CN111320979A - 一种sted超分辨成像荧光探针 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种STED超分辨成像探针。该齐聚苯乙烯撑(OPV)骨架的有机分子通过使用二氧化硅包覆后形成核壳结构,包覆后的纳米粒子(40‑60nm)尺寸均匀,表面光滑,具有较高的荧光强度。其最大受激辐射擦除效率可达到99%,同时在较低的功率下可实现60nm左右的分辨率,可以对亚细胞器进行可视化的同时,兼顾生物体生理活动的实时动力学监测,可见其是一类新颖的可用于STED超分辨成像的荧光探针。
Description
技术领域
本发明涉及受激发射损耗(STED)超分辨成像领域,具体地说,我们设计合成了一类具有高亮度、高擦除效率的齐聚苯乙烯撑(OPV)骨架分子,其可以充当STED显微镜技术的造影剂。
背景技术
由于存在波动衍射极限的限制,普通的光学显微镜的分辨率在200nm左右,而细胞的亚细胞器的尺寸大约在1-50nm,因此数十年来发展超分辨显微镜技术来可视化亚细胞结构一直科学家们的不屑追求,2014年超分辨技术因其能够突破衍射极限,提供亚细胞器更精细的信息而获得诺贝尔奖。因为STED受激辐射光淬灭这一超分辨技术能够提供快速的超分辨率成像、3D成像而备受生物学家青睐并逐步广泛应用。由于现在STED显微技术的一大弊端就是其需要较大的损耗功率,影响细胞的活性和生物特性的同时,高功率的激光器本身的成本和维护的复杂性成为这一技术普及的壁垒。为此,寻找优化的路径来降低光功率的需求,实现低功率下的超分辨,将不仅能够使其更好地揭示活细胞的精细结构与功能,且能够让这一技术在更多实验室得到广泛应用。因此,发展新型的、低功率、高稳定的STED超分辨探针是非常重要的。
发明内容
本发明涉及受激发射损耗(STED)超分辨成像领域,具体地说,我们设计合成了一类具有高亮度、高擦除效率的齐聚苯乙烯撑(OPV)骨架分子,其可以充当STED显微镜技术的造影剂。
本发明的目的是制备可应用于STED超分辨成像的探针。根据文献报道齐聚苯乙烯撑分子具有较高的量子产率,较好的光稳定性,荧光寿命在几个纳秒,具有应用于STED显微镜技术的前景。我们通过文献设计改造合成了一系列OPV骨架分子,通过紫外可见分光光度计及荧光光谱仪对其进行了测试,发现其具有较大的Stokes位移(>130nm),从而有效的减少了自吸收现象而产生的荧光淬灭,我们通过测量其溶液态及纳米颗粒的量子产量(>50%)也进一步验证了这一事实。同时其在STED光附近几乎没有吸收,就有效减免了STED光对样品的二次激发。此外高的荧光强度的一大优势就在于我们只需要较低的能量就可以获得较高的亮度,从而减少了激发光对样品及生物体的损伤。
本发明公开一种可应用于STED超分辨成像的,具有高亮度、高光学稳定性、高擦除效率的荧光探针。STED显微技术需要两束光,一束光为激发光用于激发样品从基态跃迁到激发态,另一束光为损耗光,用于使处于激发态的分子产生受激发射回到基态。同时与单分子商用染料相比,我们使用二氧化硅包覆后的纳米颗粒(NPs)尺寸均一具有更好的光学稳定性,较好的生物相容性及水溶性,会更加有利于生物成像。基于OPV分子具有这些明显的特性,我们设计合成了一系列OPV骨架分子并首次将其成功应用于STED显微镜成像。
首先,我们合成了一系列OPV骨架的分子,通过质谱和核磁共振氢谱确认了化合物结构的正确性。我们通过再沉淀的方法,制备了该类化合物的纳米颗粒,通过APTES和TEOS在碱性条件下的水解使其包覆上SiO2
并使纳米颗粒表面连接上氨基(-NH2),使合成的纳米颗粒更加有利于吞噬进入细胞。同时,包覆后的纳米颗粒光学稳定性更加优异于未包覆的纳米颗粒,同时表面氨基的修饰可以更加方便的连接抗体,为今后的连接抗体靶向特定的部位诊断疾病做好了铺垫。其次,我们将制备得到的纳米颗粒应用于STED成像,可以看到,其具有非常高的擦出效率(≈99%),在低功率下(89mW)达到约60nm的分辨力,通过拟合可以看出我们的OPV骨架分子在高的功率下可以达到30nm左右的高分辨力。这展现出来的一系列优异的特性,使其具有非常明显的应用于STED超分辨成像的潜力。
应当理解的是,本发明的优点将在随后的说明书中阐述,并且一下的详细描述都是范例和解释性的。本发明的目的和其他优点可通过在说明书、权利要求书以及附图中所特别指出的结构来实现和获得。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施实例中的技术方案,下面将对实施例描述中所需要的附图做简单的介绍:
图1是本发明实施例一设计合成了一系列的OPV骨架的分子,该类化合物反应条件温和,通过在甲苯和正己烷的体系中重结晶,可以得到纯度较高的目标产物,产率较高(>50%)。
图2是本发明实施例一通过再沉淀的方法在CTAB胶束溶液中制备得到该类化合物的纳米颗粒,同时在CTAB胶束的辅助及氨水的水解TEOS和APTES的条件下,以有机OPV系列纳米颗粒为模板,在其表面包覆上一层均匀的介孔二氧化硅的核壳结构的示意图。
图3是本发明实施例一制备得到的表面包裹一层均匀的介孔二氧化硅的核壳结构的TEM图和尺寸分布图。
图4是本发明实施例一制备得到的纳米颗粒具有较高的STED光擦除效率,同时随着功率的增加,其最大擦除效率可达到99%,饱和功率在21mW。
图5是本发明实施例一制备得到的纳米颗粒包覆后在较低的STED光功率89(mW)下,其分辨率在60nm左右。同时其较低的生物毒性使其有望于应用于生物体成像。
图6是本发明实施例一将制备好的核壳结构纳米颗粒吞噬进入Hela细胞,可见OPV系列纳米颗粒可以很好的进入细胞并有效的被STED光擦除,结构更加精细,同时可以靶向生物细胞器。
具体实施方式
以下将结合附图及实施例来详细说明本发明的实施方式,借此对本发明如何应用技术手段来解决技术往年提,并达成技术效果的实现过程能充分理解并据以实施。需要说明的是,只要不构成冲突,本发明中的各个实施例中的各个特征可以相互结合,形成的技术方案均在本发明的保护范围之内。
本发明公开了一类具有高亮度、高擦除效率的齐聚苯乙烯撑(OPV)骨架分子,其可以充当STED技术的造影剂。
通过设计改造,合成了一系列OPV骨架的分子。
OPV骨架系列分子通过在不良溶剂水中利用再沉淀的方法制备其纳米颗粒,通过在CTAB胶束的辅助及氨水的水解作用下,使制备的纳米颗粒表面包覆上一层介孔的二氧化硅壳层,并表面修饰上一层氨基。
包覆后的纳米颗粒表面光滑,为球形结构,尺寸分布比较均匀(40-60nm)。包覆过程对有机纳米颗粒的光学性质没有任何影响。
OPV系列化合物具有较高的光学稳定性,较高的荧光量子产量,同时其具有较高的STED光擦出效率。
制备的得到的包覆后的纳米颗粒其在较低的功率下具有较高的分辨率。
制备的得到的包覆后的纳米颗粒能够高效的吞噬进入细胞,靶向生物细胞器。
实施例一:
图1所示在一个10mL的支管反应器中加入溴代OPV骨架分子(0.26g,0.5mmol),Ruphos(69mg,0.15mmol),Pd2(dba)3(34mg,0.038mmol),二苯胺类化合物(5.0mmol),K3PO4(1.1g,5.0mmol)。在氩气保护下加入2mL甲苯溶液,100℃油浴下反应8个小时。得到的粗产物通过减压蒸馏除去溶剂,分别通过一个短的硅胶柱和中性氧化铝柱后,通过减压蒸馏得到粗产品。将得到的粗产品用甲苯溶剂后,加入不良溶剂正己烷重结晶。
实施例二:
图2为通过再沉淀法制备的纳米颗粒及纳米颗粒的包覆过程的示意图:取0.01mmol OPV骨架分子溶解于四氢呋喃中,将其打入到快速搅拌中的CTAB胶束溶液中。在搅拌的条件下依次加入150μL氨水溶液,逐滴加入50μL正硅酸乙酯(TEOS)的乙醇溶液,当溶液混合均匀稳定后,接下来再向其中加入20μL的3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES),在室温下持续搅拌反应20min。反应完毕,将反应制得到的包覆后的纳米颗粒进行离心分离,用去离子水洗涤几次去除表面活性剂CTAB。
实施例三:
图3a TEM图表明制备得到的包覆后的纳米颗粒表面光滑,b图统计纳米颗粒的尺寸可见所制备的纳米颗粒尺寸分布均匀。
实施例四:
图4a表明了通过STED测试可以看出,OPV化合物在激发光照射下(on),及在激发光和STED光照射下(off)多少重复600s荧光强度随时间的变化,可以看出该类化合物的擦除效率来源于STED光的作用,而不是样品本身的光漂白,同时表明该类化合物具有较好的光稳定性。通过b图可以看出,OPV骨架的纳米颗粒在较低的功率25mW下具有较高的擦除效率>60%。通过c图可以看出,该类化合物纳米颗粒其饱和强度在21mW,表明其可以再较低的功率下实现较高的擦除效率。
实施例五:
图5为材料的分辨率的实验。将制备得到的包覆后的纳米颗粒均匀的涂抹在共聚焦小皿上,a图为共焦下其分辨率。b图为加入STED光(89mW)之后的分辨率图。通过c图可见加入STED光之后分辨率由共焦的134nm提高到了61nm,表明该OPV骨架纳米颗粒具有非常优越的应用于STED超分辨成像的潜力。d图表明该纳米颗粒具有较低的生物毒性,使其进入细胞并进行成像成为可能。
实施例六:
制备得到的包覆后的纳米颗粒被Hela细胞吞噬的实验。a图可以看出制备得到的纳米颗粒被细胞吞噬的共焦照片。b图为加入STED光之后的纳米颗粒在细胞中的照片,表明在细胞中制备得到的包覆后的纳米颗粒依然可以被有效的擦除,结构更加的精细,可以靶向与生物细胞器。
Claims (9)
1.一种STED超分辨成像荧光探针,其特征在于,设计合成了齐聚苯乙烯撑骨架分子,该类分子及纳米颗粒具有较高的荧光量子产率。
2.如权利要求1所述的STED超分辨成像荧光探针,其特征在于,在CTAB胶束溶液中通过自组装生成纳米颗粒,在氨水的水解作用下表面包覆一层均匀的介孔二氧化硅壳层,从而形成包覆后的纳米颗粒。
3.如权利要求2所述的STED超分辨成像荧光探针,其特征在于,包覆后的纳米颗粒尺寸均匀,表面光滑,形貌完整。
4.如权利要求3所述的STED超分辨成像荧光探针,其特征在于,包覆后的纳米颗粒具有较高的荧光量子产量,同时在STED光的作用下,其具有最大99%的擦除效率。
5.如权利要求1所述的STED超分辨成像荧光探针,其特征在于,其具有较低的STED光饱和功率21mW。
6.如权利要求1所述的STED超分辨成像荧光探针,其特征在于,随着STED光功率的增加其分辨率不断提高。
7.如权利要求1所述的STED超分辨成像荧光探针,其特征在于,在较低的STED光功率下其可实现较高的分辨率,理论值可达到约小于30nm。
8.如权利要求2所述的STED超分辨成像荧光探针,其特征在于,包覆后的纳米颗粒具有较低的生物毒性。
9.如权利要求2所述的STED超分辨成像荧光探针,其特征在于,包覆后的纳米颗粒具有很高的生物相容性,可被细胞吞噬,同时可以靶向生物细胞器。
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