JP2013543980A - 自然放出蛍光をパルス励起、連続誘導、およびゲート記録するsted顕微鏡法 - Google Patents
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Abstract
【選択図】図2
Description
2 試料
3 励起光
4 励起光源
5 ダイクロイックミラー
6 対物部
7 ダイクロイックミラー
8 光学素子
9 自然放出蛍光
10 検出器
11 脱励起光源
12 脱励起光
13 位相マスク
14 フィルタ
15 時間ゲート
16 収集カード
Claims (30)
- 試料(2)内の蛍光体で標識された構造を撮像するSTED蛍光顕微鏡法であって:
蛍光体を励起して蛍光化し、少なくとも1個の焦点域に焦点される励起光(3)を前記試料(2)にパルス照射する工程と;
励起蛍光体を脱励起し、前記少なくとも1個の焦点域内に強度ゼロポイントを備える脱励起光(12)を前記試料(2)に連続波照射する工程と;
前記試料(2)内の励起蛍光体が自然放出する蛍光(9)を、励起光(3)の各パルス後に、前記脱励起光(12)の照射に重ね合せた後、記録する工程と;
前記照射工程および記録工程を前記励起光(3)の焦点域および前記脱励起光(12)の強度ゼロポイントの異なる位置で繰返し実行する工程とを備え;
前記記録工程において、励起蛍光体が自然放出する前記蛍光(9)は前記励起光(3)の連続パルス間の時間分解能により記録される、STED蛍光顕微鏡法。 - 試料(2)に含まれる蛍光体の変動を前記試料(2)の空間的に制限された所定範囲内で観察するSTED蛍光相関分光法であって:
蛍光体を励起して蛍光化し、少なくとも1個の焦点域に焦点される励起光(3)を前記試料(2)に連続波パルス照射する工程と;
励起蛍光体を脱励起し、前記少なくとも1個の焦点域内に強度ゼロポイント備える脱励起光(12)を前記試料(2)に照射する工程と;
前記試料(2)内の励起蛍光体が自然放出する蛍光(9)を、励起光(3)の各パルス後に、前記脱励起光(12)の照射に重ね合せた後、記録する工程とを備え;
前記記録工程において、励起蛍光体が自然放出する前記蛍光(9)は前記励起光(3)の連続パルス間の時間分解能により記録される、蛍光相関分光顕微鏡法。 - 前記記録工程において、励起蛍光体が放出する前記蛍光(9)は、蛍光(9)の自然放出によってのみ減衰する蛍光体の励起状態の寿命より高い時間分解能で記録される、請求項1又は請求項2に記載の方法。
- 前記記録工程において、励起蛍光体が放出する前記蛍光(9)は、少なくとも、蛍光(9)の自然放出および最大照射強度の前記脱励起光(12)による脱励起により減衰する蛍光体の励起状態の寿命と同程度に高い時間分解能で記録される、請求項3に記載の方法。
- 前記記録工程において、励起蛍光体が放出する前記蛍光(9)は少なくとも毎秒200の時間分解能で記録される、請求項3又は請求項4に記載の方法。
- 前記記録工程において、励起蛍光体が放出する前記蛍光(9)は少なくとも毎秒100の時間分解能で記録される、請求項5に記載の方法。
- 前記記録工程において、励起光(3)の各パルスの後に放出される前記蛍光(9)に対して少なくとも1個の時間ゲートが設けられる、請求項1〜6のうちいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも1個のゲートは、前記脱励起光(12)の強度ゼロポイント外の励起蛍光体の原則的に全てが蛍光を放出した直後に開放される、請求項7に記載の方法。
- 前記少なくとも1個のゲートは、前記励起光(3)の焦点域内の励起蛍光体の原則的に全てが蛍光を放出する前に閉鎖される、請求項7又は請求項8に記載の方法。
- 前記少なくとも1個のゲートは励起光(3)の各パルスに対して所定の時間間隔で開放および閉鎖される、請求項7〜9のうちいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも1個のゲートおよび補助ゲートは交互に開放および閉鎖される、請求項7〜10のうちいずれか一項に記載の方法。
- 前記記録工程において、励起光(3)の各パルスの後に自然放出される前記蛍光(9)に対して前記少なくとも1個のゲートおよび時間的に連続するゲートが設けられ、前記時間的に連続するゲートは、前記試料に含まれる第2の励起蛍光体より短い寿命を有する第1の励起蛍光体の原則的に全てが蛍光を放出した後にのみ開放される、請求項7〜11のうちいずれか一項に記載の方法。
- 前記記録工程において、前記蛍光(9)は複数の時間的に連続するチャンネルに記録される、請求項1〜6いずれか一項に記載の方法。
- 前記励起光(3)のパルス照射工程において、前記励起光(3)の波長は、多光子プロセスを介して蛍光体を励起して蛍光化するよう選択される、請求項1〜13のうちいずれか一項に記載の方法。
- 前記励起光(3)のパルス照射工程において、前記励起光(3)の波長は波長のスーパーコンティニウムから選択される、請求項1〜14のうちいずれか一項に記載の方法。
- STED蛍光顕微鏡(1)であって:
試料(2)に含まれる蛍光体を励起して蛍光化し、少なくとも1個の焦点域に焦点される励起光(3)を前記試料(2)にパルス照射するパルス励起光源(4)と;
励起蛍光体を脱励起し、前記少なくとも1個の焦点域内に強度ゼロポイントを備える脱励起光(12)を前記試料(2)に照射する連続波脱励起光源(11)と;
前記試料(2)内の励起蛍光体が自然放出する蛍光(9)を励起光(3)の各パルス後に、前記脱励起光(12)の照射に重ね合せた後、記録する検出器(10)と、を備え;
前記検出器は、励起蛍光体が自然放出する前記蛍光(9)を前記励起光源(4)の連続パルス間の時間分解能により記録する、STED蛍光顕微鏡(1)。 - 前記検出器(10)は、励起蛍光体が放出する前記蛍光(9)を少なくとも毎秒200の時間分解能で記録する、請求項16に記載の顕微鏡(1)。
- 前記検出器(10)は、励起蛍光体が放出する前記蛍光(9)を少なくとも毎秒100の時間分解能で記録する、請求項17に記載の顕微鏡(1)。
- 前記検出器(10)の時間ジッタは毎秒200以下である、請求項17に記載の顕微鏡(1)。
- 前記検出器(10)の時間ジッタは毎秒100以下である、請求項18に記載の顕微鏡(1)。
- 前記検出器(10)は単一光子計数器を含む、請求項16〜20のうちいずれか一項に記載の顕微鏡(1)。
- 前記検出器(10)は少なくとも1個の時間ゲート(15)を備える、請求項16〜21のうちいずれか一項に記載の顕微鏡(1)。
- 前記少なくとも1個の時間ゲート(15)は励起光源(4)の各パルスにより起動される、請求項22に記載の顕微鏡(1)。
- 前記少なくとも1個のゲート(15)は、前記励起光源(4)の各パルスに対する可調な時間間隔で開放および閉鎖される、請求項23に記載の顕微鏡(1)。
- 前記検出器(10)は更に補助ゲートを備え、前記少なくとも1個のゲートおよび前記補助ゲートは交互に開放および閉鎖される、請求項22又は請求項23のうちいずれか一項に記載の顕微鏡(1)。
- 前記脱励起光源(11)は連続波レーザダイオードである、請求項16〜25のうちいずれか一項に記載の顕微鏡(1)。
- 前記パルス励起光源(4)は、前記検出器(10)が記録する蛍光の波長の約2倍の長さを有する波長の励起光(3)を放出する、請求項16〜26のうちいずれか一項に記載の顕微鏡(1)。
- 前記パルス励起光源(4)は、音響光学変調器を用いて前記励起光(3)の波長を選択するための波長のスーパーコンティニウムを出力する、請求項16〜26のうちいずれか一項に記載の顕微鏡(1)。
- 前記検出器(10)は時間的に連続するチャンネルを複数備える、請求項16〜18のうちいずれか一項に記載の顕微鏡(1)。
- 前記励起光源(4)からの前記励起光(3)の焦点域および前記脱励起光源(11)からの前記脱励起光(12)の強度ゼロポイントを用いて前記試料(2)を走査する走査ステージを更に備える、請求項16〜29のうちいずれか一項に記載の顕微鏡(1)。
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