image du détecteur, 26. Dans la plupart des systèmes pratiques, le trou confocal, 27, est placé dans un plan d'imagerie
intermédiaire non représenté et réimagé sur le plan image du détecteur, 26. L'assemblage du détecteur, 23, détecte l'intensité fluorescente globale dans le volume éclairé, et la transforme en signal numérique. Pour un microscope confocal à balayage, l'assemblage du détecteur est constitué d'un détecteur d'un seul élément, comme un PMT ou SPAD. Pour un microscope confocal à disque rotatif, l'assemblage du détecteur est constitué d'une matrice d'éléments de détection, telle qu'un CCD, un EMCCD, un CMOS ou une matrice de SPAD.
L'ensemble des composants montés à partir de la source lumineuse jusqu'au filtre dichroïque est la voie d'éclairage, 201. L'ensemble des composants montés à partir du filtre dichroïque jusqu'à l'assemblage du détecteur est la voie de détection, 202.
Le processus optique élémentaire d'un microscope confocal standard peut être segmenté en six parties:
• Projection de la lumière sur le volume d'analyse
• Emission de lumière fluorescente par les fluorophores
• Imagerie des fluorophores sur le plan focal
• Limitation dans le plan focal de la lumière analysée par le trou confocal
• Intégration de la lumière analysée par un détecteur photoélectrique
• Visualisation de l'intensité mesurée sous forme d'une valeur de pixel dans une image
Des microscopes à fluorescence sont disponibles auprès de plusieurs fabricants, comme par exemple, Nikon, Zeiss, Leica ou Olympus. Les microscopes à fluorescence peuvent être soit des microscopes standards adaptés à la fluorescence soit des microscopes spécifiques optimisés pour la fluorescence. Les microscopes modernes sont des instruments polyvalents capables de fonctionner dans de nombreuses modalités différentes, y compris, mais sans s'y limiter, les modalités de fluorescence, en utilisant la même plate- forme optomécanique et la plupart des composants. La plupart des microscopes à fluorescence sont développés en tant que plate-forme ouverte, capable d'effectuer plusieurs fonctionnalités additionnelles avec des modifications minimes. D'autres microscopes à fluorescence sont des instruments dédiés, personnalisés à une tâche spécifique, comme le diagnostic médical ou pharmaceutique.
Cependant, d'autres activités biologiques fondamentales se produisent également à des échelles de taille inférieure à 200 nm dans des échantillons biologiques. A ce niveau de résolution spatiale, des phénomènes importants peuvent être observés : les processus biologiques à l'échelle intracellulaire, le transfert d'information cellulaire, le repliement et le dépliement des protéines ou les modifications de l'ADN et l'ARN. Ainsi, par exemple, la mesure de ces informations intracellulaires ouvrira de nouvelles voies à la compréhension de l'activité biologique, et conduira à des progrès dans la connaissance et le suivi de la recherche et du diagnostic médical.
Toutefois, les différentes méthodes de microscopie existantes et les microscopes existants, n'incorporant pas la superrésolution, permettent l'observation microscopique sous la limite de la diffraction optique. Ceci réduit leur champ d'utilisation à un ensemble d'applications limité. Superrésolution
De nouvelles méthodes optiques, les méthodes de superrésolution, sont capables d'obtenir des images à une résolution supérieure à la limite de diffraction. Ces méthodes sont développées par plusieurs entreprises, laboratoires et chercheurs et certains des instruments utilisant ces méthodes, les microscopes de superrésolution, sont disponibles commercialement. Une synthèse des techniques de superrésolution a été publiée par l'Académie des Sciences de Suède, à l'occasion de la remise des Prix Nobel de Chimie 2014 [38]. Plusieurs analyses comparatives des méthodes de superrésolution ont été publiées récemment dans la littérature, comme les articles de Schermelleh et al. [1].
Une bibliographie mise à jour sur la superrésolution se trouve sur le site web de la société Zeiss, et sur le site web de la société Nikon.
Les nouvelles techniques de superrésolution permettent d'obtenir des informations au-delà de la limite de résolution. Le principal problème de l'ensemble des techniques existantes de superrésolution est la limite de l'enveloppe des performances, exprimée en termes de résolution, latérale et longitudinale, de vitesse, d'intensité lumineuse nécessaire et de phototoxicité dans l'objet biologique, et donc d'aptitude à mesurer des objets biologiques différents. Ce point a d'ailleurs été souligné par Eric Betzig, lors de sa présentation magistrale à la cérémonie de réception du prix Nobel de Chimie 2014.
De plus, la plupart des méthodes et instruments existants de superrésolution peuvent fournir soit une bonne résolution latérale, soit une bonne résolution longitudinale, mais rarement les deux.
De plus, tous ces instruments sont complexes et nécessitent une haute technicité de l'opérateur.
De plus, ces instruments ne peuvent observer généralement qu'une faible partie des spécimens biologiques, en raison de fortes limitations opérationnelles, telles que pour certains d'entre eux une faible profondeur de champ ou de très fortes intensités nocives pour les cellules.
Un autre problème avec les méthodes et instruments existants de superrésolution, est que la plupart d'entre eux sont en mesure de récupérer, dans le volume illuminé, les attributs d'un fluorophore unique, mais ne parviennent pas à reconnaître simultanément la présence de plusieurs fluorophores et de mesurer leurs attributs.
Un problème supplémentaire avec certaines méthodes et instruments existants de
superrésolution est que ces méthodes et instruments existants sont présentés aux utilisateurs et perçus par eux comme un outil général, apte à remplacer les microscopes standard ou confocal. Cependant, les méthodes et instruments existants de superrésolution manquent de simplicité, de robustesse, de facilité d'utilisation et sont onéreux par rapport aux microscopes standards, ce qui freine leur utilisation comme outils de recherche générale ou comme outils de diagnostic.
Un autre problème avec certaines méthodes et instruments existants de superrésolution est que la plupart de ces méthodes et instruments sont construits comme des instruments autonomes conçus pour remplacer les microscopes standards. Une telle approche nécessite le remplacement des instruments existants ainsi que le renouvellement de tous les systèmes périphériques et toutes les connaissances et savoir-faire, liés aux plateformes de microscopie et développées depuis de nombreuses années.
Un autre problème avec la plupart des méthodes et instruments existants de microscopie de fluorescence et de superrésolution est que ces méthodes et instruments sont conçus sur un paradigme d'acquisition d'image, pour lequel l'entité de base de l'information est une - ou plusieurs images, ou une - ou plusieurs - régions ROI - Région Of Intérest bi ou
tridimensionnelles. Les méthodes algorithmiques, systémiques et de superrésolution décrites ultérieurement dans le contexte de l'invention permettront, par leur inhérente flexibilité, le développement de stratégies nouvelles d'acquisition. Ces procédures d'acquisition, dynamiques et sélectives, seront définies par une gestion optimisée de la séquence d'acquisition et de traitement interactif et différé. Elles permettront une optimisation plus évoluée de l'information utile, définie par des critères basés sur la forme, la géométrie et la dynamique d'un ou plusieurs objets fluorescents, séparément ou l'un par rapport à l'autre.
Un autre problème avec la plupart des méthodes et instruments existants de microscopie de fluorescence et de superrésolution est que ces méthodes et instruments sont conçus pour étudier des échantillons sur des lamelles de microscopes. Cependant, le microscope confocal est aujourd'hui utilisé dans de nombreux domaines médicaux comme instrument de diagnostics in- vivo pour des examens internes et externes au corps humain par le biais de fibres optiques utilisées pour illuminer et pour visualiser la fluorescence émise par les tissus à diagnostiquer. La superrésolution ne permet pas actuellement de pratiquer de tels diagnostics in-vivo. Les méthodes algorithmiques, systémiques et de superrésolution décrites ultérieurement dans le contexte de l'invention permettront le développement de nouvelles méthodes de diagnostics in-vivo qui réduiront les besoins de pratiquer des biopsies et raccourciront le temps d'attente du patient.
Il y a donc toujours un besoin urgent de fournir des méthodes et instruments de
superrésolution et des méthodes algorithmiques capable de mesurer avec une grande précision un objet ou une scène biologique.
RESUME DE L'INVENTION
Un premier aspect de l'invention concerne un dispositif optique de mesure pour déterminer la distribution spatiale ou la localisation de sources réémettrices sur un échantillon, l'échantillon comportant au moins une source réémettrice, excitée par la lumière et réémettant de la lumière suivant une loi déterminée en fonction de la lumière projetée sur l'échantillon, le dispositif comportant
un module de projection achromatique, contenant un laser, dont la longueur d'onde est accordée sur la longueur d'onde d'excitation de ladite au moins une source réémettrice, pour créer soit une distribution lumineuse compacte soit une séquence des distributions lumineuses compactes de topologie différentes
un module de balayage pour balayer optiquement l'échantillon,
un module de détection pour détecter la lumière réémise par ledit au moins une source réémettrice de l'échantillon pour la ou pour chacune des distributions lumineuses compactes de topologie différentes et pour chacun des points de balayage de l'échantillon;
un module d'acquisition d'image pour acquérir pour chaque point de balayage, soit une image soit une séquence d'images, pour la séquence d'images, chaque image correspondant à une des distributions lumineuses compactes de topologies différentes,
un module d'algorithme dans lequel la formulation de la reconstruction de l'échantillon et de ses propriétés spatiales et/ou temporelles et/ou spectrales est considérée comme un problème inverse bayésien et conduit à la définition d'une distribution a posteriori.
Une loi a posteriori peut combiner, grâce à la loi de Bayes, la formulation probabiliste d'un modèle de bruit, ainsi que d'éventuels aprioris sur une distribution de lumière crée dans l'échantillon par projection.
Dans un mode de réalisation le module d'algorithme est configuré pour
estimer la distribution de lumière dans l'échantillon par l'utilisation de nuées d'émetteurs ponctuels qui permet de favoriser les solutions parcimonieuses; et
estimer la moyenne a posteriori,
représenter les résultats, basés sur la moyenne a posteriori, soit sous forme d'une image soit sous forme de données numériques ou graphiques
Selon un mode de réalisation l'estimation de la moyenne a posteriori est réalisée au moyen d'un algorithme de type Monte-Carlo Markov Chain (MCMC)
Un autre aspect de l'invention concerne un dispositif optique de mesure pour déterminer la distribution spatiale ou la localisation de sources réémettrices sur un échantillon, l'échantillon comportant au moins une source réémettrice, excitée par la lumière et réémettant de la lumière suivant une loi déterminée en fonction de la lumière projetée sur l'échantillon, le dispositif comportant un module de projection achromatique, contenant un laser, dont la longueur d'onde est accordée sur la longueur d'onde d'excitation de ladite au moins une source réémettrice, pour créer soit une distribution lumineuse compacte soit une séquence des distributions lumineuses compactes de topologie différentes,
un module de balayage pour balayer optiquement l'échantillon, intégré ou non dans le dispositif,
un module de détection pour détecter la lumière réémise par ledit au moins une source réémettrice de l'échantillon pour la ou pour chacune des distributions lumineuses compactes de topologie différentes et pour chacun des points de balayage de l'objet;
un module d'acquisition d'image pour acquérir pour chaque point de balayage, soit une image soit une séquence d'images, pour la séquence d'images, chaque image correspondant à une des distributions lumineuses compactes de topologies différentes,
un module d'algorithme MAP non régularisé avec contrainte de positivité pour traiter les données et reconstruire l'échantillon,
la représentation des résultats, basés sur les résultats de l'algorithme MAP, soit sous forme d'une image soit sous forme de données numériques ou graphiques
Selon un mode de réalisation l'algorithme MAP contient de plus une contrainte de limitation de bande-fréquentielle
Selon un mode dé réalisation l'algorithme MAP utilise un schéma numérique accéléré de type Nesterov
Selon un mode de réalisation pour une séquence d'images, la redondance dans l'information fréquentielle est utilisée, due au caractéristiques fréquentielles différentes des différentes distributions projetées sur l'échantillon, pour compenser et réduire fortement l'impact de points manquants ou d'irrégularités de balayage.
Selon un mode de réalisation l'algorithme MAP est adapté afin de résoudre un problème inverse portant sur une somme d'un petit nombre de termes, comme une composante basse- fréquence et une composante plus parcimonieuse.
Selon un mode de réalisation l'algorithme MAP est adapté afin d'imposer une contrainte de redondance non-locale de la solution, par exemple en calculant des poids sur les images ou sur les différents masques numériques et l'arbre de similitudes non-locales étant appliqué à la solution comme une régularisation.
Selon un mode de réalisation un masque de taille variable est utilisé dans le plan du détecteur pour obtenir des images ayant soit des caractéristiques axiales différentes, soit des capacités de rejection de lumière parasite différentes ou optimisées, globalement ou localement.
Selon un mode de réalisation un programme d'ordinateur configuré pour mettre en œuvre les modes de réalisation décrit précédemment. Un autre aspect de l'invention concerne un procédé optique de mesure pour déterminer la distribution spatiale ou la localisation de sources réémettrices sur un échantillon, l'échantillon comportant au moins une source réémettrice, excitée par la lumière et réémettant de la lumière suivant une loi déterminée en fonction de la lumière projetée sur l'échantillon, le procédé comportant
la projection achromatique, par un laser, dont la longueur d'onde est accordée sur la longueur d'onde d'excitation de ladite au moins une source réémettrice, pour créer soit une distribution lumineuse compacte soit une séquence des distributions lumineuses compactes de topologie différentes,
le balayage optique de l'échantillon,
la détection de la lumière réémise par ledit au moins une source réémettrice de l'échantillon pour la ou pour chacune des distributions lumineuses compactes de topologie différentes et pour chacun des points de balayage de l'échantillon;
l'acquisition d'image pour acquérir pour chaque point de balayage, soit une image soit une séquence d'images, pour la séquence d'images, chaque image correspondant à une des distributions lumineuses compactes de topologies différentes,
l'application d'un algorithme dans lequel la formulation de la reconstruction de l'échantillon et de ses propriétés spatiales et/ou temporelles et/ou spectrales est considérée comme un problème inverse bayésien et conduit à la définition d'une distribution a posteriori.
Une loi a posteriori peut combiner, grâce à la loi de Bayes, la formulation probabiliste d'un modèle de bruit, ainsi que d'éventuels aprioris sur une distribution de lumière crée dans l'échantillon par projection.
Dans un mode de réalisation l'algorithme comporte
l'estimation de la distribution de lumière dans l'échantillon par l'utilisation de nuées d'émetteurs ponctuels qui permet de favoriser les solutions parcimonieuses; et
l'estimation de la moyenne a posteriori,
représenter les résultats, basés sur la moyenne a posteriori, soit sous forme d'une image soit sous forme de données numériques ou graphiques
Selon un mode de réalisation l'estimation de la moyenne a posteriori est réalisée au moyen d'un algorithme de type Monte-Carlo Markov Chain (MCMC)
Un autre aspect de l'invention concerne un procédé optique de mesure pour déterminer la distribution spatiale ou la localisation de sources réémettrices sur un échantillon, l'échantillon comportant au moins une source réémettrice, excitée par la lumière et réémettant de la lumière suivant une loi déterminée en fonction de la lumière projetée sur l'échantillon, le procédé comportant la projection achromatique, par un laser, dont la longueur d'onde est accordée sur la longueur d'onde d'excitation de ladite au moins une source réémettrice, pour créer soit une distribution lumineuse compacte soit une séquence des distributions lumineuses compactes de topologie différentes,
le balayage optique de l'échantillon,
la détection de la lumière réémise par ledit au moins une source réémettrice de l'échantillon pour la ou pour chacune des distributions lumineuses compactes de topologie différentes et pour chacun des points de balayage de l'objet;
l'acquisition d'image pour acquérir pour chaque point de balayage, soit une image soit une séquence d'images, pour la séquence d'images, chaque image correspondant à une des distributions lumineuses compactes de topologies différentes,
l'application d'algorithme MAP non régularisé avec contrainte de positivité,
la représentation des résultats, basés sur les résultats de l'algorithme MAP, soit sous forme d'une image soit sous forme de données numériques ou graphiques
Selon un mode de réalisation l'algorithme MAP contient de plus une contrainte de limitation de bande-fréquentielle
Selon un mode de réalisation l'algorithme MAP utilise un schéma numérique accéléré de type Nesterov
Selon un mode de réalisation pour une séquence d'images, la redondance dans l'information fréquentielle est utilisée, due au caractéristiques fréquentielles différentes des différentes distributions projetées sur l'échantillon, pour compenser et réduire fortement l'impact de points manquants ou d'irrégularités de balayage.
Selon un mode de réalisation l'algorithme MAP est adapté afin de résoudre un problème inverse portant sur une somme d'un petit nombre de termes, comme une composante basse- fréquence et une composante plus parcimonieuse.
Selon un mode de réalisation l'algorithme MAP est adapté afin d'imposer une contrainte de redondance non-locale de la solution, par exemple en calculant des poids sur les images ou sur les différents masques numériques et l'arbre de similitudes non-locales étant appliqué à la solution comme une régularisation.
Selon un mode de réalisation un masque de taille variable est utilisé dans le plan du détecteur pour obtenir des images ayant soit des caractéristiques axiales différentes, soit des capacités de rejection de lumière parasite différentes ou optimisées, globalement ou localement
Selon un mode de réalisation un programme d'ordinateur configuré pour mettre en œuvre les modes de réalisation décrit précédemment.
Dans un autre mode de réalisation de cette invention, on utilise un procédé optique de mesure pour déterminer la distribution spatiale ou la localisation de sources réémettrices sur un échantillon, l'échantillon comportant au moins une source réémettrice ledit au moins une source réémettrice réémettant de la lumière en fonction de la lumière projetée sur l'échantillon, suivant une loi déterminée, par une première source lumineuse comprenant un premier laser, dont la longueur d'onde est accordée sur la longueur d'onde d'excitation de la source réémettrice et la source réémettrice pouvant être déplétée ou activée par l'action d'une ou plusieurs source(s) lumineuse(s), comprenant au moins un second laser, dont la longueur d'onde est accordée sur la longueur d'onde de déplétion ou d'activation de la dite source réémettrice, le procédé comportant les deux distributions lumineuses compactes se propageant suivant le même chemin optique pour l'ensemble des lasers,
la distribution lumineuse compacte du premier laser d'excitation étant de famille topologique régulière, idéalement une distribution gaussienne ou un spot d'Airy,
la distribution lumineuse compacte du laser de déplétion ou d'activation consistant en une superposition d'une distribution singulière, de type vortex, sur une première polarisation, linéaire ou circulaire, et d'une distribution dite de sphère noire ou « top-hat » sur la polarisation orthogonale à la première polarisation,
lesdites distributions lumineuses compactes étant créées par une cascade d'au moins deux cristaux de diffraction conique, ou un assemblage de cristaux uniaxes, optionnellement séparés par un élément de contrôle de polarisation chromatique ou non, dynamique ou statique, ,
la détection de la lumière réémise par ledit au moins une source réémettrice de l'échantillon
la génération, d'au moins une image, à partir de la lumière détectée ; et
la détection directe ou l'analyse algorithmique des images pour obtenir une information de distribution spatiale ou localisation dudit au moins une source réémettrice.
Dans une disposition particulière du mode de réalisation précèdent de cette invention, l'élément de contrôle de polarisation décrit est un élément optique consistant en un assemblage de une ou deux quart d'ondes achromatiques et une lame d'onde chromatique l'ensemble étant conçu de façon à ce que l'élément optique créée, entre les deux cristaux coniques ou entre deux cristaux uniaxes une différence de rotation de la polarisation entre le faisceau d'excitation et le faisceau de déplétion proche de 180 degrés et ne différant pas de plus de 30 degrés de cette valeur
Dans une disposition particulière du mode de réalisation précèdent de cette invention, l'élément de contrôle de polarisation est un élément optique dont le matériau possède une propriété d'activité optique et que l'épaisseur de l'élément optique est choisie de façon à ce que la dispersion naturelle de l'activité optique du matériau créée entre les deux cristaux coniques ou entre deux cristaux uniaxes pour les une différence de rotation de la polarisation entre le faisceau d'excitation et le faisceau de déplétion proche de 180 degrés et ne différant pas de plus de 30 degrés de cette valeur Dans une disposition particulière du mode de réalisation précèdent de cette invention, on n'utilise pas d'élément de contrôle de polarisation mais les deux cristaux coniques sont de matériau différent et que la dispersion naturelle de ces deux matériaux compense la diffraction conique approximativement à la longueur d'onde d'excitation et non à la longueur d'onde de déplétion.
Dans un autre mode de réalisation de cette invention, on utilise un dispositif optique pour déterminer la distribution spatiale ou la localisation de sources réémettrices sur un échantillon, l'échantillon comportant au moins une source réémettrice ledit au moins une source réémettrice réémettant de la lumière en fonction de la lumière projetée sur l'échantillon, suivant une loi déterminée, par une première source lumineuse comprenant un premier laser, dont la longueur d'onde est accordée sur la longueur d'onde d'excitation de la source réémettrice et la source réémettrice pouvant être déplétée ou activée par l'action d'une ou plusieurs source(s) lumineuse(s), comprenant au moins un second laser, dont la longueur d'onde est accordée sur la longueur d'onde de déplétion ou d'activation de la dite source réémettrice, le procédé comportant les deux distributions lumineuses compactes se propageant suivant le même chemin optique pour l'ensemble des lasers,
la distribution lumineuse compacte du premier laser d'excitation étant de famille topologique régulière, idéalement une distribution gaussienne ou un spot d'Airy,
la distribution lumineuse compacte du laser de déplétion ou d'activation consistant en une superposition d'une distribution singulière, de type vortex, sur une première polarisation, linéaire ou circulaire, et d'une distribution dite de sphère noire ou « top-hat » sur la polarisation orthogonale à la première polarisation,
lesdites distributions lumineuses compactes étant créées par une cascade d'au moins deux cristaux de diffraction conique, ou un assemblage de cristaux uniaxes, optionnel lement séparés par un élément de contrôle de polarisation chromatique ou non, dynamique ou statique, ,
la détection de la lumière réémise par ledit au moins une source réémettrice de l'échantillon
la génération, d'au moins une image, à partir de la lumière détectée ; et
la détection directe ou l'analyse algorithmique des images pour obtenir une information de distribution spatiale ou localisation dudit au moins une source réémettrice.
Dans une disposition particulière du mode de réalisation précèdent de cette invention, l'élément de contrôle de polarisation décrit est un élément optique consistant en un assemblage de une ou deux quart d'ondes achromatiques et une lame d'onde chromatique l'ensemble étant conçu de façon à ce que l'élément optique créée, entre les deux cristaux coniques ou entre deux cristaux uniaxes une différence de rotation de la polarisation entre le faisceau d'excitation et le faisceau de déplétion proche de 180 degrés et ne différant pas de plus de 30 degrés de cette valeur Dans une disposition particulière du mode de réalisation précèdent de cette invention, l'élément de contrôle de polarisation est un élément optique dont le matériau possède une propriété d'activité optique et que l'épaisseur de l'élément optique est choisie de façon à ce que la dispersion naturelle de l'activité optique du matériau créée entre les deux cristaux coniques ou entre deux cristaux uniaxes pour les une différence de rotation de la polarisation entre le faisceau d'excitation et le faisceau de déplétion proche de 180 degrés et ne différant pas de plus de 30 degrés de cette valeur
Dans une disposition particulière du mode de réalisation précèdent de cette invention, on n'utilise pas d'élément de contrôle de polarisation mais les deux cristaux coniques sont de matériau différent et que la dispersion naturelle de ces deux matériaux compense la diffraction conique approximativement à la longueur d'onde d'excitation et non à la longueur d'onde de déplétion.
Une autre implémentation de cette invention, décrit une méthode optique pour évaluer localement l'aberration sphérique dans chaque lieu de l'échantillon, ou chaque lieu de l'objet que l'on image, en utilisant la diffraction conique et ses effets de phase et polarisation. L'échantillon est illuminé avec une distribution lumineuse non uniforme, qui peut être, par exemple mais non de façon limitative, une sphère noire (ou top hat) de sorte que la distribution en 3D présente deux lobes de même intensité en dessous et au-dessus du plan focal. En présence d'aberration sphérique dans le système, ces deux lobes ne sont pas de même intensité. On peut alors utiliser cet effet pour prendre une image, en particulier une image confocale, en illuminant au-dessus et au-dessous du plan focal (en découplant l'illumination et l'imagerie). En analysant ensuite le rapport d'intensité des deux images, on peut e déduire la quantité d'aberration sphérique du système.
Une autre implémentation de cette invention, décrit un dispositif optique pour évaluer localement l'aberration sphérique dans chaque lieu de l'échantillon, ou chaque lieu de l'objet que l'on image, en utilisant la diffraction conique et ses effets de phase et polarisation. L'échantillon est illuminé avec une distribution lumineuse non uniforme, qui peut être, par exemple mais non de façon limitative, une sphère noire (ou top hat) de sorte que la distribution en 3D présente deux lobes de même intensité en dessous et au-dessus du plan focal. En présence d'aberration sphérique dans le système, ces deux lobes ne sont pas de même intensité. On peut alors utiliser cet effet pour prendre une image, en particulier une image confocale, en illuminant au-dessus et au-dessous du plan focal (en découplant l'illumination et l'imagerie). En analysant ensuite le rapport d'intensité des deux images, on peut e déduire la quantité d'aberration sphérique du système.
Une autre implémentation de cette invention, décrit une méthode optique pour évaluer localement l'aberration sphérique dans chaque lieu de l'échantillon, ou chaque lieu de l'objet que l'on image, en utilisant la diffraction conique et ses effets de phase et polarisation. La mise en forme d'un faisceau lumineux par diffraction conique à travers une cascade de cristaux permet d'obtenir une distribution d'intensité reliée directement à l'aberration sphérique. Cette distribution peut être obtenue, par exemple mais de façon non limitative, entre polariseurs linéaires croisés et deux cristaux biaxes dont les axes optiques sont alignés. Une lame demi-onde est insérée entre les deux cristaux. De par sa forme caractéristique, cette distribution sera appelée « trèfle à quatre feuilles » ou « four-leaf-clover » en anglais. En l'absence d'aberration sphérique, cette distribution se compose de quatre lobes parfaitement égaux et tous au même focus. L'aberration sphérique induite par un système optique rompt la symétrie de cette distribution à la fois dans le focus et la répartition d'intensité dans les quatre lobes. Une mesure fine de la valeur d'aberration sphérique est possible par un estimateur de décalage de focus des lobes et des ratios d'intensité à différents plans de focalisation.
Une autre implémentation de cette invention, décrit un dispositif optique pour évaluer localement l'aberration sphérique dans chaque lieu de l'échantillon, ou chaque lieu de l'objet que l'on image, en utilisant la diffraction conique et ses effets de phase et polarisation. La mise en forme d'un faisceau lumineux par diffraction conique à travers une cascade de cristaux permet d'obtenir une distribution d'intensité reliée directement à l'aberration sphérique. Cette distribution peut être obtenue, par exemple mais de façon non limitative, entre polariseurs linéaires croisés et deux cristaux biaxes dont les axes optiques sont alignés. Une lame demi-onde est insérée entre les deux cristaux. De par sa forme caractéristique, cette distribution sera appelée « trèfle à quatre feuilles » ou « four-leaf-clover » en anglais. En l'absence d'aberration sphérique, cette distribution se compose de quatre lobes parfaitement égaux et tous au même focus. L'aberration sphérique induite par un système optique rompt la symétrie de cette distribution à la fois dans le focus et la répartition d'intensité dans les quatre lobes. Une mesure fine de la valeur d'aberration sphérique est possible par un estimateur de décalage de focus des lobes et des ratios d'intensité à différents plans de focalisation.
Une autre implémentation de cette invention, décrit une méthode optique pour calibrer en temps réel d'un système de balayage de faisceau par suivi de point généré par une diode laser proche infrarouge. Une méthode optique est réalisée permettant de suivre en temps réel sur une caméra un point scanné par un système de balayage de faisceau (miroirs galvanométriques, miroir piézo-électrique bidirectionnel ou tout autre système). En utilisant une longueur d'onde dans le proche infrarouge, on s'affranchit des effets chromatiques des optiques ce qui rend ce système utilisable pour le calibrage de plusieurs longueurs d'onde projetées dans un microscope confocal. De plus en utilisant une diode laser dans le proche infrarouge on s'assure également qu'un faible passage du laser de calibrage dans le microscope n'aura qu'un effet très marginal, la longueur d'onde étant bien supérieure aux longueurs d'onde d'excitation usuelles de la fluorescence.
Une autre implémentation de cette invention, décrit un dispositif optique pour calibrer en temps réel d'un système de balayage de faisceau par suivi de point généré par une diode laser proche infrarouge. Une méthode optique est réalisée permettant de suivre en temps réel sur une caméra un point scanné par un système de balayage de faisceau (miroirs galvanométriques, miroir piézo-électrique bidirectionnel ou tout autre système). En utilisant une longueur d'onde dans le proche infrarouge, on s'affranchit des effets chromatiques des optiques ce qui rend ce système utilisable pour le calibrage de plusieurs longueurs d'onde projetées dans un microscope confocal. De plus en utilisant une diode laser dans le proche infrarouge on s'assure également qu'un faible passage du laser de calibrage dans le microscope n'aura qu'un effet très marginal, la longueur d'onde étant bien supérieure aux longueurs d'onde d'excitation usuelles de la fluorescence.
Une autre implémentation de cette invention, décrit une méthode optique, prisme de
Wollaston modifié, pour dupliquer un ensemble des distributions lumineuses sans modifier les relations entre elles, pouvant être utilisée dans le cadre des méthodes décrites dans cette invention ou dans le cadre des méthodes STED décrites dans cette invention ou à d'autres méthodes STED standard. En utilisant plusieurs prismes de Wollaston en cascade, on peut ainsi séparer un faisceau incident en un grand nombre de faisceaux émergents. On peut obtenir le même effet en modifiant le prisme de Wollaston, pour créer le prisme de Wollaston composé, en lui ajoutant des pièces de cristal uniaxe dont l'indice et l'orientation de la biréfringence sont choisis de façon adéquate. On peut ainsi construire un prisme d'un seul bloc de cristal uniaxe qui peut séparer un faisceau incident en 2n faisceaux émergents (par exemple huit ou seize) qui sont contenus dans un plan, et séparé par des angles égaux. Une fois focalisés sur l'échantillon, on obtient 2" points alignés et également séparés. Si le faisceau incident a traversé un module LatSRC, ces 2n points ne sont pas 2" tâches d'Airy, mais les distributions créées par le module et sont toutes identiques. L'avantage d'utiliser ce beamsplitter est de balayer l'échantillon plus rapidement puisqu'on a 2" points lumineux à la place d'un seul.
Une autre implémentation de cette invention, décrit un dispositif optique, prisme de Wollaston modifié, pour dupliquer un ensemble des distributions lumineuses sans modifier les relations entre elles, pouvant être utilisée dans le cadre des dispositifs décrits dans cette invention ou dans le cadre des dispositif STED décrits dans cette invention ou à d'autres dispositif STED standard. En utilisant plusieurs prismes de Wollaston en cascade, on peut ainsi séparer un faisceau incident en un grand nombre de faisceaux émergents. On peut obtenir le même effet en modifiant le prisme de Wollaston, pour créer le prisme de Wollaston composé, en lui ajoutant des pièces de cristal uniaxe dont l'indice et l'orientation de la biréfringence sont choisis de façon adéquate. On peut ainsi construire un prisme d'un seul bloc de cristal uniaxe qui peut séparer un faisceau incident en 2" faisceaux émergents (par exemple huit ou seize) qui sont contenus dans un plan, et séparé par des angles égaux. Une fois focalisés sur l'échantillon, on obtient 2n points alignés et également séparés. Si le faisceau incident a traversé un module LatSRC, ces 2" points ne sont pas 2" tâches d'Airy, mais les distributions créées par le module et sont toutes identiques. L'avantage d'utiliser ce beamsplitter est de balayer l'échantillon plus rapidement puisqu'on a 2" points lumineux à la place d'un seul.
Une autre implémentation de cette invention, décrit une méthode optique, et une procédure algorithmique utilisant une propriété du bruit de Poisson permettant de générer, à partir d'une réalisation d'une VAR de Poisson de paramètre I (la moyenne), deux réalisations indépendantes d'une VAR de Poisson de paramètre 1/2, grâce à un traitement a posteriori. Grâce à un procédé de génération de nombres aléatoires ou pseudo-aléatoires, on simule une loi binomiale L'analyse ou la reconstruction des deux mesures ainsi générées, appelée méthode Split Photon, fournit deux résultats indépendants au sens des probabilités, et les différences entre ces deux résultats illustrent la dépendance de l'algorithme de reconstruction vis-à-vis du bruit de mesure. En utilisant un critère local de comparaison de ces deux reconstructions, lorsque il y a une différence significative entre les deux images ou signaux reconstruits, il est possible d'appliquer, localement ou globalement, des paramètres différents dans l'algorithme de reconstruction appliqué aux mesures d'origine. Il est aussi possible d'utiliser un autre algorithme, comme un algorithme MAP avec contrainte de régularité global ou local, en utilisant la carte de similarité ou tout autre critère de comparaison afin d'optimiser le ou les paramètres de régularisation. Il est aussi possible de rendre compte de la carte de similarité ou du critère utilisé dans la méthode Split Photon, de manière graphique ou numérique, afin d'illustrer la dépendance locale ou globale de la reconstruction au bruit de mesure. Il est aussi possible de générer, plutôt qu'un couple de mesures, un n-uplet de mesures, en utilisant plutôt qu'une loi binomiale, une loi multinomiale de paramètres
Enfin, il est possible d'itérer la méthode Split Photon en générant plusieurs couples ou n-uplets de mesures, toujours par un traitement a posteriori des mesures, mais en modifiant la graine dans le générateur pseudo-aléatoire.
Une autre implémentation de cette invention, décrit un dispositif optique, et un dispositif algorithmique utilisant une propriété du bruit de Poisson permettant de générer, à partir d'une réalisation d'une VAR de Poisson de paramètre I (la moyenne), deux réalisations indépendantes d'une VAR de Poisson de paramètre 1/2, grâce à un traitement a posteriori. Grâce à un procédé de génération de nombres aléatoires ou pseudo-aléatoires, on simule une loi binomiale L'analyse ou la reconstruction des deux mesures ainsi générées, appelée méthode Split Photon, fournit deux résultats indépendants au sens des probabilités, et les différences entre ces deux résultats illustrent la dépendance de l'algorithme de reconstruction vis-à-vis du bruit de mesure. En utilisant un critère local de comparaison de ces deux reconstructions, lorsqu'il y a une différence significative entre les deux images ou signaux reconstruits, il est possible d'appliquer, localement ou globalement, des paramètres différents dans l'algorithme de reconstruction appliqué aux mesures d'origine. Il est aussi possible d'utiliser un autre algorithme, comme un algorithme MAP avec contrainte de régularité global ou local, en utilisant la carte de similarité ou tout autre critère de comparaison afin d'optimiser le ou les paramètres de régularisation. Il est aussi possible de rendre compte de la carte de similarité ou du critère utilisé dans la méthode Split Photon, de manière graphique ou numérique, afin d'illustrer la dépendance locale ou globale de la reconstruction au bruit de mesure. Il est aussi possible de générer, plutôt qu'un couple de mesures, un n-uplet de mesures, en utilisant plutôt qu'une loi binomiale, une loi multinomiale de paramètres Enfin, il est possible d'itérer la méthode Split Photon en générant plusieurs couples ou n-uplets de mesures, toujours par un traitement a posteriori des mesures, mais en modifiant la graine dans le générateur pseudo-aléatoire.
Une autre implémentation de cette invention, décrit une méthode optique, et une méthode algorithmique utilisant l'algorithme ICE qui remplace le calcul de l'espérance de la loi a posteriori effectué par LSE par l'itération du calcul explicite de la moyenne de la loi a posteriori d'un pixel conditionnellement à ses voisins.
Une autre implémentation de cette invention, décrit un dispositif optique, et un dispositif algorithmique utilisant l'algorithme ICE qui remplace le calcul de l'espérance de la loi a posteriori effectué par LSE par l'itération du calcul explicite de la moyenne de la loi a posteriori d'un pixel conditionnellement à ses voisins.
Une autre implémentation de cette invention, décrit une méthode optique, et une méthode algorithmique permettant de mesurer la proportion de signal qui appartient bien à la région d'intérêt (pinhole), pour chaque image Cette mesure, appelée Pinhole Ratio, consiste à comparer dans une région spatiale de l'objet la proportion de photons qui sont réémis et imagés dans la région d'intérêt de chaque image issue de cette région par rapport au nombre total de photons réémis par l'objet dans l'ensemble des images considérées. Ce ratio donne une information localement sur la nature de l'objet imagé. Dans le cas où le Pinhole Ratio dévie de la valeur prédite, il est possible de modifier les caractéristiques de l'algorithme de reconstruction.
Une autre implémentation de cette invention, décrit un dispositif optique, et un dispositif algorithmique permettant de mesurer la proportion de signal qui appartient bien à la région d'intérêt (pinhole), pour chaque image Cette mesure, appelée Pinhole Ratio, consiste à comparer dans une région spatiale de l'objet la proportion de photons qui sont réémis et imagés dans la région d'intérêt de chaque image issue de cette région par rapport au nombre total de photons réémis par l'objet dans l'ensemble des images considérées. Ce ratio donne une information localement sur la nature de l'objet imagé. Dans le cas où le Pinhole Ratio dévie de la valeur prédite, il est possible de modifier les caractéristiques de l'algorithme de reconstruction.
Une autre implémentation de cette invention, décrit une méthode optique, et une méthode algorithmique permettant de mesurer la position de l'émetteur en utilisant les particularités des distributions dites demi-lunes décalées, décrites dans cette invention, en utilisant une méthode algorithmique appropriée, par une mesure du rapport d'intensité entre les lobes. Cette localisation 3D peut être utilisée soit en projection, c'est-à-dire en projetant une, ou plusieurs distributions à demi-lune décalées sur l'objet et en utilisant un algorithme adapté, par exemple les algorithmes décrits dans cette invention, soit en émission en faisant passer la lumière émise par l'émetteur à travers un module optique créant cette distribution et en analysant la PSF de retour.
Une autre implémentation de cette invention, décrit un dispositif optique, et un dispositif algorithmique permettant de mesurer la position de l'émetteur en utilisant les particularités des distributions dites demi-lunes décalées, décrites dans cette invention, en utilisant un dispositif algorithmique approprié, par une mesure du rapport d'intensité entre les lobes. Cette localisation 3D peut être utilisée soit en projection, c'est-à-dire en projetant une, ou plusieurs distributions à demi-lune décalées sur l'objet et en utilisant un algorithme adapté, par exemple les algorithmes décrits dans cette invention, soit en émission en faisant passer la lumière émise par l'émetteur à travers un module optique créant cette distribution et en analysant la PSF de retour.
Une autre implémentation de cette invention, décrit une méthode optique, et une méthode algorithmique permettant de mesurer la position de l'émetteur en utilisant les particularités des distributions dites « dark hélix », décrites dans cette invention, en utilisant une méthode algorithmique appropriée, par une mesure de l'angle de l'axe reliant les deux zéros. Cette localisation 3D peut être utilisée soit en projection, c'est-à-dire en projetant une, ou plusieurs distributions à demi-lune décalées sur l'objet et en utilisant un algorithme adapté, par exemple les algorithmes décrits dans cette invention, soit en émission en faisant passer la lumière émise par l'émetteur à travers un module optique créant cette distribution et en analysant la PSF de retour.
Une autre implémentation de cette invention, décrit un dispositif optique, et un dispositif algorithmique permettant de mesurer la position de l'émetteur en utilisant les particularités des distributions dites « dark hélix », décrites dans cette invention, en utilisant un dispositif algorithmique approprié, par une mesure de l'angle de l'axe reliant les deux zéros. Cette localisation 3D peut être utilisée soit en projection, c'est-à-dire en projetant une, ou plusieurs distributions à demi-lune décalées sur l'objet et en utilisant un algorithme adapté, par exemple les algorithmes décrits dans cette invention, soit en émission en faisant passer la lumière émise par l'émetteur à travers un module optique créant cette distribution et en analysant la PSF de retour.
BREVE DESCRIPTION DES DESSINS
L'invention va maintenant être décrite en relation avec certains modes de réalisation en référence aux figures illustratives suivantes de sorte qu'elle puisse être mieux comprise.
Avec une référence spécifique aux figures, il est souligné que les indications figurantes sont présentées à titre d'exemple, et à des fins d'illustration de la discussion des modes de réalisation de l'invention et ne sont présentés que dans le but de fournir ce qui puisse être considéré comme la description la plus utile et facile à comprendre des principes et des aspects conceptuels de l'invention. À cet égard, aucune tentative n'est faite pour montrer des détails de structure de l'invention plus en détail que ce qui est nécessaire pour une compréhension fondamentale de l'invention, la description prise avec les dessins faisant apparaître à l'homme de l'art comment les différentes formes de l'invention peuvent être réalisées dans la pratique.
Dans les dessins:
Fig. 1 est une représentation simplifiée d'un microscope à fluorescence confocal de l'art antérieur, utilisé aussi comme support de l'invention;
Fig. 2 est une représentation picturale simplifiée d'un système de microscopie de
fluorescence,;
Fig. 3 est une illustration schématique simplifiée d'un module de diffraction conique, conformément à un mode de réalisation de la présente invention;
Fig. 4a à 4f sont des représentations picturales simplifiées des paradigmes de mesure et de confinement volumique selon des modes de réalisation de l'invention et de la microscopie confocale;
Fig. 5 est une représentation picturale simplifiée d'un mode de réalisation particulier de la plateforme de microscopie SRCDP ;
Fig. 6a est une illustration schématique simplifiée d'un module latéral de superrésolution, conformément à un mode de réalisation de la présente invention;
Fig. 6b est une illustration schématique simplifiée d'une autre réalisation d'un module latéral de superrésolution, conformément à un mode de réalisation de la présente invention;
Fig. 7a à 7c présente des tables de distributions lumineuses d'un module de diffraction conique en fonction de la polarisation des polariseurs d'entrée et de sortie pour plusieurs valeurs du paramètre de diffraction conique, po. Ces distributions lumineuses ont été calculées par simulation des équations développées par Berry, [2] ; la Figure 7d complète ces tables de distribution en présentant la variation des distributions dites demi-lunes décalées en fonction de la position axiale (axe z). La Figure 7e présente une nouvelle distribution, « dark hélix » comprenant deux zéros, dont l'axe reliant ces deux zéros tourne en fonction de la propagation.
Fig.8 est une illustration schématique simplifiée d'un des modes de réalisation du dark tracking ; Fig. 9 est une illustration schématique simplifiée d'une méthode d'algorithme de superrésolution de données de fluorophores, conformément à un mode de réalisation de la présente invention.
Fig. 10 est une illustration schématique simplifiée du calcul des descripteurs ;
Fig. 1 1 est une illustration schématique simplifiée du module de contrôle de la plateforme SRCDP.
Fig. 12 présente les distributions lumineuses obtenues distribution « Four-leaf-clover » à différentes valeurs d'aberration sphérique.
Dans toutes les figures, des chiffres de référence similaires identifient des pièces similaires.
DEFINITIONS ET COMPLEMENTS TECHNIQUES
Nous utiliserons le terme biologique pour décrire toute entité de la Science du vivant, quelle que soit sa provenance, humaine, animale ou végétale et la finalité de son observation, recherche, diagnostique ou thérapeutique. Ce terme inclut les utilisations médicales de la technique décrite. La Microscopie est utilisée dans le domaine de la Biologie, par exemple, pour observer, étudier et mesurer des entités (objets) biologiques et leur dynamique.
Nous utiliserons, par extension, le terme de Vision artificielle pour décrire l'ensemble des applications de mesure, métrologie ou observation d'objets ou éléments produits ou construits ou réalisés par un être humain ou une machine, par exemple, pour observer, étudier et mesurer des Semi-conducteurs ou pour caractériser les matériaux.
Les définitions usuelles sont utilisées dans la description pour: phase et polarisation, polarimétrie, vecteurs et matrices de Jones, paramètres de Stokes et techniques de mesure des paramètres de Jones et de Stokes.
Les définitions usuelles sont utilisées pour: limite de diffraction optique, critère de Rayleigh, disque d'Airy et ses rayon et diamètre. Nous utilisons dans le contexte de l'invention les termes de superrésolution, superrésolu, d'imagerie de superrésolution et de microscopie de superrésolution pour décrire l'acquisition de données optiques, en imagerie, en microscopie ou en Vision artificielle, à une résolution supérieure à la limite de diffraction optique. Les définitions usuelles sont utilisées pour la fluorescence et pour les fluorophores.
Nous utiliserons alternativement les termes longitudinal et axial pour décrire la dépendance de la lumière le long de l'axe de propagation, auquel nous nous référons comme l'axe z ou axe longitudinal. Nous utiliserons le terme latéral pour décrire la dépendance de la lumière dans les axes orthogonaux à l'axe optique du système, auquel nous nous référons comme les axes x et y.
Les définitions usuelles sont utilisées dans la description pour le mode TEMoo d'une fibre et les termes anglais, « Photonic Crystal Fiber » - PCF -, « few modes fiber » - FMF , vortex Fiber et « dual core Photonic Crystal Fiber » pour des fibres spécifiques.
Nous nous référerons à un dispositif permettant de coupler plusieurs lasers à différentes longueurs d'onde ou à une même longueur d'onde, avec la même polarisation ou avec différentes polarisations, dans une ou plusieurs fibres optiques, en utilisant le terme de banc laser.
La définition des superoscillations est celle de Yakir Aaronov et de Sir Michael Berry. Une superoscillation est un phénomène dans lequel un signal qui est globalement limité en bande peut contenir des segments locaux qui oscillent plus rapidement que ses composantes de Fourier les plus rapides. [26]
Le centre ou centroïde d'une distribution de lumière est le centre de gravité de l'intensité. Le diamètre d'une distribution de lumière est le diamètre du premier zéro d'intensité, pour des ondes régulières et singulières, sans prendre en compte le zéro central de l'onde singulière. Deux distributions de lumière sont co-localisées si leurs centres coïncident ou sont séparés par une valeur spatiale faible par rapport à la dimension de la distribution de lumière.
Dans cette demande de brevet, nous utiliserons la longueur d'onde d'émission, comme métrique de base du système.
Dans cette demande de brevet, les définitions usuelles sont utilisées pour les composants optiques suivants : lentille dont la définition est élargie, pour inclure l'ensemble des moyens optiques qui transmettent, réfractent ou réfléchissent la lumière, optique auxiliaire - sous-module optique visant à interfacer et à ajuster soit les paramètres géométriques soit les paramètres de phase et/ou de polarisation entre deux autres sous-modules ou modules optiques -, polariseur, analyseur, lame de retard, séparateur de faisceau « beamsplitter » en anglais, polarisant et non- polarisant, combineur de faisceau « beam combiner » en anglais, polarisant et non-polarisant.
Dans cette demande de brevet, les définitions usuelles sont utilisées pour les polariseurs azimutal et radial. Nous étendrons, implicitement ou explicitement, certains développements décrits ultérieurement pour les polariseurs azimutal et radial, à l'ensemble des éléments polarisants variables dans l'espace.
Dans cette demande de brevet, les définitions usuelles, [3] et [38], sont utilisées pour les différentes techniques de superrésolution; ces techniques peuvent être regroupées en familles:
• REversible Saturable OpticaL Fluorescence Transitions(RESOLFT), regroupant les techniques : Stimulated Emission Depletion microscopy (STED), Ground State Depletion (GSD), Saturated Structured Illumination Microscopy (SSIM) et SPEM (Saturated Pattern Excitation Microscopy), Localisation Microscopy, (microscopie de localisation, en anglais) regroupant les techniques Photo-Activated Localization Microscopy (PALM), FPALM (3D Localization in Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy), Stochastic Optical Reconstruction Microscopy (STORM), dSTORM (direct STORM), SPDM (Spectral Précision Distance Microscopy),
« stochastic blinking », Ground State Depletion (GSD), et techniques similaires (quel que soit l'acronyme utilisé)
• Structured Image Microscopy (SIM)
• FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching),
• TIRF (Total Internai Reflection Fluorescence Microscopy).
Dans cette demande de brevet, les définitions usuelles sont utilisées pour différentes techniques de Microscopie, de résolution standard ou de superrésolution, fluorescentes ou non, telles que les termes anglais « Computational Microscopy », « Corrélative Microscopy », « Cross- platform-microscopy », FCS - « Fluorescence Corrélation Spectroscopy », FCCS - « Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy », ou PCH - Photon Counting Histogram, RICS « Raster Imaging Corrélation Spectroscopy » ou FRAP - « Fluorescence Recovery After Photobleaching analysis ».
Dans cette demande de brevet, les définitions usuelles sont utilisées pour la transformée de Hough, pour les algorithmes MAP - « Maximum A Posteriori estimation », LSE « Least Squares Estimation », ICE « Iterated Conditional Expectation ». Nous nous référons à l'algorithme E-LSE, « emitter-Least Square Error » un algorithme nouveau décrit dans cette demande de brevet.
Nous nous référons à un polariseur partiel pour décrire un élément ou un module dont l'absorption est différente pour les deux polarisations linéaires - dichroïsme linéaire - ou pour les deux polarisations circulaires - dichroïsme circulaire.
Nous nous référons à des éléments dynamiques de polarisation ou de phase, pour décrire les moyens optiques dont les propriétés de polarisation ou de phase varient en fonction du temps de façon contrôlée, de façon discrète ou continue.
Ces éléments dynamiques de polarisation ou de phase comprennent, mais ne sont pas limités à: lames d'onde tournante sur leur axe, valves de lumière basées sur des technologies à cristaux liquides, dispositifs électro-optiques, connus aussi comme cellules de Pockels, cellules de Kerr, par exemple en utilisant des composants de matériau PLZT, dispositifs électro-optiques résonnants, dispositifs magnéto-optiques, connus également en tant que cellules de Faraday, dispositifs acousto- ou élasto- optiques ou toute combinaison de ces moyens.
Nous nous référons à des éléments dispersifs de polarisation ou de phase pour décrire des éléments dont l'état de polarisation dépend de la longueur d'onde. Le plus simple des sous- modules dispersifs de polarisation est la lame d'onde multimode ou épaisse,
Nous nous referons a Γ « algorithme du centroïde » pour décrire la procédure usuelle de mesure du centroïde et éventuellement de la largeur (FWHM - acronyme en anglais pour « Full Width Half Maximum ») d'une distribution lumineuse.
Dans ce document, les définitions usuelles sont utilisées pour les composants
optoélectroniques suivants : détecteur photoélectrique, CCD, EMCCD, CMOS, SPAD Single Photon Avalanche Diode et matrice de SPAD.
Nous utiliserons les termes:
o image optique, pour la distribution spatiale d'intensité lumineuse,
o image électronique, pour décrire la distribution spatiale de charges pour un CCD, de courant pour un CMOS ou d'événements pour un SPAD, créées par l'image optique, à un instant donné, dans un plan de détection,
o image numérique, pour décrire une matrice de nombres créée par la numérisation de l'image électronique. Pour simplifier la lecture et la compréhension du texte nous utiliserons aussi le terme d'image pour la sortie d'un détecteur à pixel unique tel qu'un PMT ou SPAD, en la considérant comme une image consistant en un unique pixel.
Lorsqu'aucune ambiguïté n'existe, ou que la distinction entre les trois types d'images n'est pas nécessaire, nous utiliserons le terme simplifié générique d'image.
Pour les images, nous utilisons la terminologie utilisée pour les détecteurs matriciels, tels que les CCD, les EMCCD et les CMOS. Pour les SPAD et les matrices de SPAD, le résultat d'une mesure est une liste ordonnée dans le temps, d'impacts de photons détaillant, pour chaque photon, le temps d'impact et la position de l'impact. Pour simplifier la présentation de ce document, nous inclurons ce cas dans notre définition des images.
Les images détaillées dans ce document, dans de nombreux cas, peuvent être qualifiées de microimages, des images de taille sensiblement égale à un petit nombre de diamètres du disque d'Airy, typiquement inférieur à 5 diamètres, et/ou à faible nombre de pixels, typiquement 4*4 à 32*32.
Dans une image numérique Aj, les indices m et n représentent les indices des pixels ; l'origine des pixels sera choisie comme la projection du centre du volume d'analyse défini dans un paragraphe ultérieur.
Polarimétrie et vecteurs de Stokes
La polarimétrie se réfère à la mesure de l'état de polarisation de la lumière incidente. L'état de polarisation de la lumière incidente peut être décrit par les paramètres de Stokes, un ensemble de valeurs, introduit par George Gabriel Stokes en 1852, et utilisé en Optique.
Copropagation de deux faisceaux optiques
De nombreux systèmes et dispositifs optiques utilisent deux faisceaux - ou plus - ayant des propriétés différentes. Les faisceaux peuvent interagir entre eux ou non, être projetés
séquentiellement ou simultanément. Dans la majorité de ces systèmes et dispositifs, les deux chemins optiques sont séparés physiquement l'un de l'autre. Cette séparation physique créée, au niveau de l'ingénierie du système un ensemble de contraintes, qui bien que résolvables, alourdissent de façon importante la complexité du système et son coût. Nous nous référons à des systèmes à chemin commun « common path » en anglais, pour référencer un ensemble de dispositifs dans lesquels les deux faisceaux différenciés se propagent suivant le même chemin physique, à des variations mineures près.
Dans cette invention, nous référencerons, par extension, des systèmes à quasi chemin commun, pour référencer un ensemble de dispositifs dans lesquels les deux faisceaux différenciés se propagent suivant le même chemin physique, mais se séparent et se recombinent dans un module optique, le chemin optique dans l'élément optique étant négligeable par rapport au chemin optique total. Cette définition permet d'introduire le cas d'un module optique, contenant un séparateur de polarisation suivi à une distance très faible par un élément combinant les deux polarisations, ou tout élément similaire. L'introduction d'un tel module ne modifie pas de façon significative la fonctionnalité et les avantages d'un système à chemin commun. Dans la suite de cette invention, pour simplifier la lecture, lorsque nous nous référerons à un système à chemin commun, nous inclurons le cas d'un système à quasi chemin commun.
Champ électrique en coordonnées polaires et modes angulaires
E(p, 0) = A{p, Θ) x exp[i φ{ρ, 0)]u( p, 0) (EQ. 1)
Il est usuel en Optique de décomposer les composantes du champ, soit son amplitude, sa phase et sa polarisation, en modes orthogonaux, cartésiens ou polaires.
De nombreuses décompositions en modes orthogonaux polaires, tels que les modes Gaussiens, Hermite-Gaussiens, HGG et « Elégant » et Laguerre-Gaussiens sont connus de l'Homme de l'Art.
Nous utiliserons principalement dans ce document, la décomposition de l'amplitude du champ Ondes singulières
Ce thème de recherche en Optique, initié par l'article majeur de J.F Nye et M. Berry, en 1974, [4], est maintenant connu comme l'« optique singulière ». Des exemples d'ondes régulières et singulières sont présentés dans la suite.
Nous utilisons le terme anglais beam shaping pour décrire la transformation d'une onde de forme et de topologie donnée en une onde d'une autre forme ou topologie, et en particulier la transformation d'une onde régulière en singulière et vice versa.
Topologie et distributions lumineuses compactes
Une distribution lumineuse, ponctuelle, sera réputée compacte si elle remplit une des conditions de compacité définies ci-dessous, par deux conditions alternatives et non exclusives :
• soit, plus de 75% de l'énergie est contenue dans un cercle de rayon inférieur à 1.75 fois le rayon d'Airy,
• soit un domaine lumineux, contenant plus de 65% de l'énergie est délimité par une ligne d'intensité nulle comprise dans un cercle de rayon inférieur à deux fois le rayon d'Airy,
Nous distinguons différentes familles de distributions lumineuses ponctuelles, de topologies différentes :
Les distributions régulières, dans leur définition usuelle en Optique,
Les distributions ou ondes singulières, dénommées aussi vortices optiques, de charge topologique (ordre azimutal) l, dans lesquelles la phase varie de 0 à 2π ί, autour de la direction de propagation, £ étant un entier.
Les distributions d'amplitude à variation azimutale d'ordre i, dénommées aussi distribution de Laguerre-Gauss, Les distributions de polarisation et optionnel lement de phase à variation azimutale d'ordre Cdénommées aussi modes de Laguerre-Gauss polarisés radialement.
Deux distributions lumineuses compactes, seront réputées de familles topologiques différentes si elles remplissent au moins une, et n'importe laquelle, des conditions suivantes :
L'une est régulière et l'autre est singulière,
L'une est ponctuelle et l'autre est annulaire,
Les ordres azimutaux l de l'amplitude des deux distributions lumineuses différent,
Les ordres azimutaux i de la polarisation ou de la phase des deux distributions lumineuses différent.
Alternativement, deux distributions lumineuses projetées sur un volume donné seront réputées de topologies différentes si dans une partie conséquente de la surface illuminée conjointement, les gradients sont de direction inversées.
Nanoémetteurs lumineux
Un nanoémetteur lumineux est un petit émetteur secondaire, attaché à un objet; il est de taille sensiblement inférieure à une fraction de longueur d'onde, typiquement mais non limité à une taille inférieure à un cinquième de la longueur d'onde ; un nanoémetteur lumineux absorbe l'énergie incidente et réémet de la lumière à la même longueur d'onde que la lumière incidente ou à des longueurs d'onde différentes ; la lumière émise par le nanoémetteur peut être cohérente, partiellement cohérente ou incohérente avec la lumière absorbée. Les principaux exemples de nanoémetteurs lumineux sont les fluorophores et les nanoparticules, mais ils incluent aussi un grand nombre d'autres éléments.
La définition, dans le contexte de l'invention, des nanoémetteurs lumineux est, déterminée par les deux conditions suivantes:
création d'un émetteur lumineux secondaire ponctuel,
et
positionnement prédéterminé de cet émetteur relativement à une entité artificielle, biologique ou organique.
Les mécanismes physiques qui peuvent créer un nanoémetteur sont nombreux ; ils incluent mais ne sont pas limités à l'absorption, la diffusion ou la réflexion, la fluorescence, «émission- déplétion», [5], par exemple en utilisant les techniques RESOLFT, les phénomènes de photo activation et de photo déplétion, la fluorescence à deux ou plusieurs photons, la diffusion élastique ou non, la diffusion Raman, ou à d'autres mécanismes physiques connues de l'Homme de l'Art. Nous utiliserons le terme émission de lumière pour décrire l'émission d'ondes électromagnétiques par le nanoémetteur lumineux, que la lumière soit cohérente, incohérente ou partiellement cohérente. Nous étendrons notre définition des nanoémetteurs, en y incluant les particules diffusantes, absorbantes et réfléchissantes, attachées à une entité biologique ou organique ; l'action d'une particule diffusante, réfléchissante ou absorbante sur le champ électromagnétique peut en effet être décrite comme la création avec une phase inverse, suivant le principe de Babinet, pour une particule absorbante d'un champ secondaire auxiliaire, émergeant de la particule, superposé au champ électromagnétique incident.
Nous nous référerons dans cette demande de brevet aux descripteurs d'un nanoémetteur pour dénoter l'ensemble d'information décrivant un nanoémetteur en tant que source ponctuelle, à un instant déterminé. Etant donné que le nanoémetteur est considéré comme une source ponctuelle, l'ensemble de l'information le représentant contient un nombre limité de paramètres, soit : sa position dans l'espace, son intensité, les caractéristiques spectrales, d'intensité, de cohérence, de phase et de polarisation de la lumière émise par le fluorophore, en fonction de la lumière incidente.
Nous nous référerons dans cette demande de brevet aux descripteurs d'un objet structuré. Par exemple, pour une ligne uniforme, l'ensemble de l'information le représentant contient un nombre limité de paramètres, soit : son orientation dans l'espace, son intensité, les caractéristiques spectrales, d'intensité, de cohérence, de phase et de polarisation de la lumière émise par l'objet, en fonction de la lumière incidente.
Pour une distribution continue, l'objet est représenté, comme habituel en traitement d'image, par une matrice d'intensités.
Toutefois, dans la majorité des cas, et dans la description de l'invention, nous nous référons, sous la désignation de descripteurs, à un sous-ensemble des descripteurs d'un nanoémetteur ou d'un objet géométrique simple, comprenant sa position géométrique, son intensité, et le type du fluorophore, lorsque plusieurs populations de nanoémetteurs lumineux, différenciées par exemple par leur spectre d'émission, sont présentes dans un même échantillon. Cette simplification utilisée dans la description n'altère pas le domaine de l'invention qui inclura dans son champ
d'application l'intégralité des descripteurs des nanoémetteurs lumineux.
Pour simplifier la compréhension du contexte de l'invention, la suite de la description référence seulement le cas le plus simple, celui dans lequel le nanoémetteur est un fluorophore et l'interaction physique est la fluorescence à un photon. Pourtant, cette description doit être comprise comme une illustration simplifiée d'une description générale des méthodes et concepts applicables à l'ensemble des nanoémetteurs lumineux cités préalablement ou connus de l'Homme de l'Art, quel que soit le phénomène physique sous-jacent.
Il est marquant que le nanoémetteur échantillonne le champ ou l'intensité incidente à une position tridimensionnelle précise, sans influence de l'ensemble de la distribution spatiale de l'intensité incidente. Nous référencerons cette propriété remarquable dans cette demande de brevet comme la capacité d'échantillonnage du nanoémetteur lumineux. Toutefois, le mode de réalisation de l'invention décrit permet aussi de mesurer des objets structurés et des distributions continues ne possédant pas la capacité d'échantillonnage du nanoémetteur lumineux.
On se réfère de nouveau à la Figure. 1 ; qui représente un ensemble de nanoémetteurs ou d'objets structurés, positionnés sur un objet biologique donné, 15 et 16 d'une part et 17 et 18 d'autre part. Alternativement, la lumière émise peut consister en une distribution continue, non représentée sur la Figure 1, ou en toute combinaison de nanoémetteurs, d'objets structurés ou de distribution continues. L'ensemble de nanoémetteurs, d'objets structurés ou de distribution continues est référencé comme un ensemble «d'objets biologiques lumineux»; ils représentent une carte de l'objet biologique, dans le sens défini par Alfred Korzybski en sémantique générale. Il est toutefois de pratique courante pour simplifier la description, de référencer l'objet biologique lumineux comme l'objet biologique lui-même, lorsqu'aucune ambiguïté ne peut apparaître. L'objet biologique lumineux contient de nombreuses informations pertinentes liées à l'objet biologique, principalement l'information spatiotemporelle, la position de l'objet et son orientation en fonction du temps, et l'information morphologique, par exemple dans le cas de la division d'une cellule en deux.
Le système de mesure selon au moins un mode de réalisation de l'invention permettra de calculer la carte mesurée, et effectuer une évaluation des descripteurs de toute combinaison de nanoémetteurs, d'objets structurés ou une évaluation de la distribution spatiale de distributions continues. Cette carte mesurée diffère de la carte originale, en raison du bruit, des conditions de mesure, des limites du système ou de l'incertitude de mesure. Cette information de la carte mesurée peut être élaborée ultérieurement en différents niveaux d'abstraction. Ce premier niveau d'abstraction, qui décrit les résultats directs de la mesure, ne contient, à priori, aucune information biologique mais les résultats d'une mesure physique décrite par des nanoémetteurs, par des objets structurés ou par des distributions continues, qui pourrait d'ailleurs représenter n'importe quelle entité marquée.
Le second niveau, le niveau d'abstraction géométrique structure les nanoémetteurs, d'objets structurés ou de distributions continues sous forme d'objets géométriques. Il consiste en une description d'objets lumineux et de leurs caractéristiques dynamiques, telles que leur position ou orientation, ou leur morphologie. A ce niveau, l'information est encore une information physique et géométrique décrivant un ensemble d'objets. L'information géométrique utilise la carte mesurée et une information auxiliaire, potentiellement extérieure au système, sur la relation entre les points lumineux et des objets.
Le niveau d'abstraction biologique permet une certaine appréhension de la réalité biologique grâce à une relation constitutive entre les objets mesurés et des entités biologiques
correspondantes. Il contient un ensemble d'informations sur l'objet biologique, principalement la position et sa dynamique, sa forme et sa morphologie. L'information biologique utilise la carte mesurée et l'information géométrique, et une information auxiliaire, potentiellement extérieure au système, sur la relation des points lumineux et des objets aux entités biologiques. Un certain nombre de conclusions sur la fonctionnalité biologique de l'échantillon peuvent être obtenues à ce niveau.
Le niveau d'abstraction fonctionnel permet une appréhension de la réalité biologique. Il consiste en une information fonctionnelle, décorrélée des informations géométriques, et répondant à des interrogations en termes et jargon biologique, tel que : « le virus a-t-il pénétré la cellule ? ».
Un niveau additionnel d'information peut être défini incluant le processus de contrôle et d'instrumentation ; en effet, un processus de contrôle et d'instrumentation plus évolué peut être défini, permettant de remonter à une information biologique plus structurée, à travers une automatisation du processus d'acquisition de données. Un exemple de tels processus est décrit par Steven Finkbeiner, sous la dénomination de « Robotic Microscopy Systems ».
Cette description des niveaux d'abstraction, définis dans cette demande, a été rédigée, par simplicité, pour la Biologie. Elle est applicable, mutatis mutandis, à tous les domaines de la Vision, biologique et médicale, artificielle et industrielle.
Diffraction conique
La diffraction ou réfraction conique, est un phénomène optique prédit par Hamilton, [6], en 1832, et confirmé expérimentalement deux mois après par Lloyd, [7]. La diffraction conique décrit la propagation d'un faisceau de lumière dans la direction de l'axe optique d'un cristal biaxe.
En effet, dans un cristal biaxe, l'axe optique est positionné dans le plan créé par les axes cristallographiques x et z; l'angle par rapport à l'axe z est θο, dépendant des trois indices de réfraction suivant la loi, tan #0 =
Figure imgf000031_0001
Hamilton a prédit que la lumière émerge sous la forme d'un cône creux de rayons. La réfraction conique est une étape importante de l'histoire des sciences et a joué un rôle dans la démonstration de la théorie des ondes électromagnétiques.
Un regain d'intérêt pour la diffraction conique eu lieu dans les dernières années du XXe siècle; elle a abouti à une théorie complète par Berry et al.[2], validée expérimentalement en 2009, [8]. Nous suivons ici la théorie, la terminologie et les définitions de Berry, y compris le changement de dénomination de l'effet physique, à partir de ce point, utilisant le terme plus rigoureux de diffraction conique.
Toutefois, il est important de noter, que le terme « diffraction conique » est aussi utilisé pour deux autres techniques n'ayant aucune relation avec la technique que nous décrivons :
• la diffraction en incidence oblique est aussi appelée diffraction conique
• Le terme anglais, « conical diffraction mounting » référence un montage de réseau de diffraction dans lequel le réseau est monté sur une surface courbe. La diffraction conique a suscité un intérêt considérable au niveau théorique et expérimental, mais, « aucune application pratique ne semble avoir été trouvée », [9].
Historiquement, la diffraction conique a été observée dans les cristaux biaxes. Nous nous référons à un cristal conique pour décrire un cristal biaxe inorganique ou organique, présentant le phénomène de diffraction conique. Quelques exemples non limitatifs de cristaux biaxes comprennent, l'Aragonite, KTP, KTA, KBiW, LBO, KNb03, MDT, YCOB, BIBO, DAST, POM, NPP, LAP, LiInS2 et LiInSe2.
D'autres effets existent, créant soit une diffraction conique intrinsèquement plus faible soit en créant une diffraction conique plus faible le long d'un trajet optique plus court. Toutefois, ces effets peuvent être utilisés dans le cadre des dispositifs décrits. Ces effets comprennent les polymères, les cristaux liquides et les effets de biréfringence induite par voie externe. Les polymères comprennent mais ne sont pas limités à des feuilles de polymère étirées et à la polymérisation en cascade, [10]; les cristaux liquides comprennent mais ne sont pas limités à la phase nématique biaxe thermotrope, [1 1]; les effets externes de biréfringence induite
comprennent, mais ne sont pas limités à l'application d'un champ électrique créant un effet électro-optique, sur un cristal cubique non-centrosymétrique, et le modulateur photo-élastique.
La phase dans le vortex créé par diffraction conique est une phase géométrique et est donc intrinsèquement achromatique.
Les effets chromatiques additionnels sont la dispersion de l'axe optique et la dépendance des différents paramètres présents dans les équations de la diffraction conique en fonction de la longueur d'onde.
La dispersion chromatique de l'axe optique crée un angle de l'axe optique du cristal, dépendant de la longueur d'onde, par rapport à l'axe optique du système. Elle est due, dans la majorité des cas, à la dispersion des indices de réfraction.
Les indices de réfraction dépendent de la longueur d'onde, suivant les équations de Sellmeier. L'angle de l'axe optique varie donc en fonction de la longueur d'onde, il crée un angle
d'inclinaison chromatique de l'axe optique dans le plan créé par les axes x et z cristallographiques.
Il dépend fortement du type de cristal. Dans un cristal de MDT, le cristal le moins dispersif dans le visible, la direction de l'axe optique varie de moins de 0,1 degrés entre 540 nm et 700 nm. Dans un cristal de KTP, le cristal plus achromatique dans l'IR de télécommunication, l'angle varie de 0,05 degrés, entre 1,350 nm et 2,100 nm, et moins de 0,02 degrés sur la fenêtre de
télécommunication - 1450 nm à 1650 nm. D'autre part, l'angle θο peut varier fortement en fonction de la longueur d'onde dans certains cristaux organiques comme le DAST.
La compensation de la dispersion chromatique de l'axe optique peut être effectuée en utilisant l'optique géométrique. La dispersion chromatique de la direction de l'axe optique peut être compensée en utilisant la dispersion naturelle de verre ou d'autres matériaux optiques, ou en utilisant des réseaux ou de prismes. La procédure d'achromatisation ne diffère pas, dans ce cas, de la procédure standard de correction de toute aberration chromatique en optique géométrique. Cette procédure peut être conçue et optimisée en utilisant l'un des logiciels optiques commerciaux disponibles en définissant des fonctions cibles adéquates.
Un concept différent d'achromatisation, est basé sur l'utilisation de deux matériaux différents, ayant des effets de diffraction coniques inverses, à haute et basse dispersions chromatiques.
La dépendance des différents paramètres présents dans les équations de la diffraction conique en fonction de la longueur d'onde, modifie les paramètres d'efficacité des effets de diffraction conique.
Pour des cristaux coniques linéaires, définis ultérieurement, la fonction de transfert fondamentale est identique à l'unité et ainsi trivialement indépendante de la longueur d'onde. Par contre, la fonction de transfert du vortex dépend de la longueur d'onde et peut être représentée par un facteur chromatique égal à τ (λ).
Pour des cristaux coniques sinusoïdaux, définis ultérieurement, le comportement est différent de celui de cristaux linéaires coniques: l'onde fondamentale dépend de la longueur d'onde et l'onde vortex est presque indépendante de celle-ci. En effet, les simulations montrent que la forme de l'onde vortex n'est que légèrement modifiée par une variation du paramètre, θο de 0,5 à 0,75. Par contre, la forme de l'onde fondamentale dépend de la longueur d'onde et cet effet doit être pris en compte dans la conception de systèmes utilisant les deux ondes, fondamentale et vortex.
On se réfère maintenant à la figure 3, qui est une illustration schématique simplifiée d'une configuration d'un module de diffraction conique, 300, conformément à un mode de réalisation de la présente invention.
La lumière incidente, 30, est supposée être collimatée, même si d'autres conditions peuvent être adaptées en utilisant des moyens optiques simples.
Le montage lui-même comprend une première lentille, 31 , un cristal conique, 32 et une lentille optionnelle 33. Les deux premières lentilles, 31 et 33, sont configurées de préférence sous forme d'un télescope Kepler 1 : 1. L'ouverture numérique de la première lentille, 31 , dans l'espace image, représentée ci-dessous par Uo, détermine les paramètres de l'effet conique à travers le rayon conique, défini ci-dessous. Un plan d'imagerie conique, 35, est placé au plan focal de la première lentille 31 ; un polariseur, ou un polariseur partiel, 29, décrit ci-dessus, peut également être ajouté. Toutefois, dans certains systèmes optiques ou la lumière incidente est déjà polarisée, cet élément n'est pas nécessaire. Une lentille de focalisation, 36, détermine la taille finale de la tache lumineuse. Elle peut être un objectif de microscope externe, ou peut être fusionnée avec la seconde lentille 33, telle qu'implémentée dans un autre mode de réalisation de cette invention. La répartition de la lumière projetée sur l'échantillon est, en première approximation, en négligeant les effets vectoriels, une image réduite de la distribution de la lumière dans le plan image.
L'influence des effets vectoriels sera discutée ci-dessous. Le rapport d'échelle ou le grossissement est déterminé par l'objectif de microscope. Soit la variable spatiale, R, au plan d'imagerie conique, et le vecteur d'onde, U, représentées en coordonnées cylindriques par R, 9R et U, θυ. Soit λ, la longueur d'onde de la lumière.
Le comportement du champ électrique émergeant du cristal conique 32 est entièrement caractérisé par un seul paramètre, le rayon conique, R0; le rayon conique dépend du matériau et l'épaisseur du cristal.
Nous introduisons des paramètres normalisés permettant à la description ci-dessous de la répartition de la lumière, d'être valide à la fois au plan d'imagerie conique et au foyer de l'objectif du microscope, dans les limites de la théorie scalaire de diffraction. Un exemple d'introduction des paramètres normalisés est décrit dans la référence [2]
La position radiale normalisée, p, le vecteur d'onde normalisée, u, représentés en coordonnées cylindriques par p, 9R et u, θυ, et le rayon normalisé conique, po, sont donnés par:
p = 25 i/0, u = ^ ; Po = 2 ½ i/0 (EQ. 2)
Uo étant l'ouverture numérique du système.
Différents régimes existent pour l'ensemble des effets de diffraction optique volumique à faible interaction. Les effets de diffraction volumique à faible interaction ont les propriétés suivantes :
• une modification de la lumière incidente est créée par une perturbation des équations de Maxwell,
• l'échelle de l'interaction très supérieure à la longueur d'onde, typiquement plus de 10
Le fait que ces régimes différents créent des effets optiques totalement différents, a été étudié principalement pour les interactions acousto-optiques, mais est présent dans l'ensemble des effets optiques, incluant, la diffraction conique. Nous utiliserons une terminologie adaptée des travaux de Raman sur l'acousto-optique et différencierons les cas suivants :
po« 1 , régime de Raman Nath linéaire, référencé antérieurement, [37], « cristal conique mince linéaire », dans lequel une approximation surfacique simple de l'effet peut être utilisée, po< 1 et >0.5, régime de Raman Nath sinusoïdal, référencé antérieurement, [37], « cristal conique mince sinusoïdal», dans lequel une approximation surfacique de l'effet peut être utilisée, po< 3 et >1, régime intermédiaire, référencé antérieurement, [37], « cristal conique moyen», dans lequel des effets complexes, couplant les effets des régimes Raman Nath et le régime de Hamilton-Lloyd décrit ultérieurement,
po> 3, régime que nous appellerons régime de Hamilton-Lloyd référencé antérieurement, [37], sous la dénomination de « cristal épais», similaire au régime de Bragg en acousto-optique, dans lequel les effets décrits par Hamilton et Lloyd sont présents. Seuls, les cristaux du régime de Hamilton-Lloyd, ou cristaux coniques épais, po≥3, peuvent être décrits par la théorie de Hamilton, et ont la particularité, de propager les rayons à l'intérieur du cristal sous forme d'un « cône obscur », ou « conefringent », diffractant sous forme de cône, terme utilisé par certains auteurs.
Hamilton avait d'ailleurs, dès 1832, [6], déjà noté cette condition sur l'amplitude de l'effet des cristaux biaxes, nécessaire la validité de sa description de la réfraction conique, en montrant la nécessité, de «sufficient biaxal energy»
"29 New conséquences of Fresnel 's principles. It follows from those principles, that crystals of sufficient biaxal enersv ought to exhibit two kinds of conical refraction, an external and an internai: a cusp-ray giving an external cone of rays, and a normal of circular contact being connected with an internai cone. »
L'onde émergeante du cristal conique mince, E(p, 9R), exprimée en coordonnées normalisées pour une onde polarisée circulairement, est constituée par la superposition de deux ondes, référencées ici comme l'onde fondamentale, EF (p), une onde régulière, et l'onde vortex , Ev (p,6R), une onde singulière; ces deux ondes sont cohérentes l'une avec l'autre, co-localisées, polarisées circulairement et de chiralité inverse :
E p, 6R) = EF p) + EvÇp, θκ = EF(p) (j1.) + Fv(p) exp(-i0R) (J) (EQ. 3)
Dans cette équation, EF (p) est l'amplitude fondamentale scalaire, Fv (p) est l'amplitude scalaire de vortex réduite; elles sont donnés par:
£F(p) = 2π / du u cos(p0, u) }0(pu) Fv(p) = 2π / du u sin(p0u) /x (pu) .(EQ. 4) Pour un cristal conique mince linéaire, l'onde fondamentale peut être approximée par une tache d'Airy et l'onde de vortex peut être approximée par un vortex linéaire, représenté par:
Fv(p) = 2πρ0 / du u2 (pu). (EQ. 5)
En supposant que l'action du polariseur partiel, 29, est la mise à l'échelle de l'onde vortex par a, les paramètres de Stokes peuvent être déduits des équations précédentes, β étant l'angle de la polarisation linéaire:
S0 = (EF(p)f + (a2Fv(p))2
S1 = 2aEF p)Fv(p) sin 9R; S2 = 2aEF(p)Fv(p) cos ΘΗ ; (EQ. 6)
Figure imgf000035_0001
β = θκ;
Comme décrit précédemment, l'onde émergeante du cristal conique, pour une onde polarisée circulairement, est constituée par la superposition de deux ondes, l'onde fondamentale, une onde régulière, et l'onde vortex, une onde singulière Tous les faisceaux incidents à polarisation homogène peuvent se décomposer sur la base orthogonale composée des polarisations circulaire droite et circulaire gauche. Le faisceau incident est donc la superposition cohérente de deux faisceaux, l'un polarisé en polarisation circulaire droite et le second en polarisation circulaire gauche. Le faisceau émergent est la superposition cohérente de quatre faisceaux ; deux ondes fondamentales, la première créée par le faisceau polarisé en polarisation circulaire droite et la seconde par le faisceau polarisé en polarisation circulaire gauche et deux ondes vortex créée par les faisceaux polarisés en polarisation circulaire droite et gauche. Toutefois, si les deux ondes fondamentales ont la même distribution spatiale et peuvent interférer en gardant leur topologie, les deux, vortex sont de chiralités opposées et créent des distributions complexes. Différentes combinaisons de ces ondes peuvent être réalisées en choisissant les polarisations en entrée et sortie, ce qui permet d'obtenir des PSF de différentes formes.
Objet parcimonieux
Nous utiliserons les termes d'un objet parcimonieux « sparse object » en anglais, pour décrire soit un ensemble d'émetteurs parcimonieux, ou clairsemés, des émetteurs lumineux ponctuels, soit un ensemble d'objets parcimonieux, la parcimonie étant définie dans les références [41 -43] et n'étant pas limité à des objets ponctuels mais incluant, par exemple, des filaments. Pour des émetteurs parcimonieux, la limite choisie, est un nombre inférieur à douze, positionné dans un volume dont la taille, dans chacune des dimensions, est inférieure à 3 longueurs d'ondes, à la longueur d'onde d'émission ou de réflexion des émetteurs. Le volume de taille inférieure à 3 longueurs d'ondes, qui contient l'objet parcimonieux, sera référencé comme un volume d'analyse de taille réduite.
Nous utiliserons le terme d'objet continu pour décrire un ensemble d'émetteurs lumineux ponctuels ou continus, ne remplissant pas les conditions décrites précédemment dans la définition de l'objet parcimonieux. La transition entre ces deux régimes n'est pas franche et de nombreux cas expérimentaux seront des cas intermédiaires entre ces deux types d'objet.
On se réfère maintenant aux figures 4a à 4c qui sont une représentation simplifiée du concept de confinement volumique du microscope confocal.
La fonctionnalité du confinement volumique est de limiter, dans les trois dimensions spatiales, la région observée de l'échantillon à un volume de taille la plus petite possible, le volume d'analyse. La fonctionnalité du confinement volumique limite le volume d'analyse par la combinaison de deux effets : le confinement de la lumière projetée sur une petite surface, idéalement de la taille de la tâche d'Airy, 50, et l'élimination de la lumière défocalisée par le trou confocal, 28 de la Figure 2. La superposition de ces deux effets crée un petit volume, le volume d'analyse, 60. Ce volume détermine la taille de la région élémentaire détectée par le système.
Considérons un objet parcimonieux ou continu, 51, consistant en un ensemble de
nanoémetteurs, 53 à 59. Les nanoémetteurs 53 à 55 positionnés dans le volume d'analyse 60, et seulement eux, sont à la fois excités par la source lumineuse et les photons émis par eux arrivent au module du détecteur. Les nanoémetteurs ne se trouvant pas dans le cône d'éclairage, 56 et 57, ne sont pas illuminés par la lumière incidente. La lumière émise par les nanoémetteurs 58 et 59 ne se trouvant au plan conjugué du trou confocal, 28 de la Figure 2, est bloquée, presque intégralement, par le trou confocal, 28 de la Figure 2.
Deux repères cartésiens différents sont définis dans le système, Figure 4c:
Le référentiel « i » : Les axes référencés « i » représentent un repère cartésien centré sur le centre du volume d'analyse, 61.
Le référentiel « a » : Les axes référencés « a » représentent un repère cartésien centré, pour chaque nanoémetteur lumineux, sur le nanoémetteur lumineux considéré comme un point discret, 62,
Lorsque, en utilisant un mode de réalisation de l'invention qui sera décrite ultérieurement, on projette un vortex sur l'échantillon sous analyse, le centre du vortex sera en général défini comme le centre du volume d'analyse.
Au moins un mode de réalisation de l'invention utilise la diffraction conique pour réaliser les modules optiques fondamentaux de la technique. Toutefois, des implémentations alternatives, remplaçant les modules basés sur la diffraction conique, par des modules basés sur d'autres concepts optiques, sont en mesure de fournir les mêmes fonctionnalités. Elles font partie intrinsèquement du champ de cette invention. Les concepts optiques alternatifs comprennent mais ne sont pas limités aux cristaux uniaxes, aux réseaux à pas inférieur à la longueur d'onde, « subwavelength gratings », aux modes de laser structurés, aux composants holographiques et à d'autres techniques connues de l'Homme de l'Art,
Les concepts, techniques et dispositifs optiques et optoélectroniques, qui peuvent être utilisés dans des modes de réalisation de l'invention sont décrits dans par exemple le livre écrit par D. Goldstein, «Polarized light», [12], le « Handbook of Confocal Microscopy », [13], le « Handbook of Optics », [14].
Sémaphore optique
Nous utilisons dans ce mode de réalisation de l'invention le terme de sémaphore optique pour décrire un élément optique, passif ou actif, capable de canaliser la lumière incidente vers différents canaux ou détecteurs en fonction d'une propriété de la lumière. Le cas le plus simple est une lame dichroïque qui sépare la lumière en deux canaux en fonction de la longueur d'onde.
Nous utilisons dans ce mode de réalisation de l'invention le terme, en anglais, de « Position dépendent Optical Sémaphore » - acronyme PDOS - ou sémaphore optique dépendant de la position - pour décrire un sémaphore optique qui canalise la lumière en fonction de la position du point émetteur. Le PDOS sera déterminé par une série de fonctions de transfert, Ti(x,y,z) dépendant, pour chaque canal ou détecteur i, de la position de l'émetteur (x,y,z), dans un volume de référence. L'ordre du PDOS sera le nombre de canaux ou détecteurs. Le PDOS sera sans perte « lossless » en anglais, dans un volume d'analyse, si la somme des fonction de transfert, Ti(x,y,z) est égale à l'unité dans le volume d'analyse. Le trou confocal, décrit par Minsky, [15], pourrait être considéré dans ce mode de réalisation de l'invention comme un PDOS dégénéré d'ordre 1.
Dans la majorité des cas la dépendance du PDOS est une fonction complexe des positions latérales et longitudinale. Toutefois, nous utilisons dans des modes de réalisation de l'invention le terme, en anglais, de « Longitudinal Position dépendent Optical Sémaphore » - acronyme LPDOS - ou sémaphore optique dépendant de la position longitudinale - pour décrire un sémaphore optique qui canalise la lumière en fonction de la position longitudinale du point émetteur. Le LPDOS sera déterminé par une série de fonctions de transfert, Ti(z) dépendant, pour chaque canal ou détecteur i, de la position longitudinale de l'émetteur (z), dans un volume de référence. L'ordre du PDOS sera le nombre de canaux ou détecteurs. Le LPDOS sera souvent couplé à un stop, limitant le champ latéral du système.
Transmission par des fibres optiques
Une utilisation principale des fibres optiques est la transmission exclusive du mode TEMoo. Toutefois, certaines configurations de fibres optiques, telles que les FMF ou les vortex Fibers, principalement mais non exclusivement basées sur des fibres dites « Photonic Crystal Fiber » (en anglais) - acronyme PCF - et les fibres dites « vortex fiber » permettent la transmission simultanée ou non, de modes plus complexes, y compris des modes de vortex, ayant une vorticité égale ou inférieure à 2. 11 serait donc possible de déporter les distributions optiques créées par la diffraction conique à l'aide de fibres optiques, permettant une simplification majeure du système optique.
La possibilité de déporter les distributions optiques créées par la réfraction conique à l'aide de fibres optiques permet l'application des modes de réalisation de l'invention à de nombreuses applications supplémentaires, par exemple mais non limité à l'observation gastrique ou gastroentérologique, et à l'observation du colon et des voies urinaires.
De plus, certaines fibres les « dual-core photonic crystal fibers », en anglais, [16], permettent une interaction entre deux modes, l'un d'entre eux pouvant être un vortex, et fournissent un mécanisme physique supplémentaire pour créer des fonctions de transfert diversifiées.
Mesures à plusieurs longueurs d'onde
Dans des modes de réalisation de l'invention l'objet peut être éclairé en lumière
monochromatique et en utilisant par exemple un laser classique ou une lampe monochromatique. De plus, dans certaines configurations, un laser à spectre large - dit laser blanc » peut être utilisé. Cette configuration est simple, car un des paramètres principaux du système est fixe et bien déterminé. Toutefois, dans d'autres modes de réalisation de l'invention l'objet peut aussi être éclairé à plusieurs longueurs d'onde, soit de façon discrète, en utilisant par exemple plusieurs lasers, soit de façon continue, en utilisant par exemple une lampe ou un laser ayant un spectre plus large. De nombreux systèmes de superrésolution existant mesurent simultanément ou séquentiellement à plusieurs longueurs d'ondes. En effet, il est possible de marquer des éléments similaires ou différents avec des fluorophores ayant des réponses spectrales différentes, permettant de les reconnaître et de les séparer. Il est important de présenter deux cas différents :
• L'utilisation de marqueurs fluorescents, émettant à deux longueurs d'ondes
différentes, excités par la même longueur d'onde
• L'utilisation de marqueurs fluorescents émettant à deux longueurs d'ondes différentes ou similaires, excités par deux longueurs d'ondes différentes
Il faut noter que dans le cas de l'utilisation de marqueurs fluorescents, émettant à deux longueurs d'ondes différentes, excités par la même longueur d'onde, le problème du recalage entre les mesures d'une longueur d'onde par rapport à la seconde, sont intrinsèquement inexistants car l'information de position de superrésolution est dérivée de la projection de la lumière, qui est parfaitement identique pour les différentes longueurs d'onde.
Ceci permet une calibration relative de la position de fluorophores à deux longueurs d'onde différentes, avec une précision limitée seulement par le système expérimental de calibration, éliminant le problème majeur du recalage entre deux images de longueur d'onde différentes. La possibilité d'achromatiser les systèmes optiques basés sur la diffraction conique en font un outil de choix pour l'implémentation de systèmes optiques, a chemin commun, dans de nombreuses applications, et plus particulièrement pour des modes de réalisation de l'invention décrits.
L'achromatisation est aussi possible pour les systèmes optiques basés sur les cristaux uniaxes, et pour presque toutes les implémentations alternatives de cette invention, avec, pour chacun d'entre eux, une complexité pratique plus ou moins grande.
D'autres systèmes de fluorescence existants utilisent une lumière ayant un contenu spectral plus large, pour réduire des artefacts, et principalement les effets de speckle.
Corollairement, les propriétés spectrales des protéines fluorescentes permettent de mesurer le potentiel des interactions moléculaires intracellulaires en utilisant la technique de transfert d'énergie de Fôrster - Fôrster (Fluorescence) Résonance Energy Transfer (FRET).
Dans certaines implémentations des systèmes PSIT, la lumière d'un ou des faisceaux laser incidents est séparée à l'aide d'un séparateur de lumière en deux faisceaux, le faisceau principal qui accomplira la fonctionnalité du système PSIT, et un faisceau supplémentaire de faible intensité utilisé pour mesurer la position du faisceau laser à l'aide d'une caméra ou d'un détecteur de position. Ge dispositif permet de mesurer en temps réel la position du laser indépendamment de toute erreur de wobble ou autre erreur mécanique avec une très haute précision.
Information a priori et information complémentaire Des modes de réalisation de l'invention décrite permettent l'intégration et la fusion d'information supplémentaire externe à la plateforme décrite, optique ou contextuelle, pour obtenir une amélioration de la précision de l'information recueillie de l'échantillon pour l'un quelconque des niveaux d'abstraction cités : la carte, le niveau d'abstraction géométrique, le niveau d'abstraction biologique et le niveau d'abstraction fonctionnel.
Plus généralement, la diversité spectrale, l'information obtenue à plusieurs longueurs d'onde, la diversité de polarisation, et l'information obtenue en projetant différents états de polarisation, étend l'étendue de l'information disponible.
Le fait que l'absence d'énergie, par exemple dans le cas du zéro du vortex, est une information pertinente, ouvre des possibilités supplémentaires à l'acquisition d'information sans « coût » en nombre de photons. Cette situation a une grande importance pour la détection de phénomènes de fluorescence faible, comme par exemple l'autofluorescence.
Une des modalités décrites pour certains modes de réalisation de l'invention sera référencée sous le nom du dark tracking.
Nous introduisons le concept d'information intégrale optique, l'information qui pourrait être récupérée à partir de mesures optiques ou par ondes électromagnétiques, sur une cible, par un observateur, à partir d'un point de vue donné. Cette information contient de très nombreux paramètres de l'objet, liés à sa position, les matériaux qui la composent, sa température, ou son orientation.
L'information intégrale optique ne contient pas, par contre, d'informations sur des régions de l'objet n'ayant pas de chemin optique vers l'observateur, par exemple un élément positionné dans une boite opaque, ou une information physique qui n'a pas de transcription optique.
Mesures superrésolues et limite de diffraction
Il a longtemps été considéré que l'optique limitait intrinsèquement la résolution de tout système optique, à travers la limite de diffraction. L'apparition de techniques de superrésolution - dans différents domaines et sous différentes dénominations - a montré qu'il est possible de dépasser cette limite de diffraction, par différents moyens.
Des modes de réalisation décrits dans cette invention, tels que la détection de la présence de deux points de même intensité, par projection d'un vortex au centre de gravité de la distribution lumineuse créée par l'onde fondamentale, ne sont pas limités en résolution a priori et pourrait idéalement -avec un nombre de photons infini - obtenir n'importe quelle résolution, comme nous le décrirons ultérieurement pour un cas spécifique. Utilisation des interactions non-linéaires dans la superrésolution et famille de techniques RESOLFT et STED
L'utilisation des interactions non linéaires dans un milieu matériel, entre deux faisceaux de lumière, a été proposée en 1994 par Hell, [5] et [17], comme base d'un système de super résolution. De nombreuses techniques différentes ont découlées des travaux de Hell créant plusieurs familles de techniques, telle que le RESOLFT et la « localization microscopy».
Plusieurs revues de ces techniques ont été publiées ([1] ou [38]).
Ces interactions non linéaires incluent mais ne sont pas limitées aux phénomènes d'interaction à deux photons, aux effets d'émission-déplétion, de clignotement (blinking en anglais) et de photoactivation sur lesquels sont basées la famille de technologie RESOLFT et la famille de technologies de « localization microscopy».
La famille de technologies RESOLFT est bien connue et est décrite dans plusieurs références, telles que l'article initial de Hell [5] et du brevet initial [17], ou par Schermelleh et al. [1], ou dans des publications récentes, Vicidomini et al. [18], ou de Willig et al. [19].
Dans la technique STED décrite dans l'article initial de Hell [5], deux faisceaux sont projetés, séquentiellement sur l'objet: un faisceau d'excitation standard, modélisé dans la majorité des cas par une distribution de lumière décrite par une fonction d'Airy, et un faisceau de déplétion - ayant une forme de doughnut ou vortex ; l'effet de la déplétion est d'empêcher la fluorescence des fluorophores se trouvant dans la surface de la distribution de lumière de déplétion, tout en ne modifiant pas l'émission des fluorophores positionnés au centre de la distribution de lumière en dehors de la distribution de lumière de déplétion; ceci permet de créer une distribution de lumière d'émission équivalente plus petite que la distribution de lumière d'excitation initiale. Cette technique a permis de réaliser des distributions de lumière d'émission équivalentes de très petite taille, tout en nécessitant toutefois des énergies de déplétion lumineuses très importantes.
Plusieurs variantes du STED ont été développées : le « CW STED », [20], le « gated STED », [21 ], et le « modulated STED » [22]. Dans le CW STED le laser puisé utilisé dans la première version du STED est remplacé par un laser continu - plus simple. Dans le « gated STED » les photons émis sont discriminés en fonction de leur temps d'émission pour écarter les photons émis depuis des fluorophores n'ayant pas reçu suffisamment de temps le faisceau de déplétion ; le « modulated STED » utilise un faisceau d'excitation modulé en intensité, en combinaison avec une détection synchrone dépendant de la fréquence de modulation. Ceci permet de discriminer le signal de fluorescence créé par le faisceau d'excitation de la fluorescence résiduelle provoquée par le faisceau de déplétion.
Une autre variante, proposée par Gould et al. [45], utilise un SLM pour créer, soit séparément soit conjointement, les distributions de déplétion latérale et/ou axiale.
Le doughnut - ou vortex - était créé, dans la première version du STED, à l'aide d'une lame de phase variant spatialement, « phase plate» en anglais. Cette implémentation nécessite l'utilisation de deux chemins optiques séparés pour les deux faisceaux, le faisceau d'excitation et le faisceau de déplétion. Ce montage optique est complexe, fortement dépendant de toute dérive mécanique, et crée des alignements optiques complexes. Le système mis au point nécessite une forte technicité et le cout du système est important. De plus, cette implémentation est chromatique, car la lame de phase adaptée à une longueur d'onde ne le sera plus à une autre longueur d'onde. Le système optique n'étant pas achromatique, l'utilisation d'un STED à deux longueurs d'onde de déplétion nécessite un système optique encore plus complexe.
Pour simplifier la mise en œuvre du STED, plusieurs auteurs ont proposé des solutions permettant de réaliser un STED dans lequel les deux faisceaux, le faisceau d'excitation et le faisceau de déplétion, se propageraient suivant le même chemin optique :
- Wildanger et al. ont proposé un Microscope STED à chemin optique commun, insensible à la dérive mécanique, basé sur les propriétés de dispersion des différents matériaux optiques, [23], Cette technologie est commercialisée sous le nom EASYDOnut par la société Abberior Instruments. [28].
- Bokhor et al. [24], propose l'utilisation d'une séparation annulaire chromatique des faisceaux préalignés ; toutefois cette solution bloque une partie de la lumière de déplétion, Hoeffman [25], propose l'utilisation d'un module contenant les éléments optiques préalignés créant le vortex, dans le chemin optique du laser de déplétion, pour simplifier l'alignement,
- Menon et al ; [26], propose des lentilles diffractives permettant de créer des zéros d'amplitude sans singularités de phase,
Reuss et al. [27] introduit un dispositif de formation de faisceau placé directement en face de la lentille d'objectif. Ce dispositif se base sur l'utilisation de cristaux biréfringents, montés sous forme d'une lame d'onde segmentée, consistant en quatre segments. Par un choix du paramètre d'épaisseur de la lame, il est possible de réaliser un élément consistant en une lame de phase pour la déplétion et une lame neutre pour l'excitation.
- Gould et al. [45], utilise un SLM pour créer, soit séparément, les distributions de déplétion latérale et/ou axiale. Cette solution permet de faire varier les paramètres dynamiquement pour s'adapter à différentes longueur d'onde. D'autres travaux intègrent les distributions latérales et axiales sur un seul SLM.
Toutefois, les solutions proposées décrites antérieurement sont toutes fortement chromatiques et sont conçues pour une seule longueur d'onde d'excitation et de déplétion. Cependant, les applications biologiques nécessitent dans de nombreux cas un système à deux ou plus, longueurs d'onde d'excitation. En effet, il est de pratique courante de marquer des objets biologiques différents avec des marqueurs fluorescents différenciés par leur longueur d'onde d'excitation ou d'émission. Les systèmes de fluorescence les plus évolués peuvent utiliser quatre à six marqueurs différenciés. La présence d'une seule voie de super résolution limite fortement l'utilisation des systèmes. Des systèmes STED à deux longueurs d'onde sont d'ailleurs disponibles commercialement.
Il est clair que pour un microscope STED achromatique ou 3D STED à plusieurs longueurs d'onde, l'utilisation du même chemin optique pour deux faisceaux de déplétion à deux longueurs d'onde différentes simplifiera la super résolution sur des fluorophores différents.
Dans l'Art Antérieur, pour l'ensemble des solutions proposées pour le STED, les faisceaux laser initiaux, sont sous forme d'une distribution régulière et dans la majorité des cas d'une distribution gaussienne. Ces faisceaux laser initiaux seront ultérieurement transformés en faisceau d'excitation, une onde régulière, et en faisceau de déplétion, une onde singulière, par un système optique adéquat, décrit par les différents inventeurs. Co-localiser ces faisceaux en amont lorsqu'ils sont encore sous forme de distribution gaussienne est relativement simple. Co-localiser ces faisceaux en aval lorsqu'ils ont été transformés en onde régulière et singulière est beaucoup plus complexe. Co- localiser ces faisceaux en amont peut être réalisé de façon commerciale par des systèmes de banc laser en utilisant des techniques basées sur les fibres optiques. Il est donc relativement aisé, comme il est d'ailleurs fait dans l'ensemble des microscopes confocal, de créer un ensemble de sorties laser à différentes longueurs d'ondes d'une même fibre optique et donc co-localisées de façon très précise.
La solution proposée dans des modes de réalisation de la présente invention permet de se baser sur cette co-localisation en amont, simplifiant de beaucoup le système et permettant la réalisation d'un STED à plusieurs longueurs d'onde, de façon intrinsèque. Pour ceci, il est préférable d'utiliser un système optique qui combine les propriétés de chemin optique commun, d'achromaticité et de « beam shaping ». Il est préférable de réaliser un beam shàping différent pour les différents faisceaux, soit une onde régulière pour le faisceau d'excitation et une onde singulière pour le faisceau de déplétion, et ceci à n'importe quelle longueur d'onde dans le spectre visible ou infrarouge. La capacité de réaliser un beam shaping achromatique, permettant d'obtenir pour une polarisation une onde régulière et pour une autre polarisation, une onde singulière, sur l'ensemble de la lumière visible ou infrarouge, diffèrent pour les différentes polarisations, est nouvelle. Le module PSIT permet la réalisation d'un tel système optique qui combine les propriétés de chemin optique commun, d'achromaticité et de « beam shaping ». A notre connaissance, il n'existe pas en effet un système à chemin commun, achromatique et permettant un beam shaping différent pour les différents faisceaux, dans la littérature. Un tel système améliore certainement la simplicité de conception et d'utilisation du STED.
3D STED
De nombreux systèmes ont été proposés pour étendre le concept du STED à la troisième dimension. La solution retenue pour l'ensemble des STED-3D est le « déplétion ring » proposé par l'équipe de Stefan Hell, référence 36. Le « déplétion ring » permet de créer une « sphère noire », une distribution dans laquelle l'intensité est nulle au centre du champ à focalisation, et augmente relativement rapidement avec la défocalisation. Une implémentation de la « sphère noire » a été décrite, par Zhang, [29], créant un spot noir entouré en trois dimensions par une sphère lumineuse et par un des auteurs de ce brevet dans la référence 37.
Acronymes
Nous utiliserons dans cette demande de brevet l'acronyme, SRCD, « Super Resolution using Conical Diffraction » pour nommer la plateforme, les modules et systèmes spécifiques à
P implémentation de cette invention.
Nous utiliserons dans cette demande de brevet l'acronyme, PSIT, méthode de projection d'une séquence d'intensités lumineuses différant topologiquement, soit en anglais : « Projected
Sequence(s) of Intensities with various Topologies » ; la méthode PSIT peut aussi être utilisée pour projeter des séquences d'intensités lumineuses différant topologiquement, à deux ou plusieurs longueurs d'onde, séquentiellement ou simultanément.
Nous utiliserons dans cette demande de brevet l'acronyme, PDOS, sémaphore optique à dépendance spatiale, soit en anglais : «Position Dépendent Optical Sémaphore».
La plateforme SRCDP, « Super Resolution using Conical Diffraction Platform», est une plateforme de Microscopie utilisant des modules optiques basés sur la diffraction conique.
Nous utiliserons dans cette demande de brevet l'acronyme, LatSRCS pour nommer le module optique implémentant la méthode PSIT à P implémentation de cette invention.
Nous utiliserons dans cette demande de brevet l'acronyme, LongSRCS pour nommer le module optique implémentant la méthode PDOS.
La plateforme SRCDP, décrite en détails par la suite, consiste principalement en deux modules matériels, deux modules optiques nouveaux et complémentaires, les modules optiques LatSRCS et LongSRCS, montés sur un microscope, et un module algorithmique, SRCDA, « Super Resolution using Conical Diffraction Algorithm», permettant de reconstruire
l'information superrésolue de l'échantillon. De plus la plateforme SRCDP, inclut un module de détection amélioré, un module de contrôle du système, et un support informatique et logiciel.
De plus, certains modes de réalisation de l'invention concernent un nombre important de variantes d'implémentations des méthodes PSIT et PDOS, de la plateforme SRCD, des modules optiques LatSRCS et LongSRCS et de l'algorithmique, SRCDA.
DESCRIPTION DÉTAILLÉE DE L'INVENTION
DISTRIBUTIONS LUMINEUSES
Distributions lumineuses créées par la diffraction conique
Se référant à la Figure 7a, cette figure représente les distributions lumineuses, créées à travers un cristal conique de paramètre conique normalisé po de 0.388, calculées par une approximation scalaire, pour différents états de polarisation d'entrée et de sortie, incluant en entrée et/ou en sortie soit un polariseur circulaire ou linéaire soit un polariseur radial ou azimutal. Ces distributions lumineuses ont été calculées dans un plan intermédiaire d'imagerie et non au foyer de l'objectif pour séparer la réfraction conique des effets vectoriels. Les états de polarisation - d'entrée et de sortie - sont caractérisés par leur angle pour les polarisations linéaires et par leurs chiralités pour les polarisations circulaires.
Se référant à la Figure 7b, cette figure représente les distributions lumineuses, créées à travers un cristal conique de paramètre conique normalisé po de 0.818, calculées par une approximation scalaire, pour différents états de polarisation d'entrée et de sortie, incluant en entrée ou en sortie soit un polariseur circulaire ou linéaire soit un polariseur radial ou azimutal. Ces distributions lumineuses ont été calculées dans un plan intermédiaire d'imagerie et non au foyer de l'objectif pour séparer la réfraction conique des effets vectoriels. Les états de polarisation d'entrée et de sortie sont caractérisés par leur angle pour les polarisations linéaires et par leurs chiralités pour les polarisations circulaires.
Nous présentons dans ces figures un grand nombre de fonctions de transfert différentes, incluant les cas incluant en entrée ou en sortie des polariseurs circulaires, linéaires, azimutaux ou radiaux. Il faut compléter cette description en y incluant en plus des polariseurs circulaires, linéaires, azimutaux ou radiaux décrits dans les figures, les cas de polariseurs elliptiques, dichroïques ou partiellement dichroïques, et polariseurs variant spatialement. De plus, comme illustré dans les figures 7a et 7b, ces fonctions de transfert varient fortement en fonction du paramètre conique normalisé po. De plus, l'introduction de deux cristaux coniques, ou d'un cristal conique et d'un cristal uniaxe ou biaxe (dans lequel la lumière se propage dans une direction de propagation différente de celle de la diffraction conique) en cascade permet un nombre encore plus grand de fonctions de transfert comme illustré pour deux cristaux coniques dans la figure 7c.
En résumé nous référencerons, dans cette demande de brevet, sous le terme de fonction de transfert de diffraction conique, l'ensemble des fonctions de transfert pouvant être obtenues à l'aide d'un faible (<6) nombre de cristaux en cascade, et des éléments de polarisation, statiques ou dynamiques, uniforme ou variant spatialement
Nous noterons principalement les distributions lumineuses suivantes :
• Le fondamental : Figure 7aoo et 7an, obtenue entre polariseurs circulaires parallèles, qui est une distribution proche de la distribution d'Airy
• Le vortex : Figure 7aoi et 7aio obtenue entre polariseurs circulaires, croisés • La distribution que nous avons appelé la distribution en « croissant de lune » ou Stokes, les sous-figures 7ao,2-5, 7ai,2-5, 7a2-5,o et 7a2-s,i, et 'a figure 7c décrivant la variation axiale des distributions en « croissant de lune » ou Stokes. Ces distributions sont obtenues entre un polariseur circulaire et un polariseur linéaire d'angle variable; cette distribution est antisymétrique et l'axe tourne avec l'axe du polariseur linéaire,
• La distribution que nous avons appelé la distribution en « demi-lunes», sous-figures 7a42, 7a35, 7a24 et 7as3 est obtenue entre deux polariseurs croisés ; cette distribution est symétrique.
• La distribution que nous avons appelé la distribution en « demi-lunes décalées », figure 7d, représentant la distribution en « demi-lunes décalées » à différentes positions axiales, est obtenue entre deux polariseurs elliptiques pour certaines valeurs d'ellipticité.
• En se référant à la Figure 7e, nous décrivons dans cette invention une nouvelle
distribution, la distribution que nous avons appelé « Dark Hélix », en anglais, réalisée en positionnant une lame demi-onde entre deux cristaux de diffraction conique égaux. Cette distribution a la particularité de pouvoir être réalisée soit avec une polarisation circulaire en entrée et sans analyseur, soit sans polariseur d'entrée et avec un analyseur circulaire. Cette propriété permet de simplifier le système optique et de réduire la perte de photons inhérente dans beaucoup de systèmes basés sur la polarisation.
• Les distributions lumineuses plus complexes, Figure 7b, pour un cristal de paramètre conique normalisé, po, supérieur à 0.5
• la réalisation de distributions lumineuses additionnelles à l'aide de deux - ou plus - cristaux coniques en cascade, (non représentées) avec ou sans éléments de polarisation statiques ou dynamiques entre les cristaux.
La réalisation des différentes distributions lumineuses est réalisée par la modification de la polarisation d'entrée ou de sortie. Les différentes distributions lumineuses suivent le même chemin optique et le système optique créant ces distributions est un système optique à chemin commun, tel que nous l'avons défini antérieurement. Il existe un nombre d'éléments de polarisation ayant une polarisation différente à différentes longueur d'ondes. L'utilisation d'un de ces éléments permet de créer deux ondes compactes, soit régulières soit singulières à deux longueurs d'ondes soit une onde régulière à une longueur d'onde et une onde singulière à une autre longueur d'onde. Un tel dispositif permet une implémentation beaucoup plus simple des concepts d'émission-déplétion limités dans certains cas par les tolérances ou par les vibrations du système optique.
La description précédente, bien que valable pour n'importe quel faisceau optique, décrivait principalement, pour le Module optique LatSRCS, décrit ultérieurement, la mise en forme d'un faisceau d'excitation, ou d'un faisceau de déplétion. Toutefois, on peut utiliser la diffraction conique pour la mise en forme du faisceau d'émission, comme par exemple dans le module LongSRCS, décrit ultérieurement. Une nouvelle variante de ce module consiste à mettre en forme la PSF de sorte qu'elle présente des variations latérales et principalement axiales. Cette modification de la PSF du faisceau d'émission, référencé comme la « PSF » a de nombreuses applications, dans différentes disciplines. Par exemple, un module basé sur la diffraction conique, modifiant la PSF pour créer une dépendance axiale peut permettre la mesure de position longitudinale et latérale d'un ou plusieurs nanoémetteurs, comme décrit par la suite.
Redondance et variations de phase aléatoires
Les distributions lumineuses élémentaires décrites dans la Figure 7 peuvent être obtenues de plusieurs façons différentes. De plus, certaines d'entre elles peuvent être obtenues comme une superposition incohérente d'autres distributions lumineuses élémentaires; par exemple le vortex peut être obtenu par n'importe quelle somme de deux distributions lumineuses « demi-lunes » orthogonales.
Cette redondance permet de moyenner une partie des erreurs de phases aléatoires présentes inexorablement dans de nombreux processus de mesure d'objets biologiques.
Des distributions lumineuses nouvelles peuvent être aussi obtenues comme des combinaisons mathématiques de distributions lumineuses élémentaires. La distribution lumineuse « pseudo- vortex », calculée à partir de combinaisons arithmétiques des quatre distributions en « croissant de lune » a la particularité d'avoir une très forte courbure à l'origine.
Effets vectoriels et direction du dipôle fluorescent
La théorie développée jusqu'à présent décrit la distribution de lumière dans le plan d'imagerie du microscope, 35. La répartition de la lumière projetée sur l'échantillon est, selon la théorie de l'imagerie géométrique, une image réduite de la distribution de la lumière dans le plan image.
Toutefois, comme il est décrit abondamment dans la littérature, pour un objectif à forte ouverture numérique, la théorie de l'imagerie géométrique n'est pas exacte et les effets vectoriels, doivent être pris en compte. Ces effets consistent essentiellement en la présence d'une composante polarisée longitudinalement.
En référence de nouveau à la Figure 6a, pour atténuer les effets vectoriels, il peut être avantageux de maintenir l'analyseur final fixe et d'ajouter un élément supplémentaire, fixe ou variable, le sous-module d'adaptation de polarisation de sortie, 74, pour contrôler la polarisation de sortie. Nous avons constaté que le fait que la polarisation de sortie ait une symétrie circulaire réduit sensiblement les effets vectoriels et permet de s'adapter à la direction du dipôle fluorescent. Une telle polarisation peut être circulaire, radiale, azimutale ou dépendante de la position. Pour la polarisation circulaire, le sous-module d'adaptation de polarisation de sortie 74, est tout simplement une lame de retard d'un quatre d'onde. Dans ce cas, les éléments de polarisation longitudinale ont une symétrie de vortex et se fondent harmonieusement dans le système avec seulement une petite modification de la forme des paramètres de Stokes, même pour les objectifs de microscope avec une ouverture numérique très élevée.
Alternativement, le sous-module d'adaptation de polarisation de sortie, 74, peut être variable et/ou contrôlable et s'adapter à la topologie et à la symétrie de chacune des distributions lumineuses compactes.
*Prisme de WoIIaston modifié
On rappelle qu'on peut utiliser un prisme de Wollaston pour séparer un faisceau incident en deux faisceaux émergeants séparés par un angle. En utilisant plusieurs prismes en cascade, on peut ainsi séparer un faisceau incident en un grand nombre de faisceaux émergents. On peut obtenir le même effet en modifiant le prisme de Wollaston, pour créer le prisme de Wollaston composé, en lui ajoutant des pièces de cristal uniaxe dont l'indice et l'orientation de la biréfringence sont choisis sont choisis de façon adéquate. On peut ainsi construire un prisme d'un seul bloc de cristal uniaxe qui peut séparer un faisceau incident en 2n faisceaux émergents (par exemple huit ou seize) qui sont contenus dans un plan, et séparé par des angles égaux. Une fois focalisés sur l'échantillon, on obtient 2" points alignés et également séparés. Si le faisceau incident a traversé un module LatSRC, ces 2" points ne sont pas 2n tâches d'Airy, mais les distributions créées par le module et sont toutes identiques. L'avantage d'utiliser ce beamsplitter est de balayer l'échantillon plus rapidement puisqu'on a 2" points lumineux à la place d'un seul.
Le prisme de Wollaston modifié peut être couplé aux méthodes décrites dans cette invention pour dupliquer l'ensemble des distributions lumineuses sans modifier les relations entre elles.
Le prisme de Wollaston modifié peut être couplé aux méthodes STED décrites dans cette invention ou à d'autres méthodes STED standard pour dupliquer l'ensemble des distributions lumineuses sans modifier les relations entre elles.
PARADIGMES DE MESURE
La fonctionnalité du microscope confocal est de limiter, dans les trois dimensions spatiales, la région observée de l'échantillon à un volume de taille la plus petite possible, le volume d'analyse.
En corollaire, dans un microscope de fluorescence confocal, l'information acquise est une valeur unique d'intensité pour l'ensemble du volume d'analyse, conçu comme une entité unique. Plus clairement, l'information détaillée de la position des nanoémetteurs à l'intérieur du volume d'analyse n'est pas accessible, a priori, dans un microscope confocal. Il était généralement admis qu'aucune information optique additionnelle ne pouvait être créée qui aurait permis une discrimination supplémentaire à l'intérieur du volume éclairé.
On se réfère maintenant à la Figure 4d, qui est une représentation conceptuelle simplifiée d'un paradigme de mesure selon au moins un mode de réalisation de l'invention. Le paradigme de mesure est beaucoup plus ambitieux que celui du microscope confocal de fluorescence, représenté schématiquement dans la Figure 4a. Dans la figure4d, un volume d'analyse, 60, est créé au plan focal de l'objectif du microscope, 22 ; il contient un objet parcimonieux, 51, consistant en plusieurs nanoémetteurs, 53 à 59; le résultat du système est un objet parcimonieux reconstruit, 63, et une liste des nanoémetteurs et une liste de leurs attributs, 64.
On se réfère maintenant à la Figure 4e, qui est une représentation conceptuelle simplifiée d'un autre paradigme de mesure, basé sur les concepts du STED, selon au moins un mode de réalisation de l'invention. Ce paradigme de mesure limite, dans deux (STED 2D) ou dans les trois dimensions spatiales, (STED 3D), la région observée de l'échantillon à un volume de taille la plus petite possible, le volume d'analyse. Dans la Figure 4e, un volume d'analyse, 60, est créée au plan focal de l'objectif du microscope, il contient un objet parcimonieux, 51, comprenant plusieurs nanoémetteurs, 53 â 59 ; une ou plusieurs ondes de déplétion, 2000, réduisent par un effet de déplétion, le volume d'analyse à un volume plus petit représenté par 2001. Dans ce paradigme, comme dans le confocal, la superposition de l'ensemble des effets crée un petit volume, le volume d'analyse, 60. Ce volume détermine la taille de la région élémentaire détectée par le système.
On se réfère maintenant à la Figure 4f, qui est une représentation conceptuelle simplifiée d'un troisième paradigme de mesure, combinant les deux paradigmes précédents et utilisé selon au moins un mode de réalisation de l'invention. Dans la Figure 4f, un volume d'analyse, 60, est créée au plan focal de l'objectif du microscope, il contient un objet parcimonieux, 51, comprenant plusieurs nanoémetteurs, 53 à 59 ; une ou plusieurs ondes de déplétion, 2000, réduisent par un effet de déplétion, le volume d'analyse à un volume plus petit représenté par 2001. Comme dans la Figure 4d, ce volume contient un objet parcimonieux, 51, consistant en plusieurs
nanoémetteurs, 53 à 59; toutefois, contrairement à la Figure 4d, et de façon similaire à la Figure 4e, le volume élémentaire est réduit par une ou plusieurs ondes de déplétion. Le résultat du système est un objet parcimonieux reconstruit, 63, et une liste des nanoémetteurs et une liste de leurs attributs, 64. L'utilisation d'un objet parcimonieux dans les figures 4d-f est à fin
d'illustration et cette figure aurait parfaitement pu représenter un objet continu, mutatis mutandis.
METHODES DE MESURE
Méthode de mesure PSIT
Une méthode de mesure PSIT selon un mode de réalisation de l'invention, une séquence de distributions lumineuses de topologies différentes est projetée sur le volume d'analyse.
La méthode de mesure PSIT réalise les fonctions suivantes :
o Projection d'une séquence, la séquence d'émission, de distributions lumineuses compactes de familles topologiques différentes sur un échantillon; et
o Pour chaque distribution lumineuse compacte :
• émission de lumière par les nanoémetteurs de l'échantillon, • création, à l'aide de l'optique du microscope, d'une image optique,
• acquisition de l'image optique par un détecteur photoélectrique et création d'une image numérique.
Plus en détails, il est à noter que :
La séquence d'émission consiste en, au moins deux, distributions lumineuses ponctuelles, de familles topologiques différentes
La séquence d'émission est projetée sur un échantillon biologique marqué par des nanoémetteurs, L'émission lumineuse émergente de chaque nanoémetteur est dépendante, pour chaque nanoémetteur, de l'intensité, dans le cas incohérent, ou du champ électromagnétique dans le cas cohérent, incidents à la position spatiale, tridimensionnelle du nanoémetteur lumineux susdit propriété d'échantillonnage du nanoémetteur lumineux discutée préalablement.
Pour chaque distribution lumineuse de la séquence d'émission projetée sur l'échantillon, une image optique est créée. L'ensemble des images correspondantes à l'ensemble des distributions lumineuses de la séquence d'émission est référencée comme la séquence d'images.
La méthode PS1T selon ce mode de réalisation permet d'acquérir une information
essentiellement latérale, c'est-à-dire la position latérale chacun des nanoémetteurs.
Dans un mode de réalisation, la méthode PSIT est implémentée par la projection de distributions lumineuses de topologies différentes créées par diffraction conique et modifiées par une variation des états de polarisation d'entrée et de sortie.
Dans un mode de réalisation, la méthode PSIT peut aussi être utilisée pour projeter des séquences d'intensités lumineuses différant topologiquement, à deux ou plusieurs longueurs d'onde, séquentiellement ou simultanément.
Méthode PSIT et superrésolution axiale
La Méthode PSIT a été conçue au départ pour permettre une superrésolution latérale ;
toutefois la méthode PSIT peut aussi être utilisée pour obtenir la position longitudinale d'un nanoémetteur. En effet, certaines distributions lumineuses élémentaires sont relativement insensibles - dans des limites raisonnables - à une variation de la position longitudinale du nanoémetteur, d'autres y sont au contraire très sensibles. Une séquence de distributions lumineuses compactes, certaines d'entre elles indépendantes et certaines d'entre elles dépendantes de la position longitudinale, permettrait de remonter à la position longitudinale des nanoémetteurs.
De plus, pour les distributions lumineuses dépendant fortement de la position longitudinale du nanoémetteur, une série de distributions lumineuses élémentaires décalées légèrement longitudinalement l'une par rapport à l'autre peut être projetée sur l'échantillon, permettant un ensemble d'images contenant une information longitudinale.
Méthode PDOS originale La méthode PDOS comprend la distribution par un « sémaphore optique», de la lumière réémise par les nanoémetteurs ou par l'objet continu entre au moins deux détecteurs. Elle a été décrite par un des inventeurs, [37].
Idéalement, la fonction du sémaphore optique est de séparer sur des détecteurs différents des régions différentes du volume d'analyse. Pratiquement, le sémaphore optique crée, pour chaque détecteur, une fonction de transfert de la lumière émise par un nanoémetteur lumineux, dépendant de la position dans l'espace du nanoémetteur lumineux et différente pour les différents détecteurs.
Dans un mode de réalisation, la méthode PDOS est implémentée de façon à séparer sur des détecteurs différents la lumière collimatée, émergente de nanoémetteurs positionnés au plan focal de l'objectif, de la lumière non-collimatée émergente de nanoémetteurs se trouvant en-deçà ou au- delà du plan focal.
La méthode PDOS, permet d'acquérir une information essentiellement longitudinale, c'est-à- dire la position longitudinale de chacun des nanoémetteurs. Mathématiquement, le procédé selon des modes de réalisation de l'invention réalise une fonction de transfert transformant la distribution spatiale dans l'espace des nanoémetteurs en l'information brute consistant en un ensemble d'images. L'algorithmique réalise l'opération inverse : elle reconstruit la distribution spatiale dans l'espace des nanoémetteurs à partir de l'ensemble d'images composant l'information brute.
Méthode PDOS modifiée
Nous présentons de plus, la méthode PDOS modifiée, une méthode optique de mise en forme du faisceau d'émission, pour la localisation axiale et/ou latérale de nanoémetteurs. Cette méthode implémente une méthode PDOS à un seul canal, dans laquelle la variation d'un des paramètres décrivant la distribution créée est utilisée pour mesurer les paramètres axiaux ou latéraux. Les paramètres utilisés peuvent être soit un paramètre d'angle pour une distribution à variation axiale hélicoïdale, soit le rapport entre les lobes de la distribution - pour une distribution à deux lobes (ou plus) à variation axiale. Cette méthode a une certaine similarité avec la méthode PDOS originale, décrit par un des inventeurs en [37], mais s'en différencie par le fait que la variation de la topologie de la distribution créée est utilisée pour mesurer les paramètres axiaux ou latéraux et non par un rapport d'intensité entre deux détecteurs, comme décrit dans la version originale de la méthode PDOS. Cette méthode, comme la méthode originale, a des applications comme méthode complémentaire de la méthode PSIT, mais aussi pour la localisation axiale de nanoémetteurs, par exemple pour les modalités de localisation, telles que par exemple, les modalités PALM, STORM ou GSDIM ou similaires.
Méthode PDOS et mesures latérales
La Méthode PDOS a été conçue au départ pour permettre une superrésolution longitudinale ; toutefois la méthode PDOS peut aussi être utilisée pour obtenir la position latérale d'un nanoémetteur. En effet, les distributions lumineuses élémentaires sont sensibles aussi à une variation de la position latérale du nanoémetteur. Pour un échantillon plan, dans le cas où la projection de lumière n'est pas réalisable, la méthode PDOS peut remplacer la méthode PSIT pour réaliser des mesures superrésolues.
Toute ces variantes sont réputées faire partie de l'invention. L'inventeur a pourtant choisi, dans une des implémentations de séparer en deux modules optiques disjoints mais
complémentaires les mesures latérales des mesures longitudinales pour réduire la complexité de chacun des modules complémentaires.
L 'information dans certains modes de réalisation de l'invention
Dans certains modes de réalisation de l'invention, le résultat intermédiaire, l'information brute, est obtenu à l'issue de l'étape de détection. L'information brute consiste en un ensemble d'images Aop(m,n), représentant pour la distribution lumineuse o, l'image issue du canal de détection p.
Comme dans un microscope confocal, le processus de mesure analyse un volume de petite taille dans un objet de taille beaucoup plus grande. Il nécessitera donc l'ajout de modules supplémentaires, similaires à ceux d'un microscope confocal incluant un processus de balayage, un module logiciel d'intégration, d'analyse et de visualisation des données ponctuelles en surfaces et/ou en objets tridimensionnels.
En termes mathématiques l'algorithmique résout un problème inverse ou d'estimation de paramètres. Les équations du modèle sont connues et l'on dispose d'un modèle a priori, paramétrique ou non, sur la configuration des nanoémetteurs. Le modèle le plus naturel consiste à supposer un faible nombre de nanoémetteurs (objet parcimonieux), mais on peut également utiliser des modèles continus, supposant la présence de structures unidimensionnelles (lignes, courbes) ou de motifs spécifiques. On peut alors utiliser l'ensemble des procédures
mathématiques connues de l'Homme du métier pour la résolution de problèmes inverses ou l'estimation de paramètres. Nous décrivons ultérieurement un exemple d'algorithmique adapté spécifiquement à la mesure selon un mode de réalisation de l'invention.
De plus, nous présentons, pour sa valeur emblématique, une solution nouvelle du problème de la discrimination de deux points positionnés à faible distance l'un de l'autre. Ce problème, étudié par Lord Rayleigh, est la base du critère de résolution dans de nombreux domaines de l'Optique.
Il a ainsi été décrit, de manière assez large, les caractéristiques des modes de réalisation de l'invention afin que la description détaillée de celle-ci puisse être mieux comprise, et afin que la présente contribution à l'art puisse être mieux appréciée. De nombreuses fonctionnalités supplémentaires de l'invention seront décrites ci-après.
SYSTÈME
Plateforme matérielle et algorithmique
Un mode de réalisation de l'invention est une plateforme matérielle et algorithmique, référencée comme la plateforme SRCDP, 500, illustré à la Figure 5.
La plateforme SRCDP, 500, implémente la méthode selon un mode de réalisation de l'invention, soit en combinant les deux méthodes PSIT et PDOS, originale ou modifiée, décrites ci-dessus, soit en utilisant les techniques STED, soit en combinant les techniques STED avec les méthodes PSIT ou PDOS, originale ou modifiée.
Dans un des modes de réalisation, la plateforme SRCDP observe, Figure 5, un échantillon biologique, 1 1, intégrant un ensemble de nanoémetteurs. Le résultat de l'observation de l'échantillon biologique par la plateforme SRCDP est l'acquisition d'information de
superrésolution, représentative de l'échantillon observé.
La plateforme SRCDP, 500, Figure 5, comprend principalement :
Dans sa partie matérielle :
• Un microscope confocal 200, adapté ou optimisé, similaire au microscope confocal, décrit antérieurement, et comprenant l'ensemble des composants adéquats, tel que décrit antérieurement
• Deux modules optiques nouveaux et complémentaires, montés sur un microscope
standard. Les deux modules optiques nouveaux sont les modules optiques LatSRCS, 700, et LongSRCS, 800, décrit en détails ultérieurement en se référant aux Figures 6 et 8, respectivement. Le module optique LatSRCS 700, implémente les étapes d'illumination nécessaires à l'implémentation de la méthode PSIT selon un mode de réalisation de l'invention. Alternativement, le module optique LatSRCS 700, implémente les étapes d'illumination nécessaires à l'implémentation d'une technique STED ou RELSOFT, selon un autre mode de réalisation de l'invention. Le module optique LongSRCS, original ou modifié, 800, implémente les étapes de distribution de l'intensité lumineuse émergente en une pluralité d'images de la méthode PDOS ou, implémente la variation de la PSF émergente, en fonction de paramètres latéraux ou axiaux, selon un mode de réalisation de l'invention et,
• le module algorithmique SRCDA, 600, capable, à partir des images créées par la
plateforme SRCDP de reconstruire l'information de superrésolution de l'échantillon biologique.
• D'autres éléments auxiliaires, tels que l'ordinateur 66 et le logiciel 67, peuvent être
nécessaires à la réalisation de la plateforme,
Module de détection
En microscopie confocale à balayage le détecteur est un détecteur constitué d'un seul élément comme un PMT ou un SPAD. Le temps d'acquisition du détecteur est déterminé par le mécanisme de balayage.
Un module de détection amélioré, 65, peut être mis en œuvre en utilisant des détecteurs de petite taille à faible nombre de pixels. Un tel module n'aurait pas été réalisable il y a dix ou vingt ans, en raison de l'absence de technologies adéquates. Aujourd'hui, les détecteurs de petite taille à faible nombre de pixels, à cadence élevée, avec des caractéristiques de faible bruit, sont disponibles sur la base de plusieurs technologies. Des matrices de SPAD avec un faible nombre de pixels, comme 32 * 32, ont été démontré récemment avec des taux d'acquisition jusqu'à 1 MHz. Le module détecteur amélioré, 65, peut également être mis en œuvre à l'aide de CCD, EMCCD ou capteurs CMOS. Des capteurs CCD, CMOS ou EMCCD avec un faible nombre de pixels existent ou peuvent être conçus spécifiquement. En outre, les détecteurs CCD, CMOS EMCCD peuvent être utilisés en utilisant des fonctionnalités de région d'intérêt, de sous-fenêtrage ou de «binning», des modes « crop » ou « fast kinetics », disponibles pour certains détecteurs.
Les informations spatio-temporelles référencées ici sont la position et le temps de l'impact de chaque photon fluorescent. Dans les systèmes réels, l'information spatio-temporelle est corrompue par le bruit du détecteur, ce qui crée des photons erronés, et par l'inefficacité de détection, ce qui crée des photons qui ne sont pas détectés, réduisant les performances. Dans les matrices de SPAD, pour chaque photon, le pixel qui l'a détecté et le temps d'impact sont reçus, à savoir l'information spatio-temporelle complète est disponible. Pour des détecteurs CCD, CMOS ou EMCCD, l'acquisition de plusieurs trames est nécessaire pour approximer l'information spatio-temporelle.
Dans plusieurs implémentations nous ferons référence à des détecteurs séparés; dans de très nombreux cas les détecteurs pourront être soit physiquement séparés soit consistant en des zones différentes sur un même détecteur, soit une combinaison des deux cas précédents.
Module de contrôle
En référence à la Figure 1 1 et à la Figure 5, dans un mode de réalisation préféré de cette invention, les différents éléments de contrôle intégrés dans la plateforme SRCDP, 500 seront décrits :
Le Module de contrôle, 1 100, à l'aide de la procédure systémique de contrôle, 1101, contrôle et modifie les paramètres optiques de la plateforme SRCDP, 500, les paramètres électroniques de l'ensemble de détection amélioré, 65, et les paramètres mathématiques des procédures algorithmiques SRCDA, 900, pour optimiser l'information émergente, suivant des critères définis par le système ou par l'utilisateur. Le contrôle est réalisé en faisant varier les systèmes de contrôle 1 102, 1 103 et 1 104, des différents éléments de la plateforme, 600, 800 et 900. Le système de contrôle, 1 100, utilisera aussi, si elles sont disponibles des informations externes, 1 105, relayées par le support informatique. Remarque : 1 105 n'est pas présent sur la Figure 1 1
Il est entendu que l'invention n'est pas limitée dans son application aux détails énoncés dans la description contenue dans les présentes ou illustrés dans les dessins. L'invention est capable d'autres modes de réalisation et d'être pratiquée et effectuée de diverses manières. L'Homme de l'Art comprendra aisément que diverses modifications et changements peuvent être appliquées aux modes de réalisation de l'invention tel que décrit précédemment sans sortir du champ de cette invention
Algorithmique SRCDA
L'algorithmique de reconstruction que nous allons détailler s'applique non seulement dans le cas d'un champ donné analysé à l'aide des méthodes PSIT et PDOS, mais également dans le cas où les mesures obtenues par les méthodes PSIT et PDOS sont enrichies de mesures
supplémentaires, utilisant d'autres modalités de Microscopie. Par exemple, des mesures en microscopie confocale ou à champ large, aux mêmes positions latérales ou axiales, ou à des positions différentes peuvent être réalisées pour caler certains paramètres du modèle de la scène. Dans le cas de la microscopie confocale, le modèle direct est enrichi par le fait qu'un
recouvrement entre les différentes positions des signaux projetés permet de prendre en compte, en un point donné, plus de mesures. La prise en compte de signaux projetés décalés n'apporte néanmoins aucune complexité supplémentaire, puisque ces signaux décalés ne font que s'ajouter à la liste des signaux projetés.
On se réfère maintenant à la figure 9, qui est une illustration schématique simplifiée 900 d'une méthode d'algorithme de superrésolution de données de fluorophore, conformément à un mode de réalisation de la présente invention.
Une procédure d'algorithme, présenté dans la figure. 9, quantifie le nombre de fluorophores, récupère les attributs de chaque fluorophore et quantifie la précision de chaque paramètre de sortie.
La procédure de prétraitement, 1 11, réorganise l'information spatio-temporelle, 1 10, dans des ensembles d'images de superrésolution, 112. Cette opération peut être effectuée en utilisant une procédure banque de filtres. L'ensemble de données intermédiaire est alors une petite série de petites images, typiquement de 16 * 16 pixels. La procédure de prétraitement, s'applique sur un petit nombre d'éléments spatio-temporelles de l'ordre de quelques milliers, il peut être effectuée en temps réel et utilisant du matériel informatique existant.
La procédure de descripteur, 1 13, l'étape principale du calcul, crée à partir de chaque image, un ensemble de descripteurs, 1 14, et leur pertinence statistique. Les descripteurs comprennent, mais ne sont pas limités à : l'intensité de chaque image, la présence, à l'image d'une répartition de la lumière et sa caractérisation comme une distribution régulière ou un vortex, son centre de gravité et ses moments d'ordre un et plus.
La troisième étape est une opération de filtrage, 1 15, dans lequel seuls les descripteurs, qui sont statistiquement pertinents, sont conservés.
L'opération de classification, 116, est la dernière étape de l'algorithme. L'algorithme est capable de reconnaître, sur la base de l'ensemble des descripteurs, 1 14, et une base de
connaissances, 1 17, les différents cas de mesure comme un fluorophore unique, deux fluorophores séparés longitudinalement ou latéralement et trois ou plusieurs fluorophores.
L'algorithmique SRCDA peut utiliser les techniques classiques des problèmes inverses. Toutefois, trois approches algorithmiques nouvelles, l'algorithme MAP modifié, l'algorithme E- LSE et l'algorithme ICE sont décrits dans cette demande de brevet d'invention et sont réputées faire partie de cette invention.
MODULES OPTIQUES
Module optique LatSRCS implémentant la méthode PSIT
Nous décrivons, en se référant à la figure 6a, un module optique selon un mode de réalisation de l'invention, le module optique LatSRCS, 700, et sa fonction spécifique en microscopie. Le module optique, LatSRCS, 700 selon ce mode de réalisation, est un module optique, projetant sur une pluralité de nanoémetteurs d'un échantillon, une séquence de distributions lumineuses compactes de topologie différente. Chaque nanoémetteur fluoresce avec une séquence d'intensités fluorescentes lumineuses dépendant de l'intensité incidente sur le nanoémetteur et caractérisant la position latérale du nanoémetteur. Dans la plupart des modes de réalisation, les distributions lumineuses compactes de topologies différentes sont créées par l'interférence, avec des amplitudes et phases variables entre une onde régulière et une onde singulière. Dans le mode de réalisation préféré, les ondes régulière et singulière sont créées par un cristal conique mince.
Le module optique LatSRCS, 700, est positionné dans la voie d'éclairage du microscope confocal 200 ; il projette une séquence de distributions lumineuses compactes de topologies différentes sur l'échantillon 11 en utilisant l'objectif du microscope confocal 200. Dans un mode de réalisation utilisant la diffraction conique, l'intensité incidente à une position spécifique sur l'échantillon 1 1 sera proportionnelle, pour chaque distribution lumineuse, à une combinaison spécifique des paramètres de Stokes.
Le module optique LatSRCS, 700, utilise une fonctionnalité inhérente, décrite précédemment, spécifique au nanoémetteur, qui échantillonne l'intensité lumineuse incidente à sa position précise (du nanoémetteur) et réémet une lumière fluorescente dépendante de la lumière incidente. Il est remarquable que l'information mesurée soit directement liée à la position du nanoémetteur à l'intérieur de la distribution lumineuse compacte. Cette information est figée par la fonctionnalité du nanoémetteur, sa propriété d'absorber et de réémettre la lumière, qui rompent la chaîne optique. Cette information est portée par la lumière fluorescente, sous forme d'une distribution lumineuse émergente, récupérable par un ensemble de détection 65.
Si la lumière incidente varie dans le temps en fonction d'une séquence de distributions lumineuses compactes de topologies différentes, l'intensité de la lumière fluorescente réémise varie dans les mêmes proportions. La séquence de la lumière fluorescente réémise sera proportionnelle à la séquence des distributions lumineuses compactes de topologies différentes. A partir de cette information, il est possible de récupérer la position du nanoémetteur, comme expliqué ci-dessous.
La méthode PSIT selon des modes de réalisation de l'invention fait référence à la projection d'une séquence de distributions lumineuses compactes de topologies différentes dans un microscope, l'interaction avec l'objet parcimonieux ou l'objet continu, la collecte de la lumière réémise par l'objectif du microscope, 22, la détection de la lumière, fluorescente ou non, par l'ensemble de détection amélioré 65, et l'analyse de l'information par un algorithme approprié. Dans certains modes de réalisation, l'ensemble de détection amélioré, 65, se compose d'un détecteur unique, et ne récupère que l'intensité globale en fonction du temps, tandis que dans d'autres modes de réalisation, l'ensemble de détection amélioré se compose d'une petite zone de pixels et récupère aussi la répartition spatiale de la lumière fluorescente. L'ensemble des informations récupérées, consistant en une pluralité d'images, désigné comme les images latérales de superrésolution.
Dans un des modes de réalisation, la contribution d'un nanoémetteur positionné dans le volume éclairé à une image latérale de superrésolution spécifique est proportionnelle à une combinaison des paramètres de Stokes de la lumière incidente à la position du nanoémetteur.
Cette information nouvelle permet d'affiner la position des nanoémetteurs ou la distribution spatiale de l'objet continu, de quantifier le nombre de nanoémetteurs présents dans le volume éclairé et de différencier plusieurs nanoémetteurs présents dans le même volume.
On se réfère maintenant à la figure 6a, qui est une illustration schématique simplifiée d'un module optique LatSRCS, 700, conformément à un mode de réalisation de la présente invention.
La figure 6a représente un module optique, LatSRCS, 700, il inclut tous les composants du module de diffraction conique, de la figure 3, qui sont mis en œuvre de la même manière que dans le module de diffraction conique 300. L'optique de la source lumineuse du microscope confocal à balayage est supposée être achromatique et en conjugaison infinie, même si d'autres conditions peuvent être adaptées en utilisant une optique auxiliaire. La lumière incidente, entrant depuis la source lumineuse est parallèle, 30. Le module optique 700 lui-même comprend une première lentille, 31, un achromatique 32, ou un sous-ensemble réalisant achromatiquement la
fonctionnalité d'un cristal conique comme explicité précédemment, et une seconde lentille 33; un polariseur partiel, 29, décrit ci-dessus, peut également être ajouté. Les deux premières lentilles, 31 et 33, sont configurées de préférence sous forme d'un télescope de Kepler de rapport 1 :1 ; le plan d'imagerie conique, 35, est placé au plan focal commun des lentilles 31 et 33. L'ouverture numérique de la première lentille, 31, détermine les paramètres de l'effet de diffraction conique à travers le rayon normalisé conique, définies ci-dessous. Le second objectif, 33, restaure le parallélisme de la lumière, pour l'injecter au microscope. Il comprend en outre un sous-module de contrôle de polarisation, 71, comprenant, par exemple, une lame quart d'onde tournante, une paire de valves de lumière à cristaux liquides, une cellule de Pockels ou Kerr, 72, et un analyseur 73. L'information des paramètres de Stokes peut être transformée en information séquentielle, à travers une séquence de distributions lumineuses spatialement différenciés, et portant des informations séquentielles, comme décrit ci-dessus.
Module optique LongSRCS modifié de mise en forme du faisceau d'émission
Nous-présentons de plus, le module LongSRCS modifié, un module optique de mise en forme du faisceau d'émission, pour la localisation axiale et/ou latérale de nanoémetteurs. Ce module implémente une méthode PDOS à un seul canal, dans laquelle la variation d'un des paramètres décrivant la distribution créée est utilisée pour mesurer les paramètres axiaux ou latéraux. Les paramètres utilisés peuvent être soit un paramètre d'angle pour une distribution à variation axiale hélicoïdale, soit le rapport entre les lobes de la distribution - pour une distribution à deux lobes (ou plus) à variation axiale. Ce module a une certaine similarité avec le module LongSRCS original, décrit par un des inventeurs en [37], mais s'en différencie par le fait que la variation de la topologie de la distribution créée est utilisée pour mesurer les paramètres axiaux ou latéraux et non par un rapport d'intensité entre deux détecteurs, comme décrit dans la version originale du module LongSRCS, [37]. Ce module, comme le module original, a des applications comme module complémentaire du module LatSRCS, mais aussi pour la localisation axiale de nanoémetteurs, par exemple pour les modalités de localisation, telles que par exemple, les modalités PALM, STORM ou GSDIM ou similaires.
Le cas où la polarisation d'entrée et la polarisation de sortie sont elliptiques avec une orientation des grands axes de chaque ellipse ayant un angle de 90° entre eux est traité plus en détails. Parmi les distributions générées dans ces conditions, certaines présentent d'importantes variations axiales, et ces variations peuvent être exploitées pour mesurer la position d'un émetteur avec une grande précision axiale.
Nous séparons ces distributions en deux groupes, les distributions qui présentent un seul lobe et celles présentant deux lobes. Les distributions avec un seul lobe présentent un effet de rotation dans le plan dépendant de l'axe Z, effet spirale. Ainsi, les distributions Stokes, réalisées à partir d'une polarisation linéaire (ellipticité =0°) et une polarisation circulaire (ellipticité = 45°) présentent des variations qui apparaissent dans le tableau ci-dessous. En utilisant un algorithme approprié, l'orientation de la distribution peut être détectée et la position de l'émetteur déduite avec une grande précision axiale, (figure 7c).
De plus, certaines distributions lumineuses élémentaires plus complexes, consistant en des superpositions plus complexes d'ondes, existent avec une forte dépendance longitudinale ; par exemple les « spots tridimensionnels obscurs » décrits par Zhang, [29], créent un spot noir entouré en trois dimensions par une sphère lumineuse. Ces « spots tridimensionnels obscurs » consistent en une superposition de fonctions de Laguerre-Gauss, qui peuvent être réalisés à l'intérieur d'une cavité laser ou à l'aide d'un hologramme ou d'une plaque de phase, comme suggéré par Zhang ou à l'aide de cristaux coniques ou uniaxes comme le suggère l'inventeur dans [37].
Localisation 3D
Certaines distributions avec deux lobes ou plus, présentent un effet de décalage des deux lobes selon l'axe Z. Ainsi, les distributions dites demi-lunes décalées, réalisées à partir de deux polarisations elliptiques orientées à 90° mais avec la même ellipticité présentent des variations. En utilisant un algorithme approprié, la position de l'émetteur peut être déduite avec une grande précision axiale par une mesure du rapport d'intensité entre les lobes cette variation étant illustrée dans la Figure 7d. Cette localisation 3D peut être utilisée soit en projection, c'est-à-dire en projetant une, ou plusieurs distributions à demi-lune décalées sur l'objet et en utilisant un algorithme adapté, par exemple les algorithmes décrits dans cette invention, soit en émission en faisant passer la lumière émise à travers un module optique créant cette distribution et en analysant la PSF de retour. La distribution « dark hélix » présentent un effet de rotation de l'axe reliant les deux zéros selon l'axe Z. . En utilisant un algorithme approprié, la position de l'émetteur peut être déduite avec une grande précision axiale par une mesure de l'axe reliant les deux zéros. Cette localisation 3D peut être utilisée soit en projection, c'est-à-dire en projetant une, ou plusieurs distributions à demi-lune décalées sur l'objet et en utilisant un algorithme adapté, par exemple les algorithmes décrits dans cette invention, soit en émission en faisant passer la lumière émise à travers un module optique créant cette distribution et en analysant la PSF de retour.
Aberration sphérique
Dans le cadre de la microscopie optique en fluorescence, ou de tout système optique dans lequel l'illumination de l'échantillon est découplée de l'imagerie de l'échantillon, nous proposons une invention qui permet d'évaluer l'aberration sphérique localement dans chaque lieu de l'échantillon, ou chaque lieu de l'objet que l'on image. ^
Nous savons que le faisceau d'illumination peut être mis en forme en utilisant la diffraction conique et ses effets de phase et polarisation. L'échantillon est alors illuminé avec une distribution lumineuse non uniforme, qui peut également être une sphère noire (ou top hat) de sorte que la distribution en 3D présente deux lobes de même intensité en dessous et au-dessus du plan focal. En présence d'aberration sphérique dans le système, ces deux lobes ne sont pas de même intensité. On peut alors utiliser cet effet pour prendre une image, en particulier une image confocale, en illuminant au-dessus et au-dessous du plan focal (en découplant l'illumination et l'imagerie). En analysant ensuite le rapport d'intensité des deux images, on peut e déduire la quantité d'aberration sphérique du système.
Une autre approche de mesure de l'aberration sphérique utilise une autre variante des systèmes basés sur la diffraction conique.
Détermination a priori et mesure de l'aberration sphérique
La mise en forme d'un faisceau lumineux par diffraction conique à travers une cascade de cristaux permet d'obtenir une distribution d'intensité reliée directement à l'aberration sphérique.
Cette distribution est obtenue entre polariseurs linéaires croisés et deux cristaux biaxes dont les axes optiques sont alignés. Une lame demi-onde est insérée entre les deux cristaux. De par sa forme caractéristique, cette distribution sera appelée « trèfle à quatre feuilles » ou « four-leaf- clover » en anglais. En l'absence d'aberration sphérique, cette distribution se compose de quatre lobes parfaitement égaux et tous au même focus.
On se réfère à la Figure 12 qui décrit la rupture de symétrie créée dans une distribution « Four-leaf-clover » en présence d'aberration sphérique. La Figure 12 présente les distributions simulées sous Matlab pour différentes valeurs de défocus et d'aberration sphérique. L'aberration sphérique induite par un système optique rompt la symétrie de cette distribution à la fois dans le focus et la répartition d'intensité dans les quatre lobes comme on peut les voir dans les figures ci- dessous représentant la distribution « Four-leaf-clover » à différentes valeurs d'aberration sphérique. Une simple observation qualitative permet un test binaire présence/absence d'aberration sphérique. Une mesure fine de la valeur d'aberration sphérique est possible par un estimateur de décalage de focus des lobes et des ratios d'intensité à différents plans de focalisation.
Calibrage en temps réel d'un système de balayage de faisceau par suivi de point généré par une diode laser proche infrarouge
Le système optique décrit dans cette invention peut incorporer un module permettant de suivre en temps réel sur une caméra un point scanné par un système de balayage de faisceau (miroirs galvanométriques, miroir piézo-électrique bidirectionnel ou tout autre système). En utilisant une longueur d'onde dans le proche infrarouge, on s'affranchit des effets chromatiques des optiques ce qui rend ce système utilisable pour le calibrage de plusieurs longueurs d'onde projetées dans un microscope confocal. De plus en utilisant une diode laser dans le proche infrarouge on s'assure également qu'un faible passage du laser de calibrage dans le microscope n'aura qu'un effet très marginal, la longueur d'onde étant bien supérieure aux longueurs d'onde d'excitation usuelles de la fluorescence.
Toute ces variantes sont réputées faire partie de l'invention. L'inventeur a pourtant choisi, dans certaines implémentations de séparer en deux modules optiques disjoints mais
complémentaires les mesures latérales des mesures longitudinales pour réduire la complexité de chacun des modules complémentaires.
ALGORITHME SRCDA
Système multi-images et algorithmes de reconstruction
Nous référencerons sous le nom de système multi-images, l'ensemble des systèmes optiques et optoélectroniques, dans lequel un ensemble d'images différentes et différenciées, issues de la même région spatiale de l'objet, bidimensionnelle ou tridimensionnelle - sont enregistrées et analysées à travers un algorithme adéquat pour analyser la distribution spatiale - et/ou spectrale - de la région spatiale émettrice. Cette différentiation peut être due à la projection d'illumination spatialement différentes, tel que décrit précédemment ; elle peut aussi être due à une variation du contenu spectral de l'illumination; elle peut aussi être due à un mouvement naturel ou imposé de l'extérieur des objets. Enfin elle peut être due à une variation stochastique du contenu de la région spatiale de l'objet, bidimensionnelle ou tridimensionnelle, à travers un effet stochastique naturel ou imposé, tel que les systèmes utilisés dans la superrésolution basée sur la détection stochastique, incluant les processus PALM et STORM et leurs innombrables variantes, portant chacune un acronyme différent.
D'autres moyens de différenciation des images de la même région spatiale émettrice sont connus de l'Homme de l'Art et sont réputées faire partie intégrante de cette invention.
Nous référencerons sous le nom de système multi-images incluant l'algorithme de reconstruction E-LSE, un système multi-images utilisant l'algorithme E-LSE décrit ci-dessous
Algorithme de reconstruction MAP modifié
Cet algorithme se différencie des algorithmes existants dans la littérature connus de l'Homme de l'Art, en présentant les caractéristiques mathématiques suivantes dont la combinaison est nouvelle et diffère des approches MAP traditionnelles:
• formulation bayésienne
• pas d'à priori sur la reconstruction, hormis la positivité (contrairement aux approches MAP traditionnelles, qui en général incorporent un a priori de régularité sur la reconstruction, de type variation totale par exemple)
• la modélisation du bruit de Poisson conduit à un terme d'attache aux données qui s'écrit sous la forme d'une divergence de Csiszar (résultat bien connu)
• la loi a posteriori est exploitée par un MAP, c'est-à-dire que l'on cherche la reconstruction de probabilité maximale (on doit donc résoudre numériquement un problème de minimisation d'énergie, ce qui se fait avec une approche itérative de type descente de gradient)
• introduction dans le modèle d'un facteur de gain de résolution (facteur de suréchantillonnage de la reconstruction par rapport à la résolution des images acquises)
• imposition d'une contrainte de "bon échantillonnage" pour la reconstruction (les plus hautes fréquences du spectre de la reconstruction sont forcées à 0) • introduction d'un facteur de « pinhole » (confocal numérique)
Algorithme de reconstruction E-LSE
L'algorithme proposé permet, à partir des images enregistrées par la caméra (ou les caméras) suite à l'excitation de l'échantillon par l'ensemble des illuminations choisies, de reconstruire une image à haute résolution, bidimensionnelle ou tridimensionnelle, de l'échantillon. Cet algorithme repose sur la combinaison de plusieurs principes:
la formulation de la reconstruction comme un problème inverse bayésien qui conduit à la définition d'une distribution a posteriori. Cette loi a posteriori combine, grâce à la loi de Bayes, la formulation probabiliste du modèle de bruit (bruit de Poisson inhérent à la nature quantique de l'émission de photons, auquel vient éventuellement se superposer la modélisation des autres sources de bruits, notamment le bruit de lecture de la caméra), ainsi que d'éventuels a priori (positivité, régularité, etc.) sur la distribution de lumière dans l'échantillon;
- - L'algorithme E-LSE utilise la même formulation bayésienne que l'algorithme MAP modifié, décrit précédemment, mais exploite différemment (de façon plus complète) la loi a posteriori : en effet, on calcule la moyenne de la loi a posteriori et non son point de valeur maximale (ce qui est connu pour être plus adapté pour les problèmes de grande dimension). Cette approche, envisagée par Besag en 1984 [30], a été récemment mise en œuvre numériquement dans le cas du débruitage d'image avec un a priori de type variation totale [31,32];
l'utilisation de nuées d'émetteurs ponctuels ou à géométrie simple, qui permet de favoriser les solutions parcimonieuses (échantillons à nombre limité d'émetteurs, ou dont les émetteurs sont concentrés sur des structures de petite dimension comme des courbes, ou des surfaces dans le cas tridimensionnel (on calcule donc en fait la moyenne de la loi a posteriori avec un a priori parcimonieux sur la solution);
Le fait d'utiliser la moyenne de la loi a posteriori (et non son point de valeur maximal) permet d'obtenir une faible dépendance au nombre d'émetteurs utilisés : il n'est donc pas nécessaire que le nombre d'émetteurs utilisés corresponde aux nombre de fluorophores effectivement activés dans l'échantillon ;
l'estimation de la moyenne a posteriori au moyen d'un algorithme de type Monte-Carlo Markov Chain (MCMC) [33,34], comme dans les références [31,32] mentionnées plus haut.
Selon un mode de réalisation de l'algorithme, l'a priori de parcimonie par l'utilisation d'un nombre restreint d'émetteurs n'est pas utilisé et la moyenne de la distribution a posteriori est calculée sur l'ensemble des images possibles comme dans [31,32]. Bruit de Poisson
Dans le mode de réalisation standard, où seul le bruit de Poisson est modélisé, la densité de la loi de probabilité a posteriori s'écrit sous la forme
ρ(*, Λ) = Ι β -Είχ,λ (EQ. 9) »
où Z est une constante de normalisation - et non l'axe de propagation de la lumière - qui n'intervient pas dans l'algorithme, et
E (x, X) = ! "; (½- y) -™; (y) log l B + ^ kut {xk, y) (EQ. 10)
La nuée d'émetteurs est ici représentée par le vecteurs x=(xi,X2,...xn) (n positions discrètes dans le domaine de l'image haute résolution à reconstruire) et le vecteur
Figure imgf000064_0001
qui code les intensités des émetteurs situés aux points xi,X2,...xn. Chaque quantité de type u,(x,y) est déterminée lors de l'étape de calibration : elle représente l'intensité émise au pixel y de la caméra par un émetteur situé au pixel x de l'image haute résolution, en réponse à une illumination d'indice i (i code donc ici à la fois la position du signal d'illumination, mais aussi sa forme). Le réel positif B correspond à l'intensité du fond continu, qui résulte en général à la fois de l'échantillon (fluorescence diffuse par exemple) mais aussi du capteur. Enfin, les quantités rm(y) correspondent simplement aux mesures (images enregistrées par la caméra) : m,(y) est l'intensité mesurée au pixel y de l'image d'indice , c'est-à-dire l'image enregistrée après illumination d'indice ).
L'algorithme proposé consiste à faire évoluer les émetteurs représentés par les vecteurs x et X en accord avec la loi donnée par la densité ρ(χ,λ). L'algorithme est itératif: à chaque itération, l'un des émetteurs est perturbé (en position ou en intensité) et cette perturbation est acceptée ou non selon le principe de l'algorithme de Metropolis-Hastings [3]. L'image reconstruite est obtenue en moyennant, avec un poids égal pour chaque itération, les émetteurs ainsi construits. Si x, et j correspondent respectivement à la position et à l'intensité des émetteurs à l'itération j de l'algorithme, alors l'image / reconstruite après N itérations est donnée par
Figure imgf000064_0002
Plusieurs améliorations peuvent être apportées à cet algorithme: l'instauration d'une étape de burn-in (les premières itérations ne sont pas utilisées dans la reconstruction), l'optimisation de l'initialisation des émetteurs, l'optimisation des perturbations effectuées à chaque itération (loi de proposition), l'utilisation d'une étape de post-filtrage (par exemple un léger flou gaussien), etc.
Les résultats de l'algorithme peuvent être transmis à l'utilisateur soit sous forme d'une image soit sous forme de données numériques ou graphiques. Le même algorithme de reconstruction, peut être utilisé dans une seconde version incluant un ensemble de paramètres supplémentaires décrivant des paramètres globaux de région spatiale de l'objet soit connus a priori soit déterminés à postériori.
Cet algorithme, dans ses deux versions, peut être utilisé dans l'ensemble des systèmes multi- images, dans lesquels un ensemble d'images différentes et différenciées, issues de la même région spatiale de l'objet, bidimensionnelle ou tridimensionnelle - sont enregistrées et analysées.
Algorithme E-LSE dynamique
De plus, dans une variante de cet algorithme, l'algorithme E-LSE dynamique, la vitesse des émetteurs peut être prise en compte.
Lors de l'observation d'échantillons dynamiques, il est possible d'incorporer simplement dans l'algorithme E-LSE la vitesse des objets observés, soit individuellement pour chacun des émetteurs, soit en définissant des populations d'émetteurs ayant des vitesses différentes. Dans le cas de l'imagerie dite « time lapse » (c'est-à-dire des observations successives dans le temps du même échantillon), cela peut être réalisé naturellement en forçant la reconstruction simultanée des images successives à partir d'émetteurs mobiles paramétrés par leur position initiale et leur vitesse. Dans le cas de l'acquisition d'une seule image, il est également possible de prendre en compte le caractère dynamique de la scène à travers son impact sur la PSF de retour (flou de bougé), dont la déformation est corrélée avec l'observation multiple d'un même émetteur. Le recouvrement, « overlap » des différentes micro-images obtenues lors du scan fait qu'un même émetteur est sollicité lors de l'acquisition de plusieurs micro-images (à des instants différents, en raison de la composante temporelle du balayage).
Algorithme ICE
L'algorithme ICE a été récemment introduit pour le débruitage d'images dans le cas d'une régularisation par variation totale [39]. L'algorithme ICE peut également être utilisé pour résoudre des problèmes inverses plus complexes (deblurring, interpolation). Cet algorithme de type point fixe converge très rapidement, et la solution obtenue est extrêmement proche de celle associée à l'algorithme LSE pour ce problème. Le principe de l'algorithme ICE est de remplacer le calcul de l'espérance de la loi a posteriori effectué par LSE par l'itération du calcul explicite de la moyenne de la loi a posteriori d'un pixel conditionnel lement à ses voisins. Toutefois, l'application de l'algorithme ICE aux problèmes inverses pour une image ou pour un système multi-image doit être démontrée.
Calibration
Les algorithmes SRCDA utilisent, dans de nombreux cas, en entrée les mesures effectuées sur l'échantillon, mais également des données inhérentes au système qui sont basées soit sur des valeurs théoriques, soit sur des valeurs obtenues après une étape dite de caiibration. Dans cette étape, des mesures sont effectuées sur un échantillon de référence afin de mesurer précisément les fonctions d'illumination et la fonction de Transfert de retour (PSF) du système optique.
Spécificités et avantages des différents algorithmes SRCDA
Les différents algorithmes SRCDA, décrits précédemment, présentent les différenciations et avantages suivants par rapport à l'Etat de l'Art :
MAP modifié:
• production d'images naturellement bien échantillonnées grâce à l'introduction du gain de résolution et au forçage à 0 des plus hautes fréquences (limite les artefacts de type « night sky »)
• bon compromis entre une complexité algorithmique maîtrisée (qui permet de maintenir des temps de calcul acceptables) et une bonne qualité de la reconstruction (résolution du problème inverse par optimisation non-linéaire, plus intéressant que l'emploi de méthodes linéaires de type « reassignment » [40] par exemple)
E-LSE:
• introduction de l'hypothèse de parcimonie sous une forme souple (faible sensibilité au nombre d'émetteurs)
• reconstructions de très bonne qualité, en particulier pour des échantillons parcimonieux
• capacité de la méthode à s'adapter à la quantité d'information locale, bonne gestion des incertitudes de reconstruction (phénomène de moyennage en cas d'interprétation multiple possible)
• possibilité de modéliser la parcimonie différemment selon des a priori sur l'échantillon observé (utilisation d'émetteurs de type point, segment, courbe, surface, etc., de façon exclusive ou en combinaison)
Algorithme du processus optique composé
Le processus optique composé selon au moins un mode de réalisation de l'invention est un complément logique de l'algorithme SRCDA. En effet, la reconstruction obtenue par l'algorithme SRCDA peut mener à la conclusion qu'une image supplémentaire permettrait d'améliorer les performances de la mesure. La plateforme de microscopie SRCDP permet l'acquisition d'une - ou plusieurs - images complémentaires choisies dans un ensemble de distributions lumineuses des méthodes PSIT ou PDOS. Résolution, parcimonie, topologie de l'illumination et positivité
La capacité de dépasser la limite de résolution, pour des nanoémetteurs, en utilisant les méthodes PSIT, basée sur les topologies spécifiques de certaines illuminations créées par ces méthodes avait déjà était décrite par un des inventeurs dans la référence [37] et est décrite de nouveau dans le prochain paragraphe.
Plus généralement, un système de microscopie n'utilisant pas d'effet non-linéaire est limité, dans le cas général, à facteur de superrésolution de 2 par rapport à la limite imposée par la diffraction optique [38] et [41]. Mais dans le cas d'une scène parcimonieuse (support réel de l'échantillon sensiblement inférieur à la taille de la zone imagée, par exemple dans le cas de scènes composées de filaments et/ou de sources ponctuelles), et en l'absence d'un fond continu trop important (de sorte qu'une contrainte de positivité sur l'image reconstruite soit efficace), il commence à être reconnu que cette limite de 2 n'est plus valable et peut être dépassée [42 - 44]. Un exemple évident est donné par le cas de l'observation d'une seule source ponctuelle, même en utilisant une seule image: dans ce cas, la résolution atteignable pour l'image reconstruite (c'est-à- dire la précision avec laquelle la source peut être localisée) n'est pas limitée par la diffraction optique mais par la quantité de photons (plus précisément, par le rapport signal sur bruit de la mesure).
Dans la méthode PSIT, sur la base de l'acquisition de plusieurs images de topologies différentes utilisées dans cette méthode, un des inventeurs, [37], avait montré la capacité d'étendre cette absence de limite intrinsèque de résolution, remplacée par une limite de résolution liée au rapport Signal sur Bruit, au cas de la détection de deux points proches (critère de Rayleigh) et de la mesure de leur position. Cette démonstration peut être étendue, par des modifications simples, au cas de trois points, non positionnés sur une droite. Cette démonstration est reprise dans un prochain paragraphe. Cette démonstration se base sur un nouveau mécanisme de mesure de position, décrit dans le prochain paragraphe, qui est différent et complémentaire de méthode du centroïde utilisée dans les systèmes classiques.
Dans le cas de plusieurs sources ponctuelles, dans le cas d'illuminations uniforme, le facteur maximal de superrésolution dépend essentiellement, outre le rapport signal sur bruit, de propriétés de la scène: nombre de sources (par rapport au nombre de mesures), distance minimale entre deux sources, etc [43-44]. Dans la méthode PSIT, le facteur maximal de superrésolution dépendra, outre les facteurs décrits précédemment, des illuminations choisies.
Détection et prise en compte de la lumière hors focus
Le point suivant décrit une étape d'analyse préalable ou simultanée à l'utilisation d'un algorithme de reconstruction pour un système multi-images.
Le principe repose sur l'exploitation d'une des caractéristiques des algorithmes décrits précédemment mais pas seulement, qui est que le signal d'intérêt est localisé principalement là où la lumière d'excitation a été projetée. Il est possible de mesurer la proportion de signal qui appartient bien à la région d'intérêt (pinhole), pour chaque image c'est à dire chaque position laser, chaque distribution lumineuse et chaque orientation de cette distribution lumineuse.
Cette mesure, appelée Pinhole Ratio, consiste dans la méthode que nous décrivons, à comparer dans une région spatiale de l'objet la proportion de photons qui sont réémis et imagés dans la région d'intérêt de chaque image issue de cette région par rapport au nombre total de photons réémis par l'objet dans l'ensemble des images considérées.
Ce ratio donne une information localement sur la nature de l'objet imagé, s'il vérifie un modèle prédéfini (par exemple : objet plan) au sens du Pinhole Ratio, ou s'il dévie fortement de ce modèle.
Le critère défini ici peut prendre des valeurs entre 0 et 1 , ainsi qu'une valeur nominale PR ref dans le cas où l'objet vérifie bien le modèle. Les valeurs inférieures à PR ref sont associées à un objet qui ne vérifie pas totalement ou pas du tout le modèle en fonction d'une règle théorique ou empirique.
Dans le cas où le Pinhole Ratio dévie de la valeur prédite, nous appliquons des paramètres différents à l'algorithme de reconstruction associé.
Il est aussi possible d'utiliser un autre modèle et donc un autre algorithme que l'algorithme initial, par exemple en considérant des mesures complémentaires, ce qui peut nécessiter de remesurer l'objet avec des paramètres ou des distributions lumineuses différentes.
Il est aussi possible de changer d'algorithme et d'ajouter un apriori sur l'objet à reconstruire, par exemple un apriori de régularité comme on en trouve souvent dans les algorithmes de reconstruction (norme ΗΛ1, parcimonie 1Λ1, 1Λ0, variation totale, normes d'ordre supérieur) afin de réduire l'influence des objets hors-modèle présents dans le champ mesuré.
Variabilité de la reconstruction vis-à-vis du bruit de mesure
Nous décrivons ici une étape préalable ou simultanée à l'utilisation d'un algorithme de reconstruction pour un système dont les mesures sont bruitées avec une statistique de bruit de type bruit de Poisson.
Une propriété du bruit de Poisson est la possibilité de générer, à partir d'une réalisation d'une VAR de Poisson de paramètre I (la moyenne), deux réalisations indépendantes d'une VAR de Poisson de paramètre 1/2, grâce à un traitement a posteriori.
Grâce à un procédé de génération de nombres aléatoires ou pseudo-aléatoires, on simule une loi binomiale XI de paramètres (n, p) où n est égal à la mesure de la variable de Poisson initiale, et p un paramètre de séparatation des photons égal à 0,5 dans notre cas.
X ~ P(7)
Χ ~ Bin(X, p siX > 0, X1 = Osinon
X2— X— Xi Mathématiquement, cette propriété est une conséquence de la formule des probabilités totales et de la décomposition en série entière de l'exponentielle sur R.
Au niveau optique, cette propriété illustre le fait connu que si l'on met un miroir séparateur 50/50 devant la caméra qui image la fluorescence, et que l'on place une deuxième caméra pour imager le second faisceau de fluorescence, alors les deux caméras, dans des conditions identiques de prise d'image, acquièrent un signal de moyenne égale à la moitié du signal initial et suivant toujours une loi de Poisson.
L'analyse ou la reconstruction des deux mesures ainsi générées, appelée méthode Split Photon, fournit deux résultats indépendants au sens des probabilités, et les différences entre ces deux résultats illustrent la dépendance de l'algorithme de reconstruction vis-à-vis du bruit de mesure, bien que le rapport signal sur bruit soit plus faible dans chaque mesure générée que dans la mesure d'origine d'un facteur sqrt(2).
Nous utilisons un critère local de comparaison de ces deux reconstructions, ici le critère de similarité locale ou Local Structural Similarity Index Method (LSSIM), mais tout autre critère local ou global de comparaison d'images peut être utilisé.
Lorsque ce critère est mauvais au sens du critère en question, c'est à dire qu'il y a une différence significative entre les deux images ou signaux reconstruits, nous appliquons des paramètres différents dans l'algorithme de reconstruction appliqué aux mesures d'origine.
Il est aussi possible d'utiliser un autre algorithme, comme un algorithme MAP avec contrainte de régularité global ou local, qui utilise la carte de similarité ou tout autre critère de comparaison afin d'optimiser le ou les paramètres de régularisation.
Il est aussi possible de rendre compte de la carte de similarité ou du critère utilisé dans la méthode Split Photon, de manière graphique ou numérique, afin d'illustrer la dépendance locale ou globale de la reconstruction au bruit de mesure.
Il est aussi possible de générer, plutôt qu'un couple de mesures, un n-uplet de mesures, en utilisant plutôt qu'une loi binomiale, une loi multinomiale de paramètres (n, pl, p2 ... pk) où les probibilités de séparation de photon pl, p2 ... pk peuvent être différentes.
Enfin, il est possible d'itérer la méthode Split Photon en générant plusieurs couples ou n-uplets de mesures, toujours par un traitement a posteriori des mesures, mais en modifiant la graine dans le générateur pseudo-aléatoire. Cela produit, dans le cas d'un générateur aléatoire, des couples ou n-uplets de variables de Poisson indépendantes mais les couples ou n-uplets ne sont pas indépendants entre eux. Cela peut permettre de réduire les fausses détections de zones variables ou de zones similaires obtenues avec un seul couple/n-uplet ou un faible nombre de couples/n- uplets. Mesure de position d'un point par la méthode PSIT
La méthode PSIT peut être utilisée comme une technique permettant de mesurer la position d'un nanoémetteur avec une haute précision, en utilisant un mécanisme de mesure différent et complémentaire de la méthode du centroïde.
Considérons un nanoémetteur positionné à la position x,y en coordonnées cartésiennes et p, Θ en coordonnés polaires. Une séquence d'illumination consistant en une onde fondamentale, et un couple de distributions dites « demi-lunes », alignées suivant des axes orthogonaux est projetée sur le nanoémetteur.
La procédure de prétraitement créée deux images :
Une image « top hat » consistant en la somme des trois images de la séquence,
Une image vortex consistant en la somme des deux images demi-lunes.
Un premier descripteur est la position cartésienne calculée à l'aide de l'algorithme du centroide sur l'image « top-hat ».
En se référant à la Figure 10, la position radiale p peut être mesurée univoquement en mesurant un paramètre, pa, égal à l'arc tangente normalisé d'un facteur π, du rapport d'intensité entre l'intensité normalisée émise par le nanoémetteur illuminé par l'onde vortex, Iv, et l'intensité normalisée émise par le nanoémetteur illuminé par l'onde fondamentale, IF. En effet :
• l'intensité normalisée émise par le nanoémetteur illuminé par l'onde fondamentale varie de 1 au centre pour l'onde fondamentale à 0 au rayon d'Airy,
• l'intensité normalisée émise par le nanoémetteur illuminé par l'onde vortex varie de 0 au centre à 1 au maximum du vortex pour arriver à 0 pour une valeur légèrement supérieure au rayon d'Airy. L'arc tangente du rapport est une fonction monotone.
La position azimutale peut être mesurée en mesurant le rapport d'intensité entre l'intensité totale émise par le nanoémetteur illuminé par la première distribution demi-lune, IH, et l'intensité totale émise par le nanoémetteur illuminé par la seconde distribution demi-lune, IVE- Le rapport entre ces deux intensités est une loi géométrique en tangente carrée :
^ = tan2 ϋ (EQ. 12)
Les deux mesures sont redondantes. Cette redondance est une mesure permettant de qualifier l'objet observé comme étant un point unique et de séparer ce cas des autres objets potentiellement présents sur l'échantillon.
Une application directe de l'utilisation de la méthode PSIT selon un mode de réalisation de l'invention pour mesurer la position d'un nanoémetteur avec une haute précision est l'intégration de cette technique de mesure dans une technique nouvelle de reconstruction optique stochastique locale. Une des limites de l'applicabilité des techniques stochastiques est le processus de mesure, nécessitant un nombre important d'images et donc un temps de mesure long et une forte phototoxicité. L'utilisation de la technique PSIT selon au moins un mode de réalisation de l 'invention, qui permet de mesurer la position d'un émetteur lumineux, à une résolution bien supérieure au disque d'Airy, à des cadences pouvant atteindre les micro ou nanosecondes permet l'extension des techniques stochastiques à de nombreuses applications nouvelles.
Les images résultantes de l'utilisation de la méthode PSIT peuvent aussi être traitées en utilisant la méthode de Hough généralisée, permettant de reconnaître des objets structurés, ligne, cercle ou autres, dans une image.
Reconnaissance et mesure de deux points : un nouveau critère de résolution
Considérons maintenant deux nanoémetteurs de même intensité positionnés symétriquement autour du centre aux positions p, Θ et p, -Θ en coordonnés polaires. Nous utiliserons le système décrit dans les paragraphes précédents. Les trois descripteurs donneront les résultats suivants :
• Le centroïde mesurera le centre de gravité de la distribution lumineuse, qui sera à l'origine,
• Le descripteur p, mesurera la valeur radiale commune des deux nanoémetteurs,
• le descripteur Θ, qui dans le cas des demi-lunes contient une dégénérescence entre Θ et -Θ, mesurera la valeur Θ.
Comme cité précédemment si la valeur du descripteur p n'est pas nulle nous savons que le cas étudié n'est pas un point mais deux ou plus. De plus, les descripteurs p et Θ nous permettent de mesurer les caractéristiques de deux points à une résolution très supérieure à celle définie par le critère de Rayleigh. Qui plus est, en utilisant un processus composé, il est possible de séparer ce cas de la grande majorité des cas de 3 points et plus. Une distribution lumineuse supplémentaire peut être projetée sur l'échantillon, une demi-lune inclinée d'un angle Θ ; l'hypothèse de la présence de deux points sera confortée ou infirmée en fonction des résultats de cette image. En effet, l'énergie mesurée ne sera nulle que pour deux points, pour une ligne ou pour une série de points alignés dans la direction de l'angle Θ.
Cette mesure n'est pas limitée à priori. Bien sûr, une limite de résolution pratique existe d'abord, liée à la qualité du signal, les fluctuations et imperfections diverses. Si on néglige les limites pratiques, la limite de résolution est liée au nombre de photons détectés.
La résolution d'un système utilisant les techniques PSIT et/ou PDOS est donc, en pratique, dépendante de l'échantillon observé. Pour un échantillon marqué de manière parcimonieuse (c'est- à-dire de façon à ce que les marqueurs fluorescents se positionnent sur des structures non denses de type parois, membranes, filaments, sources ponctuelles), la résolution obtenue peut dépasser sensiblement le facteur 2 (localement voir même globalement). Dark Tracking
La diffraction conique pourrait permettre de mettre en application toute une famille de techniques de superrésolution ou super localisation, la localisation d'une seule molécule. On se réfère maintenant à la figure 8, qui illustre schématiquement une technique originale que nous avons nommée « Dark Tracking ».
En nous référant à la figure 8, 80 représente la phase d'initialisation c'est-à-dire la détection de l 'émetteur en utilisant un scanner confocal ou tout autre méthode optique connue. 81 représente la phase de positionnement du faisceau vortex sur l'émetteur ; 82 représente, le cas où l'émetteur bouge par rapport au centre du vortex et est excité par une fraction du faisceau créant une fluorescence qui peut être détectée ; 83 représente le repositionnement de l'émetteur au centre du faisceau vortex tel qu'aucune fluorescence n'est créée et détectée (position enregistrée Xi,Yi) et 84 correspond à une boucle de rétroaction dans laquelle un système indépendant de localisation repositionne l'élément suivi à une position corrigée.
Les distributions lumineuses utilisées par cette technique sont des vortex générés par diffraction conique. Toutefois cette technique peut aussi utiliser d'autres vortex ou autres distributions générés par la diffraction conique. Nous supposons que la molécule qui nous intéresse a été marquée par un ou plusieurs fluorophores qui peut être excité à λ. La position de la molécule est tout d'abord détectée par une image confocale classique à λ. La position du scanner est ensuite ajustée pour stimuler l'échantillon de telle sorte que le centre du vortex coïncide exactement avec la position de l'émetteur. Le signal en fluorescence est détecté par une caméra très sensible (ex. EMCCD ou sCMOS), ou PMT, permettant une détection du signal de faible amplitude de l'émetteur grâce à une efficacité quantique importante. Le processus de localisation repose sur l'absence de signal fluorescent quand l'émetteur se situe exactement au centre du vortex. Le fait que le gradient d'intensité soit important à proximité du centre du vortex permet une localisation précise de l'émetteur. Si l'émetteur bouge légèrement, l'intensité qu'il absorbe ne sera plus nulle, et il émettra un signal en fluorescence dont la position et l'intensité sont déduites de l 'image. Une boucle de rétroaction permet alors de recentrer le vortex sur l'émetteur et de mémoriser la position de l'émetteur. La boucle de rétroaction peut être exécutée à la vitesse d'exécution de la caméra (jusqu'à 1kHz) ou le détecteur (plusieurs MHz), ce qui permet de faire du suivi d'une molécule en temps réel et sur une période de temps conséquente. Comme nous essayons toujours de minimiser le signal émis en fluorescence en minimisant le signal excitant l 'émetteur, la localisation peut être conduite sur une longue durée de temps, le bleaching étant moins susceptible de se produire avec de si petites doses de lumière. La précision de la localisation dépend fortement du rapport signal sur bruit de l'image, par conséquent le bruit de fond (bruit de la caméra et signal en auto-fluorescence) doit être pris en compte. Supposons à présent que l'échantillon soit marqué par deux fluorophores différents qui peuvent être excités à deux longueurs d'onde différentes, λΐ et X2. Nous faisons se propager ensemble deux faisceaux avec des topologies différentes qui dépendent de leur longueur d'onde. Le premier (λΐ ) a une forme classique de Gaussien et permet d'obtenir une image confocale globale de l'échantillon. La deuxième (λ2) est un faisceau vortex utilisé pour le Dark Tracking. En contrôlant le miroir galvanométrique qui scanne l'échantillon, le Dark-Tracking peut être réalisé à chaque fois qu'une ligne pour l'image caméra est scannée, de sorte que la position de l'émetteur est suivie à une fréquence beaucoup plus haute que le nombre d'image par seconde. Les principaux avantages de cette technique, comparée à d'autre technique de suivi de molécule unique, sont l'utilisation d'un unique système de scan et la puissance envoyée aux molécules suivies est extrêmement faible. En pratique, l'utilisation, l'alignement et la mise en forme de ces deux faisceaux n'est pas une tâche triviale si l'on utilise les techniques conventionnelles de mise en forme de faisceau, telles que des hologrammes générés par ordinateurs, modulateurs spatiaux ou des lames d'onde en spirale, principalement à cause de leur chromaticité inhérente. La diffraction conique peut être utilisée pour simplifier le montage. En utilisant les optiques adaptées, un cristal peut être adapté pour générer un vortex à une longueur d'onde, et un faisceau gaussien à une autre longueur d'onde suivant le même chemin optique. Cela permet d'utiliser un simple chemin optique partant d'une fibre qui résout de nombreux problèmes pratiques. La technologie dark-tracking peut être facilement utilisée pour étudier nombre de questions biologiques dans lesquelles les techniques conventionnelles de suivi de la position d'une particule sont pénalisées par le bleaching des particules.
Le Dark Tracking a été décrit ci-dessus dans le cas de l'utilisation d'un vortex. Toutefois, de nombreuses variantes, utilisant une ou plusieurs distributions, par exemple mais non limitées aux demi-lunes ou aux vecteurs de Stokes, soit toute distribution possédant un zéro d'intensité et un gradient - si possible le plus fort possible - en fonction d'une des dimensions spatiales peut permettre la réalisation du Dark Tracking et sont réputées faire partie de cette invention. Les capacités de la diffraction conique de créer de nombreuses distributions lumineuses différentes en font un outil de choix pour la réalisation du Dark Tracking.
On se réfère maintenant à la figure 6b, qui est une illustration schématique simplifiée d'un module optique LatSRCS modifié, achromatique ou non, 700, conformément à un mode de réalisation de la présente invention. Ce module diffère de l'implémentation d'un module optique LatSRCS, 700, décrit précédemment et représenté dans la Figure 6a, par l'ajout de plusieurs éléments avant le module :
des lasers, 79a, 79b et 79c, optionnel lement à des longueurs d'ondes différentes, des fibres optiques, 78a, 78b et 78c, issues des lasers 79a, 79b et 79c,
optionnellement, des sous-modules de contrôle de polarisation, 77a, 77b et 77c, pour modifier statiquement ou dynamiquement la polarisation des lasers, 79a, 79b et 79c, les sous-modules de contrôle de polarisation pouvant être positionnés avant ou après la fibre. Toutefois, dans certaines implémentations, par exemple utilisant des fibres PM, « polarization maintàining » en anglais, les sous-modules de contrôle de polarisation 77a, 77b et 77c peuvent ne pas être nécessaires et la polarisation de la lumière issue de la fibre est déterminée par la position relative du laser et de la fibre,
un « laser combiner » (en anglais), 76a, combinant deux ou plusieurs sources lasers optionnellement à travers des fibres optiques, 78a, 78b et 78c, en une fibre de sortie commune, 76b,
un élément optique, 75, permettant de transformer la lumière issue de la fibre en lumière collimatée susceptible d'être utilisée par le reste du module LatSRCS, 700, de manière similaire à celle décrite précédemment.
De nombreuses variations de ce dispositif, connues de l'Homme de l'Art, peuvent être ajoutées à ce schéma et sont revendiquées dans cette invention: par exemple, les deux éléments optiques 31 et 75 peuvent être intégrés en un seul élément, ou même enlevés si les paramètres de sortie de la fibre commune sont adéquats. De même, la fibre commune, 76b, peut ne pas être nécessaire pour certaines implémentations.
De plus, l'introduction, à travers une fibre optique commune, ou directement en lumière se propageant dans l'espace, de deux, ou plus, longueurs d'ondes ayant des polarisations différentes, permet de créer une méthode et/ou un dispositif apte à réaliser les techniques RESOLFT ou STED dans toutes leurs différentes modalités. Dans cette méthode et/ou dispositif les ondes d'excitation et de déplétion se propagent suivant un chemin commun et le module LatSRCS, 700, peut être totalement achromatique, ou non dans une version simplifiée, tel que décrit précédemment.
Dans la variante la plus simple de cette méthode, les ondes d'excitation et de déplétion se propagent suivant deux polarisations linéaires orthogonales et une lame quart d'onde - optionnellement achromatique - est positionnée à l'entrée du système pour transformer ces polarisations en polarisations circulaires orthogonales afin d'obtenir, pour l'une une onde fondamentale et pour l'autre un vortex.
Dans une nouvelle variante de cette méthode, la méthode intégrative à polarisation unique, décrite en détails ultérieurement, la fibre est une fibre biréfringente et crée une différence de marche supérieure à la longueur de cohérence du laser de déplétion, créant une superposition incohérente des deux polarisations orthogonales. Une autre solution est l'utilisation d'un sous- module de polarisation (non représenté), consistant par exemple en un cristal uniaxe épais à forte biréfringence. De plus, dans la méthode intégrative à même polarisation, un sous-module de polarisation, (non représenté), de contrôle de rapport d'intensité peut être utilisé. Ce sous- module de polarisation, de contrôle de rapport d'intensité est différent du sous-module de polarisation précédent, mais peut potentiellement être intégré avec lui. Il peut potentiellement être aussi intégré dans le laser combiner, 76a, positionné entre le laser et la fibre optique. Ce sous-module de polarisation de contrôle de rapport d'intensité, peut être utilisé pour contrôler le rapport d'intensité entre les deux polarisations, et donc, comme il sera décrit ultérieurement, le rapport d'intensité entre le faisceau de déplétion 2D (vortex) et le faisceau de déplétion 3D (sphère noire).
On se réfère maintenant de nouveau à la figure 6b. Les sous-modules de contrôle de polarisation, 77a, 77b et 77c, peuvent être actionnés pour créer, simultanément, des séquences de distributions lumineuses, identiques ou différentes, pour la voie d'excitation et la voie de déplétion. De plus, l'intensité des lasers peut être modulée, créant un chronogramme complexe de l'intensité de chaque laser, de la séquence de distributions lumineuses d'excitation et de la séquence de distributions lumineuses de déplétion.
Dans une implémentation de cette méthode, en utilisant un microscope confocal et un module LatSRCS original ou modifié, achromatique ou non, on projette séquentiellement :
• En premier lieu, une distribution d'Airy ou un fondamental en excitation simultanément avec un vortex de déplétion. L'image d'émission résultante sera appelée l'image positive,
• En deuxième étape, un vortex d'excitation, simultanément avec un vortex de déplétion.
L'image d'émission résultante sera appelée l'image négative.
Dans une variante du premier lieu on projette uniquement une distribution d'Airy ou un fondamental en excitation
L'image différence consiste en la soustraction pondérée de ces deux images. Toutefois, cette image différence peut être un traitement numérique plus évolué qu'une simple différence arithmétique et peut incorporer un ensemble de traitement mathématiques connus de l'Homme de l'Art, permettant d'optimiser l'image résultante en fonction, par exemple mais non-limité, du contenu fréquentiel des deux images. Cette image différence, si on choisit les bons paramètres, aura une taille - en termes de PSF - plus fine qu'un STED classique, tout en ne nécessitant qu'une intensité de déplétion moins forte. En effet, le but de la déplétion du vortex ne sera plus de réduire la taille d'une tache d'Airy, nécessitant ainsi une énergie importante, comme dans le STED ou RESOLFT classique, mais de réduire l'excès d'énergie présent dans le vortex d'excitation par rapport à la distribution d'Airy ou au fondamental. De plus, la déplétion du Airy ou du fondamental, se couplera avec la soustraction de l'image négative, créée par le vortex d'excitation, ce qui est équivalent à la soustraction mathématique des deux illuminations. La réduction de la taille de la PSF résultante sera la conjugaison de ces deux effets.
De plus, ce mode de réalisation peut, dans certains cas s'affranchir de la nécessité de déclencher l'excitation comme nécessaire dans le « Gated STED ». En effet, les photons arrivés avant l'application complète de la déplétion, peuvent être pris en compte par un choix adéquat de paramètres, sans nécessiter l'adjonction d'un système complexe et contraignant. Finalement, la nécessité de moduler le STED, « ModSted » peut aussi être évitée car les photons d'émission émis par le vortex de déplétion ne différent presque pas de ceux émis par le vortex d'excitation et peuvent aussi être compensés.
Dans un deuxième mode de réalisation, en utilisant un microscope confocal et un module LatSRCS original ou modifié, on projette simultanément une séquence de faisceaux d'excitation, une séquence de faisceaux de déplétion, les deux séquences de faisceaux pouvant différer par leur polarisation, créant des distributions lumineuses de topologies différentes. Ce dispositif permet, de réaliser une séquence de distributions lumineuses de tailles inférieures à celles qui auraient été obtenues sans le faisceau de déplétion. L'algorithmique SRCDA, sera utilisé dans cette implémentation pour déterminer la distribution spatiale ou la position d'émetteurs ponctuels. Ce mode de réalisation, couplant la déplétion et l'algorithmique devrait permettre un compromis adéquat entre l'intensité du faisceau de déplétion projeté et le gain de résolution.
Dans un autre mode de réalisation, en utilisant un microscope confocal et un module LatSRCS original ou modifié, on projette simultanément un faisceau d'excitation, sous forme d'un Airy et un faisceau de déplétion sous forme d'un vortex, les deux faisceaux différant par leur polarisation. Ce dispositif permet, sans éléments dynamiques, de réaliser un dispositif STED totalement achromatique.
Utilisation de distribution à symétrie hélicoïdale pour le STED 3D
La solution implémentée dans les systèmes STED ou STED-3D utilise une distribution optique d'intensité nulle au point central, et reste zéro le long de l'axe, le long d'une certaine distance. Nous proposons ici, l'utilisation pour le STED-3D, d'une distribution ayant une position d'intensité nulle, cette position d'intensité nulle ayant une variation spatiale hélicoïdale, en fonction du paramètre axial. L'implémentation préférée de cette distribution est l'utilisation de la diffraction conique en utilisant les distributions optiques que nous avons référencées sous le nom de distribution de Stokes. Ces distributions pourraient être réalisées, en particulier mais pas exclusivement, en utilisant les techniques basées sur les dispositifs cités auparavant, incluant mais non exclusivement les SLM (Spacial Light Modulator) et miroirs segmentés qui permettent de créer des distributions de phase et /ou d'amplitude dans la pupille. L'utilisation de distribution à topologie hélicoïdale pour créer une distribution contenant une intensité nulle ayant un mouvement hélicoïdale est réputée faire partie ce cette invention. En particulier l'implémentation de ces distributions à l'aide de diffraction conique est une des implémentations préférée de cette invention mais les implémentations de ces distributions à l'aide d'un SLM ou d'un miroir segmenté pour créer des distributions de phase ou d'amplitude dans la pupille sont aussi considérées comme une des implémentations décrites dans cette invention.
Dans une nouvelle variante de cette méthode, la méthode intégrative à deux polarisations, les paramètres du cristal sont choisis, tels que l'onde fondamentale crée une sphère noire et l'onde vortex crée un vortex. Dans ces conditions, les deux distributions, polarisées orthogonal ement n'interfèrent pas et une superposition incohérente des deux faisceaux permet, avec un seul faisceau d'entrée de créer indépendamment les deux faisceaux nécessaires au STED 3D, le vortex et la sphère noire. La possibilité de créer à l'aide d'un seul faisceau de déplétion d'entrée, les deux faisceaux, permet de simplifier considérablement le système optique. De plus, ce système étant à chemin commun, il peut être mis en œuvre simplement. Un sous-module de polarisation (non représenté), statique ou dynamique, positionné entre la fibre optique et le cristal, peut être utilisé pour contrôler le rapport d'intensité entre les deux polarisations, et donc, le rapport d'intensité entre le faisceau de déplétion 2D (vortex) et le faisceau de déplétion 3D (sphère noire).
Dans une nouvelle variante de cette méthode, la méthode intégrative à polarisation unique, une fibre biréfringente - ou un sous module de polarisation - a créé antérieurement, tel que décrit précédemment, une différence de marche supérieure à la longueur de cohérence du laser de déplétion, pour un laser CW, et/ou au temps du puise, pour un laser puisé ou pour le gated STED, créant une superposition incohérente des deux polarisations orthogonales. Dans ces conditions, les deux distributions, n'interfèrent pas ; les deux distributions étant de polarisations orthogonales, créeront, sur la même polarisation, l'une un fondamental - qui par un choix de paramètres du cristal et du système optique, sera une sphère noire, et l'autre un vortex. Ces deux faisceaux, dérivés de deux distributions incohérentes, comme décrit antérieurement, n'interfèrent pas ; ce dispositif permet, avec un seul faisceau d'entrée, avant la fibre, de créer indépendamment les deux faisceaux nécessaires au STED 3D le vortex et la sphère noire. La possibilité de créer à l'aide d'un seul faisceau de déplétion d'entrée, les deux faisceaux, permet de simplifier fortement le système optique. De plus, ce système étant à chemin commun, il peut être mis en œuvre simplement. La différentiation entre ces deux variantes est dans la polarisation de sortie des deux distributions, la sphère noire et le vortex, qui sont orthogonales dans la méthode intégrative à deux polarisations et identique la méthode intégrative à polarisation unique, chacune des deux variantes ayant des avantages pour certaines configurations.
Dans une nouvelle variante de cette méthode, utilisant la diffraction conique, compatible avec l'ensemble des dispositifs décrits précédemment, et potentiellement complémentaire des deux méthodes intégratives, à deux polarisations et à polarisation unique, l'élément de diffraction conique est remplacé par un sous-module consistant en deux cristaux de diffraction coniques, de valeur du paramètre de diffraction conique sensiblement égale, séparés par un sous-module de polarisation. Le sous-module de polarisation est choisi tel qu'à la longueur d'onde de déplétion, le sous-module de polarisation n'a pas d'effet, et l'action des cristaux s'ajoutent, créant le vortex et/ou la sphère noire. A la longueur d'excitation, le sous-module de polarisation crée une rotation de la polarisation de 90° ou de 180°, l'effet des deux cristaux se soustrait, et le faisceau transmis est identique au faisceau incident. Ce dispositif évite de créer des distributions trop « exotiques » sur le faisceau d'excitation. Dans certains dispositifs les cristaux pourraient avoir des valeurs du paramètre de diffraction conique différentes, pour créer aussi un effet sur le faisceau d'excitation, mais avec une valeur du paramètre de diffraction conique différente de celle du faisceau de déplétion. Cette variante, peut être réalisée à plusieurs longueurs d'onde de déplétion et d'excitation, en utilisant les ressources des modules de polarisation bien connus de l'Homme de l'Art.
Dans une nouvelle variante de cette méthode, utilisant la diffraction conique, compatible avec l'ensemble des dispositifs décrits précédemment, et potentiellement complémentaire des deux méthodes intégratives, à deux polarisations et à polarisation unique, et compatible aussi avec implémentation précédente avec des modifications raisonnables, l'élément de diffraction conique est remplacé par une cascade de cristaux ayant des propriétés spectrale différentes, tels que le LBO et le KTP (KTA) de façon à permettre la réalisation de sphère noire à plusieurs longueurs d'onde de déplétion. En effet, la dispersion du paramètre caractéristique de l'effet de diffraction conique, po, ne permet pas de réaliser certaines distributions à plusieurs longueurs d'ondes, en particulier la sphère noire, dont la forme dépend fortement de ce paramètre. La compensation de la dispersion du paramètre caractéristique de l'effet de diffraction conique, po, permet donc la réalisation d'un STED 3D à chemin optique commun, à deux ou plusieurs longueurs d'onde. Plus encore, la
compensation de la dispersion du paramètre caractéristique de l'effet de diffraction conique, po, peut être réalisée sur une large plage de longueurs d'onde soit comme décrit précédemment par une combinaison de cristaux, soit en corrigeant spectralement le système optique au deuxième ordre, i.e, en créant une ouverture numérique dépendant de la longueur d'onde pour soit compenser la dispersion du paramètre caractéristique de l'effet de diffraction conique, po, soit corriger une compensation de la dispersion du paramètre caractéristique de l'effet de diffraction conique, po, créée par une combinaison de cristaux décrite précédemment.
Dans un autre mode de réalisation, en utilisant un microscope confocal, un module LatSRCS original ou modifié, et un module LongSRCS, on projette simultanément une séquence de faisceaux d'excitation, une séquence de faisceaux de déplétion, les deux séquences de faisceaux pouvant différer par leur polarisation, créant des distributions lumineuses de topologies différentes. Le module LatSRCS permet de réaliser une séquence de distributions lumineuses de tailles inférieures à celles qui auraient été obtenues sans le faisceau de déplétion. Le module LongSRCS implémente la méthode PDOS de façon à séparer sur des détecteurs différents la lumière collimatée, émergente de nanoémetteurs positionnés au plan focal de l'objectif, de la lumière non-collimatée émergente de nanoémetteurs se trouvant en-deçà ou au-delà du plan focal. La méthode PDOS, dans cette implémentation, permet d'acquérir une information essentiellement longitudinale, c'est-à-dire la position longitudinale de chacun des nanoémetteurs, complémentaire de l'information latérale obtenue à l'aide du module LatSRCS original ou modifié.
L'algorithmique SRCDA, sera utilisé dans cette implémentation pour déterminer la distribution spatiale ou la position d'émetteurs ponctuels. Dans un autre mode de réalisation utilisant une des implémentations décrites antérieurement et utilisant un cristal biaxe pour créer le beam shaping, on utilise un élément dynamique de polarisation avant ou après le cristal biaxe pour corriger le mouvement dynamique de la pupille, qui dans certains cas peut être créée au cours du balayage optique du microscope confocal. Cet effet de mouvement de la pupille étant dans certaines implémentations des technologues STED une des limites des performances, sans nécessiter d'un système de balayage supplémentaire. [35]
Dans un autre mode de réalisation utilisant un microscope confocal, on projette à l'aide d'un module LatSRCS original ou modifié, deux ou plusieurs distributions lumineuses localisées à différentes longueurs d'onde. La première distribution lumineuse permet de rendre la scène parcimonieuse, c'est-à-dire d'isoler des émetteurs à l'aide d'un effet physique, qui dilue la densité des émetteurs capable d'émettre de la fluorescence, de façon à créer des régions dans lesquelles l'hypothèse de parcimonie est valable c'est-à-dire la présence d'un émetteur isolé ou d'un petit nombre d'émetteurs. Les effets physiques qui permettront de réaliser cette parcimonie seront les mêmes ou seront des effets dérivés, des effets utilisés pour créer la parcimonie pour les techniques de microscopie de localisation d'émetteurs uniques. Ces techniques comprennent par exemple les techniques PALM STORM, DSTORM, FPALM et autres. La deuxième distribution lumineuse à une autre longueur d'onde créera une fluorescence dont l'intensité sera variable dans le temps. Cette deuxième distribution lumineuse utilisera une des techniques PSIT, soit une séquence de distributions discrètes, soit une séquence de distributions continues. Dans le cas de distributions discrètes, la lumière sera détectée soit par un détecteur matriciel, soit par un détecteur unique. Dans le cas de la distribution continue, bien qu'il soit aussi possible d'utiliser un détecteur matriciel, Pimplémentation la plus probable sera l'utilisation d'un détecteur unique ; dans ce cas l'information latérale de position xy et potentiellement l'information de distribution longitudinale z pourra être obtenue par des rapports d'intensités. Un des cas les plus intéressants est le cas de distributions harmoniques en temps dans lesquelles les cellules électrooptiques sont actionnées par un voltage sinusoïdal. Dans ce cas, la position xy peut être retrouvée à l'aide d'une mesure des harmoniques temporels du signal mesuré par le détecteur, qui peut être un détecteur unique, qui contiennent indirectement les informations de position latérale.
Deux cristaux montés en cascade (à la suite l'un de l'autre) créent un effet de d'addition des effets des cristaux (s'ils sont orientés dans le même sens), Comme décrit dans la Référence 46, ou de soustraction (s'ils sont orientés à 180°). L'ajout d'un rotateur entre les deux cristaux, faisant tourner le plan de polarisation de 180°, inverse cet effet créant un effet de soustraction en lieu et place d'une addition. Dans le cas d'un système à deux cristaux identiques, en utilisant l'effet d'addition des effets des cristaux, on peut avoir deux cristaux dont les effets s'ajoutent. En utilisant un rotateur chromatique qui fait tourner à des angles différents, idéalement à des angles étant des multiples différents de 180°, à des longueurs d'onde différentes, on peut avoir un module dans lequel les effets des deux cristaux s'annulent à une longueur d'onde et s'additionnent à l'autre longueur d'onde. Le rotateur en question peut être un simple cristal (ex : quartz) dont l'épaisseur est optimisée en fonction des pouvoirs rotatoires du cristal aux deux longueurs d'onde d'optimisation, afin d'obtenir une différence dans la rotation de 180° entre les deux faisceaux. Dans le cas d'un système à deux cristaux coniques, on peut utiliser deux cristaux biaxes, de matériau différent ; Si on utilise soustraction des effets des cristaux, et que ces effets dépendent de la longueur d'onde différemment pour les deux cristaux, on peut optimiser le module pour avoir deux cristaux dont les effets s'annulent à une longueur d'onde et ne s'annulent pas à une autre longueur d'onde. On peut généraliser ce procédé des systèmes à N cristaux dont les effets se compensent ou s'ajoutent, afin d'optimiser le paramètre po pour N longueur d'ondes.
Le rapport d'énergie dans le STED 3D créé par un cristal conique est fixe, l'énergie du vortex étant porté par une polarisation (circulaire) et l'énerhie de la sphère noire étant porté par l'autre polarisation. L'utilisation d'un élément dichroïque - dans le sens premier de dichroïque, soit un élément absorbant sélectivement les polarisations - permet de modifier ce rapport. Cet élément peut être soit un élément dichroïque circulaire - soit un élément dichroïque linéaire nécessitant le rajout d'un élément de polarisation avant et optionnellement après le dichroïque. Des éléments dichroiques représentatifs mais non limitatifs sont les lames de Brewster ou certains verres dichroiïques comportant des nanoparticules métalliques allongées orientées de manière homogène, renfermées dans des couches superficielles de verre.
De nombreuses autres implémentations de cette méthode générale seront claires à l'Homme de l'Art, par exemple:
Certaines des distributions créées par le module LatSRCS, 700, sont des superoscillations, Dans la Figure 7b, les cas sous figures 7boo et 7bn sont des superoscillations. Π consiste en un spot naturellement petit, entouré d'un anneau large et intense. En projetant un anneau de déplétion sur cette superoscillation, il sera possible d'empêcher, à un cout énergétique faible, les fluorophores contenus dans l'anneau d'émettre et la taille du spot sera celle du spot central de la superoscillation La création successivement ou simultanément de deux - ou plus - distributions lumineuses en déplétion peut remplacer avantageusement le vortex de déplétion dans toutes les modalités RELSOFT ou STED. Un des effets possible est l'amélioration de la forme de la distribution lumineuse de déplétion en prenant en compte les effets vectoriels. Il est aussi possible de créer un nombre plus grand que 2 de distributions dites en « demi-lunes», pour explorer différents états de polarisation.
IMPLEMENTATIONS ALTERNATIVES
Les modes de réalisation de l'invention décrits peuvent être intégrés sur un microscope confocal de fluorescence. Le système de superrésolution selon des modes de réalisation de l'invention consiste en une nouvelle modalité de mesure, en complément ou en remplacement des modalités existantes de la microscopie. Toutefois, le système de superrésolution selon des modes de réalisation de l'invention peut tout aussi bien être intégré sur les autres plateformes de microscopie. Ces plateformes de microscopie, décrites par exemple en comprennent mais ne sont pas limité aux: microscopes à champ large, « Wide field microscope », microscopes à champ obscur, « dark field microscope », les microscopes de polarisation, les microscopes à différence de phase, les microscopes à interférence différentiel de contraste, les microscopes
stéréoscopiques, les microscopes Raman, les microscopes dédiés à une tache spécifique, comme le « live cell imaging », le « cell sorting », « cell motility » ou tout autre instrument de microscopie optique.
Dans un autre mode de réalisation, la plateforme de microscope qui a été décrite est couplée à un système de microscopie électronique (CLEM- Corrélative Light Electron Microscopy), ou tout autre système similaire tel que le TEM (Transmission Electron Microscopy), ou PEBM (Electron Beam Microscopy), ou la SE (Scanning Electron Microscopy)
Dans un autre mode de réalisation de l'invention, la plateforme de microscope est une plateforme SRCDP complète, et comporte un module LongSRCS, implémentant la méthode PDOS et utilisant l'algorithmique SRCDA.
Dans un autre mode de réalisation de l 'invention, la plateforme de microscope est une plateforme SRCDP partielle, et utilise l'algorithmique SRCDA.
Dans un autre mode de réalisation de l'invention, la plateforme de microscope est une plateforme SRCDP partielle, et utilise le module de contrôle.
Dans un autre mode de réalisation de l'invention, la plateforme de microscope comporte en outre un module LongSRCS, implémentant la méthode PDOS
Quant à une discussion plus approfondie de la manière de l'utilisation et l'exploitation de l'invention, elle devrait ressortir de la description ci-dessus. Par conséquent, aucune discussion relative à la forme de l'utilisation et du fonctionnement ne sera décrite.
A cet égard, avant d'expliquer au moins un mode de réalisation de l'invention dans le détail, il est entendu que l'invention n'est pas limitée dans son application aux détails de la construction et au régime des composantes énoncées dans la description suivante ou illustrées dans le dessin. L'invention est capable d'autres modes de réalisation et peut être pratiquée et effectuée de diverses manières. En outre, il est entendu que la phraséologie et la terminologie employée dans ce document sont dans le but de la description et ne devrait pas être considérée comme limitative.
Les références citées ici enseignent de nombreux principes qui sont applicables à la présente invention. Par conséquent, la totalité du contenu de ces publications sont incorporés ici par référence, le cas échéant pour les enseignements de détails supplémentaires ou de remplacement, les caractéristiques et / ou d'information technique.
L'utilisation avantageuse des fibres optiques est la transmission du mode fondamental, le mode TEMoo et seulement lui. Toutefois, certaines configurations de fibres optiques, principalement mais non exclusivement basées sur des fibres dites « Photonic Crystal Fiber » (en anglais) permet la transmission simultanée ou non, de modes plus complexes, y compris des modes de vortex. Il serait donc possible de déporter les distributions optiques créées par la réfraction conique à l'aide de fibres optiques, permettant une simplification majeure du système optique.
De plus, certaines fibres les « dual-core photonic crystal fibers », [16], permettent une interaction entre deux modes, l'un d'entre eux pouvant être un vortex, et fournissent un mécanisme physique supplémentaire pour créer des fonctions de transfert diversifiées.
De nombreuses techniques de superrésolution sont basées sur la mesure de sources ponctuelles, de taille inférieure à une fraction de longueur d'onde. Les techniques de
superrésolution selon des modes de réalisation décrits permettent la mesure de sources ponctuelles, mais aussi d'objets structurés, par exemple et principalement des segments de lignes, des cercles ou même d'objets continus. En Biologie, cette extension permettra la mesure d'entités biologiques importantes, telles que des filaments, des neurones et certains microtubules.
Bien que les descriptions des modes de réalisation, pour simplifier la compréhension de l'invention, présentent les applications en Microscopie, plus spécifiquement en Biologie, et encore plus spécifiquement en Biologie de Fluorescence, les applications peuvent être étendues aux applications générales de la Microscopie et à l'ensemble du domaine de la Vision, incluant la Vision artificielle.
Des modes de réalisation de l'invention peuvent être appliqués, en choisissant un système optique différent, à de nombreuses applications médicales, par exemple mais sans se limiter, à l'observation ophtalmologique. Ce champ d'application correspond à la mesure d'objets biologiques ou médicaux de résolution micronique, la résolution étant comprise entre 1 et 10 μηι.
De plus, des modes de réalisation de l'invention peuvent être appliqués, comme expliquée ultérieurement, à travers une fibre optique. Ceci permet de nombreuses applications
supplémentaires, par exemple mais sans se limiter, à l'observation gastrique ou
gastroentérologique, et à l'observation du colon et des voies urinaires.
Il est entendu que l'invention n'est pas limitée dans son application aux détails énoncés dans la description contenue dans les présentes ou illustrés dans les dessins. L'invention est capable d'autres modes de réalisation et d'être pratiquée et effectuée de diverses manières. L'Homme de l'Art comprendra aisément que diverses modifications et changements peuvent être appliqués aux modes de réalisation de l'invention tel que décrit précédemment sans sortir de son champ d'application, définie dans et par les revendications annexées. Références
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46 Sirat, WO2008/047245, 24 Avril 2008

Claims

Revendications
1. Un procédé optique de mesure pour déterminer la distribution spatiale ou la localisation de sources réémettrices sur un échantillon, comportant au moins une source réémettrice, réémettant de la lumière en fonction de la lumière projetée sur l'échantillon par une première distribution lumineuse d'excitation, créée à partir d'une première source lumineuse, dont la longueur d'onde est accordée sur la longueur d'onde d'excitation de la dite source réémettrice, la première distribution d'excitation étant compacte,
ladite au moins une source réémettrice pouvant être déplétée ou activée par l'action d'au moins une deuxième distribution lumineuse de déplétion ou d'activation créée à partir d'au moins une deuxième source lumineuse, dont la longueur d'onde est accordée sur la longueur d'onde de déplétion ou d'activation de la dite source réémettrice, la distribution de déplétion ou d'activation étant compacte et consistant en la superposition d'une distribution singulière, sur une première polarisation, , et d'une distribution dite de sphère noire ou «top-hat » sur la polarisation orthogonale à la première polarisation, le procédé comportant
Les deux sources lumineuses pouvant être réalisées à partir de lasers séparés ou d'un laser continuum ou blanc,
la projection sur l'échantillon de la première distribution d'excitation et de la deuxième distribution de déplétion ou d'activation, les deux distributions se propageant suivant le même chemin optique, ou quasiment suivant le même chemin optique, de la sortie d'un banc optique à l'objectif d'un microscope
la projection sur l'échantillon de la première distribution d'excitation et de la deuxième distribution de déplétion ou d'activation étant réalisée au moyen d'un appareil optique de projection achromatique, basé sur un effet de diffraction conique ou de propagation de la lumière dans les cristaux uniaxes, comportant une cascade d'au moins deux cristaux de diffraction conique ou uniaxes, ; le procédé comportant en outre
la détection de la lumière réémise par ledit au moins une source réémettrice de l'échantillon
la génération, d'au moins une image, à partir de la lumière détectée ; pour obtenir, de l'image, une information de distribution spatiale ou localisation dudit au moins une source réémettrice..
2. Un procédé selon la revendication 1 dans lequel la projection de distributions lumineuses d'excitation et de déplétion est effectuée par une diffraction conique dans au moins un cristal
3. Un procédé selon la revendication 1 ou 2, comprenant un élément de contrôle de polarisation pour séparer les au moins deux cristaux
4. Un procédé selon la revendication 3 dans lequel l'élément de contrôle de polarisation est un élément optique comprenant un assemblage de une ou deux quart d'ondes achromatiques et une lame d'onde chromatique l'ensemble étant conçu de façon à ce que l'élément optique créée, entre les deux cristaux coniques ou entre deux cristaux uniaxes une différence de rotation de la polarisation entre le faisceau d'excitation et le faisceau de déplétion proche de 180 degrés et ne différant pas de plus de 30 degrés de cette valeur
5. Un procédé selon la revendication 3, dans lequel l'élément de contrôle de polarisation est un élément optique dont le matériau possède une propriété d'activité optique et que l'épaisseur de l'élément optique est choisie de façon à ce que la dispersion naturelle de l'activité optique du matériau créée entre les deux cristaux coniques ou entre deux cristaux uniaxes pour les une différence de rotation de la polarisation entre le faisceau d'excitation et le faisceau de déplétion proche de 180 degrés et ne différant pas de plus de 30 degrés de cette valeur
6. Un procédé selon l'une quelconque des revendications 3 à 5, dans lequel on n'utilise pas l'élément de contrôle de polarisation mais que les deux cristaux coniques sont de matériau différent et que la dispersion naturelle de ces deux matériaux compense la diffraction conique approximativement à la longueur d'onde d'excitation et non à la longueur d'onde de déplétion.
7. Un procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes dans lequel la distribution d'excitation comprend une distribution gaussienne ou un spot d'Airy,
8. Un procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes dans lequel la première source lumineuse comprend un laser et/ou la deuxième source lumineuse comprend un laser.
9. Un procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes dans lequel la première polarisation est linéaire ou circulaire
10. Un procédé optique de mesure pour déterminer la distribution spatiale ou la localisation de sources réémettrices sur un échantillon,
l'échantillon comportant au moins une source réémettrice, excitée par de la lumière et réémettant de la lumière suivant une loi déterminée en fonction de la lumière projetée sur l'échantillon, le procédé utilisant un module de projection achromatique ou non, de lumière dont la longueur d'onde est accordée sur la longueur d'onde d'excitation de ladite au moins une source réémettrice, pour créer une séquence des distributions lumineuses compactes de topologie différentes, le procédé comprenant
le balayage optique de l'échantillon,
la détection de la lumière réémise par ledit au moins une source réémettrice de l'échantillon pour la ou pour chacune des distributions lumineuses compactes de topologie différentes et pour chacun des points de balayage de l'échantillon;
l'acquisition pour chaque point de balayage, soit une image soit une séquence d'images, pour la séquence d'images, chaque image correspondant à une des distributions lumineuses compactes de topologies différentes,
l'application d'algorithme dans lequel la formulation de la reconstruction de l'échantillon et de ses propriétés spatiales et/ou temporelles et/ou spectrales est considérée comme un problème inverse bayésien et conduit à la définition d'une distribution a posteriori,
une loi a posteriori combinant, grâce à la loi de Bayes, la formulation probabiliste d'un modèle de bruit, ainsi que d'éventuels aprioris sur une distribution de lumière crée dans l'échantillon par projection la représentation des résultats, soit sous forme d'une image soit sous forme de données numériques ou graphiques
11.Un procédé optique de mesure selon la revendication 9 dans lequel
l'algorithme comprend
l'estimation de la distribution de lumière dans l'échantillon par l'utilisation de nuées d'émetteurs ponctuels qui permet de favoriser les solutions parcimonieuses;
l'estimation de la moyenne a posteriori, et
la représentation des résultats, basés sur la moyenne a posteriori, soit sous forme d'une image soit sous forme de données numériques ou graphiques
12. Le procédé optique de mesure selon l'une des revendications 9 et 10, dans lequel l'estimation de la moyenne a posteriori est réalisée au moyen d'un algorithme de type Monte-Carlo Markov Chain (MCMC)
13. Un procédé optique de mesure pour déterminer la distribution spatiale ou la localisation de sources réémettrices sur un échantillon,
l'échantillon comportant au moins une source réémettrice, excitée par de la lumière projetée sur l'échantillon et réémettant de la lumière suivant une loi déterminée en fonction de la lumière projetée le procédé utilisant un module de projection achromatique ou non, contenant un laser, dont la longueur d'onde est accordée sur la longueur d'onde d'excitation de ladite au moins une source réémettrice, pour créer une séquence des distributions lumineuses compactes de topologie différentes,
optionnellement un module de balayage pour balayer optiquement l'échantillon,
le procédé utilisant un module de détection pour détecter la lumière réémise par ledit au moins une source réémettrice de l'échantillon pour la ou pour chacune des distributions lumineuses compactes de topologie différentes et pour chacun des points de balayage de l'échantillon;
un module d'acquisition d'image pour acquérir pour chaque point de balayage, soit une image soit une séquence d'images, pour la séquence d'images, chaque image correspondant à une des distributions lumineuses compactes de topologies différentes, un module d'algorithme dans lequel la formulation de la reconstruction de l'échantillon et de ses propriétés spatiales et/ou temporelles et/ou spectrales est considérée comme un problème inverse bayésien et conduit à la définition d'une distribution a posteriori,
une loi a posteriori combinant, grâce à la loi de Bayes, la formulation probabiliste d'un modèle de bruit, ainsi que d'éventuels aprioris sur une distribution de lumière crée dans l'échantillon par projection un module d'algorithme MAP régularisé ou non régularisé avec contrainte de positivité,
la représentation des résultats, basés sur les résultats de l'algorithme MAP, soit sous forme d'une image soit sous forme de données numériques ou graphiques
14. Un procédé optique de mesure pour déterminer la distribution spatiale ou la localisation de sources réémettrices sur un échantillon selon la revendication 10, dans lequel l'algorithme MAP contient de plus une contrainte de limitation de bande-fréquentielle
15. Un procédé optique de mesure pour déterminer la distribution spatiale ou la localisation de sources réémettrices sur un échantillon selon l'une quelconque des revendications 10 et 11 , dans lequel l'algorithme MAP utilise un schéma numérique accéléré de type Nesterov
16. Un procédé optique de mesure pour déterminer la distribution spatiale ou la localisation de sources réémettrices sur un échantillon selon l'une quelconque des revendications 13 à 14, utilisant, pour une séquence d'images, la redondance dans l'information fréquentielle, due au caractéristiques fréquentielles différentes des différentes distributions projetées sur l'échantillon, pour compenser et réduire fortement l'impact de points manquants ou d'irrégularités de balayage.
17. Un procédé optique de mesure pour déterminer la distribution spatiale ou la localisation de sources réémettrices sur un échantillon selon l'une quelconque des revendications 10 à 12, dans lequel l'algorithme MAP est adapté afin de résoudre un problème inverse portant sur une somme d'un petit nombre de termes, comme une composante basse-fréquence et une composante plus parcimonieuse.
18. Un procédé optique de mesure pour déterminer la distribution spatiale ou la localisation de sources réémettrices sur un échantillon selon l'une quelconque des revendications 10 à 13, dans lequel l'algorithme MAP est adapté afin d'imposer une contrainte de redondance non-locale de la solution, par exemple en calculant des poids sur les images ou sur les différents masques numériques et l'arbre de similitudes non-locales étant appliqué à la solution comme une régularisation.
19. Un procédé optique de mesure pour déterminer la distribution spatiale ou la localisation de sources réémettrices sur un échantillon selon l'une quelconque des revendications 10 à 14, utilisant un masqué de taille variable dans le plan du détecteur pour obtenir des images ayant soit des caractéristiques axiales différentes, soit des capacités de rejection de lumière parasite différentes ou optimisées, globalement ou localement
20. Un programme d'ordinateur configuré pour mettre en œuvre un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 19.
21. Un dispositif pour mettre en œuvre le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 20
22. Un dispositif optique de mesure pour déterminer la distribution spatiale ou la localisation de sources réémettrices sur un échantillon, comportant au moins une source réémettrice, réémettant de la lumière en fonction de la lumière projetée sur l'échantillon par une première distribution lumineuse d'excitation, créée à partir d'une première source lumineuse, dont la longueur d'onde est accordée sur la longueur d'onde d'excitation de la dite source réémettrice, la première distribution d'excitation étant compacte, ladite au moins une source réémettrice pouvant être déplétée ou activée par l'action d'au moins une deuxième distribution lumineuse de déplétion ou d'activation créée à partir d'au moins une deuxième source lumineuse, dont la longueur d'onde est accordée sur la longueur d'onde de déplétion ou d'activation de la dite source réémettrice, la distribution de déplétion ou d'activation étant compacte et consistant en la superposition d'une distribution singulière, sur une première polarisation, et d'une distribution dite de sphère noire ou «top-hat » sur la polarisation orthogonale à la première polarisation, le dispositif comportant un module de projection pour projeter sur l'échantillon la première distribution d'excitation et la deuxième distribution de déplétion ou d'activation, les deux distributions se propageant suivant le même chemin optique, ou quasiment suivant le même chemin optique, de la sortie d'un banc optique à l'objectif d'un microscope
un appareil optique de projection achromatique pour projeter sur l'échantillon la première distribution d'excitation et la deuxième distribution de déplétion ou d'activation appareil optique de projection achromatique étant basé sur un effet de diffraction conique ou de propagation de la lumière dans les cristaux uniaxes, comportant une cascade d'au moins deux cristaux de diffraction conique ou uniaxes,
un module de détection de lumière pour détecter de la lumière réémise par ledit au moins une source réémettrice de l'échantillon
un module de génération d'image pour générer au moins une image, à partir de la lumière détectée pour obtenir, de l'image, une information de distribution spatiale ou localisation dudit au moins une source réémettrice..
23. Un dispositif optique de mesure pour déterminer la distribution spatiale ou la localisation de sources réémettrices sur un échantillon,
l'échantillon comportant au moins une source réémettrice, excitée par de la lumière et réémettant de la lumière suivant une loi déterminée en fonction de la lumière projetée sur l'échantillon, le procédé utilisant un module de projection achromatique ou non, de lumière dont la longueur d'onde est accordée sur la longueur d'onde d'excitation de ladite au moins une source réémettrice, pour créer une séquence des distributions lumineuses compactes de topologie différentes, le dispositif comprenant
un module de balayage pour balayer optiquement l'échantillon, un module de détection de la lumière réémise par ledit au moins une source réémettrice de l'échantillon pour la ou pour chacune des distributions lumineuses compactes de topologie différentes et pour chacun des points de balayage de l'échantillon; un module d'acquisition d'image pour acquérir pour chaque point de balayage, soit une image soit une séquence d'images, pour la séquence d'images, chaque image correspondant à une des distributions lumineuses compactes de topologies différentes, un module d'algorithme dans lequel la formulation de la reconstruction de l'échantillon et de ses propriétés spatiales et/ou temporelles et/ou spectrales est considérée comme un problème inverse bayésien et conduit à la définition d'une distribution a posteriori,
une loi a posteriori combinant, grâce à la loi de Bayes, la formulation probabiliste d'un modèle de bruit, ainsi que d'éventuels aprioris sur une distribution de lumière crée dans l'échantillon par projection la représentation des résultats, soit sous forme d'une image soit sous forme de données numériques ou graphiques
24. Un dispositif optique de mesure selon la revendication 23 dans lequel le
module d'algorithme est configuré pour
estimer la distribution de lumière dans l'échantillon par l'utilisation de nuées d'émetteurs ponctuels qui permet de favoriser les solutions parcimonieuses;
estimer la moyenne a posteriori, et
représenter les résultats, basés sur la moyenne a posteriori, soit sous forme d'une image soit sous forme de données numériques ou graphiques
25. Un dispositif optique de mesure pour déterminer la distribution spatiale ou la localisation de sources réémettrices sur un échantillon, l'échantillon comportant au moins une source réémettrice, excitée par de la lumière projetée sur l'échantillon et réémettant de la lumière suivant une loi déterminée en fonction de la lumière projetée, le dispositif comportant
un module de projection achromatique ou non, contenant un laser, dont la longueur d'onde est accordée sur la longueur d'onde d'excitation de ladite au moins une source réémettrice, pour créer une séquence des distributions lumineuses compactes de topologie différentes,
optionnellement un module de balayage pour balayer optiquement l'échantillon,
un module de détection pour détecter la lumière réémise par ledit au moins une source réémettrice de l'échantillon pour la ou pour chacune des distributions lumineuses compactes de topologie différentes et pour chacun des points de balayage de l'échantillon;
un module d'acquisition d'image pour acquérir pour chaque point de balayage, soit une image soit une séquence d'images, pour la séquence d'images, chaque image correspondant à une des
distributions lumineuses compactes de topologies différentes, un module d'algorithme dans lequel la formulation de la reconstruction de l'échantillon et de ses propriétés spatiales et/ou temporelles et/ou spectrales est considérée comme un problème inverse bayésien et conduit à la définition d'une distribution a posteriori,
une loi a posteriori combinant, grâce à la loi de Bayes, la formulation probabiliste d'un modèle de bruit, ainsi que d'éventuels aprioris sur une distribution de lumière crée dans l'échantillon par projection
un module d'algorithme MAP régularisé ou non régularisé avec contrainte de positivité,
la représentation des résultats, basés sur les résultats de l'algorithme MAP, soit sous forme d'une image soit sous forme de données numériques ou graphiques
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