CN114107431A - 阳离子共轭寡聚物荧光探针在化妆品中微生物检测的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种阳离子共轭寡聚物荧光探针在化妆品中微生物检测的应用，将阳离子共轭寡聚物与化妆品样品混合，在36～37℃培养20～40min，进行荧光检测，得到化妆品样品中微生物的浓度。本发明中所使用的荧光探针具有大的疏水结构和正电基团，进而能够在30min内同带负电且表面疏水的微生物有效结合，作为现有的用于化妆品中微生物检测的方法具有以下优点：(1)耗时短，仅需要4‑6个小时即可得到结果，(2)操作简便，无需专业操作人员，(3)需要极低浓度的OPV荧光探针即可达到所需效果，(4)共轭聚合物作为荧光探针量子产率高，光捕获能力强，(5)对微生物的检测无选择性，可批量检测化妆品样本。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，尤其涉及一种阳离子共轭寡聚物荧光探针在化妆品中微生物检测的应用。
背景技术
近年来，随着人们对化妆品需求的日益增加，化妆品安全问题已经引起了人们的高度关注。为了确保其在快速发展的同时还能保证安全使用，寻找快速高效的微生物检测方法已迫在眉睫。传统检测化妆品中微生物的方法操作繁琐、耗时长、检测成本昂贵且对检测人员有较高的要求，因此，能够快速准确地检测化妆品中微生物具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种阳离子共轭寡聚物荧光探针在化妆品中微生物检测的应用，本发明中阳离子共轭寡聚物荧光探针可用于化妆品中微生物快速高效的检测，耗时短、用量少，可批量检测化妆品样本。
本发明提供一种阳离子共轭寡聚物荧光探针在化妆品中微生物检测的应用，将阳离子共轭寡聚物与化妆品样品混合，在36～37℃培养20～40min，进行荧光检测，得到化妆品样品中微生物的浓度；所述阳离子共轭寡聚物具有式I所示结构。
优选的，所述荧光检测得到菌落数，通过标准曲线计算得到化妆品中微生物的浓度；
所述标准曲线按照以下步骤获得：
将微生物菌液加水稀释至多个设定浓度，得到多个标准样；
在所述标准样中加入LB液体培养基，36～37℃下培养4～5小时后离心，弃上清液后加入PBS进行洗菌，得到培养后的菌液；
将培养后的菌液与式I所示阳离子共轭寡聚物混合，混匀后在36～37℃培养20～40min，离心，弃上清液后加入PBS溶液，进行荧光检测，记录每个标准样的菌落数量，得到微生物菌落数量与菌液浓度的标准曲线。
优选的，所述微生物为革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和真菌中的一种或几种。
优选的，所述微生物为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌中的一种或几种。
优选的，所述阳离子共轭寡聚物在化妆品样品中的浓度为1～20μmol/L。
优选的，将阳离子共轭寡聚物与化妆品样品混合，在37℃培养30min，进行荧光检测。
优选的，对所述化妆品样品进行预处理，再与阳离子共轭寡聚物混合；
所述预处理为：
将化妆品样本加入LB液体培养基，36～37℃下培养4～5小时后离心，弃上清液后加入PBS进行洗菌，得到预处理后的化妆品样本。
本发明提供了一种阳离子共轭寡聚物荧光探针在化妆品中微生物检测的应用，将阳离子共轭寡聚物与化妆品样品混合，在36～37℃培养20～40min，进行荧光检测，得到化妆品样品中微生物的浓度；所述阳离子共轭寡聚物具有式I所示结构。本发明中所使用的荧光探针具有式I所示结构，其中由于其具有大的疏水结构和正电基团，进而能够在30min内同带负电且表面疏水的微生物有效结合，作为现有的用于化妆品中微生物检测的方法具有以下优点：(1)耗时短，仅需要4-6个小时即可得到结果，(2)操作简便，无需专业操作人员，(3)需要极低浓度的OPV荧光探针即可达到所需效果，(4)共轭聚合物作为荧光探针量子产率高，光捕获能力强，(5)对微生物的检测无选择性，可批量检测化妆品样本。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例中OD600＝1.0的菌液稀释100000倍后的平板图；
图2为本发明实施例2中含有不同数量大肠杆菌标准液的荧光显微镜图片及计数结果；
图3为基于阳离子共轭寡聚物的荧光探针用于检测化妆品中微生物的标准曲线；
图4为本发明中白色念珠球菌的荧光显微镜图片；
图5为本发明中金黄色葡萄球菌的荧光显微镜图片；
图6为本发明实施例4中人工添加微生物后的不同化妆品样品得到的荧光显微镜图像及计数结果；
图7为化妆品样品利用本方案标准曲线计算得到的微生物数量。
具体实施方式
本发明提供了一种阳离子共轭寡聚物荧光探针在化妆品中微生物检测的应用，将阳离子共轭寡聚物与化妆品样品混合，在36～37℃培养20～40min，进行荧光检测，得到化妆品样品中微生物的浓度；
所述阳离子共轭寡聚物具有式I所示结构：
在本发明中，所述阳离子共轭寡聚物为π共轭体系的大分子，可以改变系统的荧光特性，并通过主客体之间特定的相互作用对目标化合物进行选择性分析和鉴定。共轭聚合物作为荧光探针检测微生物是一种基于分子识别的荧光分析方法。
在本发明中，首先建立菌液浓度与菌落数的标准曲线，然后基于标准曲线，计算得到待检测化妆品样品中的微生物浓度。
在本发明中，所述标准曲线按照以下步骤建立：
将微生物菌液加水稀释至多个设定浓度，得到多个标准样；
在所述标准样中加入LB液体培养基，36～37℃下培养4～5小时后离心，弃上清液后加入PBS进行洗菌，得到培养后的菌液；
将培养后的菌液与式I所示阳离子共轭寡聚物混合，混匀后在36～37℃培养20～40min，离心，弃上清液后加入PBS溶液，进行荧光检测，记录每个标准样的菌落数量，得到微生物菌落数量与菌液浓度的标准曲线。
在本发明中，所述微生物优选为革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和真菌中的一种或几种，如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌中的一种或几种。
在本发明中，所述标准样的浓度和数量没有特殊的限制，根据实际需要设定即可。
在将得到的多个标准样菌液分别置于离心管中，分别加入LB液体培养基，放入36～37℃恒温振荡器中振荡4～5h，培养后从离心管中取菌液进行离心，离心后弃上清液，然后加入PBS进行洗菌，重复2～3次，得到预处理的微生物菌液。
在本发明中，所述离心的转速优选为7000～7500rpm，更优选为7100～7400rpm，最优选为7100～7300rpm；所述离心的时间优选为1～5min，更优选为2～4min，最优选为3min。
在本发明中，所述混合液中阳离子共轭寡聚物的浓度优选为1～20μmol/L，更优选为5～15μmol/L，如1μmol/L，5μmol/L，10μmol/L，15μmol/L，20μmol/L，优选为以上述任意数值为上限或下限的范围值；
取预处理后的菌液与式I所示阳离子共轭寡聚物(OPV)混合，混匀后在36～37℃培养30min，离心，弃上清液。
在本发明中，所述离心的转速优选为9000～11000rpm，更优选为10000rpm，所述离心的时间优选为8～12min，更优选为9～11min，最优选为10min。
在离心后留下的沉淀物中加入PBS溶液，混匀后取3～5μL滴在载玻片上，放上盖玻片，使用荧光显微镜进行荧光检测，记录每个标准样品的菌落数量。
然后以通过荧光显微镜计数得到的平均微生物数量为纵坐标，以微生物标准样的浓度为横坐标，通过拟合得到标准曲线。
建立了标准曲线后，本发明即可利用式I所示阳离子共轭寡聚物作为荧光探针，加入预处理后的化妆品样品中，进行荧光检测，获得菌落数量，然后代入标准曲线，得到化妆品样品中的微生物浓度。
在本发明中，所述化妆品样品的预处理方法如下：
将化妆品样品置于离心管中，加入LB液体培养基，放入36～37℃恒温振荡器中振荡4～5h，培养后从离心管中取菌液进行离心，离心后弃上清液，然后加入PBS进行洗菌，重复2～3次，得到预处理的化妆品样品。
在本发明中，所述离心的转速优选为7000～7500rpm，更优选为7100～7400rpm，最优选为7100～7300rpm；所述离心的时间优选为1～5min，更优选为2～4min，最优选为3min。
取预处理后的化妆品样品与式I所示阳离子共轭寡聚物(OPV)混合，混匀后在36～37℃培养30min，离心，弃上清液。
在本发明中，所述混合液中阳离子共轭寡聚物的浓度优选为1～20μmol/L，更优选为5～15μmol/L，如1μmol/L，5μmol/L，10μmol/L，15μmol/L，20μmol/L，优选为以上述任意数值为上限或下限的范围值；
在本发明中，所述离心的转速优选为9000～11000rpm，更优选为10000rpm，所述离心的时间优选为8～12min，更优选为9～11min，最优选为10min。
在离心后留下的沉淀物中加入PBS溶液，混匀后取3～5μL滴在载玻片上，放上盖玻片，使用荧光显微镜进行荧光检测，记录每个化妆品样品的菌落数量，然后将其代入标准曲线，得到化妆品样品中的微生物浓度。
本发明提供了一种阳离子共轭寡聚物荧光探针在化妆品中微生物检测方面的应用，其特征在于，将阳离子共轭寡聚物与化妆品样品混合，在36～37℃培养20～40min，进行荧光检测，得到化妆品样品中微生物的浓度；所述阳离子共轭寡聚物具有式I所示结构。本发明中所使用的荧光探针具有式I所示结构，其中由于其具有大的疏水结构和正电基团，进而能够在30min内同带负电且表面疏水的微生物有效结合，作为现有的用于化妆品中微生物检测的方法具有以下优点：(1)耗时短，仅需要4-6个小时即可得到结果，(2)操作简便，无需专业操作人员，(3)需要极低浓度的OPV荧光探针即可达到所需效果，(4)共轭聚合物作为荧光探针量子产率高，光捕获能力强，(5)对微生物的检测无选择性，可批量检测化妆品样本。
为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种阳离子共轭寡聚物荧光探针在化妆品中微生物的检测中的应用进行详细描述，但不能将其理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1确定菌液实际浓度
取2mL三代菌液(Ampr E.coli)分别装入1.5mL离心管中，每管1mL,对称放入离心机中(7100rpm，3min)。离心后弃去上清液。用移液枪分别取1mL灭菌1×PBS放入离心管中，混匀后离心，此步骤重复2次。最后弃去上清液，只留菌的沉淀在离心管中待用。
打开Advanced Reads软件，设置波长为600nm，取3mL 1×PBS溶液于比色皿中，进行调零。用移液枪将菌吸入比色皿中，混合均匀后开始测试，使得菌液在600nm处的吸光度数值为1.0，误差不能过大。若数值低于1.0需要加入菌，若数值高于1.0则需要加入灭菌的1×PBS溶液稀释。将调完OD值的菌液从比色皿吸入5mL离心管中冷藏备用。
取OD600＝1.0的菌液，稀释100000倍，即菌液浓度为103cfu·mL-1，涂布平板。晾干后翻转培养皿，置37℃霉菌培养箱中培养16h～18h。取出后在菌落计数分析仪下拍照数菌。
结果如图1所示。对图1进行计数，如表1所示。
表1稀释100000倍后的菌液浓度的菌落个数
采用平板计数法，确定OD600＝1.0时Ampr E.coli菌液的实际浓度为5×107cfu·mL-1。
实施例2建立标准曲线
将大肠杆菌菌液加入水中稀释至浓度分别为2×105cfu·mL-1、3.5×105cfu·mL-1、5×105cfu·mL-1、2×106cfu·mL-1、3.5×106cfu·mL-1得到五个实验组。
从五个实验组中各取1mL菌液于五个50mL离心管中，分别加入9mL LB液体培养基，放入37℃恒温振荡器中振荡4h。培养后从五个离心管中各取1mL菌液离心(7100rpm，3min)，弃上清液后加入1mL 1×PBS洗菌，重复2次。
在垂直层流洁净工作台中分别取495μL菌液和5μL 1mM OPV依次加入一至五号离心管中，混匀后放入37℃霉菌培养箱中培养30min。培养后离心(10000rpm，10min)并弃上清液。
在离心管中加入10μL 1×PBS溶液，混匀后取5μL滴在载玻片上，放上盖玻片。将荧光显微镜打开并调至100倍物镜，将载玻片置于荧光显微镜上，打开荧光光源，取视野范围内菌落分布均匀的区域拍照。每组化妆品样本至少拍摄三组照片。
该实例中利用表面带正电荷且具有疏水结构的有机共轭寡聚物OPV与大肠杆菌在37℃下培养，使荧光探针通过静电相互作用及疏水作用与大肠杆菌相结合，随后在荧光显微镜下观察其结合情况。结果如图2，图2为含有不同数量大肠杆菌标准溶液的荧光显微镜图片及计数结果，从图中可以看出，OPV在浓度极低(10μM)时即可与所有大肠杆菌有效结合并显示出明亮的黄绿色荧光。不同浓度的照片分别计数后取平均值，结果如下：在浓度分别为2×105cfu·mL-1、3.5×105cfu·mL-1、5×105cfu·mL-1、2×106cfu·mL-1、3.5×106cfu·mL-1时，对应荧光显微镜下显示的菌落数为333，574，614，1038，1068。因此，通过本发明提出的方法可以成功标记微生物并且有效计数。
纵坐标为通过荧光显微镜计数得到的平均微生物数量，横坐标为化妆品中菌液浓度的对数，通过拟合得到标准曲线。
该实例中通过拟合得到最佳的可用于化妆品中微生物检测的标准曲线，结果如图3，图3为基于阳离子共轭寡聚物的荧光探针用于检测化妆品中微生物的标准曲线。该标准曲线方程具有式(Ⅱ)所示形式：
y＝539.6x-2462 式II
其中，y为通过荧光显微镜观察到的菌落总数，x为化妆品中菌落浓度的对数，R2＝0.99717。在实际应用中在对化妆品样本进行4～6h前处理过程后即可利用荧光显微镜对菌落总数进行计数，通过该标准曲线可计算得到化妆品中微生物的浓度。
实施例3不同微生物的有效性检测
按照实施例2中的方法进行荧光检测，不同的是，实施例3中分别使用白色念珠菌(真菌)和金黄色葡萄球菌(革兰氏阳性菌)代替实施例2中的大肠杆菌(革兰氏阴性菌)。
检测结果如图4～5所示，由图4～5可知，本发明中的阳离子共轭寡聚物的荧光探针不仅能够有效检测大肠杆菌等革兰氏阴性菌，对真菌和革兰氏阳性菌也同样能够进行有效的荧光检测。
实施例4证标准曲线的准确性
选取五种不同的商用化妆水作为样品，从五种化妆水里分别取990μL于1.5mL离心管中，每管都加入10μL 5×107cfu·mL-1的大肠杆菌菌液，混匀后得到1mL 5×105cfu·mL-1浓度的实验样本，分别标记为样本1、样本2、样本3、样本4和样本5。
从1-5样本中各取1mL的菌液，用移液枪吸入50mL离心管中，加入9mL LB液体培养基，放入37℃恒温振荡器中振荡培养4h。随后从五个样本中各取1mL菌液离心(7100rpm，3min)，并用1×PBS溶液洗涤2次。将495μL1×PBS溶液和5μL 1mM OPV依次加入1-5号离心管中，混匀后放入37℃霉菌培养箱中培养30min。培养后的菌离心(10000rpm，10min)，弃上清液。
在离心管中加入10μL 1×PBS溶液，混匀后取5μL滴在载玻片上，放上盖玻片。将荧光显微镜打开并调至100倍物镜，将载玻片置于荧光显微镜上，打开荧光光源，取视野范围内菌落分布均匀的区域拍照。每组化妆品样本至少拍摄三组照片。
该实例中通过选择五种不同的商用化妆品作为样品，通过人工加入已知浓度的微生物来验证实施例2提出的标准曲线的准确性。结果如图6，图6为人工添加微生物后的不同化妆品样品按照本方案得到的荧光显微镜图像。其中样本2和样本5的重合程度较高，样本1、样本3及样本4的计算值略小于实际值，可能是由于化妆品样本中本身含有对病原微生物有杀伤作用的成分。因此，本实施例验证了可用于化妆品中微生物检测的标准曲线的准确性，并且实验过程简单快速，能够用于批量检测。
实施例5用于化妆品检测
取1mL真实化妆品样本于50mL离心管中，加入9mL LB液体培养基，放入37℃恒温振荡器中振荡4h。从离心管中取1mL样液用移液枪吸入1.5mL离心管中，离心(7100rpm，3min)后用1×PBS溶液洗2次，加入495μL 1×PBS溶液和5μL 1mM OPV，混匀后放入37℃霉菌培养箱中30min。培养后的菌离心(10000rpm，10min)，弃去上清液。
在离心管中加入10μL 1×PBS溶液，用移液枪上下混匀后取5μL滴在载玻片上，放上盖玻片。将荧光显微镜打开并调至100倍物镜，往镜头上滴一滴镜油，将载玻片放到荧光显微镜上，打开荧光光源，在相同位置拍摄荧光照片。共拍摄3次。
该实例中选择商用化妆品样本利用实施例2提出的标准曲线计算该化妆品样本的浓度。结果如图7，图7为化妆品样品利用本方案标准曲线计算得到的微生物数量。由图可知，商用化妆品中确实存在微生物，并且通过实施例2提出的检测方法可知平均微生物数量为8，代入标准曲线得到商用化妆品中微生物浓度约为3.8×104cfu·mL-1。因此本专利可有效用于快速高效的检测化妆品中的微生物含量。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (7)
1.阳离子共轭寡聚物荧光探针在化妆品中微生物检测的应用，其特征在于，将阳离子共轭寡聚物与化妆品样品混合，在36～37℃培养20～40min，进行荧光检测，得到化妆品样品中微生物的浓度；
所述阳离子共轭寡聚物具有式I所示结构：
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述荧光检测得到菌落数，通过标准曲线计算得到化妆品中微生物的浓度；
所述标准曲线按照以下步骤获得：
将微生物菌液加水稀释至多个设定浓度，得到多个标准样；
在所述标准样中加入LB液体培养基，36～37℃下培养4～5小时后离心，弃上清液后加入PBS进行洗菌，得到培养后的菌液；
将培养后的菌液与式I所示阳离子共轭寡聚物混合，混匀后在36～37℃培养20～40min，离心，弃上清液后加入PBS溶液，进行荧光检测，记录每个标准样的菌落数量，得到微生物菌落数量与菌液浓度的标准曲线。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述微生物为革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和真菌中的一种或几种。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述微生物为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌中的一种或几种。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述阳离子共轭寡聚物在化妆品样品中的浓度为1～20μmol/L。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，将阳离子共轭寡聚物与化妆品样品混合，在37℃培养30min，进行荧光检测。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，对所述化妆品样品进行预处理，再与阳离子共轭寡聚物混合；
所述预处理为：
将化妆品样本加入LB液体培养基，36～37℃下培养4～5小时后离心，弃上清液后加入PBS进行洗菌，得到预处理后的化妆品样本。
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